WO2020213745A1 - 皮膚抗老化のための方法および装置 - Google Patents

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WO2020213745A1
WO2020213745A1 PCT/JP2020/017099 JP2020017099W WO2020213745A1 WO 2020213745 A1 WO2020213745 A1 WO 2020213745A1 JP 2020017099 W JP2020017099 W JP 2020017099W WO 2020213745 A1 WO2020213745 A1 WO 2020213745A1
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skin
stimulus
extension
beauty
cells
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PCT/JP2020/017099
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大悟 井上
聡 堀場
曽我部　敦
知輝 高垣
那須　美恵子
大谷　毅
智哉 内山
高橋　明子
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株式会社 資生堂
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    • A61H2205/02—Head
    • A61H2205/022—Face

Definitions

  • the present invention relates to a method and device for skin anti-aging, in particular, a method and device for skin anti-aging including applying a physical stimulus performed at a frequency of 60 Hz or less to the target skin.
  • Skin aging is a change in the skin mediated by various factors including internal factors such as aging, hormones and metabolism, and external factors such as ultraviolet rays and dryness. Skin aging may be judged from the appearance such as spots, wrinkles, sagging, and deflation, but invisible aging such as changes in the structure and constituents of the internal tissues of the skin may be progressing. It is difficult to take preventive measures because such aging often progresses without being noticed. It is important to take appropriate measures to prevent and improve skin aging.
  • Patent Document 1 discloses an electroactive material actuator that causes displacement of a keratinous substance.
  • Patent Document 2 discloses a light-irradiating beauty device that irradiates light with the skin stretched.
  • Patent Document 3 discloses a slimming method for reducing subcutaneous fat by combining a stretch that stretches subcutaneous adipocytes and an external skin preparation containing an adipocyte accumulation inhibitor and / or an adipocyte differentiation inhibitor.
  • Patent Document 4 discloses an extension-stimulating-mediated collagen-degrading enzyme production inhibitor containing an extract of a plant of the genus Oat or an extract of a plant of the genus Psoralea.
  • Patent Document 5 discloses a wrinkle improving agent or an NF- ⁇ B activity inhibitor caused by extension stress.
  • Non-Patent Document 1 recommends mechanical stimulation at 65 to 85 Hz.
  • Patent Document 6 related to the apparatus described in Non-Patent Document 1 discloses a terminal effector that stimulates the skin at a frequency of about 65 to about 120 Hz.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • An object of the present invention is to provide a method and an apparatus for skin anti-aging.
  • a cosmetic method for skin anti-aging in a subject which includes a step of applying a weak physical stimulus to the skin, wherein the step includes, for example, (a) 0.1% or more of the subject's skin.
  • a beauty device for skin anti-aging The device is The stimulus generator that causes physical stimulus and It is equipped with a stimulus-giving part that gives the physical stimulus generated in the stimulus-generating part to the skin.
  • the device is a device for performing a step of applying a weak physical stimulus to the skin, and the step is described here, for example.
  • the extension rate is calculated by the above formula 1, the beauty device.
  • a beauty method for skin anti-aging which comprises applying the beauty device according to (5) to the target skin.
  • a subject's cosmetology act including presenting the cosmetology method according to any one of (1) to (4), (6) and (7) or the cosmetology device according to (5) to the subject.
  • a method and an apparatus that exerts a preferable skin anti-aging effect on a shallow layer such as the epidermis.
  • a shallow layer such as the epidermis.
  • FIG. 1 shows the setting of the extension stimulus performed in Experiments 1 and 3.
  • FIG. 2a shows the localization of YAP (red) and actin (green) in the monolayer culture of keratinocytes obtained from a 44-year-old donor in Experiment 1 in the state without extension stimulation and immediately after application.
  • FIG. 2b shows YAP (red) and actin in the state where the monolayer culture of keratinocytes obtained from donors (0 years old, 18 years old, 64 years old) of each age in Experiment 1 was not stimulated for extension and immediately after the application. (Green) indicates localization.
  • FIG. 1 shows the setting of the extension stimulus performed in Experiments 1 and 3.
  • FIG. 2a shows the localization of YAP (red) and actin (green) in the monolayer culture of keratinocytes obtained from a 44-year-old donor in Experiment 1 in the state without extension stimulation and immediately after application.
  • FIG. 2b shows YAP (red) and actin in the state where the
  • FIG. 3 shows the number of cells having nuclear localization YAP in the state where the keratinocyte culture obtained from donors (0 years old, 18 years old, 62 years old) of each age in Experiment 1 was not subjected to extension stimulation and immediately after the application. Shows the percentage. In the figure, * indicates that there is a significant difference due to the two-sided t-test (when the variances of the two populations are equal) (p ⁇ 0.05%).
  • FIG. 4 shows the ratio of the number of cells having actin stress fibers immediately after the keratinocyte culture obtained from donors (0 years old, 18 years old, 62 years old) of each age in Experiment 1 without the extension stimulation. Is shown.
  • FIG. 5 shows YAP (red), actin (green), and actin (green) in the state where the culture of fibroblasts obtained from donors (0 years old, 68 years old) of each age in Experiment 1 was not stimulated for extension and immediately after the culture was given. Shows the localization of the nucleus (blue).
  • FIG. 6 shows the device used in Experiment 2 and an ex vivo skin sample.
  • FIG. 7 shows the setting of the extension stimulus performed in Experiments 2, 4 and 5.
  • FIG. 5 shows YAP (red), actin (green), and actin (green) in the state where the culture of fibroblasts obtained from donors (0 years old, 68 years old) of each age in Experiment 1 was not stimulated for extension and immediately after the culture was given. Shows the localization of the nucleus (blue).
  • FIG. 6 shows the device used in Experiment 2 and an ex vivo skin sample.
  • FIG. 7 shows the setting of the extension stimulus performed in Experiments 2, 4 and 5.
  • FIG. 8 shows the localization of YAP (green) and nuclei (blue) immediately after the skin sample obtained from a 44-year-old donor in Experiment 2 without pressing stimulus.
  • FIG. 9 shows a condition in which a monolayer culture of keratinocytes obtained from a 44-year-old donor in Experiment 3 was not given a stretch stimulus, a condition in which one stretch stimulus was given, and a condition in which two stretch stimuli were given. After that, the localization of YAP and BrdU after 1 week of normal culture is shown.
  • FIG. 10 shows the device and skin sample used in Experiment 4. In FIG.
  • FIG. 14 shows an example of the apparatus of the present invention.
  • FIG. 15a shows the measurement results by the vaporometer and the corneometer in Experiment 6. * Indicates that there is a significant difference from the value on day 0 in dunnett's test (***: p ⁇ 0.005, **: p ⁇ 0.01, *: p ⁇ 0.05).
  • FIG. 15b shows the R0 value by the cute meter in Experiment 6.
  • FIG. 15c shows the results of the subjective evaluation in Experiment 6. * Indicates that there is a significant difference from the value on day 0 in the Wilcoxon signed rank test (***: p ⁇ 0.005, **: p ⁇ 0.01, *: p ⁇ 0.05).
  • the upper left of FIG. 16 shows the setting of Experiment 7.
  • the upper right of FIG. 16 shows an example (rectangular wave) of the waveform of the pressing stimulus of Experiment 7.
  • FIG. 16 shows the conditions of the pressing stimulus of Experiment 7 (waveform: Shape of wave, frequency: Frequency / Hz, depth: Displacement / ⁇ m, period: Day).
  • FIG. 17 shows a condition in which two skin samples (samples # 1 and # 2) obtained from a 44-year-old donor in Experiment 7 were not subjected to a pressing stimulus (Cont) and a condition in which a square wave pressing stimulus was applied (0.5 Hz / The localization of Ki67 (green) and nucleus (blue) on the 1st day (d1) and the 5th day (d5) at 100 ⁇ m) is shown.
  • FIG. 17 shows a condition in which two skin samples (samples # 1 and # 2) obtained from a 44-year-old donor in Experiment 7 were not subjected to a pressing stimulus (Cont) and a condition in which a square wave pressing stimulus was applied (0.5 Hz / The localization of Ki67 (green) and nucleus (blue)
  • FIG. 18 shows the first day under the conditions (Cont) and the conditions (square wave: 0.5 Hz, 5 Hz, 50 Hz / 100 ⁇ m) in which a single pressure stimulus was not applied to the skin sample obtained from a 44-year-old donor in Experiment 7.
  • the ratio of the number of cells showing Ki67 positive to the total number of cells on the (left) and the 5th day (right) is shown.
  • the upper part of FIG. 19 shows the setting of Experiment 8, and the lower part shows the waveform (square wave) of the pressure stimulus adopted.
  • FIG. 20a shows the results of Experiment 8, and the left shows the results on the 0th and 7th days when the pressing stimulus was applied and the right was not applied (control).
  • FIG. 20a is a measurement result by a corneometer.
  • FIG. 20b shows the results of Experiment 8, and the left shows the results on the 0th and 7th days when the pressing stimulus was applied and the right was not applied (control).
  • FIG. 20b is a measurement result using a vapor meter.
  • FIG. 20c shows the results of Experiment 8, and the left shows the results when the pressing stimulus was not applied (control), and the right shows the results on the 0th and 7th days when the pressing stimulus was applied.
  • FIG. 20c shows the R0 value by the cute meter. * Indicates that there is a significant difference from the value on day 0 in dunnett's test (*: p ⁇ 0.05).
  • the present inventors focused on the surface layer of the skin and conducted diligent research. As a result, we found that the behavior of YAP in keratinocytes and the structure of actin fibers are related to aging. For example, when a physical stimulus such as extension was applied to the skin, the proportion of cells with nuclear-localized YAP and actin stress fibers decreased significantly in aging keratinocytes. Furthermore, the present inventors have also found that the behavior of YAP and the structure of actin fibers are used as indicators of skin aging, and that when a specific physical stimulus is applied to the target skin, a favorable effect is exerted on the skin including the epidermis.
  • the present invention provides a method for skin anti-aging in a subject, which comprises applying a physical stimulus to the subject's skin.
  • the present invention also provides a device for skin anti-aging, which comprises a stimulus generating portion that generates a physical stimulus and a stimulating portion that imparts a physical stimulus generated in the stimulus generating portion to the skin.
  • the method of the present invention includes a step of applying a weak physical stimulus to the skin
  • the apparatus of the present invention is a device for performing a step of applying a weak physical stimulus to the skin.
  • a cycle including (a) stretching the skin to a stretch rate of 0.1% or more and 50.0% or less; and (b) recovering from the stretched state; may be performed at a frequency of 60 Hz or less. ..
  • the extension rate is calculated by the above formula 1.
  • Physical stimulation may be performed at an extension rate of 0.001% or more and 80.0 or less, 0.01% or more and 60.0% or less, 0.1% or more and 50.0% or less, preferably 0.1% or more and 50.0% or less.
  • Extension speed refers to the speed (% / s) until the maximum extension rate (%) is reached in one cycle.
  • the recovery rate refers to the rate (% / s) of returning from the maximum extension rate to the non-extension state.
  • Extension speed / recovery speed is 0.010% / s-40% / s, 0.05% / s-30% / s, 0.10% / s-20% / s, 0.2% / s-15% / s, 0.3% / It may be carried out at any speed such as s to 10% / s.
  • the extension rate and recovery rate may be the same or different.
  • the method of the present invention includes a step of applying a weak physical stimulus to the skin
  • the apparatus of the present invention is a device for performing a step of applying a weak physical stimulus to the skin.
  • a cycle including (a-1) pressing the subject skin by 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m; and (b-1) recovering the subject skin from the pressed state; at a frequency of 60 Hz or less. It may be.
  • Pressing the skin from 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m means pressing the skin to a depth of 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m from the outermost surface of the skin.
  • the depth of pressing can be arbitrarily set from 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m, 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m, 10 ⁇ m to 300 ⁇ m, 10 ⁇ m to 100 ⁇ m, etc. from the outermost surface of the skin.
  • the frequency refers to the number of cycles per second when one cycle is the cycle of recovery from the start of extension or pressing to the non-extension or non-pressing state.
  • One cycle may include maintaining a stretched or pressed state for a period of time and / or resting in a non-extended or non-pressed state. For example, during one cycle, after (a') (a) and before (b), or after (a-1) and before (b-1), 0 seconds to 30 minutes, 1 second.
  • the frequency may be, for example, 0.0000001 Hz or more and 10 kHz or less, 0.000001 Hz or more and 1 kHz or less, 0.00001 Hz or more and 100 Hz or less, preferably 0.0001 Hz or more and 60 Hz or less, 0.0001 Hz or more and 10 Hz or less.
  • facial equipment, massage equipment, etc. include those that use electromagnetic waves with a frequency of about 0.3 to 300 MHz, such as RF waves, and those that use ultrasonic waves with a frequency of about 1 MHz to 7 MHz. Compared with these frequencies / frequencies, the frequencies adopted by the method / apparatus of the present invention are extremely low. If a strong frequency is applied to the skin like a conventional facial device, there is a risk of adverse effects such as redness, pressure marks, scratches, pain, and inflammation on the skin, but if a frequency like the present invention is adopted, the above risks Is low and allows non-invasive physical stimulation. This is because the present inventors have discovered that if the extension rate, pressing degree, frequency, etc. are too high, the stimulation is too strong, and it is preferable to gently stimulate the skin by adjusting these values to appropriate values. ..
  • low- and medium-frequency devices such as EMS devices are commercially available, they are designed to act especially in deep layers such as muscle and subcutaneous fat, and the effect on the skin surface layer as in the present invention is unknown. .. Further, such a device may be accompanied by a tingling stimulus when an electric current is passed even if the frequency is low, which is different from the present invention that gives a gentle stimulus to the skin.
  • the present invention enables a beauty method by a simple method of directly applying an extension or pressing stimulus to the skin without applying energy such as ultrasonic waves, electric current, or magnetic field. Further, the extension or pressing stimulus having such a frequency is a gentle stimulus, but has a good effect on both epidermal cells and dermis cells as described in Examples. Therefore, the use of the method / apparatus of the present invention is expected to have a cosmetic effect on the epidermis of the skin in the short term and on the dermis in the long term without adversely affecting the skin.
  • the physical stimulus may be by an instrument such as a facial device, an experimental device, a massage using human hands or instruments, a facial exercise, or may be achieved by contact or non-contact. ..
  • a mechanically generated physical stimulus is applied to the skin by using a device having a stimulus generating part that generates a physical stimulus and a stimulating part that applies the physical stimulus by contact or non-contact.
  • Physical irritation may be achieved, for example, by contact such as pulling, pressing, tapping, rubbing, aspirating, and / or displacement by applying a shock wave to the skin, for example, with something like ultrasound or air pressure. It may be achieved by non-contact such as letting.
  • Facial exercises include swelling the cheeks and opening the eyes. Examples of the massage include a massage using an instrument such as a hand or a roller by the subject to be treated or a practitioner such as a cosmetologist. However, it is not limited as long as it is within the range of the physical stimulation of the present invention.
  • Examples of the device of the present invention include a beauty device provided with a skin contact portion that contacts the skin of the user and gives the physical stimulus of the present invention.
  • a beauty device provided with a skin contact portion that contacts the skin of the user and gives the physical stimulus of the present invention.
  • it may be composed of a grip portion and a skin extension portion or a skin pressing portion.
  • the device shown on the left in FIG. 14 is designed to stretch the skin at a specific frequency and extension rate when the skin contact part touches the skin.
  • the device of the present invention includes a power supply, a stimulus generating unit, and a skin stimulating unit, the power supply generates an electric signal, and the stimulus generating unit converts the electric signal from the power source into a physical stimulus.
  • the skin stimulus portion may be one that receives the physical stimulus generated by the stimulus generator and gives the physical stimulus to the user's skin.
  • the device shown on the left in FIG. 14 includes a grip portion, a power source, a control unit that controls physical stimulation, a stimulation generation unit, and a skin contact portion including a skin stimulation portion and a skin fixing portion.
  • the user holds the grip part and puts the skin contact part on the skin, fixes the skin with the skin fixing part, and operates the control part so that the electrical signal from the power supply is physically stimulated by the stimulation generating part.
  • the stimulus generator may be driven by a motor or the like to convert an electrical signal into a physical stimulus.
  • the skin stimulating portion shown on the left side of FIG. 14 gives a stretching stimulus to the skin, but may be, for example, a pressing stimulus to the skin.
  • the device of the present invention may be a beauty device including a power supply, a control unit for controlling physical stimulation, a stimulation generating unit, and a skin contact portion including a skin contact surface made of a sheet-like material.
  • a beauty device including a power supply, a control unit for controlling physical stimulation, a stimulation generating unit, and a skin contact portion including a skin contact surface made of a sheet-like material.
  • the sheet-like material can carry an electric current and may convert an electrical signal from a power source into a physical stimulus. Examples of such sheet-like materials include dielectric elastomer actuators (DEA), conductive polymers, IPMC, PVC gel, Mckinnen type and the like.
  • DEA dielectric elastomer actuators
  • the power source of the device of the present invention may be an internal power source or an external power source, or may be a rechargeable type. Further, the device of the present invention may be one that uses data stored in a mobile phone, a cloud, or the like, or one that is remotely operated wirelessly.
  • the physical stimulus may be one that achieves the stretching or pressing of the skin by giving the physical stimulus by contact or non-contact as described above.
  • the physical stimulus may be applied in the direction parallel to the skin surface, that is, in the lateral direction, in the direction perpendicular to the skin surface, that is, in the vertical direction, or in any direction such as an oblique direction or a twisting direction. it can.
  • the number of cycles to perform physical stimulation is not limited. For example, any number of cycles such as 2 to 500 cycles, 10 to 500 cycles, 20 to 400 cycles, 30 to 300 cycles, 40 to 200 cycles, and 50 to 100 cycles may be performed. For example, as described in the examples, 27 cycles may be sufficient.
  • any number of these cycles may be regarded as one set, and this set may be performed with an arbitrary number of sets, for example, 1 to 100 sets, 2 to 50 sets, or 3 to 10 sets.
  • the time to perform physical stimulation is not limited.
  • the cycle may be repeated with or without a pause time for a certain period of time such as 5 minutes to 3 hours, 10 minutes to 2 hours, and 30 minutes to 1 hour.
  • the time interval between cycles or sets is not limited.
  • the extension or pressing stimulus may be one set or multiple sets alone, with one or more sets daily, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days. It may be performed continuously or intermittently, periodically or irregularly, such as once, once every 1, 2, 3, or 4 weeks.
  • the frequency, extension rate, number of cycles, and frequency are not limited to those described above.
  • the waveform for physical stimulation can be set arbitrarily, such as a square wave, a sine wave, a triangular wave, and a sawtooth wave.
  • the object to which the method of the present invention is applied may be an object in which skin aging is objectively or subjectively recognized, or an object in which skin aging is desired to be prevented.
  • the subject may be judged to be deficient in skin constituents such as hyaluronic acid.
  • the subject may be a subject judged to have a high degree of skin aging by using the behavior of YAP in the stratum corneum cells and / or the structure of actin fibers as an index.
  • the ratio of the number of cells with nuclear localized YAP to the total number of keratinocytes and / or the ratio of the number of cells with actin stress fiber to the total number of keratinocytes was low. It may be a target. Alternatively, the subject may be concerned about skin aging, for example, spots, wrinkles, sagging, dullness, conspicuous pores, or smoothness, elasticity, firmness, gloss, and decreased elasticity. Spots, wrinkles, sagging, dullness, conspicuous pores, smoothness, elasticity, firmness, luster, elasticity, etc. can be determined by using known indicators such as visual judgment, subjective or objective evaluation, and cute meter values. Can be decided.
  • Skin anti-aging may be determined by measuring the ratio of the number of keratinocytes with nuclear localized YAP to the total number of keratinocytes.
  • the presence or absence of nuclear-localized YAP is determined by staining intracellular YAP, observing and imaging endogenous YAP in the nucleus or cytoplasm with a microscope, and using image processing analysis software. It can be determined by quantifying the ratio of YAP to intracellular YAP by the degree of fluorescence intensity. Alternatively, it can be measured by the method described in Non-Patent Document 6 and Non-Patent Document 7.
  • the ratio of the number of keratinocytes having nuclear localization YAP to the total number of keratinocytes is calculated by the above formula 2.
  • the number of cells determined to have nuclear localization YAP by the above method is counted, and the cells whose nuclei are stained by nuclear staining such as DAPI or Hoechst 33342 are counted as the total number of cells, and the formula 2 It may be calculated by.
  • the nuclear localization of YAP is that the endogenous YAP in keratinocytes is localized in the nucleus as a transcriptional conjugating factor, with the increase or decrease in the total expression level remaining within a range of 2 times or less before and after the implementation.
  • YAP is a Yes-associated protein, which is a protein of about 65 kDa, which is sometimes called YAP1, YAP65, etc. It has been reported that YAP functions as a transcriptional regulator, is involved in cell proliferation and apoptosis, maintains and establishes stem cells (nitches), and is associated with the development of tumors and cancers. YAP is degraded when it is present in the cytoplasm, but when it translocates into the nucleus, it is activated and regulates transcription. It has also been reported that such localization of YAP is associated with extracellular matrix hardness, cell density, cell proliferation and self-renewal (Non-Patent Documents 11 to 13).
  • the skin anti-aging of the present invention may be determined using the presence or absence of actin stress fibers in keratinocytes as an index. For example, skin anti-aging may be determined by measuring the ratio of the number of keratinocytes with actin stress fibers to the total number of keratinocytes. The presence or absence of actin stress fibers is determined by staining actin fibers with phalloidin cross-linked with a fluorescent compound and containing at least one actin stress fibers present in the cytoplasm or around the nucleus, as described in Examples. Can be determined to have.
  • Non-Patent Document 9 it can be measured by the method described in Non-Patent Document 9 or Non-Patent Document 10.
  • the ratio of the number of keratinocytes having actin stress fibers to the total number of keratinocytes is calculated by the above formula 3.
  • the number of cells determined to have actin stress fibers by the method as described above may be counted, and the total number of cells may be counted by DAPI staining as described above and calculated by the formula 3.
  • the keratinocyte having actin stress fiber refers to the keratinocyte in which actin stress fiber is formed without increasing the expression level of actin protein. This is because, as described in Non-Patent Document 8, the amount of actin protein does not change even if the presence or absence of YAP and the position of YAP (nucleus, cytoplasm, etc.) are different.
  • the skin anti-aging of the present invention refers to, for example, a decrease in the ratio of the number of cells having nuclear-localized YAP or actin stress fibers to the total number of keratinocytes in the keratinocytes after a skin sample is stimulated to stretch. It may also mean suppression by the method / apparatus of the invention. Suppression is, for example, suppression of the decrease in the above percentage with a statistically significant difference (eg Student's t-test) with a significance level of 5%, and / or, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, It may be 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100% suppression.
  • a statistically significant difference eg Student's t-test
  • Non-Patent Document 11 Nuclear localization YAP and actin stress fibers are known to act indirectly or directly on cell proliferation and self-renewal.
  • Non-Patent Document 12 Based on the findings of research on skin keratinocytes and various cell types, keratinocytes with phenomena such as YAP not localizing to the nucleus and actin stress fibers not forming have low self-renewal ability and self-renewal ability.
  • Non-Patent Document 13 Aging or differentiation-like cells have been suggested (Non-Patent Document 13).
  • the number of aging keratinocytes having a weak nuclear localization YAP retention ability or a weak actin stress fiber forming ability was significantly reduced by the method / apparatus of the present invention. Therefore, without being bound by theory, the method / apparatus of the present invention selectively eliminates aging keratinocytes as described above, and has weak nuclear localization YAP retention ability or actin stress fiber formation ability. It was suggested that the selection of retained "young" keratinocytes and subsequent reactivation and cell proliferation were promoted.
  • YAP selectively eliminates the keratinocytes in which YAP is not localized in the nucleus or actin stress fibers are not formed, and YAP As a result of selectively leaving keratinocytes localized in the nucleus and keratinocytes having actin stress fibers, it is possible that the keratinocytes are proliferating or self-renewing.
  • the method / apparatus of the present invention selectively eliminates aging keratinocytes by giving a physical stimulus, and selects keratinocytes that proliferate and self-replicate, resulting in proliferation of keratinocytes and It is possible that it is promoting recovery.
  • a physical stimulus such as a stretch stimulus to the skin sample.
  • the physical stimulus for measuring the degree of skin aging and the skin anti-aging effect may be the same as or different from the physical stimulus used in the anti-aging method / device of the present invention, and the degree of skin aging is measured.
  • Sufficient stimulation should be achieved.
  • contact with skin samples such as living skin, post-collection skin, or cultured keratinocytes, such as tension, pressing, tapping, kneading, suction, and / or, for example, ultrasonic waves or pneumatic pressure.
  • the extension of the skin sample may be achieved by giving a physical stimulus by non-contact such as displacement by applying a shock wave to the skin, and the direction in which the physical stimulus is given is not limited.
  • skin anti-aging effects may mean an increase in the amount of hyaluronic acid in the dermis by the methods / devices of the present invention.
  • the increase is, for example, an increase in hyaluronic acid with a statistically significant difference (eg Student's t-test) with a significance level of 5%, and / or, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40%.
  • the increase may be 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100% or more.
  • the skin anti-aging effect increases the indicators of skin viscoelasticity, elasticity, firmness, luster, smoothness, less noticeable pores, and less dullness by the methods / devices of the present invention.
  • Skin viscoelasticity, elasticity, firmness, luster, smoothness, etc. can be measured by a cute meter or a subjective or objective index.
  • the increase is, for example, an increase with a statistically significant difference (eg, dunnett's test or Wilcoxon signed rank test) with a significance level of 5%, and / or, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more,
  • the increase may be 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more.
  • the method and device of the present invention can prevent and improve skin aging while exerting a favorable effect on a shallow layer such as the epidermis. For example, improving the behavior of YAP and the structure of actin fibers in keratinocytes, especially reducing the proportion of cells with nuclear-localized YAP and actin stress fibers to keratinocytes when physical stimulation is applied to the skin. Can be suppressed or the subsequent increase can be recovered. In addition, it can lead to an increase in hyaluronic acid in the dermis, an increase in skin viscoelasticity and the above-mentioned subjective or objective indicators.
  • the method / device for skin anti-aging of the present invention may be used in combination with other treatments.
  • Other treatments include, but are not limited to, application of stimuli such as photostimulation, electrical stimulation, mechanical stimulation, human hand stimulation, administration of anti-aging agents, application of cosmetics, and the like.
  • the anti-aging agent may be a naturally or chemically synthesized compound, an extract of animals and plants, a simple substance or a mixture, a state contained in a solvent such as an aqueous solution, cosmetics, etc. It may be in the form of.
  • the administration route of the anti-aging agent can be arbitrarily selected, and examples thereof include oral administration, transdermal administration, subcutaneous administration, transmucosal administration, and intramuscular administration.
  • the method / device for skin anti-aging of the present invention may be a method / device for the purpose of beauty, medical treatment, stress relief, relaxation, and the like.
  • the methods / devices for skin anti-aging of the present invention are intended for cosmetology and may not be the therapeutic methods / devices used by physicians and healthcare professionals.
  • the present invention also provides a cosmetology counseling method that supports a cosmetological act of the subject, including presenting the cosmetology method / device of the present invention to the subject.
  • Experiment 1 In vitro changes in keratinocytes due to aging Sample: Monolayer cultured keratinocytes from donors (0 years, 18 years, 44 years, 64 years) of different ages purchased from KAC Co., Ltd. And fibroblast cultures were used.
  • Extension conditions ShellPa manufactured by Menicon Life Science was used to stimulate the above-mentioned keratinocytes and fibroblasts to extend.
  • the extension stimulation was performed at an extension rate of 10% as shown in the center of the lower figure of Fig. 1.
  • the culture chamber was pulled in one direction at an extension rate of 0.33% / s, and the cells were extended to an extension rate of 10%.
  • the extended state was maintained for 5 minutes, and the cells were returned to the original non-extended state at a recovery rate of 0.33% / s. This was regarded as one cycle, and a total of 27 cycles were performed over 3 hours. The rest time between cycles was 0 to 10 seconds.
  • Observation method Intracellular YAP after non-extension stimulation and extension stimulation was observed by the fluorescent antibody staining method as follows. YAP in cells was detected using anti-YAP antibody (Santa Cruz Biotechnology, YAP antibody (63.7): sc-101199), and actin fiber was detected using phalloidin (ThermoFisher Scientific, Alexa Fluor TM 488 Phalloidin: A12379) cross-linked with fluorescent compounds. Observation and image acquisition were performed with a confocal laser scanning microscope (ZEISS, LSM700). In addition, the image processing analysis software ImageJ was used to quantify the ratio of YAP nuclei to cytoplasm by the degree of fluorescence intensity.
  • the fluorescence intensity ratio between the nucleus and the cytoplasm was calculated, and the number of cells whose value was 1 ⁇ was counted as a cell having nuclear YAP.
  • the total number of cells is stained using DAPI (Vector Laboratories, VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI: H-1200), the number of cells with stained nuclei is counted, and the ratio of the number of cells with nuclear localized YAP is calculated. Calculated according to 2.
  • cells containing at least one actin stress fiber in the cytoplasm or around the nucleus are counted as cells having actin stress fiber, the total number of cells is counted in the same manner, and the ratio of the number of cells having actin stress fiber is calculated by Equation 3. Calculated according to.
  • FIGS. 2a and 2b Micrographs of keratinocytes are shown in FIGS. 2a and 2b.
  • YAP is localized in the nucleus in almost all cells with and without extension stimulation.
  • the number of cells having nuclear localization YAP decreased sharply when extension stimulation was given.
  • FIG. 3 shows the ratio of the number of cells having nuclear localization YAP in keratinocytes. Although there was no change in the number of cells with nuclear localization YAP in the younger generation, it was significantly reduced in the keratinocytes of the elderly.
  • FIG. 4 which shows the ratio of the number of cells having actin stress fibers in the keratinocytes
  • the number of cells having actin stress fibers did not change in the younger generation, and it decreased significantly in the keratinocytes in the elderly. I can't do it anymore.
  • fibroblasts as shown in FIG. 5, no change was observed in YAP and actin stress fibers under the condition with and without extension stimulation, and almost no age difference was observed.
  • Experiment 2 Ex vivo changes in keratinocytes due to aging Sample: Ex vivo human abdominal skin tissue pieces (NativeSkin, 12well size, about 1 cm in diameter) obtained from Genoskin were used. The piece of tissue is 38 years old. Extension conditions: A plastic pressing portion as shown in FIG. 6 was created. The bottom surface of the pressing portion was pressed vertically from the top of the sample so as to be pressed against the top surface of the sample, and the skin was adjusted to be stretched at an extension rate of 0.1% or less. Such a pressing motion is performed at a speed of 10% / s as shown in FIG. 7, then the pressing portion is held and the extended state is maintained for 10 seconds, and then lifted at a speed of 10% / s to the original non-extended state.
  • Observation method YAP and DAPI were stained, observed, and imaged in the same manner as in Experiment 1 under the conditions with and without extension stimulation.
  • Experiment 3 In vitro effect on keratinocytes by extension stimulation Sample: A monolayer culture of keratinocytes of the same middle-aged donor (44 years old) as in Experiment 1 was used. Extension conditions: The same extension stimulus as in Experiment 1 was applied. That is, a set of 27 cycles of extension stimulation performed in Experiment 1 was given. However, 12 to 24 hours after giving one set of extension stimuli consisting of 27 cycles for 3 hours, the same extension stimulus was given to the sample, and a total of 2 sets were performed.
  • Observation method YAP after non-extension stimulation and extension stimulation was stained in the same manner as in Experiment 1.
  • BrdU was stained with an anti-BrdU antibody (Abcam, Anti-BrdU antibody [BU1 / 75 (ICR1)]: ab6326) as a growth marker by the fluorescent antibody method.
  • the BrdU treatment was carried out for 6 hours, and 7 days later, it was fixed at 4 ° C. for 24 hours with 4% paraformaldehyde. The fixed sample was observed and imaged using a confocal laser scanning microscope (ZEISS, LSM700).
  • the cells recover or maintain the same cell proliferation ability as non-extended or young keratinocytes.
  • the first extension stimulation promotes cell death of aging keratinocytes with low growth maintenance and self-renewal ability, or causes aging keratinocytes to peel off by some mechanism. It is possible that the proliferation and recovery of keratinocytes are promoted by selectively eliminating cells showing nuclear-localized YAP with high growth maintenance and self-renewal ability.
  • Experiment 4 Ex vivo effect on epidermis by extension stimulation
  • Sample Ex vivo human abdominal skin tissue piece (Native Skin, 6 well size, diameter about 2 to 2.5 cm) of a middle-aged donor (42 years old) purchased from Genoskin was used. did.
  • Extension conditions An extension device having grips for gripping both ends of the skin in the well as shown in FIG. 10 and stretching the skin by pulling the grips was created. The well containing the above tissue pieces was placed horizontally, and the grip was operated to extend the skin from both ends, and as shown in Fig. 7, extension with a 10% extension rate was performed at a rate of 10% / s. The sample was returned to its original non-extended state at a recovery rate of% / s.
  • FIG. 11 shows the state of the non-extension stimulation on the 0th day and immediately after the extension stimulation (the 0th day).
  • the number of epidermal cells in the basal layer with YAP decreased, and the proliferation marker Ki67 increased immediately after tension.
  • FIG. 12 shows the state after culturing for 1 week after giving the extension stimulus twice for 2 consecutive days. Before extension, YAP was observed not only in the basal layer but also in the entire epidermal cells. YAP is usually abundant in the basal layer, but was observed in all layers of skin cultured for 1 week.
  • cell aging may cause, for example, some abnormalities in cell proliferation and cell differentiation in each layer of the epidermis, resulting in altered YAP distribution. Is also possible.
  • the expression distribution of YAP was maintained in the basal layer after two extension stimulations.
  • physical stimulation activates and maintains homeostasis of cell proliferation and cell differentiation in the epidermis, resulting in a normal distribution of YAP in early fresh skin tissue even after 1 week of culture. It is possible that the condition is maintained.
  • Experiment 5 Ex vivo effect on dermis by extension stimulation
  • Sample and extension conditions Ex vivo human abdominal skin tissue piece (Native Skin, 6 well size, about diameter) of a middle-aged donor (44 years old) purchased from the same Genoskin company as in Experiment 4. 2 to 2.5 cm) was used. Three sets of extension stimulation, which is the same extension as in Experiment 4, was performed twice for two consecutive days.
  • DAPI hyaluronic acid
  • HOKUDO Biotin-HABP: BC41
  • collagen Merck Millipore, Anti-human COL1N-terminal antibody: MAB1912
  • DAPI hyaluronic acid
  • hyaluronic acid and collagen were stained by the fluorescent antibody method as in Experiment 1, and observed and images were obtained with a confocal laser scanning microscope (ZEISS, LSM700).
  • Hyaluronic acid in the dermis was increased when the extension stimulus was given. It is shown that the stimulation of extension not only promotes the proliferation of epidermal cells but also has a positive effect on the dermis.
  • Extension conditions The extension device shown on the left of Fig. 14 was used.
  • the skin contact part indicated by the arrow on the left in Fig. 14 touches the skin, and while the skin fixing part fixes the skin, the amount of vertical pushing of the skin extension part with respect to the skin is appropriately set within a range of up to about 5 mm. It is designed to have a horizontal extension rate of 0.1 to 20% and to extend the skin at a frequency of 1.2 Hz.
  • the subjects made a subjective evaluation by entering the impression of the cheeks before and 10 days after the extension stimulus on a 5-point scale for each of the evaluation items shown below.
  • the results of the subjective evaluation were statistically processed by the Wilcoxon signed rank test (***: p ⁇ 0.005, **: p ⁇ 0.01, *: p ⁇ 0.05).
  • Experiment 7 Ex vivo effect by pressure stimulation Sample: Ex vivo human abdominal skin tissue piece (Native Skin, 6 well size, diameter about 2 to 2.5 cm) of a middle-aged donor (44 years old) purchased from the same Genoskin company as in Experiment 4. It was used.
  • Dielectric elastomer actuator manufactured by Sumitomo Riko Co., Ltd .: SRHP074-001 was used. As shown in the upper left of FIG. 16, this dielectric elastomer actuator is applied to the skin tissue piece, and by repeating contraction and expansion, a pressing stimulus of 0 to 100 ⁇ m of various waveforms is applied at 0.5 Hz and 5 Hz under the conditions described in the lower part of FIG. , Or at a frequency of 50 Hz for 1 or 5 days.
  • Experiment 8 In vivo effect of pressure stimulus Subjects: 17 healthy women in their 30s and 50s were selected. Extension conditions: The pressing device and dielectric elastomer actuator (manufactured by Sumitomo Riko Co., Ltd .: SRHP074-001) shown in FIG. 19 were used. In this device, the skin contact part of the device shown in the upper part of FIG. 19 pushes the skin with a force of 10 gf, so that the pressing stimulus of the rectangular wave shown in the lower part of FIG. 19 is given to the skin at a frequency of 5 Hz and a depth of 100 ⁇ m. Is designed for. As shown in FIG. 19, this device was applied to the medial part of the forearm of the subject, and a pressing stimulus was applied for 30 minutes every day for 5 days.
  • Measurement method The skin condition of the medial part of the forearm with and without the pressing stimulus was measured before the start of the experiment and on the 7th day.
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Abstract

【課題】皮膚抗老化のための方法および装置を提供する。 【解決手段】60Ｈｚ以下の振動数で行う物理刺激を対象の皮膚に与えることを含む皮膚抗老化のための方法および装置に関する。本発明によれば，表皮といった浅い層に好ましい皮膚抗老化作用を奏する方法および装置が提供される。

Description

皮膚抗老化のための方法および装置
　本発明は皮膚抗老化のための方法および装置，特に，60Ｈｚ以下の振動数で行う物理刺激を対象の皮膚に与えることを含む皮膚抗老化のための方法および装置に関する。
　皮膚老化は，加齢，ホルモン，代謝等の内部要因と，紫外線，乾燥等の外部要因を含め様々な因子が介在する皮膚の変化である。皮膚老化は，例えば，しみ，しわ，たるみ，しぼみなど外観から判断できる場合もあるが，例えば，皮膚内部組織の構造や構成成分の変化といった目に見えない老化が進行している場合もある。このような老化は気付かないうちに進行していることが多いため予防策をとりづらい。皮膚老化を予防・改善するための適切な対策をとることが重要である。
　ここで，現在，種々な美容方法が存在する。例えば，特許文献１は，角質物質の変位を引き起こす電気活性材料アクチュエータを開示する。特許文献２は，皮膚を伸展させた状態で光照射を行う光照射美容器具を開示する。特許文献３は，皮下脂肪細胞を伸展させるストレッチと，脂肪蓄積抑制成分及び／又は脂肪細胞分化抑制成分を配合した皮膚外用剤を組み合わせた皮下脂肪を減少させる痩身方法を開示する。特許文献４は，カラス麦属植物の抽出物，又はオランダビユ属植物の抽出物を含有する伸展刺激介在コラーゲン分解酵素生成抑制剤を開示する。特許文献５は，伸展ストレスに起因するシワ改善剤又はＮＦ－κＢ活性抑制剤を開示する。非特許文献１では，６５～８５Ｈｚでの機械的刺激を推奨している。また，非特許文献１に記載の装置に関連する特許文献６では，約６５～約１２０Ｈｚといった周波数で皮膚を刺激する末端エフェクターを開示する。
　しかし，皮膚表面より刺激を与える場合は表層部分である表皮にまず刺激が加わる為，表皮にダメージが加わるという問題がある。また，表皮直下には構造的に非常に特徴的な基底膜も存在し（アンジュレーション構造）機械刺激を受容する可能性が高いと考えられる。実際に先行文献によって物理刺激を与えることで表層が大きく変化することも報告されている（非特許文献２）。よって，表皮や基底膜を含めた皮膚に対し好ましい抗老化作用を奏する方法や装置が求められる。
特表２０１１－５０５８９７号公報 特開２００９－２８２７１号公報 特開２０１５－１２７３１５号公報 特開２０１１－１６２５０７号公報 特開２０１４－１０８９２４号公報 特表２０１８－５０１０００号公報
Caberlotto et al. PLoS One. 2017 Mar 1;12 Naruse et al. PLoS One. 2015 Nov 3;10 Furukawa et al., 2017, Cell Reports 20, 1435-1447 Cell Death and Disease (2014) 5, e1519; doi:10.1038/cddis.2014.476 Current Biology Vol 24 No 17m 8 September 2014, Pages 2012-2017 Nature Communications volume 8, Article number: 15206 (2017) Development 138, 3907-3914 (2011) doi:10.1242/dev.0709872017 Cell Reports 19, 1495-1502, May 23, 2017 Nature Communications volume 9, Article number: 2961 (2018); DOI: 10.1038/s41467-018-05388-x Nature Cell Biology volume 20, pages262-271 (2018) Trends Cell Biol. 2018 Jul;28(7):560-573. doi: 10.1016/j.tcb.2018.03.001 Nature Communications volume 8, Article number: 15206 (2017; DOI: 10.1038/ncomms15206 Cancer Res; 73(12) June 15, 2013; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-12-3793
　本発明の課題は，皮膚抗老化のための方法及び装置の提供にある。
　本発明者らは，鋭意研究の結果，伸展などの物理刺激を特定の伸展率及び振動数で皮膚に与えた場合，表皮といった浅い層に好ましい皮膚抗老化作用を奏することを発見し，本発明に想到した。
　本願は，以下の発明を提供する：
　（１）対象における皮膚抗老化のための美容方法であって，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を含み，ここで当該工程は，例えば
　（ａ）前記対象の皮膚を0.1％以上50.0％以下の伸展率まで伸展すること；及び
　（ｂ）前記対象の皮膚を伸展状態から回復すること；
並びに／又は，
　（ａ－１）前記対象の皮膚を，1μm～1000μm押圧すること；及び
　（ｂ－１）前記対象の皮膚を押圧状態から回復させること；
を含むサイクルを60Ｈｚ以下の振動数で行う物理刺激を対象の皮膚に与えることを含み，　ここで，伸展率は，
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 （式中，定点AおよびBは，表皮または表皮が接着しているマトリックス上の任意の位置であり，ここで定点AとBを通る直線が伸展方向と平行である）
で算出される，前記美容方法。
　（２）前記サイクルを2～500サイクル行うセットを，１又は複数セット行う，（１）に記載の美容方法。
　（３）前記皮膚抗老化は，全角化細胞数に対する核局在YAPを有する細胞数の割合を指標として測定された場合，皮膚に前記美容方法を適用した後に伸展角化細胞で測定される核局在YAPを有する細胞数の割合が前記美容方法を適用する前と比べて増加することであり，ここで，核局在YAPを有する細胞数の割合は，
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
 で算出される，（１）又は（２）に記載の美容方法。
　（４）前記皮膚抗老化は，全角化細胞数に対するアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合を指標として測定された場合，皮膚に前記美容方法を適用した後に伸展角化細胞で測定されるアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合が増加することであり，ここで，アクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合は，
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
 で算出される，（１）又は（２）に記載の美容方法。
　（５）皮膚抗老化のための美容装置であって，
　前記装置は，
　物理刺激を生ずる刺激発生部と，
　刺激発生部で発生した物理刺激を皮膚に付与する刺激付与部とを備え，
　ここで，当該装置は，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を行うための装置であり，ここで当該工程は，例えば，
　（ａ）皮膚を0.1％以上50.0％以下の伸展率まで伸展すること；及び
　（ｂ）前記対象の皮膚を伸展状態から回復すること；
並びに／又は，
　（ａ－１）前記対象の皮膚を，1μm～1000μm押圧すること；及び
　（ｂ－１）前記対象の皮膚を押圧状態から回復させること；を含むサイクルを60Ｈｚ以下の振動数で行うことであり，
　ここで，伸展率は，上記式１により算出される，前記美容装置。
（６）（５）に記載の美容装置を対象の皮膚に適用することを含む，皮膚抗老化のための美容方法。
（７）皮膚におけるヒアルロン酸を増加するための，（１）～（４）及び（６）のいずれか１項に記載の美容方法。
（８）（１）～（４），（６）及び（７）のいずれか１項に記載の美容方法又は（５）に記載の美容装置を対象に提示することを含む，対象の美容行為を支援する美容カウンセリング方法。
　本発明によれば，表皮といった浅い層に好ましい皮膚抗老化作用を奏する方法および装置が提供される。その結果，しみ，しわ，たるみといった皮膚老化の予防・改善が期待される。
図１は，実験１，３で行った伸展刺激の設定を示す。 図２aは，実験１において44歳のドナーから得た角化細胞の単層培養物に伸展刺激を与えない状態および与えた直後のYAP（赤）およびアクチン（緑）の局在を示す。 図２bは，実験１において各年齢のドナー（0歳，18歳，64歳）から得た角化細胞の単層培養物に伸展刺激を与えない状態および与えた直後のYAP（赤）およびアクチン（緑）の局在を示す。 図３は，実験１において各年齢のドナー（0歳，18歳，62歳）から得た角化細胞培養物に伸展刺激を与えない状態および与えた直後の核局在YAPを有する細胞数の割合を示す。図中，＊は両側t検定(2つの母集団の分散が等しい場合)により有意差があることを示す（p<0.05%）。 図４は，実験１において各年齢のドナー（0歳，18歳，62歳）から得た角化細胞培養物に伸展刺激を与えない状態および与えた直後のアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合を示す。図中，＊は両側t検定(2つの母集団の分散が等しい場合)により有意差があることを示す（p<0.05%）。 図５は，実験１において各年齢のドナー（0歳，68歳）から得た線維芽細胞の培養物に伸展刺激を与えない状態および与えた直後のYAP（赤），アクチン（緑），および核(青）の局在を示す。 図６は，実験２で使用した装置およびex vivo皮膚試料を示す。 図７は，実験２，４，５で行った伸展刺激の設定を示す。 図８は，実験２において44歳のドナーから得た皮膚試料に押下刺激を与えない状態および与えた直後のYAP（緑）および核（青）の局在を示す。 図９は，実験３において44歳のドナーから得た角化細胞の単層培養物にそれぞれ伸展刺激を与えない条件，1回の伸展刺激を与えた条件，2回の伸展刺激を与えた条件の後，通常培養を１週間おこなった後のYAPおよびBrdUの局在を示す。 図１０は，実験４で使用した装置および皮膚試料を示す。 図１１は，実験４において44歳のドナーから得た2つの皮膚試料（試料＃1および＃2）に1回の伸展刺激を与えない状態および与えた条件の後，通常培養を１週間おこなった後のYAP（緑），Ki67（赤）および核（青）の局在を示す。 図１２は，実験４において44歳のドナーから得た2つの皮膚試料（試料＃1および＃2）に2回の伸展刺激を与えない状態および与えた条件の後，通常培養を１週間おこなった後のYAP（緑），Ki67（赤）および核（青）の局在を示す。 図１３は，実験５において44歳のドナーから得た2つの皮膚試料（試料＃1および＃2）に2回の伸展刺激を与えない状態および与えた条件の後，通常培養を１週間おこなった後のヒアルロン酸（緑），コラーゲン（赤），核（青）を示す。 図１４は，本発明の装置の一例を示す。 図１５aは，実験６におけるバポメーターとコルネオメーターによる測定結果を示す。＊はdunnett’s testで0日目の値と有意差があることを示す(*** :p<0.005, ** :p<0.01, *:p<0.05)。 図１５bは，実験６におけるキュートメーターによるR0値を示す。＊はdunnett’s testで0日目の値と有意差があることを示す(*** :p<0.005, ** :p<0.01, *:p<0.05)。 図１５cは，実験６における主観的な評価の結果を示す。＊はwilcoxonの符号付順位検定で0日目の値と有意差があることを示す(*** :p<0.005, ** :p<0.01, *:p<0.05)。 図１６左上は実験７の設定を示す。図１６右上は実験７の押圧刺激の波形の一例（矩形波）を示す。図１６下は実験７の押圧刺激の条件（波形:Shape of wave，振動数:Frequency/Hz，深度:Displacement/μm，期間:Day）を示す。 図１７は，実験７において44歳のドナーから得た2つの皮膚試料（試料＃1および＃2）に押圧刺激を与えない条件（Cont）および矩形波の押圧刺激を与えた条件（0.5Hz/100μm）における１日目（d1）および５日目（d5）のKi67（緑）および核（青）の局在を示す。 図１８は，実験７において44歳のドナーから得た皮膚試料に1回の押圧刺激を与えない条件（Cont）および与えた条件（矩形波：0.5Hz，5Hz，50Hz/100μm）における１日目(左)および５日目(右)の全体の細胞数におけるKi67陽性を示す細胞数の割合を示す。 図１９上は実験８の設定を示し，下は採用した押圧刺激の波形（矩形波）を示す。 図２０aは，実験８の結果であり，左は押圧刺激を与えた場合，右は押圧刺激を与えなかった場合(control)の0日目及び７日目の結果を示す。図２０aはコルネオメーターによる測定結果である。 図２０bは，実験８の結果であり，左は押圧刺激を与えた場合，右は押圧刺激を与えなかった場合(control)の0日目及び７日目の結果を示す。図２０bはバポメーターとによる測定結果である。 図２０cは，実験８の結果であり，左は押圧刺激を与えなかった場合(control)，右は押圧刺激を与えた場合の0日目及び７日目の結果を示す。図２０cはキュートメーターによるR0値を示す。*はdunnett’s testで0日目の値と有意差があることを示す(*:p<0.05)。
　現在，真皮よりも深い層をターゲットとした美容方法は多く存在し，例えば，表情筋の強化，脂肪の分解促進，真皮線維の強化を目指すもの等が挙げられる。また，例えば特許文献１のように角質物質に着目した美容法も存在するものの電気的刺激によるものや，高い振動数を与える刺激の強いものが多い。しかしながら，上述のように皮膚表面より刺激を与えると，表皮にダメージが加わるという問題がある。さらには，特許文献４，５等に記載されるように伸展刺激は皮膚に対し悪影響を与えるという知見も存在し，実際，非特許文献２では，伸展刺激を与えることで表層が大きく変化することが報告されている。
　ここで，本発明者らは，皮膚表層部に着目し鋭意研究を行った。その結果，角化細胞におけるYAPの挙動やアクチンファイバーの構造と老化が関連することを発見した。例えば，伸展などの物理刺激を皮膚に与えた場合，老化角化細胞では核局在YAPを有する細胞やアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合が著しく減少した。さらに，本発明者らは，YAPの挙動やアクチンファイバーの構造を皮膚老化の指標とし，特定の物理刺激を対象の皮膚に与えると表皮を含む皮膚に好ましい効果が奏されることも発見した。より具体的には，老化した表皮であっても，特定の伸展率で，例えば1Hｚ以下，10Ｈｚ以下といった60Ｈｚ以下の振動数で行う物理刺激を与えると，老化角化細胞に特徴的な核局在YAPあるいはアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合の減少を結果として抑制する効果が示唆された。更には，このような物理刺激は，表皮のみならず真皮におけるヒアルロン酸量も増加することもわかり，皮膚老化の予防改善に有効であることが裏付けられた。
　本発明は，物理刺激を対象の皮膚に与えることを含む，対象における皮膚抗老化のための方法を提供する。また，本発明は，物理刺激を生ずる刺激発生部と，刺激発生部で発生した物理刺激を皮膚に付与する刺激付与部とを備える皮膚抗老化のための装置を提供する。
　本発明の方法は皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を含み，本発明の装置は皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を行うための装置であり，ここで当該工程は，例えば，（ａ）皮膚を0.1％以上50.0％以下の伸展率まで伸展すること；及び（ｂ）伸展状態から回復すること；を含むサイクルを60Ｈｚ以下の振動数で行うことであってもよい。
　伸展率は，上記式１により算出される。物理刺激は，0.001％以上80.0以下，0.01％以上60.0％以下，0.1％以上50.0％以下，好ましくは，0.1％以上50.0％以下の伸展率で行ってもよい。例えば，0.1％以上1.0%以下，0.1％以上5.0%以下，0.1％以上10.0%以下，0.1％以上20.0%以下，0.1％以上30.0%以下，1.0％以上5.0％以下，1.0％以上10.0％以下，1.0％以上20.0％以下，1.0％以上30.0％以下，1.0％以上50.0％以下，10.0％以上20.0％以下，10.0％以上30.0％以下，等任意の範囲の伸展率が採用できる。
　伸展速度は，1サイクル中で最大伸展率（％）に達するまでの速度（％/ｓ）を指す。回復速度は，最大伸展率から非伸展状態に戻る速度（％/ｓ）を指す。伸展速度・回復速度は，0.010％/ｓ～40％/ｓ，0.05％/ｓ～30％/ｓ，0.10％/ｓ～20％/ｓ，0.2％/ｓ～15％/ｓ，0.3％/ｓ～10％/ｓなど任意の速度で行ってもよい。伸展速度と回復速度は同じでも異なっていてもよい。
　本発明の方法は皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を含み，本発明の装置は皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を行うための装置であり，ここで当該工程は，例えば，（ａ－１）前記対象の皮膚を1μｍ～1000μｍ押圧すること；及び（ｂ－１）前記対象の皮膚を押圧状態から回復させること；を含むサイクルを60Ｈｚ以下の振動数で行うことであってもよい。
　「皮膚を1μｍ～1000μｍ押圧する」とは，皮膚の最表面から1μｍ～1000μｍの深度まで皮膚を押圧することを指す。押圧の深度は，皮膚の最表面から1μｍ～1000μｍ，10μｍ～1000μｍ，10μｍ～300μｍ，10μｍ～100μｍ等任意に設定可能である。
　振動数は，伸展又は押圧開始から非伸展又は非押圧状態まで回復するサイクルを1サイクルとした場合の1秒あたりのサイクル数を指す。1サイクルには，一定の時間，伸展又は押圧状態を維持すること及び/又は非伸展又は非押圧状態で休止することを含めてもよい。例えば，1サイクル中に，（ａ’）（ａ）の後かつ（ｂ）の前に，あるいは（ａ－１）の後かつ（ｂ－１）の前に，0秒～30分間，１秒～20分間，5秒～10分間，又は10秒～5分間伸展又は押圧状態を保持すること；及び／又は（ｂ’）（ｂ）の後かつ次のサイクルの（ａ）の前に，あるいは（ａ－１）の後かつ（ｂ－１）の前に，0秒～30秒間，0秒～20秒間，0秒～10秒間，1秒～10秒間，1秒～20秒間，1秒～10秒間非伸展又は非押圧状態で休止すること，を更に含んでもよい。振動数は，例えば，0.0000001Ｈｚ以上10ｋＨｚ以下，0.000001Ｈｚ以上1ｋＨｚ以下，0.00001Ｈｚ以上100Ｈｚ以下，好ましくは，0.0001Ｈｚ以上60Ｈｚ以下，0.0001Ｈｚ以上10Ｈｚ以下であってもよい。例えば，0.001Hｚ以上60Hｚ以下，0.01Hｚ以上60Hｚ以下，0.001Hｚ以上10Hｚ以下，0.01Hｚ以上10Hｚ以下，0.1Hｚ以上60Hｚ以下，0.1Hｚ以上10Hｚ以下，0.5Hｚ以上60Hｚ以下，0.5Hｚ以上50Hｚ以下，0.5Hｚ以上10Hｚ以下，0.5Hｚ以上5Hｚ以下，0.5Hｚ以上1Hｚ以下，0.001Hｚ以上0.01Hｚ以下，0.001Hｚ以上0.1Hｚ以下，0.001Hｚ以上1Hｚ以下，0.01Hｚ以上1Hｚ以下，0.1Hｚ以上1Hｚ以下，1Hｚ以上60Hｚ以下，1Hｚ以上10Hｚ以下，1Hｚ以上5Hｚ以下，等任意の範囲の振動数が採用できる。
　市販の美顔器，マッサージ機器等には，RF波といった0.3～300MHｚ程度の周波数を有する電磁波を用いるものや，1MHzから7MHz程度の周波数を有する超音波を用いるものなどがある。これらの周波数／振動数と比べ，本発明の方法／装置が採用する振動数は極めて低い。従来の美顔器等のように皮膚に強い振動数を与えると皮膚に赤み，圧力痕，傷，痛み，炎症といった悪影響を与えるリスクがあるが，本発明のような振動数を採用すると上述のリスクが低く非侵襲的な物理刺激が可能になる。本発明者らにより，伸展率，押圧度，振動数等が高すぎると刺激が強すぎるため，これらの値を適正値に調節することにより皮膚を優しく刺激するほうが好ましいことが発見されたためである。
　また，従来，当該分野において一般的に利用されているモーター等の機構を利用する美容機器類ではそのモーターの機械的機構から60Hｚを超える振動数しか選択できないことが当業者の技術常識であった。従来技術における美容機器類の限界である「60Hｚ」以下の振動数，例えば，60Hｚ以下，10Hｚ以下，1Hｚ以下といった本発明のような振動数を採用するには，特別な機械を作成する必要性が求められていた。更には，このような低い振動数では，本発明の効果を奏するには「弱すぎる」という固定概念もあり，これまで検討がほとんどされていなかった。しかしながら，本発明者らは，従来の技術常識から考えると非常に低い振動数を用いて実際に皮膚に物理刺激を与えてみたところ，驚くべきことに，このような低い振動数の優しい刺激でも良好な効果が奏された。
　EMS機器等では低中周波の装置も市販されているものの，これらは特に筋肉や皮下脂肪等の深い層で作用させるように設計されており，本願発明のような皮膚表層に対する影響は不明である。また，このような装置は周波数が低くても電流を流す際にビリビリとした刺激を伴うこともあり，皮膚に優しい刺激を与える本願発明とは異なる。一方，本発明は，超音波や電流，磁場といったエネルギーを加えず，直接皮膚に伸展又は押圧刺激を与えるという簡便な方法による美容法が可能である。更に，このような振動数を有する伸展又は押圧刺激は，優しい刺激でありながら，実施例に記載のように表皮細胞にも真皮細胞にも良好な効果を奏する。よって，本発明の方法／装置を使用すると，皮膚に悪影響を与えず，短期的には皮膚の表皮に，長期的には真皮に美容効果が期待される。
　物理刺激は，美顔器などの器具，実験的な装置，ヒトの手や器具を用いたマッサージ，顔面のエクササイズによるものであってもよく，接触又は非接触により達成されるものであってもよい。一態様では，物理刺激を生ずる刺激発生部と，物理刺激を接触又は非接触により付与する刺激付与部を備えた機器を用いて，皮膚に対して機械的に発生された物理刺激を付与することができる。物理刺激は，例えば，皮膚を引張，押圧，叩く，揉む，吸引するといった接触によって達成されてもよく，及び／又は，例えば，超音波や空気圧のようなもので皮膚に衝撃波をあたえることで変位させるといった非接触により達成されてもよい。顔面のエクササイズとしては，頬を膨らませることや，目を見開くことなどが行うことができる。マッサージとしては，施術を受ける対象自身又は美容部員などの施術者による手やローラー等の器具を用いたマッサージが挙げられる。しかしながら，本発明の物理刺激の範囲内であれば限定されない。
　本発明の装置として，例えば，使用者の皮膚に接触し本発明の物理刺激を付与する皮膚接触部を備える美容装置が挙げられる。例えば，把持部及び皮膚伸展部又は皮膚押圧部から構成されるものであってもよい。例えば，図14左に記載の装置は，皮膚接触部が皮膚に触れることにより，皮膚を特定の振動数および伸展率にて伸展するように設計されている。
　また，例えば，本発明の装置は，電源と，刺激発生部と，皮膚刺激部を備え，電源は電気信号を発生し，刺激発生部は，電源からの電気信号を物理的な刺激に変換して物理刺激を発生し，皮膚刺激部は，刺激発生部で発生された物理刺激を受け取り使用者の皮膚に物理刺激を与えるものであってもよい。
　例えば，図14左に示す装置は，把持部と，電源と，物理的な刺激を制御する制御部と，刺激発生部と，皮膚刺激部と皮膚固定部を含む皮膚接触部とを備える。使用者が把持部を持って皮膚接触部を皮膚に当て，皮膚固定部により皮膚を固定するようにし，制御部を操作することにより電源からの電気的な信号が刺激発生部により物理的な刺激に変換され，物理刺激が皮膚刺激部に伝わり，皮膚が皮膚固定部に固定されつつ皮膚刺激部により特定の振動数および伸展率にて伸展されるように設計されている。例えば，刺激発生部はモーターなどにより駆動され電気信号を物理刺激に変換するものであってもよい。また，図14左に記載の皮膚刺激部は，皮膚に伸展刺激を与えるものであるが，例えば，皮膚に押圧刺激を与えるものであってもよい。
　あるいは，本発明の装置は，電源と，物理的な刺激を制御する制御部と，刺激発生部と，シート状の材料からなる皮膚接触面を含む皮膚接触部とを備える美容装置であってもよい。例として，図14右にこのような美容装置の皮膚接触部を示す。シート状の材料は，電流を流すことが可能で，電源からの電気的な信号を物理的な刺激に変換するものであってもよい。そのようなシート状の材料としては，誘電エラストマーアクチュエータ(DEA)，導電ポリマー，IPMC，PVCゲル，Mckinnen型などが挙げられる。
　本発明の装置の電源は，内部電源又は外部電源であってもよく，充電式であってもよい。また，本発明の装置は，例えば，携帯電話やクラウドなどに保存されているデータを用いるものであっても，ワイヤレスでリモート操作されるものであってもよい。
　物理刺激は，上述のような接触又は非接触による物理的な刺激を与えることにより皮膚の伸展又は押圧を達成するものであってもよい。物理刺激は，皮膚表面に対し平行方向，すなわち横方向に加えてもよいし，皮膚表面に対し垂直方向，すなわち縦方向に加えてもよいし，あるいは斜め方向，ねじれ方向等任意の方向が採用できる。
　物理刺激を行うサイクル数は限定されない。例えば，2～500サイクル，10～500サイクル，20～400サイクル，30～300サイクル，40～200サイクル，50～100サイクルといった任意の数のサイクル行なってもよい。例えば，実施例に記載のように，27サイクル行えば十分な場合もある。
　さらに，これらの任意の数のサイクルを１セットとし，このセットを任意の数のセット，例えば，1～100セット，2～50セット，又は3～10セット行ってもよい。
　物理刺激を行う時間も限定されない。例えば，休止時間を設けて又は設けずにサイクルを繰り返し5分～3時間，10分～2時間，30分～1時間といった一定時間行ってもよい。
　サイクル間又はセット間の時間間隔も限定されない。例えば，伸展又は押圧刺激は，1セット又は複数セットを単独で行うものであってもよく，1又は複数のセットを毎日，2日，3日，4日，5日，6日，7日に１回，１，２，３，４週間に１回等，連続的又は断続的に定期的又は不定期的に行うものであってもよい。
　しかしながら，皮膚抗老化作用を発揮するのに十分な刺激が達成されれば上記のような振動数，伸展率，サイクル数，頻度に限定されない。物理刺激を行う波形も，矩形波，正弦波，三角波，のこぎり波等任意に設定できる。
　本発明の方法を適用する対象は，皮膚老化が客観的又は主観的に認められる対象であっても，皮膚老化を予防したいと希望する対象であってもよい。例えば，ヒアルロン酸などの皮膚構成成分が不足していると判断された対象であってもよい。１実施形態では，角層細胞におけるYAPの挙動及び／又はアクチンファイバーの構造を指標として皮膚老化度が高いと判断された対象であってもよい。例えば，伸展角化細胞で測定した場合，全角化細胞数に対する核局在YAPを有する細胞数の割合，及び／又は全角化細胞数に対するアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合が低いと判断された対象であってもよい。あるいは，皮膚の老化，例えば，しみ，しわ，たるみ，くすみ，毛穴の目立ち，あるいは，なめらかさ，はり，ハリ感，つや，弾力の低下等が気になる対象であってもよい。しみ，しわ，たるみ，くすみ，毛穴の目立ち，なめらかさ，はり，ハリ感，つや，弾力等は，視感判定，主観的又は客観的な評価，キュートメーターの値など公知の指標を用いることにより決定することができる。
　皮膚抗老化は，全角化細胞数に対する核局在YAPを有する角化細胞数の割合を測定することにより決定してもよい。核局在YAPの有無は，実施例に記載のように，細胞内のYAPを染色し，核又は細胞質にある内在性YAPを顕微鏡で観察，撮像し，画像処理解析ソフトウェアを使用して核内YAPと細胞質内YAPの比を蛍光強度の度合で数値化することにより決定できる。あるいは，非特許文献６や非特許文献７に記載の方法によっても測定できる。全角化細胞数に対する核局在YAPを有する角化細胞数の割合は，上記式２により算出される。例えば，上記のような方法で核局在YAPを有すると決定された細胞の数を計数し，例えばDAPIやHoechst33342等の核染色により核が染まった細胞を全細胞数として計数して，式２により算出してもよい。
　１実施形態では，YAPの核局在は，角化細胞における内在性のYAPが，その全発現量の増減が実施前後で２倍以下の範囲にとどまり，転写共役因子として核に局在することを指す。非特許文献３～５から，YAPの阻害因子を欠失させ，YAPの核局在を促進させてもタンパク量レベルでの発現量の有意な亢進は起こらない（例えば，非特許文献５ではYAPのタンパク量は平均２倍以下である）ことが確認されているためである。
　YAPとは，Yes-associated proteinのことであり，YAP1，YAP65等と称されることもある約65ｋDaのタンパク質である。YAPは，転写調節因子として機能すること，細胞増殖やアポトーシス等に関与すること，幹細胞(ニッチ)の維持・確立，腫瘍や癌の発生と関連すること等が報告されている。YAPは，細胞質に存在すると分解されるが，核内に移行すると活性化し転写を調節する。このようなYAPの局在は，細胞外マトリックスの硬度，細胞密度，細胞増殖と自己複製等と関連することも報告されている（非特許文献１１～１３）。
　また，YAP上流因子であるアクチンの細胞質におけるストレスファイバー形成がYAP核局在に相関的かつ積極的に関与することが知られている。よって，本発明の皮膚抗老化は，角化細胞におけるアクチンストレスファイバーの有無を指標として決定してもよい。例えば，皮膚抗老化は，全角化細胞数に対するアクチンストレスファイバーを有する角化細胞数の割合を測定することにより決定してもよい。アクチンストレスファイバーの有無は，実施例に記載のように，アクチンファイバーを蛍光化合物を架橋したファロイジンにより染色し，細胞質中や核周辺に存在するアクチンストレスファイバーを１つでも含む場合，アクチンストレスファイバーを有するとして決定することができる。あるいは，非特許文献９や非特許文献１０に記載の方法によっても測定できる。全角化細胞数に対するアクチンストレスファイバーを有する角化細胞数の割合は，上記式３により算出される。例えば，上記のような方法でアクチンストレスファイバーを有すると決定された細胞の数を計数し，例えば上述のようにDAPI染色により全細胞数を計数して，式３により算出してもよい。
　１実施形態では，アクチンストレスファイバーを有する角化細胞は，アクチンタンパク発現量の亢進を伴わずアクチンストレスファイバーが形成された角化細胞を指す。非特許文献８に記載のように，YAPの有無やYAPの存在位置（核，細胞質等）が異なっても，アクチンタンパク量の変動がないためである。
　したがって，本発明の皮膚抗老化とは，例えば，皮膚試料に伸展刺激を与えた後の角化細胞における全角化細胞数に対する核局在YAP又はアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合の低下を本発明の方法／装置により抑制するということを意味する場合もある。抑制は，例えば，有意水準を5％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのt検定）を有する上記割合の低下の抑制，及び／又は，例えば10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上，100％の抑制であってもよい。
　核局在YAPおよびアクチンストレスファイバーは，細胞増殖と自己複製に間接的又は直接的に働くことが知られている（非特許文献１１）。一方，核外または細胞質に局在するYAP，細胞質にて分解するYAP，あるいはアクチンストレスファイバーの不形成は，細胞死や分化により細胞集団から排除される機構に関与することが明らかになってきている（非特許文献１２）。皮膚の角化細胞および様々な細胞種における研究の知見から，YAPが核に局在しないことやアクチンストレスファイバーが形成されないといった現象を有する角化細胞は，自らの増殖維持や自己複製能の低い，老化又は分化様の細胞であることが示唆されている（非特許文献１３）。また，本願実施例において，本発明の方法／装置により，核局在YAP保持能力の弱いあるいはアクチンストレスファイバー形成能力の弱い老化角化細胞の数が有意に減少した。したがって，理論に拘束されるものではないが，本発明の方法／装置は，上記のような老化角化細胞を選択的に排除し，核局在YAP保持能力の弱いあるいはアクチンストレスファイバー形成能力の保持された“若い”角化細胞の選択とその後の再活性化，細胞増殖を促すことが示唆された。つまり，皮膚に本発明で特定する物理刺激を与えることにより伸展した角化細胞において，YAPが核に局在しないまたはアクチンストレスファイバーが形成されていない角化細胞を選択的に排除し，YAPが核に局在する角化細胞やアクチンストレスファイバーを有する角化細胞を選択的に残す結果，角化細胞を増殖または自己複製させている可能性が考えられる。つまり，本発明の方法／装置は，物理刺激を与えることにより，老化角化細胞を選択的に排除し，かつ増殖，自己複製する角化細胞を選択し，その結果，角化細胞の増殖や回復を促している可能性が考えられる。
　ここで，核局在YAP又はアクチンストレスファイバーを有する細胞数を測定する際に，皮膚試料に伸展刺激等の物理刺激を与えることが好ましい。皮膚老化度や皮膚抗老化作用を測定する際の物理刺激は，本発明の抗老化方法／装置で使用する物理刺激と同じであっても異なっていてもよく限定されず，皮膚老化度を測定するのに十分な刺激が達成されればよい。例えば，生体における皮膚，採取後の皮膚，又は培養角化細胞といった皮膚試料に対し，引張，押圧，叩く，揉む，吸引，といった接触，及び／又は，例えば，超音波や空気圧のようなもので皮膚に衝撃波をあたえることで変位させるといった非接触による物理的な刺激を与えることにより皮膚試料の伸展を達成するものであってもよく，物理刺激を与える方向も限定されない。
　代替的及び／又は追加的に，皮膚抗老化作用は，本発明の方法／装置による真皮におけるヒアルロン酸量の増加を意味する場合もある。増加は，例えば，有意水準を5％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのt検定）を有するヒアルロン酸の増加，及び／又は，例えば10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上，100％以上の増加であってもよい。
　代替的及び／又は追加的に，皮膚抗老化作用は，本発明の方法／装置による，皮膚粘弾性，はり，ハリ感，つや，なめらかさ，毛穴の目立たなさ，くすみのなさといった指標の増加を意味する場合もある。皮膚粘弾性，はり，ハリ感，つや，なめらかさ等はキュートメーターや主観的又は客観的な指標により測定できる。増加は，例えば，有意水準を5％とした統計学的有意差（例えばdunnett’s testやwilcoxonの符号付順位検定）を有する増加，及び／又は，例えば10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上，100％以上の増加であってもよい。
　本発明の方法および装置は，表皮といった浅い層に好ましい作用を奏しながら，皮膚老化を予防・改善することができる。例えば，角化細胞におけるYAPの挙動やアクチンファイバーの構造を改善すること，特に，皮膚に物理刺激を与えた際の全角化細胞に対する核局在YAPやアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合の減少を抑制あるいはその後の増加を回復することができる。さらに，真皮におけるヒアルロン酸の増加，皮膚粘弾性や上記のような主観的又は客観的な指標の増加をもたらすこともできる。
　また，本発明の皮膚抗老化のための方法／装置は，他の処置と併用してもよい。他の処置としては，例えば，光刺激，電気刺激，機械刺激，人の手による刺激といった刺激の適用，抗老化剤の投与，化粧料の塗布などが挙げられるがそれらに限定されない。抗老化剤は，天然または化学的に合成された化合物であってもよく，動植物の抽出物であってもよく，単体又は混合物，あるいは，水溶液等の溶媒中に含有された状態，化粧料などの形態であってもよい。また，抗老化剤の投与経路は任意に選択でき，例えば経口投与，経皮投与，皮下投与，経粘膜投与，筋肉内投与等が挙げられる。
　本発明の皮膚抗老化のための方法／装置は，美容，医療，ストレス緩和，リラックス等を目的とする方法／装置であってもよい。ある実施形態では，本発明の皮膚抗老化のための方法／装置は，美容を目的とするものであり，医師や医療従事者が使用する治療方法／装置ではない場合がある。また，本発明は，本発明の美容方法／装置を対象に提示することを含む，対象の美容行為を支援する美容カウンセリング方法も提供する。
　本明細書において引用される全ての文献はその全体が引用により本明細書に援用される。
　次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。本発明の実施例は例示のみを目的とし，本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として，本発明の変更，例えば，本発明の構成要件の追加，削除及び置換を行うことができる。
　実験1：老化による角化細胞のin vitroの変化
　試料：株式会社ケー・エー・シーから購入した年齢の異なるドナー（0歳，18歳，44歳，64歳）由来の単層培養角化細胞および線維芽細胞培養物を使用した。
　伸展条件：Menicon Life Science社製のShellPaを使用し，上記の角化細胞および線維芽細胞に伸展刺激を与えた。伸展刺激は図1の下図中央に記載のような10%の伸展率で行った。サイクルは，図１上図左に記載のように，0.33%/sの伸展速度にて培養チェンバーを一方向に引っ張り，細胞を10%の伸展率まで伸展させた。その後，伸展状態を5分間維持し，0.33%/sの回復速度にて細胞を元の非伸展状態に戻した。これを1サイクルとし，合計27サイクルを3時間かけて行った。サイクル間での休止時間は0～10秒とした。
　観察方法：非伸展刺激および伸展刺激後の細胞内YAPを以下のように蛍光抗体染色法で観察した。細胞におけるYAPは抗YAP抗体（Santa Cruz Biotechnology, YAP抗体(63.7): sc-101199）用い，アクチンファイバーは蛍光化合物が架橋したファロイジン（ThermoFisher Scientific, Alexa FluorTM 488 Phalloidin: A12379）を用いて検出，共焦点レーザー顕微鏡（ZEISS, LSM700）により観察および画像取得した。また，画像処理解析ソフトウェアImageJを使用してYAPの核と細胞質比を蛍光強度の度合で数値化した。核と細胞質との蛍光強度比（核内YAPの蛍光強度/細胞質内YAPの蛍光強度)を算出し，その値が１≧のものを核内YAPを有する細胞としてその細胞数を計数した。全細胞数は，DAPI（Vector Laboratories, VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI:H-1200）を用いて染色し，核が染まっている細胞の数を計数し，核局在YAPを有する細胞数の割合を式２に従って算出した。また，細胞質中や核周辺にあるアクチンストレスファイバーを１つでも含む細胞をアクチンストレスファイバーを有する細胞として計数し，同様に全細胞数を計数し，アクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合を式３に従って算出した。
　結果：
　角化細胞の顕微鏡写真を図２a，bに示す。これらの図からわかるように，若年層のドナー（0歳，18歳）から得た角化細胞では，伸展刺激の有り無しのいずれの条件においてもほぼ全ての細胞でYAPが核に局在するが，中高年層のドナー（44歳，64歳）から得た角化細胞では，伸展刺激を与えると核局在YAPを有する細胞数が急激に減少した。図３は，角化細胞における核局在YAPを有する細胞数の割合を示す。若年層では核局在YAPを有する細胞の数に変化は見られないものの，高齢者の角化細胞では有意に減少した。しかしながら，激減はしたものの核局在YAPを有する細胞数はゼロにはならず一定の割合で存在していた。角化細胞におけるアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合を示す図４では，若年層ではアクチンストレスファイバーを有する細胞の数に変化は見られず，高齢者の角化細胞では有意に減少しほぼ見られなくなった。一方，線維芽細胞では，図５に示すように，伸展刺激の有り無しの条件においてYAPやアクチンストレスファイバーに変化は見られず，年齢差もほとんど見られなかった。
　実験２：老化による角化細胞のex vivoの変化
　試料：Genoskin社から得たex vivoヒト腹部皮膚組織片（NativeSkin， 12well size，直径約1cm）を使用した。組織片は38歳のものである。
　伸展条件：図６に示すようなプラスチック製の押圧部を作成した。押圧部の底面が試料の上面に押圧されるように試料の上部から垂直に押し下げて，0.1％以下の伸展率で皮膚が伸展されるように調整した。このような押下運動を図7に示すように10％/sの速度で行い，その後押圧部を保持して10秒間伸展状態を維持し，10％/sの速度で持ち上げて元の非伸展状態に戻し，次の押下運動まで10秒間休止した。これを1サイクルとし，90サイクルを30分間かけて行った。この90サイクルを1セットとし，セット間に30分～1時間の休止時間を設けて合計3セットの押下運動（合計270サイクル）を行った。
　観察方法：伸展刺激の有り無しの条件において，YAPおよびDAPIを実験１と同様の方法で染色，観察，および画像取得を行った。
　結果：
　実験１でみられた老化によるYAPの挙動の変化はex vivoの試料でも同様に見られた。図8に見られるように，中高年層のドナー（38歳）から得たex vivo皮膚モデルにおいても表皮内の角化細胞では，伸展刺激を与えると核局在YAPが減少し染色されない部分が多くみられた。特に基底層近辺でこのような変化が著しかった。
　実験３：伸展刺激による角化細胞におけるin vitroの効果
　試料：実験1と同じ中高年層のドナー(44歳)の角化細胞の単層培養物を使用した。
　伸展条件：実験１と同じ伸展刺激を与えた。つまり，実験１で行った27サイクルの伸展刺激のセットを与えた。しかし，27サイクルからなる1セットの伸展刺激を3時間与えてから12～24時間経った後，試料に更に同じ伸展刺激を与え合計2セット行った。
　観察方法：非伸展刺激および伸展刺激後のYAPは実験１と同様に染色した。また，増殖マーカーとしてBrdUを，抗BrdU抗体（Abcam, Anti-BrdU 抗体 [BU1/75 (ICR1)]: ab6326）を用いて蛍光抗体法により染色した。BrdUの処理は6時間行い，その7日後に４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃にて２４時間固定した。固定した試料を共焦点レーザー顕微鏡（ZEISS, LSM700）を用いて観察および画像取得を行った。
　結果を図９に示す。1回目の伸展刺激では，実験1と同様，伸展刺激前後で核局在YAPを有する細胞数に大きな変化があった。BrdUも核局在YAPと同様に伸展刺激により激減した。一方，1回目の伸展刺激から24時間後に2回目の伸展刺激を与えた場合，核局在YAPおよびBrdUは，非伸展刺激条件と２回伸展刺激条件の間で大きな変化が見られないかやや増加していた。核局在YAPと増殖細胞には何らかの関連性があることが示唆されかつ，１回の伸展刺激よりも2回の伸展刺激を与えた後の細胞は，自己複製能をもつ細胞が増加しており，非伸展あるいは若年の角化細胞と同様の細胞増殖能を回復あるいは維持していることが示唆される。理論に拘束されるものではないが，１回目の伸展刺激により，増殖維持や自己複製能の低い老化角化細胞の細胞死が促進されるか，剥がれ落ちるといった何らかの機構により，老化角化細胞を選択的に排除し，増殖維持や自己複製能の高い核局在YAPを示す細胞を選択的に残すことにより角化細胞の増殖や回復を促している可能性が考えられる。
　実験４：伸展刺激による表皮におけるex vivoの効果
　試料：Genoskin社から購入した中高年層のドナー(42歳)のex vivoヒト腹部皮膚組織片（NativeSkin， 6well size，直径約2～2.5cm）を使用した。
　伸展条件：図１０に示すようなウェル内の皮膚の両端を把持する把持部を有し，把持部を引っ張ることにより皮膚を伸展させる伸展器具を作成した。上記組織片が入ったウェルを水平に設置し，把持部を操作して両端から皮膚を伸展させ図7に示すように10%の伸展率となる伸展を10%/sの速度で行い，10%/sの回復速度にて試料を元の非伸展状態に戻した。これを1サイクルとし，合計90サイクルを30分間かけて行った。この90サイクルを1セットとし，セット間に30分～1時間の休止時間を設けて合計3セット（合計270サイクル）行った。この3セットの伸展刺激を3時間与えてから12～24時間経った後，試料に更に同じ3セットの伸展刺激を2日連続で2回行った。
　観察方法：非伸展刺激０日目，伸展刺激直後(同０日目)，非伸展刺激，伸展刺激処理した皮膚組織を1週間培養した後に，実験１と同様のYAPとDAPI処理を行い，更に増殖マーカーとしてKi67を抗Ki67抗体（Abcam, Anti-Ki67 抗体 [SP6]: ab16667）を用いて染色を行い，実験1と同様の手順で観察および画像取得を行った。
　図１１に非伸展刺激０日目および伸展刺激直後(同０日目)の様子を示す。YAPを有する基底層の表皮細胞が減少し，増殖マーカーKi67は引張直後に増えていた。理論に拘束されるものではないが，伸展刺激により細胞増殖とその後の細胞分化の過程を促進した可能性も考えられる。図１２に伸展刺激を2日連続で2回与えた後に1週間培養した後の様子を示す。伸展前では，基底層のみならず表皮細胞全体にわたりYAPが見られた。YAPは，通常基底層に多くみられるが，1週間培養した皮膚では全層にわたり観察された。理論に拘束されるものではないが，非伸展の皮膚組織では，細胞老化により，例えば，表皮内の各層における細胞増殖や細胞分化に何かしらの異常が起こり，YAPの分布が変化している可能性も考えられる。しかしながら，2回の伸展刺激後YAPの発現分布は基底層に維持されていた。理論に拘束されるものではないが，物理刺激により，表皮における細胞増殖，細胞分化のホメオスタシスが活性化，維持された結果，YAPの分布が1週間の培養後でも初期の新鮮な皮膚組織の通常状態を維持している可能性も考えられる。
　実験５：伸展刺激による真皮におけるex vivoの効果
　試料および伸展条件：実験４と同じGenoskin社から購入した中高年層のドナー(44歳)のex vivoヒト腹部皮膚組織片（NativeSkin，6well size，直径約2～2.5cm）を使用した。実験４と同じ伸展である3セットの伸展刺激を2日連続で2回行った。
　観察方法：伸展刺激前，伸展刺激後1週間培養した後のDAPI，ヒアルロン酸(HOKUDO, Biotin-HABP: BC41)，コラーゲン(Merck Millipore, Anti-human COL1N-terminal antibody: MAB1912)を観察した。DAPIは実験１と同様に，ヒアルロン酸，コラーゲンは蛍光抗体法により染色し共焦点レーザー顕微鏡（ZEISS, LSM700）により観察および画像取得した。
　結果を図１３に示す。伸展刺激を与えた場合，真皮におけるヒアルロン酸が増加していた。伸展刺激により表皮細胞の増殖を促進するのみならず，真皮にも好ましい影響を与えていることが示される。
　実験６：伸展刺激によるin vivoの効果
　被験者：健康な30～50代の女性17名を選定した。
　伸展条件：図14左に記載の伸展装置を使用した。この装置は，図14左の矢印で示す皮膚接触部が皮膚に触れ，皮膚固定部が皮膚を固定しつつ皮膚伸展部の皮膚に対する垂直方向押し込み量を最大約5mmの範囲で適宜設定することで水平方向の伸展率が0.1～20％となるようにし，皮膚を1.2Hzの振動数で伸展するように設計されている。被験者は半顔にこの装置を適用することで伸展刺激を毎日30分与える操作を10日間行った。
　測定方法：実験開始後3日目と10日目に伸展刺激を付与した（treated）及び付与しなかった（control）半顔毎の皮膚状態の測定を行った。皮膚状態の計測は，経皮水分蒸散量（TEWL）をDelfin Technologies社のバポメーターにより測定し，皮膚水分量をCourage+Khazaka社のコルネオメーター（CM825）により測定し，皮膚粘弾性をCourage+Khazaka社のキュートメーター（SEM575）により測定することにより行った。得られたデータはdunnett’s testで0日目の値とそれぞれを比較することにより統計処理を行った(*** :p<0.005, ** :p<0.01, *:p<0.05)。
　更に，被験者は，伸展刺激を与える前と10日後の頬の印象を，下記に示す評価項目ごとに5段階評価にて記入することにより主観的な評価を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　主観的評価の結果は，wilcoxonの符号付順位検定により統計処理を行った(***:p<0.005, **:p<0.01, *:p<0.05)。
　結果:結果を図１５a～cに示す。図１５aに示すようにTEWLおよび皮膚水分量のいずれも伸展刺激による変化はなかったが，図１５bに示すようにキュートメーターによる測定ではR0値が有意に増加しており皮膚粘弾性が改善していることがわかった。この傾向はR2値及びR7値でも見られた。また，図１５cに示すように見た目及び触感のいずれでも被験者は皮膚状態が改善されたことを実感していることが分かった。
　実験７：押圧刺激によるex vivoの効果
　試料：実験４と同じGenoskin社から購入した中高年層のドナー(44歳)のex vivoヒト腹部皮膚組織片（NativeSkin，6well size，直径約2～2.5cm）を使用した。
　押圧条件：誘電エラストマーアクチュエータ（住友理工株式会社製：SRHP074-001）を使用した。図１６左上に記載のようにこの誘電エラストマーアクチュエータを上記皮膚組織片に施し，収縮と拡張を繰り返すことにより，図１６下部に記載の条件で各種波形の0～100μmの押圧刺激を0.5Hz，5Hz，又は50Hzの振動数で1日又は5日間与えた。
　観察方法：押圧刺激前，押圧刺激後のDAPI，Ki67を実験4と同様の方法で観察した。
　結果：
　結果を図１７，１８に示す。押圧刺激を与えない場合（Cont：silent）1日目に比べ5日目のKi67の数が減少していたが，押圧刺激を与えた場合（0.5Hz/100μm：square），5日目の表皮細胞のKi67の減少が抑制されており，押圧刺激によって表皮細胞の増殖抑制が抑えられることが示された。また押圧刺激は0.5Hz程度の低い振動数のほうが5Hz，50Hzの場合に比べて高い効果を示した。なお，図１７，１８の結果は矩形波の場合（square）を示しているが正弦波（sin）の場合であっても同様の結果が得られた。
　実験８：押圧刺激によるin vivoの効果
　被験者：健康な30～50代の女性17名を選定した。
　伸展条件：図１９に記載の押圧装置，誘電エラストマーアクチュエータ（住友理工株式会社製：SRHP074-001）を使用した。この装置は，図１９上に示す装置の皮膚接触部が10gfの力で皮膚を押し込むことにより，5Hzの振動数で100μmの深度にて図１９下に示す矩形波の押圧刺激を皮膚に与えるように設計されている。図１９に示すように，被験者の前腕内側部にこの装置を適用し押圧刺激を毎日30分与える操作を5日間行った。
　測定方法：実験開始前と7日目に押圧刺激を付与した及び付与しなかった前腕内側部の皮膚状態の測定を行った。皮膚状態の計測は，経皮水分蒸散量（TEWL）をDelfin Technologies社のバポメーターにより測定し，皮膚水分量をCourage+Khazaka社のコルネオメーター（CM825）により測定し，皮膚粘弾性をCourage+Khazaka社のキュートメーター（SEM575）により測定することにより行った。
　結果：結果を図２０a～cに示す。TEWLおよび皮膚水分量のいずれも押圧刺激による変化はなかったが，キュートメーターの結果は，押圧刺激を与えないと７日目にはR0値が有意に減少したが押圧刺激を与えることによりその減少が抑えられており，粘弾性の改善が見られた。
　本願発明の物理刺激を施した皮膚では，伸展刺激による老化細胞の選択的排除かつ核局在YAP，アクチンストレスファイバーを有する角化細胞の選択的保持が示唆された。また，それら選択された核局在YAP，アクチンストレスファイバーを有する角化細胞の細胞増殖を示唆する結果も得た。さらには角化細胞が存在する表皮のみならず，真皮におけるヒアルロン酸の量が増加していた。つまり，本発明の美容方法／装置を用いると，表皮のみならず真皮といった部分を含めた皮膚に対し抗老化作用を奏することが示唆される。実際にin vivoで本発明の美容方法／装置をヒトに適用すると皮膚の粘弾性や，はり，つや，くすみ，なめらかさといった見た目及び触感が改善した。

Claims (8)

  1. 　対象における皮膚抗老化のための美容方法であって，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を含み，ここで当該工程は，例えば，
    　（ａ）前記対象の皮膚を0.1％以上50.0％以下の伸展率まで伸展すること；及び
    　（ｂ）前記対象の皮膚を伸展状態から回復すること；
    並びに／又は，
    　（ａ－１）前記対象の皮膚を，1μm～1000μm押圧すること；及び
    　（ｂ－１）前記対象の皮膚を押圧状態から回復させること；
    を含むサイクルを60Ｈｚ以下の振動数で行う物理刺激を対象の皮膚に与えることを含み，　ここで，伸展率は，
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     （式中，定点AおよびBは，表皮または表皮が接着しているマトリックス上の任意の位置であり，ここで定点AとBを通る直線が伸展方向と平行である）
    で算出される，前記美容方法。
  2. 　前記サイクルを2～500サイクル行うセットを，１又は複数セット行う，請求項１に記載の美容方法。
  3. 　前記皮膚抗老化は，全角化細胞数に対する核局在YAPを有する細胞数の割合を指標として測定された場合，皮膚に前記美容方法を適用した後に伸展角化細胞で測定される核局在YAPを有する細胞数の割合が前記美容方法を適用する前と比べて増加することであり，ここで，核局在YAPを有する細胞数の割合は，
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
     で算出される，請求項１又は２に記載の美容方法。
  4. 　前記皮膚抗老化は，全角化細胞数に対するアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合を指標として測定された場合，皮膚に前記美容方法を適用した後に伸展角化細胞で測定されるアクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合が増加することであり，ここで，アクチンストレスファイバーを有する細胞数の割合は，
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
     で算出される，請求項１又は２に記載の美容方法。
  5. 　皮膚抗老化のための美容装置であって，
    　前記装置は，
    　物理刺激を生ずる刺激発生部と，
    　刺激発生部で発生した物理刺激を皮膚に付与する刺激付与部とを備え，
    　ここで，当該装置は，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を行うための装置であり，ここで当該工程は，例えば，（ａ）皮膚を0.1％以上50.0％以下の伸展率まで伸展すること；及び
    　（ｂ）前記対象の皮膚を伸展状態から回復すること；
    並びに／又は，
    　（ａ－１）前記対象の皮膚を，1μm～1000μm押圧すること；及び
    　（ｂ－１）前記対象の皮膚を押圧状態から回復させること；を含むサイクルを60Ｈｚ以下の振動数で行うことであり，
    　ここで，伸展率は，上記式１により算出される，前記美容装置。
  6. 　請求項５に記載の美容装置を対象の皮膚に適用することを含む，皮膚抗老化のための美容方法。
  7. 　皮膚におけるヒアルロン酸を増加するための，請求項１～４及び６のいずれか１項に記載の美容方法。
  8. 　請求項１～４，６及び７のいずれか１項に記載の美容方法又は請求項５に記載の美容装置を対象に提示することを含む，対象の美容行為を支援する美容カウンセリング方法。
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