WO2020246350A1 - 殺菌剤 - Google Patents

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WO2020246350A1
WO2020246350A1 PCT/JP2020/021025 JP2020021025W WO2020246350A1 WO 2020246350 A1 WO2020246350 A1 WO 2020246350A1 JP 2020021025 W JP2020021025 W JP 2020021025W WO 2020246350 A1 WO2020246350 A1 WO 2020246350A1
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WO
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antibody
conjugate
photosensitizer
wavelength range
staphylococcus aureus
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PCT/JP2020/021025
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English (en)
French (fr)
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眞人 光永
忠行 岩瀬
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学校法人慈恵大学
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    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the present invention relates to a bactericidal agent, and particularly to an agent for photoimmunotherapy that targets bacteria.
  • Non-Patent Document 1 Summary of Research Results describes that Staphylococcus aureus was selectively sterilized by photoimmunotherapy (PIT).
  • PIT photoimmunotherapy
  • a compound obtained by binding a photosensitive substance to a monoclonal antibody is targeted-specifically bound to Staphylococcus aureus and irradiated with near-infrared light to Staphylococcus aureus.
  • This monoclonal antibody specifically recognizes peptidoglycan, which is a major cell wall component of Staphylococcus aureus.
  • Non-Patent Document 2 describes the peptidoglycan of Staphylococcus aureus.
  • Non-Patent Document 1 The method of Non-Patent Document 1 was able to induce a bactericidal effect against drug-resistant Staphylococcus aureus such as MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) and VISA (vancomycin-intermediate S. aureus).
  • This bactericidal effect is due to the specific binding of the anti-peptidoglycan monoclonal antibody to Staphylococcus aureus. It was suggested that photoimmunotherapy using this compound could be clinically applied in the future as a treatment for target-specific infectious diseases.
  • Example 15 of Patent Document 1 discloses that it was evaluated whether or not the antibody conjugate could kill bacterial cells.
  • Paragraph [0550] states that an antibody directly conjugated to a phthalocyanine photosensitizer, such as IRDye 700DX, was used.
  • a phthalocyanine photosensitizer such as IRDye 700DX
  • protein A is a protein that binds to the Fc region of an antibody and is presented on the cell surface of Staphylococcus aureus.
  • Patent Document 1 states that PIT-mediated cell killing against Staphylococcus aureus occurred in the presence of an antibody-IR700 conjugate that binds to protein A. Only bacterial cells incubated with cetuximab-IRDye700DX and then laser irradiated had a statistically significant reduction in CFU compared to the other three groups.
  • the present invention provides a useful use for clinical application of agents for photoimmunotherapy targeting bacteria.
  • the antibody causes an antigen-antibody reaction with Staphylococcus aureus, and the absorption wavelength range of the photosensitizer overlaps with the wavelength range from red light to near infrared light.
  • the surface of the nasal cavity coated with the fungicide is irradiated with excitation light in the wavelength range from red light to near infrared light.
  • the antibody is an anti-peptidoglycan antibody.
  • the photosensitizer has a silicon phthalocyanine complex moiety.
  • the disinfectant according to ⁇ 2>. ⁇ 4> The silicon phthalocyanine complex portion is IRDye 700DX represented by the following formula.
  • the two oxygen atoms coordinated to Si at the center of the complex may be at the trans position with the phthalocyanine skeleton in between, or may be at the cis position on one side of the phthalocyanine skeleton.
  • ⁇ 5> In its usage, The surface of the nasal cavity coated with the fungicide includes the surface of the nasal vestibule.
  • the treatment includes treatment for the nose and treatment other than the nose, but does not include the treatment itself by application and irradiation.
  • the disinfectant according to ⁇ 7>. ⁇ 9> In its usage, Preliminarily inspect whether the patient is a carrier of MRSA and If, as a result of the test, it is found that the patient is or is suspected to be a carrier of MRSA, the application and irradiation are performed.
  • ⁇ 10> A fungicide containing a conjugate in which a photosensitizer is bound to an antibody.
  • the antibody causes an antigen-antibody reaction with Staphylococcus aureus, and the absorption wavelength range of the photosensitizer overlaps with the wavelength range from red light to near infrared light.
  • the surface of the navel coated with the fungicide is irradiated with excitation light in the wavelength range from red light to near infrared light.
  • ⁇ 11> A fungicide containing a conjugate in which a photosensitizer is bound to an antibody.
  • the antibody causes an antigen-antibody reaction with Staphylococcus aureus, and the absorption wavelength range of the photosensitizer overlaps with the wavelength range from red light to near infrared light.
  • the bactericide is administered to bovine udders and the udders are irradiated with excitation light in the wavelength range from red to near infrared.
  • FIG. 1 Schematic diagram of conjugates and flora. Cross section of the nasal cavity. Conjugate amount dependence of the bactericidal effect of photoimmunotherapy against bacteria (abbreviation of aPIT, antimicrobial photoimmunotherapy). Irradiation energy dependence of the bactericidal effect of aPIT.
  • aPIT photoimmunotherapy against bacteria
  • Irradiation energy dependence of the bactericidal effect of aPIT Each control test for the bactericidal effect of aPIT. The bactericidal effect of aPIT on methicillin-resistant strains. Specificity for Staphylococcus aureus in aPIT. Evaluation of aPIT for fungi colonized on cotton rats. Microscopic image of a nasal tissue section of a cotton rat. Evaluation of aPIT for logarithmic bacteria.
  • Evaluation of aPIT performed after culturing bacteria in various non-selective media Evaluation of aPIT performed after suspending bacteria in equine derailed blood. Evaluation of aPIT performed after co-culture of bacteria and fibroblasts. Comparison between antibody clones in aPIT. Evaluation of the interaction between protein A and Fc. No effect on flora including colonized bacteria, no irradiation. Impact on flora including colonized bacteria, with irradiation. Survival curve of mice infected with Staphylococcus aureus. Evaluation of aPIT performed after the bacteria formed a biofilm.
  • the disinfectant according to this embodiment contains a conjugate.
  • FIG. 1 schematically shows the conjugate 10.
  • the conjugate 10 is an antibody-drug conjugate (ADC, Antibody-Drug Conjugate) composed of the antibody 11 and the photosensitizer 12.
  • ADC Antibody-Drug Conjugate
  • the antibody 11 may be a monoclonal antibody specific for the target bacterium 16.
  • the target bacterium 16 is Staphylococcus aureus.
  • the antibody 11 causes an antigen-antibody reaction with Staphylococcus aureus.
  • the antibody class may be any of IgM, IgD, IgG, IgA and IgE.
  • the antibody 11 in the figure is IgG.
  • the IgG subclass may be any of 1 to 4.
  • the antibody 11 may be a chimeric antibody, a humanized antibody, or a fully human antibody.
  • the antibody may be a hybridoma antibody or a recombinant antibody.
  • the antibody 11 shown in FIG. 1 may be the full length or a partial fragment of the immunoglobulin and the variant.
  • the partial fragment may be a Fab fragment, a Fab'fragment, an F (ab)' 2 fragment, a single chain Fv protein so-called scFv, and a disulfide stabilized Fv protein so-called dsFv.
  • the antibody 11 in the figure is the total length of IgG.
  • the antibody 11 is specific for the antigenic determinant of the target molecule 17 specific to the target bacterium 16.
  • the target bacterium 16 has a target molecule 17 on its surface.
  • the target molecule 17 is Staphylococcus aureus peptidoglycan.
  • Antibody 11 is an anti-peptidoglycan antibody.
  • Antibody 11 is specific for the surface of Staphylococcus aureus.
  • Non-Patent Document 2 peptidoglycan is known to occupy a large proportion of the components of the cell wall of Staphylococcus aureus.
  • sugar chains formed by alternating N-acetylglucosamine and N-acetylmuramic acid are crosslinked with oligopeptides composed of pentaglycine.
  • Amino acids added to the oligopeptide moiety include D-type amino acids.
  • the lysine residue contained in the oligopeptide is a bridging part by pentaglycine. For this reason, it is also called lysine-type peptidoglycan (Lys-type PGN).
  • the following chemical formula is taken from Non-Patent Document 2.
  • the photosensitizer 12 is bound to the antibody 11 in the conjugate 10.
  • conjugate 10 is an antibody modified with photosensitizer 12.
  • the antibody 11 and the photosensitizer 12 have a covalent bond.
  • the photosensitizer 12 is bound to the Fc region of antibody 11 via the linker 13. More specifically, the photosensitizer 12 is bound to CH2 in the constant region ( CH region) of the heavy chain of antibody 11 via the linker 13.
  • the covalent bond between the antibody 11 and the photosensitizer 12 may be replaced with a non-covalent bond.
  • the photosensitizer 12 may be bound to a site-specific antibody-binding peptide, and then the conjugate of the antibody-binding peptide and the photosensitizer may be bound to a specific site of the antibody 11.
  • one or two or more photosensitizers 12 are bound to one antibody 11.
  • 3,4,5,6,7,8,9,10 and 11 or more photosensitizers 12 may be bound to one antibody 11.
  • the conjugate 10 may be a mixture of conjugates having different numbers of bonds of the photosensitizer 12.
  • the average number of bonds of the photosensitizer 12 may be 1 to 10, 2 to 5, or 2.5 to 4.
  • the portion of the photosensitizer 12 is interpreted as an atomic group.
  • the conjugate 10 itself can also be interpreted as a photosensitizer.
  • the range is limited to this atomic group portion, and this is simply referred to as a photosensitizer.
  • the photosensitizer 12 shown in FIG. 1 has a predetermined absorption wavelength range. This absorption wavelength range overlaps with the wavelength range from red light to near infrared light.
  • the wavelength range from the red light to the near infrared light is preferably a wavelength range of 650 to 850 nm.
  • wavelength range is selected depends on the substance in the living body. There are light-absorbing substances such as water on the epidermis and in the flora. Light rays in the above wavelength range are absorbed by light rays in a smaller proportion than light rays in other wavelength ranges. This is sometimes referred to as "NIR window".
  • the wavelength range of 650 to 850 nm includes not only near-infrared light but also visible light. This is because the wavelength region is the connection region between the near-infrared light and the visible light. However, the strict distinction between infrared light and visible light in such a wavelength range is not strongly related to the essence of the invention.
  • the excitation light when the conjugate exerts a photosensitizing effect by being irradiated with excitation light, the excitation light may contain red visible light as a component in addition to the near infrared light. To do.
  • the photosensitizer 12 shown in FIG. 1 may be a fluorescent group or a chromophore. In the present embodiment, even if the photosensitizer 12 fluoresces in the wavelength range of 650 to 850 nm, such fluorescence is not positively used. Since the photosensitizer 12 has a photosensitizing action 21, it is sufficient that the light energy of the excitation light 20 can be converted into damage to the target bacterium 16. The higher the rate at which the photosensitizer 12 can convert light energy into damage to the target bacteria 16. The photosensitizer may be selected from these viewpoints.
  • the photosensitizer 12 shown in FIG. 1 has a silicon phthalocyanine complex portion (atomic group).
  • the photosensitizer 12 is preferably IRDye700DX, abbreviated as IR700, which is represented by the following formula. "IR Dye” is a trademark.
  • IR700 is provided by, for example, LI-COR as an NHS ester represented by the following formula.
  • NHS esters can easily label, for example, amino groups located in the constant region of an antibody.
  • the two oxygen atoms coordinated with Si at the center of the complex may be at the trans position with the phthalocyanine skeleton in between, or may be at the cis position on one side of the phthalocyanine skeleton.
  • the oxygen atoms are shown to be at the cis position.
  • Examples of the structure of the other photosensitizer or photosensitizer that can be applied to the photosensitizer 12 shown in FIG. 1 include a derivative having a porphyrin or a porphyrin skeleton and a derivative having a phthalocyanine or a phthalocyanine skeleton.
  • naphthalocyanine having a structure similar to IR700 can be mentioned.
  • the photosensitizer may be a porphyrin-based derivative used in photodynamic therapy (PDT).
  • Examples of porphyrin-based derivatives include chlorin e6, protoporphyrin and hematoporphyrin derivatives (HpD).
  • the antibody 11 and the target molecule 17 are bound by an antigen-antibody reaction.
  • a binding mode other than the antigen-antibody reaction is known between Staphylococcus aureus and the antibody. That is, protein A is expressed on the surface of Staphylococcus aureus. As described in the background art, protein A specifically binds to the Fc region of an IgG antibody.
  • the conjugate 10 specifically binds to Staphylococcus aureus of the target bacterium 16 by utilizing the antigen-discriminating power of the antibody 11 without depending on the binding between the protein A and the Fc region.
  • antibody 11 does not have an Fc region.
  • antibody 11 binds to photosensitizer 12 outside the Fc region.
  • the Fc region of antibody 11 is bound to the photosensitizer 12, and the steric hindrance of the photosensitizer 12 reduces the affinity of the Fc region for protein A.
  • the bactericidal agent may be a liquid agent containing a conjugate.
  • Fungicide includes pharmaceutically acceptable carriers.
  • a pharmaceutically acceptable fluid and a physiologically acceptable fluid may be used as a vehicle in the preparation of the liquid preparation. Examples of vehicles are water, saline, equilibrium salt solutions, aqueous dextrose, or glycerol. Wetting agents, emulsifiers, preservatives, pH buffers and the like may be further added. Examples of addition are sodium acetate and sorbitan monolaurate.
  • the dosage form of the disinfectant is not limited to the above liquids.
  • the disinfectants are external solids including external powders, external liquids including liniments and lotions, sprays including external aerosols and pump sprays, ointments, creams, gels, patches, tapes and poultices. It may be any of.
  • a spray agent is preferable.
  • the fungicide is suitable for use in PIT against bacterial infections, especially in near infrared immunotherapy (Near Infrared-PIT, NIR-PIT).
  • a fungicide is applied into the patient's nose. Apply with a cotton swab or spray.
  • An administration method other than application may be used.
  • Figure 2 shows a cross section of the nose.
  • the nasal vestibule 24 is located at the entrance of the outer nostril 26 of the nasal cavity 25.
  • Nasal hair usually grows in the nasal vestibule.
  • the epidermis and nose hair of the nasal vestibule 24 may have a flora containing Staphylococcus aureus.
  • the disinfectant is applied to the nasal vestibule 24.
  • the nasal vestibule 24 coated with the bactericidal agent is irradiated with excitation light using a light source such as an infrared treatment device 27.
  • the light source of the excitation light may be a laser or an LED.
  • the infrared treatment device 27 may be a diffuser type laser fiber. If necessary, the mucous membrane in the nasal cavity 25 may be further coated with a bactericidal agent and further irradiated with excitation light. Upon irradiation, the infrared treatment device 27 may be inserted into the nasal cavity 25 through the external nostril 26.
  • the target bacterium 16 lives in the flora 15.
  • the flora 15 is a flora that occurs on the epidermis 14.
  • the epidermis 14 is the epidermis of the nasal vestibule.
  • Bacteria other than the target bacterium 16 also inhabit the flora 15.
  • a fungicide having a large antibacterial spectrum is used instead of the fungicide containing the conjugate 10 in FIG. 1, there is a possibility that all bacteria other than the target bacteria 16 in the flora 15 will be killed.
  • the target bacterium 16 in the flora 15 can be targeted and attacked. Therefore, photoimmunotherapy is unlikely to generate new resistant bacteria from bacteria other than the target bacterium 16.
  • this embodiment does not exclude treatment with a bactericidal agent in addition to photoimmunotherapy.
  • the photosensitizer 12 that received the excitation light 20 is excited.
  • the excited photosensitizer 12 exerts a photosensitizer 21 to damage the target bacterium 16.
  • the photosensitizer 21 is accompanied by energy, but is not necessarily an electromagnetic wave.
  • the excitation light 20 is used as the excitation light 20.
  • the excitation light 20 is irradiated with light having a wavelength of 650 to 900 nm, preferably 660 to 740 nm, and more preferably 660 to 710 nm.
  • the wavelength may be 680 nm.
  • the irradiation dose of the excitation light 20 shown in FIG. 1 is preferably 1 (J / cm 2 ) or more, and more preferably 10 to 500 (J / cm 2 ).
  • the irradiation dose may be any of 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 and 400 (J / cm 2 ).
  • one or more irradiations may be performed. Irradiation may be 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 times.
  • the bactericidal agent may be administered more than once.
  • the number of irradiations after the second and subsequent administrations of the bactericidal agent may be once or twice or more.
  • an effective amount is the amount of conjugate sufficient to achieve the desired effect on the body or body part of the patient being treated.
  • the effective amount may depend on multiple factors such as the patient or affected area being treated, the type of conjugate, and the method of administration. Consider that the effective dose in an individual patient will vary depending on the patient's condition, regardless of the general pre-determined effective dose.
  • the fungicide may be administered in a single dose or in multiple doses.
  • the effective amount of the conjugate is, for example, at least 0.5 mg / kg, at least 5 mg / 60 kg, at least 10 mg / 60 kg, at least 20 mg / 60 kg, at least 30 mg / 60 kg, at least 50 mg / 60 kg per 60 kg of body weight.
  • 0.5 to 50 mg / 60 kg for intravenous administration, for example, 0.5 to 50 mg / 60 kg.
  • the amount used may be 1 mg / 60 kg, 2 mg / 60 kg, 5 mg / 60 kg, 20 mg / 60 kg, or 50 mg / 60 kg.
  • the effective amount of the conjugate is at least 10 ⁇ g / kg, at least 100 ⁇ g / kg, at least 500 ⁇ g / kg or at least 500 ⁇ g / kg based on body weight.
  • it is 10 ⁇ g / kg to 1000 ⁇ g / kg.
  • the amount used may be, for example, 100 ⁇ g / kg, 250 ⁇ g / kg, about 500 ⁇ g / kg, 750 ⁇ g / kg, or 1000 ⁇ g / kg.
  • the patient may be prevented from being infected with Staphylococcus aureus after the treatment.
  • a fungicide is applied to the nasal vestibule of a patient who will undergo surgery as a treatment. Then, as described above, the nasal vestibule is irradiated with excitation light. Application and irradiation should be done before the patient undergoes surgery.
  • the operations referred to here include operations other than the nose.
  • Such coating and irradiation is also an example of PIT application. It may be given to patients undergoing treatment other than surgery. The patient may be an inpatient.
  • Treatments performed after PIT include nasal and non-nasal treatments, but do not include the above-mentioned fungicide application and irradiation treatments themselves. That is, the treatment of application of the bactericidal agent and irradiation is performed on the premise of carrying out the main treatment.
  • Patients who receive PIT include those who have already been found to be carriers of antibiotic-resistant Staphylococcus aureus, so-called resistant bacteria.
  • the term "antibiotic" does not include the bactericide of this embodiment.
  • PIT may also be applied if the patient is suspected of being a carrier of resistant strains.
  • the resistant bacterium is a multidrug resistant bacterium.
  • the resistant strain is MRSA.
  • MRSA further has complete or incomplete resistance to vancomycin and mupirocin. Vancomycin and mupirocin are a type of antibacterial drug used against MRSA.
  • resistant strains are VISA and mupirocin-resistant MRSA.
  • PIT may be performed if the test reveals that the patient is or is suspected of being a carrier of antibiotic-resistant Staphylococcus aureus.
  • the fungicide of the present embodiment may be used to perform PIT on a carrier or a person suspected of being a carrier.
  • the present invention is not limited to the above embodiment, and can be appropriately modified without departing from the spirit.
  • the nasal cavity of a human patient particularly the nasal vestibule
  • the site to be sterilized may be the upper respiratory tract, including the patient's pharynx, or the wound site.
  • MRSA which the patient carries in the navel
  • the navel may be irradiated with light after applying a disinfectant. This usage is effective in preventing MRSA infections during the perioperative period, especially after surgery.
  • the treatment of application of fungicide and irradiation is also useful for preventive and therapeutic applications for non-human animals including mammals.
  • cattle may be treated for the prevention or treatment of mastitis.
  • the conjugate is used as a preventive agent for mastitis, it is desirable to apply the conjugate to the surface of the breast and irradiate the breast with light.
  • the conjugate is used as a therapeutic agent for mastitis, it is desirable to administer the conjugate into the breast and irradiate the breast with light.
  • aPIT photoimmunotherapy
  • JKmsSA1 strain was used as MSSA (methicillin-sensitive Staphylococcus aureus).
  • the JKmsSA1 strain is a preserved strain provided by the bacterial library of the basic research facility of the Research Center for Medical Sciences, Jikei University School of Medicine.
  • other strains such as the JCM2874 strain described in Non-Patent Document 1 may be used to confirm the effect of aPIT.
  • JKmrSA1 strain was used as MRSA.
  • the JKmrSA1 strain is a preserved strain provided by the bacterial library of the basic research facility of the Research Center for Medical Sciences, Jikei University School of Medicine.
  • MU50 shares were used as VISA.
  • the history and characteristics of the MU50 strain are described in Non-Patent Documents 3 and 4.
  • JKmmrSA1 strain was used as mupirocin-resistant MRSA.
  • the JKmmrSA1 strain is a preserved strain provided by the bacterial library of the basic research facility of the Research Center for Medical Sciences, Jikei University School of Medicine.
  • a conjugate was prepared according to the method described in Non-Patent Document 1.
  • the anti-peptidoglycan-mouse monoclonal antibody mAb15704 (clone number Staph12-569.3, IgG3 antibody, QED bioscience) and IR700DX NHS ester (LI-COR) were mixed in a predetermined amount ratio. It has been confirmed that mAb15704 also reacts with Protein A negative Staphylococcus aureus. See the product data sheet of QED bioscience in Non-Patent Document 5.
  • the conjugation reaction was carried out to obtain the compound mAb15704-IR700.
  • mAb15704-IR700 may be referred to as SA-IR700.
  • the compound was purified and extracted by gel filtration. Absorbance measurement was performed on the purified extract using a spectroaltimeter. From the measurement results, it was confirmed that about 3 molecules of IR700 were bound to each molecule of antibody.
  • the bacterial suspension was reacted with mAb15704-IR700. After that, the cell suspension was irradiated with near-infrared light having a wavelength peak of 690 nm as excitation light by an LED light. Samples of cell suspension were vortexed after irradiation. The cell suspension was diluted by a serial dilution method, and the cell suspension of each concentration was added dropwise onto a plate medium. Bacteria were cultured at 37 ° C for 24 hours. The effect of sterilization by aPIT was evaluated from the number of colonies on the plate medium. Unless otherwise specified, the plate medium was a nutrient agar medium.
  • aPIT was performed on the JKmsSA1 strain of MSSA with a conjugate in an amount of 0.01-1 ⁇ g per test. After that, the result of performing the colony counting method is shown.
  • the irradiation amount of excitation light is 5 J / cm 2 .
  • cfu represents a colony forming unit.
  • the graph shows the average of three independent trials. Error bars represent standard deviation. The same applies hereinafter.
  • FIG. 4 aPIT was performed on MSSA with an excitation light of 5-45 J / cm 2 per test. After that, the result of performing the colony counting method is shown.
  • the amount of conjugate is 0.3 ⁇ g.
  • the irradiation dose increased, the number of bacteria that formed colonies decreased. Therefore, it was shown that the bactericidal effect is enhanced depending on the irradiation amount of the excitation light.
  • FIG. 5 aPIT was performed on MSSA under various control conditions. After that, the result of performing the colony counting method is shown.
  • the second graph from the left shows the results when a large excess of 10 ⁇ g of the antibody before the conjugate was added to 1 ⁇ g of the conjugate and the reaction was carried out with the bacterial suspension. No bactericidal effect was observed even though the irradiation amount of excitation light was increased to 15 J / cm 2 as compared with the sixth graph in FIG. This is considered to be the result of antagonism between the conjugate and the antibody before the conjugate. Therefore, it was shown that the bactericidal effect depends on the antibody portion of the conjugate.
  • the third graph from the left in FIG. 5 shows the results when 4 ⁇ g of the conjugate was added but not irradiated with the excitation light.
  • the fourth graph from the left shows the results when the excitation light of 100 J / cm 2 was applied but the conjugate was not added. No bactericidal effect was observed in either case. Therefore, it was shown that the bactericidal effect cannot be obtained unless the addition of the conjugate to the cell suspension and the irradiation of the excitation light are aligned.
  • FIG. 6 aPIT was performed on resistant strains MRSA, VISA and mupirocin-resistant MRSA. After that, the result of performing the colony counting method is shown. For all resistant strains, 2 ⁇ g of conjugate was added per test. Further, an excitation light of 90 J / cm 2 was irradiated. Bacteria that formed colonies by the conjugate and the excitation light disappeared. Therefore, it was shown that the bactericidal effect is brought to not only susceptible bacteria but also resistant bacteria.
  • FIG. 7 shows the results of performing aPIT on a mixture of MRSA and heterologous bacteria and further culturing on a plate medium.
  • the JCM2414 strain of Staphylococcus epidermidis was used as a heterologous bacterium. 2 ⁇ g of conjugate was added per test.
  • MSA selective medium and OPA II selective medium were used as plate media. Both MRSA and Staphylococcus epidermidis colonize on MSA selective medium. Only MRSA colonizes OPA II selective medium, but Staphylococcus epidermidis does not.
  • the anti-peptide glycan-mouse monoclonal antibody mAb15704 also recognizes Staphylococcus epidermidis peptide glycans, but the inventors have observed that the conjugate synthesized from mAb15704 Compared with Staphylococcus aureus, it did not show sufficient binding to Staphylococcus epidermidis, and did not show a bactericidal effect against Staphylococcus epidermidis even when irradiated with light.
  • the light and dark are reversed. From the left plate, the irradiation amount of excitation light is 0.5 and 40 J / cm 2 . Bacteria that received aPIT formed colonies in the MSA selective medium even when the irradiation dose was increased. The OPA II selective medium did not form colonies as the irradiation dose increased.
  • the evaluation was performed by the colony counting method.
  • the irradiation amount of the excitation light was set to 0.5 and 40 J / cm 2 .
  • MRSA that received aPIT became more difficult to colonize as the irradiation dose of aPIT increased.
  • Staphylococcus epidermidis that received aPIT did not change the number of colonies even when the irradiation dose of aPIT increased. Therefore, the bactericidal effect was shown to be specific to Staphylococcus aureus.
  • MRSA was anchored in the nasal cavity of cotton rats.
  • Cotton rats are an animal species that is less resistant to infection. For this reason, cotton rats are a suitable model organism for creating bacterial carriers in the nasal cavity.
  • a PIT was performed on the nasal cavity of cotton rats.
  • the anchoring site was irradiated with near infrared rays of 0, 10 and 50 J / cm 2 with a laser fiber. Since the nose of cotton rats is small, near-infrared light was applied from the outside of the nose toward the nasal cavity. Bacteria were removed from the animals by cutting the nasal cavity. The flora was removed from the nasal cavity and cultured on OPA II selective medium. The effect of aPIT was evaluated by the colony counting method.
  • FIG. 8 shows the number of MRSA colonies
  • the upper part shows a photograph of the bacterial culture corresponding to each graph. The light and dark are reversed in the photo. The number of colonies decreased as the amount of irradiation to the colonization site increased. Therefore, it was shown that the bactericidal effect can also be obtained by aPIT on the flora on the surface of the living body.
  • FIG. 9 The lower part of FIG. 9 is a microscopic image of a tissue section of the nasal cavity after aPIT was performed on a cotton rat having MRSA fixed.
  • the upper row shows a control experiment without aPIT. In each case, the tissue of the nasal mucosa was healthy.
  • aPIT was performed on MSSA with an SA-IR700 conjugate in an amount of 1 ⁇ g per test.
  • the irradiation amount of the excitation light was 15 J / cm 2 .
  • MSSA was the logarithmic phase of proliferation, the so-called plateau.
  • FIGS. 3 to 5 the growth phase was observed.
  • the colony counting method was performed after aPIT.
  • the bactericidal effect of aPIT was also seen on logarithmic MSSA.
  • aPIT was performed on MSSA cultivated in various media with an SA-IR700 conjugate in an amount of 1 ⁇ g per test. From left to right, TSB (trypticase soy bouillon) medium, glucose-added TSB medium (TSBG medium), BHI (brain heart infusion) medium, and LB medium (Luria-Bertani medium) are shown. The colony counting method was performed after aPIT. The bactericidal effect of aPIT was also observed after culturing in various media.
  • TSB trypticase soy bouillon
  • TSBG medium glucose-added TSB medium
  • BHI brain heart infusion
  • LB medium Lia-Bertani medium
  • aPIT was performed with an SA-IR700 conjugate in an amount of 4 ⁇ g per test.
  • the colony counting method was performed after aPIT.
  • the bactericidal effect of aPIT was also observed in nutrient-rich blood.
  • MSSA of 1 x 10 7 CFU per test was treated with 30 ⁇ g of SA-IR700 conjugate per test.
  • Staphylococcus aureus was added to 3T3 fibroblasts and co-cultured for 30 minutes at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
  • 3T3 fibroblasts were pre-confluent on a 35 mm diameter culture dish.
  • Cells were rinsed 3 times in 1 ml RPMI medium (Roswell Park Memorial Institute medium).
  • Extracellular Staphylococcus aureus was dissolved in 1 ml of 1 mg / ml lysostaphin solution (lysostaphin, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 30 minutes.
  • the cells were rinsed 5 times in 1 ml RPMI medium and then irradiated with near infrared radiation. After homogenizing the cells and serially diluting them, the cells were cultured on an agar medium and colony counting was performed. The graph on the left shows that the excitation light was not irradiated. Staphylococcus aureus after treatment with SA-IR700 conjugate indicates that it was taken up by cells and escaped extermination by lysostaphin. Therefore, it was shown that treatment with SA-IR700 conjugate alone cannot prevent parasitism on cells. On the other hand, when the excitation light was irradiated, Staphylococcus aureus was exterminated. Therefore, it was shown that even if Staphylococcus aureus escapes into cells after treatment with SA-IR700 conjugate, the killing effect by excitation light extends into the cells.
  • FIG. 14 another conjugate was prepared using the anti-peptidoglycan-mouse monoclonal antibody mAb15702 (clone number Staph11-232.3, IgG3 antibody, QED bioscience).
  • mAb15702 clone number Staph11-232.3, IgG3 antibody, QED bioscience.
  • the second and fourth graphs from the left are the results of aPIT performed with the antibody of clone number Staph12-569.3 described above.
  • clone number Staph11-232.3, IgG3 antibody, and QED bioscience were used as other anti-peptidoglycan-mouse monoclonal antibodies.
  • the third and fifth graphs from the left are the results of aPIT performed with the antibody of clone number Staph11-232.3. There was a slight difference in the bactericidal effect of aPIT due to the difference in antibody clones. However, by increasing the irradiation dose from 15 J / cm 2 to 45 J / cm 2 , the bactericidal effect of aPIT was obtained with all antibody clones. *** represents P ⁇ 0.001.
  • Tra-IR700 is a conjugate of IR700 bound to the CH2 region of trastuzumab.
  • Trastuzumab is a humanized monoclonal antibody that contains a frame structure region derived from human IgG1 and a complementary antigen recognition region of a mouse monoclonal anti-HER2 antibody. Since Tra-IR700 is an antibody specific to human HER2, it is considered that Tra-IR700 does not react with bacteria.
  • FIG. 15 a wild-type RN4220 strain was used as Staphylococcus aureus.
  • a protein A deficient strain ⁇ spa
  • aPIT and colony counting method were performed according to the above. No bactericidal effect of aPIT via the Fc region of trastuzumab was observed with or without protein A.
  • Patent Document 1 PIT by interaction between protein A and Fc region was successful.
  • the results shown in FIG. 15 suggest that aPIT due to the interaction between protein A and the Fc region may not be a reliable method.
  • the results of experiments on protein A-deficient strains also show that the aPIT of this example is effective against protein A-negative Staphylococcus aureus.
  • MRSA was fixed to cotton rats in the same manner as in FIG. 8, and then only near infrared light was irradiated to the fixed site without administering a conjugate.
  • FIG. 17 2 ⁇ g of a conjugate was administered per test, and the fixation site was irradiated with near-infrared light.
  • the colony counting method was performed by culturing the bacteria in the colony on a plate medium of a non-selective medium. This flora is thought to be the flora originally possessed by cotton rats before they were infected with MRSA.
  • MRSA was removed by aPIT.
  • FIG. 17 other bacteria in the flora were not killed by aPIT. Therefore, it was shown that aPIT by SA-IR700 acts specifically against Staphylococcus aureus and does not affect the growth of other bacteria in the flora. As shown in FIG. 16, irradiation with excitation light did not reduce the number of viable bacteria in the flora.
  • mice 18 an MRSA of 10 8 CFU per animal was administered intraperitoneally. MRSA was treated with 50 ⁇ g of SA-IR700 per mouse prior to intraperitoneal administration. Then, 100 J / cm 2 near-infrared light was irradiated from outside the mouse body. Those that were not irradiated were designated as aPIT (-). All mice that received aPIT survived. All mice that did not undergo aPIT died. These mice are thought to have developed peritonitis. Therefore, it was shown that contact between SA-IR700 and Staphylococcus aureus alone cannot prevent the disease. It has been shown that the combination of administration of SA-IR700 and irradiation with excitation light seems to be useful for the treatment and prevention of diseases against S. aureus.
  • MRSA was statically cultured for 16 hours in a triptic soy culture medium containing 1% glucose. This allowed MRSA to form a biofilm on the culture dish. The biofilm was collected together with MRSA by peeling the biofilm from the culture dish with a scraper. The biofilm was washed with RPMI medium. After treating MRSA with SA-IR700, it was irradiated with near-infrared rays. Irradiated MRSA was suspended in RPMI medium and serially diluted. Then, MRSA was seeded on an agar medium to cause MRSA to colonize. The number of colonies was counted.
  • the graph of FIG. 19 represents the percentage of viable bacteria. Both the (-) and (+) samples in the figure were treated with MRSA at 4 ⁇ g of SA-IR700 per test. Only the (+) sample was subjected to aPIT by irradiation with a near infrared ray of 30 J / cm 2 .

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Abstract

抗体（１１）に光増感剤（１２）が結合しているコンジュゲート（１０）を含有する殺菌剤。コンジュゲート（１０）において、抗体（１１）は黄色ブドウ球菌（１６）と抗原抗体反応を起こす。また赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に光増感剤（１２）の吸収波長域が重なる。その用法において、殺菌剤の塗布された鼻腔の表面（１４）に対して赤色光線から近赤外光線にかけた波長域の励起光（２０）が照射される。他の用法において、殺菌剤の塗布された臍の表面に対して赤色光線から近赤外光線にかけた波長域の励起光が照射される。他の用法において、殺菌剤はウシの乳房に対して投与され、乳房に対して赤色光線から近赤外光線にかけた波長域の励起光が照射される。

Description

殺菌剤
　本発明は殺菌剤に関し、特に細菌を標的とする光線免疫療法のための剤（agent for photoimmunotherapy）に関する。
　非特許文献１の「研究成果の概要」には光線免疫療法（PIT）によって黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を選択的に殺菌したことが記載されている。この方法ではモノクローナル抗体に光感受性物質を結合させて得た化合物を黄色ブドウ球菌に対して標的特異的に結合させるとともに、黄色ブドウ球菌に対して近赤外光を照射する。このモノクローナル抗体は黄色ブドウ球菌の主要細胞壁構成成分であるペプチドグリカンを特異的に認識する。非特許文献２は黄色ブドウ球菌のペプチドグリカンを説明している。
　非特許文献１の方法ではMRSA（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）やVISA（vancomycin-intermediate S. aureus）のような薬剤耐性黄色ブドウ球菌に対しても、殺菌効果が誘導可能であった。この殺菌効果は抗ペプチドグリカンモノクローナル抗体の黄色ブドウ球菌への特異的な結合によるものである。この化合物を用いた光線免疫療法が標的特異的な感染症治療として今後臨床応用できる可能性が示唆された。
　特許文献１の実施例１５は、抗体コンジュゲートが細菌細胞を殺傷することができるかどうかを評価したことを開示している。段落[0550]には、IRDye 700DXのようなフタロシアニン光増感剤に直接コンジュゲートされた抗体を利用したことが記載されている。ここでは細胞表面上に提示されるタンパク質、プロテインＡに結合した抗体がレーザー照射を受けることで細菌細胞を殺傷するかどうかを評価した。ここでプロテインＡは、抗体のＦｃ領域に結合するタンパク質であり、黄色ブドウ球菌の細胞表面上に提示されるものである。
　また特許文献１の段落[0553]には、黄色ブドウ球菌に対するPITを媒介した細胞殺傷がプロテインＡに結合する抗体-IR700コンジュゲートの存在下で起きたことが記載されている。セツキシマブ-IRDye 700DXとインキュベートし、その後レーザー照射した細菌細胞だけが、その他の3群と比較して統計的に有意なCFU低下を有していた。
特表２０１８－５２８２６７号公報
光永　眞人，"薬剤耐性菌感染症を克服する光線免疫殺菌療法の開発"，[online]，2017年5月10日，日本学術振興会，[2019年3月14日検索]，インターネット，<https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-26670487/26670487seika/>，2015年度研究成果報告書　課題番号26670487； Makoto Mitsunaga, "Development of bacteria-targeted photoimmunotherapy", [online], May 10, 2017,  The Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), [searched on March 14, 2019], internet, <https://kaken.nii.ac.jp/en/report/KAKENHI-PROJECT-26670487/26670487seika/>, 2015 Fiscal Year Final Research Report, Project/Area Number 26670487 白土　明子，"黄色ブドウ球菌の細胞壁成分による自然免疫の誘導と制御"，生化学，日本生化学会，平成24年9月25日，第84巻，第9号，pp.737-752； Akiko Shiratsuchi, "Induction and regulation of innate immune responses by cell-wall components of Staphylococcus aureus", The Journal of Biochemistry (JB), Japanese Biochemical Society, September 9, 2012, Volume 84, Number 9，pp.737-752 Hanaki H, Hiramatsu K. [Evaluation of reduced vancomycin susceptibility of MRSA strain Mu50 with various conditions of antibiotic susceptibility tests]. Jpn J Antibiot. 1997 Sep;50(9):794-8. Hiramatsu K, Aritaka N, Hanaki H, Kawasaki S, Hosoda Y, Hori S, Fukuchi Y, Kobayashi I. Dissemination in Japanese hospitals of strains of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin. Lancet. 1997 Dec 6;350(9092):1670-3. QED Bioscience Inc.，"Staphylococcus aureus Monoclonal Antibodies, ORDERING INFORMATION"，［online］，［平成 31 年5月29日検索］，インターネット＜URL：https://www.qedbio.com/product/staphylococcus-aureus/＞
　本発明は細菌を標的とする光線免疫療法のための剤の臨床応用に有益な用法を提供する。
＜１＞　抗体に光増感剤が結合しているコンジュゲートを含有する殺菌剤であって、
　前記コンジュゲートにおいて、前記抗体は黄色ブドウ球菌と抗原抗体反応を起こすものであり、また赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に前記光増感剤の吸収波長域が重なり、
　その用法において、前記殺菌剤の塗布された鼻腔の表面に対して赤色光線から近赤外光線にかけた波長域の励起光が照射される、
　殺菌剤。
＜２＞　前記抗体は抗ペプチドグリカン抗体である、
　＜１＞に記載の殺菌剤。
＜３＞　前記光増感剤はケイ素フタロシアニン錯体部分を有する、
　＜２＞に記載の殺菌剤。
＜４＞　前記ケイ素フタロシアニン錯体部分は下記式で表されるIRDye 700DXである、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　式中、錯体中心のＳｉに配位する２つの酸素原子はフタロシアニン骨格を挟んでtransの位置にあってもよく、フタロシアニン骨格の一方の側でcisの位置にあってもよい、
　＜３＞に記載の殺菌剤。
＜５＞　その用法において、
　前記殺菌剤の塗布された鼻腔の表面には鼻前庭の表面が含まれる、
　＜１＞に記載の殺菌剤。
＜６＞　その用法において、
　前記鼻腔は治療を受ける患者の鼻腔であり、
　前記塗布及び照射を前記患者が前記治療を受ける前に行うところ、
　前記治療は鼻に対する治療と鼻以外に対する治療を含むが、前記塗布及び照射による処置自体は含まない、
　＜５＞に記載の殺菌剤。
＜７＞　その用法において、
　前記患者は抗生物質に耐性のある黄色ブドウ球菌の保菌者であるか又は保菌者であることが疑われる、
　＜６＞に記載の殺菌剤。
＜８＞　その用法において、
　前記抗生物質に耐性のある黄色ブドウ球菌はＭＲＳＡである、
　＜７＞に記載の殺菌剤。
＜９＞　その用法において、
　前記患者がＭＲＳＡの保菌者であるか否かを予め検査し、
　前記検査の結果、前記患者がＭＲＳＡの保菌者であるか又は保菌者であることが疑われることが判明した場合に、前記塗布及び照射を行う、
　＜６＞に記載の殺菌剤。
＜１０＞　抗体に光増感剤が結合しているコンジュゲートを含有する殺菌剤であって、
　前記コンジュゲートにおいて、前記抗体は黄色ブドウ球菌と抗原抗体反応を起こすものであり、また赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に前記光増感剤の吸収波長域が重なり、
　その用法において、前記殺菌剤の塗布された臍の表面に対して赤色光線から近赤外光線にかけた波長域の励起光が照射される、
　殺菌剤。
＜１１＞　抗体に光増感剤が結合しているコンジュゲートを含有する殺菌剤であって、
　前記コンジュゲートにおいて、前記抗体は黄色ブドウ球菌と抗原抗体反応を起こすものであり、また赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に前記光増感剤の吸収波長域が重なり、
　その用法において、前記殺菌剤はウシの乳房に対して投与され、前記乳房に対して赤色光線から近赤外光線にかけた波長域の励起光が照射される、
　ウシの乳房炎の予防又は治療のための殺菌剤。
　本発明により細菌を標的とする光線免疫療法のための剤の臨床応用に有益な用法を提供することができる。
コンジュゲートと菌叢の模式図。 鼻腔の断面図。 細菌に対する光線免疫療法（aPIT, antimicrobial photoimmunotherapyの略）の殺菌効果のコンジュゲート分量依存性。 aPITの殺菌効果の照射エネルギー依存性。 aPITの殺菌効果に関する各対照試験。 メチシリン耐性株に対するaPITの殺菌効果。 aPITにおける黄色ブドウ球菌に対する特異性。 コットンラットに定着させた菌に対するaPITの評価。 コットンラットの鼻腔組織切片の顕微鏡観察像。 対数期の細菌に対するaPITの評価。 細菌を各種非選択培地で培養した後に行ったaPITの評価。 細菌をウマ脱線維素血に懸濁した後に行ったaPITの評価。 細菌と線維芽細胞の共培養後に行ったaPITの評価。 aPITにおける抗体クローン間の比較。 プロテインＡとFcとの相互作用の評価。 定着菌を含む菌叢への影響，照射無し。 定着菌を含む菌叢への影響，照射有り。 黄色ブドウ球菌に感染したマウスの生存曲線。 細菌にバイオフィルムを形成させた後に行ったaPITの評価。
＜１．殺菌剤とコンジュゲート＞
　本実施形態にかかる殺菌剤はコンジュゲートを含有する。図１はコンジュゲート１０を模式的に示す。コンジュゲート１０は抗体１１と光増感剤１２とからなる抗体－薬物複合体（ADC, Antibody-Drug Conjugate）である。
　図１において、抗体１１は標的細菌１６に対して特異的なモノクローナル抗体でもよい。標的細菌１６は黄色ブドウ球菌である。抗体１１は黄色ブドウ球菌と抗原抗体反応を起こすものである。
　図１に示す抗体１１において、抗体のクラスはIgM、IgD、IgG、IgA及びIgEのいずれでもよい。図中の抗体１１はIgGである。IgGのサブクラスは１～４のいずれでもよい。抗体１１はキメラ抗体でも、ヒト化抗体でも、完全ヒト抗体でもよい。抗体はハイブリドーマ抗体でもよく、リコンビナント抗体でもよい。
　図１に示す抗体１１は、免疫グロブリン及びバリアントの全長でもよく部分断片でもよい。部分断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質いわゆるｓｃＦｖ、及びジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質いわゆるｄｓＦｖでもよい。図中の抗体１１はIgGの全長である。
　図１において、抗体１１は標的細菌１６に特有の標的分子１７の有する抗原決定基に対して特異的である。標的細菌１６はその表面に標的分子１７を有する。一態様において標的分子１７は黄色ブドウ球菌のペプチドグリカンである。抗体１１は抗ペプチドグリカン抗体である。抗体１１は黄色ブドウ球菌の表面に対して特異的である。
　非特許文献２によれば、ペプチドグリカンは黄色ブドウ球菌の細胞壁の構成成分のうち大きな割合を占めることが知られている。その構造において、N-アセチルグルコサミンとN-アセチルムラミン酸とが交互に結合してなる糖鎖が、ペンタグリシンからなるオリゴペプチドで架橋されている。オリゴペプチド部分に付加されるアミノ酸にはD型アミノ酸が含まれる。オリゴペプチドに含まれるリシン残基がペンタグリシンによる橋渡し部分となっている。このため、リシン型ペプチドグリカン（Lys-type PGN）とも呼ばれる。下記化学式は非特許文献２より引用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
＜２．光増感性の付与＞
　図１に示すようにコンジュゲート１０において光増感剤１２が抗体１１に結合している。他の観点においてコンジュゲート１０は光増感剤１２で修飾された抗体である。抗体１１と光増感剤１２とは共有結合性の結合をしている。図の例示では光増感剤１２がリンカー１３を介して抗体１１のＦｃ領域に結合している。より具体的には光増感剤１２がリンカー１３を介して抗体１１の重鎖の定常領域（ＣＨ領域）のＣＨ２に結合している。
　図１において抗体１１と光増感剤１２との共有結合性の結合は非共有結合性の結合に置き換えてもよい。例えば部位特異的な抗体結合ペプチドに対して光増感剤１２を結合させた上で、この抗体結合ペプチドと光増感剤のコンジュゲートを抗体１１の特定部位に結合させてもよい。
　図１において、１個の抗体１１に対して、１個又は２個以上の光増感剤１２が結合している。１個の抗体１１当たり３，４，５，６，７，８，９，１０及び１１個以上のいずれかの光増感剤１２が結合していてもよい。コンジュゲート１０は光増感剤１２の結合数が異なるコンジュゲートの混合物でもよい。光増感剤１２の結合数の平均は１～１０でもよく、２～５でもよく、２．５～４でもよい。
　図１において単一の分子であるコンジュゲート１０の全体から見れば、光増感剤１２の部分は原子団と解釈される。またコンジュゲート１０自体を光増感剤と解釈することもできる。しかしながら本明細書では説明を簡便にするため、この原子団の部分に範囲を限定して、これを単に光増感剤と呼ぶものとする。
　図１に示す光増感剤１２は所定の吸収波長域を有する。この吸収波長域は赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に重なる。赤色光線から近赤外光線にかけた波長域は、波長６５０～８５０ｎｍの波長域であることが好ましい。
　係る波長域が選ばれる理由は生体内の物質に依拠する。表皮上や菌叢には水のような光の吸収物質がある。上記波長域の光線は、他の波長域の光線に比べてこれらに吸収される割合が小さい。このことを指して“NIR window”と呼ばれることがある。
　技術分野によっては波長６５０～８５０ｎｍの波長域には近赤外光線のみならず、可視光線が含まれるものと解釈される場合がある。これは係る波長域が近赤外光線と可視光線との間の接続領域であるためである。しかしながらこのような波長域の光が赤外線であるか可視光線であるかの厳密な区別は発明の本質と強く関連しない。本実施形態ではコンジュゲートが励起光を照射されることで光増感作用を発揮する際、励起光の中に近赤外光線の他に赤い可視光線が成分として含まれていてもよいものとする。
　図１に示す光増感剤１２は蛍光団又は発色団でもよい。本実施形態において光増感剤１２が波長６５０～８５０ｎｍの波長域に蛍光を発したとしてもかかる蛍光は積極的に用いられない。光増感剤１２が光増感作用２１を有していることで、励起光２０の有する光エネルギーを標的細菌１６に対するダメージに変換できればよい。光増感剤１２が光エネルギーを標的細菌１６に対するダメージに変換できる割合が高いほどよい。これらの観点から光増感剤を選別してもよい。
　図１に示す光増感剤１２はケイ素フタロシアニン錯体部分（原子団）を有する。光増感剤１２は下記式で表されるIRDye 700DX、略称IR700が好ましい。なお「IRDye」は商標である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　IR700は例えばＬＩ－ＣＯＲ社から下記式に示すＮＨＳエステルとして提供されている。ＮＨＳエステルは例えば抗体の定常領域に位置するアミノ基を容易に標識することが出来る。なお立体化学的に許される限り、錯体中心のＳｉに配位する２つの酸素原子はフタロシアニン骨格を挟んでtransの位置にあってもよく、フタロシアニン骨格の一方の側でcisの位置にあってもよい。化学式中では酸素原子同士がcisの位置にあるようにあらわされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　図１に示す光増感剤１２に応用され得る他の光増感剤又は光増感剤の有する構造としては、ポルフィリンやポルフィリン骨格を有する誘導体や、フタロシアニンやフタロシアニン骨格を有する誘導体が挙げられる。またIR700と類似する構造を有するナフタロシアニンが挙げられる。光増感剤は光線力学的療法（PDT）に用いられるポルフィリン系の誘導体でもよい。ポルフィリン系の誘導体の例としてクロリンｅ６、プロトポルフィリン及びヘマトポルフィリン誘導体（HpD）が挙げられる。
＜３．抗体と標的細菌の結合の様式＞
　図１において、抗体１１と標的分子１７とは抗原抗体反応によって結合している。黄色ブドウ球菌と抗体との間には抗原抗体反応以外の結合様式が知られている。すなわち黄色ブドウ球菌の表面にはプロテインＡが発現している。背景技術で述べた通りプロテインＡはIgG抗体のＦｃ領域に特異的に結合する。
　図１においてコンジュゲート１０はプロテインＡとＦｃ領域との結合に依存せずとも、抗体１１の抗原識別力を利用して標的細菌１６の黄色ブドウ球菌に特異的に結合する。一例において抗体１１はＦｃ領域を有しない。一例において抗体１１はＦｃ領域以外で光増感剤１２と結合する。一例において抗体１１のＦｃ領域は光増感剤１２と結合しており、さらに光増感剤１２の立体障害によりＦｃ領域のプロテインＡに対する親和性が低下している。
＜４．殺菌剤の剤形＞
　殺菌剤はコンジュゲートを含有する液剤でもよい。殺菌剤には薬学的に許容されるキャリアが含まれる。薬学的に許容される流体及び生理学的に許容される流体を、ビヒクルとして液剤の調製に用いてもよい。ビヒクルの例は、水、生理食塩液、平衡塩類溶液、水性デキストロース、又はグリセロールである。湿潤剤、乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤などをさらに添加してもよい。添加例としては酢酸ナトリウムやソルビタンモノラウレートである。
　殺菌剤の剤形は上記液剤に限定されない。殺菌剤は外用散剤を含む外用固形剤、リニメント剤及びローション剤を含む外用液剤、外用エアゾール剤及びポンプスプレー剤を含むスプレー剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、テープ剤及びパップ剤のいずれかであってもよい。鼻前庭を含む鼻腔に投与する場合はスプレー剤が好ましい。
＜５．殺菌剤の使用法＞
　殺菌剤は細菌感染に対するPIT、特に近赤外光線免疫療法（Near Infrared-PIT, NIR-PIT）における使用に適している。まず患者の鼻の中に殺菌剤を塗布する。塗布は綿棒やスプレーで行う。塗布以外の投与方法を用いてもよい。
　図２に鼻の断面を示す。鼻前庭２４は鼻腔２５の外鼻孔２６の入り口に位置する。鼻前庭には通常、鼻毛が生えている。鼻前庭２４の表皮や鼻毛には黄色ブドウ球菌を含む菌叢が生じている場合がある。
　図２において殺菌剤を鼻前庭２４に塗布する。殺菌剤を塗布した鼻前庭２４に赤外線治療器２７などの光源を用いて励起光を照射する。励起光の光源はレーザーでもよくＬＥＤでもよい。赤外線治療器２７はディフューザー型のレーザーファイバーでもよい。必要に応じてさらに鼻腔２５内の粘膜に殺菌剤を塗布し、さらに励起光を照射してもよい。照射に当たり赤外線治療器２７を外鼻孔２６から鼻腔２５内に挿入してもよい。
　図１に戻る。標的細菌１６は菌叢１５内に生息する。菌叢１５は表皮１４上に生じる菌叢である。ここで表皮１４は鼻前庭の表皮である。菌叢１５には標的細菌１６以外の細菌も生息する。
　図１においてコンジュゲート１０を含有する殺菌剤の代わりに、抗菌スペクトルの大きい殺菌剤を利用すると菌叢１５内の標的細菌１６以外の細菌もことごとく死滅させる可能性がある。これに対して本実施形態のようにコンジュゲート１０を励起光２０で活性化することで菌叢１５内の標的細菌１６を狙い撃ちで攻撃することができる。したがって光免疫療法は標的細菌１６以外の細菌の中から新たな耐性菌を発生させる可能性が小さい。ただし、本実施形態は、光免疫療法の他に殺菌剤を用いた処置を行うことを除外するものではない。
　図１において、励起光２０を受けた光増感剤１２は励起される。励起された光増感剤１２が光増感作用２１を発揮することで、標的細菌１６にダメージを与える。光増感作用２１はエネルギーを伴っているが、必ずしも電磁波とは限らない。
　図１において、励起光２０として赤色光線から近赤外光線にかけた波長域の光を用いる。励起光２０として波長６５０～９００ｎｍの、好ましくは６６０～７４０ｎｍ、さらに好ましくは６６０～７１０ｎｍの光線を照射する。波長は６８０ｎｍでもよい。
　図１に示す励起光２０の照射線量は好ましくは１（Ｊ／ｃｍ２）以上であり、さらに好ましくは１０～５００（Ｊ／ｃｍ２）である。照射線量は２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００及び４００（Ｊ／ｃｍ２）のいずれかでもよい。
　１回の殺菌剤の投与後に、１回又は２回以上の照射をしてもよい。照射は２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回でもよい。殺菌剤の投与は２回以上行ってもよい。２回目以降の殺菌剤の投与後の照射回数も１回又は２回以上でよい。
＜６．殺菌のための有効量＞
　殺菌にあたってコンジュゲートの有効量を推定する必要がある。有効量は処置される患者の体又は体の部位において所望の効果を達成するのに十分なコンジュゲートの量である。有効量は、処置される患者又は患部、コンジュゲートの種類、及び投与方法といった複数の因子に依存してもよい。事前に決定した一般的な有効量に関わらず、個々の患者における有効量は患者のコンディションに応じて変化することを考慮する。有効量の殺菌剤を投与するために、単回投与で殺菌剤を投与してもよく、複数回投与で投与してもよい。
　コンジュゲートの有効量は例えば体重６０キログラム当たり少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／６０ｋｇである。静脈内投与では、例えば０．５～５０ｍｇ／６０ｋｇである。用いる量は１ｍｇ／６０ｋｇ、２ｍｇ／６０ｋｇ、５ｍｇ／６０ｋｇ、２０ｍｇ／６０ｋｇ、又は５０ｍｇ／６０ｋｇでもよい。
　コンジュゲートの有効量は、体重を基準として、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも５００μｇ／ｋｇ又は少なくとも５００μｇ／ｋｇである。腹腔内投与では、例えば１０μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇである。用いる量は例えば１００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、又は１０００μｇ／ｋｇでもよい。
＜７．予防的措置＞
　本実施形態の殺菌剤を、他の主となる治療に先立って患者に使用することで、その治療後に患者が黄色ブドウ球菌に感染することを予防してもよい。一例として、治療として手術を受ける予定の患者の鼻前庭に殺菌剤を塗布する。その後、上述の通り鼻前庭に励起光を照射する。塗布及び照射は患者が手術を受ける前に行う。ここでいう手術は鼻以外に対する手術を含む。このような塗布及び照射もPITの応用の一例である。手術以外の治療を受ける患者に対して行ってもよい。患者は入院患者でもよい。PITの後に行う治療は鼻に対する治療と鼻以外に対する治療を含むが、上記の殺菌剤の塗布と照射の処置自体は含まない。すなわち殺菌剤の塗布と照射の処置は、主となる治療の実施を前提として行われる。
　PITを受ける患者としては、抗生物質に耐性のある黄色ブドウ球菌、いわゆる耐性菌の保菌者であることがすでに判明している人が挙げられる。本実施形態において「抗生物質」の用語の中には、本実施形態の殺菌剤を含まない。また患者が耐性菌の保菌者であることが疑われる場合にもPITを適用してもよい。一例において耐性菌は多剤耐性菌である。一例において耐性菌はMRSAである。一例においてMRSAはバンコマイシンやムピロシンに対して完全な又は不完全な耐性をさらに有する。バンコマイシンやムピロシンはMRSAに対して用いられる抗菌薬の一種である。一例において耐性菌はVISAやムピロシン耐性MRSAである。
　一例において患者が耐性菌の保菌者であるか否かを予め検査してもよい。検査の結果、患者が抗生物質に耐性のある黄色ブドウ球菌の保菌者であるか又は保菌者であることが疑われることが判明した場合に、PITを行ってもよい。
　入院患者に対する検査の手法としては例えば、全入院患者に対して検査を行うユニバーサル・サーベイランスが挙げられる。いわゆる“search and destroy”とも呼ばれ、フィンランド、デンマーク、オランダといった国々で行われる。また他の検査の手法として耐性菌の保菌リスクが高い患者に対して検査を行うアクティブ・サーベイランスが挙げられる。また感染症兆候または症状を呈する患者だけに行うパッシブ・サーベイランスも挙げられる。いずれのサーベイランス手法の実施の後においても、本実施形態の殺菌剤を利用して保菌者又は保菌者であることが疑われる者に対してPITを施してよい。
＜８．変形例＞
　なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。上記実施形態ではヒトの患者の鼻腔、特に鼻前庭を例にして説明した。殺菌する部位は患者の咽頭を含む上気道やあるいは創傷部位でもよい。
　患者が臍（へそ）に保菌しているMRSAも殺菌の対象とし得る。臍に対して殺菌剤を塗布した後に光線照射してもよい。この用法は周術期、特に術後のMRSA感染症の予防に効果的である。
　また殺菌剤の塗布と照射の処置は、哺乳動物を含む非ヒト動物に対する予防及び治療の用途にも有用である。例えば乳房炎予防又は治療のためにウシに対して処置を行ってもよい。コンジュゲートを乳房炎の予防薬として用いる場合は乳房の表面にコンジュゲートを塗布で投与するとともに、乳房に光線を照射することが望ましい。コンジュゲートを乳房炎の治療薬として用いる場合は乳房内にコンジュゲートを投与するとともに、乳房に光線を照射することが望ましい。
　細菌に対する光線免疫療法（aPIT）の効果を調べた。以下において、in vitro及びin vivoでの実験の違いによらず、コンジュゲートを細菌に適用した後、励起光を細菌に照射して光増感剤の作用を細菌に対して特異的に作用させることをaPITと略称する。
＜９．細菌株＞
　MSSA（メチシリン感受性黄色ブドウ球菌）としてJKmsSA1株を利用した。JKmsSA1株は、東京慈恵会医科大学の総合医科学研究センターの基盤研究施設の細菌ライブラリから提供された保存株である。JKmsSA1株に代えて非特許文献１に記載のJCM2874株などその他の株を使用してaPITの効果を確認してもよい。
　MRSAとしてJKmrSA1株を利用した。JKmrSA1株は、東京慈恵会医科大学の総合医科学研究センターの基盤研究施設の細菌ライブラリから提供された保存株である。
　VISAとしてMU50株を利用した。MU50株は、非特許文献３及び４にてその来歴と特性が記されている。
　ムピロシン耐性MRSAとしてJKmmrSA1株を利用した。JKmmrSA1株は、東京慈恵会医科大学の総合医科学研究センターの基盤研究施設の細菌ライブラリから提供された保存株である。
＜１０．コンジュゲート＞
　非特許文献１に記載の方法に従いコンジュゲートを作製した。まず抗ペプチドグリカン－マウスモノクローナル抗体mAb15704（クローン番号Staph12-569.3，IgG3抗体，QED bioscience社）とIR700DX NHS ester (LI-COR社)とを所定の量比で混和した。mAb15704はProtein Aネガティブな黄色ブドウ球菌に対しても反応することが確認されている。非特許文献５のQED bioscience社のプロダクトデータシート参照。コンジュゲート化の反応を行って化合物mAb15704-IR700を得た。以下mAb15704-IR700をSA-IR700と呼ぶ場合がある。次にゲルろ過にて化合物を精製抽出した。精製抽出物に対して分光高度計を用いて吸光度測定を行った。測定結果から1分子の抗体当たり約3分子のIR700が結合していることを確認した。
＜１１．コロニー計数法＞
　細菌懸濁液とmAb15704-IR700とを反応させた。その後細胞懸濁液にLEDライトによって波長ピーク690nmの近赤外光を励起光として照射した。照射後に細胞懸濁液のサンプルをボルテックスした。細胞懸濁液を段階希釈法にて希釈し、各濃度の細胞懸濁液を平板培地上に滴下した。37℃で24時間、細菌を培養した。平板培地上のコロニー数からaPITによる殺菌の効果を評価した。特に断りがない限り平板培地は栄養寒天培地とした。
＜１２．結果＞
　図３ではMSSAのJKmsSA1株に対して、一試験当たり0.01-1 μｇの分量のコンジュゲートでaPITを行った。その後コロニー計数法を行った結果を表す。励起光の照射量は5 J/cm2である。コンジュゲートの分量が増えるほどコロニーを形成した菌は減った。したがってコンジュゲートの分量又は濃度に依存して殺菌効果の高まることが示された。**はP<0.01を表す。c.f.u.はコロニー形成単位を表す。グラフは3回の独立試行の平均をあらわす。エラーバーは標準偏差を表す。以下同様である。
　図４ではMSSAに対して、一試験当たり5-45 J/cm2の照射量の励起光でaPITを行った。その後コロニー計数法を行った結果を表す。コンジュゲートの分量は0.3μｇである。照射量が増えるほどコロニーを形成した菌は減った。したがって励起光の照射量に依存して殺菌効果の高まることが示された。
　図５ではMSSAに対して、種々の対照条件下でaPITを行った。その後コロニー計数法を行った結果を表す。左から2番目のグラフは1 μｇのコンジュゲートに対して、さらにコンジュゲート化前の抗体を大過剰の10μｇ添加して細菌懸濁液との反応を行った場合の結果を示す。図３の6番目のグラフと比較して励起光の照射量を15 J/cm2に引き上げたにも関わらず、殺菌効果は見られなかった。これはコンジュゲートと、コンジュゲート化前の抗体との間で拮抗が起きた結果と考えられる。したがって殺菌効果はコンジュゲートの抗体部分に依存していることが示された。
　図５の左から3番目のグラフは4μｇのコンジュゲートを添加したが励起光の照射はしなかった場合の結果を示す。左から4番目のグラフは100 J/cm2の励起光を照射したがコンジュゲートは添加しなかった場合の結果を示す。いずれの場合も殺菌効果は見られなかった。したがって殺菌効果は細胞懸濁液へのコンジュゲートの添加と励起光の照射とが揃わなければ得られないことが示された。
　図６は耐性菌MRSA、VISA及びムピロシン耐性MRSAに対してaPITを行った。その後コロニー計数法を行った結果を表す。いずれの耐性菌に対しても1試験当たり２μｇのコンジュゲートを添加した。さらに90 J/cm2の励起光を照射した。コンジュゲートと励起光とによってコロニーを形成した菌は見られなくなった。したがって殺菌効果は感受性菌のみならず耐性菌にももたらされることが示された。
　図７はMRSA及び異種細菌の混合物にaPITを行い、さらに平板培地上で培養した結果を表す。異種細菌として表皮ブドウ球菌Staphylococcus epidermidisのJCM2414株を用いた。1試験当たり２μｇのコンジュゲートを添加した。平板培地としてMSA選択培地とOPA II選択培地とを用いた。MSA選択培地上ではMRSA及び表皮ブドウ球菌のいずれもコロニーを形成する。OPA II選択培地上ではMRSAだけがコロニーを形成するが、表皮ブドウ球菌はコロニーを形成しない。なおプロダクトデータシートのSPECIFICATION SUMMARYによれば、抗ペプチドグリカン－マウスモノクローナル抗体mAb15704は表皮ブドウ球菌のペプチドグリカンについても認識するものとされているが、発明者らの観察では、mAb15704から合成されたコンジュゲートは、黄色ブドウ球菌に比べ、表皮ブドウ球菌には十分な結合を示さず、光線照射を行っても黄色ブドウ球菌に対するような殺菌効果を表皮ブドウ球菌に対して示さなかった。
　図７の上段の写真では明暗が反転している。左のプレートから順に励起光の照射量が０，５及び４０ J/cm2である。aPITを受けた細菌はMSA選択培地では照射量が増えてもコロニーを形成していた。OPA II選択培地では照射量が増えるほどコロニーを形成しなくなった。
　図７の下段ではコロニー計数法による評価をおこなった。励起光の照射量を０，５及び４０ J/cm2とした。aPITを受けたMRSAは、aPITの照射量が増えるほどコロニーを形成しにくくなった。aPITを受けた表皮ブドウ球菌は、aPITの照射量が増えてもコロニー数が変化しなかった。したがって殺菌効果は黄色ブドウ球菌に特異的であることが示された。
　図８及び９ではMRSAをコットンラットの鼻腔に定着させた。コットンラットは感染に対して抵抗力の弱い動物種である。このためコットンラットは鼻腔に細菌の保菌状態を作るのに適したモデル生物である。コットンラットの鼻腔に対してaPITを行った。
　図８では、1匹あたり５μｇのSA-IR700を定着部位に滴下することで投与したのち、定着部位に０，１０及び５０ J/cm2の近赤外線をレーザーファイバーで照射した。コットンラットの鼻は小さいので、鼻の外側から鼻腔に向けて近赤外光を照射した。鼻腔を切断することで動物より細菌を取り出した。鼻腔から菌叢を取り出し、OPA II選択培地上で培養した。コロニー計数法でaPITの効果を評価した。
　図８の下段にはMRSAのコロニー数が、上段にはそれぞれのグラフに対応する細菌の培養の写真が示されている。写真では明暗が反転している。定着部位への照射量が増えるに従い、コロニー数が減少した。したがって殺菌効果は生体表面上の菌叢に対するaPITでも得られることが示された。
　図９の下段はMRSAを定着させたコットンラットに対してaPITを行った後の、鼻腔の組織切片の顕微鏡観察像である。上段はaPITを行っていない対照実験を表す。いずれの場合も鼻腔粘膜の組織は健全であった。
　図１０ではMSSAに対して、一試験当たり1 μｇの分量のSA-IR700コンジュゲートでaPITを行った。励起光の照射量は15 J/cm2であった。ただし図１０に示す実験ではMSSAが増殖の対数期、いわゆるプラトーであった。これに対いて図３から図５に示した実験では増殖期であった。aPIT後コロニー計数法を行った。対数期のMSSAに対してもaPITの殺菌効果が見られた。
　図１１では各種培地での培養中のMSSAに対して、一試験当たり1 μｇの分量のSA-IR700コンジュゲートでaPITを行った。左から順にTSB（トリプトンソイブイヨン）培地、グルコースを添加したTSB培地（TSBG培地）、BHI（ブレインハートインフュージョン）培地及びLB培地（Luria-Bertani medium）を表す。aPIT後コロニー計数法を行った。各種培地での培養後にもaPITの殺菌効果が見られた。
　図１２ではMSSAをウマ脱線維素血に対して懸濁後に、一試験当たり4 μｇの分量のSA-IR700コンジュゲートでaPITを行った。aPIT後コロニー計数法を行った。栄養豊富な血液中でもaPITの殺菌効果が見られた。
　図１３では1試験当たり1x107 CFUのMSSAを1試験当たり30μｇのSA-IR700コンジュゲートで処理した。さらに黄色ブドウ球菌を、3T3繊維芽細胞に添加して、37℃、5%CO2雰囲気の下で30分間共培養した。3T3繊維芽細胞は予め直径35 mmの培養皿上でコンフルエントにした。細胞を1 mlのRPMI培地（Roswell Park Memorial Institute medium）で3回リンスした。細胞外の黄色ブドウ球菌を1 mlの1 mg/mlリゾスタフィン溶液（lysostaphin，富士フイルム和光純薬社）で30分間溶解した。細胞を1 mlのRPMI培地で5回リンスした後、近赤外線を照射した。細胞をホモジナイズして段階希釈した後、寒天培地上で培養してコロニー計数法を行った。左側のグラフは励起光の照射を行わなかったことを示す。SA-IR700コンジュゲートで処理した後の黄色ブドウ球菌は、細胞に取り込まれることでリゾスタフィンによる駆除を免れたことを示す。したがってSA-IR700コンジュゲートによる処理のみでは細胞への寄生を防げないことが示された。これに対して励起光を照射した場合は黄色ブドウ球菌は駆除された。したがってSA-IR700コンジュゲートでの処理後に黄色ブドウ球菌が細胞に逃げ込んでも、励起光による殺傷効果は細胞内まで及ぶことが示された。
　図１４では抗ペプチドグリカン－マウスモノクローナル抗体mAb15702（クローン番号Staph11-232.3，IgG3抗体，QED bioscience社）を用いて別のコンジュゲートを作製した。（ａ）左から2番目と4番目のグラフが先に述べたクローン番号Staph12-569.3の抗体で行ったaPITの結果である。
　図１４ではさらに他の抗ペプチドグリカン－マウスモノクローナル抗体としてクローン番号Staph11-232.3，IgG3抗体，QED bioscience社を使用した。（ｂ）左から3番目と5番目のグラフがクローン番号Staph11-232.3の抗体で行ったaPITの結果である。抗体クローンの違いによってaPITの殺菌効果に若干の違いが現れた。しかしながら照射量を15 J/cm2から45 J/cm2に増大させることでいずれの抗体クローンでもaPITの殺菌効果が得られた。***はP<0.001を表す。
　図１５ではプロテインＡとＦｃとの相互作用を評価した。aPITを1試験当たり2μｇのTra-IR700コンジュゲートで行った。Tra-IR700はトラスツズマブのCH2領域にIR700が結合したコンジュゲートである。トラスツズマブはヒトIgG1に由来するフレーム構造領域及びマウスモノクローナル抗HER2抗体の相補的抗原認識領域を含むヒト化モノクローナル抗体である。Tra-IR700はヒトHER2に対して特異的な抗体であるから、Tra-IR700が細菌と抗体抗原反応することはないと考えられる。
　図１５では黄色ブドウ球菌として野生型のRN4220株を利用した。またプロテインＡ欠損株（Δspa）を利用した。その他の点については上記に倣いaPITとコロニー計数法を行った。プロテインＡの有無に関わらず、トラスツズマブの有するFc領域を介したaPITの殺菌効果は見られなかった。これに対して特許文献１ではプロテインＡとFc領域との相互作用によるPITが成功していた。しかしながら、図１５の示す結果はプロテインＡとFc領域との相互作用によるaPITは確実な方法ではない可能性を示唆している。またプロテインＡ欠損株に対する実験の結果はプロテインＡネガティブな黄色ブドウ球菌に対しても本実施例のaPITが有効であることを示している。
　図１６では図８と同様にMRSAをコットンラットに定着させたのち、コンジュゲートを投与せずに近赤外光だけ定着部位に照射した。図１７では１試験当たり２μｇのコンジュゲートを投与して近赤外光を定着部位に照射した。図８と異なり、非選択培地の平板培地で菌叢中の菌を培養してコロニー計数法を行った。この菌叢はコットンラットがMRSAに感染する前からもともと有していた菌叢であると考えられる。
　図８に示したようにMRSAがaPITにより駆除された。しかしながら、図１７に示すように菌叢中の他の菌はaPITによって死滅することはなかった。したがってSA-IR700によるaPITは黄色ブドウ球菌に対して特異的に働くため、菌叢の他の菌の生育に影響を及ぼさないことが示された。なお図１６に示すように励起光の照射が菌叢中の生菌を減少させることも無かった。
　図１８ではマウスに対して、１匹当たり108 CFUのMRSAを腹腔内投与した。MRSAは腹腔内投与の前にマウス１匹当たり50μｇのSA-IR700で処理しておいた。その後、100J/cm2の近赤外光をマウスの体外から照射した。照射しなかったものをaPIT(-)とした。aPITを受けたマウスはいずれも生存した。aPITを受けなかったマウスはいずれも死亡した。これらのマウスは腹膜炎を起こしたものと考えられる。したがってSA-IR700と黄色ブドウ球菌との接触だけでは疾病を予防できないことが示された。SA-IR700の投与と励起光の照射との組み合わせが、黄色ブドウ球菌に対する疾病の治療や予防にひつようであることが示された。
　図１９ではMRSAを１％のグルコースを加えたトリプチックソイ培養液で16時間静置培養した。これにより培養皿上でMRSAにバイオフィルムを形成させた。バイオフィルムをスクレイパーで培養皿から剥がすことで、MRSAごとバイオフィルムを回収した。このバイオフィルムをRPMI培地で洗浄した。MRSAをSA-IR700で処理した後、近赤外光線の照射をした。照射を受けたMRSAをRPMI培地に懸濁し、段階希釈した。その後、MRSAを寒天培地に播種することでMRSAにコロニーを形成させた。コロニーの数をカウントした。
　図１９のグラフは生存菌の割合（％）を表す。図中で（－）及び（＋）の両サンプルとも1回の試験当たり4 μgのSA-IR700でMRSAを処理した。（＋）のサンプルに対してのみ、30 J/cm2の近赤外光線の照射によるaPITを行った。
　図１９に示すように照射無し（－）のサンプルに比べて、照射あり（＋）のサンプルでは殺菌効果が観察された。以上より、aPITでは、抗生物質に耐性のある黄色ブドウ球菌がバイオフィルムを形成していても、殺菌効果を得られることが分かった。
　この出願は、２０１９年６月３日に出願された日本出願特願２０１９－１０３５７３を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１０　コンジュゲート
１１　抗体
１２　光増感剤
１３　リンカー
１４　表皮
１５　菌叢
１６　標的細菌
１７　標的分子
２０　励起光
２１　光増感作用
２４　鼻前庭
２５　鼻腔
２６　外鼻孔
２７　赤外線治療器

Claims (12)

  1. 　抗体に光増感剤が結合しているコンジュゲートを含有する殺菌剤であって、
    　前記コンジュゲートにおいて、前記抗体は黄色ブドウ球菌と抗原抗体反応を起こすものであり、また赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に前記光増感剤の吸収波長域が重なり、
    　その用法において、前記殺菌剤の塗布された鼻腔の表面に対して赤色光線から近赤外光線にかけた波長域の励起光が照射される、
    　殺菌剤。
  2. 　前記抗体は抗ペプチドグリカン抗体である、
    　請求項１に記載の殺菌剤。
  3. 　前記光増感剤はケイ素フタロシアニン錯体部分を有する、
    　請求項２に記載の殺菌剤。
  4. 　前記ケイ素フタロシアニン錯体部分は下記式で表されるIRDye 700DXである、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    　式中、錯体中心のＳｉに配位する２つの酸素原子はフタロシアニン骨格を挟んでtransの位置にあってもよく、フタロシアニン骨格の一方の側でcisの位置にあってもよい、
    　請求項３に記載の殺菌剤。
  5. 　その用法において、
    　前記殺菌剤の塗布された鼻腔の表面には鼻前庭の表面が含まれる、
    　請求項１に記載の殺菌剤。
  6. 　その用法において、
    　前記鼻腔は治療を受ける患者の鼻腔であり、
    　前記塗布及び照射を前記患者が前記治療を受ける前に行うところ、
    　前記治療は鼻に対する治療と鼻以外に対する治療を含むが、前記塗布及び照射による処置自体は含まない、
    　請求項５に記載の殺菌剤。
  7. 　その用法において、
    　前記患者は抗生物質に耐性のある黄色ブドウ球菌の保菌者であるか又は保菌者であることが疑われる、
    　請求項６に記載の殺菌剤。
  8. 　その用法において、
    　前記抗生物質に耐性のある黄色ブドウ球菌はＭＲＳＡである、
    　請求項７に記載の殺菌剤。
  9. 　その用法において、
    　前記抗生物質に耐性のある黄色ブドウ球菌はバイオフィルムを形成している、
    　請求項７に記載の殺菌剤。
  10. 　その用法において、
    　前記患者がＭＲＳＡの保菌者であるか否かを予め検査し、
    　前記検査の結果、前記患者がＭＲＳＡの保菌者であるか又は保菌者であることが疑われることが判明した場合に、前記塗布及び照射を行う、
    　請求項６に記載の殺菌剤。
  11. 　抗体に光増感剤が結合しているコンジュゲートを含有する殺菌剤であって、
    　前記コンジュゲートにおいて、前記抗体は黄色ブドウ球菌と抗原抗体反応を起こすものであり、また赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に前記光増感剤の吸収波長域が重なり、
    　その用法において、前記殺菌剤の塗布された臍の表面に対して赤色光線から近赤外光線にかけた波長域の励起光が照射される、
    　殺菌剤。
  12. 　抗体に光増感剤が結合しているコンジュゲートを含有する殺菌剤であって、
    　前記コンジュゲートにおいて、前記抗体は黄色ブドウ球菌と抗原抗体反応を起こすものであり、また赤色光線から近赤外光線にかけた波長域に前記光増感剤の吸収波長域が重なり、
    　その用法において、前記殺菌剤はウシの乳房に対して投与され、前記乳房に対して赤色光線から近赤外光線にかけた波長域の励起光が照射される、
    　ウシの乳房炎の予防又は治療のための殺菌剤。
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