WO2021006242A1 - 細胞培養足場、その製造方法と足場製造キット及び細胞培養物の作製方法 - Google Patents

細胞培養足場、その製造方法と足場製造キット及び細胞培養物の作製方法 Download PDF

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WO2021006242A1
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cell culture
cells
cell adhesion
base material
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正暢 楠
大輝 武内
秀孝 東郷
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学校法人近畿大学
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    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
    • C12N2535/10—Patterned coating

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture scaffold for culturing cells and a method for producing a cell culture (particularly a three-dimensional cell aggregate) using the cell culture scaffold.
  • Non-Patent Document 1 As a method of exfoliating the cell culture from the culture scaffold after the cell culture, a method using an enzyme is known. However, with this method, it is difficult to recover the cell culture without breaking the bonds between the cells. Further, there is also known a method in which a temperature-responsive polymer is used for a cell culture scaffold and heat treatment is performed to decompose the temperature-responsive polymer to peel off the cell culture from the culture scaffold and recover it (for example, Patent Document). See 1st grade.). Further, in regenerative medicine, there is a high demand for recovering cultured cells as spheroids. Non-Patent Document 1 and the like have been proposed for culturing cells in spheroids.
  • a dot pattern of hydroxyapatite is formed on the surface of polytetrafluoroethylene (PTFE), and cells are cultured on the dot pattern to form spheroids.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • a base material obtained by coating a hydrophobic base material with an extracellular matrix such as a protein or a peptide as a cell carrier is also known (Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 1 describes that cells are cultured in a spheroid-like manner, there is no finding that the cells are exfoliated from the substrate.
  • Patent Document 2 describes that an extracellular matrix is coated on a hydrophobic substrate, it does not intend to form a spheroid in the first place.
  • an object of the present invention is to provide a cell culture scaffold that can be recovered without destroying the cell culture after the cell culture, and a method for producing the cell culture using the scaffold.
  • the cell culture scaffold according to the present invention includes a base material having a water-repellent surface made of a fluororesin and cell adhesion molecules formed on the water-repellent surface of the base material.
  • the method for producing a cell culture according to the present invention includes a step of culturing cells on the surface of the cell adhesion molecule using the cell culture scaffold.
  • the interface between the water-repellent surface of the fluororesin and the cell-adhesive molecules is firmly adhered for a certain period of time after the start of cell culture, but after a certain period of time has passed.
  • the adhesiveness of the interface is reduced.
  • cells can be cultured to a certain stage and then suspended from the cell culture scaffold without destroying the cell culture.
  • the cell adhesion molecules in a pattern, the cell culture can be recovered as a three-dimensional cell aggregate that is three-dimensionally assembled.
  • a large number of these three-dimensional cell aggregates having the same size can be collected. Further, it is an advantage of the present invention that there is no difficulty in temperature control as in the case of using a temperature-responsive polymer, and size control is easy.
  • the cells after adding an inducing factor to two-dimensionally cultured stem cells to form cell polarity, the cells should be peeled off from the substrate by an operation such as pipetting, which causes less damage to the cells at an appropriate timing while maintaining the cell polarity. Therefore, it is considered that a three-dimensional spheroid can be formed, and the above-mentioned problem which has been a problem when obtaining a spheroid in the past can be solved.
  • the base material in the present invention has a water-repellent surface made of fluororesin.
  • a base material having such a water-repellent surface for example, a base material such as a petri dish, a well, a plate, a multi-plate, or a flask is made of a material other than fluororesin, and the surface of the base material is coated with a fluororesin layer.
  • a base material made of a material other than the fluororesin for example, an existing base material made of plastic such as polystyrene or glass can be used. A material whose fluororesin layer does not easily peel off may be appropriately selected.
  • the method for forming the fluororesin layer on the base material is not particularly limited, and the fluororesin layer is applied onto the base material by a known coating means such as spin coating, dip coating, or spray coating, and heated. It can be formed by hardening by, for example.
  • a fluororesin may be used as the material of the base material such as a petri dish made of fluororesin, and such a base material also has the "water-repellent surface made of fluororesin" referred to in the present invention. It is included in the "base material having".
  • a known fluororesin can be used, for example, polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, polyvinylidene fluoride, polyvinyl fluoride, perfluoroalkoxyfluororesin, ethylene tetrafluoride / propylene hexafluoride.
  • a known fluororesin include copolymers, ethylene / tetrafluoroethylene copolymers, and ethylene / chlorotrifluoroethylene copolymers.
  • Cell adhesion molecules are, for example, extracellular matrix such as collagen, vitronectin, fibronectin, laminin, elastin, heparan sulfate, proteoglycan, molecules in which their cell adhesion sites are fragmented, and cations such as polylysine, polyethyleneimine, and polyallylamine hydrochloride. Examples include sex polymers. Such cell adhesion molecules themselves are conventionally known and can be appropriately selected depending on the type of cells to be cultured and the like.
  • the cell culture scaffold of the present invention includes a base material having the water-repellent surface and cell adhesion molecules formed on the water-repellent surface of the base material.
  • cell adhesion molecules may be formed in a pattern on the water-repellent surface of the base material.
  • a region in which cell adhesion molecules are continuously formed on a substrate having a water-repellent surface is called a cell adhesion molecule region.
  • the cell adhesion molecule region has a bordering edge with the substrate. That is, the edge is the boundary between the cell adhesion molecule region and the surface of the substrate.
  • the “pattern” refers to a state in which at least one or more cell adhesion molecule regions, preferably a plurality of cell adhesion molecule regions, are formed on the substrate.
  • the cell adhesion molecule regions do not have to have the same shape and may have different sizes.
  • the cell adhesion molecule region is also simply referred to as a cell adhesion molecule.
  • the cultured cells can be collected as a three-dimensional cell aggregate.
  • the three-dimensional cell aggregate is a three-dimensional aggregate of cells. Three-dimensional cell colonies are called spheroids.
  • an aggregate of cells of a type consisting of multiple types of cells and specific to an organ is called an organoid.
  • the expression of a function as a tissue that is not expressed in a two-dimensional cell culture is observed, and various usage methods such as confirming the effect of a drug without using the human body are expected.
  • the present invention is extremely effective as a means for recovering the three-dimensional cell aggregate without destroying it as described above, and there is no difficulty in temperature control as in the case of using a temperature-responsive polymer. It also has the advantage of easy size control.
  • the size of the dots can be, for example, 100 to 1000 ⁇ m in diameter.
  • the cells to be cultured are about 5 to 25 ⁇ m, if the cell adhesion molecule region is too small, the spheroids become small, which is insufficient for tissue cells.
  • the adhesion molecule region is too large, the cells inside will die.
  • various pattern shapes can be adopted depending on the purpose, not limited to the dot shape.
  • the pattern formation of cell adhesion molecules is not particularly limited, and examples thereof include a method using an inkjet printer, a stamp method, and a sealing method.
  • the stamp method it is also possible to control the size on the order of micrometers, which is preferable.
  • the sealing method by using a sealing material having through holes in the pattern (size, thickness) of cell adhesion molecules as the base material in advance, proficiency in the technique is required for pattern formation of detailed adhesion molecules. Instead, it is possible to easily and accurately form a pattern of cell adhesion molecules. It is also possible to form a pattern of cell adhesion molecules by attaching a sealing material having patterned through holes of cell adhesion molecules to a base material, applying the cell adhesion molecules, and then peeling off the sealing material.
  • FIG. 1 is a diagram showing a procedure for producing a mold. Specifically, first, the resist 12 is applied onto the silicon substrate 11 (FIG. 1 (a)). After the resist 12 is heat-cured by the heater 13 (FIG. 1 (b)), the resist 12 is exposed through the photomask 15 using the light source 14 to form a pattern (FIG. 1 (c)). Then, it is developed and washed to obtain a mold 10 (FIG. 1 (d)).
  • FIG. 2 is a diagram showing a procedure for producing a micro stamp using the above mold. Specifically, first, with respect to the mold 10 placed in the outer container 9 (FIG. 2 (a)), the rubber tube 21 is placed (FIG. 2 (b)), and the mold is released from the mold 10. After the mold release treatment is performed with the agent 22 (FIG. 2 (c)), the stamp material 23 such as polydimethylsiloxane (PDMS) is poured (FIG. 2 (d)). Then, by heating and curing in the constant temperature dryer 24 (FIG. 2 (e)), the micro stamp 20 is obtained (FIG. 2 (f)). The micro stamp 20 has a convex portion 20a.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • FIG. 3 shows the procedure for transcription of cell adhesion molecules by the above micro stamp.
  • 3 (a), 3 (c), and 3 (e) show the flow of the procedure
  • FIGS. 3 (b), 3 (d), and 3 (f) are shown in FIGS. 3 (a) and 3 (f), respectively.
  • a state in which FIGS. 3 (c) and 3 (e) are viewed from the side is shown.
  • a base material 32 having a surface 32a treated with water repellent was prepared (FIGS. 3A and 3B), and cell adhesion molecules were formed on the surface of the convex portion 20a of the microstamp 20. Apply 20b. Then, the convex portion 20a of the micro stamp 20 is brought into close contact with the water-repellent surface 32a of the base material 32 (FIGS. 3 (c) and 3 (d)). As a result, the pattern of the convex portion 20a of the microstamp 20 can be transferred to the water-repellent surface 32a of the base material 32 as the pattern of the cell adhesion molecule 20b (FIGS. 3 (e) and 3 (f)).
  • FIG. 4 shows a procedure for pattern formation of cell adhesion molecules by the sealing method.
  • 4 (a), 4 (c), and 4 (e) show the flow of the procedure
  • FIGS. 4 (b), 4 (d), and 4 (f) are shown in FIGS. 4 (a) and 4 (f), respectively.
  • a state in which FIGS. 4 (c) and 4 (e) are viewed from the side is shown.
  • the sealing material 50 having the holes 50a is placed in close contact with the base material 32 (FIG. 4A).
  • the close contact arrangement means a state in which air is not caught between the sealing material 50 and the base material 32.
  • no air biting means a state in which there is no air biting that affects the pattern formation of cell adhesion molecules. For example, even if there are bubbles sufficiently small with respect to the film thickness of the sealing material 50. Good.
  • the method of closely arranging them is not particularly limited. A method may be used in which the material of the sealing material 50 is applied to the entire surface of the base material 32 and then the holes 50a are formed, or the sealing material 50 in which the holes 50a are formed in advance may be attached to the base material 32.
  • the cell adhesion molecule 20b is placed on the sealing material 50 (FIG. 4 (c)).
  • the method of arranging the cell adhesion molecule 20b is not particularly limited. Coating, dipping, spraying and the like can be preferably used. Then, by removing the cell adhesion molecule 20b on the sealing material 50 and then removing the sealing material 50, the pattern of the cell adhesion molecule 20b can be obtained (FIG. 4 (e)).
  • the thickness 20b of the finished cell adhesion molecule 20b (cell adhesion molecule region) can be easily controlled by controlling the thickness of the sealing material 50.
  • the sealing material 50 needs to have a property that its component does not remain on the base material 32 when it is peeled off from the base material 32. This is because if it remains on the substrate 32, it may become a contaminant for the cells to be cultured.
  • the sealing material 50 also needs to have a property that the base material 32 itself does not deteriorate after being peeled off from the base material 32. Further, the sealing material 50 is also required to have a property that it can be easily peeled off from the base material 32 and the cell adhesion molecule 20b fixed at the time of peeling is not peeled off from the base material 32.
  • the material of the sealing material 50 is not particularly limited as long as it can achieve such characteristics, but resin materials such as thermosetting resins, thermoplastic resins, and photocurable resins, and peptide materials typified by gelatin and the like can be used. Paper, clay (mixture of inorganic substance and resin) and the like can be preferably used.
  • a cell culture kit in which the sealing material 50 in which the pores 50a are formed on the base material 32 in advance is formed is effective.
  • the cell adhesion molecule 20b uses a material of the user's preference.
  • Such a cell culture kit can be said to be a cell culture kit for spheroid formation in which a sealing material 50 having holes 50a formed in a base material 32 having a water-repellent surface 32a is closely arranged.
  • a cell culture kit in which the cell adhesion molecule 20b is arranged in the pore 50a may be used.
  • Such a cell culture kit can be said to be a cell culture kit for spheroid formation in which a sealing material 50 having pores 50a formed on the substrate 32 is formed and cell adhesion molecules 20b are arranged in the pores 50a.
  • the holes 50a formed in the sealing material 50 are arranged with holes 50a having similar shapes of different sizes.
  • the quality of spheroids in the cells to be cultured may differ depending on the size of the cell adhesion molecule region. Therefore, if the sealing material 50 having pores 50a having different sizes is arranged on the base material 32, it is easy to determine how much cell adhesion molecule region should be formed when culturing cells for the first time. You can look it up in.
  • FIG. 5A exemplifies a cell culture kit for spheroid formation in which pores 50a having different sizes are formed.
  • the base material 32 exists behind the sealing material 50.
  • the holes 50aa, the holes 50ab, the holes 50ac, and the holes 50ad become smaller holes 50a in this order.
  • the sealing material 50 may be provided with a protruding portion or a tab at the end portion for gripping at the time of peeling so that the sealing material 50 can be easily peeled off.
  • FIG. 5B shows a cell culture kit for spheroid formation in which a protrusion 52 is formed.
  • the base material 32 exists behind the sealing material 50.
  • the protruding portion 52 is a portion protruding from the sealing material 50 in the same plane.
  • FIG. 5C shows a cell culture kit for spheroid formation in which tabs 54 are arranged.
  • FIG. 5 (d) is a side view of the cell culture kit for spheroid formation shown in FIG. 5 (c).
  • the tab 54 is a film sandwiched between the base material 32 and the sealing material 50. When the sealing material 50 is peeled off, the sealing material 50 can be peeled off from the base material 32 by sandwiching the tab with tweezers or the like and pulling it.
  • Cell culture The cell culture will be described below with reference to FIG. When cells are cultured in the culture medium 41 using the cell culture scaffold of the present invention, as shown in FIG. 6, cells are found on the surface of the cell adhesion molecule 20b patterned on the water-repellent surface 32a of the substrate 32. Multiply.
  • the cell culture may be carried out by a usual method except that the cell culture scaffold according to the present invention is used.
  • the interface between the water-repellent surface 32a and the cell adhesion molecule 20b has adhesiveness that does not easily peel off, but with the passage of time, the interface between the water-repellent surface 32a and the cell adhesion molecule 20b adheres. The sex is reduced.
  • the cell adhesion molecule 20b is naturally exfoliated due to the decrease in adhesive strength.
  • the cell adhesion molecule 20b can be peeled off by stimulating the interface with reduced adhesive strength by pipetting or the like.
  • the cell culture 42 floats in the culture solution 41, and by collecting this, the cell culture 42 can be recovered without being destroyed.
  • the cell adhesion molecule 20b is surrounded and floats together in the cell culture 42.
  • adhesive cells are basically assumed. Although not particularly limited, examples thereof include epithelial-like cells, mesenchymal cells, and fibrous cells.
  • pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, tissue-based stem cells, progenitor cells, and the like are also included in the application targets.
  • ⁇ Cell adhesion molecule> Fibronectin (5 ⁇ g / cm 2 ): Fibronectin solution, derived from human plasma (063-05591 / Wako) (2) Vitronectin (1 ⁇ g / cm 2 ): rhVTN (220-02041 / Wako) (3) Matrigel (250-340 ⁇ g / ml): Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR (354230 / Corning) (4) Collagen (1.6 ⁇ g / ml): Collagen type IV derived from bovine lens (acid extraction) (0.5 mg / ml) (ASC-4-104-01 / Nippi)
  • (1-2) Culture solution A mixed solution of (a): (b): (c): (d): (e) 100 mL: 390 mL: 5 mL: 5 mL: 3.5 ⁇ l was used.
  • (a) to (e) are each (A) SSR (191-18375 / Wako) (B) DMEM-F12 (046-322275 / Wako) (C) 200 mM L-alanyl-L-glutamine (01102-82 / Nakarai) (D) MEM non-essential amino acid solution (16224004 / Nakarai) (E) 2-Mercaptoethanol (135-07522 / Wako) Is.
  • DMEM medium 4.75 g of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) is dissolved in ultrapure water to obtain 500 ml of a solution. Mix in a stirrer for 30 minutes, autoclave and store.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • MMC solution Prepare a solution with the following composition.
  • Dispase solution (200 PU / ml) Prepare a solution with the following formulation.
  • Dispase II 0.25g DMEM 150ml After dissolution and sterilization by filtration through a 0.22 um filter, 1 ml each is dispensed into a 15 ml centrifuge tube and stored at ⁇ 20 ° C. (200 PU / ml). At the time of use, 9 ml of DMEM is further added and diluted 10-fold before use.
  • Cryopreservation solution DAP213 2M DMSO, 1M acetamide, 3M propylene glycol / human iPS cell medium (DAP213) is prepared by the following procedure. Dissolve 0.59 g acetamide in about 6 ml of iPS medium. Filter sterilize with a 0.22 ⁇ m filter and transfer to a 15 ml centrifuge tube. Add 1.42 ml of DMSO and 2.2 ml of propylene glycol. Mes up to 10 ml with medium, mix well, dispense 0.5 ml each into cryotubes and store at -80 ° C. It can be thawed and frozen several times.
  • the DAP to be added may be 200 ⁇ l regardless of the number of frozen cells. 12) Freeze in liquid nitrogen for 30 seconds to 1 minute to completely freeze the inside. 13) Transfer to a liquid nitrogen storage container.
  • the cell suspension is collected in a 15 ml centrifuge tube and centrifuged at 1500 rpm for 3-5 minutes. 5) The supernatant is aspirated and discarded, and 1 ml of human iPS cell medium is added. Gently pipette and suspend the iPS cell colonies to the extent that they do not become too small. For large colonies, lightly press the tip of the pipette that sucked up the cell suspension against the bottom of the centrifuge tube to gently drain the cell suspension and loosen it. 6) Remove the feeder cell medium by suction and add 3 ml of human iPS cell medium. 7) Seed the whole amount and add the bFGF solution to 15 ng / ml.
  • (2-2) Culture solution A mixed solution of (a): (b) 50: 450 (mL) was used. However, in the above, (a) and (b) are respectively.
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Nissui 05919): 433 ml (4.75 g dissolved in ultrapure water and autoclaved) 10% w / w NaHCO 3 (Nakarai) solution: 7 ml (dissolve in 0.7 g ultrapure water and autoclave) 200 mM L-glutamine (Nacalai) solution: 10 ml (0.292 g dissolved in ultrapure water and filtration) FBS (Bioest): 50 ml (deactivated)
  • Hek293 1) Discard the medium by suction and add an appropriate amount of PBS (-). 2) Collect cells by pipetting, use several tens of ⁇ l to count the number of cells, and centrifuge the rest at 1500 rpm / 3 minutes. 3) to seed cells in a 4-well dish 3.0 ⁇ 10 5 / well. 4) Incubate in an incubator. Medium is changed every 2 days.
  • the table below summarizes the dimensions of each photomask.
  • ⁇ 1 to ⁇ 3 and d are as shown in FIGS. 7 (e) and 7 (f).
  • ⁇ 1 is the diameter of the inner circle of the mask
  • ⁇ 2 is the diameter of the outer circle of the mask
  • ⁇ 3 is the diameter of the mask.
  • the diameter of each dot, d is the distance between the center points of adjacent dots.
  • a resist is applied on a silicon substrate, the resist is heated and solidified with a heater, and then exposed, developed, and washed through each of the photomasks, and the mold is formed. Was produced.
  • micro stamps were prepared using the four types of molds prepared above.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • each micro stamp will be referred to as a micro stamp 1 to 4 in correspondence with the photomasks 1 to 4 in Table 2 above.
  • the cells were cultured using the iPS cells prepared above using DMEM + 10% FBS as a medium in an environment of 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%.
  • the number of seeded cells was 1.6 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , the culture period was 10 days, and after 10 days, extremely weak stimulation by pipetting was applied to detach the cells from the scaffold, and the detached cells were removed. It was observed with a phase contrast microscope. Observation was performed every day or every other day, and medium exchange was performed every other day.
  • other cells are prepared by forming various cell adhesion molecules on the fluororesin layer in a dot shape (about 1000 ⁇ m in diameter for fibronectin and vitronectin, about 1500 ⁇ m in diameter for fibronectin and vitronectin) using a pipette.
  • the cell culture scaffold was used.
  • FIG. 8 (a) is a photograph of Example 1
  • FIG. 8 (b) is a photograph of Example 2
  • FIG. 8 (c) is a photograph of Example 3
  • FIG. 8 (d) is a photograph of a cell culture before exfoliation of Example 4.
  • FIG. 9 (a) is a photograph of Example 1
  • FIG. 9 (b) is a photograph of Example 2
  • FIG. 9 (c) is a photograph of Example 3
  • FIG. 9 (d) is a photograph of a cell culture after exfoliation of Example 4. ..
  • ⁇ When the cell aggregate can be regarded as spherical with sufficient thickness and size three-dimensionally ⁇ : When the cell aggregate has a certain thickness and size three-dimensionally ⁇ : Most of the cells aggregate If it is not and is dispersed two-dimensionally (if it is thick, the transmitted light is reduced and the color looks dark when observed under a microscope).
  • cell cultures are formed in various combinations of cultured cells and cell adhesion molecules, and the cells are suspended in the culture medium and recovered without being destroyed. I found that I could do it.
  • FIG. 14 illustrates the pattern of the cell adhesion molecule 20b produced by the sealing method.
  • a flat quartz substrate spin-coated with a fluororesin (Cytop CTX-809A, manufactured by AGC Inc.) was used.
  • the sealing material 50 was formed by spin-coating a base material 32 with an ultraviolet curable resin (manufactured by DYMAX), curing with ultraviolet rays using a negative pattern of a dot pattern as a mask, and then removing the uncured portion.
  • FIG. 14A shows a sealing material 50 having four holes 50a formed on the base material 32.
  • the scale bar is 10 mm.
  • FIG. 14B shows a state in which the sealing material 50 is peeled off from the base material 32. Even if the sealing material 50 was peeled off from the base material 32, the components of the sealing material 50 did not remain on the base material 32 and could be peeled off cleanly.
  • FIG. 14C shows a patterned cell adhesion obtained by applying the cell adhesion molecule 20b in a state where the sealing material 50 is formed on the base material 32, fixing the cell adhesion molecule 20b for 1 hour, and then peeling the sealing material 50.
  • It is a photograph of a molecule 20b (cell adhesion molecule region).
  • a cylindrical cell adhesion molecule 20b having a diameter of 1 mm and a thickness of 0.1 mm could be obtained.
  • the cell adhesion molecule 20b on the substrate 32 is the cell culture scaffold according to the present invention.
  • the cell culture kit for spheroid formation according to the present invention is obtained by closely arranging the sealing material 50 having holes 50a formed on the base material 32 of FIG. 14A.
  • spheroids were prepared using the cell culture scaffold prepared by the sealing method.
  • Matrigel was added from above the sealing material 50 (arrangement of cell adhesion molecules), and the cells were fixed in the incubator at 37 ° C. for 1 hour.
  • the sealing material 50 was peeled off with flame-sterilized tweezers to obtain a cell culture scaffold in which cell adhesion molecule (Matrigel) dots having a diameter of 1000 ⁇ m were patterned.
  • the cells (Hek293) used in Examples 5, 10 and 14 were seeded on the base material 32.
  • the cells were cultured by the same culture method as in the above example (the method described in "(2-4) Culture procedure"). After seeding the cells, the cells were peeled off from the substrate 32 by pipetting on the 5th day, and the cells were observed on the 6th day.
  • the cell culture scaffold according to the present invention can be suitably used for obtaining a spheroid-like cell culture.

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Abstract

細胞培養後、細胞培養物を破壊することなく回収することができる細胞培養足場及び細胞培養物の作製方法を提供することを課題とする。　本発明にかかる細胞培養足場は、撥水性表面を有する基材と、前記基材の撥水性表面に形成された細胞接着分子とを備える。また、本発明にかかる細胞培養物の作製方法は、上記細胞培養足場を用いて、上記細胞接着分子表面で細胞を培養する工程を含む。本発明に係る細胞培養足場は、細胞をダメージなくスフェロイド状で回収することができる。

Description

細胞培養足場、その製造方法と足場製造キット及び細胞培養物の作製方法
　本発明は、細胞を培養するための細胞培養足場と、この細胞培養足場を用いて細胞培養物（特に三次元細胞集合体）を作製する方法に関する。
　細胞培養後に、細胞培養物を培養足場から剥離する方法としては、酵素を用いる方法が知られている。しかし、この方法では、細胞間の結合を壊さずに、細胞培養物を回収することが困難である。
　また、細胞培養足場に温度応答性ポリマーを用い、熱処理を行って温度応答性ポリマーを分解することにより、細胞培養物を培養足場から剥離し、回収する方法も知られている（例えば、特許文献１等参照。）。
　また、再生医療においては、培養した細胞をスフェロイドとして回収したい要求が高い。細胞をスフェロイドに培養する点については、非特許文献１などが提案されている。ここでは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）面上にハイドロキシアパタイトのドットパターンを形成し、そのうえで細胞を培養し、スフェロイドを形成している。
　また、細胞担体とし、疎水性基材にタンパク質、ペプチドといった細胞外マトリックスをコートした基材も知られている（特許文献２）
特開２０１３－０９９２８２号公報 特開２０１６－２１４２１０号公報
田村他「細胞／スフェロイドアレイを目的としたアパタイトドット作製法の検討」生体医工学シンポジウム２０１３（予稿集ｐ．１４１），２０１３年９月２０日発表
　特許文献１の方法は、培養―剥離のプロセスを狭いマージンの温度管理下で行うことが必要であるため、温度コントロールが困難であり、また、サイズコントロールも容易ではない。
　非特許文献１は、細胞をスフェロイド様に培養する点の記載はあるものの、これを基材から剥離させるという点の知見はない。特許文献２は疎水性基材上に細胞外マトリックスをコートした記載はあるものの、そもそもスフェロイドを形成しようとするものでははい。
　従来細胞を、３次元的に集合したスフェロイドに培養し、回収しようとすると、以下の問題点があった。
（１）スフェロイドができても劣化なく基板から剥がすことができない。
（２）大きさが不均一な浮遊スフェロイドしか作製できない。
（３）構成する全ての細胞が分化誘導したスフェロイドを作製できない。
（４）スフェロイドを構成する全ての細胞に、適切な細胞極性を持たせた状態のスフェロイドを作製できない。
　上記の先行文献はこれらの課題を解決できず、細胞のスフェロイドを回収することができなかった。
　そこで、本発明は、細胞培養後、細胞培養物を破壊することなく回収することができる細胞培養足場とこれを用いた細胞培養物の作製方法を提供することを目的とする。
　本発明は、上記課題を解決するため、以下の構成を備える。
　すなわち、本発明にかかる細胞培養足場は、フッ素樹脂による撥水性表面を有する基材と、前記基材の撥水性表面に形成された細胞接着分子とを備える。
　また、本発明にかかる細胞培養物の作製方法は、上記細胞培養足場を用いて、上記細胞接着分子表面で細胞を培養する工程を含む。
　本発明にかかる細胞培養足場を用いて細胞を培養すると、細胞培養開始後、一定期間はフッ素樹脂による撥水性表面と細胞接着分子との界面が強固に接着しているが、さらに一定期間経過すると前記界面の接着性が低下する。この経時的な接着性の変化を利用することによって、一定の段階まで細胞を培養したのち、細胞培養足場から、細胞培養物を破壊することなく浮遊させることができる。しかも、細胞接着分子をパターン状に形成することで、細胞培養物が三次元的に集合した三次元細胞集合体として回収できる。また、この三次元細胞集合体は、互いに大きさが同じ程度のものが多数回収できる。さらに、温度応答性ポリマーを用いる場合のような温度コントロールの困難性もなく、また、サイズコントロールが容易なことも本発明の優位点である。
　したがって、２次元的に培養した幹細胞に誘導因子を添加し、細胞極性を形成した後に、それを維持したまま適切なタイミングで細胞にダメージが少ないピペッティング等の操作で細胞を基材から剥がすことにより、３次元のスフェロイドを形成させることができると考えられ、従来スフェロイドを得る際に問題となった上記の課題を解決することができる。
スタンプ法における鋳型作製の手順を示す模式図である。 スタンプ法におけるマイクロスタンプ作製の手順を示す模式図である。 マイクロスタンプによる細胞接着分子の転写の手順を示す模式図である。 シール法による細胞接着分子のパターン形成手順を示す模式図である。 スフェロイド形成用細胞培養キットの他の形態を例示する図である。 本発明にかかる細胞培養足場を用いた細胞培養の様子を示す模式図である。 実施例で用いたフォトマスクの平面図である。 実施例１～４における剥離前の細胞培養物の写真である。 実施例１～４における剥離後の細胞培養物の写真である。 実施例５～９における培養及び剥離後の細胞培養物の写真である。 実施例１０～１３における培養及び剥離後の細胞培養物の写真である。 実施例１４～１８における培養及び剥離後の細胞培養物の写真である。 実施例１９，２０における培養及び剥離後の細胞培養物の写真である。 シール法による細胞接着分子のパターンを形成した実際の写真である。 シール法によって作製した細胞培養足場で作製したスフェロイドの写真である。
　以下、本発明にかかる細胞培養足場及び細胞培養物の作製方法について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
〔基材〕
　本発明における基材は、フッ素樹脂による撥水性表面を有する。
　このような撥水性表面を有する基材としては、例えば、シャーレ、ウェル、プレート、マルチプレート、フラスコなどの基材がフッ素樹脂以外の材料からなり、当該基材の表面にフッ素樹脂層をコーティングしたものを用いることができる。
　フッ素樹脂以外の材料からなる基材としては、例えば、ポリスチレンなどのプラスチック製やガラス製などの既存の基材を用いることができる。フッ素樹脂層が容易に剥離しないものを適宜選択すれば良い。
　基材上に、フッ素樹脂層を形成する方法としては、特に限定されず、例えば、スピンコーティング、ディップコーティング、スプレーコーティングなどの公知の塗布手段により、基材上にフッ素樹脂層を塗布し、加熱するなどして硬化することにより、形成することができる。
　また、上記と異なり、フッ素樹脂製のシャーレなど、基材の材料としてフッ素樹脂が用いられたものであっても良く、このような基材も、本発明にいう「フッ素樹脂による撥水性表面を有する基材」に含まれる。
　フッ素樹脂としては、公知のフッ素樹脂を用いることができ、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化ビニル、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂、四フッ化エチレン・六フッ化プロピレン共重合体、エチレン・四フッ化エチレン共重合体、エチレン・クロロトリフルオロエチレン共重合体などが好ましく挙げられる。
〔細胞接着分子〕
　細胞接着分子は、例えば、コラーゲン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、ヘパラン硫酸、プロテオグリカンなどの細胞外マトリックスやそれらの細胞接着部位を断片化した分子、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン塩酸塩などのカチオン性高分子などが挙げられる。
　このような細胞接着分子自体は、従来公知であり、培養する細胞の種類などに応じて適宜選択することができる。
〔細胞培養足場〕
　本発明の細胞培養足場は、上記撥水性表面を有する基材と、上記基材の撥水性表面に形成された細胞接着分子とを備える。
　基材の撥水性表面に細胞接着分子を形成する方法としては、例えば、スピンコーティング、ディップコーティング、スプレーコーティングなどの公知の塗布手段により行うことができる。
　また、単純にコーティングするのではなく、細胞接着分子を、基材の撥水性表面にパターン状に形成してもよい。
　ここで「パターン状」を説明する。撥水性表面を有する基材上に細胞接着分子を連続的に形成した領域を細胞接着分子領域と呼ぶ。細胞接着分子領域は、基材との間に境界となる縁を有する。つまり、縁は、細胞接着分子領域と基材表面の境である。
　「パターン状」とは、細胞接着分子領域が基材上に少なくとも１つ以上、好ましくは複数個所形成された状態をいう。各細胞接着分子領域は、同一形状でなくてもよく、また、大きさが異なってもよい。なお、細胞接着分子領域を単に細胞接着分子とも呼ぶ。
　細胞接着分子をパターン状に形成する場合、培養細胞を三次元細胞集合体として回収することができる。
　ここで、三次元細胞集合体は、細胞が三次元的に集合したものである。三次元的な細胞のコロニーはスフェロイドと呼ばれる。また、複数種の細胞からなり、臓器に特異的な種類の細胞の集合体はオルガノイドと呼ばれる。
　このような三次元細胞集合体においては、二次元細胞培養物では発現されない組織としての機能の発現が認められ、人体を使用せずに薬品などの効果を確認するなど、種々の利用方法が期待されている。しかし、従来、三次元細胞集合体を破壊することなく、回収することは困難であった。
　従って、本発明は、上記のごとき三次元細胞集合体を破壊することなく回収する手段として、極めて有効であり、しかも、温度応答性ポリマーを用いる場合のような温度コントロールの困難性もなく、また、サイズコントロールが容易であるという利点をも有する。
　例えば、細胞接着分子をドット状（略円形形状）にパターン形成することにより、各ドットの大きさに依存した大きさの三次元細胞集合体を形成させることができる。
　この場合、ドット（細胞接着分子領域）の大きさとしては、例えば、直径１００～１０００μｍとすることができる。培養する細胞を５～２５μｍ程度とすると、細胞接着分子領域が小さすぎるとスフェロイドが小さくなり、組織細胞としては不十分である。一方、接着分子領域が大きすぎると、内部の細胞が壊死してしまう。
　なお、本発明においては、上記ドット状に限らず、目的に応じて、種々のパターン形状を採用し得ることはいうまでもない。
　細胞接着分子のパターン形成は、特に限定するわけではないが、例えば、インクジェットプリンタによる方法や、スタンプ法、シール法などが挙げられる。スタンプ法では、マイクロメートルオーダーで大きさを制御することも可能であり、好ましい。
　また、シール法では、予め基材に、細胞接着分子のパターン（大きさ、厚さ）形状の貫通孔を有するシール材を用いることで、細部接着分子のパターン形成に手技の習熟性を必要とせず、容易にかつ正確に細胞接着分子のパターンを形成することができる。
　細胞接着分子のパターン状の貫通孔を有するシール材を基材に貼り付けておき、細胞接着分子を塗布し、その後シール材を剥がすことで、細胞接着分子のパターン形成を行うこともできる。
　スタンプ法の手順について、図１、２を参照して、以下に説明する。
　図１は鋳型作製の手順を示す図である。
　具体的には、まず、シリコン基板１１上にレジスト１２を塗布する（図１（ａ））。ヒーター１３でレジスト１２を加熱硬化したのち（図１（ｂ））、光源１４を用いて、フォトマスク１５を通して露光してパターンを形成する（図１（ｃ））。その後、現像、洗浄して、鋳型１０が得られる（図１（ｄ））。
　図２は上記鋳型を用いたマイクロスタンプ作製の手順を示す図である。
　具体的には、まず、外容器９内に載置した鋳型１０に対して（図２（ａ））、ゴム管２１を配置した状態（図２（ｂ））で、上記鋳型１０に離型剤２２で離型処理を施した（図２（ｃ））後、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのスタンプ材料２３を流し込む（図２（ｄ））。その後、定温乾燥機２４内で加熱硬化することにより（図２（ｅ））、マイクロスタンプ２０が得られる（図２（ｆ））。マイクロスタンプ２０は、凸部２０ａを有している。
　次に、図３に、上記マイクロスタンプによる細胞接着分子の転写の手順を示す。図３（ａ）、図３（ｃ）、図３（ｅ）は手順の流れを示し、図３（ｂ）、図３（ｄ）、図３（ｆ）は、それぞれ図３（ａ）、図３（ｃ）、図３（ｅ）を側面視した状態を示す。
　図３を参照して、まず、表面３２ａを撥水処理した基材３２を用意し（図３（ａ）、図３（ｂ））、上記マイクロスタンプ２０の凸部２０ａ表面に、細胞接着分子２０ｂを塗布する。そして、マイクロスタンプ２０の凸部２０ａを、基材３２の撥水性表面３２ａに密着させる（図３（ｃ）、図３（ｄ））。これにより、マイクロスタンプ２０の凸部２０ａのパターンを基材３２の撥水性表面３２ａに細胞接着分子２０ｂのパターンとして転写することができる（図３（ｅ）、図３（ｆ））。
　次にシール法について説明する。図４はシール法による細胞接着分子のパターン形成の手順を示す。図４（ａ）、図４（ｃ）、図４（ｅ）は手順の流れを示し、図４（ｂ）、図４（ｄ）、図４（ｆ）は、それぞれ図４（ａ）、図４（ｃ）、図４（ｅ）を側面視した状態を示す。
　基材３２に対して、孔５０ａが形成されたシール材５０を密着配置させる（図４（ａ））。ここで密着配置とは、シール材５０と基材３２の間に空気の咬み込みがない状態をいう。なお、空気の咬み込みがないとは、細胞接着分子のパターン形成に影響するような空気の咬み込みがない状態をいい、例えば、シール材５０の膜厚に対して十分小さな気泡はあってもよい。
　密着配置のさせ方は特に限定されない。シール材５０の材料を基材３２の全面に塗布してから孔５０ａを形成する方法であってもよいし、予め孔５０ａが形成されたシール材５０を基材３２に貼り付けてもよい。
　次にシール材５０の上から細胞接着分子２０ｂを配置する（図４（ｃ））。細胞接着分子２０ｂの配置の方法は特に限定されない。塗布、ディップ、スプレー等が好適に利用できる。そして、シール材５０上の細胞接着分子２０ｂを除去してからシール材５０を除去することで、細胞接着分子２０ｂのパターンを得ることができる（図４（ｅ））。
　シール法では、シール材５０の厚みを制御することで、出来上がりの細胞接着分子２０ｂ（細胞接着分子領域）の厚み２０ｂｈを容易に制御することができる。
　シール材５０は、基材３２から剥がす際に基材３２にその成分が残らない特性が必要である。基材３２上に残ると、培養する細胞に対する汚染物となる可能性もあるからである。
　また、シール材５０は基材３２から剥がした後に、基材３２自体が劣化しない特性も必要となる。また、シール材５０は、基材３２から容易に剥がすことができ、引きはがしの際に定着させた細胞接着分子２０ｂを基材３２から剥がさない特性も必要である。
　このような特性を達成できる材料であれば、シール材５０の材質に特に限定はないが、熱硬化性樹脂、熱可塑性樹脂、光硬化性樹脂といった樹脂材やゼラチン等に代表されるペプチド材、紙、粘土（無機物と樹脂の混合物）等が好適に利用できる。
　なお、基材３２上にシール材５０を密着配置させるのに、貼り付けで行うには手技の成熟度が要求される。したがって、予め基材３２上に孔５０ａが形成されたシール材５０を形成した細胞培養キットは有効である。細胞接着分子２０ｂは、利用者が好みの材料を用いるのである。このような細胞培養キットは、撥水性表面３２ａを有する基材３２に孔５０ａが形成されたシール材５０が密着配置されたスフェロイド形成用細胞培養キットと言ってよい。
　また、もちろん、細胞接着分子２０ｂを孔５０ａ内に配置したものと細胞培養キットとしてもよい。このような細胞培養キットは、基材３２上に孔５０ａが形成されたシール材５０を形成し、孔５０ａ中に細胞接着分子２０ｂを配置したスフェロイド形成用細胞培養キットと言ってよい。
　また、スフェロイド形成用細胞培養キットにおいては、シール材５０に形成される孔５０ａが、大きさの異なる相似形状の孔５０ａが配置されているものは望ましい。本発明に係る細胞培養足場では、細胞接着分子領域の大きさで培養される細胞のスフェロイドの出来具合が異なる場合がある。そのため、大きさの異なる孔５０ａが形成されたシール材５０が基材３２上に配置されていれば、初めての細胞を培養する場合、どの程度の細胞接着分子領域を形成すればよいかを容易に調べることができる。
　図５（ａ）には、大きさの異なる孔５０ａが形成されたスフェロイド形成用細胞培養キットを例示する。基材３２はシール材５０の裏に存在する。孔５０ａａ、孔５０ａｂ、孔５０ａｃ、孔５０ａｄは、この順で小さい孔５０ａとなる。もちろん、孔５０ａの配置や大きさのバリエーションに限定はない。
　さらに、シール材５０は剥がしやすいように、端部に剥離時に把持するための突出部若しくはタブが配置されていてもよい。図５（ｂ）には、突出部５２が形成されたスフェロイド形成用細胞培養キットを示す。基材３２はシール材５０の後ろに存在する。突出部５２は、シール材５０から同一平面内で突き出た部分である。
　また、図５（ｃ）には、タブ５４を配したスフェロイド形成用細胞培養キットを示す。図５（ｄ）は図５（ｃ）のスフェロイド形成用細胞培養キットの側面視である。
　タブ５４は、基材３２とシール材５０の間に挟み込まれたフィルムである。シール材５０を剥離させる場合はピンセット等でこのタブを挟んで引っ張ることで、シール材５０を基材３２から剥離させることができる。
〔細胞培養〕
　細胞培養について、図６を参照しつつ、以下に説明する。
　本発明の細胞培養足場を用いて、培養液４１中で細胞培養を行うと、図６に示すように、基材３２の撥水性表面３２ａにパターン形成された細胞接着分子２０ｂの表面で細胞が増殖する。
　細胞培養は、本発明にかかる細胞培養足場を用いることを除けば、通常の方法により行えば良い。
　細胞培養初期においては、撥水性表面３２ａと細胞接着分子２０ｂとの界面は容易に剥離しない接着性を有しているが、時間の経過とともに撥水性表面３２ａと細胞接着分子２０ｂとの界面の接着性が低下する。
　接着力の低下により、自然に細胞接着分子２０ｂが剥離する。あるいは、接着力が低下した界面にピペッティングなどで刺激を与えることにより細胞接着分子２０ｂを剥離することもできる。
　細胞接着分子２０ｂが剥離すると、培養液４１中で、細胞培養物４２が浮遊するため、これを回収することにより、細胞培養物４２を破壊することなく回収することができる。
　この場合、細胞接着分子２０ｂは、図６に示すように、細胞培養物４２内に取り囲まれて一体となって浮遊する。
　細胞接着分子２０ｂ上で幹細胞を培養し、細胞接着分子２０ｂが基材３２から剥離する前に誘導因子を添加しておくことで、幹細胞が分化した細胞をスフェロイドで回収することもできる。
　本発明に適用可能な細胞としては、基本的には接着性細胞を想定している。
　特に限定するわけではないが、例えば、上皮様細胞、間葉系細胞、繊維様細胞などが挙げられる。また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞や、組織系幹細胞、前駆細胞なども適用対象に含まれる。
　以下、実施例を用いて、本発明について詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔細胞接着分子及び培養細胞の準備〕
　各実施例で用いた細胞接着分子及び培養細胞について、以下に説明する。
＜細胞接着分子＞
（１）フィブロネクチン（５μｇ／ｃｍ２）：フィブロネクチン溶液，ヒト血漿由来（０６３－０５５９１／和光）
（２）ビトロネクチン（１μｇ／ｃｍ２）：ｒｈＶＴＮ（２２０－０２０４１／和光）
（３）マトリゲル（２５０－３４０μｇ／ｍｌ）：Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｍａｔｒｉｇｅｌ　基底膜マトリックス，ＧＦＲ（３５４２３０／Ｃｏｒｎｉｎｇ）
（４）コラーゲン（１．６μｇ／ｍｌ）：コラーゲンタイプＩＶ　ウシレンズ由来（酸抽出）（０．５ｍｇ／ｍｌ）（ＡＳＣ－４－１０４－０１／ニッピ）
＜培養細胞及びその入手元、型番＞
（１）Ｈｅｌａ：東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター、ＴＫＧ０３３１
（２）ＨｅｐＧ２：東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター、ＴＫＧ０２０５
（３）Ａ５４９：東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター、ＴＫＧ０１８４
（４）ＭＣＦ７：東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター、ＴＫＧ０４７９
（５）２９３：：理化学研究所バイオリソースセンター、ＲＣＢ１６３７
（６）ｉＰＳ　４０９Ｂ２：理化学研究所バイオリソースセンター、ＨＰＳ００７６
＜それぞれの細胞の培養条件＞
（１）ｉＰＳ細胞
（１－１）播種密度
　２８．５ｃｏｌｏｎｙ／ｃｍ２（５００ｃｅｌｌｓ／ｃｏｌｏｎｙで計算）、若しくはＳｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌでは１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２
（１－２）培養液
　（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）＝１００ｍＬ：３９０ｍＬ：５ｍＬ：５ｍＬ：３．５μｌの混合液を用いた。
　但し、上記において、（ａ）～（ｅ）はそれぞれ、
　（ａ）ＳＳＲ（１９１－１８３７５／和光）
　（ｂ）ＤＭＥＭ－Ｆ１２（０４６－３２２７５／和光）
　（ｃ）２００ｍＭ　Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（０１１０２－８２／ナカライ）
　（ｄ）ＭＥＭ　非必須アミノ酸溶液（１６２２４００４／ナカライ）
　（ｅ）２－メルカプトエタノール（１３５－０７５２２／和光）
である。
（１－３）剥離液
　（ａ）：（ｂ）＝０．２５ｇ：３７５ｍＬの混合液を用いた。
　但し、上記において、（ａ），（ｂ）はそれぞれ、
　（ａ）ディスパーゼＩＩ（３８３０２２８１／和光）
　（ｂ）ＤＭＥＭ－Ｆ１２（０４６－３２２７５／和光）
である。
（１－４）培養の手順
　培養の詳細な手順を以下に示す。
（１－４－１）試薬
　ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＮＩＳＳＵＩ　０５９１９）
　Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２（ＤＭＥＭ－Ｆ１２；和光　０４２３０７９５）
　Ｓｔｅｍ　Ｓｕｒｅ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＳＲ）（和光　０４６３２２７５）
　ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＢｉｏＷｅｓｔ）
　ＭＥＭ　非必須アミノ酸溶液（１００×）（ナカライ　０６３４４－５６）
　２００ｍＭ　Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（粉末；ナカライ　０１１０２－８２）
　２－メルカプトエタノール（和光　１３７０６８６２）
　マイトマイシンＣ（和光　１３９－１８７１１）
　エタノール（ナカライ　１４７１３－９５）
　エチレングリコール（ナカライ　０５８－００９８６）
　ＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇ不含）（ナカライ　０７２６９－８４）
　ゼラチン，タイプＢ，粉末，細胞培養向け生体試薬（Ｓｉｇｍａ　Ｇ９３９１－１００Ｇ）
　トリプシン粉末（ナカライ　３５５４７－６４）
　ＥＤＴＡ（ナカライ　１５１０５－３５）
　ディスパーゼＩＩ　（和光　３８３０２２８１）
　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；和光　０４３－０７２１６）
　アセトアミド（ナカライ　００１１７－３２）
　プロピレングリコール（ナカライ　２９２１８－３５）
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ナカライ　０１２８１－８４）
　ＣＨＡＰＳ（和光　３４１０４７２１）
　線維芽細胞成長因子（塩基性）（ｂＦＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ　ＡＦ－１００－１８Ｂ）
　Ｙ－２７６３２　（Ｃａｙｍａｎ　２９２１８－３５）
　セルリザーバーワン（ナカライ　０７４８５－４４）
（１－４－２）試薬の調製
（１－４－２－１）Ｌ－グルタミン溶液
　Ｌ－グルタミン３．２１２ｇを超純水に溶解させ、１１０ｍｌの溶液を得る。
　溶解後、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌後、１５ｍｌ遠沈管に１０ｍｌずつ分注し、－２０℃で保存する。
（１－４－２－２）１０％ＮａＨＣＯ３溶液
　ＮａＨＣＯ３１０ｇを超純水に溶解させ、１０％ＮａＨＣＯ３溶液１００ｍｌを得る。
　オートクレーブ溶解・滅菌後、室温で保存する。
（１－４－２－３）ＤＭＥＭ培地
　ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）４．７５ｇを超純水に溶解させ、５００ｍｌの溶液を得る。
　スターラーで３０分混和し、オートクレーブ後、保存する。
（１－４－２－４）０．１％ゼラチン溶液
　ゼラチン０．５ｇを超純水に溶解させ、５００ｍｌの溶液を得る。
　オートクレーブ溶解・滅菌後、室温で保存する。
（１－４－２－５）ＭＭＣ溶液
　下記の配合で溶液を調製する。
　マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）　１０ｍｇ
　エタノール　１ｍｌ
　エチレングリコール　９ｍｌ
　溶解後、０．２２ｕｍのフィルターにてろ過滅菌し、溶液を得る。
（１－４－２－６）ディスパーゼ液（２００ＰＵ／ｍｌ）
　下記の配合で溶液を調製する。
　ディスパーゼＩＩ　０．２５ｇ
　ＤＭＥＭ　１５０ｍｌ
　溶解し０．２２ｕｍのフィルターにてろ過滅菌後、１５ｍｌ遠沈管に１ｍｌずつ分注し、－２０℃で保存する（２００ＰＵ／ｍｌ）。
　使用時はさらにＤＭＥＭ９ｍｌを加え１０倍希釈して使用する。
（１－４－２－７）ヒトｉＰＳ細胞用培地
　下記の配合で培地を調製する。
　ＤＭＥＭ－Ｆ１２　３９０ｍｌ
　非必須アミノ酸　５ｍｌ
　２００ｍＭ　Ｌ－グルタミン　５ｍｌ
　ＳＳＲ（２０％）　１００ｍｌ
　２－メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）　３．５μｌ
　調製後４℃で保存し、２週間以内に使用する。
（１－４－２－８）ｂａｓｉｃ　ＦＧＦ溶液
　下記の配合で溶媒を溶解し、０．２２ｕｍのフィルターにてろ過滅菌後、溶液を調製する。
　ＢＳＡ　０．０５ｇ
　ＣＨＡＰＳ　０．０１ｇ
　Ｄ－ＰＢＳ（－）　１０ｍｌ
（１－４－２－９）凍結保存溶液　ＤＡＰ２１３
　以下の手順で、２Ｍ　ＤＭＳＯ，１Ｍ　アセトアミド，３Ｍ　プロピレングリコール／ヒトｉＰＳ細胞用培地（ＤＡＰ２１３）を調製する。
　０．５９ｇアセトアミドを６ｍｌ程度のｉＰＳ培地に溶解する。０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し、１５ｍｌの遠心チューブへ移す。
　ＤＭＳＯ　１．４２ｍｌ、プロピレングリコール２．２ｍｌを添加する。
　培地で１０ｍｌにメスアップし、よく混ぜて、０．５ｍｌずつクライオチューブに分注し、－８０℃で保存する。数回の融解・凍結は可能である。
（１－４－３）フィーダー細胞の調製
（１－４－３－１）ＳＴＯもしくはマウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）の解凍
１）　１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を室温に戻す。
２）　１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地８ｍｌを１５ｍｌコニカルチューブに移す。
３）　凍結保存していた細胞を３７℃ウォーターバスで完全解凍直前まで解凍する。
４）　１ｍｌディスポーザブルピペットで、培地を入れて予め準備した１５ｍｌチューブへ移す。新しい１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地１ｍｌでチューブ内を洗い、残りの細胞も回収する。
５）　１，５００ｒｐｍ、３～５分遠心する。
６）　上清を吸引し１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を１０ｍｌ加える。ピペッティングを十分に行い、細胞の凝集塊が残らないように懸濁する。
７）　細胞懸濁液全量をφ１００ディッシュに移す。
８）　３７℃、ＣＯ２インキュベーターで一晩培養し接着・増殖させる。
９）　翌日、顕微鏡で細胞の状態を観察する。１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を室温に戻す。
１０）　ディッシュ内の培地を除き、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地１０ｍｌをディッシュに加える。
１１）　３７℃、ＣＯ２インキュベーターでコンフルエントに達するまで培養する。
（１－４－３－２）マイトマイシンＣ処理
１）　細胞がコンフルエントに達していることを確認する。
２）　φ１００ディッシュに、最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにマイトマイシンＣを添加する。（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地１０ｍｌ当たり１ｍｇ／ｍｌ　マイトマイシンＣストック液１００μｌ添加。）細胞全体に液が行き渡るようディッシュを充分に揺らす。
３）　３７℃、ＣＯ２インキュベーターで２－３時間静置する。
４）　２－３時間後、ディッシュ内の培地を除き、ＰＢＳ（－）５ｍｌ以上で３回洗浄する。
５）　新たに１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを加える。
６）　３７℃、ＣＯ２インキュベーターで一晩培養する。
７）　この状態で、ほとんどの細胞は非分裂細胞となっている。
８）　ＰＢＳ（－）５ｍｌで洗浄し吸引破棄し、その後１ｍｌ　０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを加え３７℃で２．５－３分静置する。
９）　１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地３ｍｌを加え、ピペッティングし１５ｍｌ遠沈管に細胞を回収する。
１０）　１，５００ｒｐｍ、３－５分遠心。
１１）　上清を吸引し、９００μｌ　セルリザーバーワンを加え、２ｍｌ凍結チューブに２００μｌずつ分注し凍結保存。（１．９５×１０６ｃｅｌｌｓ／本、融解時φ６０×２枚に播種可能）
（１－４－３－３）フィーダー細胞の作製
１）　前日に、ディッシュに０．１％ゼラチン溶液を加える（ディッシュのサイズに応じたゼラチン溶液の添加量は下表１のとおり）。
２）　３７℃、ＣＯ２インキュベーターで３０分以上静置する。
３）　１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を室温に戻し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地　５ｍｌを１５ｍｌコニカルチューブに移す。
４）　細胞を一部カウントする。
５）　凍結保存していた細胞を３７℃ウォーターバスで完全解凍直前まで解凍する。
６）　１ｍｌディスポーザブルピペットで、培地を入れて予め準備した１５ｍｌチューブへ移す。新しい１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地１ｍｌでチューブ内を洗い、残りの細胞も回収する。
７）　１，５００ｒｐｍ、３－５分遠心する。
８）　上清を吸引し１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加える。ピペッティングを十分に行い、細胞の凝集塊が残らないように懸濁する。
９）　細胞濃度が０．８－１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように加えるため培地の量を計算する。
１０）　ゼラチン溶液を除き、計算した量の細懸濁液をφ６０ディッシュに播種する。
１１）　３７℃、ＣＯ２インキュベーターで一晩培養する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（１－４－３－４）ヒトｉＰＳ細胞の継代培養法
１）　前日までに、フィーダー細胞を準備する。
（以下の試薬容量は、６０ｍｍ細胞培養ディッシュ１枚の場合）
２）　ヒトｉＰＳ細胞用培地とディスパーゼ液を室温に戻す。
３）　ディスパーゼ液０．５ｍｌをディッシュに加え、細胞表面全体に液が行き渡るようにした後、３７℃、ＣＯ２インキュベーターで３分加温する。
４）　細胞の状態を顕微鏡で観察し、ディスパーゼ液を除去する。
５）　３７℃で１０分インキュベーションする。半分以上のコロニーが周囲から小さくまとまり、フィーダー細胞からはがれかけている状態が望ましい。
６）　ヒトｉＰＳ細胞用培地を１ｍｌ加え、細胞をディッシュからはがす。数回（１０回以内）ピペッティングを行い、コロニーを適切なサイズに砕く。ギルソンＰ－１０００を使用するとよい。（ｉＰＳ細胞コロニー１つあたり約１００細胞程度になるようにする。）コロニーが小さくなりすぎると再接着・増殖の効率が極端に低下する原因になるため、顕微鏡で確認しながら、コロニーを解離する。
７）　７００ｒｐｍ、２分遠心し、上清をできるだけ除く。
８）　フィーダー細胞のディッシュから培地を除き、ヒトｉＰＳ細胞用培地を３ｍｌずつ加える。
９）　コニカルチューブに１．５－２ｍｌの培地を加え、軽く懸濁する。既にｉＰＳ細胞は１００細胞前後の適切なサイズのコロニーなっているため、激しいピペッティングを避ける。もし大きなコロニーがみえるようなら、細胞懸濁液を吸い上げたピペットの先端をコニカルチューブの底に軽く押しつけ、穏やかに細胞懸濁液を排出して細胞をほぐす。フィーダー細胞ディッシュ×１枚あたり１ｍｌのヒトｉＰＳ細胞懸濁液を加える。１５ｎｇ／ｍｌの終濃度でｂＦＧＦを加える。（必要であれば、Ｙ－２７５３２溶液を１０μＭ／ｍｌとなるように添加する。）
１０）　細胞の状態を顕微鏡で観察する。ｉＰＳ細胞のコロニーがディッシュ全体に行き渡るように、ディッシュを充分に揺する。
１１）　３７℃、ＣＯ２インキュベーターで一晩培養する。
１２）　翌日、顕微鏡で細胞の状態を観察し、培地交換する。
１３）　以後毎日培地交換する。３－４日でコンフルエントになる。
（１－４－３－５）ヒトｉＰＳ細胞の凍結保存法
１）　コンフルエントの状態のヒトｉＰＳ細胞をφ６０ディッシュ×１枚準備する。
２）　ヒトｉＰＳ細胞用培地とディスパーゼ液を室温に戻す。液体窒素と氷を準備する。
凍結保存用チューブ（Ｎｕｌｇｅｎｅ　＃５０００－１０１２）に「細胞名」「日付」「継代数」等を記入し、氷上で冷やしておく。
３）　凍結保存液ＤＡＰ２１３を解凍、氷上で冷やしておく。
４）　ヒトｉＰＳ細胞ディッシュの培地を除き、適量のＰＢＳ（－）を加え洗浄し破棄する
５）　ディスパーゼ液５００μｌをディッシュに加え、細胞表面全体に液が行き渡るようにした後、３７℃、ＣＯ２インキュベーターで３分加温する。
６）　細胞の状態を顕微鏡で観察し、ディスパーゼ液を除去する。
７）　３７℃で１０分インキュベーションする。
８）　ヒトｉＰＳ細胞用培地を３ｍｌ加え、細胞全体をディッシュからはがす。
９）　細胞を１５ｍｌ遠沈管に回収する。
１０）　１５００ｒｐｍ、３－５分遠心し、上清をできるだけ除く。
１１）　ＤＡＰ２１３を２００μｌ加え、穏やかに懸濁する。予め準備した凍結保存用チューブに移す。ピンセットで凍結チューブをつかみ、液体窒素につける。ＤＡＰは細胞毒性が強いため出来る限りすばやく作業するように留意する。目安として１５秒以内が望ましい。また、加えるＤＡＰは、凍結する細胞数に関係なく２００μｌで良い。
１２）　液体窒素中で、３０秒から１分凍結し、内部まで完全に凍らせる。
１３）　液体窒素保存容器に移す。
（１－４－３－６）ヒトｉＰＳ細胞の解凍
１）　前日までに、ヒトｉＰＳ細胞の凍結チューブ１本あたりφ６０ディッシュ×１枚分のフィーダー細胞を用意する。
２）　ヒトｉＰＳ細胞用培地１０ｍｌを１５ｍｌコニカルチューブに移し、３７℃ウォーターバスで温めておく。
３）　凍結保存していたヒトｉＰＳ細胞凍結チューブに、あらかじめ３７℃に温めたヒトｉＰＳ細胞用培地を１ｍｌ加え、ピペッティングを行い、急速解凍する。解凍および希釈はすばやく行うように留意する。また、ウォーターバスでの解凍は、融解後の細胞生存率が極端に低下する原因になる。
４）　上記操作を数回繰り返した後細胞懸濁液を１５ｍｌ遠沈管へ回収し、１５００ｒｐｍ、３－５分遠心する。
５）　上清を吸引破棄し、ヒトｉＰＳ細胞用培地を１ｍｌ加える。ピペッティングを穏やかに行い、ｉＰＳ細胞のコロニーが小さくなりすぎない程度に懸濁する。大きなコロニーは、細胞懸濁液を吸い上げたピペットの先端を遠沈管の底に軽く押しつけ、穏やかに細胞懸濁液を排出してほぐす。
６）　フィーダー細胞の培地を吸引除去しヒトｉＰＳ細胞培地を３ｍｌ加える。
７）　全量を播種し、ｂＦＧＦ溶液を１５ｎｇ／ｍｌとなるように添加する。
（必要であれば、Ｙ－２７５３２溶液を１０μＭ／ｍｌとなるように添加する。）
８）　顕微鏡で細胞の状態を確認する。
９）　３７℃、ＣＯ２インキュベーターで一晩培養する。
１０）　翌日、顕微鏡で細胞の状態を確認する。通常解凍した翌日は、多数の細胞が死んでいるのが確認される。毎日１回培地交換を継続する。通常、３日程度で継代可能になる。
（２）ｉＰＳ細胞以外の細胞
（２－１）播種密度
　７．８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２
（２－２）培養液
　（ａ）：（ｂ）＝５０：４５０（ｍＬ）の混合液を用いた。
但し、上記において、（ａ），（ｂ）はそれぞれ、
　（ａ）ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）
　（ｂ）ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ニッスイ　０５９１９）
である。
（２－３）剥離液
　（ａ）：（ｂ）：（ｃ）＝１．２５ｇ：０．２ｇ：５００ｍＬの混合液を用いた。
　但し、上記において、（ａ）～（ｃ）はそれぞれ、
　（ａ）トリプシン（３５５４７－６４／ナカライ）
　（ｂ）ＥＤＴＡ（１５１０５－３５／ナカライ）
　（ｃ）ＰＢＳ（－）（０７２６９－８４／ナカライ）
である。
（２－４）培養の手順
　培養の詳細な手順を以下に示す。
（２－４－１）ＤＭＥＭ培地
　ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ニッスイ　０５９１９）：４３３ｍｌ（４．７５ｇを超純水で溶解しオートクレーブ）
　１０％ｗ／ｗ　ＮａＨＣＯ３（ナカライ）液：７ｍｌ（０．７ｇ超純水で溶解しオートクレーブ）
　２００ｍＭ　Ｌ－グルタミン（ナカライ）液：１０ｍｌ（０．２９２ｇ超純水で溶解しフィルトレーション）
　ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）：５０ｍｌ（非働化処理済み）
（２－４－２）トリプシン／ＥＤＴＡ液
　トリプシン（ナカライ）：１．２５ｇ、ＥＤＴＡ（ナカライ）：０．２ｇ、ＰＢＳ（－）：５００ｍｌ
　溶解しフィルトレーション、１０ｍｌ分注し－２０℃で保管
（２－４－３）培養・継代
１）　凍結している細胞株を３７℃で湯煎する（凍結液５００μｌ）。
２）　１０倍量のＤＭＥＭ培地５ｍｌに回収し、１５００ｒｐｍ／３分遠心する。
３）　上清を破棄し、φ６０又はφ１００ディッシュに播種する。
４）　数日培養器内で培養する。
５）　培養細胞に応じて、以下に従い継代する（Ｈｅｌａ、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＵＶ♀２、ＭＣＦ７：２－３日、Ｈｅｋ２９３：４－７日）。
・Ｈｅｋ２９３以外
１）　培地を吸引破棄し、適量のＰＢＳ（－）を適量加え、吸引破棄する。
２）　トリプシン／ＥＤＴＡ液をφ６０には５００μｌ、φ１００には１ｍｌ加え３７℃で２．５－３分インキュベーションする。
３）　トリプシン／ＥＤＴＡ液の２倍量以上のＤＭＥＭ培地を加え、細胞を回収し、数十μｌ使用し細胞数をカウント、残りは１５００ｒｐｍ／３分遠心する。
４）　４ウェルディッシュに３．０×１０５／ウェルで細胞を播種する。
５）　培養器内で培養する。２日毎に培地交換する。
・Ｈｅｋ２９３
１）　培地を吸引破棄し、適量のＰＢＳ（－）を適量加える。
２）　ピペッティングにて細胞を回収し、数十μｌ使用し細胞数をカウント、残りは１５００ｒｐｍ／３分遠心する。
３）　４ウェルディッシュに３．０×１０５／ウェルで細胞を播種する。
４）　培養器内で培養する。２日毎に培地交換する。
〔マイクロスタンプの作製〕
　各実施例で用いたマイクロスタンプについて、作製方法を記載する。
　まず、フォトマスクとして図７（ａ）～（ｄ）に示す４種類を用いて、４種類の鋳型を作製した。
　下表に、各フォトマスクの寸法をまとめた。φ１～φ３、ｄの意味については、図７（ｅ），（ｆ）に示すとおりであり、φ１はマスク内円の直径、φ２はマスク外円の直径、φ３はマスクにおける各ドットの直径、ｄは隣接するドットの中心点間距離である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　鋳型作製の具体的な手順としては、図１に示すように、シリコン基板上にレジストを塗布し、ヒーターでレジストを加熱固化したのち、前記各フォトマスクを通して露光し、現像、洗浄して、鋳型を作製した。
　次に、上記で作製した４種類の鋳型を用いて、４種類のマイクロスタンプを作製した。
　具体的な手順としては、上述した図２に示す手順に従い、鋳型に離型剤で離型処理した後、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流し込み、定温乾燥機を用いて乾燥し、マイクロスタンプを作製した。
　以下、各マイクロスタンプについて、上記表２のフォトマスク１～４に対応させて、マイクロスタンプ１～４と称する。
〔発明の効果の検証実験〕
　上記により準備した各細胞接着分子、細胞を用いて、以下のとおり、各種検証実験を行った。一部の実施例では、上記により準備したマイクロスタンプを用いた。
＜実施例１＞
　平面の石英基板上に、フッ素樹脂（サイトップＣＴＸ－８０９Ａ、ＡＧＣ社製）をスピンコートした。スピンコート後はヒーターの上に乗せて２００℃で１時間焼成した。
　マイクロスタンプ１（φ３＝２５０μｍ）を用いて、上述した図３に示す手順に従い、フッ素樹脂層上に、細胞接着分子としてマトリゲルをパターン形成した。
　次いで、上述した図６に示す手順に従い、細胞培養及びスフェロイド回収を行った。
　すなわち、作製した細胞培養足場を培養液で覆い、細胞を播種した。細胞は、上記にて準備しておいたｉＰＳ細胞を用い、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを培地として、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養を行った。播種細胞数は、１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２とし、培養期間は１０日間とし、１０日経過後にピペッティングによる極めて微弱な刺激を与えて細胞を足場から剥離させ、剥離させた細胞を位相差顕微鏡で観察した。観察は連日もしくは隔日とし、培地交換は隔日で行った。
＜実施例２＞
　マイクロスタンプ１に代えて、マイクロスタンプ２（φ３＝５００μｍ）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、細胞培養足場を作製し、細胞を培養した。
＜実施例３＞
　マイクロスタンプ１に代えて、マイクロスタンプ３（φ３＝７５０μｍ）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、細胞培養足場を作製し、細胞を培養した。
＜実施例４＞
　マイクロスタンプ１に代えて、マイクロスタンプ４（φ３＝１０００μｍ）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、細胞培養足場を作製し、細胞を培養した。
＜実施例５～２０＞
　さらに、培養細胞及び細胞接着分子を下表３のとおりに様々に組み合わせて、実施例１の方法に準じて、実験を行った。
　ただし、ｉＰＳ細胞に係る実施例（実施例８，１７）では、マイクロスタンプ２（φ３＝５００μｍ）又はマイクロスタンプ３（φ３＝７５０μｍ）を用いてフッ素樹脂層上に各種細胞接着分子をパターン形成した細胞培養足場を用いた。他方、その他の細胞については、ピペットを用いて、フッ素樹脂層上に各種細胞接着分子をドット状（フィブロネクチン及びビトロネクチンにおいては直径１０００μｍ程度、フィブロネクチン及びビトロネクチンにおいては直径１５００μｍ程度）に形成することにより作製した細胞培養足場を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔検証実験結果〕
　各実施例１～４について、剥離前の細胞培養物の写真を図８に示す。図８（ａ）は実施例１、図８（ｂ）は実施例２、図８（ｃ）は実施例３、図８（ｄ）は実施例４の剥離前の細胞培養物の写真である。また、剥離後の細胞培養物の写真を図９に示す。図９（ａ）は実施例１、図９（ｂ）は実施例２、図９（ｃ）は実施例３、図９（ｄ）は実施例４の剥離後の細胞培養物の写真である。
　図８、図９に見るように、いずれの実施例においても、細胞培養物（スフェロイド）が形成され、かつ、これを破壊することなく培養液中に浮遊させ、回収できることが分かった。
　また、ドットの寸法に応じて、スフェロイドの大きさが制御可能であることも分かった。
　また、実施例５～２０について、図１０～図１３に、各実施例での写真を示す。初期接着性・パターン形成性、スフェロイド形成を評価し、その結果を上記表３及び図１０～図１３に併記した。
　なお、スフェロイド形成の評価は、以下の基準に従った。
　〇：　細胞凝集体が、３次元的に十分な厚みと大きさで球型とみなせる場合
　△：　細胞凝集体が、３次元的にある程度の厚みと大きさを持つ場合
　×：　細胞がほとんど凝集しておらず、２次元的に分散している場合
（厚みがある場合、顕微鏡観察時に透過光が減り、色が濃く見える。）
　表３及び図１０～図１３に示す通り、様々な培養細胞及び細胞接着分子の組み合わせにおいて、細胞培養物（スフェロイド）が形成され、かつ、これを破壊することなく培養液中に浮遊させ、回収できることが分かった。
〔シール法〕
　図１４にシール法で作製した細胞接着分子２０ｂのパターンを例示する。基材３２は、平面状の石英基板にフッ素樹脂（サイトップＣＴＸ－８０９Ａ、ＡＧＣ社製）をスピンコートしたものを用いた。シール材５０は紫外線硬化樹脂（ＤＹＭＡＸ社製）を基材３２にスピンコートし、ドットパターンのネガ型をマスクにして紫外線硬化した後、未硬化部分を除去することで形成した。図１４（ａ）は、基材３２の上に、孔５０ａが４つ形成されたシール材５０が形成されたものである。スケールバーは１０ｍｍである。
　図１４（ｂ）は、シール材５０を基材３２から剥がした状態を示す。シール材５０を基材３２から剥がしても、シール材５０の成分は基材３２上に残らず、きれいに剥離させることができた。
　図１４（ｃ）は、シール材５０を基材３２上の形成した状態で、細胞接着分子２０ｂを塗布し、１時間定着した後、シール材５０を剥離して得たパターン化された細胞接着分子２０ｂ（細胞接着分子領域）の写真である。直径１ｍｍ、厚み０．１ｍｍの円筒状の細胞接着分子２０ｂを得ることができた。基材３２上の細胞接着分子２０ｂは本発明に係る細胞培養足場である。また、図１４（ａ）の基材３２上に孔５０ａが形成されたシール材５０が密着配置されたものは、本発明に係るスフェロイド形成用細胞培養キットである。
　次にシール法で作製した細胞培養足場を使ってスフェロイドを作製した。
　まず、図１４に示した直径１ｍｍ（＝１０００μｍ）の孔５０ａが形成されたシール材５０付き基材３２をガス滅菌した。
　次にシール材５０上からマトリゲルを添加し（細胞接着分子の配置）、３７℃でインキュベータ内で１時間定着させた。
　火炎滅菌したピンセットでシール材５０を剥離し、直径１０００μｍの細胞接着分子（マトリゲル）ドットがパターン化された細胞培養足場を得た。
　次に実施例５、１０、１４で用いた細胞（Ｈｅｋ２９３）を基材３２上に播種した。そして、上記実施例と同様の培養方法（「（２－４）培養の手順」に記載方法）で培養した。
　細胞播種後、５日目にピペッティングで基材３２から剥離し、６日目に細胞をを観察した。
　観察結果を図１５に示す。細胞Ｈｅｋ２９３のスフェロイドを得ることができた。
　本発明に係る細胞培養足場は、スフェロイド状体の細胞培養物を得るのに好適に利用できる。
　９　　外容器
　１０　　鋳型
　１１　　基板
　１２　　レジスト
　１３　　ヒーター
　１４　　光源
　１５　　フォトマスク
　２０　　マイクロスタンプ
　２０ｂ　　細胞接着分子
　２０ｂｈ　　厚み
　２１　　ゴム管
　２２　　離型剤
　２３　　スタンプ材料
　２４　　定温乾燥機
　２０ａ　　凸部
　３２　　基材
　３２ａ　　（撥水性）表面
　４１　　培養液
　４２　　細胞培養物
　５０　　シール材
　５０ａ　　孔

 

Claims (10)

  1. 　フッ素樹脂による撥水性表面を有する基材と、前記基材の撥水性表面に形成された細胞接着分子とを備える、細胞培養足場。
  2. 　前記細胞接着分子が細胞外マトリックスである、請求項１に記載の細胞培養足場。
  3. 　前記細胞接着分子が、前記基材の撥水性表面にパターン状に形成されている、請求項１又は２に記載の細胞培養足場。
  4. 　前記細胞接着分子は、直径１００～１０００μｍのドット形状に形成されている、請求項１乃至３の何れか一の請求項に記載された細胞培養足場。
  5. 　請求項１から４までのいずれかに記載の細胞培養足場を用いて、前記細胞接着分子表面で細胞を培養する工程を含む、細胞培養物の作製方法。
  6. 　細胞培養開始から一定期間経過後、前記基材の撥水性表面と前記細胞接着分子の界面での接着力が低下することを利用して、自然に又は前記界面に刺激を与えて、細胞接着分子を剥離し、これを回収する工程を含む、請求項５に記載の細胞培養物の作製方法。
  7. 　前記細胞が接着性細胞である、請求項５又は６に記載の細胞培養物の作製方法。
  8. 　フッ素樹脂による撥水性表面を有する基材に１つ以上の孔の開いたシール材を配置させる工程と、
    　前記シール材の上から細胞接着分子を配置する工程と、
    　前記シール材を剥離する工程を有する細胞培養足場の製造方法。
  9. 　フッ素樹脂による撥水性表面を有する基材に１つ以上の孔が形成されたシール材を密着配置させたスフェロイド形成用細胞培養キット。
  10. 　前記孔は大きさの異なる孔が複数形成されたことを特徴とする請求項９に記載されたスフェロイド形成用細胞培養キット。

     
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