WO2020222538A9 - Hapln1을 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Hapln1을 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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하해찬
장지민
신인철
백문정
주단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss comprising hyaluronan and proteoglycan link protein 1 (HAPLN1) as an active ingredient.
  • the HAPLN1 protein of the present invention grows hair by promoting proliferation of hair cells through the ERK1/2 signaling pathway (ie, non-canonical signaling pathway) activated by TGF- ⁇ protein upon administration.
  • Human hair is an aggregate of about 100,000 individual hairs, each of which is produced by a hair follicle.
  • the hair follicle serves as a reservoir for stem cells that can generate all the cell lines needed to rebuild the follicle itself, the epithelium, and the sebaceous gland.
  • the hair follicle is composed of a dermal papilla cell, a hair germinal matrix cell, an outer wall of a hair follicle cell, an outer, inner layer, a bulge, and the like (FIG. 1).
  • the growth phase usually lasts for 3 to 5 years, and is a stage in which hair grows by proliferating and keratinizing keratinocytes of the hair cells as the dermal papilla cells and hair cells develop.
  • the degeneration period lasts for 10 to 14 days, and it is a stage in which the hair follicles shrink as overall apoptosis occurs.
  • the resting period is maintained for about 3 to 4 months, and hair generation is stopped, and new cells are supplied to the entire hair follicle to prepare for the next growth period.
  • Signaling pathways involved in the hair growth cycle include signaling pathways involving Wnt, Shh, JAK, TGF ⁇ /BMP, and Testosterone. Among these, the Wnt, Shh, and JAK signaling pathways are activated at the end of the resting phase and promote entry into the growth phase.
  • Hair loss can be largely divided into four types: male-pattern hair loss, female-pattern hair loss, alopecia areata, and telogen effluvium.
  • the cause of male pattern hair loss is largely a genetic cause, and is related to 5 ⁇ -reductase.
  • 5 ⁇ -reductase converts the male hormone testosterone into 5 ⁇ -dihydrotestosterone (DHT), and DHT causes hair loss by shrinking hair follicles.
  • DHT 5 ⁇ -dihydrotestosterone
  • the main cause of female pattern hair loss is an unbalanced secretion of hormones due to childbirth or menopause.
  • finasteride (trade name Propecia ® ), dutasteride (trade name Avodart ® ), and minoxidil (trade name Myoxydil ® or Rogaine ® ) are the most frequently used hair loss treatments in Korea.
  • Finasteride and dutasteride are 5 ⁇ -reductase inhibitors that inhibit the conversion of testosterone to 5 ⁇ -dihydrotestosterone (DHT).
  • DHT 5 ⁇ -reductase inhibitors that inhibit the conversion of testosterone to 5 ⁇ -dihydrotestosterone
  • this product has side effects such as decreased libido, impotence, and loss of driving and performance capabilities.
  • Hyaluronan and proteoglycan link protein 1 (HAPLN1) is an extracellular matrix protein found in the cartilage. This protein plays a role in stabilizing the aggregates of hyaluronic acid and proteoglycans, and is reported to be involved in the binding between cells.
  • HAPLN1 hair follicle formation inducible dermal papilla cells and dermal sheath cells such as hair growth skin cells (trichogenic dermal cells)
  • hair growth skin cells trichogenic dermal cells
  • U.S. Patent Registration No. 8,334,136 lists 20 genes involved in cell adhesion in dermal papilla cells, and mentions the possibility of promoting hair follicle formation by maintaining or increasing the expression of the gene.
  • HAPLN1 is only initiated as one of 20 genes, and the results of confirming whether the expression of these genes actually promotes hair follicle formation are not disclosed at all.
  • HAPLN1 as one of the biomarkers for identifying dermal papilla cells or hair follicle cells or distinguishing them from other cells, and the effect of preventing or treating hair loss when the HAPLN1 protein is directly administered as an active ingredient. There is no mention of the point of representing. Furthermore, among many pathways involved in the hair growth cycle, activation of the ERK1/2 signaling pathway, which is activated by the TGF- ⁇ protein, is effective in treating hair loss. In particular, HAPLN1 acts on the germinal matrix cell to activate the above pathway. The fact that it promotes hair growth has not been studied so far.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss, which has excellent effect of treating hair loss and has fewer side effects, as compared to conventional hair loss treatments with serious side effects.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition exhibiting an effect of preventing or treating hair loss through a mechanism of action different from that used in conventional hair loss treatments.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for growing hair by promoting the proliferation of hair cells.
  • Hair repeats the growth phase, the degeneration phase, and the resting phase, among which the growth phase is a phase in which the hair cells actively differentiate to generate hair, and the thickness and length of the hair are determined at this stage. Since the growth phase is the most critical step in the treatment of hair loss, it is important to develop a therapeutic agent that promotes the initiation of the growth phase of hair follicles or helps proliferation of hair cells during the growth phase.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss comprising HAPLN1 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for preventing or improving hair loss comprising HAPLN1 as an active ingredient.
  • the HAPLN1 activates a non-canonical signaling pathway, wherein the non-canonical signaling pathway is an ERK1/2 signaling pathway that is activated with a TGF- ⁇ protein. Accordingly, the HAPLN1 of the present invention promotes proliferation of hair germinal matrix cells to grow hair.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be for the prevention or treatment of male pattern hair loss, female pattern hair loss, circular hair loss, or telogen hair loss.
  • the hair loss may be a decrease in the expression of the HAPLN1 protein in hair germinal matrix cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used alone or in combination with other therapeutic agents.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains, as an active ingredient, HAPLN1, an intracellular protein constituting the extracellular matrix, as an active ingredient, it has fewer side effects than conventional hair loss treatments.
  • HAPLN1 contained as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention activates the ERK1/2 signaling pathway, that is, a non-canonical signaling pathway that is activated by the TGF- ⁇ protein. Grow. These mechanisms of action are completely different from those used in conventional hair loss treatments, and have not been known until now. Accordingly, HAPLN1 can be used as a new concept of hair loss treatment, and can suggest a breakthrough strategy and a new direction for future hair loss research.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a hair follicle.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a hair growth cycle.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the mechanism of promoting hair growth and hair growth of HAPLN1.
  • FIGS. 4 and 5 show the expression levels of HAPLN1 protein and HAPLN1 mRNA in each of the hair growth cycles of the anagen, catagen, and telogen.
  • 17 shows the results confirming that cell proliferation was promoted in the group treated with HAPLN1 and/or HA in the presence of TGF- ⁇ 2.
  • 21 shows the results of confirming cell proliferation when human dermal papilla cells were treated with HAPLN1, CX3CL1, CDON protein, or minoxidil.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss comprising HAPLN1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a method of preventing or treating hair loss in a subject, comprising administering an effective amount of HAPLN1 protein to the subject in need thereof.
  • the present invention provides the use of HAPLN1 protein for the prevention or treatment of hair loss.
  • HAPLN1 is a protein present in the body, and has been used as a biomarker to identify specific cells or to distinguish them from other cells in conventional hair loss treatment related studies.
  • the HAPLN1 protein of the present invention When used directly as an active ingredient, it exhibits excellent hair loss prevention or treatment effect while having relatively few side effects compared to conventional hair loss treatments with serious side effects.
  • the HAPLN1 protein of the present invention when directly used as an active ingredient, it promotes hair growth in a completely different way from the existing hair loss treatment.
  • the HAPLN1 protein of the present invention activates a non-canonical signaling pathway, and in this case, the non-canonical signaling pathway is an ERK1/2 signaling pathway that is activated with a TGF- ⁇ protein.
  • the non-canonical signaling pathway is an ERK1/2 signaling pathway that is activated with a TGF- ⁇ protein.
  • TGF- ⁇ signaling mechanism when the parental cell is stimulated by TGF- ⁇ , TGF- ⁇ binds to the TGF- ⁇ receptor 2 (T ⁇ RII) of the parental cell. Thereafter, T ⁇ RII binds to TGF- ⁇ receptor 1 (T ⁇ RI) to form a T ⁇ R complex.
  • T ⁇ RI TGF- ⁇ receptor 1
  • T ⁇ R complex enters the cell by endocytosis, and the cell cycle is blocked (cell cycle arrest) through Smad2/3 signaling when the clathrin-induced endocytosis occurs. This pathway is a canonical pathway.
  • caveolin-1 induces inclusion, T ⁇ RI and T ⁇ RII are finally degraded through Smad7 signaling.
  • the TGF- ⁇ signaling pathway is also activated, and apart from the canonical Smad pathway, there is a Ras-ERK1/2 mechanism of a non-canonical pathway, such as Ras-ERK1.
  • the result of activation of /2 signaling is cell proliferation.
  • HAPLN1 activates the Ras-ERK1/2 pathway, that is, a non-canonical pathway in the TGF- ⁇ signaling mechanism (Fig. 3).
  • hyaluronic acid is produced by hyaluronic acid synthase 2 (HAS2) in cells.
  • HAS2 hyaluronic acid synthase 2
  • HA binds to CD44 (receptor of HA) in the cell membrane, and CD44 binds to T ⁇ R. That is, HA is indirectly bound to T ⁇ R.
  • HA decomposition of hyaluronidase (HYAL2) is essential for the inclusion of HA to occur.
  • HAPLN1 induces stabilization of HA by linking HA with proteoglycans.
  • HAPLN1 tightly surrounds HA with proteoglycans to inhibit HYAL2 from decomposing HA, or inhibiting decomposition of HA by reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • HAPLN1 inhibits the inclusion of T ⁇ R, prevents Smad2/3 mechanism activity and degradation of T ⁇ R, and increases T ⁇ RII in cell membranes.
  • the non-canonical signaling pathway that is, the Ras-ERK1/2 mechanism, is activated by HAPLN1, and cell proliferation is promoted and eventually leads to hair growth.
  • the HAPLN1 protein of the present invention promotes cell proliferation through Ras-ERK1/2 signaling activated by TGF- ⁇ protein, and can be used for preventing or treating hair loss.
  • the HAPLN1 protein of the present invention promotes the proliferation of hair germinal matrix cells to grow hair.
  • hair loss refers to a state where there is no hair in the area where the hair should normally be present, regardless of the cause, and may be, for example, male-type hair loss, female-type hair loss, circular hair loss, or telogen hair loss. .
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving hair loss comprising HAPLN1 as an active ingredient.
  • the cosmetic composition may be, for example, a cosmetic for hair, and its formulation is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the cosmetic composition is formulated as a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, and spray. May be, but is not limited thereto.
  • it may be a cosmetic composition for hair such as cleaning agents such as shampoo, conditioner, and body cleanser, hairdressing agents such as hair tonic, gel or mousse, and hair dye or hair dye.
  • the cosmetic composition may contain a variety of suitable bases and additives as needed, and the types and amounts of these ingredients can be easily selected by the inventor. It may contain acceptable additives as needed, and for example, it may further include components such as preservatives, colors, additives, etc. that are common in the art.
  • the expression of the HAPLN1 protein was confirmed in each hair growth cycle using mouse skin.
  • Mouse skin was collected at 23 days of age (early growth period), 32 days of age (growth period), 40 days of age (degeneration period), and 44 days of life (rest period), and fresh frozen.
  • the skin tissue section was made to have a thickness of 8 ⁇ m, and the presence or absence of the HAPLN1 protein was detected using an antibody HAPLN1 (Abcam, USA). Immunofluorescence was carried out according to a common experimental method.
  • HAPLN1 was significantly expressed in the parental cells in the growth phase, and it was confirmed that the expression was reduced in the degeneration phase and the resting phase.
  • HAPLN1 mRNA was identified in mouse skin to determine which cells were produced in HAPLN1.
  • the mouse skin was collected at 32 days old (growth period), 40 days old (degeneration period), and 44 days old (rest period), and the skin tissue sections were paraffin cut to a thickness of 8 ⁇ m. It was detected using the HAPLN1 mRNA probe (ACDbio, USA), and the in-situ hybridization experiment was performed according to the manufacturer's experimental method (ACDbio; RNAscope ® 2.5 HD Assay-BROWN, CA, USA).
  • HAPLN1 mRNA was expressed in the parental cells in the growth phase, and the expression was not confirmed in the degeneration phase and the resting phase.
  • HAPLN1 was treated by concentration in human hair cells. Specifically, human hair germinal matrix cells (HHGMC) were dispensed into poly-D-lysine 6 well plates by 5.0 ⁇ 10 4 per well and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed and replaced with a new medium containing no serum. HAPLN1 was treated with 0, 5, 10, 20 ng/mL and incubated for 24 hours. After collecting the cells, lysis buffer (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1% Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor) was added, and all cells were broken through sonication. T ⁇ RII was measured in the sample using Western blotting. The optical concentration of each T ⁇ RII compared to GAPDH was compared using a densitometer (ie, T ⁇ RII optical concentration ⁇ GAPDH optical concentration). At this time, GAPDH was used as a loading control.
  • HHGMC human hair germinal matrix cells
  • T ⁇ RII increased at 20 ng/mL of HAPLN1.
  • T ⁇ RII increased when HAPLN1 was treated in human hair cells.
  • HAPLN1 affects T ⁇ RII by stabilizing HA, not directly acting on T ⁇ RII in the TGF- ⁇ signaling pathway. To confirm this, an experiment was performed in which HAPLN1 and HA were treated together.
  • Human hair cells were dispensed into poly-D-lysine 6 well plates by 5.0 ⁇ 10 4 per well and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed and replaced with a new medium containing no serum. HAPLN1 was treated at 25 ng/mL and HA at 25 ⁇ g/mL, and 1 hour later, TGF- ⁇ 2 (2 ng/mL) was treated. After 23 hours, the cells were collected, lysis buffer (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1% Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor) was added, and all cells were awakened through sonication. Western blotting was used to measure T ⁇ RI and T ⁇ RII in the sample. The optical concentration of each T ⁇ RII compared to GAPDH was compared using a densitometer.
  • endogenous HAPLN1 was deficient using HAPLN1 siRNA.
  • Human hair cells were dispensed into poly-D-lysine 6 well plates at 5.0 ⁇ 10 4 per well and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed and replaced with a low serum medium.
  • HAPLN1 siRNA and scrambled siRNA were added at 25 pmol per well and incubated for 24 hours. After collecting the cells, lysis buffer (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1% Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor) was added, and all cells were broken through sonication.
  • HAPLN1 and T ⁇ RII were measured in the sample using Western blotting. The optical concentration of each HAPLN1 and T ⁇ RII was compared to GAPDH using a densitometer.
  • T ⁇ RII was also reduced as human hair cells were treated with HAPLN1 siRNA to deplete endogenous HAPLN1.
  • HAPLN1 siRNA was used to determine whether the T ⁇ RII protein was increased by exogenous HAPLN1 and/or HA in human blast cells deficient in HAPLN1.
  • Human hair cells were dispensed into poly-D-lysine 6 well plates by 5.0 ⁇ 10 4 per well and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed and replaced with a low serum medium. HAPLN1 siRNA and scrambled siRNA were added at 25 pmol per well and incubated for 24 hours. After removing all the siRNA and the medium, it was replaced with a serum-free medium to which HAPLN1 (25 ng/mL) or HA (25 ⁇ g/mL) was added, and cultured for 1 hour. TGF- ⁇ 2 (2 ng/mL) was treated and incubated for 23 hours.
  • lysis buffer 25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1% Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor
  • T ⁇ RII was measured in the sample using Western blotting.
  • the optical concentration of T ⁇ RII versus GAPDH was compared using a densitometer.
  • 4-MU (4-methylumbelliferone) is an inhibitor of HA-producing hyaluronan synthase 2 (HAS2). In order to confirm the effect of HA produced in cells, 4-MU was used to inhibit cell HA production.
  • Endogenous HA-inhibited human blast cells were treated with 4-MU in a poly-D-lysine 6 well plate, and 5.0 ⁇ 10 4 per well were dispensed and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed and replaced with a new medium containing no serum.
  • HAPLN1 was treated with 25 ng/mL, and after 1 hour, TGF- ⁇ 2 (2 ng/mL) was treated. After 23 hours, the cells were collected, lysis buffer (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1% Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor) was added, and all cells were awakened through sonication.
  • HAS2 and T ⁇ RII were measured in the sample using Western blotting. Optical concentrations of HAS2 and T ⁇ RII were compared to GAPDH using a densitometer.
  • Example 3 HAPLN1 was confirmed to regulate T ⁇ RII through HA. However, HA does not directly bind to T ⁇ RII, and CD44, a receptor for HA, binds to T ⁇ RII.
  • CD44 is one of the important factors in the T ⁇ RII regulation process, and whether CD44 is actually essential in the process of increasing T ⁇ RII by HAPLN1.
  • CD44 siRNA-treated human hair cells deficient in intracellular CD44 were dispensed into poly-D-lysine 6 well plates at 5.0 ⁇ 10 4 per well and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed and replaced with a low serum medium. CD44 siRNA and scrambled siRNA were added at 25 pmol per well and incubated for 24 hours. After collecting the cells, lysis buffer (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1% Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor) was added, and all cells were broken through sonication. CD44 and T ⁇ RII were measured in the sample using Western blotting. Optical concentrations of CD44 and T ⁇ RII were compared to GAPDH using a densitometer.
  • CD44 siRNA Human hair cells deficient in CD44 using CD44 siRNA were dispensed into poly-D-lysine 6 well plates at 5.0 ⁇ 10 4 per well and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed and replaced with a low serum medium. CD44 siRNA and scrambled siRNA were added at 25 pmol per well and incubated for 24 hours. After removing all the siRNA and the medium, it was replaced with a serum-free medium to which HAPLN1 (25 ng/mL) or HA (25 ⁇ g/mL) was added, and cultured for 1 hour. TGF- ⁇ 2 (2 ng/mL) was treated and incubated for 23 hours.
  • HAPLN1 25 ng/mL
  • HA 25 ⁇ g/mL
  • lysis buffer 25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1% Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor
  • T ⁇ RII was measured in the sample using Western blotting.
  • the optical concentration of T ⁇ RII versus GAPDH was compared using a densitometer.
  • CD44 is an essential element in the process of increasing T ⁇ RII by HAPLN1 and HA.
  • HAPLN1 would cause an increase in cell membrane T ⁇ RII by inhibiting the inclusion of T ⁇ RII, and an experiment to prove this was performed.
  • Human hair cells were dispensed into a poly-D-lysine 100 mm dish at a rate of 2.7 x 10 6 and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed and replaced with a new medium containing no serum.
  • HAPLN1 was treated at 25 ng/mL and HA at 25 ⁇ g/mL, and 1 hour later, TGF- ⁇ 2 (2 ng/mL) was treated.
  • EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) was treated at a concentration of 250 ⁇ g/mL and incubated at 4° C. for 1 hour.
  • the biotin labeling reaction was terminated by treatment with 50 mM Tris-HCl. After collecting the cells, lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor) was added, and all cells were broken through sonication. Cell membrane proteins were isolated by performing immunoprecipitation experiments using anti-biotin antibodies. T ⁇ RII was measured in the cell membrane protein sample isolated by Western blotting. The optical concentration of each T ⁇ RII compared to GAPDH was compared using a densitometer.
  • Western blotting was used to measure p-ERK1/2, p-Smad2, p-MEK1/2, and pc-Raf in the sample.
  • Optical concentrations of p-ERK1/2, p-Smad2, p-MEK1/2, and pc-Raf were compared to ERK1/2, Smad2/3, MEK1, and c-Raf using a densitometer. At this time, ERK1/2, Smad2/3, MEK1, and c-Raf were used as loading controls.
  • HAPLN1 did not activate the canonical pathway of Smad2/3.
  • Human hair cells were dispensed into a poly-D-lysine 96 well plate at 2.0 x 10 3 per well and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed and replaced with a new medium containing no serum.
  • HAPLN1 was treated with 25 ng/mL and HA with 25 ⁇ g/mL, incubated for 1 hour, and then stimulated with TGF- ⁇ 2 (2 ng/mL) for 23 hours.
  • CCK-8 (Enzo Biochem, NY, USA) was treated and incubated at 37°C for 1 hour. The absorbance was measured at 450 nm, and the results are shown in FIG. 17.
  • HAPLN1 promotes the proliferation of human hair cells through the non-canonical TGF- ⁇ signaling pathway.
  • HAPLN1 and T ⁇ RII were fluorescently stained in each hair cycle of mouse skin to confirm the expression of HAPLN1 protein and T ⁇ RII protein.
  • Mouse skin was collected at 32 days of age (growth period), 40 days of age (degeneration period), and 44 days of birth (rest period), and fresh frozen.
  • the skin tissue sections were made to be 8 ⁇ m thick, and the presence or absence of HAPLN1 and T ⁇ RII proteins was detected using HAPLN1 (Abcam, USA) antibody and T ⁇ RII antibody. Immunofluorescence was carried out according to a common experimental method.
  • HAPLN1 was expressed in the parental cells in the growth phase, and the expression was reduced in the degeneration phase and the resting phase.
  • HAPLN1 and T ⁇ RII were expressed at the same location in the hair germical matrix of the growth phase (Aangen) (co-localization). This means that HAPLN1 and T ⁇ RII contribute to the proliferation of human hair cells.
  • HAPLN1 in the body decreases with age.
  • HAPLN1 was administered to 20-month-old C57 mice with a decrease in HAPLN1 in the body.
  • HAPLN1 was injected intraperitoneally at 0.1 mg/kg every 3 days.
  • HAPLN1 siRNA was administered to 7-week-old C57 mice, and how the hair growth cycle changed according to HAPLN1 deficiency was observed.
  • HAPLN1 siRNA (Dharmacon; Accell HAPLN1 siRNA SMARTpool, CO, USA) was intraperitoneally injected twice a week at 4 nmol for 4 weeks (refer to the schedule of FIG. 20).
  • U.S. Patent Registration No. 8,334,136 suggests the possibility that hair follicle formation or hair regeneration can be promoted by maintaining or increasing the expression of cell adhesion genes such as HAPLN1, CX3CL1, and CDON present in dermal papilla cells.
  • cell adhesion genes such as HAPLN1, CX3CL1, and CDON present in dermal papilla cells.
  • the HAPLN1, CX3CL1 or CDON proteins expressed by the cell adhesion genes were directly treated on dermal papilla cells or hair cells, it was verified whether or not the proliferative effect was actually expressed.
  • Human dermal papilla cells were cultured in a 37°C, 5% CO 2 incubator using dermal papilla cell proliferation medium (Promocell). When the cells were about 90% full, the cells were detached with a 0.05% Trypsin/EDTA solution, and then only the cells were recovered by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes. These were dispensed into a 96 well plate by 2.0 ⁇ 10 3 per well, cultured for 24 hours, and diluted to a final concentration of each of HAPLN1, CX3CL1 and CDON in a serum-free medium to be 25 ng/ml.
  • dermal papilla cell proliferation medium Promocell
  • HAPLN1, CX3CL1 and CDON were dispensed into each well and cultured for 1 hour.
  • 3 wells per group were treated (triplication).
  • minoxidil which is known to proliferate dermal papilla cells, was treated with 10 ⁇ M and set as a positive control.
  • HAPLN1 25 ng/ml
  • CX3CL1 25 ng/ml
  • CDON 25 ng/ml
  • minoxidil 10 ⁇ M
  • human recombinant TGF- ⁇ 2 at a final concentration of 2 ng/ml
  • 200 ⁇ l of the medium of the group containing TGF- ⁇ 2 was exchanged.
  • 3 wells per group were treated (Triplicate).
  • HAPLN1 exhibited significant blast proliferative activity in the absence of TGF- ⁇ 2 (*P ⁇ 0.05), and particularly superior blast proliferation activity in the presence of TGF- ⁇ 2. As a result (***P ⁇ 0.001), it was confirmed that it has a proliferative effect of human hair cells through the TGF- ⁇ signaling pathway. On the other hand, CX3CL1 and CDON showed a result of inhibiting cell proliferation in dermal cells as in the case of dermal papilla cells.
  • HAPLN1 protein has the effect of preventing or treating hair loss by promoting proliferation of hair cells and growing hair.

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Abstract

본 발명은 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1)을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 HAPLN1 단백질은 투여시 TGF-β 단백질로 활성화되는 Ras-ERK1/2 신호전달 경로를 통해 모모세포의 증식을 촉진함으로써 모발을 성장시킨다.

Description

HAPLN1을 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1)을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 HAPLN1 단백질은 투여시 TGF-β 단백질로 활성화되는 ERK1/2 신호전달 경로(즉, 비정규(non-canonical) 신호전달 경로)를 통해 모모세포의 증식을 촉진함으로써 모발을 성장시킨다.
전세계적으로 약 3,500만 명의 남성과 2,500만 명의 여성이 탈모로 고통 받고 있고, 매년 탈모 환자의 수는 증가하는 추세이다. 모발은 외모, 단열, 두피 보호, 마찰 완충 등의 여러가지 기능을 갖는다. 그 중에서도 모발은 특히 자존감, 사회성과 직접적으로 연관되므로, 심미적인 이유로 많은 사람들은 모발 관리에 매우 많은 관심을 갖고 있다.
인간 머리카락은 약 100,000개의 개별 모발의 집합체이며, 각각의 모발은 모낭(hair follicle)에 의해 생성된다. 모낭은, 모낭 자신, 상피, 및 피지선을 재구성하는 데 필요한 모든 세포주를 생성할 수 있는 줄기세포의 저장소 역할을 한다. 모낭은 모유두세포(dermal papilla cell), 모모세포(hair germinal matrix cell), 모낭 세포 외벽, 내벽(outer, inner layer), 돌출부(bulge) 등으로 구성되어 있다(도 1).
모발은 성장기(anagen), 퇴화기(catagen), 휴지기(telogen)의 성장 주기를 반복한다(도 2). 성장기는 통상 3년 내지 5년간 지속되며, 모유두세포와 모모세포가 발달하면서 모모세포의 케라티노사이트(keratinocyte)가 증식, 각질화되어 모발이 성장하는 단계이다. 퇴화기는 10 내지 14일간 지속되며, 전반적인 모낭세포의 세포사멸(apoptosis)이 일어나면서 모낭이 축소되는 단계이다. 휴지기는 약 3 내지 4개월간 유지되며, 모발 생성이 중단된 시기로, 모낭 전체에 새로운 세포를 공급하여 다음 성장기를 준비하는 단계이다.
모발 성장 주기에 관여하는 신호전달 경로로는 Wnt, Shh, JAK, TGFβ/BMP, Testosterone 등이 관여하는 신호전달 경로가 있다. 이 중 Wnt, Shh, JAK 신호전달 경로는 휴지기 말기에 활성화되어 성장기로의 진입을 촉진한다.
이와 같이 사람의 모발은 일정한 모주기(hair growth cycle)를 가지고 있기 때문에 항상 일정한 모발의 수를 유지하게 된다. 그러나 탈모가 진행되면 모근에 존재하는 유두가 작아지고, 모유두가 작아지면 머리털의 굵기도 가늘어지고, 동시에 모주기도 짧아지며, 새로 자라나온 털은 더욱 가늘어지게 된다. 따라서 탈모가 진행되면 머리털은 솜털로 변하며 모주기는 더욱 짧아져 조금 자란 후 빠지게 된다.
탈모는 크게 남성형 탈모(male-pattern hair loss), 여성형 탈모(female-pattern hair loss), 원형 탈모(alopecia areata), 휴지기성 탈모(telogen effluvium)의 4가지 타입으로 나눌 수 있다. 남성형 탈모의 원인은 유전적인 원인이 크게 자리하고 있으며, 5α-환원효소(5α-reductase)와 관련되어 있다. 5α-환원효소는 남성호르몬 테스토스테론(testosterone)을 5α-dihydrotestosterone(DHT)로 변환시키며, DHT는 모낭을 축소시켜 탈모가 유발된다. 여성형 탈모의 주 원인으로는 출산 또는 폐경으로 인한 호르몬의 불균형적인 분비를 들 수 있다. 그 외 사회생활의 정신적 스트레스, 대기오염 노출, 가공 식품의 섭취, 고열로 인한 중병, 영양의 불균형, 항암제 및 항갑상선제의 복용, 경구 피임약의 투여, 샴푸, 강한 자외선이나 운동 중 흘리는 땀, 식습관, 심리적 압박감등의 다양한 습관과 환경 역시 탈모의 주범으로 알려져 있다.
현재 국내에서 가장 빈번하게 쓰이는 탈모 치료제로는 피나스테라이드(finasteride; 상품명 Propecia®), 두타스테라이드(dutasteride; 상품명 Avodart®), 미녹시딜(minoxidil; 상품명 마이녹실®　또는 Rogaine®) 등이 있다. 피나스테라이드와 두타스테라이드는 5α-환원효소 억제제(5α-reductase inhibitor)로 남성호르몬(testosterone)이 5α-dihydrotestosterone(DHT)로 전환되는 것을 억제한다. 그러나 이 제품은 성욕감퇴, 발기부전, 운전 및 수행능력 상실 등의 부작용을 나타낸다. 한편 미녹시딜의 경우 아직까지 그 기전이 완벽히 밝혀지지 않았으나, 세포막을 과분극(hyperpolarization)시키는 칼륨 채널 개방제(potassium chaennel opener)로서, 혈관 확장 및 칼륨 채널 개방을 통해, 모낭에 산소, 혈액, 영양소 등의 공급을 증가시켜 모낭을 건강하게 하는 것으로 여겨지고 있다. 그러나 이 제품 역시 도포 부위의 가려움, 홍반, 피부 자극, 눈의 자극 등의 부작용이 나타나며, 머리 이외에 신체 부위에서도 원치않는 모발의 성장이 관찰되기도 한다. 이러한 기존 제품들의 부작용은 환자들의 불안감을 증폭시키고 심할 경우 투여 거부까지 이어질 수 있기 때문에 부작용이 적은 약물을 개발하려는 노력이 계속되고 있다.
히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1)은 기질(cartilage)에서 발견되는 세포외 기질 단백질이다. 이 단백질은 히알루론산과 프로테오글리칸의 응집체를 안정화시키는 역할을 하며, 세포간의 결합에 관여하는 것으로 보고되어 있다.
최근 보고된 연구로서, 미국특허공개공보 제2012/0128632호에서는, 모낭 형성을 유도할 수 있는 모유두세포(dermal papilla cell) 및 모근초 세포(dermal sheath cell)와 같은 발모성 피부 세포(trichogenic dermal cell)를 동정하는 방법을 제시하면서, 발모성 피부 세포를 검출 및 동정하는데 사용될 수 있는 바이오마커(biomarker) 중 하나로서 HAPLN1를 제시하고 있다. 또한 미국특허등록공보 제8,334,136호에서는 모유두세포에서 세포 접착(cell adhesion)에 관여하는 20여개 유전자를 나열하고, 상기 유전자의 발현을 유지 또는 증가시켜 모낭 형성을 촉진시킬 수 있는 가능성을 언급하지만, 상기 20개의 유전자들 중 하나로 HAPLN1를 개시할 뿐이며, 또한 이들 유전자의 발현으로 실제로 모낭 형성이 촉진되는지 여부를 확인한 결과를 전혀 개시하고 있지 않다.
따라서, 상기 문헌들은 단지 모유두세포 또는 모근초 세포를 동정하거나 다른 세포들과 구별하기 위한 바이오마커 중 하나로서 HAPLN1을 언급하고 있을 뿐이며, HAPLN1 단백질을 직접 유효성분으로 투여시 탈모를 예방 또는 치료하는 효과를 나타낸다는 점에 대해서는 전혀 언급한 바 없다. 나아가 모발 성장 주기에 관여하는 많은 경로 중 TGF-β 단백질로 활성화되는 ERK1/2 신호전달 경로의 활성화가 탈모 치료에 효과적이며, 특히, HAPLN1이 모모세포(germinal matrix cell)에 작용하여 위 경로를 활성화시킴으로써 발모를 촉진한다는 점에 대해서는 현재까지 전혀 연구된 바가 없다.
본 발명은, 심각한 부작용이 동반되는 기존의 탈모 치료제와 비교하여, 탈모 치료의 효과가 우수하면서도 부작용이 적은 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 기존의 탈모 치료제에서 사용되는 작용기전과는 다른 작용기전을 통해 탈모 예방 또는 치료 효과를 나타내는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 모모세포의 증식을 촉진하여 모발을 성장시키는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 모발은 성장기, 퇴화기, 휴지기를 반복하는데, 그 중 성장기는 모모세포가 활발하게 분화하여 모발을 생성하는 단계로, 이 단계에서 모발의 굵기와 길이가 결정된다. 성장기는 탈모 치료에 있어 가장 핵심적 단계이기 때문에 모낭의 성장기 돌입을 촉진하거나 성장기의 모모세포의 증식을 돕는 치료제를 개발하는 것이 중요하다.
본 발명은 HAPLN1을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 HAPLN1을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
일 실시태양에서, 상기 HAPLN1은 비정규(non-canonical) 신호전달 경로를 활성화시키며, 여기서 비정규(non-canonical) 신호전달 경로는 TGF-β 단백질로 활성화되는 ERK1/2 신호전달 경로이다. 이에 따라, 본 발명의 HAPLN1은 모모세포(hair germinal matrix cell)의 증식을 촉진시켜 모발을 성장시킨다.
일 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 남성형 탈모, 여성형 탈모, 원형 탈모, 또는 휴지기성 탈모의 예방 또는 치료용일 수 있다. 또한 상기 탈모는 모모세포(hair germinal matrix cell)에서 HAPLN1 단백질의 발현이 감소된 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 조합하여 사용된다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분으로서 세포외기질을 구성하는 체내 단백질인 HAPLN1을 유효성분으로 포함하므로, 기존의 탈모 치료제보다 부작용이 적다.
또한 본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로 포함된 HAPLN1은 TGF-β 단백질로 활성화되는 ERK1/2 신호전달 경로, 즉, 비정규(non-canonical) 신호전달 경로를 활성화시켜, 모모세포의 증식을 통해 모발을 성장시킨다. 이러한 작용기전은 기존의 탈모 치료제에서 사용되는 작용기전과는 전혀 다른 방식이며, 현재까지 알려진 바 없다. 이에 따라 HAPLN1은 새로운 개념의 탈모 치료제로서 사용될 수 있으며, 향후 탈모 연구에 획기적인 전략 및 새로운 방향을 제시할 수 있다.
도 1은 모낭의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2는 모발 성장 주기를 보여주는 모식도이다.
도 3은 HAPLN1의 모모세포 증식 및 모발 성장 촉진 기전을 나타내는 모식도이다.
도 4 및 도 5는 성장기(anagen), 퇴화기(catagen), 휴지기(telogen)의 각각의 모발 성장 주기에서 HAPLN1 단백질 및 HAPLN1 mRNA의 발현 정도를 나타낸다.
도 6은 인간 모모세포에서 HAPLN1에 의한 TβRII 단백질 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 인간 모모세포에서 HAPLN1 및/또는 HA에 의한 TβRII 단백질 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 인간 모모세포에서 TβRII 단백질 농도에 대한 내인성 HAPLN1 결핍 효과 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 내인성 HAPLN1이 결핍된 인간 모모세포에서 TβRII 단백질 농도에 대한 외인성 HAPLN1 및/또는 HA의 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 내인성 HA가 결핍된 인간 모모세포에서 TβRII 및 HAS2 단백질 농도에 대한 외인성 HAPLN1의 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 인간 모모세포에서 TβRII 단백질 농도에 대한 CD44 결핍의 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 CD44가 결핍된 인간 모모세포에서 TβRII 단백질 농도에 대한 HAPLN1 및/또는 HA의 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 세포막 TβRII 단백질 농도에 대한 HAPLN1 및/또는 HA의 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 14 내지 도 16는 인간 모모세포에서 p-ERK1/2, p-Smad2, p-MEK1/2, p-c-Raf에 대한 HAPLN1 및/또는 HA의 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 17은 TGF-β2 존재 시 HAPLN1 및/또는 HA을 처리한 군에서 세포증식이 촉진되었음을 확인한 결과를 나타낸다.
도 18은 각 모발 성장 주기에서 HAPLN1 단백질 및 TβRII 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 19는 마우스의 모발 성장에 대한 HAPLN1의 복강 전신 투여의 효과를 확인하기 위한 실험 스케줄 및 그 결과를 나타낸다.
도 20은 마우스의 모발 성장에 대한 HAPLN1 siRNA의 복강 전신 투여의 효과를 확인하기 위한 실험 스케줄 및 그 결과를 나타낸다.
도 21은 인간 모유두세포에 HAPLN1, CX3CL1, CDON 단백질 또는 미녹시딜을 처리한 경우 세포 증식을 확인한 결과를 나타낸다.
도 22는 인간 모모세포에 HAPLN1, CX3CL1 또는 CDON 단백질을 처리한 경우 세포 증식을 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 HAPLN1을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 일 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 HAPLN1 단백질을 탈모 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 탈모를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 탈모 예방 또는 치료를 위한 HAPLN1 단백질의 용도를 제공한다.
HAPLN1은 체내 존재하는 단백질로, 종래 탈모 치료 관련 연구들에서는 특정 세포를 동정하거나 이를 다른 세포들과 구별하기 위한 바이오마커로서 사용되었다. 본 발명의 HAPLN1 단백질은 직접 유효성분으로 사용되는 경우, 심각한 부작용을 동반하는 기존의 탈모 치료제와 비교하여, 상대적으로 부작용이 적으면서도, 우수한 탈모 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
특히, 본 발명의 HAPLN1 단백질은 직접 유효성분으로 사용되는 경우, 기존의 탈모 치료제와는 전혀 다른 방식으로 모발 성장을 촉진시킨다. 구체적으로, 본 발명의 HAPLN1 단백질은 비정규(non-canonical) 신호전달 경로를 활성화시키며, 이 때 비정규(non-canonical) 신호전달 경로는 TGF-β 단백질로 활성화되는 ERK1/2 신호전달 경로이다. 이를 통해, HAPLN1은 모모세포(hair germinal matrix cell)의 증식을 촉진시키고 모발을 성장시켜, 탈모 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
본 발명에서 최초로 밝힌 HAPLN1 단백질의 비정규(non-canonical) 신호전달 경로 활성화에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
TGF-β 신호전달 기전과 관련하여, 모모세포가 TGF-β에 의해 자극을 받으면 TGF-β는 모모세포의 TGF-β receptor 2(TβRII)와 결합한다. 이후 TβRII는 TGF-β receptor 1(TβRI)과 결합하여 TβR 복합체(TβR complex)를 형성한다. TβR 복합체는 내포작용에 의해 세포 내로 들어가게 되는데, Clathrin에 의한 내포작용 시 Smad2/3 신호전달을 통해 세포 주기가 차단된다(cell cycle arrest). 이 경로는 정규적 신호전달 경로(canonical pathway)이다. 반면 Caveolin-1에 의한 내포작용 시 Smad7 신호전달을 통해 TβRI과 TβRII은 최종적으로 분해되게 된다. 이러한 과정에서도 TGF-β 신호전달 경로가 작동되는데, 정규적인 Smad 기전(canonical Smad pathway)과는 별개로 비정규적인 경로(non-canonical pathway)의 Ras-ERK1/2 기전이 존재하는데, 이러한 Ras-ERK1/2 신호전달이 활성화될 경우 나타나는 결과는 세포 증식이다.
본 발명에서는 HAPLN1이 TGF-β 신호전달 기전에서 Ras-ERK1/2 경로, 즉, 비정규적인 경로(non-canonical pathway)를 활성화시킨다는 사실을 최초로 밝혔다(도 3). 구체적인 기전을 살펴보면, 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 세포의 히알루론산 합성 효소 2(hyaluronan synthase 2, HAS2)에 의해 생성된다. HA는 세포막의 CD44(HA의 수용체)와 결합하고, CD44는 TβR과 결합한다. 즉, HA는 TβR과 간접적으로 결합되어 있다. HA의 내포작용이 일어나기 위해서는 히알루로니다아제(hyaluronidase, HYAL2)의 HA 분해가 필수적이다. HAPLN1은 HA와 프로테오글리칸을 연결시켜 HA의 안정화를 유도한다. HAPLN1은 HA를 프로테오글리칸으로 촘촘하게 둘러싸게 하여 HYAL2가 HA를 분해시키는 것을 억제하거나, 활성산소(reactive oxygen species, ROS)에 의한 HA 분해를 억제한다. 그 결과, HAPLN1은 TβR의 내포작용을 억제하여 Smad2/3 기전 활성 및 TβR의 분해를 막고 세포막의 TβRII를 증가시킨다. 이에 따라 HAPLN1에 의해 비정규(non-canonical) 신호전달 경로, 즉, Ras-ERK1/2 기전이 활성화되며 세포증식이 촉진되고 결국 모발 성장으로 이어진다.
따라서 본 발명의 HAPLN1 단백질은 TGF-β 단백질로 활성화되는 Ras-ERK1/2 신호전달을 통해 세포증식을 촉진하며, 탈모 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 HAPLN1 단백질은 모모세포(hair germinal matrix cell)의 증식을 촉진시켜 모발을 성장시킨다.
본 발명의 "탈모"는, 그 원인과 무관하게, 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 지칭하며, 예를 들어, 남성형 탈모, 여성형 탈모, 원형 탈모, 또는 휴지기성 탈모일 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 HAPLN1을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물로는 예를 들어, 모발용 화장료일 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다.
예를 들면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 샴푸, 린스, 바디클렌저 등의 세정료, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물 일 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서 상기 화장료 조성물은 필요에 따라 적절한 각종의 기제와 첨가제를 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예를 들면, 당업계에 통상적인 방부제, 색소, 첨가제 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
각 모발 성장 주기에서 HAPLN1 단백질 및 HAPLN1 mRNA 발현 확인
본 실시예에서는 마우스 피부를 이용하여 각 모발 성장 주기에서 HAPLN1 단백질의 발현을 확인하였다.
마우스 피부는 생후 23일령(초기 성장기), 생후 32일령(성장기), 생후 40일령(퇴화기), 생후 44일령(휴지기)에서 채취하였으며, 신선 동결(fresh frozen) 하였다. 피부 조직 절편은 8 μm 두께로 제작되었으며, HAPLN1(Abcam, USA) 항체를 이용하여 HAPLN1 단백질의 존재 유무를 검출하였다. 면역형광법(immunofluorescence)은 보편적인 실험 방법을 따라 진행하였다.
그 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이, HAPLN1은 성장기의 모모세포에서 상당히 발현되어 있음을 확인하였고, 퇴화기, 휴지기에선 발현이 줄어들었음을 확인하였다.
이어서 HAPLN1이 어떤 세포에서 생성되는지 알아보기 위해 마우스 피부에서 HAPLN1 mRNA를 확인하였다.
마우스 피부는 생후 32일령(성장기), 생후 40일령(퇴화기), 생후 44일령(휴지기)에서 채취하였으며, 피부조직 절편은 8 μm 두께로 파라핀 박절하였다. HAPLN1 mRNA probe(ACDbio, USA)를 이용하여 검출하였고, in-situ hybridization 실험은 제조사의 실험방법(ACDbio; RNAscope® 2.5 HD Assay-BROWN, CA, USA)을 따라 수행되었다.
그 결과는 도 5에 나타낸 바와 같이, HAPLN1 mRNA는 성장기의 모모세포에서 발현되는 것을 확인하였고, 퇴화기, 휴지기에선 발현이 확인되지 않았다.
[실시예 2]
인간 모모세포에서 HAPLN1에 의한 TβRII 단백질 증가 확인
본 실시예에서는 HAPLN1이 TβRII의 분해를 막아 그 양을 증가시키는지 여부를 확인하였다.
HAPLN1을 인간 모모세포에 농도별로 처리하였다. 구체적으로 인간 모모세포(human hair germinal matrix cell; HHGMC)를 poly-D-lysine 6 well plate에 각 well 당 5.0 × 104 개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 혈청이 들어가지 않은 새 배지로 바꾸어주었다. HAPLN1을 0, 5, 10, 20 ng/mL로 처리하고 24시간동안 배양하였다. 세포를 모은 후 lysis buffer(25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 % Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor)를 넣어주고 초음파 처리(sonication)를 통해 세포를 전부 깨주었다. Western blotting을 이용하여 해당 시료에서 TβRII를 측정하였다. 농도계(densitometer)를 이용하여 GAPDH 대비 각 TβRII의 광학적 농도를 비교하였다(즉, TβRII 광학적 농도 ÷ GAPDH 광학적 농도). 이 때 GAPDH는 로딩 대조군(loading control)으로 사용되었다.
그 결과는 도 6에 나타낸 바와 같이, HAPLN1 20 ng/mL에서 TβRII가 증가함이 확인되었다.
이로부터 인간 모모세포에 HAPLN1을 처리하면 TβRII가 증가함을 확인하였다.
[실시예 3]
인간 모모세포에서 HAPLN1 및/또는 HA에 의한 TβRII 단백질 증가 확인
HAPLN1은 TGF-β 신호전달 경로에서 TβRII에 직접 작용하는 것이 아닌 HA를 안정화시킴으로써 TβRII에 영향을 미친다고 가정하였는바, 이를 확인하기 위해 HAPLN1과 HA를 같이 처리하는 실험을 수행하였다.
인간 모모세포를 poly-D-lysine 6 well plate에 각 well 당 5.0 Х 104 개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 혈청이 들어가지 않은 새 배지로 바꾸어주었다. HAPLN1을 25 ng/mL, HA를 25 μg/mL로 처리하고 1시간 뒤 TGF-β2(2 ng/mL)를 처리하였다. 23시간 뒤 세포를 모은 후 lysis buffer(25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 % Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor)를 넣어주고 초음파 처리(sonication)를 통해 세포를 전부 깨주었다. Western blotting을 이용하여 해당 시료에서 TβRI 및 TβRII를 측정하였다. 농도계를 이용하여 GAPDH 대비 각 TβRII의 광학적 농도를 비교하였다.
그 결과는 도 7에 나타낸 바와 같이, 인간 모모세포에 HAPLN1 또는 HA를 처리하였을 때 TβRII의 증가를 확인하였다.
이로부터 HAPLN1 단독 처리 시 TβRII가 현저하게 증가한 것을 재확인하였고, 특히 HAPLN1이 HA에 의한 TβRII의 증가를 더욱 강화시켜준다는 것을 확인하였다. 이에 반해, TβRI의 농도에는 변화가 없었으므로, HAPLN1에 의한 TβRII의 증가는 선택적이라 할 수 있다.
[실시예 4]
인간 모모세포에서 TβRII 단백질 농도에 대한 내인성 HAPLN1 결핍 효과 확인
인간 모모세포의 TβRII 단백질 농도에 대한 내인성 HAPLN1의 영향을 확인하고자 HAPLN1 siRNA를 사용하여 내인성 HAPLN1을 결핍시켰다.
인간 모모세포를 poly-D-lysine 6 well plate에 각 well 당 5.0 Х 104 개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 low serum 배지로 바꾸어 주었다. HAPLN1 siRNA 및 scrambled siRNA를 well당 25 pmol 씩 넣어주고 24시간 배양하였다. 세포를 모은 후 lysis buffer(25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 % Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor)를 넣어주고 초음파 처리(sonication)를 통해 세포를 전부 깨주었다. Western blotting을 이용하여 해당 시료에서 HAPLN1 및 TβRII를 측정하였다. 농도계를 이용하여 GAPDH 대비 각 HAPLN1 및 TβRII의 광학적 농도를 비교하였다.
그 결과는 도 8에 나타낸 바와 같이, 인간 모모세포에 HAPLN1 siRNA를 처리하여 내인성 HAPLN1을 결핍시킴에 따라 TβRII도 줄어든 것을 확인하였다.
[실시예 5]
내인성 HAPLN1이 결핍된 인간 모모세포에서 TβRII 단백질 농도에 대한 외인성 HAPLN1 및/또는 HA의 효과 확인
HAPLN1 siRNA를 이용해 HAPLN1을 결핍시킨 인간 모모세포에 외인성 HAPLN1 및/또는 HA에 의한 TβRII 단백질 증가 여부를 확인하였다.
인간 모모세포를 poly-D-lysine 6 well plate에 각 well 당 5.0 Х 104 개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 low serum 배지로 바꾸어 주었다. HAPLN1 siRNA 및 scrambled siRNA를 well당 25 pmol 씩 넣어주고 24시간 배양하였다. siRNA 및 배지를 모두 제거한 후 HAPLN1(25 ng/mL) 또는 HA(25 μg/mL)가 첨가된 serum-free 배지로 교체하고 1시간 배양하였다. TGF-β2(2 ng/mL)을 처리하고 23시간 배양하였다. 세포를 모은 후 lysis buffer(25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 % Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor)를 넣어주고 초음파 처리(sonication)를 통해 세포를 전부 깨주었다. Western blotting을 이용하여 해당 시료에서 TβRII를 측정하였다. 농도계를 이용하여 GAPDH 대비 TβRII의 광학적 농도를 비교하였다.
그 결과는 도 9에 나타낸 바와 같이, 내인성 HAPLN1이 결핍된 인간 모모세포에 외인성 HAPLN1 및/또는 HA를 처리하자 줄어들었던 TβRII가 회복됨을 확인할 수 있었다.
[실시예 6]
내인성 HA가 결핍된 인간 모모세포에서 TβRII 및 HAS2 단백질 농도에 대한 외인성 HAPLN1의 효과 확인
4-MU(4-methylumbelliferone)은 HA를 생성하는 HAS2(hyaluronan synthase 2)의 억제제이다. 세포에서 생성되는 HA의 영향을 확인하고자 4-MU를 사용하여 세포의 HA 생성을 억제시켰다.
4-MU를 처리하여 내인성 HA가 억제된 인간 모모세포를 poly-D-lysine 6 well plate에 각 well 당 5.0 Х 104 개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 혈청이 들어가지 않은 새 배지로 바꾸어주었다. HAPLN1을 25 ng/mL로 처리하고 1시간 뒤 TGF-β2(2 ng/mL)를 처리하였다. 23시간 뒤 세포를 모은 후 lysis buffer(25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 % Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor)를 넣어주고 초음파 처리(sonication)를 통해 세포를 전부 깨주었다. Western blotting을 이용하여 해당 시료에서 HAS2 및 TβRII를 측정하였다. 농도계를 이용하여 GAPDH 대비 HAS2 및 TβRII의 광학적 농도를 비교하였다.
그 결과는 도 10에 나타낸 바와 같이, 4-MU 처리시에는 HAS2 및 TβRII의 양이 줄어들었고, 여기에 HAPLN1을 처리하자 HAS2 및 TβRII가 회복되는 것을 확인하였다.
[실시예 7]
실시예 3에서 HAPLN1은 HA를 통해 TβRII를 조절함이 확인된 바 있다. 그러나 HA도 TβRII와 직접 결합하고 있는 것은 아니며, HA의 수용체인 CD44가 TβRII와 결합하고 있다.
본 실시예에서는 CD44는 TβRII 조절 과정에서의 중요한 요소 중 하나인지, 그리고 실제로 HAPLN1이 TβRII를 증가시키는 과정에서 CD44가 필수적인지 확인하였다.
1. 인간 모모세포에서 TβRII 단백질 농도에 대한 CD44 결핍의 효과 확인
우선, 인간 모모세포에 CD44가 결핍될 경우 TβRII 단백질 농도가 어떻게 변화되는지를 확인하였다.
CD44 siRNA를 처리하여 세포 내 CD44를 결핍시킨 인간 모모세포를 poly-D-lysine 6 well plate에 각 well 당 5.0 Х 104 개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 low serum 배지로 바꾸어 주었다. CD44 siRNA 및 scrambled siRNA를 well당 25 pmol씩 넣어주고 24시간 배양하였다. 세포를 모은 후 lysis buffer(25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 % Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor)를 넣어주고 초음파 처리(sonication)를 통해 세포를 전부 깨주었다. Western blotting을 이용하여 해당 시료에서 CD44 및 TβRII를 측정하였다. 농도계를 이용하여 GAPDH 대비 CD44 및 TβRII의 광학적 농도를 비교하였다.
그 결과는 도 11에 나타낸 바와 같이, CD44의 결핍시 인간 모모세포에서 TβRII 단백질 농도가 상당히 줄어든 것을 확인하였다.
2. CD44가 결핍된 인간 모모세포에서 TβRII 단백질 농도에 대한 HAPLN1 및/또는 HA의 효과 확인
이어서, CD44가 결핍된 인간 모모세포에서 TβRII 단백질 농도에 대한 HAPLN1 및/또는 HA의 효과를 확인하였다.
CD44 siRNA를 이용해 CD44를 결핍시킨 인간 모모세포를 poly-D-lysine 6 well plate에 각 well 당 5.0 Х 104 개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 low serum 배지로 바꾸어 주었다. CD44 siRNA 및 scrambled siRNA를 well당 25 pmol 씩 넣어주고 24시간 배양하였다. siRNA 및 배지를 모두 제거한 후 HAPLN1(25 ng/mL) 또는 HA(25 μg/mL)가 첨가된 serum-free 배지로 교체하고 1시간 배양하였다. TGF-β2(2 ng/mL)을 처리하고 23시간 배양하였다. 세포를 모은 후 lysis buffer(25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 % Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor)를 넣어주고 초음파 처리(sonication)를 통해 세포를 전부 깨주었다. Western blotting을 이용하여 해당 시료에서 TβRII를 측정하였다. 농도계를 이용하여 GAPDH 대비 TβRII의 광학적 농도를 비교하였다.
그 결과는 도 12에 나타낸 바와 같이, 인간 모모세포에 CD44가 결핍된 경우, HAPLN1 및/또는 HA를 처리하더라도 TβRII가 회복되는 것을 확인할 수 없었다.
위 실험으로부터 HAPLN1 및 HA가 TβRII를 증가시키는 과정에 CD44가 필수적인 요소라는 것을 확인하였다.
[실시예 8]
세포막 TβRII 단백질 농도에 대한 HAPLN1 및/또는 HA의 효과 확인
HAPLN1이 TβRII의 내포작용을 억제하여 세포막 TβRII 증가를 초래할 것이라고 가정하였는바, 이를 증명하기 위한 실험을 수행하였다.
세포막에 존재하는 모든 단백질을 biotin으로 표지하고, Biotin 항체로 immunoprecipitation을 수행하여 세포막 단백질만을 분리하였다. 세포막 단백질 중 TβRII의 비율 변화를 확인하기 위해 western blotting을 수행하였다. 구체적인 실험 방법은 아래와 같다.
인간 모모세포를 poly-D-lysine 100 mm dish에 2.7 Х 106 개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 혈청이 들어가지 않은 새 배지로 바꾸어주었다. HAPLN1을 25 ng/mL, HA를 25 μg/mL로 처리하고 1시간 뒤 TGF-β2(2 ng/mL)를 처리하였다. 23시간 뒤 biotin을 표지하기 위해, EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 250 μg/mL 농도로 처리하고 4℃, 1시간 배양하였다. 50 mM Tris-HCl을 처리하여 biotin 표지 반응을 종결시켰다. 세포를 모은 후 lysis buffer(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor)를 넣어주고 초음파 처리(sonication)를 통해 세포를 전부 깨주었다. Anti-biotin 항체를 이용하여 immunoprecipitation 실험을 수행하여 세포막 단백질을 분리하였다. Western blotting을 이용하여 분리한 세포막 단백질 시료에서 TβRII를 측정하였다. 농도계를 이용하여 GAPDH 대비 각 TβRII의 광학적 농도를 비교하였다.
그 결과는 도 13에 나타낸 바와 같이, HAPLN1 및/또는 HA를 처리시 세포막 TβRII 단백질 농도가 증가하는 것을 확인하였다.
[실시예 9]
HAPLN1의 세포증식 효과 및 작용기전 규명
본 실시예에서는 HAPLN1이 어떤 기전으로 세포 증식을 유도하는지를 알아보기 위해 Smad2 pathway 및 ERK1/2 pathway에 대한 HAPLN1의 효과를 확인하였다.
인간 모모세포를 poly-D-lysine 6 well plate에 각 well 당 5.0 Х 104 개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 혈청이 들어가지 않은 새 배지로 바꾸어주었다. HAPLN1을 25 ng/mL, HA를 25 μg/mL로 처리하고 23시간 배양한 뒤 TGF-β2(2 ng/mL)로 1시간 동안 자극을 주었다. 세포를 모은 후 lysis buffer(25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 % Triton-X100, phosphatase inhibitor, and protease inhibitor)를 넣어주고 초음파 처리(sonication)를 통해 세포를 전부 깨주었다. Western blotting을 이용하여 해당 시료에서 p-ERK1/2, p-Smad2, p-MEK1/2, p-c-Raf를 측정하였다. 농도계를 이용하여 ERK1/2, Smad2/3, MEK1, c-Raf 대비 p-ERK1/2, p-Smad2, p-MEK1/2, p-c-Raf의 광학적 농도를 비교하였다. 이 때 ERK1/2, Smad2/3, MEK1, c-Raf는 로딩 대조군(loading control)로 사용되었다.
그 결과는 도 14 내지 도 16에 나타낸 바와 같이, HAPLN1 및/또는 HA를 처리한 세포에서는 TGF-β2에 의한 ERK1/2 신호전달이 활성화되었다. 또한 HAPLN1은 HA의 ERK1/2 신호전달 활성화를 강화시켜준다는 것을 확인하였다. 반면 Smad2의 인산화에는 변화가 없었다. 또한 ERK1/2의 상위 기전(upstream)인 MEK1/2와 c-Raf도 HAPLN1 및/또는 HA 처리에 의해 활성이 증가한 것을 확인하였다.
이로부터 HAPLN1에 의해 ERK signal이 활성화됨을 확인하였고, 이는 non-canonical pathway를 통해 신호전달이 이루어짐을 나타낸다. 그러나 HAPLN1은 Smad2/3의 canonical pathway는 활성화시키지 않음을 확인하였다.
[실시예 10]
HAPLN1의 세포증식 효과 및 작용기전 규명
인간 모모세포를 poly-D-lysine 96 well plate에 각 well 당 2.0 Х 103 개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 혈청이 들어가지 않은 새 배지로 바꾸어주었다. HAPLN1을 25 ng/mL, HA를 25 μg/mL로 처리하고 1시간 배양한 뒤 TGF-β2(2 ng/mL)로 23시간 동안 자극을 주었다. CCK-8(Enzo Biochem, NY, USA)을 처리하고 37℃, 1시간 배양하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
TGF-β2 존재 시 HAPLN1 및/또는 HA를 처리한 군에서 대조군보다 세포증식이 촉진된 것을 확인하였다. 이는 HAPLN1이 non-canonical TGF-β 신호전달 경로를 통해 인간 모모세포의 증식을 촉진시킴을 의미한다.
[실시예 11]
각 모발 성장 주기에서 HAPLN1 단백질 및 TβRII 단백질 발현 확인
본 실시예에서는 마우스 피부의 각 모발 주기에서 HAPLN1과 TβRII를 형광염색하여, HAPLN1 단백질 및 TβRII 단백질의 발현을 확인하였다.
마우스 피부는 생후 32일령(성장기), 생후 40일령(퇴화기), 생후 44일령(휴지기)에서 채취하였으며, 신선동결(fresh frozen) 하였다. 피부조직 절편은 8 μm 두께로 제작되었으며, HAPLN1(Abcam, USA) 항체와 TβRII 항체를 이용하여 HAPLN1 및 TβRII 단백질의 존재 유무를 검출하였다. 면역형광법(immunofluorescence)은 보편적인 실험 방법을 따라 진행하였다.
그 결과는 도 18에 나타낸 바와 같이, HAPLN1은 성장기의 모모세포에서 발현되어 있음을 확인하였고, 퇴화기, 휴지기에선 발현이 줄어들었음을 확인하였다. 또한 성장기(Aangen)의 모모세포(hair germical matrix)에서 HAPLN1 및 TβRII가 같은 위치에 발현하고 있는 것을 확인하였다(co-localization). 이는 HAPLN1 및 TβRII가 인간 모모세포의 증식에 기여한다는 것을 의미한다.
[실시예 12]
동물 모델에서 HAPLN1에 의한 모발 성장 주기 변화 관찰
1. 마우스의 모발 성장에 대한 HAPLN1의 복강 전신 투여의 효과 확인
체내 HAPLN1은 나이가 들수록 줄어든다. 체내 HAPLN1이 줄어든 20개월령 C57 마우스에 HAPLN1을 투여하였다.
C57 마우스는 모발 성장 주기가 제각각이기 때문에 두 번의 모발 성장 주기를 거쳐 모든 마우스의 주기를 일정하게 맞춰주었다(도 19 스케줄 참조). 그 후 3일에 한번씩 HAPLN1을 0.1 mg/kg으로 복강주사하였다.
그 결과는 도 19에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하였을 때, HAPLN1을 처리한 군에서 단기간에 모발 성장기로 진입하였다.
2. 마우스의 모발 성장에 대한 HAPLN1 siRNA의 복강 전신 투여의 효과 확인
HAPLN1 siRNA를 7주령 C57 마우스에 투여하여, HAPLN1 결핍에 따라 모발 성장 주기가 어떻게 변화하는지 관찰하였다. 이를 위해 HAPLN1 siRNA(Dharmacon; Accell HAPLN1 siRNA SMARTpool, CO, USA)를 일주일에 두 번 4 nmol씩 4주 동안 복강주사 하였다(도 20 스케줄 참조).
그 결과는 도 20에 나타낸 바와 같이, HAPLN1 siRNA를 투여한 군이 대조군에 비해 모발 성장기로의 진입이 더뎌진 것을 확인하였다.
[실시예 13]
HAPLN1, CX3CL1 및 CDON의 모유두세포 또는 모모세포 증식효과 검증
미국특허등록공보 제8,334,136호는, 모유두세포에 존재하는 HAPLN1, CX3CL1, CDON 등의 세포접착유전자의 발현을 유지 또는 증가시키면 모낭 형성 또는 모발 재생이 촉진될 수 있다는 가능성을 제시하고 있다. 본 실시예에서는 상기 세포접착유전자들이 발현하는 HAPLN1, CX3CL1 또는 CDON 단백질을 모유두세포 또는 모모세포에 직접 처리하였을 때, 실제로 증식효과가 발현되는지 여부를 검증하였다.
1. 모유두세포 증식효과 확인
인간 모유두세포를 모유두세포 증식 배지(Promocell)를 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 세포가 90% 정도 차게 되면 0.05% Trypsin/EDTA 용액으로 세포를 탈부착 시킨 후, 1000 rpm, 3분 동안 원심분리하여 세포만 회수하였다. 이를 96 well plate에 각 well 당 2.0 Х 103 개씩 분주하여 24시간 배양하고, serum-free 배지에 HAPLN1, CX3CL1 및 CDON 각각의 최종 농도가 25 ng/ml이 되도록 희석시켰다. 기존 배양 배지를 제거한 후, 희석시킨 HAPLN1, CX3CL1 및 CDON을 각 well에 200 μl씩 분주하고 1시간 동안 배양하였다. 실험의 편차를 줄이기 위해 그룹 당 3개의 well씩 처리하였다 (triplication). 또한, 모유두세포를 증식시키는 것으로 알려진 미녹시딜 (Minoxidil)을 10 μM 처리하여 양성대조군으로 설정하였다.
상기 희석 방법과 동일하게 HAPLN1 (25 ng/ml), CX3CL1 (25 ng/ml), CDON (25 ng/ml) 또는 미녹시딜(10 μM), 및 human recombinant TGF-β2를 최종 농도가 2 ng/ml이 되도록 희석시킨 후, TGF-β2가 포함되는 그룹의 배지를 200 μl씩 교환해주었다. 실험의 편차를 줄이기 위해 그룹 당 3개의 well씩 처리하였다(Triplicate).
23시간 동안 배양 후 배양기에서 플레이트를 꺼내 배지와 시약이 포함된 채로 CCK-8(WST-8) 용액을 200 μl 배지 당 20 μl 첨가하여 1시간 동안 37℃, 배양기에서 반응시킨 후 microplate reader기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, TGF-β2가 존재하거나 존재하지 않는 경우, 미녹시딜을 처리한 양성대조군에서는 유의한 모유두세포 증식 활성이 확인되었으나(***P<0.001), HAPLN1, CX3CL1 및 CDON는 모두 모유두세포를 증식시키지 못하거나 오히려 증식을 억제하였다. 즉, 모유두세포 내 세포접착유전자가 발현하는 단백질을 모유두세포에 투여하더라도, 모유두세포의 증식효과는 나타나지 않는 것을 알 수 있다.
2. 모모세포 증식효과 확인
인간 모모세포를 Mesenchymal Stem Cell Medium(MSCM)을 이용하여 poly-D-lysine이 코팅된 플라스크에 풀어서 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 세포가 90% 정도 차게 되면 0.05% Trypsin/EDTA 용액으로 세포를 탈부착 시킨 후 1000 rpm, 3분 동안 원심분리 하여 세포만 회수하였다. 이를 96 well poly-D-lysine coated plates(BD bioscience)에 각 well 당 2.0 Х 103 개씩 분주하여 24시간 배양하고, serum-free 배지에 HAPLN1, CX3CL1 및 CDON 각각의 최종 농도가 25 ng/ml이 되도록 희석시켰다. 이후의 과정은 상기 모유두세포에 대한 실험과 동일하게 진행하여 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, HAPLN1은 TGF-β2가 존재하지 않는 환경에서 유의한 모모세포 증식활성을 나타냈고(*P<0.05), TGF-β2가 존재하는 환경에서는 특히 월등한 모모세포 증식활성을 나타내어(***P<0.001), TGF-β 신호전달 경로를 통해 인간 모모세포의 증식효과를 갖는 것이 확인되었다. 반면, CX3CL1 및 CDON는 모유두세포의 경우와 마찬가지로 모모세포에서도 오히려 세포증식을 억제하는 결과를 보였다.
결국, 미국특허등록공보 제8,334,136호는 모유두세포에 존재하는 세포접착유전자의 발현을 유지 또는 증가시키면 모낭 형성 또는 모발 재생이 촉진될 수 있다는 가능성을 언급하지만, 실제로 세포접착유전자들이 발현하는 단백질이 모두 모유두세포 또는 모모세포를 증식시키는 것은 아닌 것을 확인할 수 있다.
따라서, HAPLN1 단백질만이 모모세포의 증식을 촉진하고 모발을 성장시켜, 탈모 예방 또는 치료 효과를 가지는 것을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1)을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HAPLN1은 비정규(non-canonical) 신호전달 경로를 활성화시키며, 상기 비정규(non-canonical) 신호전달 경로는 TGF-β 단백질로 활성화되는 Ras-ERK1/2 신호전달 경로인 것을 특징으로 하는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 HAPLN1은 모모세포(hair germinal matrix cell)의 증식을 촉진시켜 모발을 성장시키는 것을 특징으로 하는 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 탈모는 남성형 탈모, 여성형 탈모, 원형 탈모, 또는 휴지기성 탈모인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1)을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 HAPLN1은 비정규(non-canonical) 신호전달 경로를 활성화시키며, 상기 비정규(non-canonical) 신호전달 경로는 TGF-β 단백질로 활성화되는 Ras-ERK1/2 신호전달 경로인 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 HAPLN1은 모모세포(hair germinal matrix cell)의 증식을 촉진시켜 모발을 성장시키는 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.
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