WO2021010481A1

WO2021010481A1 - 接着タンパク質

Info

Publication number: WO2021010481A1
Application number: PCT/JP2020/027921
Authority: WO
Inventors: 克敏堀
Original assignee: 国立大学法人東海国立大学機構
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2021-01-21
Also published as: EP4001299A1; JPWO2021010481A1; EP4001299A4; US20220259268A1

Abstract

本発明は、新規ポリペプチドなどを提供し、本発明者らによって見出されたポリペプチドは、自己凝集性を有さず、かつ接着性を有する特性を有していた。本発明の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の断片からなる。特定の実施形態では、本発明の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位を含み、かつアミノ酸２８４７～３０９３位のうち、自己凝集性を付与するのに必要な領域の欠如を含む。

Description

接着タンパク質

　本開示は、自己凝集性を有さない接着性のポリペプチドおよびその用途に関する。

　本発明者が以前にバイオフィルターから単離したＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５（アシネトバクター属細菌Ｔｏｌ５株）は、細胞自己凝集性が高く、また、疎水性の各種プラスチック担体から親水性のガラス、金属表面まで、様々な材料表面に対して高い接着性を示す非病原性のグラム陰性細菌である。他の微生物では報告例のないこのような接着特性をもたらす因子として、細菌細胞表層に存在する新規のバクテリオナノファイバーを発見し、さらにナノファイバーを構成する新しいタンパク質を同定した。このタンパク質はグラム陰性細菌がもつ三量体オートトランスポーターアドヘシン（ＴＡＡ）ファミリーに属しており、本発明者がＡｔａＡと名付けた（非特許文献１）。ＴＡＡファミリーに属するタンパク質はホモ三量体を形成し、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、シグナルペプチド－ｈｅａｄ－ｎｅｃｋ－ｓｔａｌｋ－メンブレンアンカーという共通の基本構造をとる（非特許文献２）。メンブレンアンカードメインはトランスロケータードメインともいい、外膜にベータバレルを形成し、ペリプラズムでシグナルペプチドが切断された後のｈｅａｄ－ｎｅｃｋ－ｓｔａｌｋから成るパッセンジャードメインを細胞外に輸送、ファイバーとして細胞表層に提示させる機能を有する。パッセンジャードメインのヘッド側がファイバーの先端になり、成熟タンパク質のアミノ末端側にあたる。しかしＴＡＡには、構成単量体ポリペプチド鎖のアミノ酸残基数が３００ほどの小さなものから３０００を超える大きなものまで存在し、アミノ酸配列、特にパッセンジャードメインを構成するドメインやモチーフの種類と並びは多様である。本発明者が見つけたＡｔａＡを構成する単量体ポリペプチド鎖は３６３０アミノ酸（シグナルペプチドを含む長さ）から成り、ＴＡＡの中でも最大級である。長いｓｔａｌｋに複数の長い繰返し配列がモザイク状に並ぶユニークな一次構造をしている。この繰返し配列は、何種類ものドメインが反復、混在して形成されている。ｈｅａｄもドメインの一つであり、ファイバーの先端以外にｓｔａｌｋの途中、メンブレンアンカー寄りにもう一つ存在する。

　ＡｔａＡは微生物の固定化に極めて有用であり、様々なバイオプロセスへの応用が期待される（例えば特許文献１、２を参照）。また、本発明者は先の特許出願（特許文献３）において、様々な機能性ペプチドやタンパク質をＡｔａＡに導入し、微生物表面に提示させ得ることを報告した。尚、特許文献１ではＡｔａＡ及びそれをコードする遺伝子（ａｔａＡ遺伝子）をそれぞれＡａｄＡ及びａａｄＡ遺伝子と呼称していた。

国際公開第２００９／１０４２８１号パンフレット国際公開第２０１４／１５６７３６号パンフレット国際公開第２０１５／０３０１７１号パンフレット

Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．；Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｈ．；Ｈｏｒｉ，Ｋ．，ＡｔａＡ，　ａ　ｎｅｗ　ｍｅｍｂｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒｉｍｅｒｉｃ　ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ａｄｈｅｓｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ　５　ｍｅｄｉａｔｉｎｇ　ｈｉｇｈ　ａｄ　ｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ　ｔｏ　ｖａｒｉｏｕｓ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｕｒｆａｃｅｓ．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ　２０１２，７，（１１），ｅ４８８３０．Ｌｉｎｋｅ，Ｄ．；Ｒｉｅｓｓ，Ｔ．；　Ａｕｔｅｎｒｉｅｔｈ，Ｉ．　Ｂ．；　Ｌｕｐａｓ，　Ａ．；　Ｋｅｍｐｆ，　Ｖ．　Ａ．，　Ｔｒｉｍｅｒｉｃ　ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ａｄｈｅｓｉｎｓ：　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　ｃｏｍｍｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６，１４，（６），２６４－２７０．

　本発明者らは、鋭意研究した結果、ＡｔａＡタンパク質はパッセンジャードメインのみを細胞表層から切り離して精製した状態でも、接着性と自己凝集性を発揮できることを発見した。さらに、接着性と自己凝集性は同じドメインが担っているということを発見した。にも拘わらず、細胞から切り離したＡｔａＡパッセンジャードメインから、自己凝集を担うドメインとは異なるドメインを削除することにより、接着性を維持しつつ自己凝集性を欠如させたＡｔａＡ断片が得られるという予期せぬ新事実を見出した。本開示は、本開示の接着性ポリペプチドの応用、例えば機能性付与実体の固定および／または接着方法等にも関する。

　本開示における改良されたＡｔａＡは、細胞から生えている状態ではなく、ＡｔａＡを分離精製したタンパク質の場合に、見出されたものである。一つの具体的な実施形態では、この目的のためにＣ末の膜結合部位がないことが一つの特徴でありうる。また、シグナルペプチドも、接着タンパク質としては存在していないことも一つの非制限的な代表的な特徴でありうる。これらの特徴は、従来知られるＡｔａＡと異なり、微生物から切り離したタンパク質材料として利用されうる。本開示では、細胞上に存在するときは、Ｃｈｅａｄはなくても自己凝集することが判明した。しかし、細胞から切り離されて、かつＣｈｅａｄが削除された時に、ＡｔａＡ断片は自己凝集性を失う。これらの特徴は従来のＡｔａＡにない特徴である。

　したがって、本開示は、以下を提供する。
（１）自己凝集性を有さず、かつ接着性を有する、配列番号１に示すアミノ酸配列またはその改変配列の断片を含むポリペプチド。
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を含み、かつ配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８４７～３０９３位に対応する配列の範囲に１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（３）前記配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８４７～３０９３位に対応する配列の範囲は、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８５５～３０９３位に対応する範囲である、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８５５～３０９３位に対応する配列のすべてを欠失する、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（５）（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～３５１８位に対応する配列またはその改変配列またはその断片において、
　配列番号１のアミノ酸２８５５～３０９３位に対応する配列に少なくとも１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含み、
　配列番号１のアミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する配列を含む、ポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～３０９３位に対応する配列またはその改変配列またはその断片において、
　アミノ酸２８５５～３０９３位に対応する配列に少なくとも１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含み、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する配列を含む、ポリペプチド；
（Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８４６位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；
（Ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～３５１８位の一部を含み、
　配列番号１のアミノ酸２８５５～３０９３位に対応する配列に少なくとも１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含み、
　配列番号１のアミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；
（Ｅ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；
（Ｆ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド
である、ポリペプチド。
（５Ａ）（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド、または
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８４６位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；または
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；または
（ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド
である、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（５Ｂ）（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片を含む、ポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８４６位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片を含む、ポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片を含む、ポリペプチド；または
（ｉｖ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片を含む、ポリペプチド
である、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（５Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（５Ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８４６位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（５Ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（５Ｅ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（６）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位に対応するアミノ酸配列からなる、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（７）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８４６位に対応するアミノ酸配列からなる、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（８）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位に対応するアミノ酸配列からなる、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（９）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位に対応するアミノ酸配列からなる、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（１０）前記改変配列は、保存的置換による改変を含む、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（１１）アシネトバクター菌由来である、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（１２）前記アシネトバクター菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株である、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（１３）配列番号１とは異なるアミノ酸配列をさらに含む、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（１４）前記異なるアミノ酸配列は、前記断片と融合されたものである、上記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（１５）上記項目のいずれかに記載のポリペプチドと、機能性付与実体との複合体。
（１６）上記項目のいずれかに記載のポリペプチドまたは上記項目のいずれかに記載の複合体を含む、自己凝集せずに第一の対象を第二の対象に接着および／または固定させるための組成物。
（１７）前記第一の対象を前記第二の対象に単層接着させるための、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（１８）前記第一の対象と前記第二の対象とが同じである、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（１９）前記第一の対象と前記第二の対象とが異なる、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（２０）前記第一の対象または前記第二の対象の少なくとも１つが、機能性付与実体である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（２１）前記機能性付与実体が、ペプチドおよび／またはタンパク質である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（２２）前記機能性付与実体が、ストレプトアビジン、中性アビジンまたはそれらの改変体である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（２３）前記機能性付与実体が、細胞である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（２４）前記第二の対象が支持体である、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（２５）前記支持体がリポソームである、上記項目のいずれかに記載の組成物。
（２６）上記項目のいずれかに記載のポリペプチドまたは上記項目のいずれかに記載の複合体を含む、自己凝集せずに第一の対象を第二の対象に接着および／または固定させるための組成物であって、該第一の対象は、前記異なるアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記機能性付与実体である、組成物。
（２７）上記項目のいずれかに記載のポリペプチドまたは上記項目のいずれかに記載の複合体を、第一および／または第二の対象に作用させることを包含する、該第一の対象を該第二の対象に接着および／または固定するための方法。
（２８）前記第一の対象を前記第二の対象に単層接着させるための、上記項目のいずれかに記載の方法。
（２９）前記第一の対象と前記第二の対象とが同じである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３０）前記第一の対象と前記第二の対象とが異なる、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３１）前記第一の対象または前記第二の対象の少なくとも１つが、機能性付与実体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３２）前記機能性付与実体が、ペプチドおよび／またはタンパク質である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３３）前記機能性付与実体が、ストレプトアビジン、中性アビジンまたはそれらの改変体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３４）前記機能性付与実体が、細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３５）前記第二の対象が支持体である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３６）前記支持体がリポソームである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（３７）上記項目のいずれかに記載のポリペプチドまたは上記項目のいずれかに記載の複合体を、第二の対象に作用させることを包含する、前記異なるアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記機能性付与実体を該第二の対象に自己凝集させずに接着および／または固定するための方法。
（３８）上記項目のいずれかに記載のポリペプチドまたは上記項目のいずれかに記載の複合体が固定された支持体。
（３９）前記支持体は、脂質二重構造体、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、チタン、アクリル、天然および合成のポリマーからなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の支持体。
（４０）上記項目のいずれかに記載のポリペプチドまたは上記項目のいずれかに記載の複合体の、自己凝集せずに第一の対象を第二の対象に接着および／または固定させるための使用。
（４１）前記使用が、前記第一の対象を前記第二の対象に単層接着させるための使用である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（４２）前記第一の対象と前記第二の対象とが同じである、上記項目のいずれかに記載の使用。
（４３）前記第一の対象と前記第二の対象とが異なる、上記項目のいずれかに記載の使用。
（４４）前記第一の対象または前記第二の対象の少なくとも１つが、機能性付与実体である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（４５）前記機能性付与実体が、ペプチドおよび／またはタンパク質である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（４６）前記機能性付与実体が、ストレプトアビジン、中性アビジンまたはそれらの改変体である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（４７）前記機能性付与実体が、細胞である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（４８）前記第二の対象が支持体である、上記項目のいずれかに記載の使用。
（４９）前記支持体がリポソームである、上記項目のいずれかに記載の使用。
（５０）上記項目のいずれかに記載のポリペプチドまたは上記項目のいずれかに記載の複合体の、自己凝集せずに第一の対象を第二の対象に接着および／または固定させるための使用であって、該第一の対象は、前記異なるアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記機能性付与実体である、使用。

　本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

　本開示を使用して、接着性ポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）および／または本開示の接着性ポリペプチドと機能性付与実体との複合体を自己凝集させずに、固定および／または接着させることが可能になった。一局面では、本開示によれば、接着性ポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）および機能性付与実体をリポソームの膜上に固定および／または接着させることが可能になった。したがって、本開示の接着性ポリペプチドは、医薬品・化成品工業の分離プロセス、再生医療、細胞工学、医用工学、バイオセンサー、表面改質や機能性材料の設計などの材料工学に有用である。

図１は、顕微鏡観察による細胞の凝集解析を示す。図１Ａは、凝集解析のモデル系を示す。図１Ａにおいて、楕円は細胞を示し、濃い楕円はｍＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）を発現する細胞を示し、薄い楕円はＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現する細胞を示す。図１Ａの中央上側は、両細胞が凝集作用を有する場合の細胞の凝集パターンを示し、中央下段は、ｍＲＦＰ発現細胞だけが凝集作用を有しＥＧＦＰ発現細胞は凝集作用を有しない場合の細胞の凝集パターンを示す。図１Ａの左から３番目に、それぞれの細胞の凝集を２μｍ区画に分断した場合の細胞の存在パターン示す。図１Ａの最も右側に、それぞれの細胞の存在パターンを、ＧＦＰの蛍光を発する細胞の比率に基づき計数したグラフを示す。グラフにおいて横軸はＧＦＰの蛍光を発する細胞の比率を表し、左から順に、０～２０％、２０～４０％、４０～６０％、６０～８０％、８０～１００％の細胞でＧＦＰの蛍光が認められることを表しており、縦軸にそれぞれのＧＦＰの蛍光を発する細胞の比率が認められた区画の数の比率を示す。図１Ｂは、ｍＲＦＰおよび正常なＡｔａＡタンパク質を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株と、ＥＧＦＰおよび正常なＡｔａＡタンパク質を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株とを混合して形成された細胞凝集塊の画像および微小区画中のＥＧＦＰを発現する細胞の割合のヒストグラムを示す。図１Ｃは、ｍＲＦＰおよび正常なＡｔａＡタンパク質を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株と、ＥＧＦＰを発現するΔＡｔａＡ　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株とを混合して形成された細胞凝集塊の画像および微小区画中のＥＧＦＰを発現する細胞の割合のヒストグラムを示す。図２は、全長ＡｔａＡタンパク質または部分欠損株を使用した凝集実験を示す。図２Ａは、上から順に、全長ＡｔａＡタンパク質、（１）Ｎｈｅａｄが欠損した構造のＡｔａＡ、（２）Ｎｓｔａｌｋ内の一部が欠損した構造のＡｔａＡ、（３）Ｎｓｔａｌｋ内の一部が欠損した構造のＡｔａＡ、（４）Ｎｓｔａｌｋ内の一部が欠損した構造のＡｔａＡ、（５）Ｎｓｔａｌｋ内の一部に加え、Ｃｈｅａｄを欠損させた構造のＡｔａＡ、（６）Ｃｓｔａｌｋの大部分が欠損（ＦＧＧドメインは保存）した構造のＡｔａＡのドメイン構造を示す。図２Ｂは、ｍＲＦＰおよび正常なＡｔａＡタンパク質を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株と、ＥＧＦＰおよび正常なＡｔａＡタンパク質または図２Ａの６種類の部分欠損体を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株とを混合して形成された細胞凝集塊の画像および微小区画中のＥＧＦＰを発現する細胞の割合のヒストグラムを示す。図３は、Ｎｈｅａｄ組換えタンパク質が二次構造をとることを示す。図３Ａは、上から順に、Ｎｈｅａｄ組換えタンパク質のコンストラクト設計、およびＮｈｅａｄ組換えタンパク質のＡｔａＡ断片部分のドメイン構造を明示した図である。図３Ｂは、Ｎｈｅａｄ組換えタンパク質のＣＤスペクトル測定の結果を示す。図３Ｂにおいて、グラフの横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸はＣＤ（ｍｄｅｇ）を示す。図３Ｃは、Ｎｈｅａｄ組換えタンパク質（ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－Ｈｉｓ）のアミノ酸配列とその詳細説明を示す。図４は、Ｎｈｅａｄドメイン内のループ構造を欠損させた変異体を使用した、微生物の接着性の測定結果を示す。グラフの軸は、左から順に、ＡｔａＡ欠損株（ΔａｔａＡ）、野生型（ＡｔａＡ）、ΔＮｈｅａｄ欠損株、Δ１ｓｔ　ｌｏｏｐ欠損株、およびΔ２ｎｄ　ｌｏｏｐ欠損株を使用した場合の結果を示し、黒色の棒グラフはポリスチレンプレートへの接着性に対応し、灰色の棒グラフはガラスプレートへの接着性に対応する。グラフの縦軸は、Ａ_５９０により測定された微生物の接着性を示す。図５は、大腸菌組換えＮｈｅａｄの分散性と自己凝集性を示す。グラフの横軸はＮｈｅａｄ精製物のサイズ（ｄ．ｎｍ）を示し、縦軸はＮｈｅａｄ精製物の体積（比率）を示す。図６は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株の凝集塊の顕微鏡写真を示す。左側に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株の凝集塊の顕微鏡写真を示し、右側に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株にＡＶＬペプチドを添加した場合の顕微鏡写真を示す。図７は、ＱＣＭ－Ｄにより測定した大腸菌組換えＮｈｅａｄの接着性を示す。図７Ａはポリスチレンセンサーへの接着を示し、図７Ｂはシリカセンサーへの接着を示す。各グラフは、縦軸がΔｆ７／７（Ｈｚ）値による接着量を示し、横軸に時間を示す。グラフの各矢印は、左から順に、５０μｇ／ｍｌのＮｈｅａｄを添加した時間、Ｎｈｅａｄを再度添加した時間、リンスを行った時間、０．１ｍＭのＡＶＬペプチドを添加した時間、再びリンスを行った時間を示す。図８は、全長ＡｔａＡのＮｈｅａｄをＣｈｅａｄに置換したＷＣｈｅａｄのＡｔａＡ改変体を発現する菌株の自己凝集性および微生物固定化率を示す。図８Ａは、ＡｔａＡを発現しない株（ΔＡｔａＡ）、野生株（ＡｔａＡ）、Ｎｈｅａｄを欠損したＡｔａＡを発現する株（ΔＮｈｅａｄ）およびＷＣｈｅａｄのＡｔａＡ改変体を発現する株（ＷＣｈｅａｄ）の自己凝集性を示す。図８Ｂは、野生株（ＡｔａＡ）、Ｎｈｅａｄを欠損したＡｔａＡを発現する株（ΔＮｈｅａｄ）およびＷＣｈｅａｄのＡｔａＡ改変体を発現する株（ＷＣｈｅａｄ）の、ポリスチレン表面、ガラス表面への固定化率を示す。図９は、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ぺプチドが二次構造をとることを示す。図９Ａは、上から順に、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドのコンストラクト設計、およびＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドのＡｔａＡ断片部分のドメイン構造を明示した図である。図９Ｂは、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドのＣＤスペクトル測定の結果を示す。図９Ｂにおいて、グラフの横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸はＣＤ（ｍｄｅｇ）を示す。図９Ｃは、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチド（ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－ＳＮＡＰ－Ｈｉｓ）のアミノ酸配列とその詳細説明を示す。図１０は、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの様々な材料表面への固定化を示す。図１０Ａは、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの各種材料表面への固定化を、Ｎｈｅａｄに融合したＳＮＡＰタンパク質の蛍光分子基質によって調べるためのモデルを示し、左から順に、材料表面へのＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの滴下、蛍光分子基質の滴下、洗浄、および蛍光測定のステップに対応する。図１０Ｂは、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドまたはＳＮＡＰタンパク質のみを各種材料と接着させた場合の蛍光を示し、写真の列は左から順に、ガラス、ポリスチレン、チタンおよびポリテトラフルオロエチレン樹脂材料を示し、写真の行は上から順に、タンパク質を何も接着させていない場合、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを接着させた場合、およびＳＮＡＰタンパク質を接着させた場合の蛍光を示す。図１１は、ベンジルグアニル（ＢＧ）基を付加した抗菌ペプチドＣＡＰ１８を、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを介してポリスチレン表面に固定化したときの表面の抗菌性を示す。写真の列は左から順に、何も接着させていない表面、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを接着させた表面、およびＳＮＡＰタンパク質を接着させた表面を示し、この表面に対し、写真の行は上から順に、抗菌ペプチドを作用させない（抗菌ペプチドで被覆されない）場合、抗菌ペプチドを作用させた（抗菌ペプチドで被覆した）場合を示す。各写真で白く見える部分は、材料表面に付着した緑膿菌（蛍光染色されている）からの蛍光を示す。白い部分が少ないほど、微生物が殺菌されて付着せず、したがってより高い抗菌性を示している。下の行の真ん中の写真には、他の写真と比べて白い部分がほとんどなく、緑膿菌に対する高い抗菌効果が見られる。図１２は、ＳＮＡＰタンパク質をＮ末端に有するＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドが二次構造をとることを示す。図１２Ａは、上から順に、ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドのコンストラクト設計、およびＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドのＡｔａＡ断片部分のドメイン構造を明示した図を示す。図１２Ｂは、ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドのＣＤスペクトル測定の結果を示す。図１２Ｂにおいて、グラフの横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸はＣＤ（ｍｄｅｇ）を示す。図１２Ｃは、ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチド（ＳＮＡＰ－ＡｔａＡ_{６０－３２５}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－Ｈｉｓ）のアミノ酸配列とその詳細説明を示す。図１３は、ＳＮＡＰタンパク質をＮｈｅａｄのＮ末端側に融合した場合（ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ）とＣ末端側に融合した場合（Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ）との比較を示す。グラフは、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドとＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドとの接着性の比較を示す。グラフの縦軸は５３５ｎｍでの蛍光強度を示し、横軸は、左から順に何も接着させていない場合、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを接着させた場合、ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドを接着させた場合、ＳＮＡＰタンパク質を接着させた場合を示す。グラフのうち黒軸はＢＧ化ＣＡＰ１８（ＢＧ）を添加していない場合を示し、白軸はＢＧ化ＣＡＰ１８（ＢＧ）を添加した場合の蛍光強度を示す。黒軸と白軸の差が、ＢＧ化ＣＡＰ１８が接着したことにより蛍光基質が接着できなくなった分、すなわちＢＧ化ＣＡＰ１８の接着量に相当する分を示す。図１４は、ＧＣＮ４ｐＩＩタグを使用しないＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドが二次構造をとることを示す。図１４Ａは、上から順に、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＧＣＮ４ｐＩＩ融合ペプチドのコンストラクト設計、およびＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＧＣＮ４ｐＩＩ融合ペプチドのＡｔａＡ断片部分のドメイン構造を明示した図を示す。図１４Ｂは、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＧＣＮ４ｐＩＩ融合ペプチドのＣＤスペクトル測定の結果を示す。図１４Ｂにおいて、グラフの横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸はＣＤ（ｍｄｅｇ）を示す。図１４Ｃは、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＧＣＮ４ｐＩＩ融合ペプチド（ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＳＮＡＰ－Ｈｉｓ）のアミノ酸配列とその詳細説明を示す。図１５は、ＮｓｔａｌｋのＮ末端の先端コイルドコイル領域を削除した（ΔＣＣ）Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドが二次構造をとることを示す。図１５Ａは、上から順に、ＮｓｔａｌｋのＮ末端の先端にあるＦＧＧドメインの一部であるコイルドコイルを削除したＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＣＣ融合ペプチドのコンストラクト設計、およびＮｈｅａｄドメイン－ＳＮＡＰ＿ΔＣＣ融合ペプチドのＡｔａＡ断片部分のドメイン構造を明示した図を示す。図１５ＢはＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＣＣ融合ペプチドのＣＤスペクトル測定の結果を示す。図１５Ｂにおいて、グラフの横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸はＣＤ（ｍｄｅｇ）を示す。図１５ＣはＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＣＣ融合ペプチド（ＡｔａＡ_{５９－３１４}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－ＳＮＡＰ－Ｈｉｓ）のアミノ酸配列とその詳細説明を示す。図１６は、図９、図１４、および図１５に示した各種Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの固定化試験の結果を示す。ＳＮＡＰタンパク質の基質であり、ＳＮＡＰタンパク質と共有結合を形成する蛍光分子の蛍光強度により、蛍光分子基質の固定化量を計測した結果を示す。グラフは、左から順に、Ｎｏｎ（タンパク質でのコーティング無しで蛍光分子基質のみ添加）、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチド、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＧＣＮ４ｐＩＩ融合ペプチド、およびＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＣＣ融合ペプチドでポリスチレン（ＰＳ）プレートをコーティングした場合の、蛍光分子の固定化試験の結果を示し、グラフの縦軸は、蛍光値（５３５ｎｍ）を示す。図１７は、大腸菌組換えＮｈｅａｄとストレプトアビジンとが、複合体を形成することを示す。グラフは、Ｎｈｅａｄまたはストレプトアビジン（ＳＡ）単独または、両者を混合したものの粒子径を動的光散乱（ＤＬＳ）により計測した結果を示す。グラフの横軸は粒子径を、縦軸は粒子の存在比を体積比で示す。グラフにおいて、粒子径１０ｎｍ付近にピークが認められる折れ線は、Ｎｈｅａｄ単独およびＳＡ単独での測定結果に対応し、１０００ｎｍを超える粒子径にピークが認められる折れ線は、ＮｈｅａｄとＳＡの複合体の測定結果に対応する。図１８は、大腸菌組換えＮｈｅａｄと中性アビジンとが結合することを示す。グラフは、Ｎｈｅａｄ単独、中性アビジン単独、および両者を混合したものの粒子径を動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した結果を示す。グラフの横軸は粒子径（ｎｍ）を示し、縦軸は各粒子の存在比（体積％）を示す。グラフの横軸は粒子径を、縦軸は粒子の存在比を体積比で示す。グラフにおいて、粒子径１０ｎｍ付近にピークが認められる折れ線は、Ｎｈｅａｄ単独および中性アビジン単独での測定結果に対応し、１０００ｎｍを超える粒子径にピークが認められる折れ線は、Ｎｈｅａｄと中性アビジンの複合体の測定結果に対応する。図１９は、大腸菌組換えＮｈｅａｄとアビジンとは結合せず、複合体を形成しないことを示す比較例の結果である。グラフは、Ｎｈｅａｄ、アビジン単独および両者を混合したものの粒子径を、動的光散乱（ＤＬＳ）により計測した結果を示す。グラフの横軸は粒子径を、縦軸は粒子の存在比を体積比で示す。図２０は、表面に大腸菌組換えＮｈｅａｄをコーティングしたプレートへの細菌の固定化を示す。図２０Ａは、細菌の固定化を検出するための実験系を示す。図２０Ｂは、左側は枯草菌を固定化させた場合の写真を示し、右側は大腸菌を固定化させた場合の写真を示す。各細菌について、写真は、左から順に、何もコーティングを行っていない場合、ＢＳＡをコーティングした場合、Ｎｈｅａｄをコーティングした場合の写真を示す。各写真において、蛍光染色された細菌細胞は白く見える。図２１は、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを表層に固定化したリポソーム（Ｎｈｅａｄ表層修飾リポソーム）の粒子解析を示す。図２１において、グラフの縦軸はリポソームの直径ごとの数基準の比率（％）を示し、横軸はリポソームの直径を示す。図２２は、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを表層に固定化したリポソーム（Ｎｈｅａｄ表層修飾リポソーム）の表面への固定化を示す。図２２において、グラフの縦軸はＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７の蛍光強度を示し、横軸は、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドをそれぞれ０μＭ、１μＭ、１０μＭ添加した場合のベンジルグアニル（ＢＧ）基を介したＮｈｅａｄ表層修飾リポソーム、および被修飾の通常のリポソームでの結果を示す。図２３は、大腸菌組換えＮｈｅａｄＮｓｔａｌｋ（ＮｈＮｓ）－ＳＮＡＰ融合ペプチドのコンストラクト設計を示す。上段はＡｔａＡタンパク質の全長を、下段にＮｈＮｓ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを示す。上段の全長配列は、ＡｔａＡタンパク質のドメイン群構造を示し、左から順に、ＳＰ（シグナルペプチド）、Ｎｈｅａｄ、Ｎｓｔａｌｋ、Ｃｈｅａｄ、ＣｓｔａｌｋおよびＴＭ（メンブレンアンカー）ドメインに対応する。下段は、融合ペプチドの構成を示し、左から順に、Ｎｈｅａｄ、Ｎｓｔａｌｋ、ＧＣＮ４アダプター、ＳＮＡＰタンパク質およびＳｔｒｅｐタグに対応する。図２４は、ＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームとコントロールの通常のリポソームの顕微鏡写真を示す。左側はＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームの写真であり、右側は非修飾の通常のリポソーム（コントロール）の写真を示す。図２５は、ＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームの粒形を、ＤＬＳにより解析した結果を示す。図２５Ａは、比較のため、純水中に懸濁させたＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株およびΔａｔａＡ変異株をＤＬＳによって解析した結果を示し、白抜きの点は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株での結果を示し、灰色の点は、ΔａｔａＡ変異株での結果を示す。図２５Ｂは、Ｔｏｌ５株細胞が純水中では自己凝集しないことを示す図である。図２５Ｃは、ＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームおよび非修飾リポソームを、ＤＬＳにより解析した結果を示し、白抜きの点はＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームでの結果を示し、灰色の点は、非修飾リポソームでの結果を示す。図２６は、ＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームによる接着アッセイを示す。図２６Ａは、ポリスチレンプレートに、リポソームを接着させた実験の結果を示し、左側はベンジルグアニル基（ＢＧ）リポソームを使用してＮｈＮｓファイバーで修飾されたリポソームの接着結果を示し、右側はＥｇｇ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＣ）リポソームを使用したコントロールの非修飾リポソームの接着結果を示す。図２６Ｂは、ガラスプレートに、リポソームを接着させた実験の結果を示し、左側はＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームの接着結果を示し、右側はコントロールの非修飾リポソームの接着結果を示す。図２６Ｃは、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を封入し、ポリスチレンプレートに固定したＮｈＮｓファイバー修飾リポソームによる酵素反応試験の結果を示す。グラフにおいて、丸印でデータを示す軸はＧＵＳを封入したＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームのデータに対応し、三角印でデータを示す軸はＧＵＳを封入した非修飾リポソームのデータに対応し、四角印でデータを示す軸はＧＵＳを含まないＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームのデータに対応する。図２７は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合した、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドが二次構造をとることを示す。図２７Ａは、上から順に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドのコンストラクト設計、およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドのＡｔａＡ断片部分のドメイン構造を明示した図を示す。図２７Ｂは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチド（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－Ｈｉｓ）のアミノ酸配列とその詳細説明を示す。図２７Ｃは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドのＣＢＢ染色の結果を示す。図２７Ｃにおいて、左側に分子量を示し、右側の矢印はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドの分子量を示す。図２７Ｄは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドのＣＤスペクトル測定の結果を示す。図２７Ｄにおいて、グラフの横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸はＣＤ（ｍｄｅｇ）を示す。図２８は、ＳｐｙＴａｇと融合した、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ融合ペプチドが二次構造をとることを示す。図２８Ａは、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰのコンストラクト設計を示す。図２８Ｂは、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ融合ペプチド（ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ－Ｈｉｓ）のアミノ酸配列とその詳細説明を示す。図２８Ｃは、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ融合ペプチドのＣＢＢ染色の結果を示す。図２８Ｃにおいて、左側に分子量を示し、右側の矢印はＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ融合ペプチドの分子量を示す。図２８Ｄは、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ融合ペプチドのＣＤスペクトル測定の結果を示す。図２８Ｄにおいて、グラフの横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸はＣＤ（ｍｄｅｇ）を示す。図２９は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄが、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰと結合することを示す。図２９Ａは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＮｈｅａｄとＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰとの結合を検出するための実験系を示す。図２９Ｂは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＮｈｅａｄとＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰとの結合を、ＣＢＢ染色により検出した結果を示す。図２９Ｂにおいて、ＣＢＢ染色のデータは、左から順に、分子量マーカー、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ単独、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ単独、およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＮｈｅａｄとＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰとの混合物に対応する。左側に分子量を示し、右側の矢印は、ＧＦＰ－Ｎｈｅａｄ結合産物、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチド、およびＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ融合ペプチドの分子量を示す。図３０は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄを介して、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰをポリスチレンプレートに固定化することができることを示す。図３０Ａは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄをポリスチレン（ＰＳ）プレート上に固定して、そこにＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰを結合させることによって、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰを固定するモデル図を示す。図３０Ｂは、ＧＦＰの蛍光強度により、ＧＦＰの固定化量を計測した結果を示す。グラフは、左から順に、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ単独、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰとＮｈｅａｄとを使用したもの、ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄとを使用したもので、ポリスチレンプレートをコーティングした場合の、ＧＦＰ分子の固定化試験の結果を示し、グラフの縦軸は、相対蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５３５ｎｍ）を示す。

　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

　（用語の定義）
　本明細書において、「接着（ａｄｈｅｒｅ，ａｄｈｅｓｉｏｎ）」または「固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」とは、互換可能に使用され、本技術分野において通常使用される意味で使用され、「接着」または「固定」の対象の少なくとも一部を、接着または固定される目的物における一定の位置から少なくとも相対的に動かなくさせることを意味する。

　本明細書において、「凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｅ，ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、分散した状態のポリペプチド等が、そのポリペプチド自体または他のポリペプチド等同士で、塊状に集まることを意味する。特に同じ種類のポリペプチド鎖同士が凝集する場合、自己凝集する（ｓｅｌｆ－ａｇｇｒｅｇａｔｅ，ｓｅｌｆ－ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）という。例えば、ＡｔａＡについていうと、複数のＡｔａＡ同士が凝集することで、塊を形成する現象が生じるので、自己凝集能があると言える。本開示の接着性ポリペプチドは、自己凝集性を有さないため、一例では、積層接着しないことになるため積層接着が好ましくない局面で有利である。

　また、自己凝集性を有しないことにより、接着用組成物中でポリペプチドが均質に分散し、均質な応力状態を生成することを可能にするため、より強固に接着または固定することができる。

　このほか、接着を維持しつつ自己凝集しない特性は以下の用途で有用である。すなわち、本開示の接着性ポリペプチドは、単層で融合物や機能性付与実体を接着または固定化させることによって、医薬品・化成品工業の分離プロセス、再生医療、細胞工学、医用工学、バイオセンサー、表面改質や機能性材料の設計などの材料工学等における、融合物および機能性付与実体の機能の制御に有用である。

　本明細書において、「結合（ｂｉｎｄ，ｂｏｕｎｄ）」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、２つの物質の間、あるいはそれらの組み合わせの間で、物理的または化学的に会合することを意味する。特に、本開示においては、接着性ポリペプチドとストレプトアビジン、中性アビジンまたはそれらの改変体等との間の相互作用は、本明細書における「結合」に該当する。本明細書では、「結合」は、特異的な相互作用に該当するため「特異的結合」ともいう。他方、接着または固定は非特異的な相互作用によるものである。

　本明細書において、「分離（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｓｅｐａｒａｔｅ）」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、「結合」した状態にある２つ以上の物質において、物質間の少なくとも一部の「結合」状態が解除されることを意味する。

　本明細書において、「崩壊（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｅ）」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、「凝集」した状態にある２つ以上の物質において、物質間の少なくとも一部の「凝集」状態が解除されることを意味する。

　本明細書において、「ＡｔａＡ」とは、グラム陰性細菌がもつ三量体オートトランスポーターアドヘシン（ＴＡＡ）ファミリーに属するタンパク質である。ＡｔａＡは、ホモ三量体を形成し、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、シグナルペプチド－Ｎｈｅａｄ－Ｎｓｔａｌｋ－Ｃｈｅａｄ－Ｃｓｔａｌｋ－メンブレンアンカーの順に並んだドメイン群構造を有する。さらにＮｈｅａｄ、Ｎｓｔａｌｋ、Ｃｈｅａｄ、Ｃｓｔａｌｋは、ＹｌｈｅａｄやＴｒｐ－ｒｉｎｇ、ＧＩＮ、ＦＧＧなど様々なドメインを、またドメインによっては反復して含む。各ドメインは、ｎｅｃｋやコイルドコイルなどの構造によって連結されている。Ｎ末端にシグナルペプチドを含まずに、先頭にメチオニンを付加し、かつ微生物細胞の外膜との結合部位を削除して、いわば細胞から分離状態にあるＡｔａＡの断片配列のアミノ酸配列および核酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。配列番号１および２において、Ｎｈｅａｄ（ｎｅｃｋを含む）は、アミノ酸２～２５８位、核酸４～７７４位に対応し、Ｎｓｔａｌｋは、アミノ酸２５９～２８４６位、核酸７７５～８５３８位、Ｃｈｅａｄ（ｎｅｃｋを含まない）は、アミノ酸２８５５～３０９３位、核酸８５６３～９２７９位に対応し、Ｃｓｔａｌｋ（βバレル内包部分を含む）は、アミノ酸３０９４～３５１８位、核酸９２８０～１０５５４位に対応する。さらに、Ｎｈｅａｄドメイン中には、接着性に関係するループ構造が２箇所存在し、これらのループ構造は、アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位、核酸６４～１５０位および４８１～５２５位にそれぞれ対応する。Ｃｈｅａｄは自己凝集に関与し得る。

　本明細書において、「アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）」とは、生物分類上のアシネトバクター属を意味する。アシネトバクター属には、代表的にＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株が包含される。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株は、排ガス処理リアクターから分離されたトルエン分解能を有する株であり、名古屋大学堀克敏研究室から入手可能である。本開示の接着性ポリペプチドは、アシネトバクター属に属するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株によって生産されるものを包含するが、これに限定されない。

　本明細書において、「機能性付与実体」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、任意の機能や作用を有するものを意味する。機能性付与実体は、本開示における接着性ポリペプチドまたはその断片によって結合され、その機能または作用としては、代表的に、医薬品・化成品工業の分離プロセス、再生医療、細胞工学、医用工学、バイオセンサー、表面改質や機能性材料の設計などの材料工学等において有用な各種機能または作用があり、標識などの機能が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、機能性付与実体は、タンパク質および／またはペプチドである。特定の実施形態では、機能性付与実体は、ストレプトアビジン、中性アビジンまたはそれらの改変体である。別の実施形態では、機能性付与実体は、細胞である。

　本明細書において、「ストレプトアビジン」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、ストレプトマイセス属によって産生されるストレプトアビジン、またはその変異体、誘導体もしくはその等価物を意味する。そのアミノ酸配列の例としては、Ｐ２２６２９－１、核酸配列はＸ０３５９１により特定されているものなどを挙げることができるがこれに限定されない。本明細書における「ストレプトアビジン」は、代表的にはビオチンに高親和性で結合する。本明細書における「中性アビジン」は、「ニュートラ（ア）ビジン」等と同じ意味で使用され、中性付近にｐＩ値有し、非特異的結合が抑制されたアビジンの改変体（特に、糖鎖除去体）を意味する。「中性アビジン」もまた、代表的にはビオチンに高親和性で結合する。「ストレプトアビジン」および「中性アビジン」は、本開示の接着性ポリペプチドと特異的に結合する特性を有する。

　本明細書において、「リポソーム」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、極性の親水性基と脂質性の親油基を含む両親媒性分子が形成する球状の自己集合体であり、脂質二重層構造を有し、水性媒体中で実質的に閉じた構造を形成する小胞を意味する。リポソームは、内部にＤＮＡ、タンパク質、ペプチド等を包含させることが可能である。特定の実施形態において、リポソームは、輸送小胞として使用される。別の実施形態において、リポソームは、人工細胞として有用である。

　本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸あるいは部分とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子（例えば、ＡｔａＡ等）において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドあるいは部分と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に接着性ポリペプチドにあっては、接着に必須の部位中の同様の位置に存在し接着性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ－Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、三量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。

　本明細書において、「融合」とは、２つ以上の分子（例えば、ポリペプチドまたは核酸）またはその一部が共有結合により連結されることを意味する。２以上の部分がポリペプチドであり、それらが共有結合した複合体の場合は、「融合」によって生じた融合体または融合物、あるいは融合タンパク質または融合ペプチドであり、キメラペプチドとも称しうる。通常、ポリペプチド融合体の場合、二種類のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列どうしを連結することにより核酸の融合体を作製し、それを設計図として融合ペプチドを組換えタンパク質として生産する。

　本明細書において、「複合体」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素、さらには細胞等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、非共有結合性の様式（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合され得る。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。また、共有結合以外の結合による複合体は、２以上の部分を簡単な方法により分離しえる。簡単な方法とは、例えば、攪拌などの物理的手段によってせん断応力を与える、化合物を添加する、ｐＨや塩濃度などの溶液条件を変える、温度変化を与える、といった操作が挙げられる。

　あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、接着性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。親水性指標もまた、改変体作製において考慮される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；およびトリプトファン（－３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。

　本開示において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

　本明細書で使用される（接着性ポリペプチド等の）「改変体」、「誘導体」、「類似体」または「変異体」は、交換可能に使用され、好ましくは、限定を意図するものではないが、対象となるタンパク質（例えば、接着性ポリペプチド）に実質的に相同な領域を含む分子を含み、アミノ酸配列、核酸配列（ヌクレオチド配列、塩基配列）の場合、このような配列は「改変配列」、「誘導配列」、「類似配列」、「変異配列」という。このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、（高度に）ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、タンパク質を改変した産物であり、その改変体または誘導体がなお元のタンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。改変体は、もとの配列に対して好ましくは７０％以上同一、より好ましくは８０％以上同一、さらに好ましくは９０％以上同一、さらにより好ましくは、９５％以上同一、９８％以上同一、９９％以上同一の配列を有し得る。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本開示のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。したがって、一つの実施形態では、本開示の改変体は機能的等価物を指す。

　本開示において、接着性ポリペプチドのフラグメントとは、接着性ポリペプチドの任意の領域を含むポリペプチドであり、本開示の目的（例えば、自己凝集せずに固定および／または接着させること）として機能する限り、必ずしも天然の接着性ポリペプチドの生物学的機能のすべてを有していなくてもよい。

　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。本開示のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの長さとしては好ましくは最小で２３７アミノ酸残基、最大で３３６４アミノ酸残基、より好ましくは、最小で２５６アミノ酸残基、最大で２８４６アミノ酸残基が挙げられうる。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、メチル化、トリメチル化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。本開示の実施形態に係るポリペプチドが「特定のアミノ酸配列」を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が塩、または溶媒和物を形成していてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸がＬ型、またはＤ型であってもよい。それらのような場合でも、本開示の実施形態に係るタンパク質は、上記「特定のアミノ酸配列」を含むといえる。タンパク質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えば、Ｎ末端修飾（例えば、アセチル化、ミリストイル化等）、Ｃ末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、または側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。アミノ酸は、本開示の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。

　本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’－Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ－５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’－メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　８：９１－９８（１９９４））。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。

　本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。

　本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。また、「相同性」の概念は同様に、アミノ酸配列についても該当し、その場合同一性の数値などはアミノ酸配列に置き換えて解釈し得る。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する融合体等のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは微生物、より好ましくは細菌におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本開示の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。

　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ２．７．１（２０１７．１０．１９発行）を用いて行うことができる。本明細書における「同一性」の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。「類似性」は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。

　本開示の一実施形態において「数個」は、例えば、１０、８、６、５、４、３、または２個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。１または数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている（Ｍａｒｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．１９８４　Ｓｅｐ；８１（１８）：５６６２－５６６６．、Ｚｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９８２　Ｏｃｔ　２５；１０（２０）：６４８７－６５００．、Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８４　Ｊｕｎ　２９；２２４（４６５６）：１４３１－１４３３．）。欠失等がなされたポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法、またはランダム変異導入法等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ　ＣＯ．，ＬＴＤ．）を使用できる。欠失等を導入した変異型ポリペプチドから、野生型と同様の活性のあるポリペプチドを選択することは、ＦＡＣＳ解析やＥＬＩＳＡ等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。

　本開示の一実施形態において同一性等の数値である「７０％以上」は、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％以上であってもよく、それら起点となる数値のいずれか２つの値の範囲内であってもよい。上記「同一性」は、２つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、上述したような公知の方法に従って算定される。具体的に説明すると、割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該分野で従来からよく知られている（例えば、上述したＢＬＡＳＴ等）。本明細書において「同一性」および「類似性」は、特に断りのない限りＮＣＢＩのＢＬＡＳＴによって測定された値で表すことができる。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Ｂｌａｓｔｐをデフォルト設定で使用できる。測定結果はＰｏｓｉｔｉｖｅｓまたはＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓとして数値化される。

　本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本開示のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、以下の条件を採用することができる。（１）洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム）、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる（例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、および７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、または（３）２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベーションし、次に約３７－５０℃で１×ＳＳＣでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は５０％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、５、１５、３０、６０、もしくは１２０分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はＡｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５～６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３８，ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第３番、Ｖｏｌ．１、７．４２－７．４５　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０－５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ－６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本開示において使用されるポリペプチドには、本開示で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。

　本開示の接着性ポリペプチドは、好ましくは「精製された」または「単離された」ものであり得る。本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本開示で用いられる物質または生物学的因子は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書で使用される「単離された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子が実質的に除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「単離された」は、その目的に応じて変動するため、必ずしも純度で表示される必要はないが、必要な場合、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本開示で用いられる物質は、好ましくは「単離された」物質または生物学的因子である。

　本明細書において「断片」または「フラグメント」とは、本明細書において同じ意味で使用され、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１～ｎ－１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。断片の長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本開示のポリペプチドの断片としては、２３７以上、３３６４以下が好ましく、より好ましくは２５６以上、２８４６以下が挙げられ、例えば下限は、２３７アミノ酸、２５６アミノ酸、３００アミノ酸、４００アミノ酸、５００アミノ酸、６００アミノ酸、７００アミノ酸、８００アミノ酸、９００アミノ酸、１０００アミノ酸などであり得、上限は、１０００アミノ酸、１１００アミノ酸、１２００アミノ酸、１３００アミノ酸、１４００アミノ酸、１５００アミノ酸、１６００アミノ酸、１７００アミノ酸、１８００アミノ酸、１９００アミノ酸、２０００アミノ酸、２１００アミノ酸、２２００アミノ酸、２３００アミノ酸、２４００アミノ酸、２５００アミノ酸、２６００アミノ酸、２７００アミノ酸、２８００アミノ酸、２８４６アミノ酸、２９００アミノ酸、３０００アミノ酸、３１００アミノ酸、３２００アミノ酸、３３００アミノ酸、３３６４アミノ酸であり得るがこれに限定されるものではなく、所望の特性（例えば、自己凝集性の欠如、接着性の維持）が維持される限り、これら以外の長さでもよい。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このような断片は、例えば、全長のものが接着性分子として機能する場合、その断片自体もまた接着性ポリペプチドとしての機能を有する限り、本開示の範囲内に入ることが理解される。

　本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内または生体外において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、接着性等を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、対応する「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、接着性）を発揮する活性が包含される。「生物学的活性」は、生体内で発揮される活性であっても、分泌などによって生体外で発揮される活性であってもよい。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度も含まれ得る。

　本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様である。したがって、本明細書において「発現産物」とは、このようなポリペプチドもしくはタンパク質、またはｍＲＮＡを含む。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。例えば、接着性ポリペプチドの発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、接着性ポリペプチドのｍＲＮＡの量、接着性ポリペプチドの量、そして接着性ポリペプチドの生物学的な活性を評価することによって、接着性ポリペプチドの発現レベルを知ることができる。接着性ポリペプチドのｍＲＮＡやポリペプチドまたはタンパク質の量は、本明細書の他の箇所に詳述したような方法あるいは他の当該分野において公知の方法によって決定することができる。

　本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、本開示の「接着性ポリペプチド」の機能的等価物は、本開示の接着性ポリペプチド自体ではないが、その変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、その接着性ポリペプチドの持つ生物学的作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、その接着性ポリペプチドの持つ生物学的作用を持つ変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、その変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本開示において、接着性ポリペプチドの機能的等価物は、格別に言及していなくても、接着性ポリペプチドと同様に用いられうることが理解される。機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　８５：２４４４－２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本開示において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。

　本開示（ポリペプチドなど）の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、配列番号１または４のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。

　本明細書において「支持体」とは、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞、細菌、またはウイルスさらには糖、脂質、その他の低分子を担持することができる物質をいう。支持体として使用するための材料には、固体表面を形成し得る任意の物質が使用され得るが、例えば、脂質二重構造体（例えば、リポソーム）、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、チタン、アクリル、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、セルロース、キトサン、デキストラン、ナイロン、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ乳酸、およびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ））が挙げられるがそれらに限定されない。

　本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、酵素や緩衝液、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、酵素）をどのように使用するか、あるいは、試薬あるいは使用後の廃液をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、酵素等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。

　本明細書において「指示書」は、本開示を使用する方法を使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本開示の使用方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、必要な場合は、本開示が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省または農林水産省等、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）、農務省（ＵＳＤＡ）など）が規定した様式に従って作製され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、紙媒体で提供され得るが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。

　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。

　（自己凝集性を有しない接着性ポリペプチド）
　１つの局面において、本開示は、自己凝集性を有さず、かつ接着性を有する、接着性ポリペプチドの新規の断片またはその改変体、およびそれをコードする核酸を提供する。

　代表的局面において、本開示は、ＡｔａＡの断片またはその改変体であって、自己凝集性を有さず接着性を有するものを提供する。

　ある実施形態において、本開示は、代表的に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株から得られる、接着性ポリペプチドの代表的配列およびその改変体を提供する。

　１つの実施形態において、本開示は、自己凝集性を有さず、かつ接着性を有する、配列番号１に示すアミノ酸配列の断片またはその改変体を含むポリペプチドを提供する。

　特定の実施形態では、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を含み、かつ配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８４７～３０９３位に対応する配列の範囲に１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む。好ましくは、上記配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８４７～３０９３位に対応する配列の範囲は、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８５５～３０９３位に対応する範囲である。より好ましくは、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８５５～３０９３位に対応する配列のすべてを欠失する。特定の実施形態では、上記改変配列は、保存的置換による改変を含む。

　特定の実施形態において、本開示は、
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～３５１８位に対応する配列またはその改変配列またはその断片において、
　配列番号１のアミノ酸２８５５～３０９３位に対応する配列に少なくとも１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含み、
　配列番号１のアミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する配列を含む、ポリペプチド；
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～３０９３位に対応する配列またはその改変配列またはその断片において、
　アミノ酸２８５５～３０９３位に対応する配列に少なくとも１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含み、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する配列を含む、ポリペプチド；
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８４６位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～３５１８位の一部（ここで、「一部」とは、全長配列に対して、欠損している部分があるものを指し、断片の他、中間部分が欠落している配列も包含する。）を含み、
　配列番号１のアミノ酸２８５５～３０９３位に対応する配列に少なくとも１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含み、
　配列番号１のアミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；
（５）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；
（６）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；または
（７）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド
である、ポリペプチドを提供する。

　特定の実施形態では、本開示は、
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８４６位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド；または
（ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位に対応する配列またはその改変配列またはその断片であって、
　アミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を有する、ポリペプチド
であるポリペプチドを提供する。

　特定の実施形態では、本開示は、
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である、ポリペプチド；
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８４６位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である、ポリペプチド；
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である、ポリペプチド；または
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である、ポリペプチド；
である、ポリペプチドを提供する。

　特定の実施形態では、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位または２位～２８５４位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である。好ましくは、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位または２位～２８５４位に対応するアミノ酸配列からなる。

　特定の実施形態では、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１位～２８４６位または２位～２８４６位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である。好ましくは、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１位～２８４６位または２位～２８４６位に対応するアミノ酸配列からなる。

　特定の実施形態では、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位または２～２６８位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である。好ましくは、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位または２～２６８位に対応するアミノ酸配列からなる。

　特定の実施形態では、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位または２～２５７位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片である。好ましくは、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位または２～２５７位に対応するアミノ酸配列からなる。

　一部の実施形態では、本発明の接着性ポリペプチドは、アシネトバクター菌由来である。特定の実施形態では、上記アシネトバクター菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株である。

　一部の実施形態では、本開示の接着性ポリペプチドは、配列番号１とは異なるアミノ酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、上記異なるアミノ酸配列は、本開示の接着性ポリペプチドと融合されている。一実施形態では、上記異なるアミノ酸配列は、ＳＮＡＰタンパク質をコードするアミノ酸配列である。

　特定の実施形態では、本開示は、本開示の接着性ポリペプチドと、機能性付与実体との複合体を提供する。

　１つの実施形態では、本開示のポリペプチドまたはその機能性付与実体との複合体は、第一の対象を第二の対象に接着および／または固定化する能力、または自己凝集しない能力またはその両方を有し得る。

　１つの実施形態では、本開示のポリペプチドまたはその機能性付与実体との複合体は、上記第一の対象を単層で接着させる能力を有する。

　特定の実施形態において、上記第一の対象と上記第二の対象とは同じである。別の実施形態では、上記第一の対象と上記第二の対象とは異なる。

　１つの実施形態では、上記第一の対象または上記第二の対象の少なくとも１つは、機能性付与実体である。機能性付与実体としては、バイオセンサー、生体分子の分離・標識、再生医療、バイオ・有機・無機ハイブリッド材料の生産、表面改質・機能化、発酵工業、医薬品工業、化成品工業、バイオ燃料の製造、排水処理、バイオレメディエーション等に有用な機能を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、機能性付与実体は、タンパク質および／またはペプチドである。さらに具体的な実施形態では、機能性付与実体は、ストレプトアビジン、中性アビジン、それらの誘導体、酵素、抗体、蛍光分子、受容体、機能性ペプチド（抗菌・蛍光・シグナル因子・誘導因子等）、核酸アプタマー、血清成分等である。

　１つの実施形態では、本開示のポリペプチド、融合ポリペプチド、またはその機能性付与実体との複合体は、細胞を接着および／または固定化するために使用される。接着および／または固定化される細胞は、任意の細胞であり、例えば、動物細胞、植物細胞および微生物細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。

　１つの実施形態では、上記第二の対象は、支持体である。特定の実施形態では、上記支持体は、リポソームである。

　１つの実施形態では、本開示のポリペプチド、融合ポリペプチド、またはその機能性付与実体との複合体は、上記ポリペプチドが含む、ＡｔａＡとは異なるアミノ酸配列のポリペプチド、または上記複合体が含む機能性付与実体を、第二の対象に接着させる能力を有する。

　（接着性ポリペプチドの生産）
　１つの実施形態では、本開示の接着性ポリペプチドおよび融合ポリペプチドは、微生物を使用する発現系によって生産される。

　本開示の接着性ポリペプチド、またはその融合ポリペプチドは、大腸菌に組換えタンパク質として、通常、実験室でよく行われている通りの方法で生産させることができる。すなわち、ＡｔａＡの断片または該断片にペプチドを融合した融合ペプチドをコードする遺伝子を、ｐＥＴシステムなど適切な大腸菌発現ベクターの適切な位置に挿入し、大腸菌を形質転換し、誘導物質を加えて遺伝子発現を誘導するか、恒常発現プロモーター下で恒常発現させる。該タンパク質は、細胞質内に生産させることが多いが、ペリプラズム中に分泌生産させることも可能である。後者の場合、ＡｔａＡタンパク質が本来有しているシグナルペプチドあるいは、大腸菌発現ベクターに組み込まれているシグナルペプチドをコードする遺伝子配列を、該タンパク質をコードする５’末端側につなぐことで、該タンパク質のアミノ末端側にシグナルペプチドが付加される形式で該タンパク質が生産される。なお、シグナルペプチドは、生産された該タンパク質がペリプラズムに分泌されると切断除去されるので、得られるＡｔａＡ断片またはその融合タンパク質は、シグナルペプチドを含んでいない。細胞内に生産された該タンパク質は、可溶化成分から分離精製することが通常であるが、インクルージョンボディから分離したのち、巻き戻しによって活性を有するタンパク質として得てもよい。なお、生産されたタンパク質は、あらかじめ該タンパク質に融合したＨｉｓタグやストレプトタグなどを利用して、通常用いられるアフィニティ精製法によって分離精製することができる。さらに、ＳＮＡＰタンパク質などが融合されている場合は、ベンジルグアニル（ＢＧ）基を有する分子を利用して、分離精製してもよい。さらに精製度をあげる場合、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過などを併用してもよい。

　この微生物を使用する接着性ポリペプチドの生産方法において、接着性ポリペプチドを発現させる方法、接着性ポリペプチドを発現させる宿主、宿主から分泌された接着性ポリペプチドの精製方法等の詳細な条件は、当業者によって適宜調整される。さらに、本開示の接着性ポリペプチドは、微生物の菌体内発現系以外にも、分泌生産系、無細胞発現系等の種々の発現系を使用して発現させることもできる。

　上述の微生物に本開示の接着性ポリペプチドを含む目的のポリペプチドを生産させるための方法は、単なる例示であり、当業者は、本技術分野で慣用される手法によって、本開示の遺伝子の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列を参考に、合成遺伝子を作製することで、発現ベクターに挿入するＤＮＡ断片の設計および構築を容易に行うことができる。

　（ポリペプチドの使用）
　一つの局面において、本開示の接着性ポリペプチドは、材料工学プロセスに有用である。他の局面では、本開示の接着性ポリペプチドは、バイオプロセスを使用する工業に有用である。ある実施形態では、本開示の接着性ポリペプチドは、タンパク質、ペプチドまたは細胞を高密度に密集させて固定することによって、表面改質、材料設計等の材料工学プロセス、発酵工業、医薬品工業、化成品工業、バイオ燃料の製造、排水処理、バイオレメディエーション、再生医療、細胞工学、医用工学、バイオセンサー等の技術分野におけるバイオプロセスを効率的に実施することができる。

　別の局面では、本開示の接着性ポリペプチドは、酵素などを含有させたリポソームを固定して、バイオセンサーや環境浄化などに利用することも可能である。特に環境中で使用する場合、生きている細胞と異なり増殖はできないため、組換え遺伝子やタンパク質を使用してもバイオハザードや生態系破壊のリスクがほぼないという利点がある。

　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその４ｔｈ　Ｅｄ．（２０１２）、岡田雅人、宮崎香、２０１１年、「タンパク質実験ノート　改訂第４版」上巻および下巻、羊土社などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

　（注記）
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。

　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

　以下に実施例を記載する。以下の実施例で用いる生物の取り扱いは、必要な場合、名古屋大学や監督官庁およびカルタヘナ法において規定される基準を遵守した。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、富士フイルム和光純薬、ナカライテスク、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＩＮＣ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、関東化学、フナコシ、東京化成、Ｍｅｒｃｋ等）の同等品でも代用可能である。

　（実施例１：細胞凝集においてＡｔａＡと共に凝集塊を形成する細胞表層分子の探索）
　本実施例では、図１Ａの実験モデルに示される実験手法によって得られた、顕微鏡観察による細胞の凝集解析を示す。

　（方法）
　ｍＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）を発現し、正常なＡｔａＡタンパク質を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株と、ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現し、正常なＡｔａＡタンパク質を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株、またはΔＡｔａＡ株とを均一に混合した。形成された細胞凝集を顕微鏡下で観察し、取得された画像を微小領域に区切って、ＥＧＦＰを発現する細胞の割合を計算した。

　（結果）
　図１Ｂは、ＥＧＦＰを発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株と、ｍＲＦＰを発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株とを混合して形成された細胞凝集塊の画像および微小区画中のＥＧＦＰを発現する細胞の割合のヒストグラムを示す。どちらの蛍光タンパク質発現株も、正常なＡｔａＡタンパク質を発現している。図１Ｃは、正常なＡｔａＡタンパク質とｍＲＦＰを発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株と、ＥＧＦＰを発現するΔＡｔａＡ株とを混合して形成された細胞凝集塊の画像および微小区画中のＥＧＦＰを発現する細胞の割合のヒストグラムを示す。図１Ｂにおいて、ＥＧＦＰを発現する細胞は、細胞塊中に均一に存在し、ＥＧＦＰを発現する細胞の割合のヒストグラムは中央にピークを示した。これに対し、図１Ｃにおいて、ＥＧＦＰを発現する細胞は、細胞塊中に取り込まれず、ＥＧＦＰを発現する細胞の割合のヒストグラムは端にピークを示した。

　（考察）
　ＡｔａＡを発現する細胞は、他の細胞表層分子とは凝集塊を形成せず、ＡｔａＡを発現する細胞と凝集することが示された。すなわち、Ｔｏｌ５株の細胞自己凝集は、ＡｔａＡ分子同士の相互作用によるものであることが示された。

　（実施例２：自己凝集ドメインの探索）
　本実施例では、ＡｔａＡタンパク質のうちの自己凝集に関係するドメインの探索を行った。

　（方法）
　（１）Ｎｈｅａｄが欠損した構造のＡｔａＡ（配列番号７）、（２）、（３）および（４）Ｎｓｔａｌｋ内の一部が欠損した構造のＡｔａＡ（それぞれ配列番号９、１１および１３）、（５）Ｎｓｔａｌｋ内の一部に加え、Ｃｈｅａｄを欠損させた構造のＡｔａＡ（配列番号１５）、（６）Ｃｓｔａｌｋの大部分が欠損（ＦＧＧドメインは保存）した構造のＡｔａＡ（配列番号１７）を設計した（図２Ａ）。なお、各部分欠損体の構築は、ドメインアノテーションに基づいて構造を壊さないようにドメイン間のつなぎの部分で切断、削除し再結合するか、やむを得ずドメイン内で切断する場合でも、ＡｔａＡ内に存在する繰り返し配列を利用することで、欠損後もそのドメインとアミノ酸配列が保存されているようにつないだ。さらに、ドメイン内にあって繰り返し配列も利用できない場合は、コイルドコイルの周期性を利用して、切断、削除、再結合後にコイルドコイルの周期性が復活するようにした。

　各部分欠損体について、ａｔａＡ遺伝子をクローニングしてあるｐＡｔａＡ、ｐＤＯＮＲ２２１：：ａｔａＡ、合成遺伝子断片を利用して発現コンストラクトを構築した。発現コンストラクトを保有するドナー株Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｓ１７－１（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．；Ｐｒｉｅｆｅｒ，Ｕ．；Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ．，Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌ１９８３，１，（９），７８４－７９１）との接合により、Ｔｏｌ５のａｔａＡ遺伝子欠損変異株である４１４０株を形質転換し、各部分欠損体を発現する形質転換株（ドメイン欠損株）を得た。全長ＡｔａＡを発現する野生株はｍＲＦＰの遺伝子で、ドメイン欠損株はＥＧＦＰの遺伝子で形質転換し、それぞれ赤色、緑色蛍光を示す株を作製した。そして、これらの形質転換株を使用して、実施例１に記載の方法と同様の手法によって、細胞凝集特性を評価した。

　（結果）
　結果を図２Ｂに示す。正常なＡｔａＡタンパク質を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株と、（１）Ｎｈｅａｄが欠損した構造のＡｔａＡタンパク質を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株とを混合した場合には、ＥＧＦＰを発現するドメイン欠損株細胞の細胞塊への取り込みが認められなかった。一方で、（１）以外の部分欠損体を発現させたドメイン欠損株細胞は、細胞塊中に均一に存在し、ＥＧＦＰを発現する細胞の割合のヒストグラムは中央にピークを示した。

　（考察）
　（１）全長のＡｔａＡタンパク質を発現するＴｏｌ５野生株は、Ｎｈｅａｄが欠損した構造のＡｔａＡタンパク質を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株のみと凝集できず、Ｎｈｅａｄ以外の部位を欠損した構造のＡｔａＡタンパク質を発現するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株とは凝集できたことから、ＡｔａＡのＮｈｅａｄ同士が微生物細胞の自己凝集、つまりＡｔａＡ同士の相互作用に必須であることが示された。すなわち、Ｎｈｅａｄ同士が自己凝集することで、ＡｔａＡの分子間相互作用を引き起こすことが示唆された。

　（実施例３：Ｎｈｅａｄ組換えタンパク質の設計・作製とフォールディングの解析）
　本実施例では、ＡｔａＡのＮｈｅａｄドメインを、正常にフォールディングされる組換えタンパク質として発現させるためのコンストラクトの設計を行った。

　（方法）
　（コンストラクトの構築）
　今回、初めて、ＡｔａＡの接着と自己凝集性を担う機能部位であるＮｈｅａｄを組換えタンパク質として大腸菌に作らせることととした。Ｎｈｅａｄ組換えタンパク質のコンストラクト設計（配列番号１９）を図３Ａに示す。ＡｔａＡは同種のポリペプチド鎖が三本集まってホモ三量体を形成することで、正しくフォールディングされ、機能を発揮する。組換えタンパク質のコンストラクトの設計は非常に難しく、三量体がきちんと形成され、正しくフォールディングされるように設計することは、タンパク質工学の専門家にとっても容易ではない。Ｎｈｅａｄの構造は主としてβストランドで構成されることが、一次構造（アミノ酸配列）から想定された。βストランドの会合による三量体の形成は困難が予想され、ＮｈｅａｄのＣ末側に存在するｎｅｃｋもコンストラクトに含める必要があると考えた。さらに、三量体形成を促進することが知られているコイルドコイル構造であるＧＣＮ４ｐＩＩタグを、Ｎｈｅａｄにつなげることとした。ＧＣＮ４ｐＩＩとうまくつながるように、ＮｓｔａｌｋのＮ末側先端にあるＦＧＧドメインの一部であるコイルドコイルを介してＧＣＮ４ｐＩＩタグにつなげることで、コイルドコイルの周期性を維持する設計とした。さらに、分離精製を容易にするため、ＧＣＮ４ｐＩＩタグのＣ末側にＨｉｓタグも導入した。このように設計されたＮｈｅａｄ組換えタンパク質（ＡｔａＡの配列の５９～３２５位のアミノ酸断片：配列番号１の２～２６８位のアミノ酸断片に対応する）のアミノ酸配列を図３Ｃに示す。これには、配列の由来も示してある。このコンストラクトを作製するため、ｐＩＢＡ－ＧＣＮ４ｔｒｉ－Ｈｉｓベクターの制限酵素ＸｂａＩ／ＢｓａＩ消化断片に、配列番号１のアミノ酸１～２６８位をコードする遺伝子断片を挿入し、ｐＩＢＡ：：Ｎｈｅａｄ組換えＤＮＡ（ｐＩＢＡ－ＧＣＮ４ｔｒｉ－Ｈｉｓ：：ａｔａＡ_{５９－３２５}）を作製した。精製したＮｈａｅｄ組換えタンパク質がきちんとフォールディングされているかどうかを知る指標として、ＣＤスペクトルによる二次構造の解析を行った。

　（Ｎｈｅａｄ組換えタンパク質の精製）
　ＢＬ２１　ｓｔａｒ（ＤＥ３；ｐＩＢＡ－ＧＣＮ４ｔｒｉ－Ｈｉｓ：：ａｔａＡ_{５９－３２５}）を終夜培養した培養物を、ＬＢ培地中で１：１００に希釈し、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、培地中に０．２μｇ／ｍｌの無水テトラサイクリン（ＡＨＴＣ）を添加し、さらに２８℃で６時間インキュベートした。細胞を４℃、５，０００×ｇで１５分間遠心分離を行うことによって回収し、溶解バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび２０ｍＭ　イミダゾール、ｐＨ９．０）に再懸濁し、高圧ホモジナイザー（ＬＡＢ　２０００、株式会社エスエムテー）を使用して、１，０００ｂａｒで１０分間溶解した。４℃において１０，０００×ｇで１５分間遠心分離後、上清をＮｉ－ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｑｉａｇｅｎ　ＮＶ）にロードし、溶解バッファーで２回洗浄することによって、未結合のタンパク質を除去した。結合したタンパク質を溶出バッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび４００ｍＭ　イミダゾール、ｐＨ９．０）により溶出した。溶出されたタンパク質を、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＨＰ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、組換えタンパク質を含むフロースルー画分を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。次いで、組換えタンパク質を陽イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ　ＳＰ　ＨＰ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、０～１，０００ｍＭ　ＮａＣｌの直線的な濃度勾配により精製した。組換えタンパク質を含むピーク画分を、遠心式フィルターデバイス（Ａｍｉｃｏｎ　ｕｌｔｒａ、ＥＭＤ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した限外ろ過によって濃縮し、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ９．０）で平衡化したゲルろ過カラム（ＨｉＬｏａｄ　２６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードして、ゲルろ過精製した。

　（精製されたＮｈｅａｄ組換えタンパク質のフォールディングの解析）
　精製されたＮｈｅａｄ組換えタンパク質のＣＤスペクトルを、Ｊ－７２５　ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ（日本分光株式会社）を使用して測定した。パラメータは、波長１９０～２５０ｎｍ、スキャン速度１００ｎｍ／分、スキャン間隔０．１ｎｍ、レスポンス０．２５秒およびバンド幅１．０ｎｍに設定した。

　（結果）
　ＣＤスペクトルの解析の結果、大腸菌に作らせ精製したＮｈｅａｄ組換えタンパク質は、ランダムコイル状態ではなく二次構造を形成していることが示され、フォールディングされていると推定された（図３Ｂ）。そこで、結晶化を行い、Ｎｈｅａｄの結晶構造を決定した。その結果、Ｎｈｅａｄには、他のＴＡＡのｈｅａｄドメインには見られない特徴的な２つのループ（第１ループと第２ループ）が存在することがわかった。

　（実施例４：Ｎｈｅａｄ上のループの機能評価）
　Ｎｈｅａｄに特徴的な第１および第２のループが、ＡｔａＡの非特異的な接着性に関与しているかどうかを調べた。

　（方法）
　（ＡｔａＡ変異株の作製）
　クローニング済みのａｔａＡ遺伝子断片を利用して、インバースＰＣＲにより、各ループを一つずつ欠損させた変異体（配列番号２１および２３）を作製し、Ｔｏｌ５のａｔａＡ遺伝子欠損変異株である４１４０株（ΔａｔａＡ）に導入して発現させた。これらループ欠損変異株と、比較のため野生株（ＡｔａＡ）、ΔａｔａＡおよびＮｈｅａｄ欠損株（ΔＮｈｅａｄ、配列番号７）を、ポリスチレン（ＰＳ）プレートおよびガラスプレートを用いた微生物付着試験に供した。

　（方法）
　（微生物付着試験）
　回収した細胞を超純水で３回洗浄し、ＯＤ_６６０が０．５となるようにＢＳ－Ｎ培地中に懸濁した。細胞懸濁物（各２００μＬ）を９６穴のポリスチレン（ＰＳ）またはガラスプレートのウェル中に入れた。振とうせずに２８℃で２時間インキュベート後、細胞懸濁物をマイクロピペットにより除去し、各ウェルを１２０μＬのＢＳ－Ｎ培地で３回リンスした。固定化した細胞は、２００μＬの０．１％クリスタルバイオレット溶液によって１５分間染色した。２００μＬのＢＳ－Ｎ培地による３回のリンス後、色素を２００μＬの７０％エタノールを使用して細胞から溶出させ、溶出液の５９０ｎｍにおける吸光度（Ａ５９０）を、マイクロプレートリーダーによって測定した。ＢＳ－Ｎ培地の組成については、論文（Ｓ．Ｉｓｈｉｉ，Ｊ．Ｋｏｋｉ，Ｈ．Ｕｎｎｏ，Ｋ．Ｈｏｒｉ；Ｔｗｏ　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｅｎｄａｇｅｓ　ｏｎ　ａ　Ｓｔｒｏｎｇｌｙ　Ａｄｈｅｓｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ,　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ.　Ｓｔｒａｉｎ　Ｔｏｌ５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０，（２００４）５０２６－５０２９）と論文（Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．Ｔａｎｊｉ，Ｈ．Ｕｎｎｏ，Ｋ．Ｈｏｒｉ；Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｌｕｅｎｅ　ｂｙ　ａｎ　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．Ｔｏｌ５　Ｍｕｔａｎｔ　Ｓｈｏｗｉｎｇ　Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ　Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｗａｔｅｒ－Ｏｉｌ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０６　（２００８）２２６-２３０）に記されている。

　（結果）
　接着試験の結果を図４に示す。図４のグラフは、微生物の接着性を、Ａ_５９０により測定した結果を示す。第１および第２のループ欠損株は接着性が大きく低下している結果となった。よって、これら二つのループがＡｔａＡの接着に必須であることが判明した。

　（実施例５：大腸菌で発現させた組換えＮｈｅａｄの自己凝集性評価）
　Ｎｈｅａｄ組換えタンパク質の精製時に、凝集しない試料を得ることができた。そこで、本実施例では、大腸菌で発現させた組換えＮｈｅａｄについて、動的光散乱法（ＤＬＳ）により自己凝集性を評価した。

　（方法）
　組換えタンパク質を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ緩衝液に溶解して試料溶液を調製した。４０μＬの試料溶液を石英セルに入れ、Ｈｅ－Ｎｅレーザー（波長６３３ｎｍ）を装着したＤＬＳ測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳＰ、Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）にて粒形を測定した。温度は２５℃、平衡時間１２０秒、散乱角１７３°の条件で測定した。

　（結果および考察）
　結果を図５に示す。全くの予想外のことに、大腸菌で発現させた組換えＮｈｅａｄは、自己凝集性を示さなかった。したがって、大腸菌で発現させた組換えＮｈｅａｄは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株において発現したＡｔａＡ上のＮｈｅａｄとは異なる性質を示すことが明らかになった。

　（実施例６：Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株の凝集塊の特徴）
　発明者は、偶然にも、ＡＶＬペプチドがＮｈｅａｄの第１および第２ループに相互作用し、ＡｔａＡによるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株細胞の凝集塊を崩壊させる機能を有することを見出した。本実施例では、該ペプチドによるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株の凝集塊の崩壊について顕微鏡観察を行った。

　（方法）
　フローセル内の、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株の凝集塊、およびＡＶＬペプチド存在下でのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株を、顕微鏡を用いて観察した。フローセルは下記のとおり自作したものを用いた。

　（フローセルの作製）
　本開示において構築したフローセルシステムの基本構造は、細胞懸濁物または流体を送流するためのシリコーンチューブに細胞を観察するためにガラスチューブを連結したものである。直方体のフローセルシステムを構築するために、長さが３００ｍｍであり、内径が１ｍｍであり、外径が２ｍｍであるシリコーンチューブを、長さが５０ｍｍであり、各内径寸法が１ｍｍである直方体ガラス（Ｖｉｔｒｏｃｏｍ）の両端に連結し、その連結部をパラフィンフィルムでシールした。入口のシリコーンチューブを、三方活栓（テルモ株式会社）を介してシリンジポンプ（Ｌｅｇａｔｏ　２００、ＫＤ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結し、直方体のガラスチューブの細胞観察部（フローセル）に流体を送流した。

　上記フローセルにＢＳ－Ｎ培地に懸濁したＴｏｌ５細胞懸濁液を６４μｌ／ｍｉｎの速度で３０分間流して、ガラス製フローセルにＴｏｌ５細胞の凝集塊を付着させた。その後、０．１ｍＭのＡＶＬペプチドを含むＢＳ－Ｎ培地を同速度で流し、付着したＴｏｌ５細胞凝集塊の挙動を、デジタル顕微鏡（キーエンス社製ＶＨＸ－２００）で観察した。

　（結果および考察）
　結果を図６に示す。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株の細胞凝集塊は、ＡＶＬペプチドにより崩壊する様子が観察された。該ペプチドを含まない培地を同速度で流しても、凝集塊は全く影響を受けなかった。このことより、ＡＶＬペプチドは、ＡｔａＡのＮｈｅａｄ同士の自己凝集を崩壊させる機能があることがわかった。

　（実施例７：大腸菌組換えＮｈｅａｄの接着性の計測）
　本実施例では、大腸菌で発現させた組換えＮｈｅａｄの接着性を、ＱＣＭ－Ｄによって計測した。

　（方法）
　組換えＮｈｅａｄタンパク質（配列番号１９）をＰＢＳ溶液中に５０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させて試料液を準備した。装置はＱ－Ｓｅｎｓｅ　Ｅ４（Ｂｉｏｌｉｎ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、センサーにはポリスチレン（ＰＳ）製またはシリカ製のものを使用した。まず、２５０μｌ／分の流量でＰＢＳ緩衝液を流して装置が安定するまで待った。その後、試料液を同じ流速で１．５分間流し、流れを止めて１５分間静置後、再び試料液を同流速で１．５分間流した。再び流れを止めて１０分間静置後、ＰＢＳ緩衝液を同流速で１分間流すことでリンスを行い、さらに流れを止めて５分間静置した。続いて、０．１ｍＭのＡＶＬペプチド溶液を同流速で２分間流し、流れを止めてから１５分間静置した。最後にＰＢＳ緩衝液を同流速で２分間流してから流れを止め、１０分間静置して測定を終了した。

　（結果）
　結果を図７Ａおよび７Ｂに示す。ポリスチレンセンサーおよびシリカセンサーのいずれを使用した場合でも、Ｎｈｅａｄ添加後すぐにΔｆ７／７（Ｈｚ）値が低減し、平衡状態に達した。その後のＮｈｅａｄの再供給工程、緩衝液によるリンス工程、ＡＶＬペプチドの添加工程、２回目の緩衝液によるリンス工程を経ても、Δｆ７／７（Ｈｚ）値の変化は認められなかった。

　（考察）
　大腸菌組換えＮｈｅａｄを添加すると瞬時にセンサーへ接着し、平衡に達したと考えられた。その後、大腸菌組換えＮｈｅａｄ溶液を再供給しても、Δｆ７／７（Ｈｚ）値の変化は認められなかったことから、Ｎｈｅａｄは新たに接着しなかったと考えられた。これらのことから、大腸菌組換えＮｈｅａｄは、ポリスチレン、シリカ表面への接着力は有するが、積層はしないと考察される。これは、大腸菌組換えＮｈｅａｄが自己凝集性を有しないことを反映している。また、緩衝液によるリンス程度では、表面に接着した大腸菌組換えＮｈｅａｄは剥がれないと考えられる。続いて、ネイティブＮｈｅａｄの自己凝集を崩壊させるＡＶＬペプチドを供給しても、分離は認めらなかった。この事実からも、大腸菌組換えＮｈｅａｄは自己凝集性を示さず、積層接着もしていないことがわかる。再リンスによる分離も認められなかった。以上より、大腸菌組換えＮｈｅａｄは積層せずに、固体表面に単層接着することが判明した。なお、Ｎｈｅａｄの再供給、リンス、ＡＶＬペプチドの供給、再リンスによるシグナルの若干の変動は、操作によるノイズと考えられる。

　（実施例８：ＷＣｈｅａｄを発現する細胞の自己凝集性および微生物固定化率）
　実施例７までで、微生物細胞上のＡｔａＡの先端に存在するとき、Ｎｈｅａｄは接着性と自己凝集性を発揮するが、大腸菌で生産させた組換えＮｈｅａｄタンパク質は接着性のみを示し、自己凝集性を示さないという、研究当事者にとっても予測不可能で不可解な結果が得られた。応用的側面からすると、組換えＮｈｅａｄタンパク質のこの予想外の特性は、材料表面に単層接着するという有用な機能をもたらすものである。そこで、この理由を解明するために、Ｎｈｅａｄ以外のドメインの機能をより詳細に探ることとした。Ｃｈｅａｄは、微生物細胞上のＡｔａＡ上に存在するときは、接着と自己凝集性には関与しないということが公的事実となっている（Ｋ．Ｋｏｉｗａｉ，Ｍ．Ｄ．Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｄ．Ｌｉｎｋｅ，Ａ．Ｎ．Ｌｕｐａｓ　ａｎｄ　Ｋ．Ｈｏｒｉ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｏｕｇｈｎｅｓｓ　ａｎｄ　ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｐａｓｓｅｎｇｅｒ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ａｎ　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｔｒｉｍｅｒｉｃ　ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ａｄｈｅｓｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９１（２０１６）３７０５－３７２４．）。しかし、ＣｈｅａｄはＡｔａＡファイバーの根元の方に存在する。この場所ではＣｈｅａｄは表面や他のＡｔａＡ分子と相互作用するのが難しいが、Ｎｈｅａｄと同様にＡｔａＡファイバーの先端にあれば、類似の構造（Ｙｌｈｅａｄ）をもつＣｈｅａｄも接着や自己凝集の機能を発揮するのではないかとの仮説を立てた。そこで、ＡｔａＡのＮｈｅａｄをＣｈｅａｄに置換したＷＣｈｅａｄ変異株を作製することとした。本実施例では、ＷＣｈｅａｄを発現する微生物細胞の自己凝集性および微生物固定化率の測定を行った。

　（方法）
　ＷＣｈｅａｄ改変体は、全長のＡｔａＡタンパク質のＮｈｅａｄドメインを欠損させ、その領域にＣｈｅａｄドメインを組み込むことによって、Ｃｈｅａｄ－Ｎｓｔａｌｋ－Ｃｈｅａｄ－Ｃｓｔａｌｋのドメイン群構造をとるように作製した（配列番号２５）。このＷＣｈｅａｄ株と野生株（ＡｔａＡ）、ΔＡｔａＡ株、ΔＮｈｅａｄ株の細胞接着性を比較した。接着性については、図４と同じ接着試験方法で試験した。また、自己凝集試験のために、微生物細胞をＢＳ－Ｎ培地に初期ＯＤ_６６０が０．５になるように懸濁した菌懸濁液を調製した。この懸濁液を使用して、試験管沈降法（ｔｕｂｅ－ｓｅｔｔｌｉｎｇ　ａｓｓａｙ）によって自己凝集性を調べた。本方法の詳細な手順は、Ｍ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．Ｓｈｉｇｅｍｏｒｉ，Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ，ａｎｄ　Ｋ．Ｈｏｒｉ；Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ　ｏｆ　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．Ｔｏｌ５　ｔｏ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｕｒｆａｃｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１３（２０１２）７１９－７２５．に記載の通りである。ただし、試験管の静置時間は３時間とした。

　（結果）
　結果を図８Ａおよび８Ｂに示す。図８Ａにおいて、野生型のＡｔａＡで認められた自己凝集性は、ΔＮｈｅａｄ欠損株において消失していたことから、Ｎｈｅａｄが自己凝集性に関係していることが改めて示された。さらに、ＷＣｈｅａｄを発現させると自己凝集性が認められることから、Ｃｈｅａｄもまた、Ｎｈｅａｄと同様にＡｔａＡファイバー先端に存在するときは、自己凝集性を発揮することが示された。図８Ｂにおいて、野生型のＡｔａＡで認められた微生物接着性は、ＷＣｈｅａｄ発現株ではΔＮｈｅａｄ欠損株と同程度に低減しており、ＣｈｅａｄはたとえＡｔａＡファイバーの先端に位置しても、Ｎｈｅａｄのように接着性を示すことはないことが明確となった。すなわち、Ｃｈｅａｄは接着性を有しないものの、ＡｔａＡファイバー上の存在位置によっては凝集性を示し得る、すなわち潜在的には自己凝集機能を有するという、意外な事実を発見したのである。

　（考察）
　ファイバーから切断されたＡｔａＡのパッセンジャードメインは、接着能力と自己凝集能力を有することが公知となっている。このパッセンジャードメインはＮｈｅａｄとＣｈｅａｄの両方を含んでいる。ＡｔａＡファイバー上のＣｈｅａｄは、ＡｔａＡファイバーが細胞から切断されると細胞表層上に存在するときの立体障害から解放され、潜在的に有していた自己凝集機能を発揮することができるようになると考えられる。細胞表層上にＡｔａＡファイバーが存在するときは、タンパク質の配向が揃っているため、先端のＮｈｅａｄだけで細胞凝集を引き起こすのに十分な力を発揮できる。しかし、細胞から切断されたＡｔａＡのパッセンジャードメインファイバーは配向性を失うため、Ｎｈｅａｄ同士の接触効率は細胞上に存在するときと比べて低下する。そのため、Ｎｈｅａｄだけでは自己凝集性を発揮できない。しかし、Ｃｈｅａｄが存在すると、ファイバーの両端付近に凝集性を有するドメインがくることになり、自己凝集性を示すようになる。すなわち、微生物細胞から切断されたＡｔａＡ断片は、ＮｈｅａｄとＣｈｅａｄの両方を有するときは自己凝集性を示すが、Ｃｈｅａｄが存在しないでＮｈｅａｄしか有しないときは自己凝集性を示さなくなると考えられる。よって、Ｃｈｅａｄを含まないＡｔａＡ断片、またはＣｈｅａｄの自己凝集機能を失わせるような変異を導入したＣｈｅａｄを有するＡｔａＡ断片がＮｈｅａｄを含んでいるときは、接着機能を有するが自己凝集機能を有しない組換えタンパク質となる。

　（実施例９：Ｎｈｅａｄ融合ペプチドによる融合物の固定化）
　Ｎｈｅａｄの単層接着性を利用して、機能性タンパク質を材料表面に固定する実施例を示す。この目的のため、モデルタンパク質としてＳＮＡＰタンパク質をＮｈｅａｄに融合した融合ペプチド（配列番号２７）を設計した。図９Ａにコンストラクト設計を示す。図３に示したＮｈｅａｄ組換えタンパク質のＧＣＮ４ｐＩＩタグとＨｉｓタグの間にＳＮＡＰタンパク質を融合した設計とした。このＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの配列を図９Ｃに示す。精製したＮｈａｅｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドが正しくフォールディングされているかどうかを知る指標として、ＣＤスペクトルによる二次構造の解析を行った。

　（方法）
　ｐＩＢＡ－ＧＣＮ４ｔｒｉ－Ｈｉｓ：：ａｔａＡ_{５９－３２５}からインバースＰＣＲにより増幅した断片と、別に準備したＳＮＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ（ＳＮＡＰ－ＤＮＡ）断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングにより結合してＤＮＡコンストラクトを作製した。これを大腸菌に導入して生産させ、該融合ペプチドを精製した。具体的な手順は実施例３に記載したとおりである。

　（結果）
　ＣＤスペクトルの解析の結果、大腸菌に作らせ精製したＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドは、ランダムコイル状態ではなく二次構造を形成していることが示さた（図９Ｂ）。

　（実施例１０：Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの様々な材料表面への固定化）
　本実施例では、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドをガラス、ポリスチレン（ＰＳ）、チタン（Ｔｉ）、ポリテトラフルオロエチレン樹脂（ＰＴＦＥ）の各表面に固定化することを試みた。

　（方法）
　該融合ペプチドの表面への固定化の手順を図１０Ａに示す。テフロン（登録商標）テープ（ニットーコーテープＮｏ．３０３；日東電工）にポリ塩化ビニルテープ（ＶＴ－１９６；ニチバン）を４枚重ねて貼りつけたものに、穴あけパンチで直径５ｍｍの穴を１．５ｃｍ間隔で空けた。使用前にテフロンテープを剥がし対象の素材に貼り付けることで、平らな素材に深さ０．８ｍｍのポリ塩化ビニル製の試験用ウェルを作製した。ウェルに１μＭのＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチド溶液を滴下し、１時間静置した。陰性対照として、なにも加えないもの（Ｂｌａｎｋ）およびＳＮＡＰタンパク質のみを添加したものも調製した。表面に固定された該融合ペプチドを定量するために、Ｎｈｅａｄへの融合物であるＳＮＡＰタンパク質の蛍光基質分子であるＳＮＡＰ　Ｓｕｒｆａｃｅ４８８を１μＭ滴下し、３７℃で１時間静置することにより、ベンジルグアニル基を介してＳＮＡＰタンパク質に蛍光基質を共有結合させた。ＰＢＳで５回洗浄後、蛍光スキャナで５０６ｎｍの励起波長を含んだ緑色ＬＥＤ光を照射しながら１２０秒間露光し、５２６ｎｍの蛍光を撮影した。

　（結果）
　結果を図１０Ｂに示す。Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを添加した全ての基板において、蛍光の発生が認められた。したがって、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドは、実験に使用した全ての材料に、Ｎｈｅａｄを介して接着、固定することができることが明らかになった。なお、ＳＮＡＰタンパク質だけでは基板に固定できないことも示されている。

　（実施例１１：Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドによる抗菌ペプチドの固定化）
　本実施例では、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドにより抗菌ペプチドを固定化することによって、材料表面に抗菌活性を付与することを試みた。

　（方法）
　１２穴高撥水性印刷スライドガラス（松浪硝子工業）に３μＭのＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチド溶液を１５μｌ添加し、室温で１時間静置した。２０μｌのＰＢＳで３回洗浄を行い、９μＭのベンジルグアニル（ＢＧ）化ＣＡＰ１８抗菌ペプチドを添加して３７℃で１時間インキュベートすることにより、該融合ペプチドのＳＮＡＰタンパク質部分に該抗菌ペプチドを共有結合させた。その後、２０μｌのＰＢＳで３回洗浄した。ここに、緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＡＯ１を懸濁させたＭ９培地（ＯＤ６００＝０．０１）を１５μｌ添加し、室温で１５分間静置した。微生物懸濁液を除去後、２０μｌのＭ９培地で３回洗浄した。その後、１５μｌのＭ９培地を添加して、３７℃で１０時間、静置培養を行った。培養後、ＰＢＳで３回洗浄し、終濃度３．３４μＭのＳＹＴＯ９で１５分間、微生物細胞の蛍光染色を行った。最後にＰＢＳで５回洗浄を行ってから、共焦点レーザー顕微鏡でスライドガラス上に形成されたバイオフィルムを観察した。

　（結果）
　結果を図１１に示す。Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰでコーティング処理したポリスチレン表面に対してだけ、ＢＧ化抗菌ペプチドを添加すると該ペプチドが固定され、緑膿菌のバイオフィルム形成が抑制された。しかし、ＳＮＡＰタンパク質だけでコーティング処理した表面も、非処理の表面も、ＢＧ化抗菌ペプチドを加えても緑膿菌のバイオフィルム形成を抑えることはできなかった。ＳＮＡＰタンパク質自体には表面接着能がないこと、抗菌ペプチド自体も表面への吸着能を示さないことが確認された。よって、Ｎｈｅａｄを接着タグとしてＳＮＡＰタンパク質を表面に固定し、さらにＢＧ化した機能分子をＳＮＡＰに結合させることで、抗菌性表面など、機能性表面を作製することが可能になった。

　（実施例１２：ＳＮＡＰタンパク質をＮ末端側に有するＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ－ＧＣＮ４ｐＩＩ融合ペプチドの作製）
　本実施例は、ＳＮＡＰタンパク質をＮ末端側に有するＮｈｅａｄ（配列番号２９）を作製し、それが正常にフォールディングするのか否かを明らかにすること目的としたものである。

　（方法）
　ａｔａＡ遺伝子がクローニングされているｐＤＯＮＲ：：ａｔａＡとＳＮＡＰ－ＤＮＡ断片を利用してオーバーラップＰＣＲにより、（１）ａｔａＡ遺伝子の上流の塩基配列（ＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＣＴＣ　ＣＴＡ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＡＧＣ　ＧＡＴ（配列番号５）：下線は制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列）、（２）ＡｔａＡシグナルペプチド認識配列（配列番号４のアミノ酸１位から５９位）－ＳＮＡＰタンパク質－グリシンリンカーをコードする塩基配列、（３）Ｎｈｅａｄ先端をコードする塩基配列（配列番号２の塩基配列７位～３５位（制限酵素ＸｍｎＩ切断部位まで）を融合したＤＮＡを調製した。これをｐＤＯＮＲ：：ａｔａＡのＥｃｏＲＩ、ＸｍｎＩ消化断片と繋ぐことによりＡｔａＡのシグナルペプチド認識配列とＮｈｅａｄ（正確には最初のアラニン残基を除いたもの）の間にＳＮＡＰタンパク質とグリシンリンカーを挿入したポリペプチドをコードする融合遺伝子断片を構築した。これを鋳型にして、ＳＮＡＰタンパク質－グリシンリンカー－ＡｔａＡのＮｈｅａｄとコイルドコイル部分（配列番号１のアミノ酸３位～２６８位）をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。これをｐＩＢＡ－ＧＣＮ４ｔｒｉ―Ｈｉｓベクターに、実施例３と同様に挿入し、ｐＩＢＡ：：ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチド（ｐＩＢＡ：：ＳＡＮＰ－ＡｔａＡ_{６０－３２５}）を作製した。これを大腸菌に導入して組換えタンパク質として生産した。ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドの生産と精製、および精製した融合ペプチドが正しくフォールディングされているかどうかの確認は、実施例３に準じて実施した。

　（結果）
　結果を図１２に示す。ＣＤスペクトルの解析の結果、大腸菌に作らせ精製したＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドは、ランダムコイル状態ではなく二次構造が形成されていることが示され、フォールディングしていると推定された。

　（実施例１３：ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドの固定化能と機能評価）
　本実施例では、実施例１２で作製したＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドによる抗菌ペプチドの固定化機能を評価した。

　（方法）
　表面に固定した融合ペプチドにまずＢＧ化抗菌ペプチドＣＡＰ１８を反応させ、融合ペプチド内のＳＮＡＰタンパク質と共有結合させる。次に、固定化融合ペプチドにＳＮＡＰタンパク質の蛍光基質を反応させることで、抗菌ペプチドが結合できずに空席状態となっていたＳＮＡＰタンパク質に蛍光基質が共有結合する。この蛍光強度を、あらかじめＣＡＰ１８を反応させずに蛍光基質を反応させた場合の蛍光強度と比較することで、ＣＡＰ１８の融合ペプチドへの結合効率を調べることができる。そのために、融合ペプチド溶液（１μＭ）１００μｌを、黒色のポリスチレン製９６穴プレートにアプライし、室温で１時間静置することで、融合ペプチドをプレートに固定した。１１０μｌのＰＢＳで３回洗浄後、３μＭのＢＧ化ＣＡＰ１８抗菌ペプチド溶液１００μｌを添加して３７℃で１時間インキュベートすることにより反応させた。１１０μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、３μＭのＳＮＡＰ　ｓｕｒｆａｃｅ４８８を１００μｌアプライして、さらに３７℃１時間反応させた。最後に１１０μｌのＰＢＳで５回洗浄して、プレートリーダーで４８５ｎｍの励起光を当て、５３５ｎｍの波長の蛍光強度を測定した。他方、ＣＡＰ１８との反応過程を除いてＳＮＡＰ　Ｓｕｒｆａｃｅ４８８をアプライした場合の蛍光強度についても、同じ手法で測定した。なお、本試験は、ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドに加え、コントロールとしてＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドとオリジナルのＳＮＡＰタンパク質についても実施した。

　（結果）
　結果を図１３に示す。ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドは、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを使用した場合と同様の蛍光値の低減をもたらした。したがって、ＳＮＡＰ－Ｎｈｅａｄ融合ペプチドは、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドと同様のペプチド固定化能を有すると結論付けられた。

　（考察）
　Ｎｈｅａｄ組換えタンパク質を接着タグとして使用する場合、固定したいペプチドはＮｈｅａｄのカルボキシ末端側またはアミノ末端側のどちらに融合してもよいことが示された。

　（実施例１４：ＧＣＮ４ｐＩＩタグ有さないＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの作製）
　本実施例は、ＡｔａＡ断片の三量体化を補助することを期待して融合してきたＧＣＮ４ｐＩＩタグが、大腸菌組換えＮｈｅａｄタンパク質のフォールディングに必須であるか、なくてもよいかを明らかにすることを目的としたものである。

　（方法）
　本実施例で作製した融合ペプチドのコンストラクト設計（配列番号３１）を図１４Ａに示す。実施例９に示したＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの作製の際に構築したコンストラクトＤＮＡを利用してインバースＰＣＲによりＧＣＮ４ｐＩＩタグをコードする領域を削除することにより目的のコンストラクトＤＮＡを構築した。このコンストラクトＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＧＣＮ４ｐＩＩ融合ペプチドのアミノ酸配列を図１４Ｃに示す。融合ペプチドの精製については実施例３に記載したＮｈｅａｄ組換えタンパク質の精製法に準じて実施した。また、精製された該融合ペプチドのＣＤスペクトルを実施例３と同じ手法で測定した。

　（結果）
　ＣＤスペクトルの解析の結果、大腸菌に作らせ精製したＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＧＣＮ４ｐＩＩ融合ペプチドは、ランダムコイル状態ではなく二次構造を形成し、フォールディングされていることが示された（図１４Ｂ）。

　（考察）
　上述の結果より、三量体化タグであるＧＣＮ４ｐＩＩタグは、大腸菌組換えＮｈｅａｄタンパク質およびその融合ペプチドの設計と作製においては必須でないと考えられる。

　（実施例１５：コイルドコイル領域を除いたＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの作製）
　本実施例は、実施例９に示したＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドからコイルドコイル領域を除いて、Ｎｈｅａｄドメイン領域（Ｎｈｅａｄ－ｎｅｃｋ）だけでも大腸菌組換えタンパク質の作製が可能か、作製されたコンストラクトが活性を有するためにフォールディングし得るかを明らかにすることを目的したものである。

　（方法）
　本実施例で作製した融合ペプチドのコンストラクト設計（配列番号３３）を図１５Ａに示す。実施例９に示したＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの作製の際に構築したコンストラクトＤＮＡを利用してインバースＰＣＲによりコイルドコイルをコードする領域を削除することにより目的のコンストラクトＤＮＡを構築した。このコンストラクトＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＣＣ融合ペプチドのアミノ酸配列を図１５Ｃに示す。融合ペプチドの精製については実施例３に記載したＮｈｅａｄ組換えタンパク質の精製法に準じて実施した。また、精製された該融合ペプチドのＣＤスペクトルを実施例３と同じ手法で測定した。

　（結果）
　ＣＤスペクトルの解析の結果、大腸菌に作らせ精製したＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＣＣ融合ペプチドは、ランダムコイル状態ではなく二次構造を形成し、フォールディングされていることが示された（図１５Ｂ）。

　（考察）
　上述の結果より、大腸菌組換えＮｈｅａｄタンパク質およびその融合ペプチドの設計と作製においては、コイルドコイル部分は不要と考えられる。

　（実施例１６：ＮｈｅａｄとＳＮＡＰタンパク質との各種融合ペプチドの機能評価）
　本実施例では、実施例１４および１５において作製した、ＮｈｅａｄとＳＮＡＰタンパク質の各種融合ペプチドについて、固定化能力を評価した。融合ペプチドの固定化量を、ＳＮＡＰタンパク質の蛍光基質を用いて評価した。

　（方法）
　実施例１３に準じた方法で黒色のポリスチレン製９６穴プレートに固定した融合ペプチドに、ＳＮＡＰ　Ｓｕｒｆａｃｅ４８８を結合させ、プレートリーダーで測定することにより定量した。ただし、実施例１３と異なり、あらかじめＣＡＰ１８と結合させることはしなかった。

　（結果）
　Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＧＣＮ４ｐＩＩ融合ペプチドもＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ＿ΔＣＣも、Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドと同等以上の固定化能を有していることが明らかとなった。

　（考察）
　機能性ペプチドを融合する場合、ＧＣＮ４ｐＩＩタグを利用する必要性もＡｔａＡのコイルドコイル領域を残す必要性もないことが、はっきりした。これらがなくても、ＮｈｅａｄおよびＮｈｅａｄの融合ペプチドは正しくフォールディングされ、機能を発揮する。

　（実施例１７：大腸菌組換えＮｈｅａｄの表面接着タンパク質としての実用例）
　本実施例では、大腸菌組換えＮｈｅａｄとストレプトアビジンとが結合して複合体を形成することを示す。

　（方法）
　実施例５に準じ、ＤＬＳにより、大腸菌組換えＮｈｅａｄ単独、ストレプトアビジン（ＳＡ）単独、ＮｈｅａｄとＳＡの混合溶液中のタンパク質の粒形を測定した。単独のタンパク質溶液の場合、試料溶液の濃度は実施例５と同様に０．２ｍｇ／ｍｌに調製した。二種類のタンパク質を混合する場合は、それぞれ０．２ｍｇ／ｍｌに調製した試料溶液を等量ずつ混合してから５分間静置した。その後、混合液を４０μｌ使用して測定した。

　（結果）
　結果を図１７に示す。大腸菌組換えＮｈｅａｄ単独またはＳＡ単独では共に５～数１０ｎｍのところに単分子のピークが出ている。これらを混合すると、数千ｎｍのピークにシフトしており、これは、単なる大腸菌組換えＮｈｅａｄとＳＡの単分子の和よりもはるかに大きい。両タンパク質分子が多数、複合体を形成しながら凝集したことを示している。

　（実施例１８：大腸菌組換えＮｈｅａｄと中性アビジンとの結合）
　本実施例では、大腸菌組換えＮｈｅａｄと中性アビジンとが結合して複合体を形成することを示す。

　（方法）
　実施例１７と同じ方法で実施した。ただし、実施例１７のＳＡを、本実施例では中性アビジンに代えた。

　（結果）
　結果を図１８に示す。大腸菌組換えＮｈｅａｄ単独または中性アビジン単独では共に５～数１０ｎｍのところに単分子のピークが出ている。これらを混合すると、数千ｎｍのピークにシフトしており、これは、単なる大腸菌組換えＮｈｅａｄと中性アビジンの単分子の和よりもはるかに大きい。両タンパク質分子が多数、複合体を形成しながら凝集したことを示している。

　（比較例１：大腸菌組換えＮｈｅａｄとアビジンとの相互作用）
　本実施例では、大腸菌組換えＮｈｅａｄはアビジンとは結合しないことを示す。

　（方法）
　実施例１７と同じ方法で実施した。ただし、実施例１７のＳＡを、本実施例ではアビジンに代えた。

　（結果）
　結果を図１９に示す。大腸菌組換えＮｈａｅｄ単独、アビジン単独、両タンパク質の混合物ともに５～数１０ｎｍのところに単分子のピークが出ており、大腸菌組換えＮｈｅａｄはアビジンとは結合できず、したがって複合体も形成されないことが明らかとなった。

　（考察）
　大腸菌Ｎｈｅａｄの他のタンパク質との複合体形成機能は、相手を選ぶ特異的な相互作用であることが示された。

　（実施例１９：細胞の固定化）
　本実施例では、表面に大腸菌組換えＮｈｅａｄをコーティングしたプレート上に、２種類の細菌の細胞を固定することができることを示す。
（方法）
　方法の概略を図２０Ａに示す。大腸菌組換えＮｈｅａｄを、プレート上にコーティングした。このプレート上に一定濃度に調整した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を滴下し、６時間インキュベートした。その後、プレートを純水（ＤＷ）で洗浄し、核染色剤により各細胞を染色した。共焦点顕微鏡下で、プレート上に固定された細胞を観察した。

　（結果）
　結果を図２０Ｂに示す。枯草菌および大腸菌のいずれを滴下したプレートにおいても、細胞のプレートへの固定が認められた。Ｎｈｅａｄによるコーティングを行っていないプレート、およびＮｈｅａｄの代わりにＢＳＡを滴下したプレートでは、細胞の固定化は認められなかった。

　（実施例２０：Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを表層に固定化したリポソーム（Ｎｈｅａｄ表層修飾リポソーム）の作製と確認）
　（方法）
　（Ｎｈｅａｄ表層修飾リポソームの作製）
　実施例９に示したＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドをベンジルグアニル（ＢＧ）化リポソームと反応させることにより作製した。ＢＧ化リポソームの作製は以下の通りである。

　クロロホルム中に溶解した５０ｍｇ／ｍｌの卵黄ホスファチジルコリン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＮＣ－５０（ＥＰＣ）、油化産業）の３００μｌを入れた丸底フラスコ中を、１時間、真空引きしながら回転させた。脂質フィルムを、２５μＭのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を補充した緩衝液Ａ（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６，５０ｍＭ　グルタミン酸カリウム）または緩衝液Ｂ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０））により水和し、５０ｍｇ／ｍｌの脂質溶液３００μＬを得た。ＧＵＳを伴うサンプルに対しては、２μＭのＧＵＳを緩衝液Ａに添加して使用した。電子顕微鏡観察のためのサンプルに対しては、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを緩衝液Ｂに添加した。これらの脂質溶液を１０分間ソニケーションし、１０秒間ボルテックスを行った。脂質溶液をさらに５回の凍結解凍サイクルに供した。次いで、リポソーム懸濁液を、室温で０．８μｍのＶＣＴＰアイソポアメンブレンフィルターを使用して、ミニエクストルーダー（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）によって押し出した。緩衝液ＡまたはＢを用いて調製した３００μＬの巨大単一ラメラベジクル（ＬＵＶ）に、１２００μＬの緩衝液Ａまたは緩衝液Ｂをそれぞれ添加し、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を１２００μＬの緩衝液ＡまたはＢで置換することによって洗浄した。洗浄工程は、４回繰り返した。

　ＢＧリポソームは、以下のとおり調製した。すなわち、まず、クロロホルム中に溶解した２ｍＭ　ＢＧ－ＤＳＰＥ（ＰＥＧ２００）の１４μｌを、ガラスマイクロ試験チューブ内で真空引きしながら１５分間回転させて、緩衝液ＡまたはＢで水和した。その後、このＢＧ－ＤＳＰＥ溶液を、ＬＵＶ溶液に最終濃度９３μＭとなるように添加して、室温で２０時間インキュベートし、上述のとおり４回洗浄した。

　リポソーム（ＬＵＶ）溶液とＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチド溶液（１０μＭ）を低吸着１．５ｍＬチューブ（ＭＳ－４２１５Ｍ；住友ベークライト）内で混合した。３７℃で３０分間インキュベートすることによりＢＧ化ＬＵＶリポソームと該融合ペプチドを反応させ、Ｎｈｅａｄ修飾リポソームを得た。８０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を除去してリポソームのペレットを室温の１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）５０μｌに再懸濁してＮｈｅａｄ表層修飾リポソーム溶液を得た。

　（方法）
　（Ｎｈｅａｄ表層修飾リポソームの確認）ＤＬＳにより被修飾リポソームとＮｈｅａｄ表層修飾リポソームの粒形を測定することにより、該修飾リポソームがきちんと作製されているかについて確認した。ＤＬＳの測定法は、実施例５に示した通りに行った。

　（結果および考察）
　結果を図２１に示す。大腸菌組換えＮｈｅａｄ表層修飾リポソームは、約９０ｎｍの粒子径に直径のピークが認められたのに対し、表層修飾をしていない通常のリポソームは、約６０ｎｍの粒子径に直径のピークが認められた。この結果から、大腸菌組換えＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰのリポソーム表層への固定化は、表層修飾によるリポソーム直径の増大をもたらす一方で、リポソームの凝集はもたらさずに、単分散をもたらしたことがわかった。これは大腸菌組換えＮｈｅａｄおよびそのＳＮＡＰタンパク質融合ペプチドが凝集性を有しないためである。

　（実施例２１：Ｎｈｅａｄ表層修飾リポソームの接着性の解析）
（方法）
　４５μｌのリポソーム懸濁物（Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの濃度：１μＭまたは１０μＭ相当）を９６穴ポリスチレンプレート（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）に滴下し、５μｌの１０×リン酸緩衝生理食塩水（１．３７Ｍ　ＮａＣｌ，２７ｍＭ　ＫＣｌ，８１ｍＭ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，１４．７ｍＭ　ＫＨ_２ＰＯ_４）と混合した。リポソーム粒子をプレートの表面に接着させるために、リポソーム懸濁物を含むプレートを、室温で３０分間７００ｇで遠心分離した。未結合のリポソームを除去するために、ウェルを緩衝液（９．０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１３７ｍＭ　ＮａＣｌ，２．７ｍＭ　ＫＣｌ，８．１ｍＭ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，１．４７ｍＭ　ＫＨ_２ＰＯ_４）で２～４回洗浄後、５０μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）をウェルに加えた。リポソームの接着は、リポソーム中に内包されたＡＦ６４７の蛍光シグナルを、マイクロプレートリーダー（ＡＲＶＯ　Ｘ３；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって測定することによって評価した。蛍光シグナルを、シグナル対ノイズ比を改善するために、トップリーディングモードによって定量した。接着したリポソームからの蛍光を検出する場合には、底面を黒色のプラスチックテープでマスクした。

　（結果および考察）
　結果を図２２に示す。Ｎｈｅａｄ－ＳＮＡＰと混合したＢＧ化リポソームは、Ｎｈｅａｄの濃度依存的にポリスチレンプレートへの接着が認められた。しかし、比較例として実施したＢＧ化されていないリポソームは、Ｎｈｅａｄで表層修飾されないため、プレートへの接着が認められなかった。

　（実施例２２：ＮｈｅａｄＮｓｔａｌｋ（ＮｈＮｓ）－ＳＮＡＰ融合ペプチドを表層に固定化したリポソーム（ＮｈｅａｄＮｓｔａｌｋファイバー表層修飾リポソーム）の作製と確認）
　本実施例では、ＮｈｅａｄＮｓｔａｌｋ（ＮｈＮｓ）－ＳＮＡＰ融合ペプチドを表層に固定化したリポソームの作製および確認を行った。

　（方法）
　（ＮｈＮｓ－ＳＮＡＰ融合ペプチドの作製）
　実施例９に示したＮｈｅａｄ－ＳＮＡＰ融合ペプチドとｐＤＯＮＲ：：ａｔａＡを利用して、ｐＩＢＡ－ＧＣＮ４ｔｒｉ－ｓｔｒｅｐｔ－ｔａｇ：：ＮｈＮｓ－ＳＮＡＰのコンストラクトＤＮＡを作製した。これで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた組換え大腸菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地にて３７℃でＯＤ_６００が０．５～０．７になるまで培養し、０．２μｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリンを添加後、さらに１８℃で１６時間培養することにより、ＮｈＮｓ－ＳＮＡＰ融合ペプチド（配列番号３５）を生産した。該融合ペプチドの模式図を図２３に示す。上段はＡｔａＡタンパク質の全長を、下段にＮｈＮｓ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを示す。該融合ペプチドを菌体内に生産させた組換え大腸菌の細胞溶解物とＢＧ化ＬＵＶを使って、下記の通りＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームを調製した。

　（ＮｈＮｓ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを表層に固定化したリポソームの作製）
　ＢＧ化リポソームの懸濁液をＮｈＮｓ－ＳＮＡＰ融合ペプチドを生産させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換株の細胞抽出物２．０ｍｇ／ｍＬと混合した。ローター回転機により４℃で１時間インキュベートした後、１５，０００ｇで１０分間遠心分離を行い、ＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソーム粒子を沈殿させた。沈殿したリポソーム粒子を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）緩衝液で２回洗浄し、同緩衝液中に再懸濁した。

　（作製されたＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームの観察）
　得られたＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームを電子顕微鏡で観察することにより、リポソームの修飾を確認した。リポソームの懸濁物を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）中で５０倍に希釈した。リポソームをカーボンコート銅フィルム（４００メッシュ）に吸着させ、２％のリンタングステン酸溶液（ｐＨ７．０）で１０秒間染色した。その後、グリッドを１０分間真空乾燥させた。グリッドを、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ－１４００　ｐｌｕｓ、日本電子株式会社）を使用して、１００ｋＶの加速電圧で観察した。デジタル画像（３２９６×２４７２ピクセル）は、ＣＣＤカメラ（ＥＭ－１４８３０ＲＵＢＹ２、日本電子株式会社）により取得した。

　（結果）
　結果を図２４に示す。電顕観察において、リポソームの表面にＮｈｅａｄＮｓｔａｌｋファイバーが固定され、リポソームの表層が該融合ペプチドで修飾されている様子が観察された。

　（実施例２３：ＮｈｅａＮｓｔａｌｋファイバー修飾リポソームの分散・凝集性の評価）
　（方法）
　実施例５および１７と同じ手順で、ＤＬＳによって測定した。ただし、比較のため、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株およびΔａｔａＡ変異株についても測定した。細菌細胞培養液を８，０００ｇで遠心分離することによって回収し、純水で５回洗浄し、純水でＯＤ_６６０＝０．０５に調整して測定した。

　（結果および考察）
　実施例２３の結果を図２５に示す。図２５Ａの結果から、ＡｔａＡの存在下と非存在下において、細菌細胞のサイズの分布は異なることが明らかになった。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株での大部分のサイズは約１７２０ｎｍであり、ΔａｔａＡの約１２８０ｎｍと比べて４４０ｎｍほど大きかった。これはネイティブＡｔａＡのサイズ（２２５ｎｍ×２）に対応するものであった。また、図２５Ｂに示したとおり、１００ｍＭのＫＣｌ溶液中では凝集塊が沈降して、液が透明になっているのに対し、純水中では細胞は自己凝集しないで懸濁したままであるので、液は濁っていることがわかる。すなわち、ネイティブのＡｔａＡを有するＴｏｌ５細胞でも、純水中では自己凝集しない。したがって、図２５ＡのＴｏｌ５にみられる５５００ｎｍ近辺に見られる小さなピークは、Ｔｏｌ５株の凝集塊を示しているわけではない。直径から考えると、１０程度の細胞が弱く絡まった小細胞集団であると推察される。

　図２５Ｃの結果から、ＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームの直径は約１２８０ｎｍであり、非修飾のリポソームの直径約８２５ｎｍより４５５ｎｍ大きかった。これはＮｈｅａｄＮｓｔａｌｋの長さ１８０ｎｍの２倍と同程度である。さらにＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームも自己凝集性を示さないことが明らかになった。５０００ｎｍ付近に図２５ＡのＴｏｌ５と同様に見られるピークも、ＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームの凝集塊ではないと考えられる。

　（実施例２４：ＮｈｅａｄＮｓｔａｌｋファイバー修飾リポソームの接着アッセイと接着リポソームによる酵素反応）
　本実施例では、ＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームによる接着と固定化されたリポソームによる酵素反応を示す。

　（方法）
　（接着アッセイ）
　実施例２０と同じ方法で実施した。ただし、ポリスチレンプレートに加え９６穴ガラス底プレート（松浪硝子工業）に対する接着性も評価した。

　（酵素反応）
　酵素反応のため、リポソーム調製時に２μＭのβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を封入した。以下の方法によりリポソームをプレートに固定し、酵素活性を測定した。

　プレート表面に接着させたリポソームに封入されたＧＵＳによる酵素アッセイのために、リポソーム懸濁物を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）で５０倍希釈し、５０μＬの懸濁物をポリスチレンウェルプレートに入れた。リポソームは、遠心分離によってプレート表面に接着させた。未固定のリポソームを洗浄除去した後、ＧＵＳの基質として、１０μＭのＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ－β　ＧｌｃＵ（五稜化薬）を含む５０μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を各ウェルに添加した。加水分解反応は、マイクロプレートリーダーを使用して、示される時点での蛍光シグナルとして検出した。励起波長および蛍光波長は、それぞれ４８５ｎｍおよび５３５ｎｍであった。

　（結果）
　実施例２４の結果を図２６に示す。図２６Ａ（ポリスチレンプレート）および２６Ｂ（ガラスプレート）のいずれにおいても、ＢＧ化リポソームを細胞溶解液と混合することによってＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームを得た場合には有意な蛍光が測定され、これらの蛍光は、細胞溶解液のタンパク質濃度の上昇に伴って増大した。逆に、コントロールのＢＧ基修飾を施していない非修飾リポソーム（ＥｇｇＰＣリポソーム）の場合には、蛍光は認められなかった。

　酵素活性の測定結果を図２６Ｃに示す。ＮｈＮｓファイバー表層修飾リポソームを固定化したウェルにおいて、酵素反応を示す有意な蛍光が認められた。
（考察）
　リポソーム表層をＮｈｅａｄＮｓｔａｌｋで修飾することにより、様々な材料表面にリポソームを固定できるようになり、固定化したリポソームに内包した酵素により、化学反応を行うことができることが証明された。

　（実施例２５：改変ＡｔａＡポリペプチドを使用した、自己凝集性および接着性の解析）
　本実施例では、各種のＡｔａＡポリペプチドを使用して、自己凝集性および接着性の比較を行う。

　（方法）
　上述の実施例と同様の方法、または当業者に公知の本技術分野で慣用的に行われる実験手法または市販のキットを使用して、ＡｔａＡタンパク質由来の２３７アミノ酸以上および３３６４アミノ酸以下の長さの各種ドメイン欠損体、改変体および／または変異体をコードする発現コンストラクトの設計を行う。上述の実施例と同様の方法によって、これらの各種欠損体、改変体または変異体の自己凝集性および／または接着性の解析を行う。

　（実施例２６：ＳＮＡＰタンパク質以外のタグおよび／またはタンパク質との融合ペプチドの作製）
　本実施例では、固定化技術にＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを導入し、ＳＮＡＰタンパク質以外のタグおよび／またはタンパク質との融合タンパク質の作製を行い、材料表面にタンパク質を固定化する技術を確立した。

　（方法）
　（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ発現プラスミドの構築）
　ｐＩＢＡ－ＳＮＡＰ－ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＧＣＮ４ｔｒｉ－ＨｉｓをテンプレートにＰＣＲでＳＮＡＰタグ以外の領域を含むＤＮＡ断片を、ｐＤＥＳＴ１４－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２（Ａｄｄｇｅｎｅ）をテンプレートにＰＣＲでＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含むＤＮＡ断片を増幅した。それらの断片をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙにより結合し、ｐＩＢＡ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＧＣＮ４ｔｒｉ－Ｈｉｓ（配列番号３６）を構築した（図２７）。
　使用プライマー
１．ＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＡＣ（配列番号３８）
２．ＧＡＴＧＴＣＧＴＡＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧＴＴＡＴＣＴＡＧ（配列番号３９）
３．ＧＡＴＴＡＣＧＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＧ（配列番号４０）
４．ＧＣＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＡＴＧ（配列番号４１）

　（ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ発現プラスミドの構築）
　ｐＩＶＥＸ－ＳＮＡＰ－ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ）をテンプレートにＰＣＲでベクター領域とＧＦＰを含むＤＮＡ断片をそれぞれ増幅し、それらをＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙにより結合することで、ｐＩＶＥＸ－ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ－ｈｉｓ（配列番号３７）を構築した（図２８）。
　使用プライマー
１．ＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＧ（配列番号４２）
２．ＡＧＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＴＡＧＴＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＡ（配列番号４３）
３．ＴＧＡＴＧＧＴＧＧＡＣＧＣＣＴＡＣＡＡＧＣＧＴＴＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧ（配列番号４４）
４．ＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＧＣＣＴＣＣＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴＧ（配列番号４５）

　（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ（配列番号３６）の発現精製）
　２ＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌ　Ａｍｐ）に、３７℃で一晩培養した菌体培養液を２０ｍｌ植菌した。３７℃で３時間振とう培養した後に、誘導物質としてＡＨＴＣを２００μｇ／ｌになるよう添加し２８℃で４時間振とう培養を行った。遠心分離（６，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃，Ｒ１２Ａ６ローター；日立工機）により集菌し、菌体を２００ｍｌのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ９．０）に懸濁した。懸濁した菌体はフレンチプレス（ＬＡＢ２０００；ＳＭＴ　ＣＯＭＰＡＮＹ）により１０００ｂａｒで１０ｍｉｎ破砕し、遠心分離（９，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃，Ｒ１２Ａ６ローター）した。破砕液の上清をＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＮｉ－ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）に通液した後、Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ９．０）を１０ｍｌ、Ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，４００ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ９．０）を５０ｍｌ通液させ、カラムに吸着したタンパク質を溶出した。回収したタンパク質溶液はＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＨＰカラム（ｃｏｌｕｍｎ　ｖｏｌｕｍｅ　５ｍｌ；ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。バッファーは２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用い、０－２Ｍ　ＮａＣｌの濃度勾配を掛けて溶出した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄを含む溶出画分を回収し、透析用チューブ（Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＲＣ　Ｔｕｂｉｎｇ　ＭＷＣＯ：１２－１４ｋＤ；Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ　４　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて、４℃で５０ｍＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）に透析した。溶液をチューブから回収し、ＨｉＴｒａｐ　ＳＰ　ＨＰカラム（ｃｏｌｕｍｎ　ｖｏｌｕｍｅ　５ｍｌ；ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。バッファーは５０ｍＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）を用い、０－２Ｍ　ＮａＣｌの濃度勾配を掛けて溶出した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄを含む溶出画分を回収し、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラム（ｃｏｌｕｍｎ　ｖｏｌｕｍｅ　３２０ｍｌ；ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行った。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄを含む溶出画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｆｉｌｔｅｒｓ　Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ｋ（Ｍｅｒｃｋ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて限外ろ過により濃縮と２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）へのバッファー交換を行った。濃縮後のタンパク質の濃度はＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて測定した。

　（ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ（配列番号３７）の発現精製）
　２ＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌ　Ａｍｐ）に、３７℃で一晩培養した菌体培養液を２０ｍｌ植菌した。３７℃で７時間振とう培養した後に、誘導物質としてイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭになるよう添加し、３７℃で３時間振とう培養を行った。遠心分離（６，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃，Ｒ１２Ａ６ローター；日立工機）により集菌し、菌体を２００ｍｌのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ９．０）に懸濁した。懸濁した菌体はフレンチプレス（ＬＡＢ２０００；ＳＭＴ　ＣＯＭＰＡＮＹ）により１０００ｂａｒで１０ｍｉｎ破砕し、遠心分離（９，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃，Ｒ１２Ａ６ローター）した。破砕液の上清をＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＮｉ－ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）に通液した後、Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ９．０）を１０ｍｌ、Ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，４００ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ９．０）を５０ｍｌ通液させ、カラムに吸着したタンパク質を溶出した。回収したタンパク質溶液はＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＨＰカラム（ｃｏｌｕｍｎ　ｖｏｌｕｍｅ　５ｍｌ；ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。バッファーは２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用い、０－２Ｍ　ＮａＣｌの濃度勾配を掛けて溶出した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄを含む素通り画分を回収し、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラム（ｃｏｌｕｍｎ　ｖｏｌｕｍｅ　３２０ｍｌ；ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行った。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄを含む溶出画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｆｉｌｔｅｒｓ　Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ｋ（Ｍｅｒｃｋ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて限外ろ過により濃縮と２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）へのバッファー交換を行った。濃縮後のタンパク質の濃度はＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて測定した。

　（ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄの結合試験）
　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７）を用いてＮｈｅａｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ－ｈｉｓをそれぞれ１μＭに調製した。Ｎｈｅａｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ溶液２０μｌとＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ－ｈｉｓ溶液２０μｌを混合し３７℃で５ｍｉｎ静置した。その後ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色により泳動度の変化を調べた（図２９）。

　（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄを用いたＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰのポリスチレンプレートへの固定化）
　ＰＢＳを用いてＮｈｅａｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ－ｈｉｓ、Ｎｈｅａｄをそれぞれ０．２μＭに調製した。蛍光測定用９６ｗｅｌｌ黒色ポリスチレンプレート（６５５０８６；Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）にＮｈｅａｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ溶液、Ｎｈｅａｄ溶液、またはＰＢＳを１００μｌ滴下し、２８℃で１時間静置した。各ウェルからピペッティングにより溶液を取り除いた後、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後のウェルにＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ－ｈｉｓ溶液を１００μｌ滴下し３７℃で５ｍｉｎ静置した後、各ウェルを１００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。洗浄後のウェルに１００μｌのＰＢＳを添加し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ　Ｘ３；Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）で励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５３５ｎｍの蛍光強度を測定した（図３０）。

　（結果）
　結果を図３０に示す。ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを使用した系でも、Ｎｈｅａｄを介して材料表面にタンパク質を固定化することができることができることが実証された。

　（注釈）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、上述の説明および実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０１９年７月１８日に出願された特願２０１９－１３２４８８号に対して優先権主張を伴うものであり、その内容は全体が参考として本願において援用される。

　本開示は、バイオプロセスを使用する工業において有用性を有する。

配列番号１：シグナルペプチドを除き、開始位置にメチオニンを含むＡｔａＡ断片のアミノ酸配列
配列番号２：シグナルペプチドを除き、開始位置にメチオニンを含むＡｔａＡ断片の核酸配列
配列番号３：ＡｔａＡの全長の核酸配列
配列番号４：ＡｔａＡの全長のアミノ酸配列
配列番号５：ａｔａＡのクローニングに使用したプライマーの配列
配列番号６：Ｎｈｅａｄが欠損した構造のＡｔａＡの核酸配列（実施例２）
配列番号７：Ｎｈｅａｄが欠損した構造のＡｔａＡのアミノ酸配列（実施例２）
配列番号８：Ｎｓｔａｌｋ内の一部が欠損した構造のＡｔａＡの核酸配列（実施例２）
配列番号９：Ｎｓｔａｌｋ内の一部が欠損した構造のＡｔａＡのアミノ酸配列（実施例２）
配列番号１０：Ｎｓｔａｌｋ内の一部が欠損した構造のＡｔａＡの核酸配列（実施例２）
配列番号１１：Ｎｓｔａｌｋ内の一部が欠損した構造のＡｔａＡのアミノ酸配列（実施例２）
配列番号１２：Ｎｓｔａｌｋ内の一部が欠損した構造のＡｔａＡの核酸配列（実施例２）
配列番号１３：Ｎｓｔａｌｋ内の一部が欠損した構造のＡｔａＡのアミノ酸配列（実施例２）
配列番号１４：Ｎｓｔａｌｋ内の一部に加え、Ｃｈｅａｄを欠損させた構造のＡｔａＡの核酸配列（実施例２）
配列番号１５：Ｎｓｔａｌｋ内の一部に加え、Ｃｈｅａｄを欠損させた構造のＡｔａＡのアミノ酸配列（実施例２）
配列番号１６：Ｃｓｔａｌｋの大部分が欠損（ＦＧＧドメインは保存）した構造のＡｔａＡの核酸配列（実施例２）
配列番号１７：Ｃｓｔａｌｋの大部分が欠損（ＦＧＧドメインは保存）した構造のＡｔａＡのアミノ酸配列（実施例２）
配列番号１８：ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－Ｈｉｓの核酸配列（実施例３）
配列番号１９：ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－Ｈｉｓのアミノ酸配列（実施例３）
配列番号２０：ＡｔａＡのΔ１ｓｔ　ｌｏｏｐ改変体の核酸配列（実施例４）
配列番号２１：ＡｔａＡのΔ１ｓｔ　ｌｏｏｐ改変体のアミノ酸配列（実施例４）
配列番号２２：ＡｔａＡのΔ２ｎｄ　ｌｏｏｐ改変体の核酸配列（実施例４）
配列番号２３：ＡｔａＡのΔ２ｎｄ　ｌｏｏｐ改変体のアミノ酸配列（実施例４）
配列番号２４：ＡｔａＡのＷＣｈｅａｄ改変体の核酸配列（実施例８）
配列番号２５：ＡｔａＡのＷＣｈｅａｄ改変体のアミノ酸配列（実施例８）
配列番号２６：ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－ＳＮＡＰ－Ｈｉｓの核酸配列（実施例９）
配列番号２７：ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－ＳＮＡＰ－Ｈｉｓのアミノ酸配列（実施例９）
配列番号２８：ＳＮＡＰ－ＡｔａＡ_{６０－３２５}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－Ｈｉｓの核酸配列（実施例１２）
配列番号２９：ＳＮＡＰ－ＡｔａＡ_{６０－３２５}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－Ｈｉｓのアミノ酸配列（実施例１２）
配列番号３０：ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＳＮＡＰ－Ｈｉｓの核酸配列（実施例１４）
配列番号３１：ＡｔａＡ_{５９－３２５}－ＳＮＡＰ－Ｈｉｓのアミノ酸配列（実施例１４）
配列番号３２：ＡｔａＡ_{５９－３１４}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－ＳＮＡＰ－Ｈｉｓの核酸配列（実施例１５）
配列番号３３：ＡｔａＡ_{５９－３１４}－ＧＣＮ４ｐＩＩ－ＳＮＡＰ－Ｈｉｓのアミノ酸配列（実施例１５）
配列番号３４：ＮｈＮｓ－ＳＮＡＰの核酸配列（実施例２２）
配列番号３５：ＮｈＮｓ－ＳＮＡＰのアミノ酸配列（実施例２２）
配列番号３６：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄのアミノ酸配列（実施例２６）
配列番号３７：ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰのアミノ酸配列（実施例２６）
配列番号３８：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ発現プラスミドの構築に使用したプライマーの配列（実施例２６）
配列番号３９：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ発現プラスミドの構築に使用したプライマーの配列（実施例２６）
配列番号４０：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ発現プラスミドの構築に使用したプライマーの配列（実施例２６）
配列番号４１：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－Ｎｈｅａｄ発現プラスミドの構築に使用したプライマーの配列（実施例２６）
配列番号４２：ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ発現プラスミドの構築に使用したプライマーの配列（実施例２６）
配列番号４３：ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ発現プラスミドの構築に使用したプライマーの配列（実施例２６）
配列番号４４：ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ発現プラスミドの構築に使用したプライマーの配列（実施例２６）
配列番号４５：ＳｐｙＴａｇ－ＧＦＰ発現プラスミドの構築に使用したプライマーの配列（実施例２６）

Claims

自己凝集性を有さず、かつ接着性を有する、配列番号１に示すアミノ酸配列またはその改変配列の断片を含むポリペプチド。
配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２２～５０位および１６１～１７５位に対応する配列またはその改変配列を含み、かつ配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８４７～３０９３位に対応する配列の範囲に１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
前記配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８４７～３０９３位に対応する配列の範囲は、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８５５～３０９３位に対応する範囲である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸２８５５～３０９３位に対応する配列のすべてを欠失する、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片を含む、ポリペプチド；
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８４６位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片を含む、ポリペプチド；
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片を含む、ポリペプチド；または
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位に対応するアミノ酸配列またはその改変配列またはその断片を含む、ポリペプチド
である、請求項１に記載のポリペプチド。
配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８５４位に対応するアミノ酸配列からなる、請求項５に記載のポリペプチド。
配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２８４６位に対応するアミノ酸配列からなる、請求項５に記載のポリペプチド。
配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２６８位に対応するアミノ酸配列からなる、請求項５に記載のポリペプチド。
配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸１～２５７位に対応するアミノ酸配列からなる、請求項５に記載のポリペプチド。
前記改変配列は、保存的置換による改変を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
アシネトバクター菌由来である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記アシネトバクター菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　Ｔｏｌ５株である、請求項１１に記載のポリペプチド。
配列番号１とは異なるアミノ酸配列をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記異なるアミノ酸配列は、前記断片と融合されたものである、請求項１３に記載のポリペプチド。
請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドと、機能性付与実体との複合体。
請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の複合体を含む、自己凝集せずに第一の対象を第二の対象に接着および／または固定させるための組成物。
前記第一の対象を前記第二の対象に単層接着させるための、請求項１６に記載の組成物。
前記第一の対象と前記第二の対象とが同じである、請求項１６または１７に記載の組成物。
前記第一の対象と前記第二の対象とが異なる、請求項１６または１７に記載の組成物。
前記第一の対象または前記第二の対象の少なくとも１つが、機能性付与実体である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組成物。
前記機能性付与実体が、ペプチドおよび／またはタンパク質である、請求項２０に記載の組成物。
前記機能性付与実体が、ストレプトアビジン、中性アビジンまたはそれらの改変体である、請求項２１に記載の組成物。
前記機能性付与実体が、細胞である、請求項２０に記載の組成物。
前記第二の対象が支持体である、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の組成物。
前記支持体がリポソームである、請求項２４に記載の組成物。
請求項１３もしくは１４に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の複合体を含む、自己凝集せずに第一の対象を第二の対象に接着および／または固定させるための組成物であって、該第一の対象は、前記異なるアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記機能性付与実体である、組成物。
請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の複合体を、第一および／または第二の対象に作用させることを包含する、該第一の対象を該第二の対象に接着および／または固定するための方法。
前記第一の対象を前記第二の対象に単層接着させるための、請求項２７に記載の方法。
前記第一の対象と前記第二の対象とが同じである、請求項２７または２８に記載の方法。
前記第一の対象と前記第二の対象とが異なる、請求項２７または２８に記載の方法。
前記第一の対象または前記第二の対象の少なくとも１つが、機能性付与実体である、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
前記機能性付与実体が、ペプチドおよび／またはタンパク質である、請求項３１に記載の方法。
前記機能性付与実体が、ストレプトアビジン、中性アビジンまたはそれらの改変体である、請求項３２に記載の方法。
前記機能性付与実体が、細胞である、請求項３１に記載の方法。
前記第二の対象が支持体である、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の方法。
前記支持体がリポソームである、請求項３５に記載の方法。
請求項１３もしくは１４に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の複合体を、第二の対象に作用させることを包含する、前記異なるアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記機能性付与実体を該第二の対象に自己凝集させずに接着および／または固定するための方法。
請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の複合体が固定された支持体。
前記支持体は、脂質二重構造体、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、チタン、アクリル、天然および合成のポリマーからなる群より選択される、請求項３８に記載の支持体。
請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の複合体の、自己凝集せずに第一の対象を第二の対象に接着および／または固定させるための使用。
前記使用が、前記第一の対象を前記第二の対象に単層接着させるための使用である、請求項４０に記載の使用。
前記第一の対象と前記第二の対象とが同じである、請求項４０または４１に記載の使用。
前記第一の対象と前記第二の対象とが異なる、請求項４０または４１に記載の使用。
前記第一の対象または前記第二の対象の少なくとも１つが、機能性付与実体である、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の使用。
前記機能性付与実体が、ペプチドおよび／またはタンパク質である、請求項４４に記載の使用。
前記機能性付与実体が、ストレプトアビジン、中性アビジンまたはそれらの改変体である、請求項４５に記載の使用。
前記機能性付与実体が、細胞である、請求項４４に記載の使用。
前記第二の対象が支持体である、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の使用。
前記支持体がリポソームである、請求項４８に記載の使用。
請求項１３もしくは１４に記載のポリペプチドまたは請求項１５に記載の複合体の、自己凝集せずに第一の対象を第二の対象に接着および／または固定させるための使用であって、該第一の対象は、前記異なるアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記機能性付与実体である、使用。