WO2020171650A1 - 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법 - Google Patents

소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method of analyzing metabolite differentiation between different groups in a urine sample.
  • Urine is a biological sample most usefully used for health examination. Urine samples can be conveniently collected non-invasively and contain a lot of various metabolites, so they can be routinely used for disease diagnosis. Diseases such as diabetes, gout, proteinuria, and specific physiological changes such as pregnancy change the secretion of metabolites in the body and the composition of metabolites contained in urine. Therefore, researches to present biomarkers by finding and quantifying metabolites in urine that specifically change in disease and physiological changes have been conducted since ancient times. The study to find the change of metabolites according to such specific state change is called metabolomics.
  • the inventors of the present invention to extract a urine metabolite extraction method using an optimal extraction solvent without urease treatment and different groups based thereon (e.g., sex, disease, etc.) in order to reproducibly extract a large amount of metabolites of a urine sample without change.
  • the present invention was completed by establishing a method for analyzing metabolites of the liver.
  • an object of the present invention is to provide a kit for discriminating sex by extracting metabolites in a urine sample.
  • an object of the present invention is to provide a method of analyzing metabolite differentiation between different groups in a urine sample.
  • the present invention is succinate, fumarate, asparagine dehydrated, palmitic acid, beta-alanine, L-cysteine, It provides a kit for gender discrimination comprising a quantification device for one or more metabolites selected from the group consisting of lactic acid, tyrosine, glycine, and stearic acid.
  • a method for analyzing metabolite differentiation between different groups in a urine sample including the step of sampling metabolites in which metabolites are extracted using pure methanol or a mixed solvent of formic acid and methanol without urease treatment in urine. do.
  • the present invention proposes an optimized method for extracting metabolites of urine samples through comparison of non-urease treatment, extraction efficiency and extraction reproducibility between various extraction solvents in order to reproducibly extract as much as possible of metabolites of urine samples without change. It works. In addition, by presenting a comparative analysis method for metabolites between different groups based on this, there is an effect of suggesting a method for detecting biomarkers such as gender and disease.
  • the present invention is expected to be used in various pathology and biomarker presentation studies through metabolite analysis of urine samples.
  • urease 1 is a treatment of urease using PLS-DA and a stationary culture group (UI) at 37° C. for 1 hour, an untreated urease and stationary culture group at 37° C. for 1 hour (WI), non-urease treatment and stationary culture non-treatment group ( DE) shows the liver metabolite profile (A: score plot; B: loading plot).
  • Figure 2 shows the metabolite profile (A: score plot; B: loading plot) between males (DE_Male) and females (DE_Female) in the non-urease treatment and stationary culture non-treatment group (DE) using PLS-DA.
  • 3 is a comparison of the amounts of 10 metabolites that distinguish males and females in a box plot.
  • Figure 4 shows urine pure methanol (MeOH), pure ethanol (EtOH), acetonitrile: water mixture (50ACN; 1:1, v/v), water: 2-propanol: methanol mixture (WiPM; 2:2:5) , v/v/v), formic acid:methanol mixture (AM; 0.125:99.875, v/v) shows a comparison box plot of the extraction rate during metabolite extraction.
  • Figure 5 shows urine pure methanol (MeOH), pure ethanol (EtOH), acetonitrile: water mixture (50ACN; 1:1, v/v), water:2-propanol:methanol mixture (WiPM; 2:2:5) , v/v/v), formic acid:methanol mixture (AM; 0.125:99.875, v/v) shows a comparison box plot of the coefficient of variation (%CV) during metabolite extraction.
  • Figure 6 shows urine pure methanol (MeOH), pure ethanol (EtOH), acetonitrile: water mixture (50ACN; 1:1, v/v), water:2-propanol:methanol mixture (WiPM; 2:2:5) , v/v/v), formic acid:methanol mixture (AM; 0.125:99.875, v/v) shows a comparison box plot (A) and a photograph (B) of protein precipitation rates upon metabolite extraction based.
  • the present invention relates to a method for processing a urine sample for analysis of metabolites in urine.
  • the metabolites are directly extracted from the urine sample without urease treatment.
  • pure methanol or a mixed solvent of formic acid and methanol is used as an extraction solvent capable of extracting as much of a metabolite in urine reproducibly and properly precipitating proteins.
  • the present inventors extracted metabolites using pure methanol or a mixed solvent of formic acid and methanol without urease treatment in urine in order to find a biomarker that distinguishes the metabolite differentiation between the two biological sample groups in the urine sample, and GC/TOF Using MS, the urine metabolite pretreatment method and the difference in metabolite profile according to sex were compared and analyzed, and a study to discover biomarkers capable of distinguishing sex based on metabolites was performed using this difference.
  • 107 and/or 113 metabolites including amines, amino acids, sugars and sugar alcohols, fatty acids, phosphoric acids, organic acids, and the like were identified.
  • sex-classifying model selected the top 10 metabolites based on the VIP value of the PLS-DA model for each metabolite, and selected as a new biomarker candidate for gender classification (Table 4).
  • the present invention is succinate, fumarate, asparagine dehydrated, palmitic acid, beta-alanine, L-cysteine (L-cysteine) ), lactic acid (lactate), tyrosine (tyrosine), glycine (glycine) and stearic acid (stearic acid). It includes a kit for gender identification comprising a quantification device for one or more metabolites selected from the group consisting of.
  • succinate, palmitic acid, lactate, stearic acid, and glycine tend to increase, while fumarate, asparagine dihydride.
  • Tides asparagine dehydrated
  • beta-alanine ⁇ -alanine
  • L-cysteine L-cysteine
  • tyrosine tyrosine
  • the increase or decrease tendency means an increase or decrease in the concentration of metabolites
  • the term “increased metabolite concentration” means that the male to female urine metabolite concentration or the male to female urine metabolite concentration can be measured significantly. It means an increase, and in this specification, the term “reduction in metabolite concentration” means that the concentration of the female urine metabolite relative to the male, or the concentration of the male urine metabolite relative to the female has significantly decreased so that the metabolite concentration can be measured. I mean.
  • the quantification device included in the kit of the present invention may be a chromatography/mass spectrometer.
  • the chromatography used in the present invention is Gas Chromatography, Liquid-Solid Chromatography (LSC), Paper Chromatography (PC), and Thin-Layer Chromatography (TLC). ), Gas-Solid Chromatography (GSC), Liquid-Liquid Chromatography, LLC, Foam Chromatography (FC), Emulsion Chromatography (EC), Gas-Liquid Chromatography (GLC), Ion Chromatography (IC), Gel Filtration Chromatograhy (GFC), or Gel Permeation Chromatography (GPC).
  • GSC Gas-Solid Chromatography
  • FC Liquid-Liquid Chromatography
  • EC Emulsion Chromatography
  • GFC Gas-Liquid Chromatography
  • IC Ion Chromatography
  • GFC Gel Filtration Chromatograhy
  • GFC Gel Permeation Chromatography
  • GFC Gel Filtration Chromatograhy
  • GFC Gel Permeation Chromatography
  • GPC Gel Permeation Chromatography
  • each component is separated by gas chromatography, and components are identified through structural information (elemental composition) as well as accurate molecular weight information using information obtained through TOF MS.
  • the present invention also includes a method of analyzing metabolite differentiation to distinguish between different groups in urine.
  • the present invention is a method of analyzing metabolite differentiation to distinguish between different groups (eg, sex, disease, etc.) in a urine sample,
  • Including metabolite sampling step of extracting metabolites using pure methanol or a mixed solvent of formic acid and methanol without urease treatment of a urine sample analyzing metabolite differentiation to distinguish between different groups in a urine sample includes method.
  • the method of analyzing metabolite differentiation is a method of analyzing discrimination between different groups in a urine sample. First, a metabolite sampling step including a quenching process and a metabolite extraction process is performed.
  • Metabolite sampling is to extract metabolites using pure methanol, pure ethanol, acetonitrile:water mixture, water:2-propanol:methanol mixture, and formic acid:methanol mixture as an extraction solvent without urease treatment.
  • a mixed solvent of formic acid:methanol it is more preferable to use a mixed solvent of formic acid:methanol.
  • the mixing ratio of formic acid and methanol is more preferably a volume ratio of 0.05 to 0.5: 99.5 to 99.95.
  • the metabolite extracted in the metabolite sampling step undergoes the following analysis steps:
  • PLS-DA partial least squares discriminant analysis
  • the step of converting the GC/TOF MS analysis result into a statistically processable value is the largest of the area or height of the chromatogram peaks displayed during the unit time by dividing the total analysis time by unit time intervals. The value is set as the representative value for the unit time.
  • the step of statistically verifying the difference between the two biological sample groups using the converted values is metabolism that shows a significant difference between the two biological sample groups by performing a partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). Sieve biomarkers are analyzed and verified.
  • PLS-DA partial least squares discriminant analysis
  • the metabolite biomarker according to an embodiment of the present invention distinguishes between male and female sex.
  • Metabolite biomarkers include succinate, fumarate, asparagine dehydrated, palmitic acid, beta-alanine, and L-cysteine. ), lactic acid (lactate), tyrosine (tyrosine), glycine (glycine) and stearic acid (stearic acid).
  • a positive loading value of the partial least squares discriminant analysis indicates an increase in metabolite biomarkers, and a negative loading value indicates a decrease in metabolite biomarkers.
  • succinate as a biomarker for distinguishing gender, succinate, fumarate, asparagine dehydrated, palmitic acid, beta-alanine ( ⁇ -alanine), L-cysteine (L-cysteine), lactic acid (lactate), tyrosine (tyrosine), glycine (glycine) and one or more selected from the group consisting of stearic acid (stearic acid) can be used.
  • succinate, fumarate, asparagine dehydrated, palmitic acid, beta-alanine ( ⁇ -alanine), L-cysteine (L-cysteine), lactic acid (lactate), tyrosine (tyrosine), glycine (glycine) and one or more selected from the group consisting of stearic acid (stearic acid) can be used.
  • biomarkers in men, fumarate, asparagine dehydrated, beta-alanine, L-cysteine, and tyrosine tend to increase. And, succinate, palmitic acid, lactate, stearic acid and glycine show a decreasing tendency.
  • succinate, palmitic acid, lactate, stearic acid and glycine tend to increase in women, while fumarate, asparagine di. Hydrated (asparagine dehydrated), beta-alanine ( ⁇ -alanine), L-cysteine (L-cysteine), tyrosine (tyrosine) showed a tendency to decrease.
  • Example 1 Metabolite Profiling of 68 Urine Samples Using PLS-DA
  • Urine samples obtained from 68 healthy adults were treated with urease and stationary culture group (UI) at 37°C for 1 hour, urease non-treated and stationary culture group at 37°C for 1 hour (WI), urease and stationary culture ratio After the treatment was divided into treatment groups (DE), metabolites were extracted using pure methanol, which has been widely used, as an extraction solvent, and analyzed by GC/TOF MS.
  • the metabolite profile of the urease and stationary culture treatment groups was negative for most samples based on t[1] and t[2] values in the score plot, and the most samples for the non-urease and stationary culture treatment groups were t[ 1] and t[2] values are based on positive numbers, and in the non-urease-treated and stationary culture groups, most of the samples have positive values for t[1] and negative values for t[2].
  • the sieve profiles were completely differentiated (Table 3). Therefore, it was found that treatment with urease and each treatment method of stationary culture changed not only urea but also other metabolites of urine.
  • Table 1 below shows the urine sample information of 68 people.
  • Table 2 below shows 107 metabolites extracted using pure methanol from 68 urine samples.
  • Table 3 shows the treatment of urease using PLS-DA and stationary culture group (UI) for 1 hour at 37°C.
  • Table 4 shows the treatment of urease using PLS-DA and stationary culture group (UI) for 1 hour at 37°C. It shows the loading value of each metabolite in the metabolite profile between the non-urease treatment and the stationary culture group (WI) at 37° C. for 1 hour, and the urease and stationary culture non-treatment group (DE).
  • Table 3 can be judged that the types and amounts of metabolites vary according to each treatment. It can be assumed that the DE group extracts metabolites without pretreatment and confirms that the types and amounts of metabolites in the urine are maintained. Treatment of urease used in the past and stationary culture group (UI) for 1 hour at 37°C. Since the urease-free and 1 hour stationary culture group (WI) at 37°C changed the t[1] or t[2] values of most of the samples, it can be seen that the type and amount of metabolites changed ( 1, Table 3). Changes in the type and amount of metabolites through such treatment may change the type or amount of a biomarker material for diagnosis of a disease, decrease the ability to discover biomarkers, and select an incorrect biomarker.
  • UI past and stationary culture group
  • Example 2 Selection of major metabolites of 68 urine samples
  • Table 5 shows the treatment of urease using PLS-DA and a stationary culture group (UI) for 1 hour at 37°C.
  • VIP variable importance in projection
  • WI urease-free and stationary culture group
  • DE urease-free and stationary culture non-treatment group
  • Example 3 Metabolite Profiling to Distinguish Male and Female of 68 Urine Samples Using PLS-DA
  • metabolites in urine of males and females have different patterns, and statistically significant differences were shown based on the PLS-DA model. That is, the metabolite profile for male classification is positive in the score plot for most samples based on t[1] and t[2] values, and the metabolite profile for female classification is [t]1 and t[ 2]
  • the metabolite profile according to sex was completely differentiated with a negative number based on the value (Table 7). In order to select the major metabolites showing the difference in the metabolite profile, metabolites having the same trend in both loading 1 and loading 2 in Table 8 were selected.
  • Table 6 shows the mean and standard of the t[1] and t[2] values of each sample in the metabolite profile showing differences in metabolite profiling that distinguishes males and females from 68 urine samples using PLS-DA. It shows the deviation.
  • Table 7 shows the loading values of each metabolite in the metabolite profile showing differences in metabolite profiling that distinguishes males and females from 68 urine samples using PLS-DA.
  • Example 4 Selection of major metabolites showing differences in metabolite profiling that distinguishes males and females from 68 urine samples using PLS-DA
  • Table 8 shows the variable importance in projection (VIP) scores of 10 major metabolites showing significant differences in metabolite profiles showing differences in metabolite profiling that distinguishes males and females from 68 urine samples using PLS-DA. It shows the value.
  • Example 5 Selection of the optimal extraction solvent for metabolite analysis of urine samples
  • Table 9 shows 113 metabolites extracted from a human urine mixture sample using pure methanol, pure ethanol, acetonitrile:water mixture, water:2-propanol:methanol mixture, and formic acid:methanol mixture.

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Abstract

본 발명은 소변 시료의 대사체를 변화 없이 가능한 많은 양을 재현성있게 추출하기 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법에 관한 것으로, 소변 시료 내 대사체 샘플링을 위한 최적 조건을 확립하고, 또한 이에 기반한 서로 다른 그룹 간의 대사물질 비교 분석법을 제시함으로써, 성별 등의 바이오마커 검출법을 제시하는 효과가 있다.

Description

소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법
본 발명은 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법에 관한 것이다.
소변은 건강 검진에 가장 유용하게 사용되는 생체 시료이다. 소변 시료는 비침투적으로 편리하게 채취할 수 있으며 다양한 대사 물질을 많이 함유하고 있으므로 질병 진단에 일상적으로 이용될 수 있다. 당뇨, 통풍, 단백뇨 등의 질병이나 임신과 같은 특이적인 생리학적 변화는 생체 내 대사물질의 분비를 변화시키고 소변에 함유된 대사물질의 조성을 바꾼다. 따라서 질병 및 생리학적 변화에 특이적으로 변화하는 소변 내 대사물질을 찾고 정량하여 바이오마커를 제시하는 연구는 예로부터 많이 진행되어왔다. 이러한 특이적 상태 변화에 따른 대사물질들의 변화를 찾는 연구를 대사체학이라고 한다.
대사체학 연구는 시료 내 대사물질의 변화를 막고 가능한 많은 물질을 변화없이 재현성 있게 추출하는 것이 매우 중요하다. 소변 대사체학의 경우, 표준화된 소변 대사체 추출법이 nature protocol에 제시된 바 있다 (Chan EC et al., 2011, Nat. Protoc. vol. 6, pp. 1483-1499). 그러나 이 추출 방법은 실험적 연구에 기반하지 않고, 기존에 사용해왔던 방법을 차용 및 정리한 것이라 최적의 소변 대사체 추출법이라고 할 수 없다. 표준화 소변 대사체 추출법은 소변 내 우레아(urea)를 제거하기 위하여 우레아제(urease)를 처리하고, 메탄올을 투여하여 소변 내 단백질 침전 및 대사체 추출을 시행한다. 그러나 우레아제의 처리는 37℃에서 1 시간 동안 반응시키므로 소변 내 효소 등의 활성에 의해 대사물질의 변화를 일으킬 수 있다. 이는 질병의 진단용 바이오마커를 발굴하고자 소변 대사체학 연구를 수행할 때 바이오마커 발굴 능력을 떨어뜨릴 수 있다. 또한 순수 메탄올은 그 추출 효율 및 재현성에 대해 다른 추출 용매와 비교, 분석된 바가 없어서 최적의 추출 용매라고 할 수 없다. 따라서 기존의 표준화 방법에서 우레아제 처리가 미치는 영향을 살펴봄과 동시에 다양한 추출 용매를 비교 분석함으로써, 소변 시료의 대사체를 변화 없이 원 상태로, 가능한 많이 재현성 있게 추출하는 최적화된 추출법을 제시하는 것이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 소변 시료의 대사체를 변화 없이 가능한 많은 양을 재현성 있게 추출하기 위하여, 우레아제 처리 없이 최적의 추출 용매를 사용한 소변 대사체 추출법 및 이에 기반한 서로 다른 그룹(예, 성별, 질병 등) 간의 대사체 분석법을 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 소변 시료 내 대사체 추출에 의한 성별 구별용 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
본 발명은 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 성별 구별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법으로서,
소변에 우레아제(urease) 처리 없이, 순수 메탄올 또는 포름산과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는, 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명은 소변 시료의 대사체를 변화 없이 가능한 많은 양을 재현성있게 추출하기 위하여 소변 시료에서 우레아제 비처리, 다양한 추출 용매 간 추출 효율 및 추출 재현성 비교를 통해 최적화된 소변 시료의 대사체 추출법을 제시하는 효과가 있다. 또한, 이에 기반한 서로 다른 그룹 간의 대사물질 비교 분석법을 제시함으로써, 성별, 질병 등의 바이오마커 검출법을 제시하는 효과가 있다.
본 발명은 소변 시료의 대사체 분석을 통한 다양한 병리학 및 바이오마커 제시 연구에 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 PLS-DA를 이용한 우레아제의 처리 및 37 ℃에서 1시간 정치배양군(UI), 우레아제 비처리 및 37 ℃에서 1시간 정치 배양군(WI), 우레아제 비처리 및 정치 배양 비처리군(DE) 간의 대사체 프로파일 (A: score plot; B: loading plot)을 나타낸 것이다.
도 2는 PLS-DA를 이용한 우레아제 비처리 및 정치 배양 비처리군(DE)에서 남성 (DE_Male)과 여성 (DE_Female) 간의 대사체 프로파일 (A: score plot; B: loading plot)을 나타낸 것이다.
도 3은 남성과 여성을 구분 짓는 10개의 대사체의 양을 박스 플롯으로 나타내어 비교한 것이다.
도 4는 소변의 순수 메탄올 (MeOH), 순수 에탄올 (EtOH), 아세토니트릴:물 혼합물 (50ACN; 1:1, v/v), 물:2-프로판올:메탄올 혼합물 (WiPM; 2:2:5, v/v/v), 포름산:메탄올 혼합물 (AM; 0.125:99.875, v/v) 기반 대사체 추출 시의 추출율 비교 박스 플롯을 나타낸 것이다.
도 5는 소변의 순수 메탄올 (MeOH), 순수 에탄올 (EtOH), 아세토니트릴:물 혼합물 (50ACN; 1:1, v/v), 물:2-프로판올:메탄올 혼합물 (WiPM; 2:2:5, v/v/v), 포름산:메탄올 혼합물 (AM; 0.125:99.875, v/v) 기반 대사체 추출 시의 변동 계수 (%CV) 비교 박스 플롯을 나타낸 것이다.
도 6은 소변의 순수 메탄올 (MeOH), 순수 에탄올 (EtOH), 아세토니트릴:물 혼합물 (50ACN; 1:1, v/v), 물:2-프로판올:메탄올 혼합물 (WiPM; 2:2:5, v/v/v), 포름산:메탄올 혼합물 (AM; 0.125:99.875, v/v) 기반 대사체 추출 시의 단백질 침전율 비교 박스 플롯 (A) 및 사진 (B)을 나타낸 것이다.
본 발명은 소변의 대사체 분석을 위한 소변 샘플 처리 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 소변 시료의 대사체를 변화 없이 가능한 많은 양을 재현성있게 추출하기 위하여 소변 시료에서 우레아제 처리 없이 대사체를 바로 추출한다.
또한, 본 발명의 일 구현예에서, 소변 시료의 대사체를 기반으로 서로 다른 그룹을 구별하고, 바이오마커를 찾을 수 있는 연구 방법을 제시하기 위하여 소변 시료에서 우레아제 처리 없이 추출된 대사체를 기반으로 서로 다른 그룹 간의 비교 분석한다.
본 발명의 일 구현예에서, 소변의 대사체를 가능한 많은 양을 재현성있게 추출하고, 단백질을 적절히 침전시킬 수 있는 추출 용매로는 순수 메탄올 또는 포름산과 메탄올의 혼합 용매를 사용한다.
본 발명자들은 소변 시료 내 두 생체시료군 간의 대사체 차별성을 구별하는 바이오마커를 찾기 위해 소변에 우레아제(urease) 처리 없이 순수 메탄올 또는 포름산과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 대사체를 추출하고 GC/TOF MS를 이용하여 소변 대사체 전처리 방법 및 성별에 따른 대사체 프로파일 차이를 비교 분석하고, 이 차이를 이용하여 대사체에 기반하여 성별을 구별할 수 있는 바이오마커 발굴 연구를 수행하였다.
그 결과, 아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 인산류, 유기산류 등을 포함한 107개 및/또는 113개의 대사체가 동정되었다.
소변 시료에서 서로 다른 전처리 방법 기반으로 샘플링하여 생체 시료를 비교하였을 때, 부분최소자승판별분석(PLS-DA)을 통해 서로 다른 전처리 방법으로 추출했을 시의 대사체 프로파일의 명확한 차이를 확인하였으며 (도 1), 성별에 따른 대사체 프로파일의 명확한 차이도 확인하였다 (도 2). 이 중 성별을 구분하는 모델은, 각각의 대사물질에 대해 PLS-DA 모델의 VIP 값을 기준으로 상위 10종의 대사체를 선별하고 성별 구분의 신규 바이오마커 후보 물질로 선정하였다(표 4).
따라서, 본 발명은 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 성별 구별용 키트를 포함한다.
또한, 남성은 대사체 중에서 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 및 티로신 (tyrosine)은 증가하는 경향을, 스테아르산 (stearic acid), 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate) 및 글라이신 (glycine)은 감소하는 경향을 나타낸다.
여성은 대사체 중에서 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate), 스테아르산 (stearic acid) 및 글라이신 (glycine)은 증가하는 경향을, 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 및 티로신 (tyrosine)은 감소하는 경향을 나타낸다.
상기 증가 또는 감소 경향이란 대사체 농도의 증가 또는 감소를 의미하는 것으로, 용어 “대사체 농도의 증가”는 남성 대비 여성 소변 대사체 농도가, 혹은 여성 대비 남성 소변 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 본 명세서에서, 용어 “대사체 농도의 감소”는 남성 대비 여성 소변 대사체 농도가, 혹은 여성 대비 남성 소변 대사체 농도가 대비 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 뜻한다.
본 발명의 키트에 포함된 정량 장치는 크로마토그래피/질량분석기일 수 있다.
본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography), 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기일 수 있다.
본 발명의 대사체는 가스 크로마토그래피에서 각 성분들이 분리되며, TOF MS를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 통해 구성 성분을 확인한다.
본 발명은 또한 소변 내 서로 다른 그룹 간 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법을 포함한다.
일 구현예로, 본 발명은 소변 시료 내 서로 다른 그룹(예, 성별, 질병 등) 간의 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법으로서,
소변 시료를 우레아제(urease) 처리 없이 순수 메탄올 또는 포름산과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는, 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법을 포함한다.
상기 대사체 차별성을 분석하는 방법은 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간 차별성을 분석하는 방법으로써, 우선, 퀜칭 과정과 대사체 추출 과정을 포함하는 대사체 샘플링 단계를 거친다.
대사체 샘플링은 소변 시료를 우레아제 처리 없이 추출 용매로 순수 메탄올, 순수 에탄올, 아세토니트릴:물 혼합물, 물:2-프로판올:메탄올 혼합물, 포름산:메탄올 혼합물을 사용하여 대사체를 추출한다. 특히, 포름산:메탄올의 혼합 용매를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 포름산과 메탄올의 혼합 비는 0.05~0.5 : 99.5~99.95 의 부피 비가 더욱 바람직하다.
이때, 소변과 추출 용매는 1:8~10의 부피비로 처리되는 것이 실험의 오차를 줄일 수 있으므로 바람직하다.
상기 대사체 샘플링 단계에서 추출된 대사체에 대해서는 다음의 분석 단계를 거친다:
추출된 대사체를 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기로 분석하는 단계;
GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계; 및
변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 서로 다른 그룹의 차별성을 검증하는 단계를 더 포함한다.
다음으로, 대사체의 프로파일링 차이를 비교하기 위해 부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)을 수행하여 서로 다른 그룹 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 선정하고, 분석 및 검증한다.
일 구현예로서, 본 발명의 분석 방법은 GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계는 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정한다.
변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계는 부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)을 수행하여 두 생체시료군 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 분석 및 검증한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 대사체 바이오마커는 남성과 여성의 성별 구별한다.
대사체 바이오마커는 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 구성된다.
부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)의 로딩 값이 양수인 것은 대사체 바이오마커의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체 바이오마커의 감소 경향을 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 성별을 구별하기 위한 바이오마커로, 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 바이오마커들 중 남성에서는 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 및 티로신 (tyrosine)은 증가하는 경향을, 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate), 스테아르산 (stearic acid) 및 글라이신 (glycine)은 감소하는 경향을 나타낸다.
상기 바이오마커들 중 여성에서는 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate), 스테아르산 (stearic acid) 및 글라이신 (glycine)은 증가하는 경향을, 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 티로신 (tyrosine)은 감소하는 경향을 나타낸다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: PLS-DA를 이용한 68 개 소변 샘플의 대사체 프로파일링
68 명의 건강한 성인 (표 1)에서 얻은 소변 샘플을 우레아제의 처리 및 37℃에서 1시간 정치배양군(UI), 우레아제 비처리 및 37℃에서 1시간 정치배양군(WI), 우레아제 및 정치배양 비처리군(DE)으로 나누어 처리한 후, 기존에 많이 사용되고 있는 순수 메탄올을 추출 용매로 이용하여 대사체를 추출한 후 GC/TOF MS로 분석하였다.
아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 유기산류 등을 포함한 107개의 대사체를 동정하였다(표 2).
대사체 프로파일링 차이를 비교하기 위하여 우레아 (urea)를 제외한 106개의 대사체를 기반으로 PLS-DA를 실시하였다. 우레아제 및 정치배양 처리군과 우레아제 비처리 및 정치배양 처리군, 우레아제 및 정치배양 비처리군 각각에서 서로 다른 대사체 패턴을 가짐을 살펴보았다 (도 1, 표 3, 표 4). 즉, 우레아제 및 정치배양 처리군의 대사체 프로파일은 스코어 플롯에서 대부분의 샘플이 t[1] 및 t[2] 값 기준으로 음수를, 우레아제 비처리 및 정치배양 처리군은 대부분의 샘플이 t[1] 및 t[2] 값 기준으로 양수를, 우레아제 비처리 및 정치배양 비처리군은 대부분의 샘플이 t[1] 값은 양수를, t[2] 값은 음수를 띠어 처리 방법에 따라서 대사체 프로파일이 완전히 구분되었다 (표 3). 따라서 우레아제의 처리나 정치 배양 각각의 처리방법이 우레아뿐만 아니라 다른 소변 본연의 대사체를 변화시킴을 밝혔다.
다음 표 1은 68명의 소변 샘플 정보는 나타낸 것이다.
다음 표 2는 68명 소변 샘플에서 순수 메탄올을 이용해 추출한 107개 대사체를 나타낸 것이다.
다음 표 3은 PLS-DA를 이용한 우레아제의 처리 및 37 ℃에서 1시간 정치배양군(UI). 우레아제 비처리 및 37 ℃에서 1시간 정치배양군(WI), 우레아제 비처리 및 정치배양 비처리군(DE) 간의 대사체 프로파일에서 t[1](PC1) 및 t[2](PC2) 값을 평균 및 표준편차로 나타낸 것이다.
다음 표 4는 PLS-DA를 이용한 우레아제의 처리 및 37 ℃에서 1시간 정치배양군(UI). 우레아제 비처리 및 37 ℃에서 1시간 정치배양군(WI), 우레아제 및 정치배양 비처리군(DE) 간의 대사체 프로파일에서 각 대사체의 로딩 값을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2020002542-appb-T000001
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000001
Figure PCTKR2020002542-appb-T000002
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000002
Figure PCTKR2020002542-appb-T000003
표 3은 각 처리에 따라서 대사물질의 종류와 양이 달라진다는 것을 판단할 수 있다. DE 군은 전처리 없이 대사물질을 추출하여 소변 본연의 대사물질 종류 및 양을 유지함을 확인한다고 가정할 수 있다. 기존에 사용되던 우레아제의 처리 및 37 ℃에서 1시간 정치배양군(UI). 우레아제 비처리 및 37 ℃에서 1시간 정치배양군(WI)은 대부분의 샘플의 t[1] 값 혹은 t[2] 값을 변화시켰으므로 대사물질의 종류 및 양의 변화가 일어난 것을 알 수 있다 (도 1, 표 3). 이러한 처리를 통해 대사물질의 종류 및 양이 변화하는 것은 질병의 진단용 바이오마커 물질의 종류나 양을 변화시키고 바이오마커를 발굴하는 능력을 떨어뜨리고 잘못된 바이오마커가 선정될 수 있다.
따라서 우레아제 처리는 대사체 프로파일을 변화시키므로 (표 3) 본연의 대사체 프로파일을 갖고 있는 우레아제 비처리군 DE 보다 바이오마커 발굴 능력이 떨어진다.
Figure PCTKR2020002542-appb-T000004
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000003
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000004
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000005
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000006
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000007
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000008
실시예 2: 68 개 소변 샘플의 주요 대사체 선정
실시예 1로부터 나온 PLS-DA 분석을 이용하여, 68 개 소변 샘플의 우레아제의 처리 및 37℃에서 1시간 정치배양군(UI), 우레아제 비처리 및 37℃에서 1시간 정치배양군(WI), 우레아제 비처리 및 정치배양 비처리군(DE) 세 개의 그룹을 분리하는데 높은 기여를 한 주요 대사체를 VIP값 기준으로 상위 10개를 선정하였다 (표 5).
다음 표 5는 PLS-DA를 이용한 우레아제의 처리 및 37 ℃에서 1시간 정치배양군(UI). 우레아제 비처리 및 37℃에서 1시간 정치배양군(WI), 우레아제 비처리 및 정치배양 비처리군(DE) 간의 대사체 프로파일에서 큰 차이를 보이는 10개의 주요 대사체의 VIP(variable importance in projection) score 값을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2020002542-appb-T000005
실시예 3: PLS-DA를 이용한 68 개 소변 샘플의 남성 및 여성을 구분하는 대사체 프로파일링
68 명의 건강한 성인 (표 1)에서 얻은 소변 샘플 중 31명의 남성 소변 샘플과 37명의 여성 소변 샘플에 우레아제 처리 없이 기존에 많이 사용되고 있는 순수 메탄올을 추출 용매로 이용하여 대사체를 추출한 후 GC/TOF MS로 분석하였다. 이 후 각 성별을 구분지을 수 있도록 우레아를 제외한 106개의 대사체를 이용하여 PLS-DA 모델을 생성하였다 (도 2, 표 6, 표 7).
도 2에 나타난 바와 같이 남성과 여성의 소변 내 대사체는 서로 다른 패턴을 가지며, PLS-DA 모델을 기반으로 통계적으로 유의적 차이를 보였다. 즉, 남성 구분 시의 대사체 프로파일은 스코어 플롯에서 대부분의 샘플이 t[1] 및 t[2] 값 기준으로 양수를, 여성 구분 시의 대사체 프로파일은 스코어 플롯에서 [t]1 및 t[2] 값 기준으로 음수를 띠어 성별에 따른 대사체 프로파일이 완전히 구분되었다 (표 7). 이러한 대사체 프로파일의 차이를 나타내는 주요 대사물질을 선정하기 위해서 표 8에서의 로딩 1과 로딩 2 모두에서 동일한 경향을 보이고 그 값이 큰 대사체를 선별하였다.
다음 표 6는 PLS-DA를 이용한 68개 소변 샘플의 남성 및 여성을 구분하는 대사체 프로파일링에서 차이를 나타내는 대사체 프로파일에서 각 샘플의 t[1]값과 t[2] 값의 평균 및 표준편차를 나타낸 것이다.
다음 표 7는 PLS-DA를 이용한 68개 소변 샘플의 남성 및 여성을 구분하는 대사체 프로파일링에서 차이를 나타내는 대사체 프로파일에서 각 대사체의 로딩 값을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2020002542-appb-T000006
Figure PCTKR2020002542-appb-T000007
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000009
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000010
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000011
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000012
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000013
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000014
실시예 4: PLS-DA를 이용한 68 개 소변 샘플의 남성 및 여성을 구분하는 대사체 프로파일링에서 차이를 나타내는 주요 대사체 선정
실시예 3으로부터 나온 PLS-DA 분석을 이용하여, 각 성별 그룹이 분리가 됨을 확인하고, 모델 내 각 성별의 분리에 기여하는 정도인 VIP값에서 높은 수치를 보인 주요 대사체 상위 10개를 선정하였다 (표 8). 또한 10개의 대사체의 양을 박스 플롯으로 나타내어 성별에 따른 대사체의 양을 비교하였다 (도 3).
다음 표 8은 PLS-DA를 이용한 68개 소변 샘플의 남성 및 여성을 구분하는 대사체 프로파일링에서 차이를 나타내는 대사체 프로파일에서 큰 차이를 보이는 10개의 주요 대사체의 VIP(variable importance in projection) score 값을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2020002542-appb-T000008
실시예 5: 소변 샘플의 대사체 분석을 위한 최적의 추출 용매 선정
소변 샘플에서 대사체 샘플을 얻기 위하여 68 명의 소변 샘플을 동일한 비율로 하나로 합쳐서 소변 혼합물로 만든 후에, 100 μl의 소변 혼합물에 우레아제 처리 없이 직접 900 μl의 추출용매, 순수 메탄올 (MeOH), 순수 에탄올 (EtOH), 아세토니트릴:물 혼합물 (50ACN; 1:1, v/v), 물:2-프로판올:메탄올 혼합물 (WiPM; 2:2:5, v/v/v), 포름산:메탄올 혼합물 (AM; 0.125:99.875, v/v)을 처리하여 대사체를 추출한 후 GC/TOF-MS로 분석하여 추출 효율을 비교 분석하였다.
소변 혼합물에서 아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 유기산류 등을 포함한 113 개의 대사체를 동정하였다(표 9).
도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 추출 용매에 따라서 추출율 및 추출 재현성이 다름을 확인할 수 있었다. 정성 및 상대적으로 정량 분석된 피크 인텐시티가 AM에서 가장 높아, 종합적인 대사체의 추출율이 AM에서 가장 높음을 볼 수 있었다 (도 4). 또한 추출 용매에 따른 재현성을 살펴보면, %CV 값이 AM에서 모두 최저의 수치를 기록하여, 재현성이 제일 높음을 알 수 있었다 (도 5). 또한 단백질의 침전율이 AM에서 두 번째로 높은 수치를 기록하여, AM이 적절한 단백질을 침전능을 가지는 것으로 보였다 (도 6). 이를 통하여 소변의 대사체 분석을 위한 대사체 추출 시에 추출율 및 재현성과 단백질 침전율에 기반한 최적 용매로 AM을 선정하였다.
다음 표 9는 인간 소변 혼합물 샘플에서 순수 메탄올, 순수 에탄올, 아세토니트릴:물 혼합물, 물:2-프로판올:메탄올 혼합물, 포름산:메탄올 혼합물을 이용해 추출한 113개의 대사체를 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2020002542-appb-T000009
(계속)
Figure PCTKR2020002542-appb-I000015

Claims (11)

  1. 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 소변 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 성별 구별용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    정량 장치는 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기인 키트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    남성은 대사체 중에서 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 및 티로신 (tyrosine)은 증가하는 경향을, 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate), 스테아르산 (stearic acid) 및 글라이신 (glycine)은 감소하는 경향을 나타내는 키트.
  4. 제 1 항에 있어서,
    여성은 대사체 중에서 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate), 스테아르산 (stearic acid) 및 글라이신 (glycine)은 증가하는 경향을, 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 및 티로신 (tyrosine)은 감소하는 경향을 나타내는 키트.
  5. 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법으로서,
    소변에 우레아제(urease) 처리 없이 순수 메탄올 또는 포름산과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는, 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 분석 방법은 추출된 대사체를 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기로 분석하는 단계; GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계; 및 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계는 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하는 것인, 방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계는 부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)을 수행하여 두 생체시료군 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 분석 및 검증하는 것인, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)의 로딩 값이 양수인 것은 대사체 바이오마커의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체 바이오마커의 감소 경향을 나타내는 것인, 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    대사체 바이오마커는 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 구성된 것인, 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    대사체 바이오마커는 성별을 구별하는 것인, 방법.
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