WO2020165473A1 - Formulación o adhesivo tisular obtenido de una composición sanguínea que contiene plaquetas, y método de preparación de dicha formulación - Google Patents

Formulación o adhesivo tisular obtenido de una composición sanguínea que contiene plaquetas, y método de preparación de dicha formulación Download PDF

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Eduardo Anitua Aldecoa
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Definitions

  • the invention relates to a formulation with desirable biological or medical properties, obtained from an initial blood composition containing platelets.
  • the invention also relates to a method of preparing said formulation.
  • the formulation serves as a tissue adhesive.
  • compositions from human or animal blood where the blood is processed in such a way as to obtain a plasma rich in platelets (PRP) and / or a plasma rich in growth factors that they have useful biological and medical properties.
  • PRP plasma rich in platelets
  • Said PRP or plasma rich in growth factors have been used successfully in ex vivo applications, for example as a cell culture medium, and in vivo, for example to carry out a bone regeneration process in a patient or to treat a patient for a joint ailment through infiltrations.
  • the technology for preparing PRP formulations and plasma rich in growth factors has evolved towards the preparation of autologous compositions, that is, obtained from the patient's own blood. Examples of this type of compositions and preparation methods can be found in patents US6569204 and ES2221770.
  • compositions consisting of platelet-rich fibrin (PRF), obtained from blood, are also known.
  • PRF platelet-rich fibrin
  • fibrin can be autologous or heterologous.
  • plasma which is liquid, fibrin has a solid or semi-solid consistency.
  • fibrin gel or fibrin mesh An example of fibrin is known as fibrin gel or fibrin mesh, which is a formulation whose semi-solid consistency is very convenient for certain applications.
  • the fibrin gel or mesh preparation procedure generally begins with a first phase in which a PRP or growth factor-rich plasma is obtained by an applicable method, for example by centrifuging blood drawn from a patient until the blood separates. in several fractions, and extracting the upper fraction, that is the fraction of platelet rich plasma (PRP) or plasma rich in growth factors. Subsequently, the platelets contained in the PRP or plasma rich in growth factors are activated (activation being understood as the action of causing the platelets to release certain growth factors contained within), for example by adding calcium chloride.
  • PRP platelet rich plasma
  • fibrin gel also called fibrin gel or mesh for its semi-solid consistency, like a kind of biological sponge.
  • This procedure is usually performed to obtain a fibrin gel from blood modified with an anticoagulant, such as sodium citrate.
  • an anticoagulant such as sodium citrate.
  • blood can also be processed without mixing it previously with anticoagulant; In this case, by centrifuging the blood it is possible to separate the plasma from the red blood cells and, at the same time, to obtain the fibrin gel without the need to add calcium chloride or another platelet activator.
  • fibrin gel or mesh application are: forming a biological scaffold to fill bone defects; be applied on wounds or lesions for the progressive release of growth factors; be used as a matrix for stem cell culture; be used as a membrane to close defects or ulcers; be used in the manufacture of tissues, which is known as tissue engineering, where in addition to cells and growth factors it is especially important to have a matrix or scaffold where the cells can grow.
  • tissue engineering where in addition to cells and growth factors it is especially important to have a matrix or scaffold where the cells can grow.
  • platelet-rich preparations PRP, plasma rich in growth factors, PRF
  • PRF platelet-rich preparations
  • PRF plasma rich in growth factors
  • the object of the invention is a formulation with desirable biological or medical properties, which comprises or is derived from an initial blood composition (of human or animal origin; autologous, homologous or heterologous), rich in platelets and / or growth factors and which comprises proteins from the initial blood composition itself, with the particularity that the formulation presents an increased adhesiveness.
  • This formulation can be autologous (it is prepared and applied to the same donor), homologous (the donor and the recipient are of the same species) or heterologous (the donor and recipient are of different species and could be classified as a “sealant of fibrin ”(using a terminology analogous to that used to refer to the application of fibrin preparations to seal) due to its increased adhesiveness and accelerated coagulation.
  • the composition presents a new morphological and biomechanical configuration compared to the rest of senators of fibrin, blood compositions rich in platelets and / or growth factors, and the like known in the state of the art.
  • the formulation according to the invention is biocompatible, biodegradable and exhibits the desirable biological or medical properties provided by the presence of platelets or growth factors.
  • the formulation exhibits increased tissue adhesiveness and is obtained in short times.
  • the formulation according to the invention is therefore an advantageous alternative to conventional fibrin sealant, due to the fact that the formulation is autologous, adhesive and is obtained in a short time without the addition of chemicals.
  • the formulation exhibits good compressive adhesiveness, similar to or better than the conventional allogeneic fibrin sealant Tisseel® and PRP (commonly used as a sealant), and adequately supports the resistance that a tissue can exert; therefore, the formulation is very suitable for use as a fibrin sealant. In addition, it is injectable.
  • Another object of the invention is a method of preparing the above formulation, wherein said method comprises the steps of: having an initial blood composition rich in platelets and / or growth factors whose base formulation can vary; heating the blood composition having a temperature of 40 to 55 Q C; centrifuge the initial blood composition for at least 1 minute; reduce the volume of the initial composition.
  • This method of the invention also comprises the addition of a platelet activating substance and the formation of fibrin to obtain a blood composition rich in platelets and / or growth factors in gel form.
  • FIG. 1 shows the coagulation time of different examples of formulations according to the invention.
  • FIG. 3 shows the effect of the activator and platelets on the clotting time of the formulations according to the invention.
  • FIG. 6 shows the efficacy as a tissue adhesive of different examples of formulations according to the invention compared to the commercial sealant Tisseel® as a tissue adhesive.
  • Said formulation comprises or is derived from an initial blood composition containing platelets.
  • This composition is adhesive due to heat treatment and formation of a fibrin clot.
  • the sealant prepared according to this invention has been found to have a tissue adhesiveness similar to the Tisseel® fibrin sealant and better than the adhesiveness of a conventional platelet-rich fibrin or platelet-rich plasma.
  • the initial blood composition can be, for example, a platelet-rich blood plasma, that is, a plasma with a high concentration of platelets.
  • Said plasma has generally been obtained through the technique of centrifuging blood (to separate it into a fraction of a fraction of red blood cells, a fraction of white blood cells and a fraction of platelet-rich plasma (PRP)) and separating all or part of the fraction of platelet rich plasma (PRP).
  • the initial blood composition may or may not contain leukocytes.
  • the initial blood composition For the activation of the initial blood composition one or more of: calcium chloride, thrombin, sodium gluconate, collagen, supernatant (a liquid substance that appears on the clot when coagulation of a platelet-rich plasma (PRP) is caused ) and its subsequent retraction), supernatant of a blood plasma rich in growth factors, or any other agent that acts by activating platelets and inducing fibrin formation in such a way that the platelets have released certain growth factors from within.
  • PRP platelet-rich plasma
  • a method of preparing a formulation with desirable biological or medical properties comprises the steps of: a) having an initial blood composition rich in platelets and / or growth factors with or without anticoagulant, which is preferably a platelet-rich plasma with or without leukocytes, or a growth factor-rich plasma with or without leukocytes. b) Raise the temperature of the initial composition at a temperature of 40 to 55 Q C. c) Centrifuge the initial blood composition during at the least 1 minute. d) Remove at least part of the plasma fraction obtained as a result of centrifugation. e) Activate the blood composition that remains after removing at least part of the plasma fraction as indicated in step d).
  • Activation can be performed, for example, by adding calcium chloride, thrombin, a combination of calcium chloride and thrombin, sodium gluconate, collagen, supernatant (a substantial liquid that appears on the clot when coagulation of a rich plasma is caused platelets (PRP) and its subsequent retraction), supernatant of a blood plasma rich in growth factors and / or any other platelet activating agent.
  • platelets are activated and fibrin formation is induced so that platelets release from their interior certain growth factors.
  • the above method produces a precipitation of protein substances without the denaturation of fibrinogen as evidenced by the obtaining of a fibrin clot after activation.
  • the concentration of these protein substances is increased.
  • the method produces a remarkable acceleration in the coagulation of the blood composition and in its adhesion strength.
  • new biocompatible and biodegradable formulations are achieved, with two main advantages: a short coagulation time and a higher adhesiveness, which makes this formulation can be applied as an adhesive or fibrin sealant.
  • the temperature of the initial blood composition is increased to a temperature in the range of 40 to 53 Q C.
  • the initial blood composition rich in platelets and / or growth factors can be of human or animal origin.
  • it can be autologous (belonging to a patient whom it is desired to treat later with the final formulation), homologous (belonging to a member of the same species as the patient, patients, cells or other biological entity to be treated or processed with the final formulation) or heterologous (belonging to a member of a different species than the patient, patients, cells, or other biological entity to be treated or processed with the final formulation).
  • the initial blood composition may optionally incorporate one or more additional substances, added prior to the claimed heat treatment.
  • additional substances can be:
  • bioactive agents selected from proteins, peptides, nucleic acids, polysaccharides, lipids, non-protein organic substances and inorganic substances;
  • biodegradable polymers selected from: acid hyaluronic, hyaluronate salts, chondroitin 4 sulfate, chondroitin 6 sulfate, dextran, silica gel, alginate, hydroxypropylmethylcellulose, chitin derivatives, preferably chitosan, xanthan gum, agarose; polyethylene glycol (PEG), polyhydroxyethylene methacrylate (HEMA), synthetic or natural proteins, collagens;
  • PEG polyethylene glycol
  • HEMA polyhydroxyethylene methacrylate
  • organic polymers selected from the group of polycarpolactone, polyglycolic, polylactic, and their co-polymers;
  • antibiotics antibiotics, antimicrobials, anticancer agents, analgesics, growth factors, hormones;
  • inorganic components selected from the group of calcium salts, magnesium salts, and / or strontium salts.
  • the invention also contemplates that any of the above substances can be added to the formulation after the heat treatment has been carried out.
  • the formulation according to the invention contemplates various embodiments in which the formulation may comprise, in addition to the technical aspects claimed, other compounds, components, molecules, etc. that are convenient for the specific application for which the formulation is intended. Furthermore, it is possible to perform additional steps on the formulation produced according to the method described in this invention that include desiccates to increase its versatility. That is, prior to its activation (activation of platelets and formation of fibrin), the formulation according to the invention can be dried (dry heat) or lyophilized.
  • This formulation can be subsequently rehydrated by different alternatives such as adding a saline solution, a plasma rich in platelets, a supernatant of a plasma rich in platelets, a plasma rich in growth factors, a supernatant of a plasma rich in growth factors, or any other liquid substance.
  • Example 1 The starting point is a sample of 9 tubes (9ml) that hermetically contain blood drawn from a patient.
  • the tubes are centrifuged at a speed of 580 g, for a time of 8 minutes and at room temperature. As a consequence of centrifugation, the blood contained in each tube is divided into several fractions.
  • the upper fraction, or platelet-rich plasma (PRP) fraction is extracted into a white tube, obtaining a total of 36 ml of plasma.
  • the plasma is distributed into 6 tubes, each tube containing 6 ml of plasma. Then, the temperature each of the six tubes is raised to 37.55, 45.95, 51, 05, 52.4, 53.9 and 55.35 Q C, respectively.
  • PRP platelet-rich plasma
  • the 6 tubes are centrifuged at a speed of 580 g, for a time of 8 minutes and at room temperature, producing the precipitation of platelets and new protein substances.
  • the upper half of the plasma is removed.
  • the precipitate is resuspended in the plasma that has remained in the tube.
  • the formulations in the 6 tubes are activated by adding a PRP supernatant (333mI) and 20 ml of calcium for each 1 ml of formulation, which initiates the formation of fibrin in the formulations.
  • a PRP supernatant 333mI
  • 20 ml of calcium for each 1 ml of formulation, which initiates the formation of fibrin in the formulations.
  • Clotting time (the time it takes for the blood composition to change its state from liquid to gel) due to fibrin formation has been measured.
  • Figure 1 shows the ability of the method of the invention to accelerate clotting time.
  • the clotting time of a conventional PRP activated in the same way as the previous formulations according to the invention (that is, with PRP supernatant (333mI) and 20 ml of calcium per 1 ml) has been 4.5 minutes.
  • the formulations according to the invention have lower or accelerated coagulation times with respect to said conventional PRP. Said acceleration of Coagulation is higher for the temperature of 51 05 Q C, followed by 52.4 and 53.9 temperatures Q C. No coagulum obtained stable when the temperature is 55.3 Q C.
  • Example 2
  • the starting point is a sample of 9 tubes (9ml) that hermetically contain blood drawn from a patient.
  • the blood is centrifuged at a speed of 580 g, for a time of 8 minutes and at room temperature.
  • the upper fraction, or platelet-rich plasma (PRP) fraction is extracted into a white tube, obtaining a total of 36 ml of plasma.
  • the plasma is distributed into 6 tubes, each tube containing 6 ml of plasma. Thereafter, the temperature of each of the tubes 37,55, 45,95, 51, 05, 52.4, 53.9 and 55.35 Q C respectively rises.
  • the formulations in the 6 tubes are activated by adding a PRP supernatant (333mI) and 20 ml of calcium for each 1 ml of formulation, which initiates the formation of fibrin in the formulations.
  • a PRP supernatant 333mI
  • 20 ml of calcium for each 1 ml of formulation, which initiates the formation of fibrin in the formulations.
  • the starting point is a sample of 9 tubes (9ml) that hermetically contain blood drawn from a patient.
  • the tubes are centrifuged at a speed of 580 g, for a time of 8 minutes and at room temperature. As a consequence of centrifugation, the blood contained in each tube is divided into several fractions.
  • the upper fraction, or platelet-rich plasma (PRP) fraction is extracted into a white tube, obtaining a total of 36 ml of plasma.
  • the plasma is distributed into 6 tubes, each tube containing 6 ml of plasma. Samples are processed according to the following:
  • Control-activator sample PRP that is activated with PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • PRP that is centrifuged at a speed of 580 g, for a time of 8 minutes and at room temperature. 2/3 of the initial volume is removed and the platelet precipitate is resuspended in the remaining 1/3 of the initial volume. It is activated with a PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • the formulation is activated with a PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • the formulation is activated with a PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • the platelet and protein precipitate is resuspended in the total initial volume.
  • the formulation is activated with supernatant of PRP (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • - Formulation sample 4 Platelets are removed from PRP by filtration with filters with a pore size of 20 ml. The temperature of the PRP is then up to 51 Q C. then centrifuged at a speed of 580 g for 8 minutes and time room temperature. 2/3 of the initial volume is removed and the platelet and protein precipitate is resuspended in the remaining 1/3 of the initial volume. The formulation is activated with a PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • the results of the clotting time in Figure 3 indicate that: the use of the activator thrombin (PRP supernatant) + calcium, used in the control-activator, control-method and formulations 1 -4, accelerates the coagulation of PRP with respect to the use only calcium ions (control sample). Also, a second centrifugation of the PRP before activation (control-method and formulations 1-4) accelerates coagulation even more, possibly due to the increase in platelet concentration by removing part of the initial volume. However, the method according to the invention accelerates coagulation independently of the platelet concentration as shown by the results of formulation 3 (without increase in platelet concentration) and formulation 4 (without platelets). The shorter clotting times were those corresponding to formulations 1 and 2. Thus, the clotting time indicates the novelty and effectiveness of the method of the invention to accelerate the clotting process.
  • the starting point is a sample of 9 tubes (9ml) that hermetically contain blood drawn from a patient.
  • the tubes are centrifuged at a speed of 580 g, for a time of 8 minutes and at room temperature. As a consequence of centrifugation, the blood contained in each tube is divided into several fractions.
  • the upper fraction, or platelet-rich plasma (PRP) fraction is extracted into a white tube, obtaining a total of 36 ml of plasma.
  • the plasma is distributed into 6 tubes, each tube containing 6 ml of plasma. Samples are processed according to the following:
  • Control-activator sample PRP that is activated with PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • PRP that is centrifuged at a speed of 580 g, for a time of 8 minutes and at room temperature. 2/3 of the initial volume is removed and the platelet precipitate is resuspended in the remaining 1/3 of the initial volume. It is activated with a PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • the formulation is activated with a PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • the platelet and protein precipitate is resuspended in the total initial volume.
  • the formulation is activated with supernatant of PRP (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • - Formulation sample 4 Platelets are removed from PRP by filtration with filters with a pore size of 20 ml. The temperature of the PRP is then up to 51 Q C. then centrifuged at a speed of 580 g for 8 minutes and time room temperature. 2/3 of the initial volume is removed and the platelet and protein precipitate is resuspended in the remaining 1/3 of the initial volume. The formulation is activated with a PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • the starting point is a sample of 8 tubes (9ml) that hermetically contain blood drawn from a patient.
  • the tubes are centrifuged at a speed of 580 g, for a time of 8 minutes and room temperature.
  • the upper fraction, or platelet-rich plasma (PRP) fraction is extracted into a white tube, obtaining a total of 30 ml of plasma.
  • the plasma is distributed into 5 tubes, each tube containing 6 ml of plasma. Samples are processed according to the following:
  • Control-activator sample PRP that is activated with PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • the formulation is activated with a PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • the formulation is activated with the following activator / formulation volume ratios:
  • Tisseel® Sample A commercial Tisseel® adhesive and sealant (Baxter S. L., Valencia, Spain) has been purchased and used according to the manufacturer's instructions.
  • the starting point is a sample of 7 tubes (9ml) that hermetically contain blood drawn from a patient.
  • the tubes are centrifuged at a speed of 580 g, for a time of 8 minutes and at room temperature.
  • the blood contained in each tube is divided into several fractions.
  • the upper fraction, or platelet-rich plasma (PRP) fraction is extracted into a blank tube, obtaining a total of 24 ml of plasma.
  • the plasma is divided into 4 tubes, each tube containing 6 ml of plasma. Samples are processed according to the following:
  • Control-activator sample PRP that is activated with PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • the formulation is activated with a PRP supernatant (333 ml) and 20 ml of 10% calcium chloride for each 1 ml of PRP.
  • Tisseel® Sample A commercial Tisseel® adhesive and sealant (Baxter S. L, Valencia, Spain) has been purchased and used according to the manufacturer's instructions.
  • Biological samples of pig skin have been prepared. The skin samples have been glued to a support using a universal adhesive. Then two skin specimens have been glued with the samples described above. The adhesion strength of the formulation was then measured using gram weights and hanging them on the support of a skin specimen.
  • Figure 6 shows the novelty and effectiveness of the invention in improving adhesion strength and that adhesion capacity can be further increased by optimizing the volume of activator added (Formulation 2B).
  • the results also indicate that the adhesion force of the formulation according to the present invention (Formulation 2 B) is comparable with the adhesion force of the commercial sealant of the Tisseel® brand.

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Abstract

Formulación o adhesivo tisular obtenido de una composición sanguínea rica en plaquetas y/o factores de crecimiento, y método de preparación de dicho adhesivo. El método de preparación del adhesivo comprende los pasos de subir la temperatura de la composición sanguínea inicial y posteriormente activar la composición. Entre otras ventajas, el adhesivo tisular es biocompatible y biodegradable, presenta propiedades biológicas o médicas deseables proporcionadas por la presencia de plaquetas o factores de crecimiento, y además presenta una elevada adhesividad y un acelerado proceso de coagulación.

Description

FORMULACIÓN O ADHESIVO TISULAR OBTENIDA DE UNA COMPOSICIÓN SANGUÍNEA QUE CONTIENE PLAQUETAS. Y
MÉTODO DE PREPARACIÓN DE DICHA FORMULACIÓN
DESCRIPCIÓN
Sector de la técnica
La invención se refiere a una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, obtenida de una composición sanguínea inicial que contiene plaquetas. La invención se refiere asimismo a un método de preparación de dicha formulación. La formulación sirve como adhesivo tisular.
Estado de la técnica
En el estado de la técnica se conoce la preparación de composiciones a partir de la sangre humana o animal, donde la sangre es procesada de manera que se obtiene un plasma rico en plaquetas (PRP) y/o un plasma rico en factores de crecimiento que presentan útiles propiedades biológicas y médicas. Dichos PRP o plasma rico en factores de crecimiento vienen siendo utilizados con éxito en aplicaciones ex vivo, por ejemplo como medio de cultivo celular, e in vivo, por ejemplo para realizar un proceso de regeneración ósea en un paciente o para tratar a un paciente de una dolencia articular mediante infiltraciones. En el caso de composiciones destinadas a aplicaciones in vivo, la tecnología de preparación de formulaciones PRP y plasma rico en factores de crecimiento ha ido evolucionando hacia la preparación de composiciones autólogas, es decir, obtenidas de la sangre del propio paciente. Ejemplos de este tipo de composiciones y métodos de preparación pueden encontrarse en las patentes US6569204 y ES2221770.
Se conocen asimismo composiciones consistentes en una fibrina rica en plaquetas (PRF), obtenida a partir de la sangre. Al igual que los plasmas citados anteriormente, la fibrina puede ser autóloga o heteróloga. Al contrario que el plasma, que es líquido, la fibrina presenta una consistencia sólida o semisólida.
Un ejemplo de fibrina es el conocido como gel de fibrina o malla de fibrina, que es una formulación cuya consistencia semisólida resulta muy conveniente para ciertas aplicaciones. El procedimiento de preparación del gel o malla de fibrina generalmente comienza con una primera fase en la cual se obtiene un PRP o un plasma rico en factores de crecimiento por un método aplicable, por ejemplo centrifugando sangre extraída de un paciente hasta que la sangre se separa en varias fracciones, y extrayendo la fracción superior, es decir la fracción de plasma rico en plaquetas (PRP) o plasma rico en factores de crecimiento. Posteriormente, se realiza la activación de las plaquetas contenidas en el PRP o plasma rico en factores de crecimiento (entendiéndose por activación la acción de provocar que las plaquetas liberen ciertos factores de crecimiento contenidos en su interior) por ejemplo mediante la adición de cloruro cálcico. Como consecuencia de la activación, y si se espera un tiempo suficiente, se produce la eventual polimerización de fibrina a partir del fibrinógeno contenido en el plasma, obteniéndose un compuesto final que es un coágulo de fibrina (también denominado gel o malla de fibrina por su consistencia semisólida, como una especie de esponja biológica). Este procedimiento es el que suele realizarse para obtener un gel de fibrina a partir de una sangre modificada con un anticoagulante, como por ejemplo con citrato sódico. Pero también se puede procesar la sangre sin mezclar ésta previamente con anticoagulante; en este caso, al centrifugar la sangre se consigue tanto separar el plasma de los glóbulos rojos como, al mismo tiempo, obtenerse el gel de fibrina sin necesidad de añadir cloruro cálcico u otro activador de las plaquetas. Algunos ejemplos de aplicación del gel o malla de fibrina son: formar un andamiaje biológico para rellenar defectos óseos; ser aplicado sobre heridas o lesiones para la liberación progresiva de los factores de crecimiento; ser empleado como matriz para el cultivo de células madre; ser empleado como una membrana para poder cerrar defectos o úlceras; ser empleado en la fabricación de tejidos, lo que se conoce como ingeniería de tejidos, donde además de células y factores de crecimiento es de especial importancia contar con una matriz o andamiaje donde las células puedan crecer. Sin embargo, los preparados ricos en plaquetas (PRP, plasma rico en factores de crecimiento, PRF) tienen una capacidad limitada como adhesivo tisular. La importancia de poseer una propiedad adhesiva adecuada se destaca en que las heridas quirúrgicas y crónicas representan una carga socioeconómica a nivel mundial, a menudo subestimada, tanto para los pacientes como para los sistemas de salud. Una de las principales preocupaciones que nos encontramos a este nivel son las profusas y continuas hemorragias que puedan producirse durante una cirugía o en una herida crónica, y las molestias postoperatorias y complicaciones derivadas de las suturas quirúrgicas, como pueden ser los abscesos de sutura, la formación de granulomas o la necrosis tisular. A lo largo de los años, ha surgido una amplia gama de modalidades de tratamiento en el mundo de la cirugía con el objetivo de reducir dichas complicaciones, entre dichos tratamientos se encuentra el uso del pegamento/sellante de fibrina.
Los sellantes de fibrina alogénicos comerciales representan una alternativa no invasiva muy adecuada. Sin embrago, aunque funcionan de manera eficiente, su coste es elevado y podrían no estar disponibles en cada país o región. Además, debido a que el sellante de fibrina alogénico comercial se obtiene de plasma humano, existe un riesgo de transmisión de ciertas enfermedades y de que se produzcan reacciones de hipersensibilidad. La forma más segura para preparar el sellante de fibrina es obtenerlo a partir de la sangre del propio paciente. Pero, el tiempo de preparación (normalmente utilizando técnicas de congelación o liofilización) es largo, requiriéndose al menos 24 horas para el procesamiento, por lo que no se puede hacer durante la cirugía o bien requiere que el paciente venga el día anterior a la cirugía para extraerle sangre. Estas técnicas de congelación o liofilización se basan en conseguir un aumento en la concentración del fibrinógeno y sufren de unas limitaciones tales como una concentración de fibrinógeno y proteínas de la coagulación baja por lo que el tiempo de sellado es largo y muy variable debido a la variabilidad biológica que existe en cada paciente. Otras metodologías utilizadas para agilizar la preparación de un sellante de fibrina autólogo usan productos químicos para favorecer la precipitación del fibrinógeno, pero dichos productos pueden producir procesos irritativos e inflamatorios en los tejidos de aplicación. La presente invención tiene como objetivo conseguir una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, obtenida de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento, que se pueda preparar en tiempos quirúrgicos y una adhesividad tisular aumentada. Entre otras aplicaciones, se desea que la formulación sirva como alternativa al sellador de fibrina comercial.
Descripción breve de la invención
Es objeto de la invención una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, que comprende o se deriva de una composición sanguínea inicial (de origen humano o animal; autóloga, homologa u heteróloga), rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y que comprende proteínas provenientes de la propia composición sanguínea inicial, con la particularidad de que la formulación presenta una adhesividad aumentada. Esta formulación puede ser autóloga (se prepara y se aplica en el mismo donante), homologa (el donante y el receptor son de la misma especie) o heteróloga (el donante y el receptor son de diferentes especies y podría calificarse como un “sellador de fibrina” (usando una terminología análoga a la utilizada para referirse a la aplicación de preparaciones de fibrina para sellar) debido a que presenta una adhesividad aumentada y una coagulación acelerada. La composición presenta una configuración morfológica y biomecánica nueva en comparación con el resto de senadores de fibrina, composiciones sanguíneas ricas en plaquetas y/o factores de crecimiento, y similares conocidos en el estado de la técnica.
La formulación de acuerdo con la invención es biocompatible, biodegradable y presenta las propiedades biológicas o médicas deseables proporcionadas por la presencia de plaquetas o factores de crecimiento. Además, la formulación presenta una adhesividad tisular aumentada y se obtiene en tiempos cortos. La formulación según la invención es por tanto una alternativa ventajosa al sellador de fibrina convencional, debido al hecho de que la formulación es autóloga, adhesiva y se obtiene en tiempo cortos sin la adición de sustancias químicas. Además, la formulación presenta una buena adhesividad a la compresión, similar o mejor que el sellador de fibrina alogénico convencional Tisseel® y el PRP (utilizado habitualmente como sellador), y soporta adecuadamente la resistencia que le puede ejercer un tejido; por tanto, la formulación resulta muy apta para ser utilizada como sellador de fibrina. Además, es inyectable. Es también objeto de la invención un método de preparación de la formulación anterior, donde dicho método comprende los pasos de: disponer de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento cuya formulación de base puede variar; calentar la composición sanguínea para que tenga una temperatura de 40 a 55QC; centrifugar la composición sanguínea inicial durante al menos 1 minuto; reducir el volumen de la composición inicial. Este método de la invención comprende también la adición de una sustancia activadora de las plaquetas y la formación de fibrina para la obtención de una composición sanguínea rica en plaquetas y/o factores de crecimiento en forma gel.
Descripción breve de las figuras
Los detalles de la invención se aprecian en las figuras que se acompañan, no pretendiendo éstas ser limitativas del alcance de la invención:
- La Figura 1 muestra el tiempo de coagulación de diferentes ejemplos de formulaciones según la invención.
- La Figura 2 muestra la adhesividad de diferentes ejemplos de formulaciones según la invención.
- La Figura 3 muestra el efecto del activador y las plaquetas en el tiempo de coagulación de las formulaciones según la invención.
- La Figura 4 muestra el efecto del activador y las plaquetas en la adhesividad de diferentes ejemplos de formulaciones según la invención.
- La Figura 5 muestra el efecto del activador y la eficacia de diferentes ejemplos de formulaciones según la invención y en comparación con el sellador comercial Tisseel® en la adhesividad.
- La Figura 6 muestra la eficacia como adhesivo tisular de diferentes ejemplos de formulaciones según la invención en comparación con el sellador comercial Tisseel® como adhesivo tisular.
Descripción detallada de la invención
Con el fin de superar problemas aún existentes en el estado de la técnica relacionados con la adhesividad de los PRP, se propone una formulación alternativa con propiedades biológicas o médicas deseables y con una adhesividad mejorada. Dicha formulación comprende o se deriva de una composición sanguínea inicial que contiene plaquetas. Esta composición es adhesiva debido al tratamiento térmico y la formación de un coagulo de fibrina. Se ha comprobado que el sellador preparado según esta invención tiene una adhesividad tisular similar al sellador de fibrina Tisseel® y mejor que la adhesividad de un plasma rico en plaquetas o fibrina rica en plaquetas convencionales.
La composición sanguínea inicial puede ser, por ejemplo, un plasma sanguíneo rico en plaquetas, es decir, un plasma con una concentración elevada de plaquetas. Dicho plasma se ha obtenido generalmente mediante la técnica de centrifugar sangre (para separarla en una fracción de fracción de glóbulos rojos, una fracción de glóbulos blancos y una fracción de plasma rico en plaquetas (PRP)) y separar toda o parte de la fracción de plasma rico en plaquetas (PRP). La composición sanguínea inicial puede contener o no leucocitos.
Para la activación de la composición sanguínea inicial se puede utilizar uno o más de: cloruro de calcio, trombina, gluconato sódico, colágeno, sobrenadante (una sustancia líquida que aparece sobre el coágulo cuando se causa la coagulación de un plasma rico en plaquetas (PRP) y su posterior retracción), sobrenadante de un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento, o cualquier otro agente que actúe activando las plaquetas e induciendo la formación de fibrina de manera que las plaquetas han liberado de su interior ciertos factores de crecimiento.
Se propone asimismo un método de preparación de una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, donde dicho método comprende los pasos de: a) disponer de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento con o sin anticoagulante, la cual es preferentemente un plasma rico en plaquetas con o sin leucocitos, o un plasma rico en factores de crecimiento con o sin leucocitos. b) Subir la temperatura de la composición inicial a una temperatura de 40 a 55QC. c) Centrifugar la composición sanguínea inicial durante al menos 1 minuto. d) Quitar al menos parte de la fracción de plasma obtenida como consecuencia del centrifugado. e) Activar la composición sanguínea que queda tras retirar al menos parte de la fracción de plasma como se indica en el paso d). La activación puede realizarse, por ejemplo, añadiendo cloruro de calcio, trombina, una combinación de cloruro de calcio y trombina, de gluconato sódico, de colágeno, sobrenadante (una sustancial líquida que aparece sobre el coágulo cuando se causa la coagulación de un plasma rico en plaquetas (PRP) y su posterior retracción), sobrenadante de un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento y/o cualquier otro agente activador de plaquetas. Como consecuencia, se produce la activación de las plaquetas y se induce la formación de fibrina de manera que las plaquetas liberen de su interior ciertos factores de crecimiento.
El método anterior produce una precipitación de sustancias proteicas sin la desnaturalización del fibrinógeno como evidencia la obtención de un coagulo de fibrina después de la activación. Al quitar parte del volumen de la composición inicial, se incrementa la concentración de estas sustancias proteicas. De hecho, y además, el método produce una aceleración notable en la coagulación de la composición sanguínea y en su fuerza de adhesión. En resumen, como consecuencia del proceso térmico se logran nuevas formulaciones biocompatibles y biodegradables, con dos ventajas principales: un tiempo de coagulación corto y una adhesividad mayor lo que hace que esta formulación se pueda aplicar como un adhesivo o sellador de fibrina. Preferentemente, la temperatura de la composición sanguínea inicial se incrementa a una temperatura en el rango de 40 a 53QC.
La composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento puede ser de origen humano o animal. Además, puede ser autóloga (perteneciente a un paciente al cual se desea tratar posteriormente con la formulación final), homologa (perteneciente a un miembro de la misma especie que el paciente, los pacientes, las células u otra entidad biológica que vaya a ser tratada o procesada con la formulación final) o heteróloga (perteneciente a un miembro de diferente especie que el paciente, los pacientes, las células u otra entidad biológica que vaya a ser tratada o procesada con la formulación final).
La invención contempla que la composición sanguínea inicial puede incorporar opcionalmente una o más sustancias adicionales, añadidas de forma previa al tratamiento térmico reivindicado. Dichas sustancias adicionales pueden ser:
- uno o más agentes bioactivos seleccionados entre proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos, sustancias orgánicas no proteicas y sustancias inorgánicas;
- uno o más polímeros biodegradables seleccionados entre: ácido hialurónico, sales de hialuronato, chondroitín 4 sulfato, chondroitín 6 sulfato, dextrán, gel de sílice, alginato, hidroxipropilmetilcelulosa, derivados de chitín, preferiblemente chitosano, goma xanthan, agarosa; polietileno glicólicos (PEG), polihidroxietilenometacrilato (HEMA), proteínas sintéticas o naturales, colágenos;
- uno o más polímeros orgánicos seleccionados del grupo de policarpolactona, poliglicólico, poliláctico, y sus co-polímeros;
- uno o más de entre los siguientes agentes: antibióticos, antimicrobianos, anticancerígenos, analgésicos, factores de crecimiento, hormonas;
- uno o más componentes inorgánicos seleccionados del grupo de sales de calcio, sales de magnesio, y/o sales de estroncio. La invención contempla también que cualquiera de las sustancias anteriores puedan ser añadidas a la formulación después de realizado el tratamiento térmico.
La formulación según la invención contempla modos de realización diversos en los que la formulación pueda comprender, además de los aspectos técnicos reivindicados, otros compuestos, componentes, moléculas, etc. que resulten convenientes para la aplicación concreta a la que vaya a estar destinada la formulación. Además, es posible realizar pasos adicionales sobre la formulación producida según el método descrito en esta invención que incluyen desecados para aumentar su versatilidad. Es decir, antes de su activación (la activación de las plaquetas y la formación de la fibrina), la formulación de acuerdo con la invención puede ser desecada (calor seco) o liofilizada. Esta formulación puede ser posteriormente rehidrata mediante diferentes alternativas tales como añadir una solución salina, un plasma rico en plaquetas, un sobrenadante de un plasma rico en plaquetas, un plasma rico en factores de crecimiento, un sobrenadante de un plasma rico en factores de crecimiento, o cualquier otra sustancia líquida. Ejemplos
Ejemplo 1 Se parte de una muestra de 9 tubos (de 9ml) que contienen herméticamente sangre extraída de un paciente. Se centrifugan los tubos a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugación, la sangre contenida en cada tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fracción superior, o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), a un tubo blanco, obteniéndose un total de 36 mi de plasma. Se reparte el plasma en 6 tubos, conteniendo cada tubo 6 mi de plasma. Seguidamente, la temperatura cada uno de los 6 tubos se sube a 37,55, 45,95, 51 ,05, 52,4, 53,9 y 55,35QC, respectivamente. Posteriormente, se centrifugan los 6 tubos a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a temperatura ambiente, produciendo la precipitación de las plaquetas y nuevas sustancias proteicas. Para concentrar estas sustancias proteicas y después de la centrifugación del plasma calentado, se quita la mitad superior del plasma. Finalmente se resuspende el precipitado en el plasma que se ha quedado en el tubo.
Seguidamente, se activan las formulaciones de los 6 tubos añadiendo un sobrenadante de PRP (333mI) y 20 mI de calcio por cada 1 ml de formulación, lo cual inicia la formación de fibrina en las formulaciones.
Se ha medido el tiempo de coagulación (el tiempo en el que tarda la composición sanguínea en cambiar su estado de líquido a gel) debido a la formación de fibrina. La Figura 1 muestra la capacidad del método de la invención de acelerar el tiempo de coagulación. Fia de hacerse notar que el tiempo de coagulación de un PRP convencional, activado de la misma manera que las formulaciones anteriores según la invención (es decir, con sobrenadante de PRP (333mI) y 20 mI de calcio por cada 1 ml) ha sido de 4,5 minutos. Como puede observarse en la gráfica, las formulaciones según la invención presentan tiempos de coagulación inferiores o acelerados con respecto a dicho PRP convencional. Dicha aceleración de la coagulación es mayor para la temperatura de 51 ,05QC, seguida de las temperaturas de 52,4 y 53,9QC. No se ha obtenido un coagulo estable cuando la temperatura es de 55,3QC. Ejemplo 2
Se parte de una muestra de 9 tubos (de 9ml) que contienen herméticamente sangre extraída de un paciente. Se centrifuga la sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugación, la sangre contenida en cada tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fracción superior, o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), a un tubo blanco, obteniéndose un total de 36 mi de plasma. Se reparte el plasma en 6 tubos, conteniendo cada tubo 6 mi de plasma. Seguidamente, se sube la temperatura de cada uno de los tubos a 37,55, 45,95, 51 ,05, 52,4, 53,9 y 55,35QC, respectivamente. Posteriormente, se centrifuga a velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente, produciendo la precipitación de las plaquetas y nuevas sustancias proteicas. Para concentrar estas sustancias proteicas y después de la centrifugación del plasma calentado, se ha quitado la mitad superior del plasma. Finalmente se resuspende el precipitado en el plasma que se ha quedado en el tubo.
Seguidamente, se activan las formulaciones de los 6 tubos añadiendo un sobrenadante del PRP (333mI) y 20 mI de calcio por cada 1 ml de formulación, lo cual inicia la formación de fibrina en las formulaciones.
Se han pegado dos portas de cristal con la formulación después de su activado. Después de la coagulación, se han incubado las portas pegadas en agua destilada durante 3 minutos y luego se ha medido la fuerza de la adhesión de la formulación utilizando pesos en gramos. La Figura 2 muestra la fuerza de la adhesión de las formulaciones. La mayor fuerza de adhesión es la correspondiente a la temperatura de 51 ,05QC, seguida por las temperaturas de 37,55 y 45,95QC. La menor fuerza de adhesión es para la temperatura de 55,3QC, seguida por la de 53,9QC. Ejemplo 3
Se parte de una muestra de 9 tubos (de 9ml) que contienen herméticamente sangre extraída de un paciente. Se centrifugan los tubos a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugación, la sangre contenida en cada tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fracción superior, o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), a un tubo blanco, obteniéndose un total de 36 mi de plasma. Se reparte el plasma en 6 tubos, conteniendo cada tubo 6 mi de plasma. Las muestras se procesan según lo siguiente:
- Muestra control: El PRP que se activa con iones de calcio en una relación de 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 ml del
PRP.
- Muestra control-activador: PRP que se activa con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra control-método: PRP que se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 2/3 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario en el restante 1/3 del volumen inicial. Se activa con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra formulación 1 : La temperatura de PRP se sube a 51 QC.
Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 2/3 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el restante 1/3 del volumen inicial. Se activa la formulación con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra formulación 2: La temperatura de PRP se sube a 51 QC.
Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 1/2 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el restante 1/2 del volumen inicial. Se activa la formulación con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra formulación 3: La temperatura de PRP se suba a 51 QC.
Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el total del volumen inicial. Se activa la formulación con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 ml del PRP.
- Muestra formulación 4: Al PRP se le quitan las plaquetas mediante la filtración con filtros con tamaño de poro de 20 mI. Luego se sube la temperatura del PRP a 51 QC. Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 2/3 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el restante 1/3 del volumen inicial. Se activa la formulación con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
Los resultados del tiempo de coagulación en la Figura 3 indican que: el uso del activador trombina (sobrenadante del PRP) + calcio, utilizado en el control-activador, control-método y formulaciones 1 -4, acelera la coagulación del PRP con respecto al uso solo de iones de calcio (muestra control). También una segunda centrifugación del PRP antes de la activación (control-método y formulaciones 1 -4) acelera todavía más la coagulación posiblemente por el aumento en la concentración de las plaquetas al quitar parte del volumen inicial. Sin embargo, el método según la invención acelera la coagulación de manera independiente de la concentración plaquetaria tal como muestran los resultados de la formulación 3 (sin incremento en la concentración plaquetaria) y la formulación 4 (sin plaquetas). Los tiempos de coagulación menores fueron los correspondientes a la formulaciones 1 y 2. Así el tiempo de coagulación indica la novedad y la eficacia del método de la invención para acelerar el proceso de la coagulación. Ejemplo 4
Se parte de una muestra de 9 tubos (de 9ml) que contienen herméticamente sangre extraída de un paciente. Se centrifugan los tubos a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugación, la sangre contenida en cada tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fracción superior, o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), a un tubo blanco, obteniéndose un total de 36 mi de plasma. Se reparte el plasma en 6 tubos, conteniendo cada tubo 6 mi de plasma. Las muestras se procesan según lo siguiente:
- Muestra control: PRP que se activa con iones de calcio en una relación de 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra control-activador: PRP que se activa con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra control-método: PRP que se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 2/3 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario en el restante 1/3 del volumen inicial. Se activa con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra formulación 1 : La temperatura de PRP se sube a 51 QC.
Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 2/3 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el restante 1/3 del volumen inicial. Se activa la formulación con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra formulación 2: La temperatura de PRP se sube a 51 QC.
Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 1/2 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el restante 1/2 del volumen inicial. Se activa la formulación con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra formulación 3: La temperatura de PRP se sube a 51 QC.
Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el total del volumen inicial. Se activa la formulación con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 ml del PRP.
- Muestra formulación 4: Al PRP se le quitan las plaquetas mediante la filtración con filtros con tamaño de poro de 20 mI. Luego se sube la temperatura del PRP a 51 QC. Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 2/3 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el restante 1/3 del volumen inicial. Se activa la formulación con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
Se han pegado dos portas de cristal con las muestras anteriormente descritas después de su activación. Las muestras se han incubado en agua destilada y luego se ha medido la fuerza de la adhesión de la formulación utilizando pesos en gramos. La Figura 4 muestra la fuerza de la adhesión de las formulaciones. Los resultados indican claramente que la mejora en la adhesión se produce sólo en las formulaciones según la presente invención (formulaciones 1 y 2) ya que el uso de trombina + calcio (control-activador) o aumentar la concentración plaquetaria (control-método) no han mejorado la adhesión del PRP activado con iones de calcio. La mejor adhesión ha sido obtenida por las formulaciones 1 y 2 de la presente invención.
Ejemplo 5
Se parte de una muestra de 8 tubos (de 9ml) que contienen herméticamente sangre extraída de un paciente. Se centrifugan los tubos a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugación, la sangre contenida en cada tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fracción superior, o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), a un tubo blanco, obteniéndose un total de 30 mi de plasma. Se reparte el plasma en 5 tubos, conteniendo cada tubo 6 mi de plasma. Las muestras se procesan según lo siguiente:
- Muestra control-activador: PRP que se activa con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra formulación 1 : La temperatura de PRP se sube a 51 QC.
Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 2/3 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el restante 1/3 del volumen inicial. Se activa la formulación con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra formulación 2: La temperatura de PRP se sube a 51 QC.
Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita
1/2 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el restante 1/2 del volumen inicial. Se activa la formulación con las siguientes ratios de volumen activador/formulación:
1. Sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 ml del PRP (formulación 2).
2. Sobrenadante del PRP (235,8 mI) y 14,2 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP (formulación 2 A)
3. Sobrenadante del PRP (166,7 mI) y 10 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP (formulación 2 B)
- Muestra Tisseel®: Se ha adquirido y usado un adhesivo y sellador comercial Tisseel® (Baxter S. L., Valencia, España) según las instrucciones del fabricante.
Se han pegado dos portas de cristal con las muestras anteriormente descritas después de su activación. Las muestras se han incubado en agua destilada y luego se ha medido la fuerza de la adhesión de la formulación utilizando pesos en gramos. La Figura 5 muestra la fuerza de la adhesión de las formulaciones según la presente invención se pueden mejorar también mediante la optimización del volumen de activador añadido (Formulación 2 B). Los resultados también que la fuerza de adhesión de la formulación según la invención (Formulación 2 B) es comparable con el sellador comercial de la marca Tisseel®. Ejemplo 6
Se parte de una muestra de 7 tubos (de 9ml) que contienen herméticamente sangre extraída de un paciente. Se centrifugan los tubos a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugación, la sangre contenida en cada tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fracción superior, o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), a un tubo blanco, obteniéndose un total de 24 mi de plasma. Se reparte el plasma en 4tubos, conteniendo cada tubo 6 mi de plasma. Las muestras se procesan según lo siguiente:
- Muestra control-activador: PRP que se activa con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra formulación 1 : La temperatura de PRP se sube a 51 QC.
Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 2/3 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el restante 1/3 del volumen inicial. Se activa la formulación con sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 mi del PRP.
- Muestra formulación 2: La temperatura de PRP se sube a 51 QC.
Posteriormente, se centrifuga a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Se quita 1/2 del volumen inicial y se resuspende el precipitado plaquetario y proteico en el restante 1/2 del volumen inicial. Se activa la formulación con las siguientes ratios de volumen activador/formulación:
1. Sobrenadante del PRP (333 mI) y 20 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 ml del PRP (formulación 2).
2. Sobrenadante del PRP (166,7 mI) y 10 mI de 10% cloruro cálcico por cada 1 ml del PRP (formulación 2 B)
- Muestra Tisseel®: Se ha adquirido y usado un adhesivo y sellador comercial Tisseel® (Baxter S. L, Valencia, España) según las instrucciones del fabricante.
Se han preparado muestras biológicas de piel de cerdo. Las muestras de piel se han pegado a un soporte mediante un adhesivo universal. Luego se han pegado dos especímenes de piel con las muestras anteriormente descritas. Luego se ha medido la fuerza de la adhesión de la formulación utilizando pesos en gramos y colgándolos en el soporte de un espécimen de piel. La Figura 6 muestra la novedad y la eficacia de la invención en mejorar la fuerza de la adhesión y que la capacidad de adhesión se puede incrementar aún más mediante la optimización del volumen de activador añadido (Formulación 2 B). Los resultados también indican que la fuerza de adhesión de la formulación según la presente invención (Formulación 2 B) es comparable con la fuerza de adhesión del sellador comercial de la marca Tisseel®.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de preparación de una formulación adhesiva a partir de una composición sanguínea inicial, que se caracteriza por que comprende los pasos de: a) obtener una composición sanguínea inicial, de origen humano o animal, que contiene plaquetas;
b) subir la temperatura de la composición sanguínea inicial a una temperatura de 40 a 55QC; y
c) activar las plaquetas y formar una formulación que contiene fibrina.
2. Método según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial es un plasma sanguíneo rico en plaquetas.
3. Método según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial es un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento liberados.
4. Método según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que en el paso b) se sube la temperatura de la composición sanguínea inicial a una temperatura de 40 a 53QC.
5. Método según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que comprende un paso adicional de centrifugar la composición sanguínea después del paso b).
6. Método según la reivindicación 5, que se caracteriza por que comprende un paso adicional de quitar parte del volumen de la composición inicial después del paso b).
7. Método según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que el paso de activar las plaquetas comprende añadir al menos uno de: cloruro de calcio, trombina, gluconato sódico, colágeno, sobrenadante de plasma sanguíneo, y sobrenadante de plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento.
8. Método según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la formulación comprende uno o más agentes bioactivos seleccionados entre proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos, sustancias orgánicas no proteicas y sustancias inorgánicas.
9. Método según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la formulación comprende uno o más polímeros biodegradables seleccionados entre: ácido hialurónico, sales de hialuronato, chondroitín 4 sulfato, chondroitín 6 sulfato, dextrán, gel de sílice, alginato, hidroxipropilmetilcelulosa, derivados de chitín, preferiblemente chitosano, goma xanthan, agarosa; polietileno glicólicos (PEG), polihidroxietilenometacrilato (HEMA), proteínas sintéticas o naturales, colágenos.
10. Método según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la formulación comprende uno o más polímeros orgánicos seleccionados del grupo de policarpolactona, poliglicólico, poliláctico, y sus co-polímeros.
11. Método según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la formulación comprende uno o más de entre los siguientes agentes: antibióticos, antimicrobianos, anticancerígenos, analgésicos, factores de crecimiento, hormonas.
12. Método según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la formulación comprende uno o más componentes inorgánicos seleccionados del grupo de sales de calcio, sales de magnesio, y/o sales de estroncio.
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