WO2020138256A1 - Ｔ細胞受容体の改変体 - Google Patents

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WO2020138256A1
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cell
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新 金子
義明 葛西
哲 林
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国立大学法人京都大学
武田薬品工業株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a modified T cell receptor and cells expressing the modified body.
  • T cells play a central role in the immune system against foreign pathogens such as bacteria and viruses and abnormal cells such as cancer cells.
  • CTL cytotoxic T cells
  • TCR T cell receptor
  • T cells play a central role in the immune system
  • cells derived from patients or allogeneic cells having the same or substantially the same HLA genotype are treated with antigen peptides derived from viruses or tumors.
  • Development of T cell therapy which is an approach of artificially producing a large amount of cancer antigen-specific T cells in vitro by introducing a TCR gene that recognizes, a chimeric antigen receptor (CAR), etc.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the T cell that has undergone gene transfer has an endogenous TCR, and the endogenous TCR and the introduced TCR compete with each other to bind to the CD3 molecule required for cell surface expression of TCR. This causes a problem that the expression of the introduced TCR is inhibited.
  • Non-Patent Document 2 a mismatch between the introduced TCR chain and the endogenous TCR chain can be suppressed by introducing cysteine into the constant regions of the ⁇ chain and ⁇ chain of the TCR to be introduced.
  • Non-Patent Document 2 mainly focus on preventing the mismatch between the introduced TCR chain and the endogenous TCR chain, and alloreactivity (Alloreactivity) of the endogenous TCR chain is described. Disclosure and even suggestion of variants of TCR that have not been validated and do not have any complementarity determining regions (CDRs) of the TCR ⁇ and ⁇ chains that are important for recognition of the antigen-HLA complex Absent.
  • CDRs complementarity determining regions
  • T cell receptor variant which does not have the complementarity determining regions (CDRs) of the T cell receptor (TCR) ⁇ chain and ⁇ chain.
  • Another object of the present invention is to provide a T cell that expresses the variant and is suppressed in alloreactivity.
  • TCR T cell receptor
  • modification of T cell receptor not containing CDR of TCR ⁇ chain and ⁇ chain It was surprisingly found that in cells into which the body is introduced, alloreactivity, which is considered to be caused by the endogenous TCR, is suppressed. It was also found that a modified TCR having a combination of different TCR chains, that is, a modified TCR having a constant region of ⁇ TCR and a CDR of ⁇ TCR can similarly suppress the alloreactivity of T cells. As a result of intensive research based on these findings, the present invention has been completed.
  • a variant of a T cell receptor which comprises a combination of two polypeptides containing a constant region of a T cell receptor chain selected from the group consisting of ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain, The polypeptide does not contain the complementarity determining region (CDR) of the T cell receptor chain, the ⁇ chain complementarity determining region (CDR) and the ⁇ chain complementarity determining region (CDR), A variant.
  • CDR complementarity determining region
  • CDR complementarity determining region
  • CDR ⁇ chain complementarity determining region
  • CDR ⁇ chain complementarity determining region
  • At least one of the polypeptides contains a complementarity determining region (CDR) of a T cell receptor ⁇ chain and/or a complementarity determining region (CDR) of a T cell receptor ⁇ chain.
  • CDR complementarity determining region
  • the constant region contained in at least one of the polypeptides is an ⁇ chain constant region, and the complementarity determining region (CDR) is a ⁇ chain complementarity determining region (CDR). Modified form of.
  • the constant region contained in at least one of the polypeptides is a ⁇ chain constant region, and the complementarity determining region (CDR) is a ⁇ chain complementarity determining region (CDR), [2a] or [2a] 2b].
  • CDR complementarity determining region
  • [3a] The variant according to any one of [1] to [3], wherein the polypeptide further comprises one or more signal peptides.
  • [3c] The modified form according to [3a], wherein the signal peptide is a CD8 and/or IGH signal peptide.
  • [4] A nucleic acid molecule encoding the variant according to any one of [1] to [3c].
  • [5] A vector containing the nucleic acid molecule according to [4].
  • [6] A method for producing a cell, which comprises a step of introducing the vector according to [5].
  • [6a] A pluripotent stem cell containing a nucleic acid encoding the variant according to any one of [1] to [3c].
  • [6b] The cell according to [6a], wherein the pluripotent stem cell is an induced pluripotent stem cell (iPS cell).
  • iPS cell induced pluripotent stem cell
  • the T cell receptor variant of the present invention when introduced into cells, can suppress the alloreactivity of the cells, thus reducing the risk of graft-versus-host disease (GvHD) in allogeneic transplantation.
  • GvHD graft-versus-host disease
  • FIG. 1 shows the results of detection of CD3 molecule expression on the cell membrane surface using flow cytometry for T cells that express a variant of TCR that does not contain the variable region of the TCR chain but contains the C region.
  • the abscissa represents the cell membrane surface expression of the CD3 molecule, and the ordinate represents the cell number.
  • FIG. 2 shows the results of flow cytometric measurement of the expression of CD3, CD5, CD7 and ⁇ TCR expressed on the cell membrane differentiated from iPS cells into which AB6 gene was introduced using a lentivirus vector.
  • T cell receptor variant The present invention comprises a combination of two polypeptides containing a constant region of a T cell receptor (TCR) chain selected from the group consisting of ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain.
  • T cell receptor variants (hereinafter may be referred to as “variants of the invention”).
  • the variant of the present invention has a complementarity determining region (CDR) of TCR ⁇ chain and ⁇ chain, or a complementarity determining region (CDR) of the same type of chain (preferably a part or all of a variable region containing the CDR).
  • the variant of the present invention includes a natural type or an artificial type (for example, different animal species from which the constant region and the variable region are derived) ⁇ TCR, ⁇ TCR, or a TCR modification in which an amino acid is further added to these TCRs.
  • the body is not included.
  • the polypeptide corresponding to at least one chain of the variant of the present invention contains the constant region of T cell receptor ⁇ chain
  • the polypeptide includes CDR of T cell receptor ⁇ chain, preferably Does not include a part or all of the variable region containing the CDR, but may include different TCR chains other than the ⁇ chain and the ⁇ chain, for example, the CDR and variable regions of the ⁇ chain and the ⁇ chain.
  • the polypeptide corresponding to at least one chain of the variant of the present invention contains the constant region of T cell receptor ⁇ chain
  • the polypeptide includes CDR of T cell receptor ⁇ chain
  • a part or all of the variable region containing the CDR is not included, but different TCR chains other than the ⁇ chain and the ⁇ chain, for example, CDRs and variable regions of ⁇ chain and ⁇ chain may be included.
  • the T cell receptor ⁇ chain comprises the T cell receptor ⁇ 1 chain (SEQ ID NO:2) or the T cell receptor ⁇ 2 chain (SEQ ID NO:3).
  • the T cell receptor ⁇ chain comprises the T cell receptor ⁇ 1 chain (SEQ ID NO:2) and the T cell receptor ⁇ 2 chain (SEQ ID NO:3).
  • the polypeptide of the present invention may further have a membrane translocation signal peptide (hereinafter referred to as “signal peptide”) added thereto.
  • the signal peptide include CD8, Immunoglobulin-H (IGH), CD4, a transmembrane signal peptide derived from genes encoding various peptides having a transmembrane domain, and/or 1 or a number in the amino acid sequence of the signal peptide. It consists of an amino acid sequence in which individual (for example, 2, 3, 4, 5) amino acids have been deleted, substituted, inserted and/or added, or an amino acid sequence having identity with the amino acid sequence of the signal peptide.
  • a signal peptide can be used.
  • the binding position and the number of signal peptides when a signal peptide is added are not particularly limited.
  • T cell receptor is composed of a dimer of TCR chains ( ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain), and is an antigen or the antigen-HLA (human leukocyte antigen).
  • MHC major histocompatibility complex
  • Each TCR chain is composed of a variable region and a constant region, and there are three complementarity determining regions (CDR1, CDR2, CDR3) in the variable region.
  • the modified TCR means a dimer of the TCR chain in which each polypeptide contains at least the constant region of the TCR chain.
  • one of the polypeptides constituting the variant of the present invention comprises a constant region (also referred to as C region) of a T cell receptor ⁇ chain or ⁇ chain, and the other polypeptide is a T cell receptor ⁇ chain or Variants containing the constant region of the ⁇ chain are provided.
  • one polypeptide has a CDR of the TCR ⁇ chain, preferably a part or all of the variable region of the TCR ⁇ chain containing the CDR, and/or a CDR of the TCR ⁇ chain, preferably the variable region of the TCR ⁇ chain containing the CDR. It is preferable to include a part or all of the region.
  • the constant region of at least one of the polypeptides constituting the variant of the present invention is the constant region of TCR ⁇ chain or ⁇ chain, and the CDR is ⁇ chain or ⁇ chain. It is preferable that the CDR is More preferably, the constant region of one of the polypeptides constituting the variant of the present invention is the constant region of the TCR ⁇ chain, the CDR is the CDR of the ⁇ chain, and the constant region of the other polypeptide is the constant region of the TCR ⁇ chain. The region is the CDR, and the CDR is the CDR of the ⁇ chain.
  • one polypeptide may contain a constant region of T cell receptor ⁇ chain or ⁇ chain, and the other may contain a constant region of T cell receptor ⁇ chain or ⁇ chain.
  • one polypeptide may contain a constant region of T cell receptor ⁇ chain or ⁇ chain, and the other may contain a constant region of T cell receptor ⁇ chain or ⁇ chain.
  • one polypeptide may include the constant region of the T cell receptor ⁇ chain or ⁇ chain, and the other may include the constant region of the T cell receptor ⁇ chain or ⁇ chain.
  • polypeptide constituting the variant of the present invention for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or one or several (eg, 2, 3, 4, 5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of (1) is deleted, substituted, inserted and/or added, or a polypeptide comprising a constant region of the TCR ⁇ chain consisting of an amino acid sequence having the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as “polypeptide”). "Peptide 1").
  • polypeptide constituting the variant of the present invention for example, one or several (for example, two or three) in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 or 3 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 or 3. (4, 5) amino acids deleted, substituted, inserted and/or added, or a constant region of the TCR ⁇ chain consisting of an amino acid sequence having identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3. (Hereinafter, referred to as “polypeptide 2” and “polypeptide 3”, respectively).
  • the variant of the present invention comprises the polypeptide 1 (constant region of TCR ⁇ chain) and the polypeptide 2 (constant region of TCR ⁇ 1 chain), or the polypeptide 1 (constant region of TCR ⁇ chain). And polypeptide 3 (constant region of TCR ⁇ 2 chain).
  • a polypeptide containing a C region that does not include a part or all of the variable region containing the CDR of the TCR chain for example, the above-mentioned polypeptide 1 and polypeptide 2, or the above-mentioned polypeptide 1 and polypeptide
  • a signal peptide is further added to at least one of the polypeptides.
  • the signal peptide is preferably CD8 or IGH.
  • the binding position when the signal peptide is added is not particularly limited, and it is preferably added to the C-terminal or N-terminal of the polypeptide containing the C region of TCR, more preferably to the N-terminal.
  • the number of signal peptides is not particularly limited, and it is preferable to add one or more to each polypeptide, and it is preferable to add one.
  • the signal peptide includes, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (CD8) or 5 (IGH), the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5 by one or several (for example, 2, 3, 4) Individual, 5) amino acids have been deleted, substituted, inserted and/or added, or a signal peptide consisting of an amino acid sequence having identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5, respectively (hereinafter referred to as “ Signal peptide 4" and "signal peptide 5").
  • the modified form of the present invention comprises the polypeptide represented by SEQ ID NO: 8 or 11 (hereinafter, referred to as “polypeptide 8” and “polypeptide 8”, in which the signal peptide 5 is added to the N-terminus of polypeptide 1).
  • Polypeptide 11 polypeptide represented by SEQ ID NO: 7 or 10 in which the signal peptide 4 is added to the N-terminal of Polypeptide 2 (hereinafter, referred to as "Polypeptide 7" and “Polypeptide 10").
  • examples of the polypeptide constituting the variant of the present invention include a polypeptide containing the variable region of the TCR ⁇ chain.
  • examples of the polypeptide constituting the variant of the present invention include a polypeptide containing the variable region of the TCR ⁇ chain.
  • a short fragment eg 1-3 amino acids
  • the origins of the constant region, variable region and CDR of the TCR chain contained in the variant of the present invention are not particularly limited, but include animal mammals (eg, mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, monkey). , Humans) are preferred, and those derived from humans are more preferred.
  • animal mammals eg, mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, monkey.
  • Humans are preferred, and those derived from humans are more preferred.
  • the constant region of the TCR chain contained in the variant of the present invention is preferably subjected to predetermined modification in the constant region of the natural TCR chain.
  • a specific amino acid residue in the constant region of natural TCR is replaced with a cysteine residue (eg, the 48th threonine (threonine) in the constant region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • cysteine residue eg, the 48th threonine (threonine) in the constant region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • substitution with cysteine, and substitution of serine at position 56 or 55 of the constant region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 with cysteine resulting in dimer expression efficiency due to disulfide bond between ⁇ chain and ⁇ chain And the like, but is not limited thereto.
  • the two polypeptides are bound by one or more, preferably two or more disulfide bonds, and the disulfide bonds are the cysteine residues (naturally occurring residues contained in each variant polypeptide). It may be contained in the mold or may be artificially introduced as described above), and is formed by oxidative or post-translational modification.
  • the modified form of the present invention can be prepared by genetic engineering using the nucleic acid or vector of the present invention described below.
  • both a nucleic acid encoding one polypeptide and a nucleic acid encoding the other polypeptide constituting the variant of the present invention are introduced into cells to express each polypeptide to form a dimer, which is known per se. It can be produced by isolating the dimer according to the method of.
  • nucleic Acid Encoding the Variant of the Present Invention or Vector Containing the Nucleic Acid provides the above-mentioned nucleic acid encoding the TCR of the present invention (hereinafter may be referred to as “the nucleic acid of the present invention”).
  • the nucleic acid encoding one of the polypeptides constituting the variant of the present invention and the nucleic acid encoding the other polypeptide may be contained in different molecules.
  • the nucleic acid encoding the peptide may be contained in a single molecule.
  • the nucleic acid of the present invention may be DNA or RNA, or may be a DNA/RNA chimera, but is preferably DNA.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. When it is double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or a hybrid of DNA:RNA. When the nucleic acid is RNA, T in the sequence listing is replaced with U for the RNA sequence.
  • the nucleic acid of the present invention may also include natural nucleotides, modified nucleotides, nucleotide analogs, or a mixture thereof, so long as the polypeptide can be expressed in vitro or in cells.
  • the nucleic acid of the present invention can be prepared by a method known per se. For example, based on the known DNA sequence information of the TCR chain, an oligo DNA primer is synthesized so as to cover a desired portion of the sequence, Cloning can be performed by using the total RNA or mRNA fraction prepared from cells having the sequence as a template and amplifying by the RT-PCR method. Alternatively, by chemically synthesizing a DNA chain, or by synthesizing a partially overlapping oligo DNA short chain that is synthesized by using a PCR method (overlap PCR method) or a GibsonAssembly method, the full length or It is possible to construct the DNA encoding the part.
  • a PCR method overlap PCR method
  • GibsonAssembly method the full length or It is possible to construct the DNA encoding the part.
  • the nucleic acid of the present invention can be incorporated into an expression vector. Therefore, the present invention provides an expression vector (hereinafter sometimes referred to as “vector of the present invention”) containing the above-described nucleic acid of the present invention.
  • Examples of the promoter used in the vector of the present invention include ubiquitin promoter, EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV( Moloney murine leukemia virus) LTR, HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter and the like are used.
  • ubiquitin promoter, EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, MoMuLVLTR, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • the vector of the present invention may optionally contain a transcriptional and translational regulatory sequence, a ribosome binding site, an enhancer, an origin of replication, a poly A addition signal, a selection marker gene and the like.
  • a selectable marker gene include dihydrofolate reductase gene, neomycin resistance gene, puromycin resistance gene and the like.
  • an expression vector containing a nucleic acid encoding one polypeptide constituting the above-described variant of the present invention and a nucleic acid encoding the other polypeptide is introduced into a target cell to induce intracellular expression.
  • Heterodimers of both polypeptides can be constructed on the cell surface.
  • the nucleic acid encoding one polypeptide and the nucleic acid encoding the other polypeptide constituting the variant of the present invention may be incorporated into separate expression vectors or may be incorporated into one expression vector. ..
  • these two types of nucleic acids are preferably incorporated via a sequence allowing polycistronic expression.
  • sequences that enable polycistronic expression include 2A sequences (eg, 2A sequence (F2A) derived from foot-and-mouth disease virus (FMDV), 2A sequence (E2A) derived from equine rhinitis A virus (ERAV), Porcinetes chovirus (PTV).
  • 2A sequences eg, 2A sequence (F2A) derived from foot-and-mouth disease virus (FMDV), 2A sequence (E2A) derived from equine rhinitis A virus (ERAV), Porcinetes chovirus (PTV).
  • 1A-derived 2A sequence (P2A) Thosea signature virus (TaV)-derived 2A sequence (T2A)) (PLoS ONE, 3:e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007, etc.), internal ribosome entry site ( IRES) (US Patent No. 4,937,190) and the like, but the 2A sequence is preferable from the viewpoint of uniform expression level. Further, of the 2
  • expression vectors examples include viral vectors and plasmid vectors.
  • viral vectors include retrovirus vectors (including lentivirus vectors and pseudotyped vectors), adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, Sendai viruses, episomal vectors and the like.
  • a transposon expression system eg, PiggyBac system
  • the plasmid vector include animal cell expression plasmids (eg, pa1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) and the like.
  • T cell expressing variant of the present invention provides a cell into which the nucleic acid or vector of the present invention has been introduced (hereinafter sometimes referred to as "cell of the present invention").
  • the cells of the present invention preferably express the variant of the present invention.
  • lymphocytes examples include lymphocytes, lymphocyte precursor cells, and pluripotent stem cells.
  • lymphocyte means one of the subtypes of white blood cells in the immune system of vertebrates, and examples of lymphocytes include T cells, B cells, and natural killer cells (NK cells).
  • NK cells natural killer cells
  • the “T cell” means a CD3 positive cell.
  • T cells expressing the variant of the present invention include CD8-positive cell cytotoxic T cells (CTL), CD4-positive cells of helper T cells, regulatory T cells, effector T cells, and the like. Are preferably cytotoxic T cells.
  • T cells expressing the variant of the present invention can be obtained by introducing the nucleic acid or vector of the present invention into T cells collected from a living body.
  • a T cell that expresses the TCR of the present invention that is, the pluripotency-imparted pluripotency is obtained by inducing differentiation of a pluripotent stem cell or lymphocyte precursor cell into which the nucleic acid or vector of the present invention has been introduced into T cell.
  • T cells derived from cells or progenitor cells can be obtained.
  • T cells may express CD5 and/or CD7 in addition to CD3.
  • CD5 and/or CD7 may also be expressed on the cell surface of T cells in vivo.
  • T cells express CD5 and/or CD7
  • CD3 is expressed on the cell surface in T cells by forming a complex with TCR, whereas CD5 and CD7 form a complex with TCR molecule.
  • the cell of the present invention (eg, cytotoxic T cell) has an exogenous TCR gene derived from the nucleic acid or vector of the present invention, in addition to the TCR gene originally possessed by the cell.
  • the cells of the present invention are different from cells collected from a living body.
  • the cell of the present invention may express a chimeric antigen receptor (CAR) in addition to the variant of the present invention.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the lymphocytes can be collected from human or non-human mammals such as peripheral blood, bone marrow and cord blood.
  • the cells expressing the variant of the present invention are used for the treatment of diseases such as cancer, it is preferable that the cell population is collected from the subject to be treated or a donor having a HLA type matching the subject to be treated.
  • lymphocyte progenitor cells include hematopoietic stem cells, multipotent progenitors (MMPs) that have lost self-renewal ability, myelolymphoid common progenitor cells (MLPs), myeloid progenitor cells (MPs), Granulocyte mononuclear progenitor cells (GMP), macrophage-dendritic cell precursor cells (MDP), dendritic cell precursor cells (DCP) and the like can be mentioned.
  • MMPs multipotent progenitors
  • MLPs myelolymphoid common progenitor cells
  • MPs myeloid progenitor cells
  • GMP Granulocyte mononuclear progenitor cells
  • MDP macrophage-dendritic cell precursor cells
  • DCP dendritic cell precursor cells
  • pluripotent stem cells for example, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonal tumor cells (EC cells), embryonic germ stem
  • the pluripotent stem cell is an ES cell or any cell derived from a human embryo, even if the cell is a cell produced by destroying the embryo, it is a cell produced without destroying the embryo. However, it is preferably a cell produced without destroying the embryo.
  • pluripotent stem cells means embryonic stem cells (ES cells) and pluripotency similar thereto, that is, various tissues of the living body (endoderm, mesoderm, exodermis). Refers to cells that have the potential to differentiate into all of the germ layers). Examples of cells having pluripotency similar to ES cells include "induced pluripotent stem cells” (also referred to as “iPS cells” in the present specification).
  • ES cells various mouse ES cell lines established by inGenious targeting laboratory, RIKEN (RIKEN) can be used for mouse ES cells, and NIH, RIKEN for human ES cells.
  • RIKEN RIKEN
  • human ES cell lines established by Kyoto University and Cellartis are available.
  • human ES cell lines include NIH CHB-1 to CHB-12 strains, RUES1 strains, RUES2 strains, HUES1 to HUES28 strains, WisCell Research H1 strains, H9 strains, RIKEN KhES-1 strains, KhES- strains. Two strains, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SSES2 strain, SSES3 strain and the like can be used.
  • induced pluripotent stem cells are cells obtained by introducing specific factors (nuclear reprogramming factors) into mammalian somatic cells or undifferentiated stem cells and reprogramming them.
  • specific factors nuclear reprogramming factors
  • IPS cells derived from human cells (TakahashiK, Miyazaki, S., Cell, (2006) 126: 663-676) and human cell-derived iPS cells established by introducing the same four factors into human fibroblasts. S., et al.
  • Nanog-iPS cells established by selecting Nanog expression as an index and established (Okita, K., Ichisaka, T. , And Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), iPS cells produced by a method that does not contain c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26 , 101-106), iPS cells established by introducing 6 factors by virus-free method (Okita K et al. Nat. Methods20112011March;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.) can also be used.
  • induced pluripotent stem cells established by introducing the four factors of OCT3/4/SOX2/NANOG/LIN28 produced by Thomson et al. (Yu J., ThomsonJA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), artificial pluripotent stem cells produced by Daley et al. (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), artificial pluripotent stem cells produced by Sakurada et al. (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-307007) and the like can also be used.
  • the artificial pluripotent cell line various iPS cell lines established by NIH, RIKEN, Kyoto University, etc. can be used.
  • the human iPS cell line Riken HiPS-RIKEN-1A strain, HiPS-RIKEN-2A strain, HiPS-RIKEN-12A strain, Nips-B2 strain, Kyoto University 253G1 strain, 201B7 strain, 409B2 strain, 454E2 strain, 606A1 strain, 610B1 strain, 648A1 strain, 1231A3 strain, FfI-01s04 strain and the like.
  • hematopoietic progenitor cells are multipotent stem cells that can differentiate into hematopoietic cells. In humans, it is mainly present in bone marrow and differentiates into white blood cells (neutrophils, eosinophils, basophils, lymphocytes, monocytes, macrophages), red blood cells, platelets, mast cells, and dendritic cells. Further, in the present invention, the “hematopoietic progenitor cell” means a CD34-positive cell, preferably a CD34/CD43 double positive (DP) cell.
  • DP double positive
  • hematopoietic progenitor cells used in the present invention is not limited, and may be, for example, hematopoietic progenitor cells obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells by the method described below. It may be a hematopoietic progenitor cell isolated by the above method.
  • the cells are preferably differentiated into lymphocytes, preferably T cells, by a method known per se.
  • a method for differentiating a pluripotent stem cell into a T cell for example, (1) a step of differentiating a pluripotent stem cell into which the nucleic acid or vector of the present invention has been introduced into a hematopoietic progenitor cell, and (2) the hematopoietic progenitor cell And a method including a step of differentiating T cells into T cells.
  • the step (1) is, for example, as described in WO 2013/075222, WO 2016/076415 and Liu S.et al., Cytotherapy, 17 (2015);344-358.
  • the step (2) as described in WO 2016/076415 and the like, (2-1) a step of inducing CD4CD8 bipositive T cells from hematopoietic progenitor cells, and (2-2) A method including a step of inducing CD8-positive T cells from both CD4 and CD8-positive T cells can be mentioned.
  • the method of introducing the nucleic acid or vector of the present invention into cells is not particularly limited, and known methods can be used.
  • a nucleic acid or a plasmid vector for example, calcium phosphate coprecipitation method, PEG method, electroporation method, microinjection method, lipofection method, etc. can be used.
  • Cell Engineering Supplement 8, New Cell Engineering Experimental Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, Volume 52, 456 (1973), Journal of Japanese Pharmacology (Folia Pharmacol.Jpn.), No. The method described in Volume 119 (No. 6), 345-351 (2002), etc. can be used.
  • the nucleic acid of the present invention is introduced into an appropriate packaging cell (eg, Plat-E cell) or a complementary cell line (eg, 293 cell) to produce a virus produced in the culture supernatant.
  • the vector can be introduced into a cell by recovering the vector and infecting the cell with the vector by an appropriate method depending on each viral vector.
  • specific means using a retrovirus vector as a vector is disclosed in International Publication No. 2007/69666, Cell 126, 663-676 (2006) and Cell 131, 861-872 (2007).
  • a specific means of using a lentivirus as a vector is disclosed in Zufferey R.
  • the nucleic acid or vector of the present invention may be introduced into the cell genome by genome editing (eg, CRISPR system, TALEN, ZFN, etc.).
  • the nucleic acid of the present invention may also be directly introduced into a cell in the form of RNA and used for expressing the variant of the present invention in the cell.
  • a method for introducing RNA a known method can be used, and for example, a lipofection method, an electroporation method or the like can be preferably used.
  • the expression of the variant of the present invention can be detected or measured by an immunological method using, for example, an antibody that recognizes a part of the variant of the present invention (eg, constant region of TCR chain).
  • immunological techniques include antibody array, flow cytometry analysis, radioisotope immunoassay (RIA method), ELISA, western blotting, immunohistostaining, enzyme immunoassay (EIA method), fluorescent immunoassay. (FIA), immunochromatography method and the like.
  • the suppression of alloreactivity of cells by the variant of the present invention can be confirmed by a method known per se.
  • a mixed leukocyte reaction MLR
  • an Elispot assay a limiting dilution assay (Limiting dilution assay), or the like is performed on cells expressing the variant of the present invention and target cells that do not express the variant, When at least one of the expressed cells results in low alloreactivity, it can be evaluated that the variant of the present invention suppressed alloreactivity.
  • the present invention provides a method for producing a cell (hereinafter sometimes referred to as “production method of the present invention”) including a step of introducing the nucleic acid or vector of the present invention into a cell.
  • production method of the present invention including a step of introducing the nucleic acid or vector of the present invention into a cell.
  • the cells into which the nucleic acid or vector of the present invention is introduced, the method of introduction, and the like are described in the above 3.
  • the cells preferably express the variant of the present invention. Expression of the variant of the present invention is described in the above 3. It can be detected or measured by the method described in.
  • a step of differentiating a pluripotent stem cell into which the nucleic acid or vector of the present invention has been introduced into a hematopoietic progenitor cell and (2) differentiating the hematopoietic progenitor cell into a T cell
  • a method for producing T cells includes steps.
  • Step (1) Step of differentiating pluripotent stem cells into hematopoietic progenitor cells (step (1))
  • the method for differentiating pluripotent stem cells into hematopoietic progenitor cells is not particularly limited as long as it can differentiate into hematopoietic progenitor cells, and for example, WO 2013/075222, WO 2016/076415 and Liu S. et al. ., Cytotherapy, 17 (2015); 344-358 and the like, a method of culturing pluripotent stem cells in a medium for inducing hematopoietic progenitor cells can be mentioned.
  • the medium for inducing hematopoietic progenitor cells is not particularly limited, but a medium used for culturing animal cells can be prepared as a basal medium.
  • a basal medium for example, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, 640's, Ham's , Neurobasal Medium (Life Technologies), mixed media of these, and the like.
  • the medium may contain serum or may be used without serum.
  • the basal medium may contain, for example, vitamin Cs (eg, ascorbic acid), albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine.
  • Vitamin Cs eg, ascorbic acid
  • albumin e.g, ascorbic acid
  • insulin transferrin
  • selenium fatty acids
  • trace elements 2-mercaptoethanol
  • thiolglycerol lipids
  • amino acids L-glutamine.
  • Non-essential amino acids vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, cytokines and the like may be contained.
  • vitamin Cs mean L-ascorbic acid and its derivatives
  • L-ascorbic acid derivatives mean those that become vitamin C by an enzymatic reaction in vivo.
  • examples of the ascorbic acid derivative used in the present invention include vitamin C phosphate, ascorbic acid glucoside, ascorbyl ethyl, vitamin C ester, ascobyl tetrahexyldecanoate, ascobyl stearate, and ascorbic acid-2phosphate-6palmitic acid.
  • Preferred is vitamin C phosphate and examples thereof include phosphate-L-ascorbate such as phosphate-Na-ascorbate or Mg-phosphate-L-ascorbate.
  • the preferred basal medium used in step (1) is IMDM medium containing serum, insulin, transferrin, serine, thiolglycerol, L-glutamine, and ascorbic acid.
  • the medium used in step (1) is at least one kind selected from the group consisting of BMP4 (Bone morphogenetic protein 4), VEGF (vascular endothelial growth factor), SCF (Stem cell factor), and FLT-3L (Flt3Ligand). Cytokine may be further added. More preferred is a medium supplemented with VEGF, SCF and FLT-3L.
  • vitamin Cs are preferably added (supplemented) separately every 4 days, every 3 days, every 2 days, or every 1 day, and preferably added every 1 day.
  • concentration of the vitamin Cs in the medium is not particularly limited, but an amount equivalent to 5 ng/ml to 500 ng/ml (eg 5 ng/ml, 10 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 50 ng/ml ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500 ng/ml) is preferable.
  • the concentration of BMP4 in the medium is not particularly limited, but it is 10 ng/ml to 100 ng/ml (eg 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml) are preferred, 20 ng/ml to 40 ng/ml Is more preferable.
  • the concentration of VEGF in the medium is not particularly limited, but is 10 ng/ml to 100 ng/ml (eg 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml) is preferable, and 20 ng/ml is particularly preferable. ..
  • the concentration of SCF in the medium is not particularly limited, but is 10 ng/ml to 100 ng/ml (eg 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml) is preferable, and 30 ng/ml is particularly preferable. ..
  • the concentration of FLT-3L in the medium is not particularly limited, but is 1 ng/ml to 100 ng/ml (eg 1 ng/ml, 2 ng/ml, 3 ng/ml, 4ng/ml, 5ng/ml, 6ng/ml, 7ng/ml, 8ng/ml, 9ng/ml, 10ng/ml, 20ng/ml, 50ng/ml, 100 ng/ml) is preferable, and above all, 10 ng/ml is preferable.
  • the culture of pluripotent stem cells may be adherent culture or suspension culture, and in the case of adherent culture, it may be carried out using a culture vessel coated with a coating agent, or with other cells.
  • Other co-cultured cells include C3H10T1/2 (Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010) and heterologous stromal cells (Niwa A et al. J CellPhysiol. 2009 Nov;221( 2):367-77.) is exemplified.
  • the coating agent include Matrigel (Niwa A, et al. PLoSOne.6(7):e22261, 2011).
  • the culture temperature condition is not particularly limited, but for example, about 37°C to 42°C, preferably about 37°C to 39°C is preferable.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of hematopoietic progenitor cells.
  • the number of days is not particularly limited, for example, at least 6 days, 7 days or more, 8 days or more, 9 days or more, 10 days or more, 11 days or more, 12 days or more, 13 days or more, It is 14 days or more, preferably 14 days.
  • a long culture period is not usually a problem in the production of hematopoietic progenitor cells, but is preferably 35 days or less, more preferably 21 days or less. Further, it may be cultured under low oxygen condition, and in the present invention, the low oxygen condition is 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% or an oxygen concentration thereof is exemplified. It
  • Step (2) Step of differentiating hematopoietic progenitor cells into T cells
  • the method for differentiating a hematopoietic progenitor cell into a T cell is not particularly limited as long as the hematopoietic progenitor cell can be differentiated into a T cell.
  • (2-1 ) A method including a step of inducing CD4CD8 both positive T cells from hematopoietic progenitor cells, and (2-2) inducing CD8 positive T cells from CD4CD8 both positive T cells.
  • the hematopoietic progenitor is preferably isolated in advance from the cell population obtained in step (1) using a marker for hematopoietic progenitor cells.
  • the marker includes at least one selected from the group consisting of CD43, CD34, CD31 and CD144.
  • examples of the method of differentiating into CD4CD8 bipositive T cells include a method of culturing hematopoietic progenitor cells in a medium for inducing CD4CD8 bipositive T cells.
  • the medium for inducing differentiation into CD4CD8 both positive T cells is not particularly limited, but a medium used for culturing animal cells can be prepared as a basal medium.
  • the basal medium may be the same as that used in the above step (1).
  • the medium may contain serum or may be used without serum.
  • the basal medium may contain, for example, vitamin Cs, albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins. , Growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, cytokines and the like.
  • the preferred basal medium used in step (2-1) is ⁇ MEM medium containing serum, transferrin, serine, and L-glutamine.
  • vitamin C is the same as that of the process (1).
  • the medium used in the step (2-1) may further contain cytokines FLT-3L and/or IL-7, and more preferably a medium supplemented with FLT-3L and IL-7.
  • the concentration of IL-7 in the medium should be 1ng/ml to 50ng/ml (eg 1ng/ml, 2ng/ml, 3ng/ml). , 4ng/ml, 5ng/ml, 6ng/ml, 7ng/ml, 8ng/ml, 9ng/ml, 10ng/ml, 20ng/ml, 30ng/ml, 40ng/ml , 50 ng/ml) is preferred, and 5 ng/ml is particularly preferred.
  • FLT-3L when FLT-3L is used in step (2-1), FLT-3L can be used in the same manner as in step (1) above.
  • the hematopoietic progenitor cells may be adherent-cultured or suspension-cultured.
  • a culture vessel may be coated and used, or co-cultured with feeder cells and the like.
  • feeder cells to be co-cultured include bone marrow stromal cell line OP9 cells (available from RIKEN BioResource Center).
  • the OP9 cells are preferably OP9-DL4 cells or OP9-DL1 cells that constantly express DLL4 or DLL1 (for example, Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC. Cold Spring Harb Protoc. 2009).
  • DLL4 or DLL1 prepared separately or a fusion protein of DLL4 or DLL1 and Fc or the like may be appropriately added to the medium.
  • feeder cells it is preferable to appropriately exchange the feeder cells for culturing.
  • the replacement of feeder cells can be performed by transferring the cells of interest in culture onto previously seeded feeder cells. The exchange may occur every 5 days, every 4 days, every 3 days, or every 2 days.
  • the embryoid body is subjected to suspension culture to obtain hematopoietic progenitor cells, it is preferable to dissociate the cells into single cells and then perform adherent culture.
  • the cells may be co-cultured with the feeder cells, the culture is preferably performed without using the feeder cells.
  • Examples of coating agents for coating culture vessels in the case of adherent culture include Matrigel (Niwa A, et al. PLos One, 6(7):e22261, 2011)), collagen, gelatin, laminin, Examples include heparan sulfate proteoglycan, retronectin, DLL4 or DLL1, or a fusion protein of DLL4 or DLL1 with an Fc region of an antibody (eg, DLL4/Fcchimera), entactin, and/or a combination thereof, and retronectin and DLL4 and Fc region. The combination of the fusion protein with etc. is preferred.
  • the culture temperature condition is not particularly limited, but for example, about 37°C to 42°C, preferably about 37°C to 39°C is preferable.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of CD4CD8 both positive T cells and the like.
  • the number of days is not particularly limited, so long as hematopoietic progenitor cells are obtained, for example, at least 10 days or more, 12 days or more, 14 days or more, 16 days or more, 18 days or more, 20 days or more, 22 days or more, 23 days or more. Yes, preferably 23 days. Further, it is preferably 90 days or less, more preferably 42 days or less.
  • step (2-2) Step of inducing CD8-positive T cells (CD3 single-positive T cells) from CD4CD8 both-positive (DP) T cells (step (2-2)) By subjecting the CD4/CD8 DPT cells obtained in step (2-1) to a step of inducing differentiation into CD8-positive T cells, differentiation into CD8-positive T cells can be induced.
  • the same basal medium and medium described in the step (1) can be mentioned.
  • the medium may contain a corticosteroid.
  • corticosteroids include glucocorticoids and derivatives thereof, and the glucocorticoids include, for example, cortisone acetate, hydrocortisone, fludrocortisone acetate, prednisolone, triamcinolone, methylprednisolone, dexamethasone, betamethasone, Examples include beclomethasone propionate. Of these, dexamethasone is preferred.
  • the concentration of dexamethasone in the medium is preferably 1nM to 100nM (eg 1nM, 5nM, 10nM, 20nM, 30nM, 40nM, 50nM, 60nM, 70nM, 80nM, 90nM, 100nM). Of these, 10 nM is preferable.
  • the medium may contain antibodies (eg, anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, anti-CD2 antibody), cytokines (eg, IL-7, IL-2, IL-15) and the like.
  • antibodies eg, anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, anti-CD2 antibody
  • cytokines eg, IL-7, IL-2, IL-15
  • the anti-CD3 antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically recognizes CD3, and examples thereof include an antibody produced from an OKT3 clone.
  • the anti-CD3 antibody may be one to which magnetic beads or the like are bound, and instead of adding the anti-CD3 antibody to the medium, the anti-CD3 antibody may be bound to the T-cell on a culture vessel having the surface bound thereto. Stimulation may be provided by culturing lymphocytes for a period of time.
  • the concentration of anti-CD3 antibody in the medium is 10ng/ml to 1000ng/ml (eg 10ng/ml, 50ng/ml, 100ng/ml, 200ng/ml, 300ng/ml, 400ng/ml, 500ng).
  • ng/ml, 600 ng/ml, 700 ng/ml, 800 ng/ml, 900 ng/ml, 1000 ng/ml is preferable, and 500 ng/ml is particularly preferable.
  • concentration of other antibodies can be appropriately determined by those skilled in the art based on culture conditions and the like.
  • the concentration of IL-2 in the medium is 10U/ml to 1000U/ml (eg 10U/ml, 20U/ml, 30U/ml 40U/ml, 50U/ml, 60U/ml, 70U/ml, 80U/ml, 90U/ml, 100U/ml, 200U/ml, 500U/ml, 1000U/ml ) Is preferable, and 100 U/ml is particularly preferable.
  • the concentration of IL-7 or IL15 used in the step (2-2) in the medium is 1 ng/ml to 100 ng/ml (Example: 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml (ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml) are preferable, and above all, 10 ng /ml is preferred.
  • the culture temperature condition is not particularly limited, but is preferably about 37°C to 42°C, more preferably about 37°C to 39°C.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of CD8-positive T cells and the like.
  • the number of days is not particularly limited as long as CD8-positive T cells can be obtained, but it is preferably 1 day or more, 3 days or more, 7 days or more, preferably 60 days or less, and more preferably 35 days or less.
  • the present invention provides a method for reducing alloreactivity in a cell, which comprises the step of introducing the nucleic acid or vector of the present invention into the cell.
  • Example 1 Preparation of LentiV vector containing a nucleic acid encoding a variant of TCR having a constant region of ⁇ TCR and not having a complementarity determining region (CDR)
  • a CD8 molecule translocation signal peptide was added to the N-terminus
  • a polypeptide chain was designed by connecting each ⁇ chain (TRAC) and the amino acids of each ⁇ chain (TRBC1 or TRBC2) to which the membrane translocation signal peptide of the IGH molecule was added to the N-terminus with the P2A sequence (Table 1AB5-AB8).
  • oligo DNA encoding the designed polypeptide chain was artificially synthesized (GenScript) and inserted into the multicloning site of the lentivirus vector plasmid.
  • GenScript oligo DNA encoding the designed polypeptide chain
  • the lentiviral vector tar plasmid one in which the CMV promoter of pCDH-CMV-MCS-EF1a-Puro (SystemBioscience) was replaced with a human ubiquitin promoter was used.
  • the virus vector production was outsourced to SIRION.
  • Example 2 Production of T cells expressing modified TCR Using a 24-well plate coated with RetroNectin (Takara Bio Inc.), four types of CD3 genes ( ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ ) were forcibly expressed.
  • K562 cells K562-CD3 cells, kindly provided by Dr. Uemura, National Cancer Center
  • T Cell Membrane Surface Molecule Expression of T Cells Expressing TCR Variants The T cells expressing each variant shown in Table 1 obtained in [Example 2] were treated with anti-CD3 antibody ( After staining with APC/Cy7, UCHT1, BioLegend), expression of CD3 molecule on the cell membrane surface was detected using flow cytometry using LSRFortessaTMX-20 (BD Bioscience) (Fig. 1). .. Expression of CD3 was also observed on the cell membrane surface in the cells obtained with AB5 and the cells obtained with AB7. Further, in the cells obtained by AB6 and the cells obtained by AB8, stronger CD3 expression was observed on the cell membrane surface.
  • Example 3 Production of iPS cell-derived T cells expressing a modified TCR 1.
  • iPS cells Ff-I01s04 strain: derived from normal human peripheral blood mononuclear cells
  • CiRA Kyoto University iPS Cell Research Institute
  • the iPS cell culture was performed according to the protocol “Culturing of human iPS cells in a feeder-free manner” distributed by CiRA.
  • Lenti V vector containing a nucleic acid encoding a variant of TCR having a constant region of ⁇ TCR and not having a complementarity determining region (CDR)
  • CDR complementarity determining region
  • HPC hematopoietic progenitor cells
  • HPC hematopoietic progenitor cells
  • EB medium (10 ⁇ g/ml human insulin, 5.5 ⁇ g/ml human transferrin in StemPro34, 5 ng/ml sodium selenite, 2 mM L-glutamine, 45 mM ⁇ -monothioglycerol, and 50 ⁇ g/ml Ascorbic acid 2-phosphate) 10 ng/ml BMP4, 50 ng/ml bFGF , 15 ng/ml VEGF, 2 ⁇ M SB431542, were added, and the cells were cultured under hypoxic conditions (5% O 2 ) for 5 days.
  • the medium contains 15% FBS and 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 ng/ml streptomycin, 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol, 50 ⁇ g/ml Ascorbic acid 2-phosphate, 10 ⁇ g/ml human. Insulin, 5.5 ⁇ g/ml human transferrin, 5 ng/ml sodium selenite, 50 ng/ml SCF, 50 ng/ml IL-7, 50 ng/ml Flt3L, 100 ng/ml TPO, 15 ⁇ M SB203580, 30 ng/ml An ⁇ MEM medium supplemented with ml SDF-1 ⁇ was used. On the 7th and 14th days after the start of the culture, the cells were subcultured to a 48-well-plate with the same coating. All cells were collected 21 days after the start of culture. The collected cells were stained with the antibody set in Table 3.
  • the variant of the present invention When the variant of the present invention is expressed in cells, it can suppress the alloreactivity of the cells, thus reducing the risk of graft-versus-host disease (GvHD) in allograft transplantation. That is, introduction of the variant of the present invention can be one option for controlling alloreactivity in T cell therapy.
  • GvHD graft-versus-host disease

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Abstract

本発明は、α鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖からなる群から選択されるＴ細胞受容体鎖の定常領域を含むポリペプチドを２つ組み合わせてなる、Ｔ細胞受容体の改変体であって、該ポリペプチドが該Ｔ細胞受容体鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、α鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含まないことを特徴とする、改変体を提供する。

Description

Ｔ細胞受容体の改変体
　本発明は、Ｔ細胞受容体の改変体及び該改変体を発現する細胞等に関する。
（発明の背景）
　Ｔ細胞は、細菌やウイルスなどの外来の病原体や癌細胞などの異常な細胞に対する免疫システムにおいて中心的な役割を果たしている。なかでも、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、その細胞表面上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して、抗原提示細胞のクラス１主要組織適合抗原と共に提示された、ウイルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識し、異物である該抗原ペプチドを提示する細胞に対して特異的に細胞傷害活性を発揮する。
　このように、Ｔ細胞は免疫システムにおいて中心的な役割を果たしているため、患者由来の細胞、又はＨＬＡ遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である同種細胞に、ウイルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識するＴＣＲ遺伝子、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等を導入し、人為的に大量のがん抗原特異的Ｔ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで作製し、生体内に輸注するアプローチであるＴ細胞療法の開発が進められている。しかしながら、遺伝子導入を受けるＴ細胞には、内在性のＴＣＲが存在しており、内在性のＴＣＲと導入したＴＣＲとが競合して、ＴＣＲの細胞表面への発現に必要なＣＤ３分子と結合することで、導入したＴＣＲの発現が阻害されるとの問題が生じる。また、遺伝子導入したＴＣＲ鎖が、内在性のＴＣＲ鎖とミスペアリングするとの問題も指摘されている。さらに、同種細胞を用いた場合には、内在性のＴＣＲがレシピエントの抗原を認識し、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こす可能性も存在する。
　これらの問題を解決する方法として、ＴＣＲβ鎖の定常領域（Ｃβ）に、α鎖の可変領域（Ｖα）とβ鎖の可変領域（Ｖβ）とを融合させた一本鎖のキメラＴＣＲと、ＴＣＲα鎖の定常領域（Ｃα）を細胞に導入する方法が報告されており、該方法により内在性のＴＣＲα鎖とのミスマッチを抑制でき、それにより予期せぬｉｎｖｉｖｏ作用を抑制することが可能と考えられることが報告されている（非特許文献１）。また、導入するＴＣＲのα鎖とβ鎖の定常領域にシステインを導入することで、導入されたＴＣＲ鎖と内在性のＴＣＲ鎖とのミスマッチを抑制できることも報告されている（非特許文献２）。しかしながら、これらの文献は、導入したＴＣＲ鎖と、内在性のＴＣＲ鎖とでミスマッチが生じることを防ぐことに主に焦点を当てており、内在性のＴＣＲ鎖のアロ反応性（Ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）については検証しておらず、また、抗原－ＨＬＡ複合体の認識に重要であるＴＣＲα鎖及びβ鎖のいずれの相補性決定領域（ＣＤＲ）も有さないＴＣＲの改変体については、開示も示唆さえもない。
Knies D. et al., Oncotarget, 7(16):21199-21221 (2016） Kuball J. et al., blood, 109(6):2331-2338 (2007)
　従って、本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖のいずれの相補性決定領域（ＣＤＲ）も有さない、新規なＴ細胞受容体の改変体を提供することを課題とする。また、該改変体を発現する、アロ反応性（Ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）が抑制されたＴ細胞を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決できる、アロ反応性が抑制されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の開発を進めていたところ、ＴＣＲα鎖及びβ鎖のＣＤＲを含まないＴ細胞受容体の改変体が導入された細胞では、意外にも内在性のＴＣＲに起因すると考えられるアロ反応性が抑制されているとの知見を見出した。また、ＴＣＲ鎖の異なる鎖を組み合わせる、即ちαβＴＣＲの定常領域と、γδＴＣＲのＣＤＲを有する改変ＴＣＲも、同様にＴ細胞のアロ反応性を抑制できることを見出した。これらの知見に基づき鋭意研究した結果、本発明を完成させるに至った。
　即ち、本発明は以下を提供する。
［１］　α鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖からなる群から選択されるＴ細胞受容体鎖の定常領域を含むポリペプチドを２つ組み合わせてなる、Ｔ細胞受容体の改変体であって、該ポリペプチドが該Ｔ細胞受容体鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、α鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含まないことを特徴とする、改変体。
［２］　前記ポリペプチドの一方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含み、他方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含む、［１］に記載の改変体。
［２ａ］　前記ポリペプチドの少なくとも一方が、Ｔ細胞受容体γ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び／又はＴ細胞受容体δ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、［２］に記載の改変体。
［２ｂ］　前記ポリペプチドの少なくとも一方に含まれる定常領域がα鎖の定常領域であり、かつ相補性決定領域（ＣＤＲ）がγ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）である、［２ａ］に記載の改変体。
［２ｃ］　前記ポリペプチドの少なくとも一方に含まれる定常領域がβ鎖の定常領域であり、かつ相補性決定領域（ＣＤＲ）がδ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）である、［２ａ］又は［２ｂ］に記載の改変体。
［３］　２つのポリペプチドが１つ以上のジスルフィド結合で結合された、［１］～［２ｃ］のいずれかに記載の改変体。
［３ａ］　前記ポリペプチドがさらに１つ以上のシグナルペプチドを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の改変体。
［３ｂ］　前記シグナルペプチドが、Ｔ細胞受容体鎖の定常領域のＮ末端に結合している、［３ａ］に記載の改変体。
［３ｃ］　前記シグナルペプチドが、ＣＤ８および／またはＩＧＨのシグナルペプチドである、［３ａ］に記載の改変体。
［４］　［１］～［３ｃ］のいずれかに記載の改変体をコードする核酸分子。
［５］　［４］に記載の核酸分子を含む、ベクター。
［６］　［５］に記載のベクターを導入する工程を含む、細胞の製造方法。
［６ａ］　［１］～［３ｃ］のいずれかに記載の改変体をコードする核酸を含む多能性幹細胞。
［６ｂ］　前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（iPS細胞）である、［６ａ］に記載の細胞。
［７］　［１］～［３ｃ］のいずれかに記載の改変体を発現する細胞。
　本発明のＴ細胞受容体の改変体は、細胞に導入されると、該細胞のアロ反応性を抑制することができるため、同種移植における移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを低減することができる。
図１は、ＴＣＲ鎖の可変領域を含まず、Ｃ領域を含むＴＣＲの改変体を発現するＴ細胞について、フローサイトメトリーを用いて細胞膜表面上のＣＤ３分子の発現を検出した結果を示す。横軸はCD3分子の細胞膜表面発現、縦軸は細胞数をそれぞれ示す。 図２は、レンチウイルスベクターを用いてＡＢ６を遺伝子導入したｉＰＳ細胞から分化させた細胞膜上に発現するＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７およびαβＴＣＲの発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示す。
（発明の詳細な説明）
１．Ｔ細胞受容体の改変体
　本発明は、α鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖からなる群から選択されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の定常領域を含むポリペプチドを２つ組み合わせてなる、Ｔ細胞受容体の改変体（以下「本発明の改変体」と称する場合がある）を提供する。本発明の改変体は、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は同一種類の鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）（好ましくは該ＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部）をいずれも含まないこと、および、定常領域が由来するＴ細胞受容体鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は同一種類の鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）（好ましくは該ＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部）を含まないことを特徴とする。従って、本発明の改変体には、天然型又は人工型（例えば、定常領域と可変領域の由来となる動物種が異なる）のαβＴＣＲ、γδＴＣＲ、あるいはこれらのＴＣＲにアミノ酸がさらに付加されたＴＣＲ改変体は包含されない。例えば、本発明の改変体の少なくとも一方の鎖に該当するポリペプチドが、Ｔ細胞受容体α鎖の定常領域を含む場合には、該ポリペプチドには、Ｔ細胞受容体α鎖のＣＤＲ、好ましくは該ＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部、を含まないが、α鎖およびβ鎖以外、の異なるＴＣＲ鎖、例えばγ鎖、δ鎖のＣＤＲや可変領域は含んでいてもよい。同様に、本発明の改変体の少なくとも一方の鎖に該当するポリペプチドが、Ｔ細胞受容体β鎖の定常領域を含む場合には、該ポリペプチドには、Ｔ細胞受容体β鎖のＣＤＲ、好ましくは該ＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部、を含まないが、α鎖およびβ鎖以外、の異なるＴＣＲ鎖、例えばγ鎖、δ鎖のＣＤＲや可変領域は含んでいてもよい。γ鎖及びδ鎖についても同様である。本発明の一態様において、Ｔ細胞受容体β鎖は、Ｔ細胞受容体β１鎖（配列番号２）またはＴ細胞受容体β２鎖（配列番号３）を含む。本発明の一態様において、Ｔ細胞受容体β鎖はＴ細胞受容体β１鎖（配列番号２）およびＴ細胞受容体β２鎖（配列番号３）を含む。
　また、本発明のポリペプチドはさらに、膜移行シグナルペプチド（以下、「シグナルペプチド」と称する）が付加されていてもよい。シグナルペプチドとしては、ＣＤ８、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｈ（ＩＧＨ）、ＣＤ４の他、膜貫通ドメインを有する各種ペプチドをコードする遺伝子に由来する膜移行シグナルペプチド及び／または、当該シグナルペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／若しくは付加されたアミノ酸配列、もしくは当該シグナルペプチドのアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナルペプチドを使用することができる。シグナルペプチドが付加する場合の結合位置およびシグナルペプチドの数は特に限定されない。
　本明細書において、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」とは、ＴＣＲ鎖（α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖）のダイマーから構成され、抗原又は該抗原－ＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）（ＭＨＣ；主要組織適合遺伝子複合体）複合体を認識してＴ細胞へ刺激シグナルを伝達する受容体を意味する。それぞれのＴＣＲ鎖は可変領域と定常領域から構成され、可変領域には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）が存在する。ＴＣＲの改変体は、各ポリペプチドが上記ＴＣＲ鎖の定常領域を少なくとも含む、該ＴＣＲ鎖のダイマーを意味する。
　本発明の一態様において、本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドがＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域（Ｃ領域ともいう）を含み、他方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含む改変体が提供される。該改変体は、一方のポリペプチドがＴＣＲγ鎖のＣＤＲ、好ましくは該ＣＤＲを含むＴＣＲγ鎖の可変領域の一部又は全部、及び／又はＴＣＲδ鎖のＣＤＲ、好ましくは該ＣＤＲを含むＴＣＲδ鎖の可変領域の一部又は全部、を含んでいることが好ましい。かかる可変領域の少なくとも一部を含む場合、好ましくは、本発明の改変体を構成する少なくとも一方のポリペプチドの定常領域がＴＣＲα鎖又はβ鎖の定常領域であり、かつＣＤＲがγ鎖又はδ鎖のＣＤＲであることが好ましい。より好ましくは、本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドの定常領域がＴＣＲα鎖の定常領域であり、ＣＤＲがγ鎖のＣＤＲであり、かつ他方のポリペプチドの定常領域がＴＣＲβ鎖の定常領域であり、ＣＤＲがδ鎖のＣＤＲである。
　本発明の一態様として、ＴＣＲ鎖のＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部を含まず、Ｃ領域を含む改変体が提供される。該改変体は例えば、一方のポリペプチドがＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含み、他方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含むことができる。また、該改変体は、例えば、一方のポリペプチドがＴ細胞受容体γ鎖又はδ鎖の定常領域を含み、他方がＴ細胞受容体γ鎖又はδ鎖の定常領域を含むことができる。また、該改変体は例えば、一方のポリペプチドがＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含み、他方がＴ細胞受容体γ鎖又はδ鎖の定常領域を含むことができる。
　本発明の改変体を構成するポリペプチドとして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列からなるＴＣＲα鎖の定常領域を含むポリペプチド（以下「ポリペプチド１」と称する）が挙げられる。また、本発明の改変体を構成するポリペプチドとして、例えば、配列番号２または３で示されるアミノ酸配列、配列番号２または３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号２または３で示されるアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列からなるＴＣＲβ鎖の定常領域を含むポリペプチド（以下それぞれ「ポリペプチド２」及び「ポリペプチド３」と称する）が挙げられる。本発明の好ましい実施態様において、本発明の改変体は、前記ポリペプチド１（ＴＣＲα鎖の定常領域）及びポリペプチド２（ＴＣＲβ１鎖の定常領域）、または前記ポリペプチド１（ＴＣＲα鎖の定常領域）及びポリペプチド３（ＴＣＲβ２鎖の定常領域）からなる。
　本発明の一実施形態として、ＴＣＲ鎖のＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部を含まず、Ｃ領域を含むポリペプチド（例えば、前記ポリペプチド１及びポリペプチド２、または前記ポリペプチド１及びポリペプチド３からなる改変体）をより効率的に細胞膜表面上に発現させるために、少なくともいずれかのポリペプチドにさらにシグナルペプチドが付加されていることが好ましい。シグナルペプチドとしては、ＣＤ８、ＩＧＨが好ましい。シグナルペプチドが付加する場合の結合位置は特に限定されず、ＴＣＲのＣ領域を含むポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に付加することが好ましく、Ｎ末端に付加することがより好ましい。シグナルペプチドが付加する場合のシグナルペプチドの数は特に限定されず、各ポリペプチドに対して１つ以上付加することが好ましく、１つ付加することが好ましい。
　シグナルペプチドとしては、例えば、配列番号４（ＣＤ８）または５（ＩＧＨ）で示されるアミノ酸配列、配列番号４または５で示されるアミノ酸配列においてそれぞれ１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号４または５で示されるアミノ酸配列とそれぞれ同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナルペプチド（以下それぞれ「シグナルペプチド４」および「シグナルペプチド５」と称する）が挙げられる。
　本発明の好ましい実施態様において、本発明の改変体は、前記シグナルペプチド５がポリペプチド１のＮ末端に付加した、配列番号８もしくは１１で示されるポリペプチド（以下、「ポリペプチド８」および「ポリペプチド１１」と称する）、および前記シグナルペプチド４がポリペプチド２のＮ末端に付加した、配列番号７もしくは１０で示されるポリペプチド（以下、「ポリペプチド７」および「ポリペプチド１０」と称する）からなる。
　また、本発明の別の好ましい実施態様において、ポリペプチド８もしくはポリペプチド１１、および前記シグナルペプチド４がポリペプチド３のＮ末端に付加した、配列番号１３もしくは１５で示されるポリペプチド（以下、「ポリペプチド１３」および「ポリペプチド１５」と称する）からなる。
　また、本発明の改変体を構成するポリペプチドとして、ＴＣＲγ鎖の可変領域を含むポリペプチドが挙げられる。また、本発明の改変体を構成するポリペプチドとして、ＴＣＲδ鎖の可変領域を含むポリペプチドが挙げられる。
　本明細書において、「同一性」とは、90％以上の（例：91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％又はそれより高い）同一性を意味する。アミノ酸配列の同一性は、以下の条件下（expectancy =10; gap allowed; matrix=BLOSUM62; filtering=OFF）で、相同性計算アルゴリズムのNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて計算することができる。同一性を決定するため、全長にわたる本発明の配列を別の配列と比較することが理解される。言い換えれば、本発明における同一性は、本発明の配列の短い断片（例えば１～３アミノ酸）を別の配列と比較すること、又はその逆を除外する。
　本発明の改変体に含まれるＴＣＲ鎖の定常領域、可変領域及びＣＤＲの由来は、特に制限されないが、動物哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト）に由来するものが好ましく、なかでもヒトに由来するものがより好ましい。
　また、本発明の改変体に含まれるＴＣＲ鎖の定常領域は、天然型のＴＣＲ鎖の定常領域において、所定の改変が施されていることが好ましい。この改変としては、例えば、天然型のＴＣＲの定常領域の特定のアミノ酸残基をシステイン残基に置換（例：配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる定常領域の48番目のスレオニン（トレオニン）をシステインに置換、配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる定常領域の56番目又は55番目のセリンをシステインに置換）することで、α鎖とβ鎖間のジスルフィド結合によるダイマー発現効率を亢進することなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、２つのポリペプチドが１つ以上、好ましくは２つ以上のジスルフィド結合で結合されていることが好ましく、該ジスルフィド結合は、改変体の各ポリペプチドの含まれるシステイン残基（天然型に含まれているものでもよいし、上述のように人工的に導入したものでもよい）間で、酸化又は翻訳後修飾により形成される。
　本発明の改変体は、後述する本発明の核酸又はベクターを使用して遺伝子工学的に作製することができる。例えば、本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドをコードする核酸及び他方のポリペプチドをコードする核酸の両方を細胞に導入して、各ポリペプチドを発現させてダイマーを形成させ、自体公知の方法により該ダイマーを単離することで作製することができる。
２．本発明の改変体をコードする核酸又は該核酸を含むベクター
　本発明は、上述した本発明のＴＣＲをコードする核酸（以下「本発明の核酸」と称する場合がある）を提供する。本発明の核酸としては、本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドをコードする核酸と、他方のポリペプチドをコードする核酸とは、別の分子に含まれていてもよく、両方のポリペプチドをコードする核酸が単一の分子に含まれていてもよい。
　本発明の核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ/ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。核酸がＲＮＡである場合は、ＲＮＡの配列については、配列表におけるＴをＵと読み替えることとする。また、本発明の核酸は、ｉｎｖｉｔｒｏ又は細胞中で、ポリペプチドを発現できる限り、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はこれらの混合物を含んでもよい。
　本発明の核酸は、自体公知の方法により作製することができ、例えば、ＴＣＲ鎖の公知のＤＮＡ配列情報に基づいて、当該配列の所望の部分をカバーするようにオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該配列を有する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＲＴ－ＰＣＲ法によって増幅することにより、クローニングすることができる。あるいは、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法（オーバーラップＰＣＲ法）やＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ法を利用して接続することにより、その全長又は一部をコードするＤＮＡを構築することが可能である。
　本発明の核酸は、発現ベクターに組み込むことができる。従って、本発明は、上述した本発明の核酸を含む発現ベクター（以下「本発明のベクター」と称する場合がある）を提供する。
　本発明のベクターに使用されるプロモーターとしては、例えば、ユビキチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ-ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ユビキチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭｏＭｕＬＶＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
　本発明のベクターは、上記プロモーターの他に、所望により、転写及び翻訳調節配列、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子などを含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
　本発明の一態様において、上述した本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドをコードする核酸と、他方のポリペプチドをコードする核酸とを含む発現ベクターを標的細胞内に導入し、細胞内や細胞表面に両方のポリペプチドのヘテロダイマーを構成することができる。この場合において、本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドをコードする核酸と、他方のポリペプチドをコードする核酸は、別々の発現ベクターに組み込んでもよいし、１つの発現ベクターに組み込んでもよい。1つの発現ベクターに組み込む場合には、これら２種類の核酸は、ポリシストロニック発現を可能にする配列を介して組み込むことが好ましい。ポリシストロニック発現を可能にする配列を用いることにより、1種類の発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする配列としては、例えば、２Ａ配列（例：口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａ配列（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）由来の２Ａ配列（Ｅ２Ａ）、Ｐｏｒｃｉｎｅｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ－１）由来の２Ａ配列（Ｐ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ　ｖｉｒｕｓ（ＴａＶ）由来の２Ａ配列（Ｔ２Ａ））（PLoS ONE, 3:e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007等）、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）（U.S. Patent No. 4,937,190）などが挙げられるが、均一な発現量の観点からは、２Ａ配列が好ましい。また、２Ａ配列のうち、Ｐ２Ａ配列およびＴ２Ａ配列が好ましい。
　本発明に用いることができる発現ベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターやシュードタイプベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルス、エピソーマルベクターなどが挙げられる。また、トランスポゾン発現システム（例：ＰｉｇｇｙＢａｃシステム）を用いてもよい。プラスミドベクターとしては、動物細胞発現プラスミド（例：ｐａ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ/ＣＭＶ、ｐＲｃ/ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ/Ｎｅｏ）などが挙げられる。
３．本発明の改変体を発現するＴ細胞
　本発明は、本発明の核酸又はベクターが導入された細胞（以下「本発明の細胞」と称する場合がある）を提供する。本発明の細胞は、本発明の改変体を発現していることが好ましい。
　本発明の核酸又は発現ベクターを導入する細胞としては、例えば、リンパ球、リンパ球の前駆細胞、多能性幹細胞が挙げられる。本発明において、「リンパ球」とは、脊椎動物の免疫系における白血球のサブタイプの一つを意味し、リンパ球としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が挙げられる。本発明の核酸又はベクターを導入する細胞としては、多能性幹細胞が好ましい。
　本発明において、「Ｔ細胞」とは、ＣＤ３陽性細胞を意味する。本発明の改変体を発現するＴ細胞としては、例えば、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞などが挙げられるが、好ましくは、細胞傷害性Ｔ細胞である。本発明の改変体を発現するＴ細胞は、生体より採取されたＴ細胞に、本発明の核酸又はベクターを導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の核酸又はベクターが導入された、多能性幹細胞又はリンパ球の前駆細胞からＴ細胞へ分化誘導することで、本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞（即ち、該多能性化細胞又は前駆細胞に由来するＴ細胞）を得ることができる。
　本発明の一形態において、Ｔ細胞はＣＤ３に加えて、ＣＤ５および／またはＣＤ７を発現する場合がある。ＣＤ５および／またはＣＤ７は生体内のＴ細胞においてもその細胞表面に発現する場合がある。Ｔ細胞がＣＤ５および／またはＣＤ７を発現する場合、ＣＤ３はＴ細胞において、ＴＣＲと複合体を形成することにより細胞表面に発現するのに対し、ＣＤ５およびＣＤ７はＴＣＲ分子と複合体を形成することなく発現する。
　本発明の細胞（例：細胞傷害性Ｔ細胞）は、該細胞が本来有するＴＣＲ遺伝子に加えて、本発明の核酸又はベクターに由来する外因性のＴＣＲ遺伝子も有する。この点において、本発明の細胞は、生体より採取された細胞とは異なる。本発明の細胞は、本発明の改変体に加えて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現していてもよい。
　前記リンパ球は、ヒト又は非ヒト哺乳動物の例えば末梢血、骨髄及び臍帯血より採取することができる。本発明の改変体を発現する細胞を、癌などの疾患の治療に用いる場合には、当該細胞集団は治療対象本人、又は治療対象のＨＬＡタイプと一致したドナーから採取することが好ましい。
　リンパ球の前駆細胞としては、例えば、造血幹細胞、自己複製能を失った多能性前駆細胞（multipotent progenitor：ＭＭＰ）、ミエローリンフォイド共通前駆細胞（ＭＬＰ）、ミエロイド系前駆細胞（ＭＰ）、顆粒球単核前駆細胞（ＧＭＰ）、マクロファージ－樹状細胞前駆細胞（ＭＤＰ）、樹状細胞前駆細胞（ＤＣＰ）などが挙げられる。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）などが挙げられる。上記多能性幹細胞がＥＳ細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
　本明細書において、「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ES細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「iPS細胞」と称することもある）が挙げられる。
　「ES細胞」としては、マウスES細胞であれば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞であれば、NIH、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。たとえば、ヒトES細胞株としては、NIHのCHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCell ResearchのH1株、H9株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。
　本明細書において、「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPS細胞（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPS細胞（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPS細胞（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPS細胞（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPS細胞（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　人工多能性細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPS細胞株が利用可能である。例えば、ヒトiPS細胞株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学の253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、FfI-01s04株等が挙げられる。
　本発明において、「造血前駆細胞」とは、血球系細胞に分化し得る多能性幹細胞（multipotent stem cell）である。ヒトでは、主として骨髄に存在し、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、マクロファージ）、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞に分化する。また本発明において、「造血前駆細胞」とは、ＣＤ３４陽性細胞を意味し、好ましくは、ＣＤ３４/ＣＤ４３両陽性（ＤＰ）細胞である。本発明に用いる造血前駆細胞の由来は制限されず、例えば、下述の方法により、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる造血前駆細胞であってもよく、また、生体組織から、公知の手法により単離した造血前駆細胞であってもよい。
　多能性幹細胞又はリンパ球の前駆細胞に本発明の核酸又は発現ベクターを導入する場合、該細胞は、自体公知の方法により、リンパ球、好ましくはＴ細胞に分化させることが好ましい。多能性幹細胞をＴ細胞に分化させる方法として、例えば、(1)本発明の核酸又はベクターが導入された多能性幹細胞を、造血前駆細胞に分化させる工程、及び(2)該造血前駆細胞をＴ細胞に分化させる工程を含む方法が挙げられる。前記工程(1)は、例えば、国際公開第２０１３／０７５２２２号、国際公開第２０１６／０７６４１５号及びLiu S.et al., Cytotherapy, 17 (2015);344-358などに記載されているように、造血前駆細胞への誘導培地中で多能性幹細胞を培養する方法が挙げられる。また、前記工程(2)は、国際公開第２０１６／０７６４１５号などに記載されているような、(2-1)造血前駆細胞からＣＤ４ＣＤ８両陽性T細胞を誘導する工程、及び(2-2)ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞からＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導する工程を含む方法が挙げられる。
　本発明の核酸又はベクターを細胞に導入する方法に特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。核酸やプラスミドベクターを導入する場合には、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより行うことができる。例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)、日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）, 第119巻 (第6号), 345-351 (2002) などに記載の方法を用いることができる。ウイルスベクターを用いる場合には、本発明の核酸を適当なパッケージング細胞（例、Ｐｌａｔ－Ｅ細胞）や相補細胞株（例、２９３細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させることで、細胞に導入することができる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が、国際公開第２００７/６９６６６号、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007)などに開示されている。また、ベクターとしてレンチウイルスを用いる具体的手段が、Zufferey R. et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-895 (1997)などに開示されている。特に、レトロウイルスベクターを用いる場合には、組換えフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ－２９６（タカラバイオ社製）を用いることにより、各種細胞に対して、高効率な遺伝子導入が可能となる。あるいは、ゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなど）により、本発明の核酸又はベクターを細胞のゲノムに導入してもよい。
　本発明の核酸はまた、ＲＮＡの形態で直接細胞に導入し、細胞内で本発明の改変体を発現するために用いてもよい。ＲＮＡの導入方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、リポフェクション法や電気穿孔法などが好適に使用できる。
　本発明の改変体の発現は、例えば、本発明の改変体の一部（例：ＴＣＲ鎖の定常領域等）を認識する抗体を用いて、免疫学的手法により検出又は測定することができる。免疫学的手法としては、例えば、抗体アレイ、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法などが挙げられる。
　本発明の改変体により、細胞のアロ反応性が抑制されることは、自体公知の方法により確認することができる。例えば、本発明の改変体を発現する細胞と、該改変体を発現しない対象の細胞とで、混合白血球反応（ＭＬＲ）、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、限界希釈アッセイ（Ｌｉｍｉｔｔｉｎｇｄｉｌｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）等を行い、該改変体を発現する細胞において、少なくともいずれかのアッセイでアロ反応性が低い結果となった場合に、本発明の改変体によりアロ反応性が抑制されたと評価することができる。
４．本発明の細胞の製造方法
　本発明は、本発明の核酸又はベクターを細胞に導入する工程を含む、細胞の製造方法（以下「本発明の製法」と称する場合がある）を提供する。本発明の核酸又はベクターが導入される細胞、導入方法等は、上記３．に記載の通りである。前記細胞は、本発明の改変体を発現していることが好ましい。本発明の改変体の発現は、上記３．に記載の方法により検出又は測定することができる。
　本発明の製法の一態様において、（１）本発明の核酸又はベクターが導入された多能性幹細胞を、造血前駆細胞に分化させる工程、及び（２）該造血前駆細胞をＴ細胞に分化させる工程を含む、Ｔ細胞の製法が提供される。
（１）多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる工程（工程（１））
　多能性幹細胞から造血前駆細胞への分化方法としては、造血前駆細胞へ分化できる限り特に制限されないが、例えば、国際公開第２０１３／０７５２２２号、国際公開第２０１６／０７６４１５号及びLiu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015);344-358などに記載されているように、造血前駆細胞への誘導培地中で多能性幹細胞を培養する方法が挙げられる。
　本発明において、造血前駆細胞への誘導培地は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）、これらの混合培地などが挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清で使用してもよい。必要に応じて、基礎培地には、例えば、ビタミンＣ類（例：アスコルビン酸）、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどが含まれていてもよい。
　本発明においてビタミンＣ類とは、L-アスコルビン酸及びその誘導体を意味し、L-アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンCとなるものを意味する。本発明に用いるアスコルビン酸の誘導体として、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコビル、ステアリン酸アスコビル及びアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が例示される。好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-L-アスコルビン酸Na又はリン酸-L-アスコルビン酸Mgなどのリン酸-L-アスコルビン酸塩が挙げられる。
　工程（１）で用いる好ましい基礎培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、L-グルタミン、アスコルビン酸を含むIMDM培地である。
　工程（１）で用いる培地は、BMP4 (Bone morphogenetic protein 4)、VEGF (vascular endothelial growth factor)、SCF (Stem cell factor)及びFLT-3L (Flt3 Ligand)からなる群より選択される少なくとも１種類のサイトカインがさらに添加されていてもよい。より好ましくは、VEGF、SCF及びFLT-3Lを添加した培地である。
　工程（１）でビタミンC類を用いる場合、ビタミンＣ類は、４日毎、３日毎、２日毎、又は１日毎に、別途添加（補充）することが好ましく、１日毎に添加することが好ましい。当該ビタミンC類の培地中の濃度は、特に制限されないが、5 ng/ml～500 ng/mlに相当する量（例：5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/mlに相当する量）であることが好ましい。
　工程（１）でBMP4を用いる場合、培地中のBMP4の濃度は、特に制限されないが、10 ng/ml～100 ng/ml（例：10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、20 ng/ml～40 ng/mlであることがより好ましい。
　工程（１）でVEGFを用いる場合、培地中のVEGFの濃度は、特に制限されないが、10 ng/ml～100 ng/ml（例：10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、20 ng/mlが好ましい。
　工程（１）でSCFを用いる場合、培地中のSCFの濃度は、特に制限されないが、10 ng/ml～100 ng/ml（例：10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、30 ng/mlが好ましい。
　工程（１）でFLT-3Lを用いる場合、培地中のFLT-3Lの濃度は、特に制限されないが、1 ng/ml～100 ng/ml（例：1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、10 ng/mlが好ましい。
　工程（１）において、多能性幹細胞の培養は、接着培養又は浮遊培養であってもよく、接着培養の場合、コーティング剤をコーティングした培養容器を用いて行ってもよく、また他の細胞と共培養してもよい。共培養する他の細胞として、C3H10T1/2（Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010）、異種由来のストローマ細胞（Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77.）が例示される。コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One.6(7):e22261, 2011）が例示される。浮遊培養では、Chadwick et al. Blood 2003, 102: 906-15、Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4: 248-62、及びSaeki et al. Stem Cells 2009, 27: 59-67に記載の方法が例示される。
　工程（１）において、培養温度の条件は、特に制限されないが、例えば、37℃～42℃程度、37℃～39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であれば造血前駆細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも6日間以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上であり、好ましくは14日である。培養期間が長いことについては、造血前駆細胞の製造においては通常問題とされないが、例えば３５日以下が好ましく、２１日以下がより好ましい。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明において低酸素条件とは、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％又はそれら以下の酸素濃度が例示される。
（２）造血前駆細胞をＴ細胞に分化させる工程（工程（２））
　造血前駆細胞からＴ細胞への分化方法としては、造血前駆細胞をＴ細胞へ分化できる限り特に制限されないが、例えば、国際公開第２０１６／０７６４１５号などに記載されているような、（２－１）造血前駆細胞からＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞を誘導する工程、及び（２－２）ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞からＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導する工程を含む方法が挙げられる。造血前駆体は、工程（１）により得られた細胞集団から、造血前駆細胞のマーカーを用いてあらかじめ単離することが好ましい。該マーカーとしては、ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３１及びＣＤ１４４からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
（２－１）造血前駆細胞からＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞を誘導する工程（工程（２－１））
　本発明において、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞への分化方法としては、例えば、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞への誘導培地中で造血前駆細胞を培養する方法が挙げられる。
　本発明において、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞への分化誘導培地としては、特に制限されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地には、上記工程（１）で用いたものと同様のものが挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清で使用してもよい。必要に応じて、基礎培地には、例えば、ビタミンＣ類、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどが含まれていてもよい。
　工程（２－１）で用いる好ましい基礎培地は、血清、トランスフェリン、セリン、及びL-グルタミンを含むαMEM培地である。基礎培地へビタミンＣ類を添加する場合、ビタミンC類は、工程（１）の場合と同様である。
　工程（２－１）で用いる培地は、サイトカインであるFLT-3L及び／又はIL-7をさらに含んでいてもよく、より好ましくは、FLT-3L及びIL-7を添加した培地である。
　工程（２－１）でIL-7を用いる場合、培地中のIL-7の濃度は、1 ng/ml～50 ng/ml（例：1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、5 ng/mlが好ましい。
　工程（２－１）でFLT-3Lを用いる場合、FLT-3Lは、上記工程(1)と同様に用いることができる。
　工程（２－１）において、造血前駆細胞を接着培養又は浮遊培養してもよく、接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよく、またフィーダー細胞等と共培養してもよい。共培養するフィーダー細胞として、骨髄間質細胞株ＯＰ９細胞（理研BioResource Centerより入手可能）が例示される。当該ＯＰ９細胞は、好ましくは、ＤＬＬ４又はＤＬＬ１を恒常的に発現するＯＰ９－ＤＬ４細胞又はＯＰ９－ＤＬ１細胞である（例えば、Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC. Cold Spring Harb Protoc. 2009）。本発明において、フィーダー細胞としてＯＰ９細胞を用いる場合、別途用意したＤＬＬ４若しくはＤＬＬ１、あるいはＤＬＬ４若しくはＤＬＬ１とＦｃ等との融合タンパク質を適宜培地に添加することにより行ってもよい。フィーダー細胞を用いる場合、当該フィーダー細胞を適宜交換して培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞の交換は、予め播種したフィーダー細胞上へ培養中の対象細胞を移すことによって行い得る。当該交換は、5日毎、4日毎、3日毎、又は2日毎にて行い得る。また、胚様体を浮遊培養して造血前駆細胞を得た場合は、これを単細胞に解離させたのちに、接着培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞と共培養してもよいが、好ましくはフィーダー細胞を用いずに培養を行う。
　接着培養の場合であって、培養容器をコーティングする場合のコーティング剤としては、例えば、マトリゲル（Niwa A, et al. PLos One, 6(7):e22261, 2011））、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、レトロネクチン、ＤＬＬ４若しくはＤＬＬ１、あるいはＤＬＬ４若しくはＤＬＬ１と抗体のＦｃ領域等との融合タンパク質（例：ＤＬＬ４／Ｆｃｃｈｉｍｅｒａ）、エンタクチン、及び／又はこれらの組み合わせが挙げられ、レトロネクチン及びＤＬＬ４とＦｃ領域等との融合タンパク質の組み合わせが好ましい。
　工程（２－１）において、培養温度の条件は、特に制限されないが、例えば、37℃～42℃程度、37℃～39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であればＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも10日間以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、23日以上であり、好ましくは23日である。また、90日以下が好ましく、42日以下がより好ましい。
（２－２）ＣＤ４ＣＤ８両陽性(ＤＰ)Ｔ細胞からＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＤ３シングルポジティブＴ細胞）を誘導する工程（工程（２－２））
　工程（２－１）により得られたＣＤ４/ＣＤ８ＤＰＴ細胞を、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に分化誘導する工程に付すことにより、ＣＤ８陽性Ｔ細胞へ分化誘導することができる。
　工程（２－２）で用いる基礎培地及び培地としては、工程（１）に記載された基礎培地及び培地と同様のものが挙げられる。
　前記培地は、副腎皮質ホルモン剤を含んでいてもよい。副腎皮質ホルモン剤としては、例えば、糖質コルチコイド及びその誘導体などが挙げられ、該糖質コルチコイドとしては、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。なかでも、デキサメタゾンが好ましい。
　副腎皮質ホルモン剤としてデキサメタゾンを用いる場合、培地中のデキサメタゾンの濃度は、1nM～100nM（例：1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM）が好ましく、なかでも、10nMが好ましい。
　前記培地は、抗体（例：抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD2抗体）、サイトカイン（例：IL-7、IL-2、IL-15）などを含有していてもよい。
　工程（２－２）で抗ＣＤ３抗体を用いる場合、該抗ＣＤ３抗体としては、ＣＤ３を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、ＯＫＴ３クローンから産生される抗体が挙げられる。抗ＣＤ３抗体は、磁気ビーズ等が結合されているものであってもよく、また、前記抗ＣＤ３抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体を表面に結合させた培養容器上で該Ｔリンパ球を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。抗ＣＤ３抗体の培地中における濃度は、10ng/ml～1000ng/ml（例：10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、700 ng/ml、800 ng/ml、900 ng/ml、1000 ng/ml）が好ましく、なかでも、500 ng/mlが好ましい。その他の抗体の濃度についても、当業者は、培養条件等に基づき、適宜決定することができる。
　工程（２－２）でIL-2を用いる場合、培地中におけるIL-2の濃度は、10 U/ml～1000 U/ml（例：10 U/ml、20 U/ml、30 U/ml、40 U/ml、50 U/ml、60 U/ml、70 U/ml、80 U/ml、90 U/ml、100 U/ml、200 U/ml、500 U/ml、1000 U/ml）が好ましく、なかでも、100 U/mlが好ましい。工程(2-2)で用いるIL-7又はIL15の培地中における濃度は、1 ng/ml～100 ng/ml（例：1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）が好ましく、なかでも、10 ng/mlが好ましい。
　工程（２－２）において、培養温度の条件は、特に制限されないが、37℃～42℃程度が好ましく、37℃～39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればＣＤ８陽性Ｔ細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することができる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、1日以上、3日以上、7日以上が好ましく、60日以下が好ましく、35日以下がより好ましい。
　また別の態様において、本発明は、本発明の核酸又はベクターを細胞に導入する工程を含む、該細胞におけるアロ反応性を低減する方法を提供する。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明はこれらに限定されない。
［実施例１］αβＴＣＲの定常領域を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を有さないＴＣＲの改変体をコードする核酸を含むＬｅｎｔｉＶベクターの作製
　N末端にCD8分子の膜移行シグナルペプチドを付加した各α鎖（ＴＲＡＣ）と、N末端にIGH分子の膜移行シグナルペプチドを付加した各β鎖（ＴＲＢＣ１もしくはＴＲＢＣ２）のアミノ酸をP2A配列で繋ぐポリペプチド鎖を設計した（表１AB5-AB8）。設計したポリペプチド鎖をコードするオリゴDNAを人工合成（GenScript）して、レンチウイルスベクタープラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した。レンチウイルスベクタータープラスミドは、pCDH-CMV-MCS-EF1a-Puro（SystemBioscience）のCMVプロモーターをヒトユビキチンプロモーターに置換したものを使用した。ウイルスベクター作製は、SIRION社に委託した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２］ＴＣＲの改変体を発現するT細胞の製造
　レトロネクチン（タカラバイオ社）でコートした２４ウェルプレートを用いて、４種類のＣＤ３遺伝子（γ、δ、εおよびζ）を強制発現させたK562細胞（K562-CD3細胞、国立癌研究センター植村先生に御供与いただいた）に、表1に示す各改変体をコードする遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターを感染させ、各改変体をコードする遺伝子を形質導入した。レンチウイルスベクターに感染させた後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。
［試験例１］上記ＴＣＲの改変体を発現するＴ細胞の細胞膜表面分子発現の評価
　［実施例２］で得られた、表1に示す各改変体を発現するＴ細胞について、抗ＣＤ３抗体（APC/Cy7, UCHT1, BioLegend）で染色した後、LSRFortessaTMX-20 (BD Bioscience社)フローサイトメトリーを用いて、細胞膜表面上のＣＤ３分子の発現を、フローサイトメトリーを用いて検出した（図１）。ＡＢ５により得られた細胞およびＡＢ７により得られた細胞においても、細胞膜表面上にＣＤ３の発現が認められた。またＡＢ６により得られた細胞およびＡＢ８により得られた細胞において、細胞膜表面上により強くＣＤ３の発現が認められた。
［実施例３］ＴＣＲの改変体を発現するｉＰＳ細胞由来のＴ細胞の製造
１．iPS細胞の準備
　iPS細胞には、京都大学iPS細胞研究所（CiRA）から供与されたiPS細胞（Ff-I01s04株：健常人末梢血単核球由来）を使用した。iPS細胞培養は、CiRAが配布するプロトコール「フィーダーフリーでのヒトiPS 細胞の培養」に準じて行った。
２．αβＴＣＲの定常領域を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を有さないＴＣＲの改変体をコードする核酸を含むＬｅｎｔｉ Ｖベクターの作製
　pLVSIN-CMV Neo（クロンテック社）からネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列を除去し、CMVプロモーターをヒトユビキチンプロモーターに置換したpLVSIN-Ubを用いたレンチウイルスベクターを作製した。上記で合成したAB6をコードする人工オリゴDNAをpLVSIN-Ubレンチウイルスベクターのマルチクローニングサイトに組込んだ。このプラスミドとクロンテック社のLenti-XTM 293T細胞株およびLenti-XTMPackaging Single Shots (VSV-G）を用いてレンチウイルスベクターを作製した。
３．iPS細胞への改変型T細胞受容体遺伝子の導入
　［実施例１］で作成したAB6を組み込んだレンチウイルスベクターを、iPS細胞に感染させることで、改変型T細胞受容体遺伝子の該細胞への導入を行った。
　作製したレンチウイルスベクターを、［実施例３］１．で準備したiPS細胞に感染させることにより、改変TCR遺伝子をiPS細胞に導入した。以下、改変TCR遺伝子が導入されたiPS細胞を「tTCR-iPSC」ということがある。
４．iPS細胞の造血前駆細胞（HPC）への分化
　iPS細胞の造血前駆細胞(HPC)への分化は、公知の方法（例えば、Cell Reports 2(2012)1722-1735や国際公開第2017/221975号に記載された方法）に準じて行った。具体的には、［実施例３］３．で得られたtTCR-iPSCを、それぞれ超低接着処理された6 well plateに3 ｘ 105cells/wellで播種し、EB培地(StemPro34に10 μg/mlヒトインスリン、5.5 μg/mlヒトトランスフェリン、5 ng/ml 亜セレン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、45 mM α-モノチオグリセロー ル、および50 μg/ml Ascorbic acid 2-phosphate を添加）に10 ng/ml BMP4、50 ng/ml bFGF、15 ng/ml VEGF、2 μM SB431542、を加えて、低酸素条件下（5% O2) にて5日間培養を行った。続いて、50 ng/ml SCF、30 ng/ml TPO、10 ng/ml Flt3Lを添加し、さらに5～9日間培養を行い、浮遊細胞集団を得た。なお、培養期間中は2日または3日ごとに培地交換を行った。HPCを含む上記浮遊細胞集団を、表２の抗体セットを用いて染色した。上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
５．HPCのT細胞への分化
　［実施例３］４．で得られた細胞分画を、公知の方法（例えば、Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175や国際公開第2017/221975号に記載された方法）に準じて、リンパ球系細胞へ分化させた。具体的には、造血前駆細胞集団を、2000 cells/wellで、Recombinant h-DLL4/Fc chimera（SinoBiological）とRetronectin（タカラバイオ）をコートした48-well-plateに2000cells/wellで播種し、5%CO2、37℃条件下に培養した。培養期間中は2日または3日ごとに培地交換を行った。なお、培地には、15% FBSと2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100 ng/mlストレプトマイシン、55 μΜ 2-メルカプトエタノール、50 μg/ml Ascorbic acid 2-phosphate、10 μg/mlヒトインスリン、5.5 μg/mlヒトトランスフェリン、 5 ng/ml亜セレン酸ナトリウム、50 ng/ml SCF、50 ng/ml IL-7、50 ng/ml Flt3L、100 ng/ml TPO、15μM SB203580、30 ng/ml SDF-1αを添加したαＭＥＭ培地を用いた。培養開始から7日目および14日目に同様のコートをした48-well-plateに継代した。培養開始21日目にすべての細胞を回収した。回収した細胞は、表３の抗体セットを用いて染色した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［試験例２］上記ＴＣＲの改変体を発現するＴ細胞の細胞膜表面分子発現の評価
　［実施例３］５．で得られた細胞について、細胞膜表面上のCD3、CD5、CD7、およびαβTCRの発現をフローサイトメーターで測定した（図２）。
　本明細書において、「含む（comprising）」又は「含む（comprise）」のような各用語は、任意選択で、「からなる（consisting of）」又は「からなる(consists of)」で置き換えられてもよい。
　本発明の改変体は、細胞に発現されると、該細胞のアロ反応性を抑制することができるため、同種移植における移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを低減することができる。即ち、本発明の改変体の導入は、Ｔ細胞療法におけるアロ反応性制御の一つのオプションとなり得る。
　本出願は、日本国で出願された特願２０１８－２４５２５３（出願日：２０１８年１２月２７日）を基礎としており、ここで言及することにより、それらの内容は本明細書に全て包含される。

Claims (7)

  1. 　α鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖からなる群から選択されるＴ細胞受容体鎖の定常領域を含むポリペプチドを２つ組み合わせてなる、Ｔ細胞受容体の改変体であって、該ポリペプチドが該Ｔ細胞受容体鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、α鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含まないことを特徴とする、改変体。
  2. 　前記ポリペプチドの一方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含み、他方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含む、請求項１に記載の改変体。
  3. 　２つのポリペプチドが１つ以上のジスルフィド結合で結合された、請求項１又は２に記載の改変体。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の改変体をコードする核酸分子。
  5. 　請求項４に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  6. 　請求項５に記載のベクターを導入する工程を含む、細胞の製造方法。
  7. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の改変体を発現する細胞。
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