WO2020180146A1 - 당뇨망막병증 진단용 복합 마커 및 이의 용도 - Google Patents

당뇨망막병증 진단용 복합 마커 및 이의 용도 Download PDF

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WO2020180146A1
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diabetic retinopathy
protein
diagnosis
marker
kit
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박성준
이영주
김혜림
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(주)레티마크
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Definitions

  • the present invention relates to a composite marker for diabetic retinopathy diagnosis and a use thereof, and more particularly, to a composite for diabetic retinopathy diagnosis with increased diagnostic performance consisting of two or more blood markers specific for diabetic retinopathy diagnosis. It's about the marker.
  • it relates to a composition for diagnosing diabetic retinopathy using the composite marker, a diagnostic kit, and a method of providing information necessary for diabetic retinopathy diagnosis.
  • Diabetic retinopathy is a typical complication of diabetes that occurs when microvessels of the retina are damaged, and is one of the three major blind diseases in ophthalmology along with age-related macular degeneration and glaucoma.
  • DR Diabetic retinopathy
  • the number of diabetic patients increased by 21% from about 2 million in 2012 to about 2.45 million in 2016, but the number of diabetic retinopathy was 38% from about 260,000 in 2012 to 336,000 in 2016. Increased to, and the increase was greater than that of diabetes.
  • Diabetic retinopathy occurs because abnormally new blood vessels are formed in this area, causing bleeding without normal blood vessel function.
  • Diabetic retinopathy is classified into non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) and proliferative diabetic retinopathy (PDR) according to its severity. In addition, NPDR is classified into mild, moderate, and severe NPDR according to its degree.
  • Nonproliferative diabetic retinopathy shows retinal bleeding, microvascular perfusion, and cotton patches, but maintains good vision until late.
  • proliferative diabetic retinopathy new blood vessels are formed in the retina, and if these blood vessels rupture, it causes severe bleeding in the vitreous cavity. It is absorbed over time, but becomes a fibrous tissue, which in turn causes tractional retinal detachment and rebleeding. Leads to blindness.
  • Diabetic retinopathy is difficult to diagnose early because there are few initial symptoms, and when symptoms (vision loss, loss of focus, glare) are in progress, the disease has already progressed, and despite treatment (laser, vitreous surgery), it leads to blindness. There are many patients. However, the need for early detection and suppression of diabetic retinopathy and early treatment for high-risk groups is emerging, since it is possible to maintain visual acuity if appropriate treatment is received at the beginning of the onset and blood sugar management is thorough. However, the exact etiology has not yet been identified, and biomarkers that determine the progression of retinopathy have very limited problems.
  • the present inventors discovered blood protein markers with high sensitivity and specificity, and tried to improve the early diagnosis ability of diabetic retinopathy by using them in combination.
  • MBL2 mannose-binding protein C
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • LGALS3BP glycosylglycerol lipase
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • An object of the present invention is to provide a complex marker for diabetic retinopathy diagnosis comprising a blood marker specific for diabetic retinopathy diagnosis.
  • Another object of the present invention is to provide a composition or a diagnostic kit for diabetic retinopathy using the complex marker for diabetic retinopathy diagnosis.
  • Another object of the present invention is to provide a method of providing information necessary for diabetic retinopathy diagnosis using the complex marker for diabetic retinopathy diagnosis.
  • the present invention provides a complex marker for diabetic retinopathy diagnosis including manose-binding protein C (MBL2), pancreatic triacylglycerol lipase (PNLIP), galectin-3-binding protein (LGALS3BP), and insulin like growth factor binding protein 2 (IGFBP2). do.
  • MBL2 manose-binding protein C
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • LGALS3BP galectin-3-binding protein
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • the complex markers are ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2), Cp (Ceruloplasmin), CFH (complement factor H), DDI2 (Protein DDI1 homolog2), FCN2 (Ficolin 2), SELE ( E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1 (Thrombospondin-1), and ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B) may further include one or more markers selected from the group consisting of. .
  • the present invention is a complex marker for diabetic retinopathy diagnosis including manose-binding protein C (MBL2), pancreatic triacylglycerol lipase (PNLIP), galectin-3-binding protein (LGALS3BP), and insulin like growth factor binding protein 2 (IGFBP2) It provides a composition for diabetic retinopathy diagnosis comprising an agent for measuring the level of mRNA or protein.
  • MBL2 manose-binding protein C
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • LGALS3BP galectin-3-binding protein
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • the complex marker is ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2), Cp (Ceruloplasmin), CFH (complement factor H), DDI2 (Protein DDI1 homolog2), FCN2 (Ficolin 2), SELE ( E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1 (Thrombospondin-1), and ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B) may further include one or more markers selected from the group consisting of. .
  • the agent for measuring the mRNA level of the complex marker may be a primer pair, a probe, or an antisense nucleotide that specifically binds to the gene of the marker.
  • the agent for measuring the protein level of the complex marker is an antibody, interacting protein, ligand, nanoparticles or aptamer that specifically binds to the protein or peptide fragment. (aptamer) may be included.
  • the present invention provides a diagnostic kit for diabetic retinopathy comprising the composition for diabetic retinopathy diagnosis.
  • the kit is a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) kit, a protein chip kit, a rapid kit, or an MRM ( Multiple reaction monitoring) kit.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • DNA chip kit a DNA chip kit
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • protein chip kit a protein chip kit
  • rapid kit a rapid kit
  • MRM Multiple reaction monitoring
  • the present invention (a) MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP (pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP (galectin-3-binding protein) and IGFBP2 (insulin like growth factor binding protein 2) from biological samples. Measuring the mRNA or protein level of the complex marker for diabetic retinopathy diagnosis comprising; And
  • It provides a method for providing information for diabetic retinopathy diagnosis comprising; (b) comparing the mRNA or protein expression level with a control sample.
  • the complex marker is ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2), Cp (Ceruloplasmin), CFH (complement factor H), DDI2 (Protein DDI1 homolog2), FCN2 (Ficolin 2), SELE ( E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1 (Thrombospondin-1), and ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B) may further include one or more markers selected from the group consisting of. .
  • the method of providing information for diabetic retinopathy is the patient's age, body mass index (BMI), smoking, Hb1Ac test results, insulin treatment, hypertension, hyperlipidemia, and One or more clinical information selected from the group consisting of cardiovascular disease may be additionally included and compared with the control group.
  • the method of providing information for diabetic retinopathy further comprises determining that the gene expression level or the protein expression level of the complex marker is increased compared to the control group, determining that it is diabetic retinopathy. can do.
  • the mRNA expression level is measured using reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real-time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, Northern blotting or DNA chip. You can do it.
  • the protein expression level measurement is performed by multiple reaction monitoring (MRM), parallel reaction monitoring (PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high- It can be performed using resolution (SWATH), selected reaction monitoring (SRM) or immune multiple reaction monitoring (iMRM).
  • MRM multiple reaction monitoring
  • PRM parallel reaction monitoring
  • SWATH resolution
  • SRM selected reaction monitoring
  • iMRM immune multiple reaction monitoring
  • the analysis in step (b) may be performed by a statistical analysis method.
  • the statistical analysis method may include a linear or nonlinear regression analysis method, a linear or nonlinear classification analysis method, a logistic regression method, and an Analysis of Variance; ANOVA), neural network analysis method, genetic analysis method, support vector machine analysis method, hierarchical analysis or clustering analysis method, hierarchical algorithm using decision tree or kernel principal component analysis method, Markov Blanket analysis method , Recursive feature elimination or entropy-basic regression feature elimination analysis method, forward floating search or rear floating search analysis method, and a combination thereof.
  • ANOVA Analysis of Variance
  • the complex marker for diabetic retinopathy diagnosis of the present invention has superior sensitivity and diagnostic performance compared to the combination of other markers, and when the protein quantitative value of the complex marker and basic clinical information are combined and analyzed, it is highly diagnosed in early diabetic retinopathy. It was confirmed that it showed the ability.
  • the composite marker of the present invention can be conveniently used for early diagnosis of diabetic retinopathy because it can be conveniently analyzed using patient plasma without using a biopsy as a blood protein.
  • DMR diabetic retinopathy
  • Non DMR Non-diabetic retinopathy
  • FIG. 2 is data analyzed by statistically processing a logistic regression model (A) and a T-test (B) by combining quantitative protein values of complex markers and basic clinical information of patients with nonproliferative diabetic retinopathy (NPDR: nonproliferative diabetic Retinopathy
  • NPDR nonproliferative diabetic Retinopathy
  • DMR Nondiabetic retinopathy
  • 3 is data analyzed by statistically processing a logistic regression model (A) and a T-test (B) by combining the quantitative value of protein of a complex marker and basic clinical information of a patient with proliferative diabetic retinopathy (PDR: proliferative diabetes Retinopathy Non DMR: Nondiabetic retinopathy).
  • A logistic regression model
  • B T-test
  • FIG. 4 is data analyzed by statistically processing the protein quantification value of a complex marker and basic clinical information of a patient with staged nonproliferative diabetic retinopathy by a T-test.
  • A is data comparing non-diabetic retinopathy (Non DMR) and mild nonproliferative diabetic retinopathy (mild NPDR)
  • B is data comparing non-diabetic retinopathy (Non DMR) and moderate diabetic retinopathy (moderate NPDR).
  • C is data comparing non-diabetic retinopathy (Non DMR) and severe diabetic retinopathy (sever NPDR).
  • FIG. 5 is a protein according to a combination of MLB2, IGFBP2, LGALS3BP and PNLIP (combination 1) and ADAMTSL2, CP, DDI, FCN2, SIGLEC14, SELE, THBS1, ZG16B and CFH combination (combination 2) among the 13 markers identified in the present invention.
  • This data is analyzed by statistically processing a logistic regression model by combining quantitative values and basic clinical information of all diabetic retinopathy patients.
  • the present invention is a composite for diabetic retinopathy diagnosis comprising manose-binding protein C (MBL2), pancreatic triacylglycerol lipase (PNLIP), galectin-3-binding protein (LGALS3BP), and insulin like growth factor binding protein 2 (IGFBP2). It is about the marker.
  • MDL2 manose-binding protein C
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • LGALS3BP galectin-3-binding protein
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • diagnosis means identifying the presence or characteristics of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether diabetic retinopathy has occurred.
  • diagnostic marker refers to a polypeptide or nucleic acid showing a significant increase or decrease in the gene expression level or the protein expression level in an individual with diabetic retinopathy compared to a normal control (individual non-diabetic retinopathy) ( Examples: mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins, and organic biomolecules such as sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.).
  • Diabetic retinopathy is classified into early nonproliferative diabetic retinopathy (NPDR) and late proliferative diabetic retinopathy (PDR) according to the degree of progression.
  • Nonproliferative diabetic retinopathy is characterized by the inability to develop blood vessels.
  • Proliferative diabetic retinopathy differs in its mechanism, such as blood vessel development, and nonproliferative diabetic retinopathy does not necessarily progress to proliferative diabetic retinopathy, so even a marker known as a diagnostic marker for proliferative diabetic retinopathy must be It cannot be used as a diagnostic marker for nonproliferative diabetic retinopathy.
  • the composite marker of the present invention can specifically diagnose both non-proliferative diabetic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy, and in particular, can diagnose an early stage of non-proliferative diabetic retinopathy.
  • the complex marker is ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2), Cp (Ceruloplasmin), CFH (complement factor H), DDI2 (Protein DDI1 homolog2), FCN2 (Ficolin 2), SELE (E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1 (Thrombospondin-1), and ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B) It may be characterized in that it further comprises at least one marker selected from the group consisting of.
  • ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2) is a member of a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS)-like protein subfamily, and is a glycoprotein that binds to the cell surface and extracellular matrix.
  • ADAMTSL2 interacts with LTBP1 (latent transforming growth factor beta binding protein 1), and LTBP1 protein is involved in the storage of TGF- ⁇ 1, an important growth factor that regulates cell growth and division, so ADAMTSL2 has the possibility of using TGF- ⁇ 1. Adjust.
  • ADAMTSL2 is expressed in cancer tissues, it is used as a marker for cancer diagnosis.
  • the ADAMTSL2 may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • Cp is the main protein that carries copper in the blood and plays an important role in iron metabolism. More than 95% of copper is present in the plasma of healthy people in the form of ceruloplasmin.
  • the Cp may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • CFH complement factor H
  • complement factor H is a glycoprotein that plays an essential role in maintaining the immune response by regulating complement activation. It binds to the same sugar chain structure on the cell surface and acts as a complement inhibitor to prevent complement activation and amplification.
  • the CFH may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • DDI2 Protein DDI1 homolog2 is an internal peptide cleavage enzyme that activates nuclear respiratory factor 1 (Nrf1), which is involved in regulating cell growth and DNA replication, and compensates for proteasome degradation.
  • Nrf1 nuclear respiratory factor 1
  • the DDI2 may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • FCN2 (Ficolin 2) is a type of oligolectin and is composed of a short N-terminal partial-collagen-like domain and a fibrinogen-like domain. It is mainly expressed in the liver and is known to play an important role in the lectin pathway of the complement system by binding to N-acetylglucosamin in the bacterial cell wall and acting as an opsonin like a mannose binding protein.
  • the FCN2 may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • IGFBP2 insulin like growth factor
  • the IGFBP2 may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • LGALS3BP (galectin-3-binding protein) is a protein encoded by the LGALS3BP gene, and specifically binds to Mac-2 (human macrophage-associated lectin) and galactin 1 (galectin 1). LGALS3BP is known to increase in serum of cancer patients and HIV-infected patients, and is involved in immune responses associated with natural killer (NK) cells and lymphokine-activated killer (LAK) cytotoxicity.
  • NK natural killer
  • LAK lymphokine-activated killer
  • the LGALS3B may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • Mannose-binding protein C is also referred to as mannose-binding lectin (MBL) or mannan-binding protein (MBP).
  • MBL2 has an oligomer structure (400-700 kDa) and is composed of subunits containing three identical peptide chains consisting of approximately 30 kDa. It is produced by the liver in response to infection and is part of a number of other factors called acute stage proteins.
  • the MBL2 may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • PNLIP is known to have a low serum concentration because it is secreted into the duodenum through the pancreatic duct system.However, when pancreatic functions such as pancreatitis or pancreatic adenocarcinoma are extremely destroyed, pancreatic enzymes including PNLIP are secreted into the serum. It is known that acute pancreatitis can be diagnosed by measuring.
  • the PNLIP may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • SELE E-selectin
  • CD62E CD62 antigen-like family member E
  • ELAM-1 endothelial-leukocyte adhesion molecule 1
  • LECAM2 leukocyte-endothelial cell adhesion molecule 2
  • interleukin 1 ⁇ tumor necrosis factor.
  • SELE is a cell adhesion molecule that is transiently expressed and induced in vascular endothelial cells activated by lipopolysaccharides with a peak of 4 to 12 hours.
  • SELE is strongly expressed in vascular endothelial cells in inflammatory tissues and promotes invasion of these cells into the inflammatory site by mediating the phenomenon that neutrophils and monocytes roll over vascular endothelial cells. It is known to be involved in adhesion of cancer cells to vascular endothelial cells.
  • the SELE may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14) is one of the subfamily of SIGLEC (Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins), and SIGLEC is a cell surface protein that binds to sialic acid and is mainly expressed on the surface of immune cells.
  • the protein interaction between SIGLEC and sialic acid acts as a switch to turn on and off the immune system, and cancer cells are also known to acquire resistance to the immune response by using the SIGLEC-sialic acid reaction.
  • the SIGLEC14 may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • THBS1 Thrombospondin-1
  • thrombospondin-1 is one of the thrombospondin family and is a glycoprotein that inhibits neovascularization and tumorigenesis. It is known that it binds to proteases related to angiogenesis, such as plasminogen, urokinase, MMP, thrombin, and cathepsin, and regulates adhesion, migration, and growth of endothelial cells.
  • the THBS1 may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B) is a pancreatic adenocarcinoma upregulated factor (PAUF), and is known to bind to carbohydrates and activate internal epithelial cells, angiogenesis, and permeability.
  • PAUF pancreatic adenocarcinoma upregulated factor
  • the ZG16B may preferably include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, but the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, or 99% or more of the same sequence may be included.
  • the markers can be used for diabetic retinopathy, and in particular, it is possible to increase the diagnostic performance of diabetic retinopathy by using a complex marker of MBL2, PNLIP, LGALS3BP and IGFBP2. None is known about the disclosed technology.
  • the present invention is a complex for diabetic retinopathy diagnosis including manose-binding protein C (MBL2), pancreatic triacylglycerol lipase (PNLIP), galectin-3-binding protein (LGALS3BP), and insulin like growth factor binding protein 2 (IGFBP2). It relates to a composition for diabetic retinopathy diagnosis comprising an agent measuring the level of mRNA or protein of a marker.
  • MBL2 manose-binding protein C
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • LGALS3BP galectin-3-binding protein
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • ADAMTSL2 ADAMTS-like protein 2
  • Cp Ceruloplasmin
  • CFH complement factor H
  • DDI2 Protein DDI1 homolog2
  • FCN2 Ficolin 2
  • SELE E-selectin
  • SIGLEC14 Sialic acid-binding Ig) -like lectin 14
  • THBS1 Thrombospondin-1
  • ZG16B Zymogen granule protein 16 homolog B
  • ZG16B Zymogen granule protein 16 homolog B
  • the agent for measuring the mRNA level of the complex marker is characterized in that it is a primer pair, probe or antisense nucleotide that specifically binds to the gene of the marker, and nucleic acid information of the genes is known in GeneBank, etc. Can design these primer pairs, probes or antisense nucleotides based on the above sequence.
  • the term "measurement of mRNA expression level" as used in the present invention is a process of confirming the presence and expression of mRNA of diabetic retinopathy diagnosis genes in a biological sample isolated from a patient suspected of diabetic retinopathy to diagnose diabetic retinopathy. Measure the amount.
  • primer as used in the present invention is a fragment that recognizes a target gene sequence, and includes forward and reverse primer pairs, preferably, a primer pair that provides an analysis result having specificity and sensitivity.
  • a primer that amplifies only the target gene sequence containing the complementary primer binding site and does not induce non-specific amplification can give high specificity. .
  • probe used in the present invention refers to a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and refers to a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in a sample through the binding. do.
  • the type of probe is a material commonly used in the art and is not limited, but preferably PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and most preferred Hagi is PNA.
  • the probe is a biomaterial that includes an organism-derived or similar thing or a thing produced in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, neurons, DNA, and It may be RNA, DNA includes cDNA, genomic DNA, oligonucleotide, RNA includes genomic RNA, mRNA, oligonucleotide, and examples of proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • antisense refers to a nucleotide base in which an antisense oligomer is hybridized with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, typically allowing the formation of an mRNA and RNA: oligomeric heterodimer within the target sequence. It means an oligomer having a sequence of and a backbone between subunits. Oligomers may have exact sequence complementarity or approximate complementarity to the target sequence.
  • the agent for measuring the protein level of the complex marker is an antibody, interacting protein, ligand, nanoparticles, or aptamer that specifically binds to the protein or peptide fragment. can do.
  • protein expression level measurement is a process of checking the presence and expression of a protein expressed from a diabetic retinopathy diagnosis gene in a biological sample in order to diagnose diabetic retinopathy.
  • an antibody refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the complex biomarker for diabetic retinopathy of the present invention.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.
  • the antibody can be easily prepared using techniques well known in the art.
  • the polyclonal antibody can be produced by a method well known in the art, including the process of injecting the diabetic retinopathy marker protein antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog.
  • the monoclonal antibody is a hybridoma method well known in the art (see the hybridoma method; Kohler and Milstein, European Journal of Immunology 6:511-519, 1976), or phage antibody library technology (Clackson et al, Nature, 352 :624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol. , 222:58, 1-597, 1991).
  • the antibody prepared by the above method may be separated and purified using a method such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the antibody of the present invention includes a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of antibody molecules.
  • the functional fragment of an antibody molecule means a fragment that has at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 and Fv.
  • the antibody of the present invention may be obtained commercially.
  • PNA Protein Nucleic Acid
  • DNA has a phosphate-ribose sugar backbone
  • PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by a peptide bond, which greatly increases the binding power and stability to DNA or RNA, resulting in molecular biology. , Diagnostic analysis and antisense therapy. PNA is described in detail in Nielsen PE et al, Science , 254(5037):1497-500, 1991.
  • aptamer is an oligonucleotide or peptide molecule, and general information of the aptamer is described in Bock LC et al. , Nature , 355(6360):5646, 1992; Hoppe-Seyler F and Butz K, J Mol Med ., 78(8):42630, 2000; Cohen BA et al. , Proc Natl Acad Sci USA ., 95(24):142727, 1998).
  • the present invention relates to a diabetic retinopathy diagnosis kit comprising the diabetic retinopathy diagnosis composition.
  • the kit can be prepared by a conventional manufacturing method known in the art.
  • the kit may include, for example, an antibody in a freeze-dried form, a buffer, a stabilizer, an inactive protein, and the like.
  • the kit may further include a detectable label.
  • detectable label refers to an atom or molecule that specifically detects a molecule containing a label among molecules of the same type without a label.
  • the detectable label may be attached to an antibody, interacting protein, ligand, nanoparticle, or aptamer that specifically binds to the protein or fragment thereof.
  • the detectable label may include a radionuclide, a fluorophore, or an enzyme.
  • the kit can be used according to various immunoassays or immunostaining methods known in the art.
  • the immunoassay or immunostaining method may include radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, ELISA, capture-ELISA, inhibition or competition analysis, sandwich analysis, flow cytometry, immunofluorescence staining, and immunoaffinity purification.
  • the kit may be a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the kit can be used for mass spectrometry.
  • the specific amino acid residues of the protein are myristoylation, isoprenylation, prenylation, glypiation, lipoylation, acylation, alkylation, methylation, demethylation, amidation, It may have modifications such as ubiquitination, phosphorylation, deamidation, glycosylation, oxidation, or acetylation.
  • the present invention provides, from a biological sample of a patient (a) MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP (pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP (galectin-3-binding protein), and IGFBP2 (insulin like growth factor binding protein). Measuring the mRNA or protein level of the complex marker for diabetic retinopathy diagnosis consisting of 2); And
  • It relates to a method for providing information for diabetic retinopathy diagnosis comprising; (b) comparing the mRNA or protein expression level with a control sample.
  • the complex marker in step (a) is ADAMTSL2 (ADAMTS-like protein 2), Cp (Ceruloplasmin), CFH (complement factor H), DDI2 (Protein DDI1 homolog2), FCN2 (Ficolin 2), SELE ( E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1 (Thrombospondin-1), and ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B), characterized by further comprising at least one marker selected from the group consisting of To do.
  • ADAMTSL2 ADAMTS-like protein 2
  • Cp Ceruloplasmin
  • CFH complement factor H
  • DDI2 Protein DDI1 homolog2
  • FCN2 Fecolin 2
  • SELE E-selectin
  • SIGLEC14 Sialic acid-binding Ig-like lectin 14
  • THBS1 Thrombospondin-1
  • biological sample refers to a sample such as tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid or urine, in which the protein expression level or gene expression level differs due to the onset of diabetic retinopathy. And, preferably, it means blood, plasma, and serum.
  • the method of providing information for diabetic retinopathy is at least one selected from the group consisting of patient's age, body mass index (BMI), Hb1Ac test result, insulin treatment, smoking, high blood pressure, hyperlipidemia, and cardiovascular disease. Additional clinical information may be included.
  • the method of providing information for diagnosing diabetic retinopathy may further include determining that it is diabetic retinopathy if the gene expression level or protein expression level of the complex marker increases compared to the control group.
  • the mRNA expression level in step (a) can be measured and compared using a primer pair, a probe, or an antisense nucleotide specifically binding to the gene of the complex marker.
  • mRNA expression level measurement or comparative analysis method reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real-time reverse transcriptase polymerase reaction, RNase protection assay, Northern blotting or DNA chip, etc. can be used, but the present invention It is not limited to these.
  • the mRNA expression level in the normal control group and the mRNA expression level in diabetic retinopathy patients can be checked, and the onset of diabetic retinopathy can be diagnosed or predicted by comparing the levels of these expression levels.
  • the measurement of the protein expression level in step (a) may be measured and compared using antibodies, interacting proteins, ligands, nanoparticles, or aptamers that specifically bind to proteins or peptide fragments.
  • Protein expression level measurement or comparative analysis methods include protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDITOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight).
  • MALDI-TOF Microx Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • SELDITOF Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight
  • Mass Spectrometry Analysis Radiation Immunoassay, Radioimmune Diffusion Method, Okteroni Immunity Diffusion Method, Rocket Immunoelectrophoresis, Tissue Immunostaining, Complement Fixation Analysis, 2D Electrophoresis Analysis, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blot, and ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), but are not limited thereto.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • PRM parallel reaction monitoring
  • SWATH sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution
  • SRM selected reaction monitoring
  • iMRM immune multiple reaction monitoring
  • the MRM is a method of determining an exact fragment of a material, breaking it in a mass spectrometer, selecting a specific ion from the broken ions once more, and obtaining the number using a continuously connected detector.
  • the protein or fragment thereof can be quantified using a mass spectrometer in blood samples of normal individuals and individuals suspected of diabetic retinopathy.
  • the analysis in step (b) can be analyzed using a statistical method or an algorithm to improve the accuracy of the diagnosis, and a linear or nonlinear regression analysis method, an preceding or nonlinear classification analysis method, and a logistic regression analysis method (logistic regression), Analysis of Variance (ANOVA), neural network analysis method, genetic analysis method, support vector machine analysis method, hierarchical analysis or clustering analysis method, hierarchical algorithm or kernel principal component analysis using decision trees Method, Markov Blanket analysis method, recursive feature elimination or entropy-basic regression feature elimination analysis method, forward floating search or rear floating search analysis method, and their An analysis method selected from the group consisting of combinations can be used.
  • the statistical method uses a logistic regression analysis method, but is not limited thereto.
  • 155 plasma samples were analyzed for tactical verification of biomarkers for diabetic retinopathy among plasma proteins (Table 1), IGFBP2 (insulin like growth factor binding protein 2), ADAMTSL2 ( ADAMTS-like protein 2), CFH (Complement factor H), Cp (Ceruloplasmin), DDI2 (Protein DDI1 homolog2), FCN2 (Ficolin 2), LGALS3BP (galectin 3 binding protein), MBL2 (mannose-binding protein C), PNLIP 13 markers consisting of (pancreatic triacylglycerol lipase), SELE (E-selectin), SIGLEC14 (Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1 (Thrombospodin-1) and ZG16B (Zymogen granule protein 16 homolog B) It was analyzed using multiple reaction monitoring (MRM). As shown in Table 2, for quantitative analysis, peptides for each marker were selected and
  • the biomarker expression level conversion information and the clinical information conversion level are input using a logistic regression model to confirm the diagnostic ability improvement effect.
  • the probability of classification as diabetic retinopathy was estimated.
  • Table 3 based on clinical information + MBL2 + PNLIP + LGALS3BP + IGFBP2, the expression levels for ADAMTSL2, Cp, DDI2, FCN2, SELE, SIGLEC14, THBS1, ZG16B and CFH were added and analyzed one by one. It was confirmed that the diagnostic ability of diabetic retinopathy increased as the number of markers increased.
  • Example 1 Diabetic retinopathy patient selection and plasma collection
  • Plasma samples from diabetic retinopathy patients were collected with the approval of the Institutional Review Board of Seoul National University Bundang Hospital. A total of 155 plasma samples were analyzed for quantitative detection of biomarkers using plasma proteins, and the clinical characteristics of the analyzed normal group (Non DMR) and diabetic retinopathy (DMR) disease group are shown in Table 1 below.
  • IGFBP2 insulin like growth factor binding protein 2
  • ADAMTSL2 ADAMTS-like protein 2
  • CFH Complement factor H
  • Cp Ceruloplasmin
  • DDI2 Protein DDI1 homolog2
  • FCN2 Fecolin 2
  • LGALS3BP galectin 3 binding protein
  • MBL2 mannose-binding protein C
  • PNLIP pancreatic triacylglycerol lipase
  • SELE E-selectin
  • SIGLEC14 Sialic acid-binding Ig-like lectin 14
  • THBS1 Thrombospodin-1)
  • ZG16B Zymogen granule protein 16 homolog B
  • a representative peptide having a specific charge-to-mass ratio (m/z) for 13 biomarker proteins is selected (Q1), and the peptide is broken by electric shock.
  • the ion (Q3) having the highest intensity was selected.
  • At least one peptide with high sensitivity per protein was measured and injected into a mass spectrometer based on this to obtain an optimum value of fragmentation energy per transition, and three or more upper fragmented ions were selected based on the intensity (Table 2).
  • SIS Stable-isotope labeled standard
  • SIS peptide is a peptide obtained by substituting 13C and 15N for 12C and 14N in the amino acids of lysine (Lys, K) or arginine (Arg, R) at the C-terminus of the peptide. This has a difference in mass value from the endogenous peptide present in the blood, but since it has the same sequence, the peptide hydrophobicity is the same, so it elutes at the same retention time (RT) on the chromatogram.
  • RT retention time
  • Example 1 Each plasma obtained in Example 1 was used as it is, or 14 kinds of proteins (Albumin, IgG, Antitrypsin, IgA, Transferrin, Haptoglobin, Fibrinogen, Alpha2-Macroglobulin, etc.) exist in high amounts for more accurate protein quantification.
  • Alpha1-Acid glycoprotein, IgM, Apolipoprotein AI, Apolipoprotein AII, Complement C3, Transthyretin) were removed.
  • 14 kinds of proteins were removed using a MARS (Multiple affinity removal system, Agilent, USA) column according to the manufacturer's method, and the remaining proteins were eluted and used for analysis.
  • MARS Multiple affinity removal system
  • 2-carboxylethyltrisphosphine Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TECP
  • 2-chloro 2-chloroacetamide
  • Acetamide (2-chloroacetamide) was added and reacted at 25° C. for 1 hour to reduce and alkylate disulfide bonds.
  • Rice seed enzyme was added so that the mass ratio of plasma protein to rice seed (wako) enzyme was 100:1, and reacted at room temperature for 4 hours.
  • Example 2-1 a heavy-labeled peptide was added (spiking) as an internal standard material (SIS peptide) determined in Example 2-1 to perform MRM analysis.
  • SIS peptide an internal standard material
  • Nano ultra 2D plus (Eksigent), a triple quadrupole mass spectrometer, QTarp 5500 (SCIEX) was used to monitor the transition of each selected protein in a scheduled MRM mode.
  • the peak area of the transition was calculated by processing raw data using Skyline (Mccoss lab, University of Washington, USA). Relative concentrations were compared for the endogenous/heavy labeled peptide using the peak area. Using the measured results, T-test and AUROC (Area under the receiver operating characteristic) values were generated to measure the predictive ability of each protein peptide. To confirm the predictive power combined with clinical information, the expression level conversion information and the clinical information conversion level in Table 1 were input using a logistic regression model to estimate a probability value classified as diabetic retinopathy. All statistical analyzes were performed using MedCal ver 17.1 (MedCalc).
  • the clinical information reflected the body mass index (BMI), smoking, hyperlipidemia, hypertension, cardiovascular disease, and glycated hemoglobin (Hb1Ac) calculated by the height and weight obtained through the interview.
  • BMI body mass index
  • Hb1Ac glycated hemoglobin
  • Example 3 composite bio Marker group According to the combination of results and clinical information Diagnostic ability Check for improvement
  • a logistic regression model is used to input biomarker expression level conversion information and clinical information conversion level to confirm the diagnostic effect.
  • the probability values to be classified were estimated.
  • Diabetic retinopathy diagnosis performance according to the number of combined biomarkers C1 (combination 1) C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 AUC One 2 3 4 5 0.784 One 2 3 4 5 6 0.803 One 2 3 4 5 6 7 0.804 One 2 3 4 5 6 7 8 0.812 One 2 3 4 5 6 7 8 9 0.814 One 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.819 One 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0.823 One 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.824 One 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0.834 One 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0.863
  • C Clinical information
  • P Protein quantitative information
  • Com Clinical and protein quantitative information included
  • AUC Area Under the Curve
  • SE Standard Error (Delong et al. , 1988)
  • 95% CI 95% confidence interval ( Confidence Interval)
  • the complex marker for diagnosing diabetic retinopathy not only has superior sensitivity and diagnostic performance compared to combinations of other markers, but also has a high diagnosis in early diabetic retinopathy by combining the quantitative value of protein and basic clinical information of the complex marker. As it shows the ability, it can be usefully used for early diagnosis of diabetic retinopathy.

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Abstract

본 발명은 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 진단용 복합 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 당뇨망막병증 진단에 특이적인 2개 이상의 혈액 마커로 구성되어, 진단 성능이 증가된 당뇨망막병증 진단용 복합 마커에 관한 것이다. 또한, 상기 복합 마커를 이용한 당뇨망막병증 진단용 조성물, 진단 키트 및 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 당뇨망막병증 진단용 복합 마커는 다른 마커의 조합에 비해 민감도 및 진단 성능이 우수한 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 복합 마커의 단백질 정량값과 기본적인 임상정보를 결합하여 분석하면 초기 당뇨망막병증에서 높은 진단능을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 복합마커는 혈액 단백질로 생검을 이용하지 않고 환자 혈장을 이용하여 간편하게 분석할 수 있어 당뇨망막병증의 조기 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

당뇨망막병증 진단용 복합 마커 및 이의 용도
본 발명은 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 진단용 복합 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 당뇨망막병증 진단에 특이적인 2개 이상의 혈액 마커로 구성되어, 진단 성능이 증가된 당뇨망막병증 진단용 복합 마커에 관한 것이다. 또한, 상기 복합 마커를 이용한 당뇨망막병증 진단용 조성물, 진단 키트 및 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
당뇨망막병증(diabetic retinopathy, DR 또는 DMR)은 망막의 미세혈관이 손상되었을 때에 나타나는, 당뇨병의 대표적인 합병증으로, 나이관련 황반변성, 녹내장과 함께 안과 3대 실명질환 중 하나이다. 건강 보험심사평가원에 따르면 당뇨병 환자는 2012년 약 200만 명에서 2016년 약 245 만명으로 21% 정도 증가했지만, 당뇨망막병증 환자수는 2012년 약 26만 명에서 2016년 33만 6000명으로 38%로 증가해, 당뇨병보다 증가폭이 컸다.
당뇨로 인해 혈당이 높아지면서, 지속적인 고혈당으로 인해 망막혈관의 미세순환에 장애가 일어나 안구의 후반부 망막에 영양을 공급하는 혈관이 좁아지거나 막혀서 노폐물이 축적됨 되어 출혈이 발생한다. 이 부위에 비정상적으로 신생 혈관이 생기면서 정상적인 혈관기능을 못하고 출혈을 일으킴으로써 당뇨망막병증이 발생하게 된다.
당뇨망막병증은 심화정도에 따라 비증식성 당뇨망막병증(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)과 증식성 당뇨망막병증(proliferative diabetic retinopathy, PDR)로 구분한다. 또한 NPDR을 경우는 정도에 따라 경증(mild), 중등도(moderate) 및 중증(severe) NPDR로 분류된다. 비증식성 당뇨망막병증은 망막의 출혈, 미세혈관류, 면화반등의 소견을 보이지만 늦게까지 좋은 시력을 유지한다. 증식성 당뇨망막병증은 망막에 신생혈관이 생성되고, 이 혈관이 파열하면 유리체강 내 심각한 출혈을 야기, 시간이 지나면 흡수되지만 섬유성 조직으로 변해 나중에는 견인성 망막박리 및 재출혈이 발생해 영구적은 실명을 일으키게 된다.
당뇨망막병증은 초기증상이 거의 없어 조기 진단이 어렵고, 증상(시력저하, 초점상실, 눈부심)을 보일 땐, 이미 병이 진행된 상태이며, 치료(레이저, 유리체 수술)에도 불구하고 심화되어 실명에 이르는 환자가 많다. 다만 발병 초기에 적절한 치료를 받고, 혈당관리를 철저히 하면 시력 유지가 가능하기에, 당뇨망막병증의 조기발견과 억제 및 고위험군에 대한 조기 치료에 대한 필요성이 대두되고 있다. 하지만 아직까지 정확한 병인은 밝혀지지 않았으며, 망막증의 진행정도를 판단하는 바이오마커도 매우 한정적인 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 민감도 및 특이성이 높은 혈액 단백질 마커를 발굴하고, 이를 복합적으로 사용하여 당뇨망막병증 조기 진단능을 높이고자 노력한 결과, MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)를 포함하는 복합 마커의 당뇨망막병증 진단 효율이 우수한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 당뇨망막병증 진단에 특이적인 혈액 마커를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 복합 마커를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 당뇨망막병증 진단용 복합 마커를 이용한 당뇨망막병증 진단용 조성물 또는 진단 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 당뇨망막병증 진단용 복합 마커를 이용한 당뇨망막병증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 복합 마커를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 복합마커는 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), Cp(Ceruloplasmin), CFH(complement factor H), DDI2(Protein DDI1 homolog2), FCN2(Ficolin 2), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1(Thrombospondin-1) 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 복합 마커는 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), Cp(Ceruloplasmin), CFH(complement factor H), DDI2(Protein DDI1 homolog2), FCN2(Ficolin 2), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1(Thrombospondin-1) 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 복합 마커의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 복합 마커의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 환자의 생물학적 시료로부터 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 복합 마커는 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), Cp(Ceruloplasmin), CFH(complement factor H), DDI2(Protein DDI1 homolog2), FCN2(Ficolin 2), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1(Thrombospondin-1) 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법은 환자의 나이, BMI(body mass index), 흡연 여부, Hb1Ac 검사결과, 인슐린 치료 여부, 고혈압 여부, 고지혈증 여부 및 심혈관 질환 여부로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 임상정보를 추가로 포함하여 대조군과 비교할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법은 복합 마커의 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 대조군에 비해 증가하면 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM)을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 분석은 통계적 분석 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 통계적 분석 방법은 선형 또는 비선형 회귀 분석방법, 선형 또는 비선형 분류(classification) 분석방법, 로지스틱 회귀 분석방법(logistic regression), 분산분석(Analysis of Variance; ANOVA), 신경망 분석방법, 유전적 분석방법, 서포트 벡터 머신 분석방법, 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법, 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘 또는 커널 주성분(Kernel principal component) 분석방법, 마르코프 블랭킷(Markov Blanket) 분석방법, 회귀 특성 소거(recursive feature elimination) 또는 엔트로피-기본 회귀 특성 소거 분석방법, 전방 플로팅 서치(floating search) 또는 후방 플로팅 서치(floating search) 분석방법, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 당뇨망막병증 진단용 복합 마커는 다른 마커의 조합에 비해 민감도 및 진단 성능이 우수한 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 복합 마커의 단백질 정량값과 기본적인 임상정보를 결합하여 분석하면 초기 당뇨망막병증에서 높은 진단능을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 복합마커는 혈액 단백질로 생검을 이용하지 않고 환자 혈장을 이용하여 간편하게 분석할 수 있어 당뇨망막병증의 조기 진단에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 복합 마커의 단백질 정량값 및 전체 당뇨망막병증 환자의 기본적인 임상정보를 결합하여 로지스틱 회기 모델(A) 및 T-검정(B)으로 통계처리 하여 분석한 데이터이다 (DMR: 당뇨망막병증, Non DMR: 비당뇨망막명증).
도 2는 복합 마커의 단백질 정량값 및 비증식성 당뇨망막병증 환자의 기본적인 임상정보를 결합하여 로지스틱 회기 모델(A) 및 T-검정(B)으로 통계처리 하여 분석한 데이터이다 (NPDR: 비증식성 당뇨망막명증 Non DMR: 비당뇨망막명증).
도 3은 복합 마커의 단백질 정량값 및 증식성 당뇨망막병증 환자의 기본적인 임상정보를 결합하여 로지스틱 회기 모델(A) 및 T-검정(B)으로 통계처리 하여 분석한 데이터이다 (PDR: 증식성 당뇨망막명증 Non DMR: 비당뇨망막명증).
도 4은 복합 마커의 단백질 정량값 및 단계별 비증식성 당뇨망막병증 환자의 기본적인 임상정보를 결합하여 T-검정으로 통계처리 하여 분석한 데이터이다.
A는 비당뇨망막명증(Non DMR) 및 경증 비증식성 당뇨망막병증(mild NPDR)를 비교한 데이터이며, B는 비당뇨망막명증(Non DMR) 및 중등도 당뇨망막병증(moderate NPDR)를 비교한 데이터이고, C는 비당뇨망막명증(Non DMR) 및 중증 당뇨망막병증(sever NPDR)를 비교한 데이터이다.
도 5는 본 발명에서 확인한 13개의 마커 중, MLB2, IGFBP2, LGALS3BP 및 PNLIP 조합(조합 1) 및 ADAMTSL2, CP, DDI, FCN2, SIGLEC14, SELE, THBS1, ZG16B 및 CFH 조합(조합 2)에 따른 단백질 정량값 및 전체 당뇨망막병증 환자의 기본적인 임상정보를 결합하여 로지스틱 회기모델로 통계처리 하여 분석한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 복합 마커에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 당뇨망막병증 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단용 마커"란 정상 대조군(당뇨망막병증이 아닌 개체)에 비하여 당뇨망막병증을 가진 개체에서 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩티드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
당뇨망막병증은 진행 정도에 따라 초기의 비증식성 당뇨망막병증(NPDR)과 후기의 증식성 당뇨망막병증(PDR)로 구분한다. 비증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하지 않는 특징이 있다. 증식성 당뇨망막병증은 혈관이 발달하는 등 그 기전에 있어서 상이하며, 비증식성 당뇨망막병증이 반드시 증식성 당뇨망막병증으로 진행되는 것이 아니어서, 증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 알려진 마커라도 반드시 비증식성 당뇨망막병증의 진단용 마커로 사용될 수는 없다.
본 발명의 복합 마커는 비증식성 당뇨망막병증 및 증식성 당뇨망막병증을 모두 특이적으로 진단할 수 있으며, 특히, 비증식성 당뇨 망막병증 초기 단계를 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 마커는 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), Cp(Ceruloplasmin), CFH(complement factor H), DDI2(Protein DDI1 homolog2), FCN2(Ficolin 2), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1(Thrombospondin-1) 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2)는 ADAMTS(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) 유사 단백질 서브 패밀리 구성원으로, 세포 표면과 세포외 기질을 바인딩하는 당단백질이다. ADAMTSL2는 LTBP1(latent transforming growth factor beta binding protein 1)과 상호작용하며, LTBP1 단백질은 세포의 성장 및 분열을 조절하는 중요한 성장인자인 TGF-β1의 저장에 관여하므로, ADAMTSL2는 TGF-β1의 이용가능성을 조절한다. 또한, ADAMTSL2는 암 조직에서 발현되므로 암 진단을 위한 마커로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 ADAMTSL2는 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
Cp(Ceruloplasmin)는 혈액에서 구리를 운반하는 주단백질로서 철 대사에서 중요한 역할을 한다. 건강한 사람의 혈장에서 약 95% 이상의 구리가 세룰로플라스민(Ceruloplasmin) 형태로 존재한다.
본 발명에 있어서, 상기 Cp는 바람직하게 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
CFH(complement factor H)는 보체 활성화를 조절하여 면역반응을 유지하는데 필수적인 역할을 하는 당단백질이다. 세포표면의 같은 당사슬구조와 결합하여 보체 활성화 및 증폭을 막는 보체 억제제 역할을 한다.
본 발명에 있어서, 상기 CFH는 바람직하게 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
DDI2(Protein DDI1 homolog2)는 내부펩타이드 절단효소로써 세포 성장 및 DNA 복제 조절에 관여하는 Nrf1(nuclear respiratory factor 1)를 활성화하여 프로테아좀 이상에 의한 단백질 분해(degradation)을 보완한다.
본 발명에 있어서, 상기 DDI2는 바람직하게 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 4의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
FCN2(Ficolin 2)는 올리고렉틴의 한 종류로서 짧은 N말단 부분-콜라겐(collagen) 유사 도메인과 피브리노겐(fibrinogen) 유사 도메인으로 구성되어 있다. 주로 간에서 발현되며 박테리아 세포벽의 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamin)과 결합하여, 만노오스 결합(mannose binding) 단백질처럼 옵소닌(opsonin) 역할을 함으로써 보체계의 렉틴 경로에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FCN2는 바람직하게 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 5의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)는 인슐린 유사생장인자(Insulin like growth factor; IGF)와 결합하여 세포 내 다양한 프로세스를 조절하며 그에 의해 혈관생성(angiogenesis)를 조절한다. 또한 다양한 암에서(전립선 및 유방암 등)에서 암세포의 생장을 촉진한다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 IGFBP2는 바람직하게 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 6의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
LGALS3BP(galectin-3-binding protein)는 LGALS3BP 유전자에 의해 암호와 되는 단백질로, Mac-2(human macrophage-associated lectin) 및 갈락틴 1(galectin 1)에 특이적으로 결합한다. LGALS3BP는 암 환자 및 HIV에 감염된 환자 혈청에서 증가하는 것으로 알려져 있으며, NK(natural killer)세포 및 LAK(lymphokine-activated killer) 세포 독성과 연관된 면역반응에 관여한다.
본 발명에 있어서, 상기 LGALS3B는 바람직하게 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 7의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
MBL2(mannose-binding protein C)는 만노오스 결합 렉틴(Mannose-binding lectin; MBL) 또는 만난 결합 단백질(mannan-binding protein; MBP)으로도 불리운다. MBL2는 올리머구조(400 ~ 700 kDa)를 가지며, 대략 30kDa으로 구성된 3개의 동일한 펩타이드 사슬을 포함하는 서브 유닛으로 구성된다. 감염에 대한 반응으로 간에서 생성되며 급성 단계 단백질이라고 불리는 다른 많은 요인 중 일부에 해당한다.
본 발명에 있어서, 상기 MBL2는 바람직하게 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 8의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase)는 트리글리세라이드의 에스테르 결합을 가수분해하는 지방 분해 효소군으로, 췌장에서 분비되는 효소이다. PNLIP는 췌장 덕트 시스템을 통해 십이지장으로 분비되기 때문에 혈청 내 농도는 낮은 것으로 알려져 있으나, 췌장염이나 췌장 선암과 같은 췌장 기능이 극도로 파괴되면, PNLIP를 포함한 췌장 효소가 혈청으로 분비되기 때문에, PNLIP 혈청 농도를 측정하여 급성 췌장염을 진단할 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PNLIP는 바람직하게 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 9의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
SELE(E-selectin)는 CD62E(CD62 antigen-like family member E), ELAM-1(endothelial-leukocyte adhesion molecule 1) 또는 LECAM2(leukocyte-endothelial cell adhesion molecule 2)로 알려져 있으며, 인터류킨 1β, 종양괴사인자, 리포다당류에 의해 활성화된 혈관내피세포에 4~12시간을 정점으로 하여 일과성으로 발현, 유도하는 세포접착분자이다. SELE는 염증 조직내 혈관내피세포에 강하게 발현하고, 호중구와 단구가 혈관내피세포 위를 구르는 현상을 매개함으로써 이들 세포의 염증부위로의 침윤을 촉진한다. 암세포의 혈관내피세포와의 접착에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 SELE는 바람직하게 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 10의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14)는 SIGLEC(Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins)의 서브패밀리 중 하나로, SIGLEC는 시알산과 결합하는 세포 표면 단백질이며 주로 면역세포의 표면에서 발현된다. SIGLEC과 시알산의 단백질 상호작용은 면역 시스템을 온, 오프 시키는 스위치 역할을 하며, 암세포 역시 SIGLEC-시알산 반응을 이용하여 면역반응에 대한 저항성을 획득하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 SIGLEC14는 바람직하게 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 11의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
THBS1(Thrombospondin-1)은 트롬보스폰딘 패밀리(thrombospondin family) 중 하나로 신혈관 생성과 종양생성을 억제하는 당단백질이다. 플라스미노겐(plasminogen), 우로키나제(urokinase), MMP, 트롬빈(thrombin) 및 카텝신(cathepsin) 등의 혈관생성과 관련 있는 프로테아제와 결합하여 내피세포의 유착, 이동, 생장을 조절한다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 THBS1는 바람직하게 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 12의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)는 PAUF(pancreatic adenocarcinoma upregulated factor)로, 탄수화물과 결합하고 내부상피세포, 혈관생성 및 침투(permeability)를 활성화 시킨다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 ZG16B는 바람직하게 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 서열번호 13의 아미노산 서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.
하지만, 상기 마커들은 당뇨망막변증 진단에 사용할 수 있음을 개시한 종래 기술은 알려진 바가 없으며, 특히, MBL2, PNLIP, LGALS3BP 및 IGFBP2의 복합 마커를 이용하여 당뇨망막변증의 진단 성능을 증가시킬 수 있음을 개시한 기술에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.
본 발명은 다른 관점에서 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 당뇨망막병증 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 복합 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), Cp(Ceruloplasmin), CFH(complement factor H), DDI2(Protein DDI1 homolog2), FCN2(Ficolin 2), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1(Thrombospondin-1) 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 마커의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 디자인할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA 발현수준 측정"이란 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 당뇨망막병증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 당뇨망막병증 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 마커의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현수준 측정"이란 당뇨망막병증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 당뇨망막병증 진단용 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 당뇨망막병증 진단용 복합 바이오 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 당뇨망막병증 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler and Milstein, European Journal of Immunology 6:511-519, 1976 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조) 을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv 등이 있다. 또한 본 발명의 항체는 상업적으로 입수한 것일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리킨다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌(Nielsen PE et al, Science, 254(5037):1497-500, 1991)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌(Bock LC et al., Nature, 355(6360):5646, 1992; Hoppe-Seyler F and Butz K, J Mol Med., 78(8):42630, 2000; Cohen BA et al., Proc Natl Acad Sci USA., 95(24):142727, 1998)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 당뇨망막병증 진단용 조성물을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 당업계에 알려져 있는 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면, 동결 건조 형태의 항체와 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 검출가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 용어 "검출가능한 표지"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자를 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미한다. 상기 검출가능한 표지는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자, 또는 압타머에 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 방사종(radionuclide), 형광원(fluorophore), 효소(enzyme)를 포함할 수 있다.
상기 키트는 당업계에 알려진 다양한 면역분석법 또는 면역염색법에 따라 이용될 수 있다. 상기 면역분석법 또는 면역염색법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(multiple reaction monitoring)인 것일 수 있다.
또한, 상기 키트는 질량분석에 이용될 수 있다. 이 경우, 상기 단백질의 특정 아미노산 잔기는 미리스토일화(myristoylation), 이소프레닐화, 프레닐화, 글리피칸화(glypiation), 리포일화(lipoylation), 아실화, 알킬화, 메틸화, 탈메틸화, 아미드화, 유비퀴틴화, 인산화, 탈아미드화, 글리코실화, 산화, 또는 아세틸화 등과 같은 변형을 가질 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 환자의 생물학적 시료로부터 MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)로 구성된 당뇨망막병증 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 복합 마커는 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), Cp(Ceruloplasmin), CFH(complement factor H), DDI2(Protein DDI1 homolog2), FCN2(Ficolin 2), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1(Thrombospondin-1) 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 방법에서 "생물학적 시료(biological sample)"란 당뇨망막병증 발병에 의해 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청을 의미한다.
상기 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법은 환자의 나이, BMI(body mass index), Hb1Ac 검사결과, 인슐린 치료 여부, 흡연 여부, 고혈압 여부, 고지혈증 여부 및 심혈관 질환 여부로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 임상정보를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법은 복합 마커의 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 대조군에 비해 증가하면 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계의 mRNA 발현 수준 측정은 상기 복합 마커의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다.
상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 당뇨망막병증 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 당뇨망막병증 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.
상기 (a) 단계의 단백질 발현 수준 측정은 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다.
단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는, 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다
보다 바람직하게, 본 발명에서는 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM), 병행 반응 모니터링(parallel reaction monitoring: PRM), sequential windowed data independent acquisition of the total high-resolution(SWATH), 선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring: SRM) 또는 면역 다중 반응 모니터링(immuno multiple reaction monitoring: iMRM)을 이용하여 측정될 수도 있다.
상기 MRM은 물질의 정확한 단편을 결정하여 이를 질량분석기에서 깬 후, 한 번 깨진 이온 중 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 검출기를 이용하여 그 수를 얻는 방법이다. MRM 방법을 이용하는 경우, 정상인 개체와 당뇨망막병증이 의심되는 개체의 혈액 시료에서 해당 단백질 또는 그의 단편을 질량분석기를 이용하여 정량할 수 있다.
상기 (b) 단계의 분석은 진단의 정확도를 향상시키기 위해 통계적 방법 또는 알고리즘을 사용하여 분석할 수 있으며, 선형 또는 비선형 회귀 분석방법, 선행 또는 비선형 분류(classification) 분석방법, 로지스틱 회귀 분석방법(logistic regression), 분산분석(Analysis of Variance; ANOVA), 신경망 분석방법, 유전적 분석방법, 서포트 벡터 머신 분석방법, 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법, 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘 또는 커널 주성분(Kernel principal component) 분석방법, 마르코프 블랭킷(Markov Blanket) 분석방법, 회귀 특성 소거(recursive feature elimination) 또는 엔트로피-기본 회귀 특성 소거 분석방법, 전방 플로팅 서치(floating search) 또는 후방 플로팅 서치(floating search) 분석방법, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 분석방법을 이용할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게, 상기 통계적 방법은 로지스틱회귀(logistic regression) 분석 방법을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서는, 혈장 단백체 중 당뇨망막병증 진단을 위한 바이오 마커의 정략적 검증을 위하여 155개의 혈장 시료를 분석하였으며(표 1), IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), CFH(Complement factor H), Cp(Ceruloplasmin), DDI2(Protein DDI1 homolog2), FCN2(Ficolin 2), LGALS3BP(galectin 3 binding protein), MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1(Thrombospodin-1) 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)로 구성된 13개의 마커를 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring: MRM)을 이용하여 분석하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 정량분석을 위해 각 마커에 대한 펩타이드를 선별하여 SIS를 이용하여 MRM-MS 분석을 수행하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서는, 복합 바이오 마커군 결과 및 임상정보를 결합하였을 때, 진단능 향상효과를 확인하기 위해 로지스틱회귀 모델을 이용하여 바이오마커 발현량 변환정보 및 임상정보 변환정도를 입력하여 당뇨망막병증으로 분류되는 확률값을 추정하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, 임상정보 + MBL2 + PNLIP + LGALS3BP + IGFBP2를 기본으로 ADAMTSL2, Cp, DDI2, FCN2, SELE, SIGLEC14, THBS1, ZG16B 및 CFH 에 대한 발현 정도를 하나씩 추가하여 분석한 결과, 바이오마커의 수가 증가됨에 따라 당뇨망막병증의 진단능이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 1 내지 도 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, 로지스틱회기 모델을 이용하여 상기 13개의 마커에 대한 단백질 정량값과 기본적인 임상정보를 결합하여 통계처리한 결과, 정상군과 당뇨망막병증(STAGE1, AUC=0.863), 정상군과 비증식성 당뇨망막병증(STAGE2, AUC=0.848) 및 정상군과 증식성 당뇨망막병증(STAGE3, AUC=0.879)에 대한 진단능이 우수함을 확인하였다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, T-검정을 통하여 비증식성 당뇨망막병증 여러 단계에서도 정상군 대비 각 단계에서 진단능이 우수함을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서는, 바이오마커의 조합에 따라 진단성능의 차이가 보이는지 확인하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 13개의 타겟 중 MBL2, PNLIP, LGALS3BP 및 IGFPB2의 조합(조합1, AUC= 0.783) 이 다른 9개의 단백질인 ADAMTSL2, Cp, FCN2 DDI2, SELE, SIGLEC14, THBS1 ZG16B 및 CFH 조합보다(조합2, AUC=0.713) 높은 진단능을 가짐을 확인 하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 당뇨망막병증 환자 선정 및 혈장 채취
당뇨망막병증 환자의 혈장 시료는 분당서울대학교병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받아 채취하였다. 혈장 단백체 이용하여 바이오마커의 정량적 검출을 위해 총155 개의 혈장 시료를 분석하였으며, 분석대상인 정상군(Non DMR) 및 당뇨망막병증(DMR) 질환군의 임상적 특징은 하기 표 1에 나타내었다.
시료 임상 정보
시료(n=155)
Non DMR(n=36) DMR(n=119) NPDR(n=60) PDR(n=59)
Mild(n=17) Moderate(n=17) Severe(n=26)
나이 64.1±8.3 57.5±9.5 57.4±10.9 58.9±12.1 60.0±7.6 56.1±9.0
성별(여/남) 29/7 29/90 12/5 3/14 5/21 9/50
Hb1Ac 7.4±1.3 7.6±1.4 7.5±0.9 7.6±1.4 7.5±1.4 7.6±1.5
당뇨치료(%) 32(88.9) 116(97.5) 17(100.0) 17(100.0) 25(96.2) 57(96.6)
Systemic risk factor
BMI(%)
저 4(11.1) 7(5.9) 0(0) 1(5.9) 3(11.5) 3(5.1)
정상 19(52.8) 64(53.8) 8(47.1) 8(47.1) 13(50.0) 35(59.3)
경도 12(33.3) 37(31.1) 8(47.1) 4(23.5) 9(34.6) 15(25.4)
고도 1(2.8) 11(9.2) 1(5.9) 4(23.5) 0(0) 6(10.2)
흡연(%) 12(33.3) 53(43.7) 10(58.5) 8(47.1) 10(38.5) 24(40.7)
고혈압(%) 19(52.8) 65(54.6) 6(35.3) 10(58.8) 14(53.8) 35(59.3)
고지혈증(%) 25(69.4) 50(42.0) 9(52.9) 8(47.1) 10(38.5) 23(39.0)
심혈관질환(%) 5(13.9) 9(7.6) 1(5.9) 1(5.9) 2(7.7) 5(8.5)
실시예 2 : 펩타이드 선정 및 MRM -MS를 이용한 펩타이드 분석
2-1 : 펩타이드 선정 및 합성 펩타이드 설계
본 발명에서는 당뇨망막병증을 진단하기 위한 바이오 마커로 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2), ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), CFH(Complement factor H), Cp(Ceruloplasmin), DDI2(Protein DDI1 homolog2), FCN2(Ficolin 2), LGALS3BP(galectin 3 binding protein), MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1(Thrombospodin-1) 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B) 의 13개를 선별하였다.
상기 바이오마커에 대한 MRM 분석을 수행하기 위해 13개의 바이오마커의 단백질에 대해 특정적인 전하 대 질량비(m/z)를 갖는 대표 펩타이드를 선정하고(Q1), 이 펩타이드를 전기적인 충격으로 깨서 발생하는 단편화 이온(fragmentation ion)중 가장 강도가 높은 이온(Q3)를 선정하였다.
단백질 당 감도 높은 1개 이상의 펩티드를 측정하고 이를 기초로 질량분석기에 주입하여 각 트랜지션 당 파편화 에너지 최적값을 얻고, 강도를 기준으로 3개 이상의 상위 단편화 이온을 선택하였다 (표 2).
13개 바이오마커에 대한 상위단편화 이온
유전자명 트립신절편 서열번호 표적이온 표적 m/z
ADAMTSL2 NFNIAGTVVK 서열번호 14 +2y6 531.801/574.356
Cp GEFYIGSK 서열번호 15 +2y6 450.728/714.382
AEVGDTI 서열번호 16 +2y5 430.727/561.299
CFH SLGNIIMVCR 서열번호 17 +2y5 581.807/678.343
SLGNVIMVCR 서열번호 18 +2y5 574.799/678.343
CYFPYLENGYNQNYGR 서열번호 19 +2y14+2 1029.444/867.897
CYFPYLENGYNQNHGR 서열번호 20 +3y13+2 677.964/781.361
DDI2 DGDVVILR 서열번호 21 +2y4 443.753/500.355
IDFSSIAVPGTSSPR 서열번호 22 +2y7 767.399/701.358
FCN2 LQAADTCPEVK 서열번호 23 +2y8 616.303/919.419
IGFBP2 LIQGAPTIR 서열번호 24 +2y6 484.798/614.362
LGALS3BP SDLAVPSELALLK 서열번호 25 +2y8 678.393/870.529
MBL2 WLTFSLGK 서열번호 26 +2y6 476.269/652.366
PNLIP TGYTQASQNIR 서열번호 27 +2y6 619.81/688.374
GEENWLANVCK 서열번호 28 +2y5 660.306/591.292
VTGHILVSLFGNK 서열번호 29 +3y4 462.270/465.246
SELE NWAPGEPNNR 서열번호 30 +2y7 577.771/783.374
QPQNGSVR 서열번호 31 +2y6 443.230/660.342
SIGLEC14 EGGEFTCR 서열번호 32 +2y3 478.201/436.197
THBS1 GGVNDNFQGVLQNVR 서열번호 33 +2y7 808.911/785.463
ZG16B YFSTTEDYDHEITGLR 서열번호 34 +3y7 649.63/825.458
정량성을 확인하기 위하여 13개의 단백질에 해당하는 SIS(Stable-isotope labeled standard) 펩타이드를 이용하였으며, 칼리브레이션을 통하여 선형성을 확인하는 실험을 이용하여 spiked heavy peptide 농도를 정하였다. SIS 펩타이드는 펩타이드 C-말단의 라이신(Lys, K)이나 아르기닌(Arg, R) 아미노산에 있는 12C와 14N을 13C와 15N으로 치환한 펩타이드이다. 이는 혈액 내에 존재하는 내인성 펩타이드(endogenous peptide)와는 질량값이 차이가 나지만, 동일한 서열을 갖기 때문에 펩타이드 소수성(hydrophobicity)이 동일하므로, 크로마토그램 상에서 동일한 머무름 시간(retention time, RT)에 용출된다.
2-2 : 혈장시료의 전처리 및 MRM-MS 분석
상기 실시예 1에서 수득한 각 혈장을 그대로 사용하거나, 더 정확한 단백질 정량을 위하여 고량(high abundant)으로 존재하는 단백질 14종(Albumin, IgG, Antitrypsin, IgA, Transferrin, Haptoglobin, Fibrinogen, Alpha2-Macroglobulin, Alpha1-Acid glycoprotein, IgM, Apolipoprotein AI, Apolipoprotein AII, Complement C3, Transthyretin)을 제거하는 감손과정(depletion)을 실시하였다. 감손은 MARS(Multiple affinity removal system, Agilent, 미국) 컬럼을 제조사의 방법대로 이용하여 14종의 단백질을 제거하고, 나머지 소량으로 존재하는 단백질을 용출시켜 분석에 사용하였다. 이 용출된 감손시료에 8 M이 되도록 요소(urea)를 첨가한 후 80 mM이 되도록 2-카르보실에틸트리스포스파인(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TECP) 및 320 mM이 되도록 2-클로로아세타마이드(2-chloroacetamide)을 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 이황화결합을 환원 및 알킬화를 하였다. 여기에 혈장 단백질과 라이스씨(wako) 효소의 질량 비율이 100:1이 되도록 라이스씨 효소를 넣고 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, 50 mM 트리스(Tris, pH8.0) 용액으로 10배 희석하고 시퀀싱이 가능한 수준의 트립신(Promega)을 단백질과 트립신의 질량 비율이 50:1이 되도록 첨가하여 37℃에서 12시간 이상 반응시켜 펩티드 절편으로 분해하였다. 0.3%가 되도록 포름산(formic acid) 용액을 가하여 pH 2.0 이하로 산성화시키고 트립신 반응을 멈추게 하였다.
여기에 탈염화를 진행하고 상기 실시예 2-1에서 정한 내부 표준 물질(SIS 펩타이드)로 heavy-labeled 펩타이드를 첨가(spiking)하여 MRM 분석을 시행했다. Nano ultra 2D plus(Eksigent)에 결합되어 있고, 삼중 사극자 질량분석기인 QTarp 5500(SCIEX) 장비를 이용하여 각 선정 단백질의 트랜지션에 대한 scheduled MRM 모드로 모니터링 하였다.
구체적으로, 5500 볼트의 이온 전압을 사용하고 및 Q1(Quadruple 1)과 Q3(Quadruple 3)에서의 해상능을 유닛(unit)으로 설정하였다. 트랜지션에 총 사이클 시간이 1.5초가 되도록 설정하였다. 20 유닛(unit)의 분무 가스(nebulizing gas)를 사용하고 히터 온도를 350℃로 설정하였다. 배치(batch) 간 변이를 보정하기 위해 각 시료에 내부 표준 물질을 스파이킹 하고 동시에 모니터링 하였다.
2-3 : 데이터 분석
스카이라인(Skyline; McCoss lab, University of Washington, 미국)를 이용하여 로우 데이터(raw data)를 프로세싱하여 트랜지션의 피크면적을 계산하였다. 내부표준물질 펩타이드(endogenous/heavy labeled peptide)에 대하여 피크면적을 사용하여 상대적 농도를 비교하였다. 이렇게 측정된 결과값을 이용하여 각 단백질 펩타이드의 질환 예측력(predictive ability)를 측정하고자 T-검정(T-test) 및 AUROC(Area under the receiver operating characteristic) 수치를 생성하였으며, 복합 바이오 마커군 결과와 임상정보가 결합된 예측력을 확인하고자, 로지스틱 회귀분석(logistic regression) 모델을 이용하여 상기 발현량 변환정보 및 상기 표 1의 임상정보 변환정도를 입력하여 당뇨망막병증으로 분류되는 확률값을 추정하였다. MedCal ver 17.1(MedCalc)를 사용하여 모든 통계 분석을 수행하였다.
상기 임상정보에는 문진을 통하여 확보한 키와 체중에 의해 계산된 신체질량지수(Body Mass Index, BMI), 흡연유무, 고지혈증 유무, 고혈압 유무, 심혈관 질환 유무, 당화혈색소(Hb1Ac) 수치를 반영하였다. 이 중 유무를 사용하는 정보는 유=1, 무=0(금연=0.5)로 변환하여 반영하였다.
실시예 3 : 복합 바이오 마커군 결과 및 임상정보 결합에 따른 진단능 향상 확인
본 발명에서는 13개의 복합 바이오 마커군 결과 및 임상정보를 결합하였을 때, 진단능 향상효과를 확인하기 위해 로지스틱회귀 모델을 이용하여 바이오마커 발현량 변환정보 및 임상정보 변환정도를 입력하여 당뇨망막병증으로 분류되는 확률값을 추정하였다.
복합 바이오 마커 결합 수에 따른 당뇨망막병증 진단 성능 확인
C1 (조합1) C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 AUC
1 2 3 4 5 0.784
1 2 3 4 5 6 0.803
1 2 3 4 5 6 7 0.804
1 2 3 4 5 6 7 8 0.812
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.814
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.819
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0.823
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.824
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0.834
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0.863
1. 임상정보, 2. LGALS3BP, 3. MBL2, 4. IGFBP2, 5, PNLIP, 6. ZG16B, 7. DDI2, 8. FCN2, 9. THBS1, 10. SIGLEC14, 11. CP, 12. ADAMTSL2, 13. SELC, 14. CFH
복합 바이오 마커군 및 임상 정보 결합에 따른 진단능 확인
Non DMR vs DMR (STAGE 1) Non DMR vs NPDR (STAGE 2) Non DMR vs PDR(STAGE 3)
AUC SE 95% CI AUC SE 95% CI AUC SE 95% CI
C 0.628 0.0550 0.520 ~ 0.735 0.644 0.0611 0.524 ~0.764 0.611 0.0602 0.493 ~0.729
P 0.813 0.0368 0.741 ~ 0.886 0.814 0.0434 0.729 ~0.900 0.813 0.0439 0.727 ~0.899
Com 0.863 0.0342 0.796 ~ 0.930 0.848 0.0401 0.769 ~ 0.927 0.879 0.0362 0.808 ~0.949
C : 임상정보, P : 단백질 정량 정보, Com : 임상정보 및 단백질 정량 정보 통함, AUC : Area Under the Curve, SE : Standard Error(Delong et al., 1988), 95% CI : 95% 신뢰구간(Confidence Interval)
표 3에 나타난 바와 같이, 임상정보 + MBL2 + PNLIP + LGALS3BP + IGFBP2를 기본으로 하여 ADAMTSL2, Cp, FCN2 DDI2, SELE, SIGLEC14, THBS1 ZG16B 및 CFH에 대한 발현 정도를 하나씩 추가하여 분석한 결과, 바이오마커의 수가 증가함에 따라 당뇨망막병증의 진단능(AUC)이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 1 내지 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, 로지스틱회기 모델을 이용하여 상기 13개의 마커에 대한 단백질 정량값과 기본적인 임상정보를 결합하여 통계처리한 결과, 정상군과 당뇨망막병증(STAGE 1, AUC=0.863), 정상군과 비증식성 당뇨망막병증(STAGE 2, AUC=0.848) 및 정상군과 증식성 당뇨망막병증(STAGE 3, AUC=0.879)에 대한 진단능이 우수함을 확인하였다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, T-검정을 통하여 비증식성 당뇨망막병증 여러 단계에서도 정상군 대비 각 단계에서 진단능이 우수함을 확인하였다.
실시예 4 : 바이오마커의 조합에 따른 당뇨망막병증 진단 성능 확인
본 발명에서는 13개의 바이오마커의 조합에 따라 당뇨망막병증의 진단 성능의 차이가 보이는지 확인하였다. 13개의 바이오마커 중 MBL2, PNLIP, LGALS3BP 및 IGFBP2 조합 및 ADAMTSL2, Cp, FCN2 DDI2, SELE, SIGLEC14, THBS1 ZG16B 및 CFH 조합으로 나누어 분석을 수행하였으며, 상기 실시예 3의 STAGE 1과 동일하게 임상정보와 함께 분석을 수행하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 13개의 바이오마커 중 MBL2, PNLIP, LGALS3BP 및 IGFBP2의 조합(조합 1, AUC= 0.784)이 다른 9개의 단백질인 ADAMTSL2, Cp, FCN2 DDI2, SELE, SIGLEC14, THBS1 ZG16B 및 CF 조합(조합 2, AUC=0.713)보다 높은 진단능을 보이는 것을 확인하였다.
본 발명에서 제공하는 당뇨망막병증 진단용 복합 마커는 다른 마커의 조합에 비해 민감도 및 진단 성능이 우수할 뿐만 아니라, 복합 마커의 단백질 정량값과 기본적인 임상정보를 결합하여 분석하면 초기 당뇨망막병증에서 높은 진단능을 보이므로, 당뇨망막병증의 조기 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (11)

  1. MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)을 포함하는, 당뇨망막병증 진단용 복합 마커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복합 마커는 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), Cp(Ceruloplasmin), CFH(complement factor H), DDI2(Protein DDI1 homolog2), FCN2(Ficolin 2), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1(Thrombospondin-1) 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨망막병증 진단용 복합 마커.
  3. MBL2(mannose-binding protein C), PNLIP(pancreatic triacylglycerol lipase), LGALS3BP(galectin-3-binding protein) 및 IGFBP2(insulin like growth factor binding protein 2)을 포함하는 당뇨망막병증 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 ADAMTSL2(ADAMTS-like protein 2), Cp(Ceruloplasmin), CFH(complement factor H), DDI2(Protein DDI1 homolog2), FCN2(Ficolin 2), SELE(E-selectin), SIGLEC14(Sialic acid-binding Ig-like lectin 14), THBS1(Thrombospondin-1) 및 ZG16B(Zymogen granule protein 16 homolog B)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 마커에 대한 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 복합 마커의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는, 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 복합 마커의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는, 당뇨망막병증 진단용 조성물.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 당뇨망막병증 진단용 조성물을 포함하는, 당뇨망막병증 진단용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는, 당뇨망막병증 진단용 키트.
  9. (a) 환자의 생물학적 시료로부터 제1항 또는 제2항의 당뇨망막병증 진단용 복합 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는, 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법은 환자의 나이, BMI(body mass index), 흡연 여부, Hb1Ac 검사결과, 인슐린 치료 여부, 고혈압 여부, 고지혈증 여부 및 심혈관 질환 여부로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 임상정보를 추가로 포함하여 대조군과 비교하는 것을 특징으로 하는, 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법은 (c) 복합 마커의 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 대조군에 비해 증가하면 당뇨망막병증이라고 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨망막병증 진단을 위한 정보제공 방법.
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