ES2846923T3 - Composición para regenerar tejido óseo, procedimiento de preparación y uso de la misma - Google Patents

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Abstract

Composición para regenerar tejido óseo, caracterizada por que comprende una o más células mesenquimales de cordón umbilical con potencial osteogénico, partículas óseas y un hidrogel de fibrinógeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para regenerar tejido óseo, procedimiento de preparación y uso de la misma
La presente invención se refiere al sector de la ingeniería tisular. En particular, se refiere a una composición para regenerar tejido óseo que comprende células mesenquimales con potencial osteogénico derivadas de la gelatina de Wharton del cordón umbilical, partículas óseas y un hidrogel de fibrinógeno, al procedimiento de preparación y al uso de la misma.
La confluencia de la terapia celular con la ingeniería de tejidos posibilita el desarrollo de nuevas herramientas basadas en la combinación de tres componentes fundamentales: 1) células; 2) matrices; y 3) señales (Daar AS y Greenwood HL. “A proposed definition of regenerative medicine”. J Tissue Eng Regen Med, 2007;1(3):179-84). La ingeniería de tejidos ofrece a traumatólogos y cirujanos ortopédicos posibles soluciones en casos en los que sea necesario aplicar un medicamento con potencial osteogénico en formato hidrogel que adapte su forma a la arquitectura tridimensional del foco de fractura o defecto óseo a tratar. En la actualidad, el trasplante de tejido óseo autólogo y el heterólogo, así como la utilización de implantes en base a diversos tipos de biomateriales representan las aproximaciones más comunes. De éstas, el autoinjerto de hueso, principalmente obtenido de la cresta ilíaca, es el tratamiento preferido para una amplia variedad de condiciones ortopédicas, que incluye la consolidación de fracturas complejas o los defectos de unión.
La utilización de tejido autólogo como vector de la regeneración ósea cumple con tres requisitos básicos clave: 1) introduce células con potencial osteogénico, 2) ofrece un apoyo estructural, y 3) aporta factores de crecimiento que promueven la vascularización y la osteoinducción. A pesar de los beneficios, desde un punto de vista exclusivamente mecanístico, la utilización de autoinjertos presenta importantes inconvenientes en la práctica clínica. En primer lugar, raramente se consigue la sustitución completa del tejido óseo dañado mediante el uso de autoinjertos. Esta circunstancia puede llevar a la rotura del injerto a largo plazo (Wheeler DL y Enneking WF. “Allograft bone decreases in strength in vivo over time”. Clin Orthop Relat Res, 2005;(435):36-42). Por otro lado, la obtención quirúrgica del hueso autólogo no está exenta de riesgos para el paciente y tiene asociada una elevada morbilidad (Chou LB y otros. “Stress fracture as a complication of autogenous bone graft harvest from the distal tibia”. Foot Ankle Int, 2007;28(2):199-201). En este sentido, la utilización de hueso humano procedente de bancos de tejidos soluciona el problema de la morbilidad asociada a los autoinjertos pero carece de los beneficios asociados a la actividad regeneradora aportada por el componente celular, que ha demostrado ser un factor clave tras su uso en modelos animales y en casos clínicos (Caminal M, y otros. “A reproducible method for the isolation and expansion of ovine mesenchymal stromal cells from bone marrow for use in regenerative medicine preclinical studies”. J Tissue Eng Regen Med, 2016). De hecho, el autoinjerto se utiliza predominantemente para el tratamiento de lesiones óseas importantes incluso cuando se dispone de tejido óseo de banco, siempre que éste no esté contraindicado. Desafortunadamente, esta opción no es válida en pacientes reincidentes y, como se ha comentado anteriormente, no está exenta de riesgos debido al propio proceso de extracción del tejido. El documento de patente EP 2361971 A1, da a conocer un procedimiento de preparación de un producto de ingeniería tisular para la regeneración de tejidos óseos. La invención está relacionada con un producto que comprende mayoritariamente células mesenquimales expandidas de origen óseo inmovilizadas con soportes óseos combinadas con geles de fibrina. Como respuesta a esta problemática, la presente invención da a conocer una composición para ingeniería tisular cuya utilización resulta en una nueva herramienta terapéutica a disposición de traumatólogos y cirujanos ortopédicos. La eficacia del uso de la composición obtenida mediante el procedimiento que da a conocer la presente invención se fundamenta en la utilización de células con potencial osteogénico combinadas con partículas óseas y embebidas en un hidrogel y, a su vez, permite inducir la regeneración de tejido óseo dañado adaptándose a la variada arquitectura de los defectos.
Tanto los geles de fibrina como las partículas óseas de banco de tejidos utilizadas en la presente invención muestran características que resultan clave para realizar tanto la función de soporte a la reconstrucción del tejido diana así como el aporte de una textura gelatinosa que permite la localización espacial del componente celular con potencial osteogénico y su adaptación a la morfología del foco de fractura. Además de ser biocompatibles y reabsorbibles, los componentes no celulares utilizados generan un entorno biológico que garantiza el aporte de nutrientes a las células y aseguran que éstas puedan realizar su función regeneradora. Además, las partículas óseas poseen capacidad osteoinductora y osteoconductora.
La fibrina es un producto disponible comercialmente (por ejemplo Tisseel/Tissucol de Baxter) o que puede incluso fabricarse in situ (por ejemplo mediante el uso del sistema Cryoseal de Thermogenesis), para su uso como adhesivo biológico alogénico o autólogo, respectivamente, y que, típicamente, se presenta en una formulación de dos componentes consistentes en: 1) fibrinógeno concentrado o purificado, que es una glicoproteína precursora de la fibrina, y 2) Factor XIII, trombina y calcio, utilizados para iniciar la reacción de polimerización (Buchta C, y otros. “Fibrin sealant produced by the CryoSeal FS System: product chemistry, material properties and possible preparation in the autologous preoperative setting”. Vox Sang, 2004;86(4):257-62). El adhesivo de fibrina es un producto muy conocido en el campo de la cirugía ya desde la década de los 90 (Carless PA, y otros. “Systematic review of the use of fibrin sealant to minimize perioperative allogeneic blood transfusion”. Br J Surg, 2002;89(6):695-703), debido a las ventajas que ofrece en cuanto a la rápida hemostasia (Mankad PS y Codispoti M. “The role of fibrin sealants in hemostasis”. Am J Surg, 2001;182:21S-8S), aceleración de la reparación de heridas (Amrani DL y otros. “Wound healing. Role of commercial fibrin sealants”. Ann N Y Acad Sci, 2001 ;936:566-79), reducción de pérdida de sangre (Carless PA, y otros. “Systematic review of the use of fibrin sealant to minimize perioperative allogeneic blood transfusion”. Br J Surg, 2002;89(6):695-703), protección frente a infecciones bacterianas (Currie LJ, y otros. “The use of fibrin glue in skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review”. Plast Reconstr Surg, 2001;108(6):1713-26) y su adaptación tridimensional a la arquitectura de la zona de aplicación (Caminal M, y otros. “A reproducible method for the isolation and expansion of ovine mesenchymal stromal cells from bone marrow for use in regenerative medicine preclinical studies”. J Tissue Eng Regen Med, 2016). Dado que la fibrina humana presenta una elevada biocompatibilidad y biodegradabilidad, ésta se presenta como posible vehículo de ingredientes bioactivos en estrategias de ingeniería de tejidos. En la presente invención se ha comprobado que células con potencial osteogénico mantienen sus características cuando son combinadas con fibrinógeno y, por tanto, la compatibilidad de fibrina y células con potencial osteogénico es de utilidad para facilitar la implantación de estas últimas específicamente en los focos de defectos óseos para la generación in situ de tejido nuevo, ya sea bien por diferenciación directa de las células aportadas con potencial osteogénico, bien como resultado de la actividad paracrina de las células que ejercen un efecto “llamada” o señalización a nivel local y sistémico (Liu G, y otros. “In vitro and in vivo evaluation of osteogenesis of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells on partially demineralized bone matrix”. Tissue Eng Part A, 2010;16(3):971-82) o como resultado de la suma de ambos mecanismos.
En la presente invención, los términos “partículas óseas” o “matriz ósea” significan lo mismo y se refieren a una composición que proporciona las características y propiedades específicas al hueso.
En la presente invención, el término “hueso inyectable” se refiere a la mezcla de células mesenquimales con potencial osteogénico, partículas óseas y un hidrogel de fibrinógeno que en combinación con trombina coagula, adaptándose a la arquitectura del defecto óseo a tratar.
En la presente invención, los términos “hidrogel” o “gel” significan lo mismo y se refieren a una red tridimensional de cadenas flexibles, constituida por unos elementos conectados de una determinada manera e hinchada por un líquido.
La presente invención da a conocer una composición para regenerar tejido óseo que comprende una o más células mesenquimales de cordón umbilical con potencial osteogénico, partículas óseas y un hidrogel de fibrinógeno. Más particularmente, el hidrogel de fibrinógeno se presenta en forma de hidrogel inyectable. El aporte de células con potencial osteogénico se obtiene tras expansión y/o inducción (o “priming”) hacia diferenciación osteogénica mediante cultivo en condiciones osteoinductoras de células mesenquimales derivadas de la gelatina de Wharton del cordón umbilical.
Preferentemente, dicho hidrogel es un hidrogel de fibrinógeno o bien, tras el contacto del fibrinógeno con trombina, es de fibrina.
Preferentemente, dichas partículas óseas son hueso desantigenizado o hueso desantigenizado/desmineralizado. En una realización, el tamaño de la lesión a tratar determinará el volumen final de hueso inyectable y por la tanto la cantidad de células mesenquimales de cordón umbilical con potencial osteogénico y partículas óseas requeridas para una adecuada regeneración ósea. Preferentemente, las células mesenquimales de cordón umbilical con potencial osteogénico resuspendidas en solución salina y el hidrogel de fibrinógeno están presentes en una proporción 1:1 (v/v). Por otra parte, preferentemente las partículas óseas están presentes en la composición de la presente invención en una concentración de al menos el 3,5% (v/v).
En una realización preferente, el número total de células mesenquimales de cordón umbilical por volumen de la composición está comprendido entre 1 y 1x109 células/mL. Preferentemente, el número total de células mesenquimales de cordón umbilical por volumen de la composición está comprendido entre 1x102 y 1x109 células/mL.
Por otra parte, la presente invención da a conocer un procedimiento para la preparación de una composición para regenerar tejido óseo tal como se menciona anteriormente, caracterizado por que comprende las etapas de: a) Obtener células con potencial osteogénico a partir de células mesenquimales de cordón umbilical b) Mezclar una o más células obtenidas en a) y partículas óseas en un hidrogel de fibrinógeno.
Preferentemente, dicho hidrogel es un hidrogel de fibrinógeno o bien, tras el contacto del fibrinógeno con trombina, es de fibrina.
Preferentemente, dichas partículas óseas son hueso desantigenizado o hueso desantigenizado/desmineralizado.
En dicho procedimiento, preferentemente, las células mesenquimales de cordón umbilical con potencial osteogénico resuspendidas en solución salina y el hidrogel de fibrinógeno están presentes en una proporción 1:1 (v/v). Por otra parte, preferentemente las partículas óseas están presentes en la composición de la presente invención en una concentración de al menos el 3,5% (v/v).
En una realización preferente, el número total de células mesenquimales de cordón umbilical por volumen de la composición está comprendido entre 1 y 1x109 células/mL. Preferentemente, el número total de células mesenquimales de cordón umbilical por volumen de la composición está comprendido entre 1x102 y 1x109 células/mL.
En otra realización, este hidrogel osteogénico, que denominamos “hueso inyectable”, puede ser utilizado directamente, sin mezclar con trombina, para regenerar defectos óseos dado que su naturaleza hidrogel permitirá que se distribuya tomando la forma de la cavidad del defecto y la coagulación se producirá in situ por la trombina presente por el sangrado en la zona de la lesión.
Opcionalmente, podrá utilizarse trombina diluida 1:100 (v/v) o trombina juntamente con una solución salina que contenga calcio en solución salina fisiológica para activar la coagulación del fibrinógeno ex vivo, en una proporción de “hueso inyectable”: trombina al 10:3 (v/v).
Por otra parte, la presente invención da a conocer el uso de la composición anterior para el tratamiento de la inducción de la regeneración de tejido óseo. En este caso, dicha composición debe administrarse antes de 5-6 minutos en el foco de la fractura hasta el momento en que se haya formado el coágulo en su totalidad y la combinación de células con potencial osteogénico, matrices óseas y fibrina haya perdido su textura de hidrogel fluido y se convierta en un coágulo gelatinoso.
A continuación, se describen realizaciones preferentes ejemplares de la presente invención en detalle en referencia de las figuras que se acompañan.
La figura 1 es un diagrama del procedimiento de la presente invención.
La figura 2 es una ilustración de la composición de la presente invención tras adaptarse a la forma de una jeringa. Dicha jeringa es cortada por la punta para facilitar la entrada del hidrogel de fibrinógeno, primero, y la salida del constructo cilíndrico gelificado, al final del proceso.
En una primera realización, tal como se observa en la figura 1, el procedimiento comprende una primera etapa de obtención de un hidrogel osteogénico -1-. Dicho hidrogel osteogénico -1-, que denominamos hueso inyectable, contiene células -2-, matriz ósea -3- y fibrinógeno -4-. Posteriormente, en una segunda etapa, se mezcla dicho hidrogel osteogénico con trombina -5- formando un cóagulo adaptado a la forma del defecto -6- que comprende las células anteriormente citadas -2-, la matriz ósea citada -3- y fibrina -7-.
La figura 2 muestra el aspecto cilíndrico del producto hueso inyectable adaptado a la forma de una jeringa de 1 mL -8- tras mezclar células mesenquimales expandidas a partir de la gelatina de Wharton de cordón umbilical, fibrinógeno comercial, hueso cadavérico particulado descelularizado y desantigenizado y trombina comercial. Tras 5 minutos de realizar la mezcla, está fue aspirada en una jeringa -9- y se observó como la mezcla gelatinosa cuajaba, adaptándose perfectamente a la arquitectura cilíndrica de la citada jeringa -9-. Dicha jeringa -9- y el producto de hueso inyectable -8- se colocaron usando como base una placa de Petri -10-.
A continuación, la presente invención se ilustra mediante Ejemplos, que no constituyen una limitación de la misma.
EJEMPLOS EJEMPLO 1: Procedimiento utilizando células mesenquimales derivadas de la gelatina de Wharton del cordón umbilical.
En este caso se utilizaron células mesenquimales expandidas a partir de la gelatina de Wharton de cordón umbilical obtenidas mediante un proceso validado acorde a las Normas de Correcta Fabricación. El cordón umbilical fue disgregado y cultivado in vitro, permitiendo así la expansión de la población de MSC. Éstas se mantuvieron en cultivo hasta alcanzar el número necesario de células para elaborar los constructos. En este caso se utilizó fibrinógeno crioprecipitado mediante el sistema Cryoseal® FS System y trombina comercial (Tissucol Duo, Baxter). Se obtuvo un sedimento celular que fue resuspendido en un volumen de solución salina al 2 % (p/v) albúmina sérica humana (Albutein®, Grifols) y se añadió el mismo volumen de fibrinógeno crioprecipitado mediante el sistema Cryoseal® FS System. Esta mezcla se combinó con hueso cadavérico particulado descelularizado y desantigenizado obtenido de banco de tejidos (partículas con diámetro comprendido en el rango 0.25-1mm) y trombina comercial (Tissucol Duo, Baxter) diluida 1:100 en solución salina, tal como se observa en la figura 1. Durante los primeros 5 minutos tras realizar la mezcla, ésta fue aspirada con una jeringa de 1 mL a la cual se le había recortado previamente la punta, con la intención de simular un defecto óseo cilíndrico.
En estas condiciones, se observó como la mezcla gelatinosa cuajaba minutos después, adaptándose perfectamente a la arquitectura cilíndrica de la jeringa, tal como se observa en la figura 2. La dosis celular aplicada fue de 60x106 MSC/cm3 (4,3x106 MSC/mL) de hueso.
Estos cilindros se cortaron de manera que se obtuvieron constructos de 0,2 cm3 totales para la posterior verificación de la capacidad osteogénica y angiogénica de los constructos in vivo mediante la utilización de un modelo de ratón atímico que acepta la implantación heteróloga de material biológico. Los constructos se implantaron de manera subcutánea entre las escápulas de los animales.
EJEMPLO 2: Procedimiento utilizando células mesenquimales derivadas de la gelatina de Wharton para demostrar la retención del potencial osteogénico y viabilidad celular (sin el componente Trombina).
En este ejemplo, se estudió el impacto in vitro tanto de la fibrina como del componente fibrinógeno sobre la viabilidad y la retención del potencial osteogénico de las células mesenquimales derivadas a partir de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano. Se evaluó el componente fibrinógeno únicamente, tanto comercial (Tissucol Duo, Baxter) como producido in situ con el sistema Cryoseal® FS System (Thermogenesis). Se siguió una estrategia basada en el recubrimiento de la superficie de plástico de cultivo con fibrinógeno, respectivamente, para luego proceder a la siembra con células mesenquimales.
Sorprendentemente ambas fibrinas mantienen las células vivas y metabólicamente activas, y además el componente fibrinógeno no afecta a la capacidad de diferenciación osteogénica de las células mesenquimales. Las técnicas utilizadas en el presente ejemplo fueron 1) la medición del ATP intracelular como medida indirecta del estado metabólico celular y 2) realización de tinciones cualitativas especificas para marcadores de tejido óseo como son la encima Alcalino Fosfatasa y deposiciones de calcio (tinción mediante reactivo Alizarin Red) después de un proceso de inducción de la diferenciación osteogénica de las células mesenquimales derivadas de gelatina de Wharton.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Composición para regenerar tejido óseo, caracterizada por que comprende una o más células mesenquimales de cordón umbilical con potencial osteogénico, partículas óseas y un hidrogel de fibrinógeno.
2. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por que dicho hidrogel es de fibrinógeno o bien, tras el contacto del fibrinógeno con trombina, es de fibrina.
3. Composición, según la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que las partículas óseas son hueso desantigenizado o desantigenizado/desmineralizado.
4. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que las células mesenquimales de cordón umbilical con potencial osteogénico resuspendidas en solución salina y el hidrogel de fibrinógeno están presentes en una proporción 1:1 (v/v).
5. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que las partículas óseas están presentes en la composición de la presente invención en una concentración de al menos el 3,5% (v/v).
6. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que el número total de células mesenquimales de cordón umbilical por volumen de la composición está comprendido entre 1x102 y 1x109 células/mL.
7. Procedimiento para la preparación de una composición para regenerar tejido óseo, según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que comprende las etapas de:
a) Obtener células con potencial osteogénico a partir de células mesenquimales de cordón umbilical.
b) Mezclar una o más células obtenidas en a) en fibrinógeno y partículas óseas.
8. Procedimiento, según la reivindicación 7, caracterizado por que además comprende la etapa de poner en contacto la mezcla obtenida en b) con trombina, dando lugar a fibrina.
9. Procedimiento, según la reivindicación 7, caracterizado por que además comprende la etapa de poner en contacto la mezcla obtenida en b) con trombina y una solución salina que contenga calcio.
10. Procedimiento, según las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado por que dicho hidrogel es de fibrinógeno o bien, tras la mezcla de fibrinógeno con trombina, es de fibrina.
11. Procedimiento, según las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado por que las partículas óseas son hueso desantigenizado o desantigenizado/desmineralizado.
12. Procedimiento, según las reivindicaciones 7 a 11, caracterizado por que el número total de células mesenquimales de cordón umbilical por volumen de la composición está comprendido entre 1x102 y 1x109 células/mL.
13. Procedimiento, según las reivindicaciones 7 a 12, caracterizado por que las células mesenquimales de cordón umbilical con potencial osteogénico resuspendidas en solución salina y el hidrogel de fibrinógeno están presentes en una proporción 1:1 (v/v).
14. Procedimiento, según las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado por que las partículas óseas están presentes en la composición de la presente invención en una concentración de al menos el 3,5% (v/v).
15. Composición, según las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en el tratamiento de la inducción de la regeneración de tejido óseo.
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