WO2020230867A1 - Ｐａｃａｐの安定化ペプチド - Google Patents

Ｐａｃａｐの安定化ペプチド Download PDF

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WO2020230867A1
WO2020230867A1 PCT/JP2020/019344 JP2020019344W WO2020230867A1 WO 2020230867 A1 WO2020230867 A1 WO 2020230867A1 JP 2020019344 W JP2020019344 W JP 2020019344W WO 2020230867 A1 WO2020230867 A1 WO 2020230867A1
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peptide
sequence
peptide according
substituted
acid
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PCT/JP2020/019344
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慎之介 町田
毅 中嶋
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千寿製薬株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Stabilizing peptide with physiological activity of PACAP neuroprotective agent containing the peptide, vascular endothelial function improving agent, corneal neurite formation promoting agent, tear secretion promoting agent, dry eye therapeutic agent, corneal epithelium or corneal endothelial disorder therapeutic agent , Neurotrophic keratitis therapeutic agent, anti-inflammatory agent, or pharmaceutical composition.
  • Nerve cells are cells that make up the nervous system, which is roughly divided into the central nervous system and the peripheral nervous system. Nerve cells are susceptible to damage due to external factors such as cerebrovascular accidents such as stroke and cerebral infarction, and internal factors such as abnormal protein accumulation, oxidative stress, and inflammation, but their regenerative ability is low. Once the disorder occurs, it becomes a factor that significantly lowers the QOL of the patient.
  • Neurodegenerative diseases associated with neurodegeneration and shedding of the central nervous system include neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, muscular atrophic lateral sclerosis, and multiple sclerosis, as well as glaucoma and optic neuropathy. Examples include degenerative diseases of the optic nerve such as, and sensory neurodegenerative diseases such as neurological deafness.
  • PACAP The pituitary adenylate cyclase activated polypeptide (PACAP) is a neuropeptide found in a sheep hypothalamic extract.
  • PACAP may have the activity of stimulating cAMP formation in anterior pituitary cells.
  • PACAP38 composed of 38 amino acid residues
  • PACAP27 composed of 27 amino acid residues exist, and both have the same action (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • PACAP belongs to the vasoactive intestinal polypeptide (VIP) / secretin / glucagon superfamily, and the sequence of human PACAP27 has 68% identity with the vasoactive intestinal polypeptide (VIP).
  • PACAP and VIP bind to the PAC1 receptor (PAC1R), VPAC1 receptor (VPAC1R) and VPAC2 receptor (VPAC2R), but differ in their affinity for these receptors.
  • PAC1R binds to PACAP with high selectivity.
  • the affinity of PAC1R for PACAP is more than 1000 times higher than the affinity of PAC1R for VIP.
  • both VPAC1R and VPAC2R have similar affinities for PACAP and VIP.
  • PACAP has various physiological actions, and has physiological actions as a neuroprotective substance, an immunosuppressive factor, a vasodilator factor, an exocrine gland secretion promoting factor (Patent Document 3), and a neurite formation promoting factor (Patent Document 4). Is known to have.
  • the present invention relates to a PACAP stabilizing peptide having high stability in an aqueous solution, a neuroprotective agent containing the peptide, a neuroprosthetic formation promoter, a lacrimal gland secretion promoter, a pharmaceutical composition for treating or preventing dry eye, corneal epithelium or corneal epithelium.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating or preventing endothelial disorders, a pharmaceutical composition for treating or preventing neurological disorders, or a composition for treating or preventing neurotrophic keratitis.
  • the present invention relates to the following: [1] HX 1 -DGX 2 -FX 3 -DX 4 -YX 5 -RYRKX 6 -X 7 -AVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 3) ⁇ In the formula, X 1 is a neutral amino acid X 2 is a neutral amino acid X 3 is a neutral amino acid X 4 is alanine, serine, Ai or Cn, X 5 is alanine, serine, Ai or Cn, X 6 is glutamine or alanine and X 7 is a non-polar amino acid ⁇
  • aspartic acid is independently tetrazole-substituted aspartic acid (Tz), tetrazole-substituted glutamic acid (egTz), tetrazole-substituted homoglutamic acid (nvTZ), and sulfoxy-substituted as
  • the peptide, wherein the modified sequence is a sequence in which one or more amino acids are deleted or added in the sequence of SEQ ID NO: 3.
  • X 3 is alanine or threonine.
  • X 7 is methionine, leucine, norleucine, or alanine.
  • amino acids at positions 3 and 8 are tetrazole-substituted aspartic acid (Tz), tetrazole-substituted glutamic acid (egTz), or tetrazole-substituted homoglutamic acid (nvTZ), these amino acids are L-form, D-form, or The peptide according to any one of items 1 to 5, which is a racemic acid.
  • the modified sequence is as follows: GKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 43); GKRYKQRVKN (SEQ ID NO: 44); GKRYKQRVK (SEQ ID NO: 45); GKRYKQRV (SEQ ID NO: 46); GKRYKQR (SEQ ID NO: 47); GKRYKQ (SEQ ID NO: 48); GKRYK (SEQ ID NO: 49); GKRY (SEQ ID NO: 50) GKR; GRR; GK; and GR G;
  • the peptide according to any one of items 1 to 10 or 12 which is a sequence in which one sequence selected from the group consisting of is added to the C-terminal of the sequence.
  • a neuroprotective agent comprising the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • a tear secretagogue containing the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • An anti-inflammatory agent comprising the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • An agent for improving vascular endothelial function which comprises the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • a therapeutic agent for corneal epithelium or corneal endothelium disorder which comprises the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • a therapeutic agent for dry eye containing the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • a method for neuroprotecting a subject in need of neuroprotection which comprises administering to the subject an effective amount of the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • the method for promoting tear secretion in a subject requiring tear secretion which comprises administering the peptide according to any one of items 1 to 13 to the subject.
  • the method for improving vascular endothelial function in a subject requiring improvement of vascular endothelial function which comprises administering the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • the method for suppressing inflammation in a subject suffering from inflammation which comprises administering the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • a method for ameliorating corneal epithelium or corneal endothelium disorder in a subject suffering from corneal epithelium or corneal endothelium disorder which comprises administering the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • the method [26] The method for treating or preventing dry eye in a subject suffering from dry eye, which comprises administering the peptide according to any one of items 1 to 13.
  • the peptide according to any one of items 1 to 13 for use in the treatment or prevention of inflammatory diseases [33] Any of items 1 to 13 for use in the treatment or prevention of vascular endothelial disorders.
  • Item for manufacturing a drug selected from the group consisting of a neuroprotective agent, a tear secretion promoter, an anti-inflammatory agent, a vascular endothelial function improving agent, a corneal epithelium or corneal endothelium disorder therapeutic agent, and a dry eye therapeutic agent.
  • a neuroprotective agent selected from the group consisting of a neuroprotective agent, a tear secretion promoter, an anti-inflammatory agent, a vascular endothelial function improving agent, a corneal epithelium or corneal endothelium disorder therapeutic agent, and a dry eye therapeutic agent.
  • PACAP which was unstable in an aqueous solution, can be significantly stabilized.
  • the aspartic acid residues at the 3- and 8-positions of PACAP are independently tetrazole-substituted aspartic acid (Tz), tetrazole-substituted glutamic acid (egTz), tetrazole-substituted homoglutamic acid (nvTZ), and sulfoxy-substituted aspartic acid (nvTz).
  • Tz tetrazole-substituted aspartic acid
  • egTz tetrazole-substituted glutamic acid
  • nvTZ tetrazole-substituted homoglutamic acid
  • sulfoxy-substituted aspartic acid sulfoxy-substituted aspartic acid
  • PACAP38 HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 1)
  • PACAP27 HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2)
  • tetrazole-substituted aspartic acid (Tz), tetrazole-substituted glutamic acid (egTz), and tetrazole-substituted homoglutamic acid (nvTz) are carboxy groups of the side chains of aspartic acid, glutamic acid, and homoglutamic acid, respectively. It means an unnatural amino acid residue having a structure substituted with the isostar tetrazole. Specifically, it is expressed by the following formula:
  • sulfoxy-substituted aspartic acid (cya) and oxadiazolone-substituted aspartic acid (5Oxa) each use the carboxy group of the side chain of aspartic acid as a sulfoxy group or 1,2,4 which is an isostar of the carboxy group.
  • -Oxadiazole-5-one (oxadiazolone) means a residue having a structure substituted. Specifically, it is expressed by the following formula:
  • the unnatural amino acid residue in which the aspartic acid at the 3- and 8-positions is substituted may be an L-form, a D-form, or a racemic form as long as it has the same physiological activity as PACAP.
  • the peptide substituted with the L-form tetrazole-substituted aspartic acid and the peptide substituted with the D-form tetrazole-substituted aspartic acid have similar binding properties to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R.
  • the inclusion of D-form amino acids makes it less likely to be degraded by enzymes and can increase stability.
  • unnatural amino acids other than proteinogenic amino acids can also be introduced into peptides by introducing a protecting group by a method such as the Fmoc method.
  • a sequence in which a part of the sequence is modified means a sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, or added to the original sequence. More preferably, a partially modified sequence is a sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added to the original sequence.
  • Amino acid substitutions can occur anywhere as long as the binding of the peptide consisting of a partially modified sequence to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R is not altered.
  • a peptide consisting of a partially modified sequence from the viewpoint of maintaining binding, at positions 2, 5, 7, 9, 11, 16, and 17 of PACAP27, Amino acid substitutions can occur.
  • the following sequence HX 1 -DGX 2 -FX 3 -DX 4 -YX 5 -RYRKX 6 -X 7 -AVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 3)
  • the amino acids at the positions indicated by X 1 to X 7 can be substituted.
  • one aspect of the present invention is the following formula: HX 1 -DGX 2 -FX 3 -DX 4 -YX 5 -RYRKX 6 -X 7 -AVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 3) ⁇
  • X 1 to X 6 are neutral amino acids
  • X 7 is a non-polar amino acid ⁇
  • the aspartic acid at the 3- and 8-positions are independently tetrazole-substituted aspartic acid (Tz), tetrazole-substituted glutamic acid (egTz), tetrazole-substituted homoglutamic acid (nvTZ), and sulfoxy-substituted aspartic acid (cya).
  • a peptide consisting of a sequence substituted with a residue selected from the group consisting of oxadiazolone-substituted aspartic acid (5Oxa), or a modified sequence thereof, which binds to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R.
  • 5Oxa oxadiazolone-substituted aspartic acid
  • conservative substitution refers to the substitution of amino acids within the following groups: (I) Non-polar amino acids: Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Nle, Ala (Ii) Neutral amino acids: Ala, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, Gly (Iii) Basic amino acids: Lys, Arg, His (Iv) Acidic amino acids: Asp, Glu
  • ⁇ -aminoisobutyric acid (Ai) in which a methyl group is substituted at the ⁇ -position of alanine or ⁇ -cyanoalanine (Cn) in which the hydrogen at the ⁇ -position of alanine is substituted with a cyano group is used instead of alanine.
  • ⁇ -aminoisobutyric acid (Ai) and ⁇ -cyanoalanine (Cn) can be used as the 9- and 11-position neutral amino acids.
  • ⁇ -aminoisobutyric acid (Ai) and ⁇ -cyanoalanine (Cn) have the following structures:
  • the amino acids represented by X 1 to X 7 are preferably as follows:
  • the neutral amino acids in X 1 are especially alanine or serine.
  • the neutral amino acids in X 2 are especially isoleucine or alanine.
  • the neutral amino acids in X 3 are especially alanine or threonine.
  • the neutral amino acids in X 4 and X 5 are especially alanine, serine, ⁇ -aminoisobutyric acid, or ⁇ -cyanoalanine.
  • the neutral amino acids in X 6 are especially glutamine or alanine.
  • Non-polar amino acids in X- 7 are especially methionine, leucine, norleucine, or alanine.
  • the modified sequence means a sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, or added to the original sequence. More preferably, a partially modified sequence is a sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added to the original sequence.
  • the amino acid substitution may be carried out by substituting one or more amino acids, but from the viewpoint of maintaining activity, any number from 1 to 10, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids can be substituted. Of these, substitutions of 1 to 4 amino acids are particularly preferred, more preferably 3 amino acids are substituted, even more preferably 2 amino acids are substituted, and particularly preferably 1 amino acid is substituted.
  • Amino acid deletions can occur anywhere as long as the binding of the peptide consisting of a partially modified sequence to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R is not altered.
  • the number of amino acids deleted is chosen from any number from 1 to 10, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10. From the viewpoint of not changing the binding property, deletion of one or two amino acids, and further deletion of one amino acid is particularly preferable.
  • Amino acid deletions may be deleted from the N-terminal side or C-terminal side of the original sequence, or from the inside of the sequence.
  • PACAP27 and PACAP38 have equivalent binding properties to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R, respectively, it is said that even if the amino acid present on the C-terminal side of PACAP38 is deleted, the binding property is not affected. Conceivable.
  • amino acids can occur anywhere as long as the binding of the peptide consisting of a partially modified sequence to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R is not altered.
  • the number of amino acids added is chosen from any number from 1 to 10, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • Amino acids may be added to the N-terminal side or C-terminal side of the original sequence, or may be added to the inside of the sequence. Since PACAP27 and PACAP38 have equivalent binding properties to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R, respectively, it is considered that the binding property is not affected even if an arbitrary amino acid is added to the C-terminal of PACAP27. ..
  • the aspartic acid residues at positions 3 and 8 are independently tetrazole-substituted aspartic acid (Tz), tetrazole-substituted glutamic acid (egTz), tetrazole-substituted homoglutamic acid (nvTz), and sulfoxy-substituted aspartic acid.
  • the modified sequence of the sequence substituted with a residue selected from the group consisting of (cya) and oxadiazolone-substituted aspartic acid (5Oxa) is preferably one or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. A sequence in which individual amino acids have been deleted or added.
  • one or two amino acids may be deleted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the following C-terminal addition sequence may be added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. ..
  • 1 to 3 amino acids for example, methionine
  • PACAP27 and PACAP38 have equivalent binding properties to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R, respectively, and thus are amino acids toward the C-terminal side in PACAP27.
  • the addition does not affect the binding to PAC1R. Therefore, the peptide of the modified sequence of the present invention can include a C-terminal addition sequence at the C-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as in PACAP27.
  • the C-terminal addition sequence refers to a sequence consisting of any of 1 to 11 amino acids.
  • the C-terminal addition sequence preferably corresponds to the amino acids at positions 28 to 38 of PACAP38.
  • examples of the C-terminal sequence include the following sequences: GKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 43); GKRYKQRVKN (SEQ ID NO: 44); GKRYKQRVK (SEQ ID NO: 45); GKRYKQRV (SEQ ID NO: 46); GKRYKQR (SEQ ID NO: 47); GKRYKQ (SEQ ID NO: 48); GKRYK (SEQ ID NO: 49); GKRY (SEQ ID NO: 50) GKR; GRR; GK; and GR; G.
  • D-form or L-form amino acids can be used, or racemic amino acids may be used as long as the binding property to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R is not lost.
  • the peptide according to the present invention may be composed of an unnatural amino acid such as 2-aminoisobutyric acid, and an N-terminal amino group, a C-terminal carboxy group or an amino acid side chain functional group is optional. Includes derivatives modified to.
  • modifications include addition of protecting groups to amino groups (eg, acylation (formylation, acetylation, propionylation, butyrylization, isobutyrylization, etc.), mesylation, urealation, carbamate, Bocization, Fmoc). ), Esterification of carboxy group (ethylation, etc.) and the like. It also includes modifications that can normally occur in vivo, such as phosphorylation, amidation, methylation, esterification, acetylation, as well as modifications that occur during the synthetic process or facilitate purification, such as biotination. May be good. In addition, modifications such as PEGylation may be performed for the purpose of prolonging the in vivo half-life of the peptide.
  • protecting groups eg, acylation (formylation, acetylation, propionylation, butyrylization, isobutyrylization, etc.), mesylation, urealation, carbamate, Bocization, Fmoc).
  • the free amino group of the N-terminal amino acid can be protected by a protecting group (for example, an acyl group).
  • a protecting group for example, an acyl group
  • the free transamination of the N-terminal amino acid can be acylated (eg, acetylation, propionylation, butyrylization, isobutyrylation) or mesylation.
  • the free carboxyl group of the C-terminal amino acid can be protected by a protecting group (eg, an amide group, an ester group).
  • the free carboxyl group of the C-terminal amino acid can be amidated or esterified.
  • the stability is further improved by acetylating or mesylating the N-terminal.
  • the C-terminus may be any of a carboxy group (-COOH), a carboxylate (-COO-), an amide (-CONH 2 ) or an ester (-COOR).
  • the peptide according to the present invention may be further glycosylated (see, for example, WO2017 / 027848).
  • the invention relates to peptides having the sequences shown in Table 1 below, or modified sequences thereof:
  • Tz is tetrazole-substituted aspartic acid
  • egTz is tetrazole-substituted glutamic acid
  • nvTZ is tetrazole-substituted homoglutamic acid
  • cya is sulfoxy-substituted aspartic acid
  • (5Oxa) is oxadiazolone-substituted aspartic acid
  • Ai is ⁇ .
  • Aminoisobutyric acid, or Cn refers to ⁇ -cyanoalanine.
  • Tz (D) indicates that the tetrazole-substituted aspartic acid is D-form.
  • the peptide according to the present invention can be produced by any production method.
  • it can be produced by performing solid-phase synthesis or liquid-phase synthesis using the Boc method, Fmoc method, or the like.
  • the nucleic acid encoding the peptide of the present invention can be produced by introducing it into a host cell by a gene transfer method and synthesizing it by the host cell.
  • a tag peptide such as a polyhistidine tag
  • the peptide according to the present invention contains a pharmaceutically acceptable salt.
  • Pharmaceutically acceptable salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochlorides, hydrobromates, sulfates, phosphates, etc.) and salts with organic acids (eg, methanesulfonates, benzenesulfones).
  • Acid salt p-toluene sulfonate, formate, acetate, trifluoroacetate, oxalate, citrate, malonate, fumarate, maleate, tartrate, succinate, malic acid Salts and the like
  • salts with bases eg, ammonium salts, methylpyridinium salts, acetylpyridinium salts, etc.
  • the peptide according to the present invention also includes a hydrate or a solvate.
  • the Fmoc-N-protected amino acids in which the side chain carboxyl group of the amino acid (aspartic acid) is replaced with tetrazole, which is an isostar of the carboxyl group are represented by the method shown in Reaction Formula 1 using Fmoc-N-protected asparagine as an initiator. Alternatively, it can be produced by a method similar to this. ⁇ In the formula, Trt has a trityl group In addition, the H or Trt group is substituted with N1 or N2 on tetrazole ⁇ .
  • step A compound (II) is produced by reacting the compound represented by (I) (for example, asparagine whose amino group is protected by Fmoc) with EDCI in the presence of a base.
  • the base is used in an amount of 1-50 equivalents, preferably 10-25 equivalents, relative to compound (I).
  • the base used include pyridine, 4-dimethylaminopyridine, triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, N-methylmorpholine and the like, and pyridine is preferable.
  • EDCI is used in an amount of 1 to 10, preferably 1 to 2 equivalents.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, toluene, dichloromethane, tetrahydrofuran, acetonitrile, and the like, preferably acetonitrile. ..
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 to 60 ° C., preferably 0 to 30 ° C., and the reaction time is 0.5 to 12 hours, preferably 1 to 5 hours.
  • step B compound (III) is produced by reacting compound (II) with trimethylsilyl azide and dibutyl tin oxide in toluene.
  • Trimethylsilyl azide is used in an amount of 1-5 equivalents, preferably 2-4 equivalents, relative to compound (II).
  • Dibutyl tin oxide is used in an amount of 0.3 to 1 equivalent, preferably 0.7 to 0.95 equivalent, relative to compound (II).
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include benzene, toluene, xylene and the like, and toluene is preferable.
  • the reaction time is usually 0.5 to 24 hours, preferably 0.5 to 2 hours.
  • the reaction time is usually 80 to 150 ° C., preferably 80 to 100 ° C.
  • Examples of the heating method include an oil bath and microwaves, and preferably microwaves.
  • step C compound (IV) can be produced by reacting trityl chloride in the presence of a base.
  • the base used in the step C include pyridine, 4-dimethylaminopyridine, triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, N-methylmorpholine and the like, and preferably N-methylmorpholine.
  • the amount of base used is 1 to 3 equivalents, preferably 1 to 1.5 equivalents, relative to compound (IX).
  • Trityl chloride is used in 1 to 3 equivalents, preferably 1.05 to 1.1 equivalents.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, toluene, dichloromethane, tetrahydrofuran, acetonitrile, and the like, preferably tetrahydrofuran. ..
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 to 60 ° C., preferably 0 to 30 ° C.
  • the reaction time is 0.5 to 12 hours, preferably 1 to 2 hours.
  • Fmoc-nvTZ (Trt) -OH in which tetrazole is bonded from the ⁇ -position of the amino acid via an alkyl having 3 carbon atoms can be produced by the method shown in Reaction Scheme 2 or a method similar thereto.
  • step D of the method of reaction formula 2 the compound (VI) is produced by reacting the compound represented by the general formula compound (V) with Boc 2 O in the presence of a base.
  • the base is used in an amount of 1 to 10 equivalents, preferably 1 to 2 equivalents, relative to compound (V).
  • Examples of the base used include triethylamine, N, N-diisopropylamine, N-methylmorpholine, sodium hydroxide, potassium carbonate, sodium hydrogencarbonate and the like, and sodium hydroxide is preferable.
  • Boc 2 O is used in an amount of 1 to 10 equivalents, preferably 1 to 2 equivalents, relative to compound (V).
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include THF, DMF, 1,4-dioxane, and 1,4-dioxane is preferably used.
  • the reaction temperature is usually 0 to 25 ° C, preferably 10 to 25 ° C.
  • the reaction time is 1 to 24 hours, preferably 18 to 24 hours.
  • N-methylpiperazine may be added to treat excess Boc 2 O as long as it does not affect the reaction.
  • step E compound (VII) is produced by reacting compound (VI) with nickel sulfate hexahydrate, sodium peroxodisulfate and sodium hydroxide.
  • sodium peroxodisulfate is used in an amount of 1 to 4 equivalents, preferably 1 to 2 equivalents, relative to compound (VI).
  • Nickel sulfate hexahydrate is 0.01 to 0.1 equivalent, preferably 0.08 to 0.1 equivalent, relative to compound (VI).
  • the base used is sodium hydroxide, and is used in an amount of 1 to 10 equivalents, preferably 6 to 8 equivalents, relative to compound (VI). Water is used as the solvent.
  • the reaction temperature is 10 to 40 ° C, preferably 10 to 25 ° C.
  • the reaction time is usually 1 to 24 hours, preferably 12 to 24 hours.
  • step F after reacting compound (VII) with TFA, the pH is adjusted to be basic and the compound (VIII) is produced by reacting with Fmoc-OSu.
  • the acid used in the step F include hydrochloric acid, sulfuric acid, trifluoroacetic acid and the like, and trifluoroacetic acid is preferably used.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include THF, dichloromethane, 1,4-dioxane and the like, and dichloromethane is preferably used.
  • the reaction temperature is 0 to 25 ° C, preferably 10 to 25 ° C.
  • the reaction time is usually 0.5 to 5 hours, preferably 0.5 to 2 hours.
  • Examples of the inorganic base used for adjusting the pH after the reaction and as a base include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydrogencarbonate, sodium carbonate, potassium carbonate and the like, and potassium carbonate is preferably used.
  • Fmoc-OSu is used in an amount of 1 to 3 equivalents, preferably 1 to 1.5 equivalents, relative to compound (VII).
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include THF, N, N-dimethylformamide, dichloromethane, 1,4-dioxane and the like, and 1,4-dioxane is preferably used.
  • the reaction temperature is 0 to 25 ° C, preferably 10 to 25 ° C.
  • the reaction time is usually 1 to 36 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • step G compound (IX) is produced by reacting compound (VIII) with trimethylsilyl azide and dibutyl tin oxide in toluene.
  • trimethylsilyl azide is used in an amount of 1-10 equivalents, preferably 2-4 equivalents, relative to compound (II).
  • Dibutyl tin oxide is used in an amount of 0.3 to 1 equivalent, preferably 0.7 to 1.0 equivalent, relative to compound (II).
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include benzene, toluene, xylene and the like, and toluene is preferable.
  • the reaction time is usually 0.5 to 48 hours, preferably 0.5 to 2 hours.
  • the reaction time is usually 80 to 150 ° C., preferably 80 to 100 ° C.
  • Examples of the heating method include an oil bath and microwaves, and preferably microwaves.
  • step H compound (X) can be produced by reacting compound (IX) with trityl chloride in the presence of a base.
  • the base include pyridine, 4-dimethylaminopyridine, triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, N-methylmorpholine and the like, and preferably N-methylmorpholine.
  • the amount of base used is 1 to 3 equivalents, preferably 1 to 1.5 equivalents, relative to compound (IX). It is used in an amount of 1 to 3 equivalents, preferably 1.05 to 1.1 equivalents, relative to the trityl chloride compound (IX).
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, toluene, dichloromethane, tetrahydrofuran, acetonitrile, and the like, preferably tetrahydrofuran. ..
  • the reaction temperature is usually ⁇ 10 to 60 ° C., preferably 20 to 30 ° C., and the reaction time is 0.5 to 12 hours, preferably 1 to 2 hours.
  • Fmoc- (5Oxa) -OH in which the carboxy group of aspartic acid is replaced with 1,2,4-oxadiazole-5-one can be produced by the method shown in Reaction Scheme 3 or a method similar thereto. it can.
  • step I the compound represented by the general formula compound (XI) is reacted with 2-bromo-2-methylpropane in the presence of benzyltriethylammonium chloride and a base to form the compound (XII).
  • the base is used in an amount of 10-30 equivalents, preferably 10-25 equivalents, relative to compound (XI).
  • the base used may be potassium carbonate.
  • Benzyltriethylammonium chloride is used in an amount of 1 to 3 equivalents, preferably 1 to 1.2 equivalents, relative to compound (XI).
  • 2-Bromo-2-methylpropane is used in an amount of 10-50 equivalents, preferably 10-40 equivalents, relative to compound (XI).
  • N, N-dimethylacetamide is used as the solvent.
  • the reaction temperature is usually 1 to 24 hours, preferably 18 to 24 hours.
  • the reaction time is usually 25-70 ° C, preferably 25-55 ° C.
  • step J compound (XIII) is produced by reacting compound (XII) with hydroxylamine hydrochloride in the presence of a base.
  • the base used in step J include triethylamine, N, N-diisopropylethylamine and the like, and triethylamine is preferably used.
  • the base used in addition to compound (XII) is 1 to 3 equivalents, preferably 1 to 2 equivalents.
  • Hydroxylammonium hydrochloride is used in an amount of 1-2 equivalents, preferably 1-1.5 equivalents, relative to compound (XII).
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include methanol, ethanol, propanol and isopropanol, and preferably ethanol.
  • the reaction temperature is usually 80 to 100 ° C, preferably 80 to 95 ° C.
  • the reaction time is usually 1 to 6 hours, preferably 1 to 4 hours.
  • step K compound (XIII) is produced by reacting compound (XIII) with carbonyldiimidazole.
  • carbodiimidazole is used in an amount of 1-2 equivalents, preferably 1-1.2 equivalents, relative to compound (XIII).
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include THF, 1,4-dioxane and the like, preferably THF.
  • the reaction temperature is 40 to 60 ° C, preferably 40 to 55 ° C.
  • the reaction time is usually 1 to 6 hours, preferably 1 to 3 hours.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include toluene, xylene, benzene and the like, preferably toluene.
  • the reaction temperature is usually 100 to 130 ° C, preferably 100 to 120 ° C.
  • step L (XV) can be produced by reacting compound (XIV) with TFA in the presence of a scavenger, adjusting the pH to be basic, and reacting with Fmoc-OSu.
  • a scavenger examples include hydrochloric acid, sulfuric acid, trifluoroacetic acid and the like, and trifluoroacetic acid is preferably used.
  • the scavenger to be used include triethylsilane and triisopropylsilane, and preferably triethylsilane.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include THF, dichloromethane, 1,4-dioxane and the like, and dichloromethane is preferably used.
  • the reaction temperature is 0 to 25 ° C, preferably 10 to 25 ° C.
  • the reaction time is usually 0.5 to 5 hours, preferably 0.5 to 3 hours.
  • Examples of the inorganic base used for adjusting the pH after the reaction and the base include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydrogencarbonate, sodium carbonate, and potassium carbonate, and sodium hydrogencarbonate is preferable.
  • Fmoc-OSu is used in an amount of 1 to 3 equivalents, preferably 1 to 1.5 equivalents, relative to compound (VII).
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include THF, N, N-dimethylformamide, dichloromethane, 1,4-dioxane, and the reaction temperature using 1,4-dioxane is preferably 0 to 25. ° C., preferably 10-25 ° C.
  • the reaction time is usually 1 to 36 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the peptide according to the present invention can exhibit the same physiological activity as PACAP by binding to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R. That is, the peptide according to the present invention can exert a physiological action as a neuroprotective substance, a nerve regeneration factor, a wound healing promoting factor, an inflammation suppressing factor, and an exocrine gland secretion promoting factor, for example. Therefore, in another aspect of the invention, a neuroprotective agent, a nerve regenerating agent, a wound healing agent, an anti-inflammatory agent, a corneal epithelial or corneal endothelium disorder therapeutic agent, a dry eye therapeutic agent or an exocrine line containing the peptide according to the present invention. It may also be a secretory promoter or a neurotrophic keratitis therapeutic agent. In yet another aspect, it also relates to a pharmaceutical composition comprising the peptide according to the invention.
  • the neuroprotective agent according to the present invention refers to a drug having a neuroprotective effect.
  • neuroprotective agents can protect nerves from disorders associated with neuronal damage, degeneration and / or cell death, and are neuronal cell death (apoptosis and / or necrosis) inhibitors, neuronal degeneration inhibitors, nerves. It can also be called a cell stress reducing agent, a nerve cell toxicity resistance improving agent, a nerve cell viability improving agent, and an abnormal protein accumulation inhibitor.
  • the neuroprotective action refers to an action of protecting nerve cells from damage, degeneration, and / or cell death, and preferably an action of protecting nerve cells from cell death. More specifically, neuroprotective effects include suppression of nerve cell death (apoptosis and / or necrosis), suppression of nerve cell degeneration, reduction of nerve cell stress, improvement of resistance to nerve cell toxicity, and survival of nerve cells. It may include improvement of sex, suppression of abnormal protein accumulation, and the like. Nerve cells are damaged by physical damage, exposure to neurotoxic substances, lack of oxygen and nutrients, and cell death occurs when the damage exceeds a certain level. In addition, nerve cells undergo degeneration by accumulating neurotoxic substances, eventually causing cell death.
  • Neurotoxic substances are roughly classified into extrinsic toxic substances and endogenous toxic substances.
  • Exogenous toxic substances include heavy metals and chemicals such as alcohol and botulinum toxin.
  • Reactive oxygen species, neurotransmitters such as glutamic acid, and abnormal proteins are known as endogenous toxic substances.
  • the neuroprotective effect can be easily measured by those skilled in the art. As an example, under conditions of various stresses such as low oxygen load, exposure to neurotoxic substances, nutrient depletion, ultraviolet irradiation, etc., in a medium containing the test substance (drug group) or a medium not containing the test substance (control group).
  • Nerve cells are cultured, the number of viable cells and the number of dead cells in the medium are measured, the ratio of the number of viable cells to the total number of cells is calculated, and the ratio of the number of viable cells in the drug group is the ratio of the number of viable cells in the control group. If it is higher, it can be determined that the test substance has a neuroprotective effect. In a more preferred embodiment, whether or not the substance has a protective effect equal to or higher than that of the positive control group as compared with the positive control group to which a substance known to have a neuroprotective effect, such as IGF-1 or NGF, is added. It can be measured by As another example, the neuroprotective effect may be measured by conducting an in vivo animal experiment.
  • the peptide of the present invention has an exocrine gland secretion promoting action possessed by PACAP. Since the exocrine glands include lacrimal glands and salivary glands, they can be used as exocrine gland secretion promoters, for example, lacrimal gland secretagogues and salivary glands.
  • PACAP, and the peptides of the invention bind to receptors (PAC1R, VPAC1R, VPAC2R) expressed in the acinar cells of the exocrine glands to cause saliva and tears. Promotes fluid secretion.
  • the tear fluid covers the surface of the corneal conjunctiva to maintain its moistness, and the tear fluid fills the depressions caused by the microvilli on the surface of the cornea to smooth the surface, so that a clear image can be obtained.
  • the epithelial cells of the keratoconjunctiva actively metabolize, and unnecessary cells and metabolites are shed and excreted from the outermost surface, but tears wash them away while supplying necessary oxygen and nutrients. doing.
  • tears wash away foreign substances mixed in the surface of the keratoconjunctiva, and play a role of protecting against infections by bacteriostatic action of tears against viruses, bacteria, fungi, etc. that have entered from the outside world.
  • tear fluid is a trace amount of liquid that forms a slight thin film on the surface of the corneal conjunctiva, but it is indispensable for maintaining the transparency and homeostasis of the cornea by various elaborate mechanisms.
  • the condition in which an abnormality occurs on the surface of the keratoconjunctiva due to impaired tear secretion is generally called dry eye, but when keratoconjunctival damage due to dry eye occurs, creating a compound that promotes tear secretion is dry eye and dry eye. It is a useful preventive and therapeutic drug for diseases associated with eye.
  • the peptide according to the present invention can be added to eye drops such as eye drops as a tear secretion promoter.
  • the peptide of the present invention has an anti-inflammatory effect of PACAP, it can be used as an anti-inflammatory agent.
  • PACAP and the peptides of the invention can suppress the production of inflammatory cytokines (TNF- ⁇ , IL-6, IL-12, etc.). Therefore, the peptide according to the present invention can be used as an anti-inflammatory agent.
  • VPAC1R and VPAC2R which are receptors for PACAP, are widely distributed in the gastrointestinal tract and exhibit an anti-inflammatory effect, and thus can be used particularly for the treatment of inflammatory bowel disease and the like.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the above peptide.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment or prevention of diseases improved by the physiological action of PACAP.
  • Diseases that are improved by the physiological action of PACAP include neuropathy, diseases related to tear reduction, inflammatory diseases, neurotrophic keratitis and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a patient to treat a disease improved by the physiological action of PACAP, or is administered to a patient who may suffer from such a disease. By doing so, the disease can be prevented.
  • treatment means preventing the deterioration of those conditions when a disorder or disease develops, and maintaining, alleviating or eliminating those conditions
  • prevention means the onset of a disorder or disease. It means to prevent the disease before its onset.
  • Neuropathy refers to a condition in which the function is impaired due to degeneration and cell death of nerve cells, and includes cerebrovascular disorders and neurodegenerative diseases.
  • cerebrovascular disorders include hemorrhagic disorders such as cerebral hemorrhage and subarachnoid hemorrhage, and disorders due to obstruction of cerebrovascular such as cerebral thrombosis, cerebral infarction, and cerebral circulatory insufficiency.
  • hemorrhagic disorders such as cerebral hemorrhage and subarachnoid hemorrhage
  • disorders due to obstruction of cerebrovascular such as cerebral thrombosis, cerebral infarction, and cerebral circulatory insufficiency.
  • cerebral thrombosis cerebral infarction
  • cerebral circulatory insufficiency cerebral thrombosis
  • cerebral infarction cerebral circulatory insufficiency
  • Neurodegenerative diseases include, but are not limited to, dementia, Parkinson's disease, spinocerebellar degeneration, Wienfeld-Jakob's disease, Alzheimer's disease, Huntington butoh disease, multiple sclerosis, mad cow disease, epilepsy and other brain / centers.
  • Examples include neurodegenerative diseases, motor neurodegenerative diseases such as spinocerebellar progressive muscle atrophy, amyotrophic lateral sclerosis, bulbar spinocerebellar muscle atrophy, and sensory neurodegenerative diseases.
  • Sensory neurodegenerative diseases include, but are not limited to, visual, auditory, tactile, taste and olfactory neurodegenerative diseases, and visual degenerative diseases include glaucoma, retinitis pigmentosa, age-related luteal degeneration, and diabetes. Examples include glaucoma, and examples of auditory neurodegenerative diseases include hearing loss.
  • Tear loss Diseases related to tear loss include, but are not limited to, dry eye, keratoconjunctivitis sicca, and tear loss.
  • Neurotrophic keratitis is a degenerative corneal disease caused by damage to the trigeminal nerve and causes damage to the corneal epithelium. The most severe form may result in corneal ulceration, melting and perforation, impairing the patient's visibility.
  • the vascular endothelial function improving agent refers to a drug that improves the function of the vascular endothelial.
  • Endothelial cells are cells in the innermost layer of blood vessels, including contraction / relaxation of blood vessel walls (hardness / softness of blood vessels), adhesion of inflammatory cells to blood vessel walls, vascular permeability, coagulation / lines. Adjust the melting system. Since the peptide of the present invention has a vasodilatory action, which is a physiological action of PACAP, it has an action of improving vascular endothelial disorders such as arteriosclerosis.
  • Corneal epithelium or endothelial damage is a disease in which corneal epithelial cells and corneal endothelial cells are damaged. Corneal epithelial cells are proliferative cells, but in corneal epithelial cell damage, when the proliferative capacity is suppressed or epithelial shedding is enhanced, the balance of epithelial homeostasis is lost. Corneal endothelial cells do not proliferate in vivo and decrease with age.
  • corneal epithelium or corneal endothelial disorder is endogenous such as corneal ulcer, corneal epithelial detachment, diabetic corneal disease, keratoconjunctivitis sicca, chronic superficial keratitis, punctate superficial keratopathy, corneal ulcer, and persistent corneal epithelial defect. It means that the corneal epithelium or endothelium is damaged by a disease, drug-induced, trauma, an extrinsic disease such as wearing a contact lens, or a physical or chemical disorder.
  • Dry eye is a chronic disease of tear fluid and keratoconjunctival epithelium caused by various factors, and is a disease accompanied by eye discomfort and visual dysfunction.
  • Tear fluid abnormalities include quantitative abnormalities in which the amount of tear fluid decreases and qualitative abnormalities in which the properties of tear fluid and the ability to retain tear fluid change.
  • Examples of dry eye include lacrimal hypotension, hyperevaporative dry eye, Sjogren's syndrome, Stevens-Johnson syndrome, corneal epithelial inflammation, palpebral inflammation, tinea keratoconjunctivitis, vernal keratoconjunctivitis, and allergic conjunctivitis.
  • Examples include dry eye associated with vitamin A deficiency.
  • Inflammatory diseases include, but are not limited to, asthma, atopic dermatomyositis, urticaria, pollinosis, anaphylactic shock, sinusitis (including eosinophilic sinusitis), rheumatism, multiple sclerosis, Arthritis, systemic erythematosus, psoriasis, tonic spondylitis, inflammatory bowel disease (eg, ulcerative colitis, Crohn's disease, gluten-sensitive bowel disease, etc.), Schegren's syndrome, chronic transplant piece-to-host disease (GVHD), corneal infection Diseases, allergic conjunctivitis, corneal trauma, polymyositis, dermatomyositis, severe myasthenia, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), strong skin disease and the like.
  • asthma atopic dermatomyositis, urticaria, pollinosis, anaphylactic shock, sinusitis (including eosinophilic sinusit
  • the peptide according to the present invention or a neuroprotective agent, a nerve regenerating agent, an anti-inflammatory agent, a wound healing promoter or an exocrine secretion promoter, or a pharmaceutical composition containing the peptide is orally administered depending on the disease to be treated. Or it can be administered orally. Oral administration includes sublingual, oral, and oral administration.
  • Parenteral administration includes, for example, intravenous, intraarterial, subcutaneous, local, intraperitoneal, intramuscular, nasal, transdermal, transmucosal, intrameningeal, transrectal, intramuscular, intracerebral, intrameningeal, It can be administered by subdural, intradural, epidural, instillation, ear instillation, nasal instillation, and intraocular routes. More specifically, the intraocular route includes subconjunctival, subconjunctival, and intravitreal routes.
  • the pharmaceutical composition containing the peptide according to the present invention can be appropriately formulated according to the route of administration thereof, and can be any, for example, eye drops, injections, powders, infusion preparations, granules, tablets, suppositories and the like. However, from the viewpoint of parenteral administration, eye drops, injections, infusion preparations, powders for preparation at the time of use and the like are preferable.
  • Formulations for intraocular administration include, for example, intravitreal injections, subconjunctival injections, and subconjunctival injections.
  • these preparations may contain various pharmaceutically acceptable auxiliary agents, that is, additives such as carriers and other auxiliary agents, for example, stabilizers, preservatives, soothing agents, emulsifiers and the like. It can also be used in combination with another drug having a neuroprotective effect, an anti-inflammatory effect or an exocrine gland secretory effect.
  • auxiliary agents such as carriers and other auxiliary agents, for example, stabilizers, preservatives, soothing agents, emulsifiers and the like. It can also be used in combination with another drug having a neuroprotective effect, an anti-inflammatory effect or an exocrine gland secretory effect.
  • Example 1A Synthesis of Fmoc- (D) -Tz (Trt) -OH (Compound IV) Fmoc-D-Tz (Trt) -OH (Compound IV) was synthesized according to the following reaction formula.
  • Step A Synthesis of Fmoc-D-Ala ( ⁇ -CN) -OH:
  • Step B Synthesis of Fmoc-D-Tz-OH: In the above structural formula, it means that H is bound to either N1 or N2 on tetrazole.
  • the obtained filtrate was washed with toluene and hexane, dissolved in ethanol / dichloromethane (3 / 2.25 mL), cooled to 4 ° C., 1 M hydrochloric acid (5 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours and 15 minutes. ..
  • the reaction solution was washed with 1M hydrochloric acid and saturated brine, the solvent was removed by distillation under reduced pressure, hexane was added to suspend the solution, and the mixture was filtered to obtain a pale yellow solid of the target compound (1.03 g, 90%).
  • Step C Synthesis of Fmoc-D-Tz (Trt) -OH: In the above structural formula, it means that the Trt group is bonded to N1 or N2 on the tetrazole.
  • Example 1B Synthesis of Fmoc-nvTz (Trt) -OH (Compound X) Synthesis of Fmoc-nvTz (Trt) -OH (Compound X) According to the following reaction formula, Fmoc-nvTz (Trt) -OH (Compound X) was synthesized.
  • Step D Synthesis of Boc-N ⁇ -trifluoroacetyl-L-lysine:
  • N ⁇ -trifluoroacetyl-L-lysine (10.0 g, 41 mmol) in a 1,4-dioxane (70 mL) solution with 1 M aqueous sodium hydroxide solution (42 mL, 42 mmol) and Boc 2 O (30% THF solution, 49. 8 g, 68 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 day.
  • N-Methylpiperazin (3.5 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours, then 1 M hydrochloric acid was added to the reaction solution to adjust the pH to 2, extracted with ethyl acetate, and washed with saturated brine.
  • Step E Synthesis of (S) -2-[(tert-butoxycarbonyl) amino] -5-cyanopentanoic acid
  • reaction solution was adjusted to pH 2 with 1M hydrochloric acid, extracted with ethyl acetate, the obtained organic layer was washed with saturated brine, dried over sodium sulfate, and the solvent was removed by distillation under reduced pressure.
  • Step G Synthesis of (S) -2-( ⁇ [(9H-fluorene-9-yl) methoxy] carbonyl ⁇ amino) -5-cyanopentanoic acid:
  • Step H Synthesis of Fmoc-nvTZ-OH In the above structural formula, it means that H is bound to either N1 or N2 on tetrazole.
  • Step I Synthesis of Fmoc-nvTZ (Trt) -OH
  • Trt Fmoc-nvTZ
  • N-Methylmorpholine (110 ⁇ L, 1.0 mmol) and trityl chloride (261 mg, 0.94 mmol) were added to a solution of Fmoc-nvTZ-OH (365 mg, 0.89 mmol) in THF (4.0 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. did. After completion of the reaction, the mixture was filtered, and the solvent of the obtained filtrate was removed by distillation under reduced pressure to give the title compound (540 mg, 93%) as a white solid.
  • Example 1C (S) -2-( ⁇ [(9H-fluoren-9-yl) methoxy] carbonyl ⁇ amino) -3- (5-oxo-4,5-dihydro-1,2,4-oxadi Synthesis of azole-3-yl) propanoic acid (Compound XV) According to the following reaction formula, (S) -2-( ⁇ [(9H-fluoren-9-yl) methoxy] carbonyl ⁇ amino) -3- (5-) Oxo-4,5-dihydro-1,2,4-oxadiazole-3-yl) propanoic acid (Compound XV) was synthesized.
  • Step I Synthesis of tert-butyl (S) -2-[(tert-butoxycarbonyl) amino] -3-cyanopropanoate
  • Step J Synthesis of tert-butyl (S) -2-[(tert-butoxycarbonyl) amino] -4- (hydroxyamino) -4-iminobutanoate
  • Step K tert-butyl (S) -2-[(tert-butoxycarbonyl) amino] -3- (5-oxo-4,5-dihydro-1,2,4-oxadiazole-3-yl) propanoate Synthesis of
  • Step L (S) -2-( ⁇ [(9H-fluorene-9-yl) methoxy] carbonyl ⁇ amino) -3- (5-oxo-4,5-dihydro-1,2,4-oxadiazole) -3-yl) Synthesis of propanoic acid
  • tert-Butyl (S) -2-[(tert-butoxycarbonyl) amino] -3- (5-oxo-4,5-dihydro-1,2,4-oxadiazole-3-yl) propanoate (658.
  • Example 2 Peptide synthesis A peptide used in the test was synthesized by a solid-phase synthesis method by the Fmoc method using a peptide synthesizer (model: PSSM-8 manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the unnatural amino acids Fmoc-Tz-OH, Fmoc-Tz (trt) -OH, and Fmoc-egTz (trt) -OH used in solid-phase synthesis were purchased from Compound, and Fmoc-cya-OH was purchased from Anaspec.
  • the compounds (IV), (X) and (XV) purchased and synthesized in Example 1 were used.
  • F-moc-Ai-OH and Fmoc-Cn-OH were purchased from Watanabe Chemical Industry, and peptides 1 to 28 having the following sequences were synthesized.
  • the molecular weight of the synthetic peptide was subjected to mass spectrometry (MALDI TOF). As shown in Table 2 below, all the measured values were in good agreement with the theoretical values. Modification of the N-terminal and C-terminal was performed by a method well known to those skilled in the art.
  • Tz is tetrazole-substituted aspartic acid
  • egTz is tetrazole-substituted glutamic acid
  • nvTZ is tetrazole-substituted homoglutamic acid
  • cya is sulfoxy-substituted aspartic acid
  • (5Oxa) is oxadiazolone-substituted aspartic acid
  • Ai is ⁇ .
  • Aminoisobutyric acid, or Cn refers to ⁇ -cyanoalanine.
  • Tz (D) indicates that the tetrazole-substituted aspartic acid is D-form.
  • Tz introduced for peptides 1-9 is racemic. Amino acids used for other peptides are L-form unless otherwise noted.
  • Example 3 Stability test 1 [Preparation of measurement sample 1]
  • the peptides (peptides 1 to 9) synthesized in Example 2 were weighed and dissolved in 0.1% phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a 1.0 mM peptide solution. Further, a 1.0 mM peptide solution was diluted to 100 ⁇ M with phosphate buffer. The mixture was filtered through a chromatographic disk (Millex-GV manufactured by Merckmillipore, 0.22 ⁇ m), and the filtrate was dispensed into an LC vial (Waters Deactivated Qsert Vial). The prepared peptide solution was incubated in a constant temperature bath at 40 ° C. for 1 or 2 months to obtain a sample after storage. In addition, among the peptide solutions prepared at the same time, a sample not to be stored was used as a standard sample (initial sample). Standard samples and post-storing samples were stored at ⁇ 30 ° C. until sample analysis.
  • the peak area value of the peptide was obtained, and the residual rate (residual rate before water correction) was calculated by the formula (2). Further, the residual rate after moisture correction was calculated by taking into consideration the transmittance of the container with respect to the residual rate before moisture correction according to the equation (3).
  • Table 4 shows the water-corrected residual rate of the peptide in the sample after storage. All peptides showed high aqueous stability at 40 ° C. at 4 and 8 weeks compared to PACAP27.
  • Table 6 shows the water-corrected residual rate of the peptide in the sample after storage. Peptides with different conformations of tetrazole and different lengths between tetrazole and the main chain of the peptide also showed higher stability than PACAP27.
  • Table 8 shows the water-corrected residual rate of the peptide in the sample after storage. It showed higher stability than PACAP27 in peptides with different acyl groups substituted at the N-terminus.
  • Table 10 shows the water-corrected residual rate of the peptide in the sample after storage.
  • Peptides substituted with oxadiazolone-substituted aspartic acid instead of tetrazole-substituted aspartic acid at positions 3 and 8 showed higher stability than PACAP27.
  • a sample not to be stored was used as a standard sample (initial sample).
  • the standard sample was stored at -30 ° C until sample analysis, and the sample was stored at -30 ° C after storage.
  • Table 13 shows the water-corrected residual rate of the peptide in the sample after storage.
  • Example 4 Stability test 2 N-terminal acylated peptides are prepared for peptides selected from the group consisting of peptides 1 to 16. For peptides selected from the group consisting of peptides 17 to 30, peptides without modification of N-terminal acylation are prepared. The N-terminal modified peptide and the N-terminal unmodified peptide are each dissolved in Tris buffer (pH 7.0) to prepare a 1.0 mM peptide solution. This solution was filtered through a chromatographic disc (Millex-GV, 0.22 ⁇ m manufactured by Merckmillipore).
  • Tris buffer pH 7.0
  • the filtrate was diluted to 100 ⁇ M with Tris buffer (pH 7.0) and dispensed into a tube (Protein Lobind Tube manufactured by eppendorf).
  • the prepared peptide solution is incubated in a constant temperature bath at 60 ° C. for 1 or 2 weeks to obtain a sample after storage.
  • a sample not to be stored was used as a standard sample (initial sample). Store standard and post-storing samples at -30 ° C until sample analysis.
  • the stored sample is analyzed under appropriate HPLC analysis conditions, and the moisture-corrected residual rate of the peptide in the stored sample is calculated in the same manner as in Example 3. It can be confirmed that the stability is improved in the peptide having N-terminal modification, particularly N-terminal acylation and further acetylation.
  • Reference example Stability test 3
  • the prepared peptides of Reference Examples 1 to 6 were weighed and dissolved in Tris buffer (pH 7.0) to prepare a 1.0 mM peptide solution. This solution was filtered through a chromatographic disc (Millex-GV, 0.22 ⁇ m manufactured by Merckmillipore). The filtrate was diluted to 100 ⁇ M with Tris buffer (pH 7.0) and dispensed into a tube (Protein Lobind Tube manufactured by eppendorf). The prepared peptide solution was incubated in a constant temperature bath at 60 ° C. for 1 or 2 weeks to obtain a sample after storage. In addition, among the peptide solutions prepared at the same time, a sample not to be stored was used as a standard sample (initial sample). Standard samples and post-storing samples were stored at ⁇ 30 ° C. until sample analysis.
  • Table 15 shows the water-corrected residual rate of the peptide in the sample after storage.
  • Reference Example 1 (PACAP) is extremely unstable with 26.6% after storage at 60 ° C. for 1 week and 15.8% after storage for 2 weeks, and Reference Example 2 in which the N-terminal of PACAP is acetylated. was only as stable.
  • Reference Examples 3 and 4 in which the carboxyl group of aspartic acid at the 3- and 8-positions was replaced with tetrazole (in Reference Example 3, methionine at the 17-position was further replaced with norleucine, and in Reference Example 4, the 17-position was substituted.
  • Example 5 cAMP assay for PACAP27 and its modified peptides
  • Cell culture Frozen CHO-K1 cells treated with mitomycin (PAC1 or VPAC1 receptor high-expressing cell line: purchased from DiscoverRx) with a Cell plating reagent (DiscoveRx) so as to have 1.35 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ l / well. After preparation, seeds were seeded on 96-well culture plates. The cells were cultured in a 5% CO 2 incubator for 18-24 hours at 37 ° C. to adhere the cells to the plate.
  • mitomycin PAC1 or VPAC1 receptor high-expressing cell line: purchased from DiscoverRx
  • DiscoveRx Cell plating reagent
  • the cAMP assay was performed using the Hit Hunter cAMP assay for Biologics kit (DiscoveRx, Cat. No. 90-0075LM25) according to the instructions included with the kit.
  • a peptide-cAMP antibody mixture was prepared by mixing the cAMP antibody solution and diluted peptide 1 to 30 solutions at each concentration. Subsequently, the medium was removed from the culture plate of CHO-K1 cells, washed with PBS, the peptide-cAMP antibody mixture was added to the cells, and the cells were incubated in a 5% CO 2 atmosphere at 37 ° C. for 30 minutes. Next, a working detection solution was added, and the culture plate was shaded with aluminum foil and then incubated at 25 ° C. for 1 hour.
  • the peptides (peptides 1 to 30) according to the present invention have extremely improved stability in an aqueous solution as compared with PACAP, and maintain the same physiological activity as PACAP.
  • having a shelf life of more than 2 years at room temperature makes it possible to develop products such as liquid preparations such as vials, ampoules, and eye drops.
  • Preparation Example A drug containing the peptide of the present invention as an active ingredient can be produced, for example, by the following formulation.
  • the agent of the present invention will be described in more detail with reference to formulation examples, but the present invention is not limited to these formulation examples.

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Abstract

安定性を高めたＰＡＣＡＰペプチドの提供を目的とする。ＰＡＣＡＰの配列中の３位及び８位のアスパラギン酸を、テトラゾール置換アスパラギン酸（Ｔｚ）、テトラゾール置換グルタミン酸（ｅｇＴｚ）、テトラゾール置換ホモグルタミン酸（ｎｖＴｚ）、スルホキシ置換アスパラギン酸（ｃｙａ）、及びオキサジアゾロン置換アスパラギン酸（５Ｏｘａ）からなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸に置換することにより、安定性が有意に亢進することを見いだしたことに基づき、本発明に至った。

Description

ＰＡＣＡＰの安定化ペプチド
　ＰＡＣＡＰの生理活性を有する安定化ペプチド、当該ペプチドを含む神経保護剤、血管内皮機能改善剤、角膜神経突起形成促進剤、涙液分泌促進剤、ドライアイ治療剤、角膜上皮又は角膜内皮障害治療剤、神経栄養性角膜炎治療剤、抗炎症剤、又は医薬組成物に関する。
　神経細胞は、中枢神経系と末梢神経系に大別される神経系を構成する細胞である。神経細胞は、脳卒中、脳梗塞などの脳血管障害などの外的要因や、異常タンパク質の蓄積、酸化ストレス、炎症などの内的要因などにより障害を受けやすい一方で、その再生能が低いことから、ひとたび障害が生じると、その患者のＱＯＬを著しく低下させる要因となる。中枢神経系の神経変性および脱落を伴う神経変性疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症などの神経変性疾患の他に、緑内障、視神経症などの視神経の変性疾患や、神経性難聴などの感覚神経変性疾患が挙げられる。
　神経科学の発展により、各種の神経保護因子が発見されてきており、神経障害の予防又は治療薬としての開発が期待される。神経変性を引き起こすフリーラジカルや興奮性アミノ酸を減少させる薬剤や、神経細胞を保護及び/又は修復することができる薬剤（例えば神経栄養因子や免疫抑制剤などのイムノフィリンリガンドなど）が神経保護作用を有することが見いだされている。一方で、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ＣＤ４４やヒト脳カルボキシペプチダーゼＢ（ＨＢＣＰＢ）などの生体内タンパク質が、神経保護作用を有することが見いだされてきている（特許文献１及び２）。
　下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、ヒツジ視床下部抽出物から発見された神経ペプチドである。ＰＡＣＡＰは、下垂体前葉細胞においてｃＡＭＰ形成を刺激する活性を有しうる。ＰＡＣＡＰとしては、３８個のアミノ酸残基からなるＰＡＣＡＰ３８と、２７個のアミノ酸残基からなるＰＡＣＡＰ２７が存在しており、両者とも同等の作用を有する（非特許文献１及び２）。ＰＡＣＡＰは、血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）／セクレチン／グルカゴンスーパーファミリーに属しており、ヒトＰＡＣＡＰ２７の配列は、血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）と６８％の同一性を有する。ＰＡＣＡＰとＶＩＰは、ＰＡＣ１受容体（ＰＡＣ１Ｒ）、ＶＰＡＣ１受容体（ＶＰＡＣ１Ｒ）及びＶＰＡＣ２受容体（ＶＰＡＣ２Ｒ）に結合するが、これらの受容体に対する親和性の点で異なっている。ＰＡＣ１Ｒは、ＰＡＣＡＰに対して高い選択性を持って結合する。ＰＡＣ１ＲのＰＡＣＡＰに対する親和性は、ＰＡＣ１ＲのＶＩＰに対する親和性と比較して１０００倍以上高い。一方で、ＶＰＡＣ１Ｒ及びＶＰＡＣ２Ｒは共に、ＰＡＣＡＰとＶＩＰに対して同程度の親和性を有する。ＰＡＣＡＰは、多様な生理作用を有しており、神経保護物質、免疫抑制因子、血管拡張因子、外分泌線分泌促進因子（特許文献３）、神経突起形成促進因子（特許文献４）としての生理作用を有することが知られている。
　ＰＡＣＡＰの有する多様な生理活性を利用して、医薬品の開発が行われてきている。しかしながら、ＰＡＣＡＰのようなペプチドは、水溶液中において不安定であることが多く、またプロテアーゼ耐性を欠如することに起因して半減期が短いといった問題が知られている。
特表２０１４－５１０１０１号公報 特開２０１２－２３２９５２号公報 特開２００９－２６９８１８号公報 ＷＯ２００５／１０２３７５号パンフレット
S. Bourgault (2009) Current Medicinal Chemistry 16, 4462-4480 Louise Dickson (2009) Pharmacology & Therapeutics, 12, 294－316
　本発明は、水溶液中で安定性の高いＰＡＣＡＰの安定化ペプチド、当該ペプチドを含む神経保護剤、神経突起形成促進剤、涙腺分泌促進剤、ドライアイ治療又は予防用医薬組成物、角膜上皮又は角膜内皮障害治療又は予防用医薬組成物、神経障害治療又は予防用医薬組成物、又は神経栄養性角膜炎治療又は予防用組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らが、ＰＡＣＡＰの水溶液中での安定性を高めるために鋭意研究を行った結果、ＰＡＣＡＰペプチド中に存在する、３位及び８位のアスパラギン酸を、それぞれ独立に、テトラゾール置換アスパラギン酸（Ｔｚ）、テトラゾール置換グルタミン酸（ｅｇＴｚ）、テトラゾール置換ホモグルタミン酸（ｎｖＴｚ）、スルホキシ置換アスパラギン酸（ｃｙａ）、及びオキサジアゾロン置換アスパラギン酸（５Ｏｘａ）からなる群から選ばれる残基に置換することで、水溶液中での安定性を大幅に高めることができることを見いだし、本発明に至った。
　そこで、本発明は以下のものに関する：
［１]　H-X1-D-G-X2-F-X3-D-X4-Y-X5-R-Y-R-K-X6-X7-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L（配列番号３）
　　｛式中、
　Ｘ1は、中性アミノ酸であり、
　Ｘ2は、中性アミノ酸であり、
　Ｘ3は、中性アミノ酸であり、
　Ｘ4は、アラニン、セリン、Ａｉ又はＣｎであり、
　Ｘ5は、アラニン、セリン、Ａｉ又はＣｎであり、
　Ｘ6は、グルタミン又はアラニンであり
　Ｘ7は、非極性アミノ酸である｝
　で表される配列の３位及び８位において、アスパラギン酸がそれぞれ独立に、テトラゾール置換アスパラギン酸（Ｔｚ）、テトラゾール置換グルタミン酸（ｅｇＴｚ）、テトラゾール置換ホモグルタミン酸（ｎｖＴｚ）、スルホキシ置換アスパラギン酸（ｃｙａ）、及びオキサジアゾロン置換アスパラギン酸（５Ｏｘａ）からなる群から選ばれる残基に置換される配列、又はその改変配列からなるペプチドであって、前記ペプチドがＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒへの結合性を有し、前記改変配列が、配列番号３の配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失又は付加された配列である、前記ペプチド。
［２］　Ｘ1が、セリン又はアラニンである、項目１に記載のペプチド。
［３］　Ｘ2が、イソロイシン又はアラニンである、項目１又は２に記載のペプチド。
［４］　Ｘ3が、アラニン又はスレオニンである、項目１～３のいずれか一項に記載のペプチド。
［５］　Ｘ7は、メチオニン、ロイシン、ノルロイシン、又はアラニンである、項目１～４のいずれか一項に記載のペプチド。
［６］　３位及び８位のアミノ酸が、それぞれテトラゾール置換アスパラギン酸（Ｔｚ）、テトラゾール置換グルタミン酸（ｅｇＴｚ）、又はテトラゾール置換ホモグルタミン酸（ｎｖＴｚ）である場合、これらのアミノ酸がＬ体、Ｄ体又はラセミ体である、項目１～５のいずれか一項に記載のペプチド。
［７］　前記ペプチドにおいて、Ｎ末端が保護基により修飾されている、項目１～６のいずれか一項に記載のペプチド。
［８］　前記保護基が、アシル基である、項目７に記載のペプチド。
［９］　前記ペプチドにおいて、Ｃ末端が保護基により修飾されている、項目１～８のいずれか一項に記載のペプチド。
［１０］　前記保護基が、アミド基、又はエステル基である、項目９に記載のペプチド。
［１１］　前記改変配列が、Ｃ末端において前記配列から１～３個のアミノ酸が欠失された配列である、項目１～１０のいずれか一項に記載のペプチド。
［１２］　前記改変配列が、Ｎ末端において前記配列から１～３個のアミノ酸が付加された配列である、項目１～１０のいずれか一項に記載のペプチド。
［１３］　前記改変配列が、以下の：
　　GKRYKQRVKNK（配列番号４３）；
　　GKRYKQRVKN（配列番号４４）；
　　GKRYKQRVK（配列番号４５）；
　　GKRYKQRV（配列番号４６）；
　　GKRYKQR（配列番号４７）；
　　GKRYKQ（配列番号４８）；
　　GKRYK（配列番号４９）；
　　GKRY（配列番号５０）
　　GKR；
　　GRR；
　　GK；及び
　　GR
　　G；
　からなる群から選択される１の配列を前記配列のＣ末端に付加された配列である、項目１～１０又は１２のいずれか一項に記載のペプチド。
［１４］　項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、神経保護剤。
［１５］　項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、涙液分泌促進剤。
［１６］　項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、抗炎症剤。
［１７］　項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、血管内皮機能改善剤。
［１８］　項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、角膜上皮又は角膜内皮障害治療剤。
［１９］　項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、ドライアイ治療剤。
［２０］　項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
［２１］　神経保護を必要とする対象における神経保護方法であって、項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドの有効量を当該対象に投与することを含む、前記方法。
［２２］　涙液分泌を必要とする対象における涙液分泌促進方法であって、項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを当該対象に投与することを含む、前記方法。
［２３］　血管内皮機能の改善を必要とする対象における血管内皮機能改善方法であって、項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを投与することを含む、前記方法。
［２４］　炎症を患う対象において炎症を抑制する方法であって、項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを投与することを含む、前記方法。
［２５］　角膜上皮又は角膜内皮障害を患う対象において、角膜上皮又は角膜内皮障害を改善するための方法であって、項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを投与することを含む、前記方法。
［２６］　ドライアイを患う対象において、ドライアイを治療又は予防する方法であって、項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを投与することを含む、前記方法。
［２７］　医薬として使用するための項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチド。
［２８］　神経障害の治療において使用するための項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチド。
［２９］　神経保護を介した神経障害の治療又は予防において使用するための項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチド。
［３０］　ドライアイおよびドライアイを伴う疾病の治療又は予防において使用するための項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチド。
［３１］　　角膜上皮又は角膜内皮障害の治療又は予防において使用するための、項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチド。
［３２］　炎症性疾患の治療又は予防において使用するための、項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチド
［３３］　血管内皮障害治療又は予防において使用するための、項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチド。
［３４］神経保護剤、涙液分泌促進剤、抗炎症剤、血管内皮機能改善剤、角膜上皮又は角膜内皮障害治療剤、ドライアイ治療剤からなる群から選ばれる医薬の製造のための、項目１～１３のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
　本発明により、水溶液中で不安定であったＰＡＣＡＰを、大幅に安定化することができる。
　本発明は、ＰＡＣＡＰの３位及び８位のアスパラギン酸残基が、それぞれ独立に、テトラゾール置換アスパラギン酸（Ｔｚ）、テトラゾール置換グルタミン酸（ｅｇＴｚ）、テトラゾール置換ホモグルタミン酸（ｎｖＴｚ）、スルホキシ置換アスパラギン酸（ｃｙａ）、及びオキサジアゾロン置換アスパラギン酸（５Ｏｘａ）からなる群から選ばれる残基に置換された配列、又は配列の一部が改変された配列とからなるペプチドに関し、かかるペプチドは、ＰＡＣＡＰと比較して、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの同程度の結合性を有する。同程度の結合性とは、ペプチドのそれぞれの受容体へのＥＣ５０値がＰＡＣＡＰと比較して１００倍以内であればよい。ＰＡＣＡＰは、３８の残基からなるＰＡＣＡＰ３８、又は２７残基からなるＰＡＣＡＰ２７のいずれであってもよい。ＰＡＣＡＰ３８及びＰＡＣＡＰ２７は、下記の配列を有する：
PACAP38：HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）
PACAP27：HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
　本発明において、テトラゾール置換アスパラギン酸（Ｔｚ）、テトラゾール置換グルタミン酸（ｅｇＴｚ）、及びテトラゾール置換ホモグルタミン酸（ｎｖＴｚ）とは、それぞれアスパラギン酸、グルタミン酸、及びホモグルタミン酸の側鎖のカルボキシ基を、カルボキシ基のアイソスターであるテトラゾールへと置換された構造を有する非天然アミノ酸残基を意味する。具体的に、下記の式により表される：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明において、スルホキシ置換アスパラギン酸（ｃｙａ）、及びオキサジアゾロン置換アスパラギン酸（５Ｏｘａ）は、それぞれアスパラギン酸の側鎖のカルボキシ基を、カルボキシ基のアイソスターであるスルホキシ基又は１，２，４－オキサジアゾール―５－オン（オキサジアゾロン）に置換された構造を有する残基を意味する。具体的に、下記の式により表される：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　３位及び８位のアスパラギン酸が置換される非天然アミノ酸残基は、ＰＡＣＡＰと同程度の生理活性を有する限りにおいて、Ｌ体、Ｄ体、又はラセミ体であってもよい。特に、Ｌ体のテトラゾール置換アスパラギン酸に置換されたペプチドと、Ｄ体のテトラゾール置換アスパラギン酸に置換されたペプチドとは、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒに対して同程度の結合性を有する。理論に限定されることを意図するものではないが、Ｄ体のアミノ酸が含まれることで、酵素により分解されにくくなり、安定性が高まりうる。タンパク質構成アミノ酸以外の非天然アミノ酸についても、タンパク質構成アミノ酸と同様に、Ｆｍｏｃ法などの方法により、保護基を導入して、ペプチド中へと導入することができる。
　本発明において、配列の一部が改変された配列とは、元の配列に対して１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加された配列のことをいう。より好ましくは、配列の一部が改変された配列とは、元の配列に対して１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列のことをいう。
　アミノ酸の置換は、配列の一部が改変された配列からなるペプチドのＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を変更しない限りにおいて、任意の場所で生じうる。配列の一部が改変された配列からなるペプチドにおいて、結合性を維持する観点から、ＰＡＣＡＰ２７の、２位、５位、７位、９位、１１位、１６位、及び１７位の位置において、アミノ酸置換が生じうる。特に好ましい態様では、下記の配列：
H-X1-D-G-X2-F-X3-D-X4-Y-X5-R-Y-R-K-X6-X7-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L　（配列番号３）
　において、X1～X7で示される位置のアミノ酸が置換されうる。
　したがって、本発明の１の態様は、下記の式：
　H-X1-D-G-X2-F-X3-D-X4-Y-X5-R-Y-R-K-X6-X7-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L　（配列番号３）
　　｛式中、
　X1～X6は中性アミノ酸であり、
　X7は非極性アミノ酸である｝
で表される配列において、３位及び８位のアスパラギン酸が、それぞれ独立に、テトラゾール置換アスパラギン酸（Ｔｚ）、テトラゾール置換グルタミン酸（ｅｇＴｚ）、テトラゾール置換ホモグルタミン酸（ｎｖＴｚ）、スルホキシ置換アスパラギン酸（ｃｙａ）、及びオキサジアゾロン置換アスパラギン酸（５Ｏｘａ）からなる群から選ばれる残基に置換された配列、又はその改変配列からなるペプチドであって、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有するペプチドに関する。
　同じ属性を有するアミノ酸によって、保存的に置換されうる。一例として、保存的置換は、下記のグループの内のアミノ酸の置換をいう：
（i)非極性アミノ酸：Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、Ala
（ii)中性アミノ酸：Ala、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、Gly
（iii)塩基性アミノ酸：Lys、Arg、His
（iv)酸性アミノ酸：Asp、Glu
　中性アミノ酸のうち、アラニンの代わりに、アラニンのα位にメチル基が置換したαアミノイソ酪酸（Ａｉ）、又はアラニンのβ位の水素がシアノ基に置換されたβシアノアラニン（Ｃｎ）を使用することができる。特に、９位及び１１位中性アミノ酸として、αアミノイソ酪酸（Ａｉ）及びβシアノアラニン（Ｃｎ）を使用しうる。αアミノイソ酪酸（Ａｉ）及びβシアノアラニン（Ｃｎ）は、以下の構造を有する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本発明の配列番号３で表される配列において、X1～X7で表されるアミノ酸は、好ましくは以下のとおりである：
　X1における中性アミノ酸は、特にアラニン又はセリンである。
　X2における中性アミノ酸は、特にイソロイシン又はアラニンである。
　X3における中性アミノ酸は、特にアラニン又はスレオニンである。
　X4及びX5における中性アミノ酸は、特にアラニン、セリン、αアミノイソ酪酸、又はβシアノアラニンである。
　X6における中性アミノ酸は、特にグルタミン又はアラニンである。
　X7における非極性アミノ酸は、特にメチオニン、ロイシン、ノルロイシン、又はアラニンである。
　本発明において、改変配列とは、元の配列に対して１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加された配列のことをいう。より好ましくは、配列の一部が改変された配列とは、元の配列に対して１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列のことをいう。
　アミノ酸置換は、１又は複数個のアミノ酸が置換されていてもよいが、活性を維持する観点から、１～１０の任意の数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が置換されうる。なかでも、１～４個のアミノ酸の置換が特に好ましく、より好ましくは３個のアミノ酸が置換され、さらにより好ましくは２個のアミノ酸が置換され、特に好ましくは１のアミノ酸が置換される。
　アミノ酸の欠失は、配列の一部が改変された配列からなるペプチドのＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を変更しない限りにおいて、任意の場所で生じうる。欠失されるアミノ酸の数は、１～１０の任意の数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０から選ばれる。結合性を変化させない観点から、１又は２個のアミノ酸の欠失、さらには１個のアミノ酸欠失が特に好ましい。アミノ酸の欠失は、元の配列のＮ末端側又はＣ末端側から欠失されてもよいし、配列の内部から欠失されてもよい。ＰＡＣＡＰ２７とＰＡＣＡＰ３８は、それぞれ同等のＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有していることから、ＰＡＣＡＰ３８のＣ末端側に存在するアミノ酸は欠失されても結合性に影響が少ないと考えられる。
　アミノ酸の付加は、配列の一部が改変された配列からなるペプチドのＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を変更しない限りにおいて、任意の場所で生じうる。付加されるアミノ酸の数は、１～１０の任意の数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０から選ばれる。アミノ酸は、元の配列のＮ末端側又はＣ末端側に付加されてもよいし、配列の内部に付加されてもよい。ＰＡＣＡＰ２７とＰＡＣＡＰ３８は、それぞれ同等のＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有していることから、ＰＡＣＡＰ２７のＣ末端に任意のアミノ酸を付加されても結合性に影響が少ないと考えられる。
　配列番号３の配列において、３位及び８位のアスパラギン酸残基が、それぞれ独立に、テトラゾール置換アスパラギン酸（Ｔｚ）、テトラゾール置換グルタミン酸（ｅｇＴｚ）、テトラゾール置換ホモグルタミン酸（ｎｖＴｚ）、スルホキシ置換アスパラギン酸（ｃｙａ）、及びオキサジアゾロン置換アスパラギン酸（５Ｏｘａ）からなる群から選ばれる残基に置換された配列の改変配列としては、好ましくは配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失又は付加された配列である。より好ましくは、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して１又は２個のアミノ酸が欠失されうるし、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して下記のＣ末端付加配列が付加されうる。また、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して、Ｎ末端に１～３個のアミノ酸（例えばメチオニン）が付加されうる。
　理論によって限定されることを意図するものではないが、ＰＡＣＡＰ２７とＰＡＣＡＰ３８は、それぞれ同等のＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有していることから、ＰＡＣＡＰ２７においてＣ末端側へのアミノ酸付加は、ＰＡＣ１Ｒへの結合性に影響しない。したがって、本発明の改変配列のペプチドとしては、ＰＡＣＡＰ２７と同様に配列番号３のアミノ酸配列のＣ末端に、Ｃ末端付加配列を含むことができる。Ｃ末端付加配列は、１～１１の任意のアミノ酸からなる配列をいう。Ｃ末端付加配列は、ＰＡＣＡＰ３８の２８位～３８位のアミノ酸に対応することが好ましい。したがって、Ｃ末端配列としては下記の配列が挙げられる：
　　GKRYKQRVKNK（配列番号４３）；
　　GKRYKQRVKN（配列番号４４）；
　　GKRYKQRVK（配列番号４５）；
　　GKRYKQRV（配列番号４６）；
　　GKRYKQR（配列番号４７）；
　　GKRYKQ（配列番号４８）；
　　GKRYK（配列番号４９）；
　　GKRY（配列番号５０）
　　GKR；
　　GRR；
　　GK；及び
　　GR；
　　G。
　本発明に係るペプチドは、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒに対する結合性が失われない限りにおいて、Ｄ体またはＬ体のアミノ酸を用いることができ、あるいはラセミ体のアミノ酸を用いてもよい。また、同様に、本発明に係るペプチドは、２－アミノイソ酪酸のような非天然アミノ酸で構成されていてもよく、Ｎ末端のアミノ基、Ｃ末端のカルボキシ基又はアミノ酸側鎖の官能基が任意に修飾された誘導体が含まれる。修飾の例としては、アミノ基への保護基の付加（例えば、アシル化（ホルミル化、アセチル化、プロピオニル化、ブチリル化、イソブチリル化等）、メシル化、ウレア化、カルバメート化、Ｂｏｃ化、Ｆｍｏｃ化）、カルボキシ基のエステル化（エチル化など）などが挙げられる。また、通常生体内で生じうる修飾、例えばリン酸化、アミド化、メチル化、エステル化、アセチル化などの他、合成過程で生じるか、又は精製を容易にする修飾、例えばビオチン化が含まれてもよい。また、ペプチドの生体内半減期を延長する目的で、ＰＥＧ化などの修飾が行われてもよい。特に、安定性を高める観点から、Ｎ末端のアミノ酸の遊離アミノ基が保護基（例えばアシル基）により保護されうる。例えば、Ｎ末端のアミノ酸の遊離アミノ基は、アシル化（例えばアセチル化、プロピオニル化、ブチリル化、イソブチリル化）又はメシル化されうる。同様に、Ｃ末端のアミノ酸の遊離カルボキシル基が保護基（例えばアミド基、エステル基）により保護されうる。例えば、Ｃ末端のアミノ酸の遊離カルボキシル基はアミド化又はエステル化されうる。本発明に係るペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化またはメシル化されることにより、安定性が更に向上する。Ｃ末端はカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（－ＣＯＯ－）、アミド（－ＣＯＮＨ2）またはエステル（－ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。本発明に係るペプチドはさらに糖鎖付加されていてもよい（例えばＷＯ２０１７／０２７８４８を参照）。
　本発明の具体的な態様では、本発明は下記表１に示される配列を有するペプチド、又はそれらの改変配列に関する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表中、Ｔｚは、テトラゾール置換アスパラギン酸、ｅｇＴｚは、テトラゾール置換グルタミン酸、ｎｖＴｚは、テトラゾール置換ホモグルタミン酸、ｃｙａは、スルホキシ置換アスパラギン酸、（５Ｏｘａ）は、オキサジアゾロン置換アスパラギン酸、Ａｉは、αアミノイソ酪酸、又はＣｎは、βシアノアラニンを指す。Ｔｚ（Ｄ）は、テトラゾール置換アスパラギン酸がＤ体であることを示す。
　本発明に係るペプチドは、任意の製造方法により製造することができる。例えば、Ｂｏｃ法又はＦｍｏｃ法等を用いて固相合成又は液相合成を行うことにより製造することができる。また、別法では、本発明のペプチドをコードする核酸を遺伝子導入法により、宿主細胞に導入し、宿主細胞により合成させることにより製造することができる。この場合ペプチドの末端にポリヒスチジンタグ等のタグペプチドを付加するように設計することで、発現後に精製を容易にすることができる。
　本発明に係るペプチドは、医薬上許容される塩が含まれる。医薬上許容される塩としては、無機酸との塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機酸との塩（例えば、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩等）、又は塩基との塩（例えば、アンモニウム塩、メチルピリジニウム塩、アセチルピリジニウム塩等）が挙げられる。本発明に係るペプチドは、水和物、又は溶媒和物も含まれる。
　アミノ酸（アスパラギン酸）の側鎖カルボキシル基を、カルボキシル基のアイソスターであるテトラゾールへと置換されたＦｍｏｃ－Ｎ保護アミノ酸は、それぞれＦｍｏｃ－Ｎ保護アスパラギンを開始物質として、反応式１に示される方法又はこれに準じた方法により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ｛式中、
　Ｔｒｔはトリチル基をし、
　また、テトラゾール上のＮ１またはＮ２にＨ又はＴｒｔ基が置換される｝
　反応式１の方法では、工程Ａにおいて、（Ｉ）で表される化合物（例えば、Ｆｍｏｃでアミノ基が保護されたアスパラギン）を塩基存在下でＥＤＣＩを反応させることにより、化合物（ＩＩ）を生成する。工程Ａにおいて、塩基は化合物（Ｉ）に対して、１～５０当量、好ましくは１０～２５当量使用される。用いる塩基は、ピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン等が挙げられ、好ましくはピリジンを挙げることができる。ＥＤＣＩは１～１０当量、好ましくは１～２当量使用される。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、トルエン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくはアセトニトリルを挙げることができる。反応温度は通常－１０～６０℃、好ましくは０～３０℃であり、反応時間は０．５～１２時間、好ましくは、１～５時間である。
　工程Ｂにおいて、化合物（ＩＩ）をトルエン中、トリメチルシリルアジド、ジブチルすずオキシドを反応させることにより、化合物（ＩＩＩ）を生成する。トリメチルシリルアジドは化合物（ＩＩ）に対して、１～５当量、好ましくは２～４当量使用される。ジブチルすずオキシドは化合物（ＩＩ）に対して、０．３～１当量、好ましくは０．７～０．９５当量使用される。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられ、好ましくはトルエンを挙げることができる。反応時間は通常０．５～２４時間であり、好ましくは０．５～２時間である。反応時間は通常８０～１５０℃、好ましくは８０～１００℃である。加熱方法は、オイルバス、マイクロウェーブ等が挙げられ、好ましくはマイクロウェーブが挙げられる。
　次いで、工程Ｃにおいて、塩基存在下でトリチルクロリドを反応させることにより化合物（ＩＶ）を製造することができる。工程Ｃに用いられる塩基はピリジン、4－ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン等が挙げられ、好ましくはＮ－メチルモルホリンを挙げることができる。用いる塩基の量は化合物（ＩＸ）に対して１～３当量、好ましくは、１～１．５当量使用される。トリチルクロリドは１～３当量、好ましくは１．０５～１．１当量使用される。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、トルエン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくはテトラヒドロフランを挙げることができる。反応温度は通常－１０～６０℃、好ましくは０～３０℃である。反応時間は０．５～１２時間、好ましくは、１～２時間である。
　アミノ酸のα位から炭素数３のアルキルを介してテトラゾールが結合したＦｍｏｃ－ｎｖＴｚ（Ｔｒｔ）－ＯＨは反応式２に示される方法又はこれに準じた方法により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　反応式２の方法の工程Ｄでは、一般式化合物（Ｖ）で表される化合物を塩基存在下、Ｂｏｃ2Ｏを反応させることにより、化合物（ＶＩ）を生成する。塩基は化合物（Ｖ）に対して１～１０当量、好ましくは１～２当量使用される。用いる塩基は、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、好ましくは水酸化ナトリウムである。Ｂｏｃ2Ｏは化合物（Ｖ）に対して、１～１０当量、好ましくは１～２当量使用される。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、ＴＨＦ、ＤＭＦ、１，４－ジオキサン等が挙げられ、好ましくは１，４－ジオキサンを用いる。反応温度は通常０～２５℃、好ましくは１０～２５℃である。反応時間は１～２４時間、好ましくは１８～２４時間である。また，反応に影響を及ぼさない限り、過剰量のＢｏｃ２Ｏを処理するために、Ｎ－メチルピペラジンを加えても良い。
　次いで工程Ｅでは、化合物（ＶＩ）を硫酸ニッケル六水和物、ペルオキソ二硫酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを反応させることにより化合物（ＶＩＩ）を生成する。工程Eでは、ペルオキソ二硫酸ナトリウムは化合物（ＶＩ）に対して、１～４当量、好ましくは１～２当量使用される。硫酸ニッケル六水和物は化合物（ＶＩ）に対して、０．０１～０．１当量、好ましくは０．０８～０．１当量である。用いる塩基は水酸化ナトリウムが挙げられ、化合物（ＶＩ）に対して、全体で１～１０当量、好ましくは６～８当量使用される。溶媒は水を用いる。反応温度は１０～４０℃、好ましくは１０～２５℃である。反応時間は通常１～２４時間、好ましくは１２～２４時間である。
　次いで工程Ｆでは、化合物（ＶＩＩ）とＴＦＡを反応させた後、ｐＨを塩基性に調整し、Ｆｍｏｃ－ＯＳｕと反応させることで化合物（ＶＩＩＩ）を生成する。工程Ｆにおいて用いる酸は、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられ、好ましくはトリフルオロ酢酸を用いる。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、ＴＨＦ、ジクロロメタン、１，４－ジオキサン等が挙げられ、好ましくはジクロロメタンを用いる。反応温度は０～２５℃、好ましくは１０～２５℃である。反応時間は通常０．５～５時間、好ましくは０．５～２時間である。反応後のｐＨの調整および塩基として用いる無機塩基は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等が挙げられ、好ましくは炭酸カリウムを用いる。Ｆｍｏｃ－ＯＳｕは化合物（ＶＩＩ）に対して、１～３当量、好ましくは１～１．５当量使用する。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、ＴＨＦ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、１，４－ジオキサン等が挙げられ、好ましくは１，４－ジオキサンを用いる。反応温度は０～２５℃、好ましくは１０～２５℃である。反応時間は通常１～３６時間、好ましくは１～２４時間である。
　次いで工程Ｇでは、化合物（ＶＩＩＩ）をトルエン中、トリメチルシリルアジドおよびジブチルすずオキシドを反応させることにより、化合物（ＩＸ）を生成する。工程Gでは、トリメチルシリルアジドは化合物（ＩＩ）に対して、１～１０当量、好ましくは２～４当量使用される。ジブチルすずオキシドは化合物（ＩＩ）に対して、０．３～１当量、好ましくは０．７～１．０当量使用される。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられ、好ましくはトルエンを挙げることができる。反応時間は通常０．５～４８時間であり、好ましくは０．５～２時間である。反応時間は通常８０～１５０℃、好ましくは８０～１００℃である。加熱方法は、オイルバス、マイクロウェーブ等が挙げられ、好ましくはマイクロウェーブが挙げられる。
　次いで工程Ｈでは、化合物（ＩＸ）を塩基存在下、トリチルクロリドを反応させることにより化合物（Ｘ）を製造することができる。化合物（Ｘ）の製造において、塩基はピリジン、4－ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン等が挙げられ、好ましくはＮ－メチルモルホリンを挙げることができる。用いる塩基の量は化合物（ＩＸ）に対して１～３当量、好ましくは、１～１．５当量使用される。トリチルクロリド化合物（ＩＸ）に対して１～３当量、好ましくは１．０５～１．１当量使用される。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、トルエン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等が挙げられ、好ましくはテトラヒドロフランを挙げることができる。反応温度は通常－１０～６０℃、好ましくは２０～３０℃であり、反応時間は０．５～１２時間、好ましくは、１～２時間である。
　アスパラギン酸のカルボキシ基が、１，２，４－オキサジアゾール―５－オンに置換されたＦｍｏｃ－（５Ｏｘａ）―ＯＨは反応式３に示される方法又はこれに準じた方法により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　反応式３の方法では、工程Ｉにおいて、一般式化合物（ＸＩ）で表される化合物をベンジルトリエチルアンモニウムクロリドおよび塩基存在下、２－ブロモ―２－メチルプロパンを反応させることにより、化合物（ＸＩＩ）を生成する。工程Ｉにおいてにおいて、塩基は化合物（ＸＩ）に対して、１０～３０当量、好ましくは１０～２５当量使用される。用いる塩基は炭酸カリウムを挙げることができる。ベンジルトリエチルアンモニウムクロリドは化合物（ＸＩ）に対して、１～３当量好ましくは１～１．２当量使用される。２－ブロモ―２－メチルプロパンは化合物（ＸＩ）に対して、１０～５０当量、好ましくは１０～４０当量使用される。溶媒はＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミドを用いる。反応温度は通常１～２４時間、好ましくは１８～２４時間である。反応時間は通常２５－７０℃、好ましくは２５～５５℃である。
　次いで工程Ｊにおいて、化合物（ＸＩＩ）を塩基存在下、ヒドロキシルアミン塩酸塩を反応させることにより化合物（ＸＩＩＩ）を生成する。工程Ｊにおいて、用いる塩基はトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ―ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられ、好ましくはトリエチルアミンを用いる。化合物（ＸＩＩ）に足して用いる塩基は、１～３当量、好ましくは１～２当量使用される。ヒドロキシルアミン塩酸塩は、化合物（ＸＩＩ）に対して１～２当量、好ましくは１～１．５当量使用される。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールが挙げられ、好ましくはエタノールを挙げることができる。反応温度は通常８０～１００℃、好ましくは８０～９５℃である。反応時間は通常１～６時間、好ましくは１～４時間である。
　次いで工程Ｋにおいて化合物（ＸＩＩＩ）とカルボニルジイミダゾールを反応させることにより化合物（ＸＩＶ）を生成する。工程Ｋにおいて、カルボジイミダゾールは化合物（ＸＩＩＩ）に対して１～２当量、好ましくは１～１．２当量使用される。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、ＴＨＦ、１，４－ジオキサン等が挙げられ、好ましくはＴＨＦを挙げることができる。反応温度は４０～６０℃、好ましくは４０～５５℃である。反応時間は通常１～６時間、好ましくは１～３時間である。連続する環化反応において、溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、トルエン、キシレン、ベンゼンなどが挙げられ、好ましくはトルエンを挙げることができる。反応温度は通常１００～１３０℃、好まし１００～１２０℃である。
　次いで工程Ｌにおいて、化合物（ＸＩＶ）とスカベンジャー存在下、ＴＦＡを反応させ、ｐＨを塩基性に調整し、Ｆｍｏｃ－ＯＳｕと反応させることで（ＸＶ）を製造することができる。工程Ｌにおいて、用いる酸は、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられ、好ましくはトリフルオロ酢酸を用いる。用いるスカベンジャーはトリエチルシラン、トリイソプロピルシランが挙げられ、好ましくはトリエチルシランを挙げることができる。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、ＴＨＦ、ジクロロメタン、１，４－ジオキサン等が挙げられ、好ましくはジクロロメタンを用いる。反応温度は０～２５℃、好ましくは１０～２５℃である。反応時間は通常０．５～５時間、好ましくは０．５～３時間である。反応後のｐＨの調整および塩基で用いる無機塩基は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムが挙げられ、好ましくは炭酸水素ナトリウムを挙げることができる。Ｆｍｏｃ－ＯＳｕは化合物（ＶＩＩ）に対して、１～３当量、好ましくは１～１．５当量使用する。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、ＴＨＦ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン，１，４－ジオキサン等が挙げられ、好ましくは１，４－ジオキサンを用いる反応温度は０～２５℃、好ましくは１０～２５℃である。反応時間は通常１～３６時間、好ましくは１～２４時間である。
　本発明にかかるペプチドは、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへ結合することで、ＰＡＣＡＰと同様の生理活性を発揮することができる。すなわち本発明にかかるペプチドは、一例として、神経保護物質、神経再生因子、創傷治癒促進因子、炎症抑制因子、外分泌線分泌促進因子としての生理作用を発揮することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明にかかるペプチドを含む、神経保護剤、神経再生剤、創傷治癒剤、炎症抑制剤、角膜上皮又は角膜内皮障害治療剤、ドライアイ治療剤又は外分泌線分泌促進剤、又は神経栄養性角膜炎治療剤に関してもよい。さらに別の態様では、本発明にかかるペプチドを含む医薬組成物にも関する。
　本発明にかかる神経保護剤は、神経保護作用を有する薬剤のことをいう。したがって、神経保護剤は、神経細胞の損傷、変性及び／又は細胞死を伴う障害から神経を保護することができ、神経細胞死（アポトーシス及び/又はネクローシス）抑制剤、神経細胞変性抑制剤、神経細胞ストレス軽減剤、神経細胞毒性抵抗性の改善剤、神経細胞の生存性の改善剤、異常タンパク質蓄積抑制剤ということもできる。
　本明細書において、神経保護作用とは、神経細胞をその損傷、変性、及び／又は細胞死から保護する作用のことをいい、好ましくは神経細胞死から保護する作用をいう。より具体的には、神経保護作用には、神経細胞死（アポトーシス及び/又はネクローシス）の抑制、神経細胞変性の抑制、神経細胞ストレスの軽減、神経細胞毒性の抵抗性の向上、神経細胞の生存性の向上、異常タンパク質蓄積抑制などが含まれてもよい。神経細胞は、物理的な損傷の他、神経毒性物質に対する暴露、酸素や栄養物質の欠乏により損傷を受け、損傷が一定のレベルを超えると細胞死が引き起こされる。また、神経細胞は、神経毒性物質を蓄積することで変性を受け、最終的に細胞死が引き起こされる。神経毒性物質は、外因性の毒性物質と内因性の毒性物質に大別される。外因性の毒性物質として、重金属や、アルコール、ボツリヌス毒素などの化学物質が挙げられる。内因性の毒性物質としては、活性酸素種、グルタミン酸などの神経伝達物質、異常タンパク質などが知られている。神経保護作用は、当業者であれば容易に測定することができる。一例として、各種ストレス、例えば低酸素負荷、神経毒性物質への暴露、栄養枯渇、紫外線照射などの条件下で、被験物質を含む培地（薬物群）又は被験物質を含まない培地（対照群）で神経細胞を培養し、培地中の生存細胞数と死細胞数を測定し、全細胞数に対する生存細胞数の割合を算出し、薬物群の生細胞数の割合が対照群の生細胞数の割合より高い場合に、被験物質が神経保護作用を有すると判断することができる。より好ましい態様では、神経保護作用を有することが知られている物質、例えばＩＧＦ－１やＮＧＦなどを添加した陽性対照群と比較し、陽性対照群と同等又はそれ以上の保護作用を有するか否かにより測定することができる。別の例としてはin vivoの動物実験を行うことで神経保護作用を測定してもよい。
　本発明のペプチドは、ＰＡＣＡＰが有する外分泌腺分泌促進作用を有する。外分泌腺として、涙腺、唾液腺などが挙げられることから、外分泌腺分泌促進剤、例えば涙液分泌促進剤や唾液分泌促進剤として使用することができる。理論に限定されることを意図するものではないが、ＰＡＣＡＰ、及び本発明のペプチドは、外分泌腺の腺房細胞において発現する受容体（ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ２Ｒ）に結合することで、唾液や涙液の分泌を促進する。涙液は角結膜の表面を覆い、その湿潤性を保つとともに、角膜表面の微絨毛による陥凹を涙液が満たして表面を平滑にするので鮮明な像を得ることが可能となる。また、角結膜の上皮細胞は活発に代謝を行ない、その最表面から不要となった細胞や代謝産物が脱落排出されているが、涙液はそれらを洗い流す一方で、必要な酸素や栄養分を供給している。さらに、涙液は角結膜表面に混入した異物を洗い流し、外界から進入したウイルス、細菌、真菌などに対しては涙液の静菌作用によって感染防御の役割を担っている。また、眼瞼と角結膜との間の滑液として瞬目や眼球運動がスムーズに行われるにように働いている。このように涙液は角結膜表面にわずかな薄膜を形成する微量の液体であるが、さまざまの精巧な仕組みにより角膜の透明性や恒常性の維持に欠かすことができないものである。涙液の分泌障害により角結膜表面に異常を生じた状態を一般にドライアイというが、ドライアイによる角結膜障害が起こった場合、涙液分泌を促進する化合物を創製することは、ドライアイおよびドライアイを伴う疾病に対して有用な予防治療薬となる。本発明にかかるペプチドは、涙液分泌促進剤として目薬などの点眼剤に配合することができる。
　本発明のペプチドは、ＰＡＣＡＰが有する炎症抑制作用を有することから、炎症抑制剤として使用することができる。理論に限定されることを意図するものではないが、ＰＡＣＡＰ、及び本発明のペプチドは、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１２等）の産生を抑制することができる。したがって、本発明にかかるペプチドを、抗炎症剤として、使用することができる。特に、ＰＡＣＡＰの受容体であるＶＰＡＣ１ＲとＶＰＡＣ２Ｒは、消化管に広く分布し、さらに抗炎症作用を示すことから、特に炎症性腸疾患などの治療に使用しうる。
　別の局面において、本発明は、上記のペプチドの治療有効量を含む医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、ＰＡＣＡＰの生理作用により改善される疾患の治療又は予防に使用されうる。ＰＡＣＡＰの生理作用により改善される疾患としては、神経障害、涙液減少に関連する疾患、炎症性疾患、神経栄養性角膜炎などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、患者に対して投与することで、ＰＡＣＡＰの生理作用により改善される疾患を治療することができるし、或いはこのような疾患を患う可能性のある患者に対し投与することで、疾患を予防することができる。また、「治療」とは、障害又は疾患が発症した際にそれらの状態の悪化を防止し、それらの状態を現状維持、軽減又は消退させることをいい、「予防」とは障害又は疾患の発症をその発症前に防止することをいう。
　神経障害とは、神経細胞の変性・細胞死に起因して、その機能が損なわれる病態をいい、脳血管障害及び神経変性疾患が含まれる。
　脳血管障害としては、出血性の障害、例えば脳出血、くも膜下出血と、脳血管の閉塞による障害、例えば脳血栓、脳梗塞、脳循環不全症などが挙げられる。出血性障害及び閉塞性障害のいずれの障害であっても、脳内の神経細胞は低酸素状態に置かれ、細胞死を生じる。したがって、こうした脳血管障害に対して、本発明に係るペプチド、神経保護剤又は医薬組成物は、治療又は予防の目的で投与することができる。
　神経変性疾患としては、非限定的に、認知症、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、狂牛病、てんかんなどの脳・中枢神経変性疾患、脊椎性進行性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、球脊椎性筋萎縮症などの運動神経変性疾患、及び知覚神経変性疾患が挙げられる。知覚神経変性疾患としては、非限定的に、視覚、聴覚、触覚、味覚及び嗅覚神経の変性疾患が挙げられ、視覚変性疾患としては、緑内障、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症などが挙げられ、聴覚神経変性疾患としては、難聴などが挙げられる。
　涙液減少に関連する疾患としては、非限定的に、ドライアイ、乾性角結膜炎、涙液減少症、などが挙げられる。
　神経栄養性角膜炎とは、三叉神経の損傷が原因の変性角膜疾患であり、角膜上皮の損傷を引き起こす。最重症型では角膜の潰瘍・融解・穿孔をもたらす場合があり、患者の視認能力が損なわれる。
　血管内皮機能改善剤とは、血管内皮の機能を改善する薬剤をいう。血管内皮細胞は、血管の最内層にある細胞であり、血管壁の収縮・弛緩（血管の硬さ・やわらかさ）をはじめとして、血管壁への炎症細胞の接着、血管透過性、凝固・線溶系の調節などを行う。本発明のペプチドは、PACAPの生理作用である、血管拡張作用を有することから、動脈硬化などの血管内皮障害を改善する作用を有する。
　角膜上皮又は内皮障害とは、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞が障害される疾患である。角膜上皮細胞は、増殖性を有する細胞であるが、角膜上皮細胞障害では、増殖能が抑制されたり、上皮脱落が亢進すると上皮恒常性のバランスが崩れ発症する。角膜内皮細胞は、生体内では増殖せず、加齢に伴い減少する。また、角膜上皮又は角膜内皮障害とは、角膜潰瘍、角膜上皮剥離、糖尿病性角膜症、乾性角結膜炎、慢性表層角膜炎、点状表層角膜症、角膜糜爛、遷延性角膜上皮欠損などの内因性疾患、薬剤性、外傷、コンタクトレンズ装着等による外因性疾患、または物理的もしくは化学的障害によって、角膜上皮又は内皮が損傷を受けることを意味する。
　ドライアイとは、様々な要因による涙液および角結膜上皮の慢性疾患であり、眼不快感や視機能異常を伴う疾患である。涙液の異常としては、涙液量が減少する量的異常と涙液の性質や涙液を保持する能力が変化する質的異常とがある。また、ドライアイとしては、例えば涙液減少症、涙液蒸発亢進型ドライアイ、シェーグレン症候群、スティーブンス－ジョンソン症候群、角膜上皮糜爛、眼瞼縁炎、眼類天疱瘡、春季カタル、アレルギー性結膜炎、ビタミンＡ欠乏症などに伴うドライアイなどが挙げられる。
　炎症性疾患としては、非限定的に、喘息、アトピー性皮膚炎、じんま疹、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、リウマチ、多発性硬化症、関節炎、全身性エリトマトーデス、乾癬、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、グルテン感受性腸疾患等）、シェーグレン症候群、慢性移植片対宿主病（GVHD）、角膜感染症、アレルギー性結膜炎、角膜外傷、多発性筋炎、皮膚筋炎、重症筋無力症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、強皮症などが挙げられる。
　本発明にかかるペプチド、又は当該ペプチドを含む、神経保護剤、神経再生剤、炎症抑制剤、創傷治癒促進剤又は外分泌線分泌促進剤、或いは医薬組成物は、治療対象疾患に応じて非経口投与又は経口投与されうる。経口投与としては、舌下、口腔内、内服投与が挙げられる。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、局所、腹腔内、筋肉内、経鼻、経皮、経粘膜、髄膜内、経直腸、筋肉内、脳内、髄膜内、くも膜下、硬膜内、硬膜外、点眼、点耳、点鼻、眼内の経路で投与することができる。眼内経路としては、さらに具体的に、結膜下、テノン嚢下、硝子体内の経路が挙げられる。本発明にかかるペプチドを含む医薬組成物は、その投与経路に応じて適宜剤形することができ、例えば点眼剤、注射剤、粉末剤、輸液製剤、顆粒剤、錠剤、坐剤等いかなるものでもよいが、非経口投与する観点では、点眼剤、注射剤、輸液製剤、用時調製用の粉末剤等が好ましい。眼内投与用の製剤として、例えば硝子体内注射剤、結膜下注射剤、及びテノン嚢下注射剤が挙げられる。また、これらの製剤は製薬上許容される種々の補助剤、即ち、担体やその他の助剤、例えば、安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等の添加剤を含有していてもよい。また、神経保護効果、炎症抑制効果又は外分泌線分泌効果を有する別の薬剤と組み合わせて使用することもできる。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１Ａ：Ｆｍｏｃ－（Ｄ）－Ｔｚ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（化合物ＩＶ）の合成
　下記の反応式に従って、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｔｚ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（化合物ＩＶ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
工程Ａ：Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ａｌａ（β－ＣＮ）－ＯＨの合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ａｓｎ－ＯＨ（５．０４ｇ、１４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３５ｍＬ）溶液に、ピリジン（３０ｍＬ）および１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（３．９６ｇ、２１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３５ｍＬ）に懸濁した溶液を０℃下で加え、室温で４時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣に酢酸エチルを加え、３Ｍ塩酸および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去で溶媒を除いた。得られた粗生成物をアセトンに溶解し、ヘキサン/ジエチルエーテル（１／１）を加えて析出させ、減圧下で濃縮し，ろ過をし、目的化合物（４．７６ｇ，９９％）を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.20 (1H, brs), 8.08 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.90 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.72 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.42 (2H, t, J = 7.2 Hz), 7.33 (2H, t, J = 7.6 Hz), 4.39-4.32 (3H, m), 4.25 (1H, t, J = 7.2 Hz), 2.98 (1H, dd, J = 16.8, 4.8 Hz), 2.88 (1H, dd, J = 16.8, 9.2 Hz).
工程Ｂ：Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｔｚ－ＯＨの合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 上の構造式で、テトラゾール上のＮ１またはＮ２のどちらかにＨが結合していることを意味する。
　Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ａｌａ（β－ＣＮ）－ＯＨ（１．０１ｇ、３．０ｍｍｏｌ）のトルエン（１８ｍＬ）溶液に、ジブチルすずオキシド（０．７１０ｇ、２．９ｍｍｏｌ）およびトリメチルシリルアジド（１．８ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）を加え、マイクロウェーブで１００℃、１．５時間加熱した。反応溶液を室温に戻し、ろ過をした。得られたろ過物をトルエンおよびヘキサンで洗浄し、エタノール／ジクロロメタン（３／２．２５ｍＬ）に溶解し、４℃に冷却した後、１Ｍ塩酸（５ｍＬ）を加え、室温で２時間１５分攪拌した。反応溶液を１Ｍ塩酸および飽和食塩水で洗浄し、減圧留去で溶媒を除き、ヘキサンを加えて懸濁し、ろ過をし、目的化合物（１．０３ｇ、９０％）の薄黄色固体を得た。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 16.00 (1H, brs), 13.07 (1H, brs), 7.89 (2H, d, H = 7.6 Hz), 7.83 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.65 (2H, t, J = 8.0 Hz), 7.41 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.31 (2H, t, J = 7.6 Hz), 4.53-4.48 (1H,m), 4.27-4.18 (3H, m), 3.40 (1H, dd, J = 15.2, 6.0 Hz), 3.28 (1H, dd, J = 15.2, 8.8 Hz).
工程Ｃ：Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｔｚ（Ｔｒｔ）－ＯＨの合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 上の構造式で、テトラゾール上のＮ１またはＮ２にＴｒｔ基が結合していることを意味する。
　Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｔｚ－ＯＨ（１．９９ｇ、５．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、Ｎ－メチルモルホリン（０．７２ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）およびトリチルクロリド（１．６３ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌した。反応溶液をろ過し、ろ過物をＴＨＦで洗浄し、ろ液と合わせ、減圧留去で溶媒を除いた。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＯＤＳ，Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ＝８０／２０→３０／７０→２０／８０）で精製し，目的化合物が含まれたフラクションを酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去で溶媒を除き、６０℃で真空乾燥を行い、目的化合物（１．２９　ｇ，　４０％）を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.03 (1H, brs), 7.91 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.79 (1H,d, J = 8.8 Hz), 7.67 (2H, brd, J = 6.8 Hz), 7.44-7.23 (13H, m), 7.01-6.99 (6H, m), 4.52-4.46 (1H, m), 4.28-4.15 (3H, m), 3.40 (1H, dd, J = 15.2, 5.2 Hz), 3.27 (1H, dd, J = 15.2, 9.2 Hz).
実施例１Ｂ：Ｆｍｏｃ－ｎｖＴｚ（Ｔｒｔ）－ＯＨの合成（化合物Ｘ）の合成
　下記の反応式に従って、Ｆｍｏｃ－ｎｖＴｚ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（化合物Ｘ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
工程Ｄ：Ｂｏｃ－Ｎε－トリフルオロアセチル－Ｌ－リジンの合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　Ｎε－トリフルオロアセチル-L-リジン（１０．０ｇ、４１ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（７０ｍＬ）溶液に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（４２ｍＬ、４２ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ2Ｏ（３０％ＴＨＦ溶液、４９．８ｇ、６８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１日攪拌した。反応溶液にＮ－メチルピペラジン（３．５ｍＬ）を加え、室温で２時間攪拌した後、反応溶液に１Ｍ塩酸を加えｐＨ２に調整し、酢酸エチルで抽出をし、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去で溶媒を除き、表題化合物（１５．９ｇ、＞１００％）を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.69 (1H, brs), 5.12 (1H, d, J = 6.8 Hz), 4.30 (1H, brs), 3.38 (2H, q, J = 6.8 Hz), 1.94-1.86 (1H, m), 1.74-1.57 (3H, m), 1.52-1.41 (3H, m), 1.45 (9H, s).
工程Ｅ：(S)-2-[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]-5-シアノペンタン酸の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　フラスコにBoc-Ne-トリフルオロアセチル-L-リジン（１．００ｇ、２．９ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（２７６．４ｍｇ、６．９ｍｍｏｌ）および水（１５ｍＬ）加え、さらに硫酸ニッケル（ＩＩ）六水和物（７７．０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の水溶液（１．０ｍＬ）、ペルオキソ二硫酸ナトリウム（１．４３ｇ、６．０ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（５２９．５ｍｇ、１３ｍｍｏｌ）を加え，室温で１９．５時間攪拌した。反応溶液を１Ｍ塩酸でｐＨ２に調整し、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去で溶媒を除いた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１００／０→９５／５）で精製し、表題化合物（６６１．５ｍｇ、８６％）を白色固体として得た。
1H NMR (400 Mz, DMSO-d6) δ 12.53 (1H, brs), 7.14 (1H, d, J = 8.4 Hz), 3.93-3.88 (1H, m), 2.53-2.48 (2H, m), 1.81-1.74 (1H, m), 1.69-1.56 (3H, m), 1.39 (9H, m)
工程Ｇ：（Ｓ）－２－（｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）－５－シアノペンタン酸の合成：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　（Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－５－シアノペンタン酸（５８６．３ｇ、２．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２．５ｍＬ）の溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（２．５ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応溶液の溶媒を減圧留去で除いた。得られた残渣に１，４－ジオキサン（３．０ｍＬ）を加え、ｐＨ９になるまで１０％炭酸カリウム水溶液および固体の炭酸カリウムを加えた後、Ｆｍｏｃ－ＯＳｕ（１．２６ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル／ヘキサン（１／１）溶液で希釈し，０．５Ｍ塩酸および飽和食塩水で洗浄し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去で溶媒を除いた。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０→３１／６９）で精製し、表題化合物（７３１．１ｍｇ、８３％）を白色固体として得た。
1H NMR (4000 MHz, CDCl3) δ 7.76 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.58 (2H, brd, J = 6.8 Hz), 7.40 (2H, t, J = 7.2 Hz), 7.31 (2H, t, J = 6.8 Hz), 5.38 (1H, d, J = 7.6 Hz), 4.64-4.36 (3H, m), 4.20 (1H, J = 6.4 Hz), 2.38 (1H, brt, J = 6.4 Hz), 2.28-2.07 (2H, m), 1.88-1.41 (3H, m)
工程Ｈ：Ｆｍｏｃ－ｎｖＴｚ－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 上の構造式で、テトラゾール上のＮ１またはＮ２のどちらかにＨが結合していることを意味する
　（Ｓ）－２－（｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）－５－シアノペンタン酸（８５１ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、ジブチルすずオキシド（５８１ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）のトルエン（１７ｍＬ）溶液にトリメチルシリルアジド（１．２ｍＬ、９．２ｍｍｏｌ）を加え、マイクロウェーブで１００℃、１．５時間加熱した。反応溶液を室温に戻し、ろ過をし、得られた固体をトルエンおよびヘキサンで洗浄し、薄橙色の固体を得た。その固体にエタノール／ジクロロメタン（３／２．５０ｍＬ）を加え、０℃に冷却後、１Ｍ塩酸（５．０ｍＬ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、１Ｍ塩酸、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去で溶媒を除いた。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１００／０→９５／５）で精製し、表題化合物（３６７ｍｇ、３９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.88 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.72 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.63 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.40 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.31 (2H, t, J = 7.2 Hz), 4.29-4.20 (3H, m), 4.01-3.96 (1H, m), 2.89 (2H, m), 1.78-1.46 (5H, m).
工程Ｉ：Ｆｍｏｃ－ｎｖＴｚ（Ｔｒｔ）－ＯＨの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 上の構造式で、テトラゾール上のＮ１またはＮ２のどちらかにＴｒｔ基が結合していることを意味する
　Ｆｍｏｃ－ｎｖＴｚ－ＯＨ（３６５ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４．０ｍＬ）溶液にＮ－メチルモルホリン（１１０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）およびトリチルクロリド（２６１ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を加え，室温で２時間攪拌した。反応終了後、ろ過をし、得られたろ液の溶媒を減圧留去で除き、表題化合物（５４０ｍｇ、９３％）を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.67 (1H, s), 7.89 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.72 (2H, m), 7.66 (1H, brs), 7.39-7.19 (13H, m), 7.02-6.98 (6H, m), 4.34-4.20 (3H, m), 3.98-3.94 (1H, m), 2.88-2.83 (2H, m), 1.77-1.62 (4H, m)
実施例１Ｃ：（Ｓ）－２－（｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）－３－（５－オキソ－４，５－ジヒドロ－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）プロパン酸（化合物ＸＶ）の合成
　下記の反応式に従って、（Ｓ）－２－（｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）－３－（５－オキソ－４，５－ジヒドロ－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）プロパン酸（化合物ＸＶ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
工程Ｉ：ｔｅｒｔ－ブチル　（Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－シアノプロパノエートの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　Ｂｏｃ－Ａｌａ（ＣＮ）－ＯＨ（２．２３ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（２．３８ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（３７．０ｇ、２６８ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（６０ｍＬ）懸濁液に、２－ブロモ－２－メチルプロパン（４６ｍｌ、４０９ｍｍｏＬ）を加え、５５℃で１日攪拌した。反応溶液を室温に戻し、水を加え、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去で溶媒を除いた。得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／０→１／４）で精製し、表題化合物（２．７９ｇ、９９％）を透明油状物質として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 (1H, brd, J = 4.8 Hz), 4.37 (1H, brq, J = 5.2 Hz), 2.94 (1H, dd, J = 16.8, 5.2 Hz), 2.88 (1H, dd, J = 16.8, 4.8 Hz), 1.51 (9H, s), 1.45 (9H, s).
工程Ｊ：ｔｅｒｔ－ブチル　（Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－４－（ヒドロキシアミノ）－４－イミノブタノエートの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　ｔｅｒｔ－ブチル　（Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－シアノプロパノエート（２．７９ｇ、１０ｍｍｏｌ）のエタノール（３０ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）およびヒドロキシルアミン塩酸塩（１．０８ｇ、１６ｍｍｌ）を加え、９５℃で４時間攪拌した。反応溶液を室温に戻し、水を加え、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去で溶媒を除き、真空乾燥を行い、表題化合物（２．８５ｇ、９１％）を白色のアモルファスとして得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.47 (1H, brs), 5.47 (1H, brs), 4.63 (2H, brs), 4.37 (1H, brs), 2.62-2.54 (2H, m), 1.46 (9H, s), 1.44 (9H, s).
工程Ｋ：ｔｅｒｔ－ブチル　（Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－（５－オキソ－４，５－ジヒドロ－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）プロパノエートの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　ｔｅｒｔ－ブチル　（Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－４－（ヒドロキシアミノ）－４－イミノブタノエート（１．０４ｇ、３．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）の溶液に１，１－カルボニルジイミダゾール（６２７ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌した。反応溶液を濃縮し、トルエン（２０ｍＬ）加え、１００℃で２時間攪拌した。反応溶液を室温に戻し、減圧留去で溶媒を除き、得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、表題化合物（６５８．９ｍｇ、５８％）を白色のアモルファスとして得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.23 (1H, brs), 7.36 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.24 (1H, q, J = 8.0 Hz), 2.90 (1H, dd, J = 15.2, 7.2 Hz), 2.81 (1H, dd, J = 15.2, 8.4 Hz), 1.38 (9H, s), 1.37 (9H, s).
工程Ｌ：（Ｓ）－２－（｛［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）－３－（５－オキソ－４，５－ジヒドロ－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）プロパン酸の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－（５－オキソ－４，５－ジヒドロ－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）プロパノエート（６５８．９ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４．０ｍＬ）の溶液に、トリエチルシラン（１．０ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（５．０ｍＬ）を０℃で加え、その後、室温で３時間攪拌した。減圧留去で溶媒を除き、ジエチルエーテルおよびヘキサンを加え、再度、減圧留去で溶媒を除き、１，４－ジオキサン（１０ｍＬ）を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をｐＨ９になるまで加えた。その後、Ｆｍｏｃ－ＯＳｕ（８１３ｍｇ、２．４ｍｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液に１０％クエン酸水溶液を加え、ｐＨ３に調整し、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去で溶媒を除き、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１００／０→９３／７）で精製し、表題化合物（４６５．３ｍｇ、５９％）を白色のアモルファスとして得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.70-7.63 (3H, m), 7.42 (2H, t, J = 7.2 Hz), 7.32 (2H, t, J = 7.2 Hz), 4.33-4.20 (4H, m), 2.96 (1H, dd, J = 15.2, 5.6 Hz), 2.80 (1H, dd, 15.2, 8.8 Hz),
実施例２：ペプチド合成
　ペプチドシンセサイザー（モデル：PSSM-8　島津製作所製）を用いてＦｍｏｃ法による固相合成法により試験に用いたペプチドを合成した。固相合成で用いる非天然アミノ酸であるＦｍｏｃ－Ｔｚ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｚ（ｔｒｔ）－ＯＨ、およびＦｍｏｃ－ｅｇＴｚ（ｔｒｔ）－ＯＨはＡｓｔａｔｅｃｈ社より購入し、Ｆｍｏｃ－ｃｙａ－ＯＨはＡｎａｓｐｅｃ社より購入し、そして実施例１で合成した化合物（ＩＶ）、（Ｘ）および（ＸＶ）を使用した。また、Ｆ－ｍｏｃ－Ａｉ－ＯＨとＦｍｏｃ－Ｃｎ－ＯＨを渡辺化学工業より購入し、下記の配列を有するペプチド１～２８を合成した。合成ペプチドの分子量は質量分析（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ）を実施した。下記表２に示すように、いずれの測定値も理論値によく一致した。Ｎ末端及びＣ末端の修飾は、当業者に周知の方法により行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　表中、Ｔｚは、テトラゾール置換アスパラギン酸、ｅｇＴｚは、テトラゾール置換グルタミン酸、ｎｖＴｚは、テトラゾール置換ホモグルタミン酸、ｃｙａは、スルホキシ置換アスパラギン酸、（５Ｏｘａ）は、オキサジアゾロン置換アスパラギン酸、Ａｉは、αアミノイソ酪酸、又はＣｎは、βシアノアラニンを指す。Ｔｚ（Ｄ）は、テトラゾール置換アスパラギン酸がＤ体であることを示す。
　ペプチド１～９について導入されるＴｚは、ラセミ体である。その他のペプチドについて使用されるアミノ酸は、特記がない限り、Ｌ体である。
実施例３：安定性試験１
［測定サンプルの調製１］
　実施例２で合成したペプチド（ペプチド１～９）を秤量し，０．１％リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。さらに１．０ｍＭのペプチド溶液をリン酸緩衝液で１００μＭに希釈した。クロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過し、ろ液をＬＣバイアル（Waters Deactivated Qsert Vial）に分注した。調製したペプチド溶液について、４０℃の恒温槽内で１か月または２か月間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで－３０℃で保存した。
［水分透過率］
　ペプチド水溶液と保存容器の合計重量を検体重量とし、保存前の検体重量を秤量し、各条件の保存後にも同様に保存後の検体重量を秤量した。また、保存容器の空重量を秤量し、下記の式に基づいて水分透過率を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000026
　標準サンプル及び保存後サンプルをボルテックスミキサーで撹拌後、ＨＰＬＣバイアル（Waters社製　Deactivated Qsert vial）にペプチド溶液を移した。逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣシステム：島津製作所製 Prominence）を下記表３の条件で作動して、ペプチド溶液の分析を行い、クロマトグラムを得た。
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：Waters社製　XSelect CSH C18，5 μm，4.6×250 mm，
ガードカラム：Waters社製　XSelect CSH C18，5 μm，4.6×20 mm Guard Cartridge
検出波長：２２０ｎｍ
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液，
移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
測定時間：３０分間
測定サンプル注入量：５０ μL
流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度４０℃
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表３のように変えて直線濃度勾配制御した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　クロマトグラムにおいて、ペプチドのピーク面積値を求め、式（２）により残存率（水分補正前残存率）を算出した。また、水分補正前残存率に対し、式（３）にしたがって、容器の透過率を考慮に入れることで水分補正後残存率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000029
　保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
すべてのペプチドがＰＡＣＡＰ２７と比較して，４０℃４週および８週において高い水溶液安定性を示した。
［測定サンプルの調製２］
　実施例２で合成したペプチド（ペプチド１３～１６）について［測定サンプルの調製１］と同じ手法で調製したペプチド溶液について４０℃の恒温槽内で２週間および８週間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで－３０℃で保存した。
［ＨＰＬＣ分析条件］
　測定時間と移動相の送液条件のみを下記の通り変更し、その他は［測定サンプルの調製１］の欄の条件と同じ条件で測定を行った：
測定時間：２０分間
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表５のように変えて直線濃度勾配制御した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
テトラゾールの立体の違いおよびテトラゾールとペプチド主鎖間の長さの違うペプチドにおいても、ＰＡＣＡＰ２７よりも高い安定性を示した。
［測定サンプルの調製３］
　実施例２で合成したペプチド（ペプチド１７～２１）について［測定サンプルの調製１］と同じ手法で調製したペプチド溶液について、４０℃の恒温槽内で４週間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで－３０℃で保存した。
［ＨＰＬＣ分析条件］
　測定時間と移動相の送液条件のみを下記の通り変更し、その他は［測定サンプルの調製１］の欄の条件と同じ条件で測定を行った：
測定時間：２０分間
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表７のように変えて直線濃度勾配制御した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
 Ｎ末端に異なるアシル基を置換したペプチドにおいて，ＰＡＣＡＰ２７よりも高い安定性を示した。
［測定サンプルの調製４］
　実施例２で合成したペプチド２２について［測定サンプルの調製１］と同じ手法で調製したペプチド溶液について、４０℃の恒温槽内で１週間および４週間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで－３０℃で保存した。
［ＨＰＬＣ分析条件］
　測定時間と移動相の送液条件のみを下記の通り変更し、その他は［測定サンプルの調製１］の欄の条件と同じ条件で測定を行った：
測定時間：２０分間
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表９のように変えて直線濃度勾配制御した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を表１０に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
３位及び８位において、テトラゾール置換アスパラギン酸の代わりに、オキサジアゾロン置換アスパラギン酸へと置換したペプチドは、ＰＡＣＡＰ２７よりも高い安定性を示した。
［測定サンプルの調製５］
　実施例２で合成したペプチド２３～３０を秤量し、トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、４０℃の恒温槽で４週または８週間，６０℃の恒温槽内で１週間または２週間の間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。試料分析まで標準サンプルは－３０℃で、保存後サンプルは－３０℃で保存した。
［ＨＰＬＣ分析条件１］
　測定時間と移動相の送液条件のみを下記の通り変更し、その他は［測定サンプルの調製１］の欄の条件と同じ条件で測定を行った：
測定時間：２０分間
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表１１のように変えて直線濃度勾配制御した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
ペプチド３０のみ下記のグラジエント時間を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を表１３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
実施例４：安定性試験２
　ペプチド１～１６からなる群から選ばれるペプチドについて、Ｎ末端アシル化を施したペプチドを調製する。ペプチド１７～３０からなる群から選ばれるペプチドについて、Ｎ末端アシル化の修飾がないペプチドを調製する。Ｎ末端修飾されたペプチドと、Ｎ末端修飾されていないペプチドについて、それぞれトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製する。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、６０℃の恒温槽内で１週間または２週間インキュベートして、保存後サンプルを得る。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで－３０℃で保存する。
　保存後サンプルを、適切なＨＰＬＣ分析条件で分析し、実施例３と同様に保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を算出する。Ｎ末端修飾、特にＮ末端アシル化、さらにはアセチル化がされたペプチドにおいて、安定性が向上することが確認できる。
参考例：安定性試験３
　調製された参考例１～６のペプチドを秤量し、トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、６０℃の恒温槽内で１週間または２週間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで－３０℃で保存した。
　保存後サンプルを下記のＨＰＬＣ分析条件にて測定し、実施例３と同様に保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を算出した。その結果を表１５に示した。
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：Waters社製　XSelect CSH C18、5 μm、4.6×250 mm
ガードカラム：Waters社製　XSelect CSH C18、5 μm、4.6×20 mm Guard Cartridge
検出波長：２２０ｎｍ
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
測定時間：２０分間
測定サンプル注入量：５０ μL
流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度４０℃
サンプルクーラー：２５℃
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表１４のように変えて直線濃度勾配制御する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
　保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を表１５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
 　参考例１（ＰＡＣＡＰ）は、６０℃で１週間保存後には、２６．６％、２週間保存後には１５．８％と極めて安定性が悪く、またＰＡＣＡＰのＮ末端をアセチル化した参考例２も同等の安定性でしかなかった。一方で、３位と８位のアスパラギン酸のカルボキシル基をテトラゾールに置換した参考例３及び４（参考例３では、さらに１７位のメチオニンがノルロイシンに置換されており、参考例４では１７位のメチオニンがさらにロイシンに置換されている）では、６０℃で１週間保存後には、９１．３％及び９１．７％、２週間保存後には８２．４％及び８４．８％と安定性が大幅に向上した。さらに参考例３及び４のＮ末端をアセチル化された参考例５及び６では、６０℃で１週間保存後には、９８．１％及び９８．４％、２週間保存後には９２．９％及び９２．８％とさらに安定性が向上した。ここで、６０℃における１週間および２週間の加速試験は、室温（２５℃）における、約１年および約２年に相当する。したがって、参考例５及び６は、室温で２年間（９０％以上の残存率）安定であると期待される。
実施例５：ＰＡＣＡＰ２７及びその改変ペプチドのｃＡＭＰアッセイ
[細胞培養]
　マイトマイシン処理済みの凍結したＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＰＡＣ１またはＶＰＡＣ１レセプター高発現細胞株：DiscoveRx社から購入）を、１．３５×１０4ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ウェルになるようCell plating reagent（DiscoveRx社製）で調製後、９６ウェル培養プレートに播種した。細胞を、５％ＣＯ2インキュベーター内で１８～２４時間、３７℃で培養して、プレートに細胞を接着させた。
[試薬調製]
　実施例２で合成したペプチド１～３０及び参考例１（ＰＡＣＡＰ）の粉末を０．１ｍＭになるように水に溶解した後、２０μＭになるようにCell assay buffer（DiscoveRx社製）（０．５ｍＭのＩＢＭＸ、０．００１％ＢＳＡを含む）で希釈した。そこから同じCell assay bufferで５倍希釈系列を作製し、アッセイに使用した。
[ｃＡＭＰアッセイ]
　ｃＡＭＰアッセイは、Hit Hunter cAMP assay for Biologicsキット（DiscoveRx社製、Cat. No.90-0075LM25）を用いて、キット付属の説明書に従って行った。ｃＡＭＰ抗体溶液と希釈した各濃度のペプチド１～３０溶液を混合し、ペプチド－ｃＡＭＰ抗体混合液を作製した。続いて、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養プレートから培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、ペプチド－ｃＡＭＰ抗体混合液を細胞に添加し、３７℃の５％ＣＯ2雰囲気下で３０分間インキュベートした。次にWorking detection solutionを添加し、培養プレートをアルミホイルで遮光後、２５℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、Solution Aを添加し、培養プレートをアルミホイルで遮光後、２５℃で３時間インキュベートした。最後に、化学発光シグナルを、ＧｌｏＭａｘ検出器（Promega社製）を用いて、Luminescence, Integration time(1 sec)の条件で検出した。得られたRelative luminescence unit（ＲＬＵ）値をGraphPad Prism Ver 6.05（Graph Pad社製）にて解析し、各ペプチドにおけるＥＣ50値を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
　以上の結果をまとめると、本発明にかかるペプチド（ペプチド１～３０）は、ＰＡＣＡＰと比較して、水溶液中での極めて改善された安定性を有するとともに、ＰＡＣＡＰと同等の生理活性を維持する。特に、室温において２年を超える貯蔵寿命を有することにより、液体製剤、例えばバイアル、アンプル、点眼剤などの製品として開発が可能となる。
製剤例
　本発明のペプチドを有効成分として含有する医薬は、例えば、次のような処方によって製造することができる。製剤例を挙げて本発明の薬剤をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの製剤例にのみ限定されるものではない。
１．カプセル剤
（１）ペプチド５ 　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
（２）ラクトース 　　　　　　　　　　　　７０ｍｇ
（３）微結晶セルロース 　　　　　　　　　　９ｍｇ
（４）ステアリン酸マグネシウム 　　　　　　１ｍｇ
１カプセル 　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍｇ
　（１）、（２）、（３）の全量、および（４）の１／２を混和した後、顆粒化する。これに残りの（４）を加えて全体をゼラチンカプセルに封入する。
２．錠剤
（１）ペプチド６ 　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
（２）ラクトース 　　　　　　　　　　　　５８ｍｇ
（３）コーンスターチ 　　　　　　　　　　１８ｍｇ
（４）微結晶セルロース 　　　　　　　　３．５ｍｇ
（５）ステアリン酸マグネシウム 　　　　０．５ｍｇ
１錠 　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍｇ
（１）、（２）、（３）の全量、（４）の２／３および（５）の１／２を混和した後、顆粒化する。残りの（４）および（５）をこの顆粒に加えて錠剤に加圧成型する。
３．硝子体注射液
　１ｍｌ中
（１）ペプチド５　　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
（２）精製白糖　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
（３）塩化ナトリウム　　　　　　　　　２．３４ｍｇ
（４）ポリソルベート８０　　　　　　　　　適量
（５）リン酸水素二ナトリウム　　　　　　　適量
（６）リン酸二水素ナトリウム　　　　　　　適量
（７）滅菌精製水　　　　　　　　　　　　　適量
　（１）～（６）を、（７）滅菌精製水に溶解して硝子体注射液を調製する。
４．目薬
１００ｍL中
（１）ペプチド６　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
（２）トロメタモール　　　　　　　　　　３００ｍｇ
（３）塩化ナトリウム　　　　　　　　　　９００ｍｇ
（４）塩化ベンザルコニウム　　　　　　　　　適量
（５）滅菌精製水　　　　　　　　　　　　　　適量
（１）～（４）を、（５）滅菌精製水に溶解して、pHを調整し、点眼液を調製する。

Claims (20)

  1. 　H-X1-D-G-X2-F-X3-D-X4-Y-X5-R-Y-R-K-X6-X7-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L　（配列番号３）
    　　｛式中、
    　Ｘ1は、中性アミノ酸であり、
    　Ｘ2は、中性アミノ酸であり、
    　Ｘ3は、中性アミノ酸であり、
    　Ｘ4は、アラニン、セリン、Ａｉ又はＣｎであり、
    　Ｘ5は、アラニン、セリン、Ａｉ又はＣｎであり、
    　Ｘ6は、グルタミン又はアラニンであり
    　Ｘ7は、非極性アミノ酸である｝
    　で表される配列の３位及び８位において、アスパラギン酸がそれぞれ独立に、テトラゾール置換アスパラギン酸（Ｔｚ）、テトラゾール置換グルタミン酸（ｅｇＴｚ）、テトラゾール置換ホモグルタミン酸（ｎｖＴｚ）、スルホキシ置換アスパラギン酸（ｃｙａ）、及びオキサジアゾロン置換アスパラギン酸（５Ｏｘａ）からなる群から選ばれる残基に置換される配列、又はその改変配列からなるペプチドであって、前記ペプチドがＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒへの結合性を有し、前記改変配列が、配列番号３の配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失又は付加された配列である、前記ペプチド。
  2. 　Ｘ1が、セリン又はアラニンである、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　Ｘ2が、イソロイシン又はアラニンである、請求項１又は２に記載のペプチド。
  4. 　Ｘ3が、アラニン又はスレオニンである、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド。
  5. 　Ｘ7は、メチオニン、ロイシン、ノルロイシン、又はアラニンである、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド。
  6. 　３位及び８位のアミノ酸が、それぞれテトラゾール置換アスパラギン酸（Ｔｚ）、テトラゾール置換グルタミン酸（ｅｇＴｚ）、又はテトラゾール置換ホモグルタミン酸（ｎｖＴｚ）である場合、これらのアミノ酸がＬ体、Ｄ体又はラセミ体である、請求項１～５のいずれか一項に記載のペプチド。
  7. 　前記ペプチドにおいて、Ｎ末端が保護基により修飾されている、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチド。
  8. 　前記保護基が、アシル基である、請求項７に記載のペプチド。
  9. 　前記ペプチドにおいて、Ｃ末端が保護基により修飾されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のペプチド。
  10. 　前記保護基が、アミド基、又はエステル基である、請求項９に記載のペプチド。
  11. 　前記改変配列が、Ｃ末端において前記配列から１～３個のアミノ酸が欠失された配列である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド。
  12. 　前記改変配列が、Ｎ末端において前記配列から１～３個のアミノ酸が付加された配列である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のペプチド。
  13. 　前記改変配列が、以下の： 
    　　GKRYKQRVKNK（配列番号４３）；
    　　GKRYKQRVKN（配列番号４４）；
    　　GKRYKQRVK（配列番号４５）；
    　　GKRYKQRV（配列番号４６）；
    　　GKRYKQR（配列番号４７）；
    　　GKRYKQ（配列番号４８）；
    　　GKRYK（配列番号４９）；
    　　GKRY（配列番号５０）
    　　GKR；
    　　GRR；
    　　GK；及び
    　　GR
    　　G；
    　からなる群から選択される１の配列を前記配列のＣ末端に付加された配列である、請求項１～１０、又は１２のいずれか一項に記載のペプチド。
  14. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、神経保護剤。
  15. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、涙液分泌促進剤。
  16. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、抗炎症剤。
  17. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、血管内皮機能改善剤。
  18. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、角膜上皮又は角膜内皮障害治療剤。
  19. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、ドライアイ治療剤。
  20. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
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LOUISE DICKSON, PHARMACOLOGY & THERAPEUTICS, vol. 12, 2009, pages 294 - 316
S. BOURGAULT, CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 16, 2009, pages 4462 - 4480

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