CN114787351A - 通过Fc隔离的移植细胞保护 - Google Patents

Abstract

本发明首次提供了包含增强的CD16、CD32或CD64表达以逃避抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的细胞。所述细胞可以是多能细胞，包括低免疫多能细胞(HIP)或ABO血型O型恒河猴因子阴性HIP细胞(HIPO‑)，其还包含增强的CD16、CD32或CD64表达。本发明涵盖衍生自所述多能细胞的细胞。

Description

通过Fc隔离的移植细胞保护

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119(e)，要求2019年10月15日提交的美国临时申请第62/915,601号的优先权，该临时申请通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及再生细胞疗法。在一些实施方案中，再生细胞疗法包括将细胞系移植到有此需要的患者体内。在一些实施方案中，所述细胞系包含具有升高的CD16、CD32或CD64表达的多能细胞。在其它实施方案中，它们是低免疫原性的，具有O血型，或者是Rh因子阴性的。在其它实施方案中，所述再生细胞疗法降低了细胞移植受者的免疫系统排斥同种异体物质的倾向。在一些实施方案中，所述再生细胞疗法用于治疗受伤的器官和组织。在一些实施方案中，本发明的再生细胞疗法利用嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞或甲状腺细胞来治疗疾病或修复受损组织。

技术背景

再生细胞疗法是用于再生受损器官和组织的重要的潜在疗法。由于用于移植的器官的可获得性低以及伴随的漫长等待，通过将容易获得的细胞系移植到患者体内来再生组织的可能性可以理解地是具有吸引力的。再生细胞疗法已经在动物模型中显示出在移植后(例如心肌梗塞后)修复受损组织的有希望的初步结果。然而，移植受体的免疫系统排斥同种异体物质的倾向大大降低了治疗的潜在功效，并减少了围绕此类治疗的可能的积极作用。

自体诱导多能干细胞(iPSC)理论上构成了基于患者特异性细胞的器官修复策略的无限细胞来源。然而，它们的产生带来了技术和制造上的挑战，并且是在概念上阻止了任何急性治疗方式的漫长过程。从制造的角度来看，基于同种异体iPSC的疗法或基于胚胎干细胞的疗法更容易，并且允许产生良好筛选的、标准化的、高质量的细胞产品。然而，由于它们的同种异体来源，此类细胞产品会发生排斥。随着细胞抗原性的降低或消除，可以产生普遍可接受的细胞产品。因为多能干细胞可以分化成三胚层的任何细胞类型，所以干细胞疗法的潜在应用是广泛的。可以通过移植祖细胞来离体或体内进行分化，所述祖细胞在植入部位的器官环境中继续分化和成熟。离体分化允许研究人员或临床医生密切监控该过程，并确保在移植前产生合适的细胞群。

然而，在大多数情况下，未分化的多能干细胞由于其形成畸胎瘤的倾向而避免用于临床移植疗法。相反，此类疗法倾向于使用分化细胞(例如，干细胞衍生的心肌细胞移植到心力衰竭患者的心肌中)。此类多能细胞或组织的临床应用将受益于在细胞移植后控制所述细胞的生长和存活的“安全特征”。

本领域寻求能够产生用于再生或替代患病或缺陷细胞的细胞的干细胞。可以使用多能干细胞(PSC),因为它们快速繁殖并分化成许多可能的细胞类型。PSC家族包括通过不同技术产生并具有不同免疫原性特征的若干成员。患者与源自PSC的工程改造的细胞或组织的相容性决定了免疫排斥的风险和对免疫抑制的需求。

从胚泡的内细胞团分离的胚胎干细胞(ESC)表现出与受体不匹配的组织相容性抗原。这种免疫屏障不能被人白细胞抗原(HLA)分型的ESC库所解决，因为即使是HLA匹配的PSC移植物也会因为作为次要抗原的非HLA分子的不匹配而发生排斥。同种异体诱导多能干细胞(iPSC)也是如此。

低免疫原性多能(hypoimmunogenic pluripotent,HIP)细胞和细胞产物具有基因敲除或转基因，以保护它们免受包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞在内的免疫系统细胞组分的影响。它们也可能是ABO血型O型和Rh阴性(HIPO-)。

涉及抗体的两种最相关的杀伤机制是通过NK细胞、巨噬细胞、B细胞或粒细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和通过激活补体级联的补体依赖性细胞毒性(CDC)。所有这些杀伤机制都利用结合靶细胞并激活效应免疫细胞或补体的抗体(图1A)。IgG抗体可以是ADCC和CDC两者的强效介质。IgG抗体具有两个与特定表位结合的可变Fab区。可结晶的Fc区突出并用于结合NK细胞、B细胞、巨噬细胞、粒细胞或补体。

识别IgG的Fc部分的受体分为四个不同的类别：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIV。FcγRI对抗体恒定区表现出高亲和力并具有限制性同种型特异性，而FcγRII和FcγRIII对IgG的Fc区具有低亲和力，但具有更广泛的同种型结合模式，并且FcγRIV是最近鉴定的具有中等亲和力和限制性亚类特异性的受体。生理上，FcγRI在早期免疫反应期间发挥作用，而FcγRII和RIII在晚期免疫反应期间以围绕多价抗原的聚集体形式识别IgG。

如果抗体通过其Fab区与未受保护的细胞结合，则FC可被NK细胞(主要通过其CD16受体)、巨噬细胞(主要通过CD16、CD32或CD64)、B细胞(主要通过CD32)或粒细胞(主要通过CD16、CD32或CD64)结合，并介导ADCC。补体还可以与Fc结合并激活其级联，形成膜攻击复合物(MAC)用于CDC杀伤。

在人中，CD16为CD16A和CD16B，在胞外免疫球蛋白结合区(也称为FCGR3A和FCGR3B)具有96％序列相似性。对于FCGR3A，存在若干亚型，并且不存在明确的主要亚型。

多能细胞目前没有针对ADCC或CDC的保护作用。

发明内容

本发明首次提供了包含增强的CD16、CD32或CD64表达以逃避抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的细胞。鉴于通常不表达Fcγ受体的靶细胞中缺乏下游激活或抑制基序，CD64的高Fc亲和力用于保护性Fc隔离。Fcγ受体I-IV中的任一种或它们的组合的过表达也应该显示出一定或甚至增强的功效。

本发明提供了CD16、CD32或CD64的过表达隔离了局部抗体的Fc部分，从而抑制了ADCC和CDC。(图1B)。所述细胞可以是多能细胞，包括低免疫多能细胞(HIP)、ABO血型O恒河猴因子阴性HIP细胞(HIPO-)诱导的多能干细胞(iPSC)、O-型iPSC、胚胎干细胞(ESC)或O-型ESC，其中任一种还包含增强的CD64表达。

CD64仅在巨噬细胞和单核细胞上组成型存在，通常不在组织细胞上表达。其更通常地被称为Fcγ受体1(FcγRI)并以高亲和力结合IgG Fc区。靶细胞上的CD64过表达隔离了IgG Fc并使其与靶细胞结合，所述靶细胞不具有胞基元用于细胞活化。即使游离的Fab区域会结合邻近的靶细胞，但Fc的占据也会阻止任何ADCC或CDC。

因此，本发明提供了经修饰的多能细胞，其中所述经修饰的细胞与所述经修饰的多能细胞的亲代形式相比，具有提高的CD16、CD32或CD64蛋白表达水平，其中所述提高的蛋白表达导致所述经修饰的多能细胞对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)更不敏感。在一些方面，CD64蛋白与SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性。在其它方面，CD64蛋白具有SEQ ID NO:7的序列。在某些方面，CD16蛋白与SEQ ID NOS:9或10具有至少90％的序列同一性。在其它方面，CD16蛋白具有SEQ ID NOS:9或10的序列。在一些方面，CD32蛋白与SEQ ID NOS:11、12或13具有至少90％的序列同一性。在其它方面，CD32蛋白具有SEQ ID NOS:11、12或13的序列。

在本发明的一些方面，经修饰的细胞源自人低免疫原性多能(HIP)细胞、人低免疫原性多能ABO血型O恒河猴因子阴性(HIPO-)细胞、人诱导多能干细胞(iPSC)或人胚胎干细胞(ESC)。

在本发明的其它方面，经修饰的细胞来自选自人、猴、牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠和豚鼠的物种。

本发明提供了如本文所述的经修饰的多能细胞，其还包含被引发剂激活的自杀基因，所述自杀基因导致经修饰的细胞死亡。在一些方面，自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)，所述引发剂是更昔洛韦。在其它方面，HSV-tk基因编码与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的蛋白质。在一个优选方面，HSV-tk基因编码包含SEQ ID NO:4序列的蛋白质。在本发明的其它方面，自杀基因是大肠杆菌(Escherichia coli)胞嘧啶脱氨酶基因(EC-CD)，所述引发剂是5-氟胞嘧啶(5-FC)。在优选方面，EC-CD基因编码与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的蛋白质。在更优选方面，EC-CD基因编码包含SEQ ID NO:5序列的蛋白质。

在本发明的一些方面，所述自杀基因编码可诱导的半胱天冬酶蛋白，所述引发剂是二聚化的化学诱导剂(CID)。在优选方面，所述基因编码诱导型半胱天冬酶蛋白，该蛋白与SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性。在更优选方面，所述基因编码包含SEQ ID No:6的序列的诱导型半胱天冬酶蛋白。在另一个优选方面，所述CID是AP1903。

本发明提供了衍生自本文所述的经修饰的多能细胞的细胞，其中所述衍生细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。在一些方面，所述CAR细胞是CAR-T细胞。

本发明提供了一种方法，包括将衍生自本文公开的经修饰的多能细胞的细胞移植入受试者，其中所述受试者是人、猴、牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠。在一些方面，衍生自经修饰的多能细胞的细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。

本发明提供了一种治疗疾病的方法，其包括施用衍生自本文公开的经修饰的多能细胞的细胞。在一些方面，所述衍生细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。在其它方面，所述疾病选自I型糖尿病、心脏病、神经疾病、癌症、眼病、血管疾病和甲状腺疾病。

本发明提供了产生本文公开的经修饰的多能细胞的方法，其包括增加多能细胞的亲代非修饰形式中CD16、CD32或CD64的表达。在一些方面，所述经修饰的细胞具有人、猴、牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠或豚鼠来源。在一些方面，所述经修饰的多能细胞衍生自HIP细胞、HIPO-细胞、iPSC细胞或ESC细胞。

在本发明的一些方面，CD16、CD32或CD64表达的增加是将启动子控制下的至少一个拷贝的人CD16、CD32或CD64基因引入经修饰的多能细胞的亲代形式中而导致的。在优选方面，所述启动子是组成型启动子。

本发明提供了一种用于治疗疾病的药物组合物，其包含衍生自权利要求1-19中任一项的经修饰的多能细胞的细胞和药学上可接受的载体。在一些方面，所述衍生细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。在其它方面，所述疾病选自I型糖尿病、心脏病、神经疾病、癌症、眼病、血管疾病和甲状腺疾病。

本发明提供了一种用于治疗疾病的药物，其包含衍生自本文公开的经修饰的多能细胞的细胞。在一些方面，所述衍生细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。在其它方面，所述疾病选自I型糖尿病、心脏病、神经疾病、癌症、眼病、血管疾病和甲状腺疾病。

本发明提供了经修饰的细胞，当与经修饰的细胞的亲代形式相比时，所述细胞包含水平提高的CD16、CD32或CD64蛋白表达，其中所述提高的蛋白表达导致经修饰的细胞对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)更不敏感。在一些方面，所述细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。

附图说明

图1是ADCC和CDC的示意图。

图2是本发明的示意图。表达CD64的细胞隔离抗体Fc区，并防止ADCC或CDC。

图3显示CD52+人巨噬细胞通过其CD64的组成型表达而免受抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的ADCC的影响。抗CD64抗体消除了这种保护作用。这在较低的抗CD52抗体浓度下最为明显。

图4显示CD52+人HIP iPSC衍生的内皮细胞被CD64保护免于由抗-CD52抗体(阿仑珠单抗)导致的NK细胞ADCC。抗CD64抗体消除了这种保护作用。CD64转基因的存在显著拯救了所述内皮细胞，但抗CD52抗体水平最高。

图5显示CD52+巨噬细胞通过其组成型表达CD64而免受抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的CDC的影响。抗CD64抗体消除了这种保护作用。这在较低的抗CD52抗体浓度下最为明显。

图6A-图6C显示了经工程改造以表达CD52(图6A)、CD52和CD64(图6B)以及CD64(图6C)的小鼠HIP iEC。

图7A和图7B显示小鼠HIP iEC不能结合阿仑珠单抗Fc(图7A)，但小鼠HIP iEC(CD64)以浓度依赖性方式结合阿仑珠单抗Fc(图7B)。

图8显示CD52+小鼠HIP iEC以浓度依赖性方式对抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的同系NK细胞ADCC易感(上排)，但如果它们共表达CD64，则它们被保护免于NK细胞杀伤(下排)。

图9显示CD52+小鼠HIP iEC以浓度依赖性方式对抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的同系巨噬细胞ADCC易感(上排)，但如果它们共表达CD64，则它们被保护免受巨噬细胞杀伤(下排)。

图10显示CD52+小鼠HIP iEC以浓度依赖的方式对抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的同系PMN ADCC易感(上排)，但如果它们共表达CD64，则它们被保护免于PMN杀伤(下排)。

图11显示CD52+小鼠B6 HIP iEC以浓度依赖的方式对同种异体BALB/c NK细胞产生的抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的ADCC易感(上排)，但如果它们共表达CD64，则它们被保护免于BALB/c NK细胞杀伤(下排)。

图12显示CD52+小鼠B6 HIP iEC以浓度依赖的方式对同种异体BALB/c巨噬细胞产生的抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的ADCC易感(上排)，但如果它们共表达CD64，则它们被保护免于BALB/c巨噬细胞杀伤(下排)。

图13显示CD52+小鼠B6 HIP iEC以浓度依赖性的方式对同种异体PMN产生的抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的ADCC易感(上排)，但如果它们共表达CD64，则它们被保护免于BALB/c PMN杀伤(下排)。

图14显示CD52+小鼠B6 HIP iEC以浓度依赖性的方式对抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的CDC易感(上排)，并且由于它们不表达CD64，所以抗CD64抗体不影响这种杀伤(下排)。

图15显示在所有测试浓度下，CD52+CD64+小鼠B6 HIP iEC均受到保护而免受抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的CDC的影响，而抗CD64抗体消除了这种保护作用(下排)。

图16A-图16C显示了经工程改造以表达CD52(图16A)、CD52和CD64(图16B)以及CD64(图16C)的人HIP iEC。

图17A和图17B显示了人HIP iEC不能结合阿仑珠单抗Fc(图17A)，但人HIP iEC(CD64)以浓度依赖性方式结合阿仑珠单抗Fc(图17B)。

图18显示组成型表达CD64的人巨噬细胞以浓度依赖性方式结合阿仑珠单抗Fc。

图19显示CD52+人HIP iEC以浓度依赖性方式对抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的NK细胞ADCC易感(上排)，但如果它们共表达CD64，则它们大多被保护免受同种异体NK细胞杀伤(下排)。只有最高浓度的抗CD52抗体引起一些细胞毒性。

图20显示CD52+人HIP iEC以浓度依赖性方式对抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的同种异体巨噬细胞ADCC易感(上排)，但如果它们共表达CD64，则它们大多被保护免于巨噬细胞杀伤(下排)。只有最高浓度的抗CD52抗体引起一些细胞毒性。

图21显示CD52+人HIP iEC以浓度依赖性方式对抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的CDC易感(上排)，由于它们不表达CD64，抗CD64抗体不影响这种杀伤(下排)。

图22显示CD52+CD64+人HIP iEC大部分被保护免受抗CD52抗体(阿仑珠单抗)介导的CDC的影响。只有最高浓度的抗CD52抗体引起一些细胞毒性。抗CD64抗体消除了这种保护作用(下排)。

图23A和图23B显示了经工程改造表达CD64的人(图23A)和小鼠(图23B)甲状腺上皮细胞(epiC)。人epiC不能结合阿仑珠单抗Fc，但人epiC(Cd64)以浓度依赖性方式结合阿仑珠单抗Fc(图23C)。小鼠epiC不能结合阿仑珠单抗Fc，但小鼠epiC(CD64)以浓度依赖性方式结合阿仑珠单抗Fc(图23D)。

图24显示人epiC不能结合抗TPO Fc，但人epiC(CD64)以浓度依赖性方式结合抗TPO Fc(图24A)。小鼠epiC不能结合抗TPO Fc，但小鼠epiC(Cd64)以浓度依赖性方式结合抗TPO Fc(图24B)。

图25显示，当与作为ADCC的效应细胞的同系巨噬细胞一起孵育时，C57BL/6甲状腺epiC对抗TPO介导的杀伤易感。

图26显示，当与作为ADCC的效应细胞的同系巨噬细胞一起孵育时，表达CD64的C57BL/6甲状腺epiC对抗TPO介导的杀伤不敏感。在广泛的抗TPO浓度范围内，靶细胞受到保护而免受抗TPO ADCC的影响。

图27A和图27B显示了抗体介导的排斥的临床相关体内模型。当同系受体用阿仑珠单抗治疗时，携带CD52的小鼠iEC被杀死(图27A)。然而，携带CD52并表达CD64的小鼠HIPiEC完全受到保护而免于抗体介导的排斥。

具体实施方案

引言

本发明首次提供了包含增强的CD16、CD32或CD64表达以逃避抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的细胞。所述细胞可以是多能细胞，包括低免疫多能细胞(hypoimmune pluripotent cells,HIP)或ABO血型O恒河猴因子阴性HIP细胞(HIPO-)，其还包含增强的CD64表达。

这项技术的一个特殊适应症可以是自身免疫疾病的细胞治疗。抗自体表位的抗体在1型糖尿病中引起β细胞死亡，在自身免疫性甲状腺炎中引起甲状腺细胞死亡。抗体可与HLA II类分子结合。另外，还描述了不依赖于HLA的抗体。如果用于再生疗法的细胞具有相同的表位，其也会被这些抗体结合并被杀死。本发明的CD64隔离防止了ADCC或CDC。

在本发明的一些实施方案中，对低免疫原性多能(“HIP”)细胞进行修饰以增强CD16、CD32或CD64的表达(HIP/CD16、HIP/CD32或HIP/CD64细胞)。由于本文概述的几种遗传操作，HIP细胞避免了宿主免疫反应。所述细胞缺乏引发免疫反应的主要免疫抗原，并被工程改造成避免吞噬作用和NK细胞杀伤。在一些实施方案中，通过消除诱导多能干细胞(iPSC)中B2M基因的两个等位基因的活性；消除iPSC中CIITA基因的两个等位基因的活性；以及增加iPSC中CD47的表达来制备HIP细胞。在WO2018132783(通过引用以其整体并入本文)中详细描述了HIP细胞。

在本发明的其它实施方案中，对低免疫原性多能O血型Rh-(hypoimmunogenicpluripotent blood group O Rh-，“HIPO-”)细胞进行修饰以增强CD16、CD32或CD64的表达(HIPO-/CD16细胞、HIPO-/CD32或HIPO-/CD64细胞)。由于本文概述的几种遗传或酶促操作，HIPO-细胞避免了宿主免疫反应。所述细胞缺乏引发免疫反应的主要血型和免疫抗原，并被工程改造成避免排斥、吞噬或杀伤。这允许衍生用于产生特定组织和器官的“现成”细胞产品。能够在人患者中使用人同种异体HIPO-细胞及其衍生物的益处提供了显著的益处，包括避免在同种异体移植中常见的长期辅助免疫抑制疗法和药物的能力。它们还提供了显著的成本节约，因为可以使用细胞疗法而不需要对每个患者进行单独治疗。HIPO-/CD16、HIPO-/CD32或HIPO-/CD64细胞可作为通用细胞来源，用于产生普遍可接受的衍生物。HIPO-细胞在美国临时申请第62/846,399号和tx 62.855,499号中有详细描述，所述专利的每一项通过引用以其整体并入本文。

定义

术语“多能细胞”(pluripotent cell)是指能够自我更新和增殖同时保持未分化状态，并且能够在适当的条件下被诱导分化成特化细胞类型的细胞。如本文中所用，术语“多能细胞”涵盖胚胎干细胞和其它类型的干细胞，包括胎儿、羊膜或体细胞干细胞。示例性的人干细胞系包括H9人胚胎干细胞系。其它示例性的干细胞系包括可通过国立卫生研究院人胚胎干细胞登记处和霍华德休斯医学研究所HUES保藏中心(如Cowan,C.A.等人，NewEngland J.Med.350:13.(2004)，通过引用以其整体并入本文)获得的那些干细胞系。

如本文中所用，“多能干细胞”具有分化成三种胚层：内胚层(例如胃粘膜、胃肠道、肺等)、中胚层(例如肌肉、骨、血液、泌尿生殖组织等)或外胚层(例如表皮组织和神经系统组织)中的任一种的潜力。如本文中所用，术语“多能干细胞”还涵盖“诱导多能干细胞”，或“iPSC”，一种衍生自非多能细胞的多能干细胞类型。亲代细胞的实例包括已被通过各种方式重新编程以诱导多能未分化表型的体细胞。此类“iPS”或“iPSC”细胞可以通过诱导某些调节基因的表达或通过某些蛋白质的外源应用来产生。诱导iPS细胞的方法是本领域已知的，并将在下文中进一步描述。(参见，例如，Zhou等人，Stem Cells 27(11):2667-74(2009)；Huangfu等人，Nature Biotechnol.26(7):795(2008)；Woltjen等人，Nature 458(7239):766-770(2009)；和Zhou等人，Cell Stem Cell8:381-384(2009)；所述文献中的每一篇通过引用以其整体并入本文)。诱导多能干细胞(iPSC)的产生概述如下。如本文中所用，“hiPSC”是人诱导多能干细胞，“miPSC”是鼠诱导多能干细胞。

“多能干细胞特征”是指将多能干细胞与其它细胞区分开来的细胞特征。产生能够在适当条件下分化成共同展示与来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型的后代的能力是多能干细胞特征。分子标志物的某些组合的表达或不表达也是多能干细胞的特征。例如，人多能干细胞表达至少几种，在一些实施方案中，表达所有来自以下非限制性列表的标志物：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。与多能干细胞相关的细胞形态也是多能干细胞的特征。如本文中所述，细胞不需要通过多能性被重编程为内胚层祖细胞和/或肝细胞。

如本文中所用，“多能”(multipotent)或“多能细胞”是指能够产生有限数量的其它特定细胞类型的细胞类型。例如，诱导多能细胞能够形成内胚层细胞。另外，多能血液干细胞可以将自身分化成几种类型的血细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞等。

如本文中所用，术语“寡能(oligopotent)”是指成体干细胞分化成仅几种不同细胞类型的能力。例如，淋巴样或骨髓样干细胞能够分别形成淋巴样或骨髓样谱系的细胞。

如本文中所用，术语“单能”(unipotent)指细胞形成单一细胞类型的能力。例如，精原干细胞只能形成精子。

如本文中所用，术语“全能的”(totipotent)指细胞形成完整生物体的能力。例如，在哺乳动物中，只有受精卵和第一卵裂期卵裂球是全能性的。

如本文中所用，“非多能细胞”是指不是多能细胞的哺乳动物细胞。此类细胞的实例包括分化细胞以及祖细胞。分化细胞的实例包括但不限于来自选自骨髓、皮肤、骨骼肌、脂肪组织和外周血的组织的细胞。示例性的细胞类型包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、成肌细胞、神经元、成骨细胞、破骨细胞和T细胞。用于产生诱导多能细胞、内胚层祖细胞和肝细胞的起始细胞可以是非多能细胞。

分化细胞包括但不限于多能细胞、寡能细胞、单能细胞、祖细胞和终末分化细胞。在特定的实施方案中，相对于更强效(more potent)的细胞，效力较弱(less potent)的细胞被认为是“分化的”。

“体细胞”是形成生物体的机体的细胞。体细胞包括构成生物体中的器官、皮肤、血液、骨骼和结缔组织的细胞，但不包括生殖细胞。

细胞可以来自例如人或非人哺乳动物。示例性的非人哺乳动物包括、但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、豚鼠、仓鼠、绵羊、猪、马、牛和非人灵长类动物。在一些实施方案中，细胞来自成年人或非人哺乳动物。在一些实施方案中，细胞来自人新生儿、成年人或非人类哺乳动物。

如本文中所用，术语“受试者”或“患者”是指任何动物，诸如驯养动物、动物园动物或人。“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，如狗、猫、鸟、牲畜或人。“受试者”和“患者”的具体实例包括但不限于患有与肝、心脏、肺、肾、胰腺、脑、神经组织、血液、骨、骨髓等相关的疾病或病症的个体(尤其是人)。

哺乳动物细胞可以来自人或非人哺乳动物。示例性的非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、豚鼠、仓鼠、羊、猪、马、牛和非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴和猿)。

本文中的“低免疫原性多能”细胞或“HIP”细胞是指保留其多能特性，但当转移到同种异体宿主中时引起降低的免疫排斥反应的多能细胞。在优选实施方案中，HIP细胞不会引起免疫反应。因此，“低免疫原性”是指与本文概述的免疫工程之前的亲代(即“wt”)细胞的免疫反应相比，显著降低或消除的免疫反应。在许多情况下，HIP细胞是免疫沉默的，但仍保留多能能力。在下文中概述了HIP特征的测定。

本文中的“HIP/CD16”、“HIP/CD32”或“HIP/CD64”细胞是指分别增强了CD16、CD32或CD64表达的HIP细胞。

“低免疫原性多能细胞O-”、“低免疫原性多能ORh-”细胞或“HIPO-”细胞在本文中意指也是ABO血型O和恒河猴因子Rh-的HIP细胞。HIPO-细胞可能是由O-细胞产生的，经酶促修饰成为O-，或经基因工程改造成为O-。

本文中的“HIPO-/CD16”、“HIPO-/CD32”或“HIPO-/CD64”细胞是指CD16、CD32或CD64表达增强的HIPO-细胞。

“HLA”或“人白细胞抗原”复合物是编码人中的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的基因复合物。这些构成HLA复合物的细胞表面蛋白质负责调节对抗原的免疫反应。在人中，有两种MHC，I类和II类(“HLA-I”和“HLA-II”)。HLA-I包括三种蛋白质，HLA-A、HLA-B和HLA-C，它们呈递来自细胞内部的肽，HLA-I复合物呈递的抗原吸引杀伤T细胞(也称为CD8+T细胞或细胞毒性T细胞)。HLA-I蛋白与β-2微球蛋白(B2M)缔合。HLA-II包括五种蛋白，HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR，它们将抗原从细胞外呈递到T淋巴细胞。这刺激了CD4+细胞(也称为T辅助细胞)。应当理解，使用“MHC”或“HLA”并不意味着是限制性的，因为这取决于基因来自人(HLA)还是来自鼠(MHC)。因此，当涉及哺乳动物细胞时，这些术语在本文中可以互换使用。

本文中的“基因敲除”意指使特定基因在其所驻留的宿主细胞中失活，导致不产生目标蛋白或导致失活形式。正如本领域技术人员所理解的和下面进一步描述的，这可以通过许多不同的方式实现，包括从基因中去除核酸序列，或者用其它序列中断该序列，改变阅读框架，或者改变核酸的调控组分。例如，可以去除目标基因的编码区的全部或部分或者用“无意义”序列替换其，可以去除或替换调控序列诸如启动子的全部或部分，可以去除或替换翻译起始序列，等等。

本文中的“基因敲入”是指向宿主细胞添加遗传功能的过程。这导致编码的蛋白质的水平升高。如本领域技术人员所理解的，这可以通过几种方式实现，包括向宿主细胞中添加一个或多个额外的基因拷贝，或者改变内源基因的调控组分，从而增加所述蛋白质的表达。这可通过修饰启动子、添加不同的启动子、添加增强子或修饰其它基因表达序列来实现。

“β-2微球蛋白”或“β2M”或“B2M”蛋白是指具有下面所示的氨基酸和核酸序列的人β2M蛋白；该人基因的登录号为NC_000015.10:44711487-44718159。

“CD47蛋白”蛋白是指具有如下所示氨基酸和核酸序列的人CD47蛋白；该人基因的登录号为NC_000016.10:10866208-10941562。

“CIITA蛋白”蛋白是指具有如下所示的氨基酸和核酸序列的人CIITA蛋白；该人基因的登录号为NC_000003.12:108043094-108094200。

细胞上下文中的“野生型”是指在自然界中发现的细胞。然而，在多能干细胞的情况下，如本文中所用，其也意指可含有导致多能性的核酸变化但没有经受本发明的基因编辑程序以实现低免疫原性的iPSC。

“同系的”(syngeneic)在本文中指其中存在免疫相容性(例如不产生免疫反应)的宿主生物与细胞移植物的遗传相似性或同一性。

本文中的“同种异体”(allogeneic)是指其中产生免疫反应的细胞移植物与宿主生物的遗传差异。

本文中的“B2M-/-”意指二倍体细胞在两条染色体上都具有失活的B2M基因。如本文中所述，这可以通过多种方式来完成。

本文中的“CIITA-/-”是指二倍体细胞在两条染色体上都具有失活的CIITA基因。如本文中所述，这可以通过多种方式来完成。

本文中的“CD47 tg”(代表“转基因”)或“CD47+”)意指宿主细胞表达CD47，在一些情况下通过具有至少一个额外的CD47基因拷贝来实现。

“Oct多肽”是指转录因子八聚体家族的任何天然存在的成员，或其保持与最密切相关的天然存在的家族成员相比相似(在至少50％、80％或90％活性的范围内)的转录因子活性的变体，或至少包含天然存在的家族成员的DNA结合结构域的多肽,并且还可包含转录激活结构域。示例性的Oct多肽包括Oct-1、Oct-2、Oct-3/4、Oct-6、Oct-7、Oct-8、Oct-9和Oct-11。Oct3/4(本文称为“Oct4”)包含POU结构域(一种在Pit-1、Oct-1、Oct-2和uric-86中保守的150个氨基酸的序列)。(参见，Ryan,A.K.&Rosenfeld,M.G.,Genes Dev.11:1207-1225(1997)，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，与天然存在的Oct多肽家族成员相比，诸如与上文所列或Genbank登录号NP-002692.2(人Oct4)或NP-038661.1(小鼠Oct4)中所列的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。Oct多肽(例如，Oct3/4或Oct 4)可来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其它动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操作的细胞种类一起使用。所述Oct多肽可以是能够有助于在非多能细胞中诱导多能性的多能因子。

“Klf多肽”是指Krüppel样因子(Klf)家族的任何天然存在的成员，包含与果蝇胚胎模式调节因子Krüppel相似的氨基酸序列的锌指蛋白，或与最密切相关的天然存在的家族成员相比保持相似(至少50％、80％或90％活性)转录因子活性的天然存在成员的变体，或至少包含天然存在家族成员的DNA结合结构域的多肽，并且还可以包含转录激活结构域。(参见，Dang,D.T.,Pevsner,J.&Yang,V.W.,Cell Biol.32:1103-1121(2000)，其通过引用以其整体并入本文)。示例性的Klf家族成员包括Klf1、Klf2、Klf3、Klf-4、Klf5、Klf6、Klf7、Klf8、Klf9、Klf10、Klf11、Klf12、Klf13、Klf14、Klf15、Klf16和Klf17。发现Klf2和Klf-4是能够在小鼠中产生iPS细胞的因子，相关基因Klf1和Klf5也是如此，尽管效率降低。(参见Nakagawa等人，Nature Biotechnology 26:101-106(2007)，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，与天然存在的Klf多肽家族成员相比，例如与上文所列或Genbank登录号CAX16088(小鼠Klf4)或CAX14962(人Klf4)中所列的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。Klf多肽(例如，Klf1、Klf4和Klf5)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其它动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操作的细胞种类一起使用。所述Klf多肽可以是多能性因子。Klf4基因或多肽的表达能够有助于在起始细胞或起始细胞群中诱导多能性。

“Myc多肽”是指Myc家族中任何天然存在的成员。(例如，参见Adhikary,S.&Eilers,M.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.6:635-645(2005)，其通过引用以其整体并入本文)。其还包括变体，所述变体在与最密切相关的天然存在的家族成员相比时保持相似转录因子活性(即，在至少50％、80％或90％活性的范围内)。其还包括至少包含天然存在的家族成员的DNA结合结构域的多肽，并且还可包含转录激活结构域。示例性的Myc多肽包括例如c-Myc、N-Myc和L-Myc。在一些实施方案中，与天然存在的Myc多肽家族成员相比，诸如与上文所列或诸如Genbank登录号CAA25015(人Myc)中所列的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。Myc多肽(例如，c-Myc)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其它动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操作的细胞种类一起使用。所述Myc多肽可以是多能性因子。

“Sox多肽”是指SRY相关HMG-盒(Sox)转录因子的任何天然存在的成员，其特征在于存在高迁移率组(high-mobility group，HMG)结构域或其变体，所述变体在与最密切相关的天然存在的家族成员相比时，保持相似的转录因子活性(即在至少50％、80％或90％活性的范围内)。其还包括至少包含天然存在的家族成员的DNA结合结构域的多肽，并且还可包含转录激活结构域。(参见例如Dang,D.T.等人，Int.J.Biochem.Cell Biol.32:1103-1121(2000)，其通过引用以其整体并入本文)。示例性的Sox多肽包括例如Sox1、Sox-2、Sox3、Sox4、Sox5、Sox6、Sox7、Sox8、Sox9、Sox10、Sox11、Sox12、Sox13、Sox14、Sox15、Sox17、Sox18、Sox-21和Sox30。已显示Sox1产生iPS细胞的效率与Sox2相似，并且还已显示基因Sox3、Sox15和Sox18产生iPS细胞，尽管效率略低于Sox2。(参见Nakagawa等人，NatureBiotechnology 26:101-106(2007)，其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，与天然存在的Sox多肽家族成员，诸如与上文所列的那些或诸如Genbank登录号CAA83435(人Sox2)中所列的那些相比，变体在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。Sox多肽(例如Sox1、Sox2、Sox3、Sox15或Sox18)可来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其它动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操作的细胞种类一起使用。所述Sox多肽可以是多能性因子。如本文中所述，SOX2蛋白在iPSC的产生中具有特殊用途。

本文中的“分化的低免疫原性多能细胞”或“分化的HIP细胞”或“dHIP细胞”意指已被工程改造成具有低免疫原性(例如，通过敲除B2M和CIITA以及敲入CD47)、然后分化为最终移植入受试者的细胞类型的iPS细胞。因此，例如HIP细胞可以分化成肝细胞(“dHIP肝细胞”)、β-样胰腺细胞或胰岛类器官(“dHIPβ细胞”)、内皮细胞(“dHIP内皮细胞”)等。平行细胞定义适用于“分化的HIP/CD64”和分化的HIPO-/CD64细胞。

在两种或更多种核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”百分比是指两种或更多种序列或子序列，当进行比较和比对以获得最大对应性时，它们具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基，如使用下述序列比较算法之一(例如BLASTP和BLASTN或本领域技术人员可用的其它算法)或通过目测所测量的。取决于应用，“同一性”百分比可以存在于被比较序列的区域上，例如在功能结构域上，或者存在于被比较的两个序列的全长上。对于序列比较，通常一个序列作为与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索算法，通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)，或者通过目测(一般参见Ausubel等人，见下文)来进行。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于在Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”影响生物相关分子的功能或表达。术语“调节剂”包括抑制剂和激活剂。它们可以用体外和体内测定靶分子的表达或活性来鉴定。

“抑制剂”是例如抑制表达或与靶分子或蛋白质结合的试剂。它们可能部分或全部阻断刺激或者具有蛋白酶抑制剂活性。它们可以降低、减少、阻止或延迟激活，包括使所述靶蛋白的活性失活、脱敏或下调。调节剂可以是靶分子或蛋白质的拮抗剂。

“激活剂”是例如诱导或激活靶分子或蛋白质的功能或表达的试剂。它们可以与靶分子结合、刺激、增加、打开、激活或促进靶分子活性。激活剂可以是靶分子或蛋白质的激动剂。

“同源物”是在核苷酸序列、肽序列、功能或结构水平上与参考分子相似的生物活性分子。同源物可以包括与参考序列共有一定百分比同一性的序列衍生物。因此，在一个实施方案中，同源或衍生序列共有至少70％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少80％或85％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少90％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少95％的序列同一性。在一个更具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。同源或衍生核酸序列也可由它们在高严格杂交条件下保持与参照核酸序列结合的能力来定义。与参考分子具有结构或功能相似性的同系物可以是参考分子的化学衍生物。检测、产生和筛选结构和功能同源物以及衍生物的方法是本领域已知的。

“杂交”通常取决于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，变性DNA重新退火的能力。探针与可杂交序列之间期望的同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。因此，较高的相对温度往往会使反应条件更严格，而较低的温度则使反应条件不太严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology,Wiley Interscience Publishers(1995)，所述文献通过引用以其整体并入本文。

杂交反应的“严谨性”可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是根据探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。一般来说，较长的探针需要较高的温度来进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。

如本文中所定义的，“严谨条件”或“高度严谨条件”可以通过以下条件来确定：(1)使用低离子强度和高温进行洗涤，例如50℃下的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中使用变性剂，诸如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5与750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)在使用50％甲酰胺、55x SSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠)、50Mm磷酸钠(Ph 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μl/m1)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖的溶液中于42℃过夜杂交，在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃洗涤10分钟，接着在55℃进行由含有EDTA的0.1x SSC组成的10分钟高严谨性洗涤。

在整个本说明书中给出的每一个最大数值限定都旨在包括每一个更小的数值限定，就好像这些更小的数值限定是在本文中明确写出的一样。本说明书中给出的每一个最小数值限定将包括每一个更大的数值限定，就好像这些更大的数值限定在本文中被明确地写出一样。在整个说明书中给出的每个数值范围将包括落入这种更宽数值范围内的每个更窄数值范围，就好像这种更窄数值范围在本文中都被清楚地写出一样。

如本文中所用，术语“修饰”是指物理上将经修饰的分子与母体分子区分开的改变。在一个实施方案中，根据本文所述方法制备的CD47、HSVtk、EC-CD或iCasp9变体多肽中的氨基酸变化将其与未根据本文所述方法修饰的相应亲本区分开，所述相应亲本诸如野生型蛋白质、天然存在的突变型蛋白质或不包括此类变体多肽的修饰的另一种工程改造的蛋白质。在另一个实施方案中，变体多肽包括一个或多个修饰，其将变体多肽与未修饰的多肽的功能区分开。例如，变体多肽中的氨基酸变化会影响其受体结合分布(receptor bindingprofile)。在其它实施方案中，变体多肽包含取代、缺失或插入修饰，或其组合。在另一个实施方案中，变体多肽包括一个或多个修饰，与未被修饰的多肽的亲和力相比，所述修饰增加了其对受体的亲和力。

在一个实施方案中，变体多肽包括相对于相应的天然或亲代序列的一个或多个取代、插入或缺失。在某些实施方案中，变体多肽包含3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31-40个、41至50个或者51个或更多个修饰。

本文中的“附加型载体”是指可以在细胞的细胞质中存在并自主复制的遗传载体；例如，其未被整合到宿主细胞的基因组DNA中。许多附加型载体是本领域已知的，并在下文中描述。

基因上下文中的“敲除”是指含有所述敲除的宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物。如本文中所概述的，敲除可以由多种方式导致：去除编码序列的全部或部分，引入移码突变使得不产生功能性蛋白质(截短的或无义序列)，去除或改变调节组分(例如启动子)使得基因不被转录，通过与mRNA结合而防止翻译等。通常，在基因组DNA水平上实现敲除，使得细胞的后代也永久地携带所述敲除。

基因上下文中的“敲入”是指含有敲入的宿主细胞在细胞中具有更多活性功能蛋白。如本文中所概述的，敲入可以以多种方式进行，通常通过将至少一个拷贝的编码蛋白质的转基因(tg)引入细胞来进行，尽管这也可以通过替换调节组分来进行，例如通过向内源基因添加组成型启动子来进行。一般来说，敲入技术导致额外拷贝的转基因整合到宿主细胞中。

本发明的细胞

本发明提供了用于产生具有增强的CD16、CD32或CD64表达的多能细胞的组合物和方法。在本发明的一些方面，细胞将衍生自诱导多能干细胞(IPSC)、O-诱导多能干细胞(iPSCO-)、胚胎干细胞(ESC)、O-胚胎干细胞(ESCO-)、低免疫原性多能(HIP)细胞、低免疫原性多能O-(HIPO-)细胞，或者由其衍生或分化的细胞。

A.用于基因改变的方法

本发明包括在细胞内或无细胞条件下修饰核酸序列以产生具有增强的CD16、CD32或CD64表达的细胞的方法。示例性技术包括同源重组、敲入、ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)、CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列)/Cas9和其它位点特异性核酸酶技术。这些技术能使双链DNA在所需的位点断裂。这些受控的双链断裂促进了特定基因座位点的同源重组。该过程集中于用核酸内切酶靶向核酸分子诸如染色体的特定序列，所述核酸内切酶识别所述序列并与共结合，并诱导核酸分子的双链断裂。双链断裂可以通过易错的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复。

如本领域技术人员将理解的，许多不同的技术可用于工程改造本发明的多能细胞，以及将iPSC工程改造成为低免疫原性的，如本文所概述的。

一般来说，这些技术可以单独使用或组合使用。例如，在HIP细胞的产生中，CRISPR可用于减少工程改造的细胞中活性B2M和/或CIITA蛋白的表达，其中用病毒技术(例如慢病毒)敲入CD47功能。此外，如本领域技术人员将理解的，尽管一个实施方案依次利用CRISPR步骤敲除B2M，接着利用CRISPR步骤敲除CIITA，最后利用慢病毒步骤敲入CD47功能，这些基因可以使用不同的技术以不同的顺序操作。

如下文更全面论述的，通常进行重编程基因的瞬时表达以产生/诱导多能干细胞。

a.CRISPR技术

在一个实施方案中，使用本领域已知的成簇的规律间隔短回文重复序列)/Cas(“CRISPR”)技术操作细胞CRISPR可用于产生起始iPSC或从iPSC产生HIP单元。有大量基于CRISPR的技术，参见例如Doudna和Charpentier，Science doi:10.1126/science.1258096，其据此通过引用并入本文。CRISPR技术和套件在市场上有销售。

b.TALEN技术

在一些实施方案中，本发明的HIP细胞是使用转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)方法制备的。TALEN是与核酸酶结合的限制性酶，其可被工程改造成与几乎任何所需的DNA序列结合并实际将其切割。TALEN试剂盒在市场上有售。

c.锌指技术

在一个实施方案中，使用锌指核酸酶技术操纵细胞。锌指核酸酶是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制性酶。锌指结构域可被工程改造成靶向特定的所需DNA序列，这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组中的独特序列。通过利用内源性DNA修复机制，这些试剂可用于精确地改变高等生物的基因组，类似于CRISPR和TALEN。

d.基于病毒的技术

有多种可用于产生本发明的HIP细胞(以及用于iPCS的最初产生)的病毒技术，包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和仙台病毒载体的使用。下文中描述了用于产生iPSC的附加型载体。

e.使用干扰RNA下调基因

在其它实施方案中，过RNAi技术下调编码HLA分子中使用的蛋白质的基因通。RNA干扰(RNAi)是其中RNA分子通常通过导致特定mRNA分子降解来抑制基因表达的过程。两种类型的RNA分子-微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)-是RNA干扰的核心。它们与靶mRNA分子结合，增强或降低其活性。RNAi帮助细胞抵御寄生核酸，诸如来自病毒和转座子的核酸。RNAi也影响发育。

sdRNA分子是一类包含19-21个碱基的引导(反义)链的不对称siRNA。它们包含5’磷酸、2’Ome或2’F修饰的嘧啶和6个3’位置处的硫代磷酸酯。它们还包含含有3’缀合的甾醇部分、3’位置处的2个磷酸酯和2’Ome修饰的嘧啶的有义链。两条链都含有2’Ome嘌呤，其中未修饰的嘌呤的连续延伸长度不超过3。sdRNA公开于美国专利第8,796,443号中，该专利通过引用以其整体并入本文。

对于所有这些技术，使用公知的重组技术来产生本文概述的重组核酸。在某些实施方案中，重组核酸(编码所需多肽，例如CD47，或者编码破坏序列)可以与表达构建体中的一个或多个调控核苷酸序列可操作地连接。调控核苷酸序列通常适合于待治疗的宿主细胞和受试者。对于多种宿主细胞，许多类型的合适表达载体和合适的调控序列在本领域是已知的。通常，一个或多个调控核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。还设想了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，也可以是组合了不止一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体(诸如质粒)上，或者表达构建体可被插入染色体中。在具体的实施方案中，表达载体包括选择标记基因，以允许选择转化的宿主细胞。某些实施方案包括表达载体，其包含与至少一种调控序列可操作连接的编码变体多肽的核苷酸序列本文所用的调控序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件。在某些实施方案中，表达载体被设计用于选择待转化的宿主细胞、期望表达的特定变体多肽、载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力、或由载体编码的任何其它蛋白质(诸如抗生素标志物)的表达。

合适的哺乳动物启动子的例子包括例如来自下列基因的启动子：仓鼠的遍在蛋白/S27a启动子(WO 97/15664)、猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复区、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)、莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复区和人巨细胞病毒(CMV)的早期启动子。其它异源哺乳动物启动子的实例是肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。

在另外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞的启动子可从诸如多瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2,211,504)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)等病毒的基因组中获得。在另外的实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期和晚期启动子可以方便地以SV40限制性片段的形式获得，该片段还含有SV40病毒的复制起点。Fiers等人，Nature 273:113-120(1978)。人巨细胞病毒的立即早期启动子以HindIII限制性片段的形式方便地获得。Greenaway,P.J.等人，Gene18:355-360(1982)。前述参考文献通过引用以其整体并入。

B.多能细胞的产生

本发明提供了从多能细胞产生非免疫原性多能细胞的方法。因此，第一步骤是提供多能干细胞。

小鼠和人多能干细胞(通常称为iPSC；鼠细胞的miPSC或人细胞的hiPSC)的产生在本领域中是公知的如本领域技术人员所理解的，有多种不同的产生iPCS的方法。使用四种转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的病毒导入，从小鼠胚胎或成体成纤维细胞进行初始诱导；参见Takahashi和Yamanaka Cell 126:663-676(2006)，其据此通过引用以其整体并入，特别是针对其中概述的技术。从那时起，已经开发了许多方法；综述见Seki等人，WorldJ.Stem Cells 7(1):116-125(2015)，以及Lakshmipathy和Vermuri，编辑，Methods inMolecular Biology:Pluripotent Stem Cells,Methods and Protocols,Springer 2013，这两篇文献据此通过此用以其整体明确地并入的全部内容通过引用明确地并入本文，特别是针对用于产生hiPSC的方法(参见例如后一参考文献的第3章)。

一般来说，iPSC是通过宿主细胞中一种或多种“重编程因子”(通常使用附加型载体引入)的瞬时表达产生的。在这些条件下，少量细胞被诱导成为iPSC(通常，这一步骤的效率较低，因为没有使用选择标记)。一旦细胞被“重新编程”，并成为多能的，它们就失去了一种或多种附加型载体，并利用内源基因产生因子。一种或多种附加型载体的这种丢失导致被称为“零足迹(zero footprint)”细胞的细胞。这是所希望的，因为遗传修饰越少(特别是在宿主细胞的基因组中)越好。因此，所得的hiPSC没有永久的遗传修饰是优选的。

又如本领域技术人员所理解的，可以使用或已经使用的重编程因子的数量可以变化。通常，当使用较少的重编程因子时，细胞向多能状态转化的效率下降，“多能性”也会下降，例如，较少的重编程因子可能导致不是完全多能的，而是只能分化成较少的细胞类型的细胞。

在一些实施方案中，使用单种重编程因子OCT4。在其它实施方案中，使用两种重编程因子OCT4和KLF4。在其它实施方案中，使用三种重编程因子OCT4、KLF4和SOX2。在其它实施方案中，使用了四种重编程因子OCT4、KLF4、SOX2和c-Myc。在其它实施方案中，可以使用5、6或7种重编程因子，其选自SOKMNLT、SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28和SV40L T抗原。

通常，这些重编程因子基因在附加型载体(诸如本领域已知的和可商购的附加型载体)上提供。例如，ThermoFisher/Invitrogen出售用于hiPSC的零足迹产生的仙台病毒重编程试剂盒，参见目录号A34546。ThermoFisher也销售基于EBNA的系统，见目录号A14703。

另外，还有许多商购可得的hiPSC系；参见例如

Episomal hiPSC系K18945，其为零足迹、无病毒整合的人iPSC细胞系(另见Burridge等人，2011，同上)。

通常，如本领域已知的，iPSC由诸如CD34+脐带血细胞、成纤维细胞等非多能细胞通过瞬时表达如本文所述的重编程因子而产生。

例如，仅使用Oct3/4、Sox2和Klf4，同时省略C-Myc，也产生了成功的iPSC，尽管重编程效率降低。

一般来说，iPSC的特征在于包括KLF4、Nanog、OCT4、SOX2、ESRRB、TBX3、c-Myc和TCL1在内的某些因子的表达。出于本发明的目的，这些因子的新的或增加的表达可以是通过内源基因座的诱导或调节或者来自转基因的表达。

例如，可使用Diecke等人，Sci Rep.2015,Jan.28；5:8081(doi:10.1038/srep08081)(据此通过引用以其整体并入，特别是对于用产生miPSC的方法和试剂)的方法来产生。还可参见，例如，Burridge等人，PLoS One,2011 6(4):18293，其据此通过引用以其整体并入，特别是对于本文概述的方法。

在一些情况下，如本文概述的那样测量或确认细胞的多能性，例如通过分析重编程因子或通过如本文和实施例中概述的那样进行分化反应。

C.低免疫原性多能(HIP)细胞的产生

从多能细胞产生HIP细胞是在少至三个遗传改变的情况下进行的，所述遗传改变导致细胞活性的最小破坏，但对细胞赋予免疫沉默。

如本文中所论述的，一个实施方案利用MHC I和II(当细胞是人时，为HLA I和II)的蛋白活性的降低或消除。这可通过改变编码其组分的基因来实现。在一个实施方案中，使用CRISPR破坏基因的编码区或调控序列。在另一个实施方案中，使用干扰RNA技术减少了基因翻译。第三变化是调节对巨噬细胞吞噬作用的易感性的基因诸如CD47的变化，这通常是使用病毒技术的基因“敲入”。

在一些情况下，当CRISPR被用于遗传修饰时，可以使用含有实现细胞系的高效编辑的Cas9构建体的hiPSC细胞；参见例如来自Life Technologies的人附加型Cas9 iPSC细胞系A33124。

1.HLA-I的减少

本发明的HIP细胞包括MHC I功能(当细胞衍生自人细胞时为HLA I)的降低。

如本领域技术人员所理解的，功能的降低可以通过多种方式实现，包括从基因中去除核酸序列，用其它序列中断该序列，或者改变核酸的调控组分。例如，目标基因编码区的全部或部分可被去除或用“无义”序列替换，移码突变可被产生，诸如启动子等调控序列的全部或部分可被去除或替换，翻译起始序列可被去除或替换等。

如本领域技术人员所理解的，多能细胞中MHC I功能(当细胞衍生自人细胞时，为HLA I)的成功降低可使用本领域已知和如下所述的技术进行测量；例如，使用结合HLA复合物的标记的抗体的FACS技术；例如，使用与人主要组织相容性HLA I类抗原的α链结合的商购可得的HLA-A、B、C抗体。

a.B2M的改变

在一个实施方案中，HLA-I活性的降低是通过破坏多能干细胞中β-2微球蛋白基因的表达来实现的，本文中公开了所述多能干细胞的人序列。这种改变在本文中通常称为基因“敲除”，在本发明的HIP细胞中，这是在宿主细胞的两个等位基因上进行的。一般来说，进行这两种中断的技术是相同的。

特别有用的实施方案使用CRISPR技术来破坏基因。在一些情况下，CRISPR技术用于将小的缺失/插入引入基因的编码区，，使得不产生功能性蛋白质，这通常是移码突变的结果，移码突变导致产生终止密码子，使得产生截短的非功能性蛋白质。

因此，有用的技术是使用被设计成靶向小鼠中B2M基因或人中B2M基因的编码序列的CRISPR序列。基因编辑后，将转染的iPSC培养物解离成单细胞。将单细胞扩增至全尺寸集落，并通过筛选来自CRISPR切割位点的异常序列的存在来测试CRISPR编辑。挑选两个等位基因都缺失的克隆。此类克隆不表达B2M，如通过PCR所示的，也不表达HLA-I，如通过FACS分析所示的(例如参见实施例1和6)。

测试B2M基因是否已经失活的测定是已知的，并在本文中有所描述。在一个实施方案中，所述测定是用针对B2M蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链式反应(rt-PCR)证实了失活改变的存在。

另外，可以测试细胞以确认HLA I复合物不在细胞表面表达。如上所述，这可以通过使用针对一种或多种HLA细胞表面组分的抗体的FACS分析来测定。

值得注意的是，其他人在试图沉默两个等位基因上的B2M基因时结果不佳。参见例如Gornalusse等人，Nature Biotech.Doi/10.1038/nbt.3860)。

2.HLA-II的减少

除了HLA I的减少之外，本发明的HIP细胞也缺乏MHC II功能(当细胞衍生自人细胞时为HLA II)。

如本领域技术人员所理解的，功能的降低可以通过多种方式实现，包括从基因中去除核酸序列、向基因中添加核酸序列、破坏阅读框架、用其它序列中断该序列或者改变核酸的调控组分。在一个实施方案中，可将目标基因的全部或部分编码区去除或用“无义”序列替代。在另一个实施方案中，可去除或替代调控序列诸如启动子，可去除或替代翻译起始序列，等等。

多能细胞或其衍生物中MHC II功能(当细胞衍生自人细胞时为HLA II)的成功降低可以使用诸如使用针对蛋白质的抗体的蛋白质印迹、FACS技术、rt-PCR技术等本领域已知的技术来测量。

a.CIITA的改变

在一个实施方案中，HLA-II活性的降低是通过破坏多能干细胞中CIITA基因的表达来实现的，所述CIITA基因的人序列如本文所示。这种改变在本文中通称为基因“敲除”，在本发明的HIP细胞中，这是在宿主细胞的两个等位基因上进行的。

测试CIITA基因是否已经失活的测定是已知的，并在本文中有描述。在一个实施方案中，该测定是用针对CIITA蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链式反应(rt-PCR)证实了失活改变的存在。

此外，可以测试细胞以确认HLA II复合物不在细胞表面表达。同样，这种测定是按照本领域已知的方法进行的。示例性的分析包括蛋白质印迹或FACS分析，其使用与如下所述的人HLA II类HLA-DR、DP和大多数DQ抗原结合的商业抗体。

一个特别有用的实施方案使用CRISPR技术来破坏CIITA基因。CRISPR被设计成靶向小鼠的Ciita基因或人的CIITA基因的编码序列，所述CIITA或CIITA为所有MHC II分子的必需转录因子。基因编辑后，将转染的iPSC培养物解离成单细胞。将它们扩增至全尺寸菌落并通过筛选来自CRISPR切割位点的异常序列的存在来测试成功的CRISPR编辑。具有缺失的克隆不表达CIITA(如通过PCR所测定的)并且不表达MHC II/HLA-II(如通过FACS分析所测定的)。

3.吞噬作用的减少

除了HLA I和II(或MHC I和II)的减少之外，通常使用B2M和CIITA敲除，本发明的HIP细胞还对巨噬细胞吞噬和NK细胞杀伤的易感性降低。由于一个或多个CD47转基因，产生的HIP细胞“逃离”免疫巨噬细胞和先天途径。

a.CD47的增加

在一些实施方案中，巨噬细胞吞噬作用和NK细胞杀伤易感性的降低由HIP细胞表面上的CD47增加引起。正如本领域技术人员所理解的，这是通过使用“敲入”或转基因技术以几种方式完成的。在一些情况下，CD47表达的增加由一个或多个CD47转基因引起。

因此，在一些实施方案中，在诱导型或组成型启动子(后者是优选的)的控制下，将一个或多个拷贝的CD47基因加入HIP细胞。在一些实施方案中，如本文所述或本领域已知的那样，使用慢病毒构建体CD47基因可以在本领域已知的合适启动子的控制下整合到宿主细胞的基因组中.

HIP细胞系由B2M-/-CIITA-/-iPSC产生。使用杀稻瘟菌素标记选择含有表达CD47的慢病毒载体的细胞。合成CD47基因序列，并将DNA克隆到具有杀稻瘟菌素抗性的质粒慢病毒pLenti6/V5(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中。

在一些实施方案中，CD47基因的表达可以通过改变内源CD47基因的调控序列(例如，通过将内源启动子替换为组成型启动子或不同的诱导型启动子)来增加。这通常可使用诸如CRISPR等已知技术来完成。

一旦发生改变，可以使用已知的技术，诸如实施例中描述的那些技术，诸如使用抗CD47抗体的蛋白质印迹、ELISA测定或FACS测定，来测定足够CD47表达的存在。一般来说，本说明书中的“充足性”是指沉默NK细胞杀伤的CD47在HIP细胞表面上表达的增加。一旦MHC I被去除，细胞上的天然表达水平太低而不能保护它们免于NK细胞裂解。

4.自杀基因

在一些实施方案中，本发明提供了包含“自杀基因”或“自杀开关”的低免疫原性多能细胞。它们被整合作为“安全性开关”,如果它们以不期望的方式生长和分裂，则可以引起低免疫原性多能细胞的死亡。“自杀基因”消融方法包括基因转移载体中的自杀基因，该基因编码仅当被特定化合物激活时导致细胞杀伤的蛋白质。自杀基因可以编码选择性地将无毒化合物转化为高毒性代谢物的酶。结果是特异性地消除表达该酶的细胞。在一些实施方案中，自杀基因是疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，引发剂是更昔洛韦。在其它实施方案中，自杀基因是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因，引发剂是5-氟胞嘧啶(5-FC)(Barese等人，Mol.Therap.20(10):1932-1943(2012),Xu等人，Cell Res.8:73-8(1998)，这两篇文献都通过引用以其整体并入本文)。

在其它实施方案中，自杀基因是可诱导的半胱天冬酶蛋白。诱导型半胱天冬酶蛋白包含至少一部分能够诱导细胞凋亡的半胱天冬酶蛋白。在一个实施方案中，在SEQ IDNO:6中举例说明了半胱天冬酶蛋白的一部分。在优选实施方案中，可诱导的半胱天冬酶蛋白是iCasp9。其包含具有F36V突变的人FK506结合蛋白FKBP12的序列，通过一系列氨基酸与编码人半胱天冬酶9的基因连接。FKBP12-F36V以高亲和力与小分子二聚剂AP1903结合。因此，本发明中iCasp9的自杀功能是通过施用二聚化的化学诱导剂(CID)来触发的。在一些实施例中，CID是小分子药物AP1903。二聚化导致细胞凋亡的快速诱导。(参见WO2011146862；Stasi等人，N.Engl.J.Med 365；18(2011)；Tey等人，Biol.Blood Marrow Transplant.13:913-924(2007)，其每一篇都通过引用以其整体并入本文)。

5.CD16、CD32或CD64的表达

由于CD16、CD32或CD64表达增加，本发明的细胞对ADCC和CDC的易感性降低。所得的细胞由于增加的表达而隔离抗体。在一个实施方案中，细胞包含一种或多种CD16、CD32或CD64转基因。

a.CD16、CD32或CD64的增加

在一些实施方案中，ADCC或CDC易感性的降低由细胞表面上CD16、CD32或CD64的增加引起。正如本领域技术人员所理解的，这是通过使用“敲入”或转基因技术以几种方式完成的。在一些情况下，CD16、CD32或CD64表达的增加由一个或多个转基因引起。

因此，在一些实施方案中，将一个或多个拷贝的CD16、CD32或CD64基因加入到受诱导型或组成型启动子(优选后者)控制下的细胞中。在一些实施方案中，如本文所述或本领域已知的那样使用慢病毒构建体。基因可以在本领域已知的合适启动子的控制下整合到宿主细胞的基因组中。

使用杀稻瘟菌素标记选择含有表达CD16、CD32或CD64的慢病毒载体的细胞。合成基因序列，并将DNA克隆到例如具有杀稻瘟菌素抗性的质粒慢病毒pLenti6/V5(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)中。

在一些实施方案中，可以通过改变内源CD16、CD32或CD64基因的调控序列，例如通过将内源启动子替换为组成型启动子或不同的诱导型启动子来增加基因的表达。这通常可使用诸如CRISPR等已知技术来完成。

一旦改变，可以使用已知的技术，诸如实施例中描述的那些技术，诸如使用抗CD16、CD32或CD64抗体的蛋白质印迹、ELISA测定或FACS测定，来测定足够表达的存在。一般来说，本说明书中的“充足性”是指隔离抗体并抑制ADCC或CDC的细胞表面表达的增加。

6.HIP表型和多能性保持的测定

一旦产生了HIP细胞，就可以测定它们的低免疫原性和/或多能性的保留，如本文和实施例中通常描述的。

例如，使用多种技术测定低免疫原性。一种示例性技术包括移植入同种异体宿主中并监测逃避宿主免疫系统的HIP细胞生长(例如畸胎瘤)。对HIP衍生物进行转导以表达萤光素酶，然后可以使用生物发光成像进行跟踪。类似地，测试宿主动物对HIP细胞的T细胞和/或B细胞反应，以证实HIP细胞不会引起宿主动物的免疫反应。T细胞功能通过Elispot、Elisa、FACS、PCR或质谱细胞计量术(CYTOF)进行评估。使用FACS或luminex评估B细胞反应或抗体反应。另外，或者可选择地，可以测定细胞的避免先天免疫反应(例如NK细胞杀伤)的能力。使用本领域已知的技术在体外或体内评估NK细胞溶解活性。

类似地，以多种方式测试多能性的保持。在一个实施方案中，如本文一般描述的，通过某些多能性特异性因子的表达来测定多能性。另外或可选地，HIP细胞分化成一种或多种细胞类型作为多能性的指征。

D.过表达CD16、CD32或CD64的HIPO-细胞的产生

在本发明的一些方面，如上产生的HIP细胞将已经是HIPO-细胞，因为该过程将始于具有O型血的多能细胞。

本发明的其它方面包括A和B抗原的酶促转化。在优选方面，使用酶将B抗原转化为O抗原。在更优选方面，酶是-半乳糖苷酶。这种酶消除B抗原的末端半乳糖残基。本发明的其它方面包括将A抗原酶促转化为O抗原。在优选方面，使用-N-乙酰半乳糖胺酶将A抗原转化为O抗原。酶促转化在例如以下文献中进行论述：Olsson等人，Transfusion Clinique etBiologique11:33–39(2004)；美国专利第4,427,777号、第5,606,042号、第5,633,130号、第5,731,426号、第6,184,017号、第4,609,627号和第5,606,042号；以及国际公布第WO9923210号，每一篇都通过引用以其整体并入本文。

本发明的其它实施方案包括通过敲除ABO基因外显子7或沉默SLC14A1(Jk)基因来对细胞进行基因工程改造。本发明的其它实施方案包括敲除Rh血型系统(RH)中的C和E抗原、Kell血型系统(KEL)中的K抗原、Duffy血型系统(Fy)中的Fya和Fy3抗原、Kidd血型系统(JK)中的Jkb抗原或者MNS血型系统中的U和S抗原。可以使用本领域已知的或本文中描述的任何敲除方法，诸如CRISPR、talens或同源重组。

E.本发明的优选实施方案

本发明的过表达CD16、CD32或CD64的HIP、HIPO-、iPSC、iPSCO-、ESC或ESCO-细胞或其衍生物可用于治疗例如1型糖尿病、心脏病、神经病学疾病、癌症、失明、血管疾病和其它对再生医学疗法有反应的疾病。特别地，本发明设想了使用细胞分化成任何细胞类型。因此，本文提供了细胞，所述细胞具有增强的CD16、CD32或CD64表达并表现出多能性，但当作为多能细胞或它们的分化产物移植到同种异体宿主诸如人患者中时，不会导致宿主ADCC或CDC反应。

一方面，本发明的细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中CD16、CD32或CD64表达已增加。CAR可包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，胞外结构域与选自CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CS1、CD171、BCMA、MUC16、ROR1和WT1的抗原结合。在某些实施方案中，胞外结构域包含单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，跨膜结构域包含CD3ζ、CD4、CD8α、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3和BTLA。在某些实施方案中，胞内信号传导结构域包含CD3ζ、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3和BTLA。

在某些实施方案中，CAR包含抗CD19 scFv结构域、CD28跨膜结构域和CD3ζ信号传导胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包含抗CD19 scFv结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB信号传导胞内结构域和CD3ζ信号传导胞内结构域。

在本发明的另一方面，提供了通过体外分化本文所述的任一种细胞而产生的分离的CAR-T过表达细胞CD16、CD32或CD64。在一些实施方案中，细胞是细胞毒性的低免疫CAR-T细胞。

在各种实施方案中，体外分化包括在包含一种或多种生长因子或细胞因子的培养基中培养携带CAR构建体的细胞，所述生长因子或细胞因子选自bFGF、EPO、Flt3L、IGF、IL-3、IL-6、IL-15、GM-CSF、SCF和VEGF。在一些实施方案中，培养基还包含选自BMP激活剂、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂、TGFβ受体/ALK抑制剂和NOTCH激活剂的一种或多种。

在特定的实施方案中，通过体外分化产生的本发明的分离的CAR-T细胞被用作癌症的治疗。

在本发明的另一方面，提供了通过施用包含治疗有效量的本文所述的任何分离的CAR-T细胞的组合物来治疗癌症患者的方法。在一些实施方案中，所述组合物还包含治疗上有效的运载体。

在一些实施方案中，施用步骤包括静脉内施用、皮下施用、结内施用、瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用和腹膜内施用。在某些情况下，施用还包括推注或连续输注。

在一些实施方案中，癌症是选自白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的血癌。在各种实施方案中，癌症是实体瘤癌症或液体瘤癌症。

另一方面，本发明提供了制备本文所述的分离的CAR-T/CD16、CD32或CD64细胞中的任一种的方法。所述方法包括体外分化本发明的任一种细胞，其中体外分化包括在包含一种或多种生长因子或细胞因子的培养基中培养它们，所述生长因子或细胞因子选自bFGF、EPO、Flt3L、IGF、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-15、GM-CSF、SCF和VEGF。在一些实施方案中，培养基还包含选自BMP激活剂、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂、TGFβ受体/ALK抑制剂和NOTCH激活剂的一种或多种。

在一些实施方案中，体外分化包括在饲养细胞上培养HIPO-细胞。在各种实施方式中，体外分化包括在模拟微重力下进行培养。在某些情况下，在模拟微重力下培养至少72小时。

在一些方面，本文提供了从具有增强的CD16、CD32或CD64表达的细胞分化的分离的、工程改造的低免疫心脏细胞(低免疫原性心脏细胞)。

在一些方面，本文提供了治疗患有心疾患或心脏病的患者的方法。所述方法包括施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的任一种分离的、工程改造的低免疫心脏细胞的群体，所述细胞衍生自本文所述的本发明的细胞。在一些实施方案中，所述组合物还包含治疗上有效的运载体。

在一些实施方案中，施用包括植入患者的心脏组织、静脉内注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输注。

在一些实施方案中，心脏疾患或疾病选自儿童心肌病、年龄相关性心肌病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病(restrictive cardiomyopathy)、慢性缺血性心肌病、围产期心肌病、炎性心肌病、其它心肌病、心肌炎、心肌缺血再灌注损伤、心室功能障碍、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、终末期心脏病、动脉粥样硬化、缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏、动脉炎症或心血管疾病。

在一些方面，本文提供了通过体外分化从HIPO-/CD16细胞、CD32细胞或CD64细胞的群体产生低免疫心脏细胞群的方法，其中内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性已被消除，而CD47在HIPO细胞中的表达增加。该方法包括：(a)在包含GSK抑制剂的培养基中培养HIPO-细胞群；(b)在包含WNT拮抗剂的培养基中培养HIPO-细胞群，以产生前心脏细胞群；以及(c)在包含胰岛素的培养基中培养前心脏细胞群，以产生低免疫心脏细胞群。

在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约2μM至约10μM。在一些实施方案中，WNT拮抗剂是IWR1、其衍生物或其变体。在一些情况下，WNT拮抗剂的浓度范围为约2μM至约10μM。

在一些方面，本文提供了从HIPO-细胞分化的分离的、工程改造的过表达CD16、CD32或CD64的内皮细胞。在其它方面，本发明的分离的工程改造的内皮细胞选自毛细血管内皮细胞、血管内皮细胞、主动脉内皮细胞、脑内皮细胞和肾内皮细胞。

在一些方面，本文提供了治疗患有血管疾患或疾病的患者的方法。在一些实施方案中，该方法包括施用包含治疗有效量的本发明的分离的工程改造的内皮细胞群的组合物。

该方法包括施用包含治疗有效量的本文所述的任一种分离的、工程改造的过表达CD16、CD32或CD64的内皮细胞群的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含治疗有效的载体或赋形剂。在一些实施方案中，施用包括植入患者的心脏组织、静脉内注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输注。

在一些实施方案中，所述血管疾患或疾病选自血管损伤、心血管疾病、血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、高血压、缺血性组织损伤、肢体缺血、中风、神经病和脑血管疾病。

在一些方面，本文提供了通过体外分化从过表达CD16、CD32或CD64的细胞群产生低免疫内皮细胞群的方法，其中内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性已被消除，并且HIPO-细胞中CD47表达增加。该方法包括：(a)在包含GSK抑制剂的第一培养基中培养HIPO-细胞群；(b)在包含VEGF和bFGF的第二培养基中培养HIPO-细胞群，以产生前内皮细胞群；以及(c)在包含ROCK抑制剂和ALK抑制剂的第三培养基中培养前内皮细胞群，以产生低免疫内皮细胞群。

在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约1μM至约10μM。在一些实施方案中，ROCK抑制剂为Y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，ROCK抑制剂的浓度范围为约1μM至约20μM。在一些实施方案中，ALK抑制剂为SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约0.5μM至约10μM。

在一些实施方案中，第一培养基包含2μM至约10μM的CHIR-99021。在一些实施例中，第二培养基包含50ng/ml VEGF和10ng/ml bFGF。在其它实施方案中，第二培养基还包含Y-27632和SB-431542。在各种实施方案中，第三培养基包含10μM Y-27632和1μM SB-431542。在某些实施方案中，第三培养基还包含VEGF和bFGF。在特定情况下，第一培养基和/或第二培养基不含胰岛素。

在一些方面，本文提供了从过表达CD16、CD32或CD64的细胞分化的分离的、工程改造的低免疫多巴胺能神经元(DN)。在一些实施方案中，内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性已被消除，CD47表达得以增加，所述神经元是O和Rh-血型。

在一些实施方案中，所述分离的多巴胺能神经元选自神经元干细胞、神经元祖细胞、未成熟多巴胺能神经元和成熟多巴胺能神经元。

在一些方面，本文提供了治疗患有神经变性疾病或疾患的患者的方法。在一些实施方案中，该方法包括施用包含治疗有效量的任一种分离的低免疫多巴胺能神经元群的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含治疗上有效的运载体。在一些实施方案中，分离的低免疫多巴胺能神经元群在可生物降解的支架上。施用可以包括移植或注射。在一些实施方案中，所述神经变性疾病或疾患选自帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化症。

在一些方面，本文提供了通过体外分化产生过表达CD16、CD32或CD64的多巴胺能神经元群的方法。在一些实施方案中，内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性已被消除，CD47表达得以增加，血型是O型和Rh-型。在一些实施方案中，所述方法包括(a)在包含选自sonic hedgehog(SHH)、BDNF、EGF、bFGF、FGF8、WNT1、视黄酸、GSK3β抑制剂、ALK抑制剂和ROCK抑制剂的一种或多种因子的第一培养基中培养细胞群，以产生未成熟多巴胺能神经元群；以及(b)在不同于第一培养基的第二培养基中培养所述未成熟多巴胺能神经元群，以产生多巴胺能神经元群体。

在一些实施方案中，GSKβ抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSKβ抑制剂的浓度范围为约2μM至约10μM。在一些实施方案中，ALK抑制剂为SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约1μM至约10μM。在一些实施方案中，所述第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。

在一些实施方案中，该方法还包括将低免疫多巴胺能神经元群与非多巴胺能神经元分离。在一些实施方案中，该方法还包括冷冻保存所述低免疫多巴胺能神经元的分离群。

在一些方面，本文提供了从过表达CD16、CD32或CD64的细胞分化的分离的工程改造的低免疫胰岛细胞。在一些实施方案中，内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性已被消除，CD47表达得到增加，血型是O型和Rh-型。

在一些实施方案中，所述分离的低免疫胰岛细胞选自胰岛祖细胞、未成熟胰岛细胞和成熟胰岛细胞。

在一些方面，本文提供了治疗糖尿病患者的方法。该方法包括施用包含治疗有效量的本文所述分离的过表达CD16、CD32或CD64的胰岛细胞中任一种的群体的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含治疗上有效的运载体。在一些实施方案中，所述分离的低免疫胰岛细胞的群体在可生物降解的支架上。在一些情况下，施用包括移植或注射。

在一些方面，本文提供了通过体外分化从过表达CD16、CD32或CD64的细胞群产生低免疫胰岛细胞群的方法。在一些实施方案中，在HIPO-细胞中，内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性已被消除，CD47表达得以增加，血型是O型和Rh-型。该方法包括：(a)在第一培养基中培养过表达CD16、CD32或CD64的细胞群以产生未成熟胰岛细胞群，所述第一培养基包含选自胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(EGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、sonichedgehog(SHH)和血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGFβ)超家族、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、骨形态发生蛋白-7(BMP7)、GSK3β抑制剂、ALK抑制剂、BMP 1型受体抑制剂和视黄酸的一种或多种因子；以及(b)在不同于第一培养基的第二培养基中培养未成熟胰岛细胞群，以产生低免疫胰岛细胞群。

在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约2μM至约10μM。在一些实施方案中，ALK抑制剂为SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约1μM至约10μM在一些实施例中，第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。

在一些实施方案中，该方法还包括将过表达CD16、CD32或CD64的胰岛细胞群与非胰岛细胞分离。在一些实施方案中，该方法还包括冷冻保存低免疫胰岛细胞的分离群。

在一些方面，本文提供了从过表达CD16、CD32或CD64的细胞分化的分离的、工程改造的低免疫视网膜色素上皮(RPE)细胞，其中内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性已被消除，CD47表达已被增加，血型为O型和Rh-型。

在一些实施方案中，所述分离的低免疫RPE细胞选自RPE祖细胞、未成熟RPE细胞、成熟RPE细胞和功能性RPE细胞。

在一些方面，本文提供了治疗患有眼疾患的患者的方法。该方法包括施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的本文所述分离的过表达CD16、CD32或CD64的RPE细胞群体中的任一种的群体。在一些实施方案中，所述组合物还包含治疗上有效的运载体。在一些实施方案中，所述分离的低免疫RPE细胞群在可生物降解的支架上。在一些实施方案中，施用包括对患者视网膜的移植或注射。在一些实施方案中，所述眼疾患选自湿性黄斑变性、干性黄斑变性、青少年性黄斑变性、莱伯氏先天性混浊、色素性视网膜炎和视网膜脱落。

在一些方面，本文提供了通过体外分化从细胞群产生过表达CD16、CD32或CD64的视网膜色素上皮(RPE)细胞群的方法。在一些实施方案中，内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性已被消除，并且CD47表达在HIPO-细胞中得以增加。该方法包括：(a)在包含选自激活素A、bFGF、BMP4/7、DKK1、IGF1、头蛋白(noggin)、BMP抑制剂、ALK抑制剂、ROCK抑制剂和VEGFR抑制剂的任一种因子的第一培养基中培养HIPO-细胞群，以产生前RPE细胞群；以及(b)在不同于第一培养基的第二培养基中培养前RPE细胞群，以产生低免疫RPE细胞群。

在一些实施方案中，ALK抑制剂为SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约2μM至约10μM。在一些实施例中，ROCK抑制剂是Y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，ROCK抑制剂的浓度范围为约1μM至约10μM。

在一些实施方案中，所述第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。

在一些实施方案中，该方法还包括将低免疫RPE细胞群与非RPE细胞分离。在一些实施方案中，该方法还包括冷冻保存低免疫RPE细胞的分离群。

在一个方面，人多能干细胞(PSC)通过CD16、CD32或CD64过表达抵抗ADCC或CDC。在一些实施方案中，它们是低免疫多能干细胞(hiPSC)。通过a)破坏每个等位基因(例如B2M-/-)处的B2M基因，b)破坏每个等位基因(例如CIITA-/-)处的CIITA基因，以及c)通过CD47基因(CD47+，例如通过引入一个或多个额外拷贝的CD47基因或激活基因组基因)的过表达，使它们具有低免疫原性。这使得hiPSC群成为B2M-/-CIITA-/-CD47tg。在一个优选方面，所述细胞是非免疫原性的。在另一个实施方案中，如上所述，使HIP细胞成为非免疫原性B2M-/-CIITA-/-CD47 tg，并通过包括诱导型自杀基因而被进一步修饰，当需要时该诱导型自杀基因被诱导在体内杀死细胞。在其它方面，当通过敲除ABO基因外显子7或沉默SLC14A1(JK)基因使HIP细胞成为O型血，并通过敲除Rh血型系统(RH)的C和E抗原、Kell系统(KEL)中的K抗原、Duffy系统(Fy)中的Fya和Fy3抗原、Kidd系统(JK)中的Jkb抗原或MNS血型系统中的U和S抗原使细胞成为Rh-型血时，产生了过表达CD16、CD32或CD64的HIPO细胞。

F.HIPO-/CD16、CD32或CD64细胞的维持

一旦产生，就可以如维持iPSC的状态所知的那样将HIPO-CD16、CD32或CD64细胞维持在未分化状态。例如，使用防止分化和保持多能性的培养基在基质胶上培养HIP细胞。

G.HIPO-/CD16、CD32或CD64细胞的分化

本发明提供了分化成不同细胞类型以用于随后移植入受试者的HIPO-/CD16、CD32或CD64细胞。如本领域技术人员所理解的，分化方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。将细胞在悬浮液中分化，然后置于凝胶基质形式(诸如基质凝胶、明胶或纤维蛋白/凝血酶形式)中，以促进细胞存活。如本领域已知的那样，通常通过评估细胞特异性标志物的存在来测定分化。

在一些实施方案中，将HIPO-/CD16、CD32或CD64细胞分化成肝细胞，以解决肝细胞功能丧失或肝硬化。有许多技术可用于将HIPO-细胞分化成肝细胞；参见例如Pettinato等人，doi:10.1038/spre32888,Snykers等人，Methods Mol Biol 698:305-314(2011),Si-Tayeb等人，Hepatology 51:297-305(2010)和Asgari等人，Stem Cell Rev(:493-504(2013)，所有这些文献据此通过引用以其整体明确地并入，特别是对于用于分化的方法和试剂。如本领域已知的那样，通常通过评估肝细胞相关和/或特异性标志物(包括但不限于白蛋白、甲胎蛋白和纤维蛋白原)的存在来测定分化。也可以从功能(诸如氨的代谢、LDL的储存和摄取、ICG的摄取和释放以及糖原的储存)上测量分化。

在一些实施方案中，HIPO-/CD16、CD32或CD64细胞分化成β样细胞或胰岛类器官，用于移植以治疗I型糖尿病(T1DM)。细胞系统是解决T1DM的有前途的方法，参见例如Ellis等人，doi/10.1038/nrgastro.2017.93，其通过引用并入本文。另外，Pagliuca等人报道了从hiPSC至β细胞的成功分化(参见doi/10.106/j.cell.2014.09.040，其据此通过引用以其整体并入，特别是对于其中概述的用于从人多能干细胞大规模产生功能性人β细胞的方法和试剂)。此外，Vegas等人显示了从人多能干细胞产生人β细胞，然后进行封装以避免宿主的免疫排斥；(doi:10.1038/nm.4030，据此通过引用以其整体并入，特别是对于其中概述的用于从人多能干细胞大规模产生功能性人β细胞的方法和试剂)。

如本领域已知的那样，通常通过评估β细胞相关或特异性标志物(包括但不限于胰岛素)的存在来测定分化。还可从功能上测量分化，诸例如测量葡萄糖代谢，通常参见Muraro等人，doi:10.1016/j.cels.2016.09.002，其据此通过引用以其整体并入，特别是对于其中概述的生物标志物。

一旦产生了dHIPO-/CD16、CD32或CD64细胞，就可以将它们移植(作为细胞悬液或在本文所述的凝胶基质内)到门静脉/肝、网膜、胃肠粘膜、骨髓、肌肉或皮下囊(subcutaneous pouches)中。

在一些实施方案中，将所述HIPO-/CD16、CD32或CD64细胞分化成视网膜色素上皮(RPE)，以治疗威胁视力的眼部疾病。已经使用Kamao等人，Stem Cell Reports 2014:2:205-18(据此通过引用以其整体并入，特别是对于其中概述的用于分化技术和试剂的方法和试剂)中概述的技术将人多能干细胞分化成RPE细胞；另参见Mandai等人，doi:10.1056/NEJMoa1608368，对于用于产生RPE细胞片和移植到患者体内的技术，也以其整体并入。

可以如本领域已知的那样，通常通过评估RPE相关和/或特异性标志物的存在或通过功能性测量来测定分化。参见例如Kamao等人，doi:10.1016/j.stemcr.2013.12.007，其据此通过引用以其整体并入，特别是结果部分第一段中概述的标志物。

在一些实施方案中，将所述HIPO-/CD16、CD32或CD64细胞分化成心肌细胞以治疗心血管疾病。用于将hiPSC分化为心肌细胞的技术是本领域已知的，并在实施例中进行了论述。可以如本领域已知的那样，通常通过评估心肌细胞相关或特异性标志物的存在或通过功能性测量来测定分化；参见例如Loh等人，doi:10.1016/j.cell.2016.06.001，其据此通过引用以其整体并入，特别是对于分化包括心肌细胞在内的干细胞的方法。

在一些实施方案中，将HIPO-/CD16、CD32或CD64细胞分化成内皮集落形成细胞(ECFC)以形成新血管来治疗外周动脉疾病。分化内皮细胞的技术是已知的。参见例如Prasain等人，doi:10.1038/nbt.3048，其通过引用以其整体并入，特别是对于用于从人多能干细胞产生内皮细胞的方法和试剂，以及移植技术。可如本领域已知的那样，通常通过评估内皮细胞相关或特异性标志物的存在或通过功能性测量来测定分化。

在一些实施方案中，将HIPO-/CD16、CD32或CD64细胞分化成甲状腺祖细胞和甲状腺滤泡类器官，其可分泌甲状腺激素来治疗自身免疫性甲状腺炎。分化甲状腺细胞的技术是本领域已知的。参见例如Kurmann等，doi:10.106/j.stem.2015.09.004，其据此通过引用以其整体明确地并入，特别是对于用于从人多能干细胞产生甲状腺细胞的方法和试剂，以及移植技术。可如本领域已知的那样，通常通过评估甲状腺细胞相关或特异性标志物的存在或通过功能性测量来测定分化。

H.分化的HIPO-/CD16、CD32或CD64细胞的移植

如本领域技术人员所理解的，使用本领域已知的技术移植分化的HIPO-/CD16、CD32和CD64衍生物，这取决于细胞类型和这些细胞的最终用途。一般来说，将本发明的细胞通过静脉内途径或通过注射在患者的特定部位来进行移植。当移植到特定位置时，可将细胞悬浮在凝胶基质中以防止在它们固定时分散。

为了更全面地理解本文所述的发明，提出了以下实施例。应该理解的是，这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不能解释为以任何方式限制本发明。

实施例

如WO2018/132783、PCT/US19/42123、PCT/US19/42117和临时申请第62/698,973号、第62/698,978号、第62/698,981号、第62/698,984号、第62/846,399号、第62/855,499号(其中每一篇通过引用以其整体并入本文)中所公开的那样，产生HIP和HIPO-细胞。

实施例1：CD64保护巨噬细胞免于NK细胞ADCC杀伤

当用抗CD52抗体攻击时，组成型CD64表达显示保护天然表达CD52的巨噬细胞免于NK细胞ADCC。将组成型表达CD52的低免疫巨噬细胞(衍生自B2M^-/-CIITA^-/-CD47 tg HIPiPSC)铺在XCelligence平台上进行体外阻抗测定(ACEA BioSciences,San Diego,CA)。它们附着在塑料培养皿上，形成汇合层。以0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml或1.0μg/ml的浓度加入FDA批准的人源化IgG抗体阿仑珠单抗(Bio-Rad,Hercules,CA，目录号MCA6101)。阿仑珠单抗是能够介导ADCC和CDC的抗CD52抗体。然后，将NK细胞加入到测定中。通过测量特殊的96孔E板(ACEA BioSciences)上电极之间的阻抗来评估巨噬细胞的杀伤。

图3上排显示，高浓度的阿仑珠单抗对于NK细胞介导的ADCC是必需的，巨噬细胞仅在1.0μg/ml时被杀死。不希望受理论束缚，在最高的阿仑珠单抗浓度下，推测所有的CD64受体都被占据并且不能用于隔离足够的阿仑珠单抗Fc结构域以减轻ADCC。当将针对CD64的封闭抗体(Thermo Fisher Scientific,Carlsbad,CA，克隆号10.1，目录号MA1-10270)以5μg/ml的浓度(下排)加入到测定中时，ADCC杀伤得以增强。在0.001μg/ml的阿仑珠单抗浓度下已经开始靶细胞杀伤。随着阿仑珠单抗浓度的增加，在CD64封闭抗体存在的情况下巨噬细胞杀伤变得更加高效。

实施例2：CD64保护巨噬细胞免受CDC的杀伤

当用抗CD52抗体攻击时，CD64显示出保护CD52+巨噬细胞免受CDC攻击。将巨噬细胞铺在Xcelligence平板上，并如实施例1中一样用阿仑珠单抗进行攻击。加入来自A型血供体的血清(与靶细胞的血型相容)，以避免在测定中产生额外的血型抗体。然而，所有的补体组分都存在。图5的第一排显示巨噬细胞具有一定的针对CDC的组成性保护，因为较低浓度的阿仑珠单抗不会导致重大杀伤。在0.001μg/ml和0.01μg/ml的阿仑珠单抗下，清楚地显示了CD64保护作用。这是因为抗CD64抗体导致显著的CDC死亡。(图5，下排)。这表明巨噬细胞通过其CD64表达而具有针对CDC的组成型保护，所述保护在高抗体浓度下可被压制。

实施例3：CD64保护工程改造的内皮细胞免受NK细胞的ADCC杀伤

当用抗CD52抗体攻击时，CD64显示保护CD52+内皮细胞免于ADCC。如下从HIP细胞分化出内皮细胞。分化方案在60％HIP汇合时开始，然后将培养基换成含有2％B-27(减去胰岛素)(两者均来自Gibco，Thermo Fisher Scientific Brand)和5μM CHIR-99021(Selleckchem，Munich，Germany)的RPMI-1640。第2天，将培养基换成简化培养基：含有2％B-27(减去胰岛素)(Gibco)和2μMCHIR-99021(Selleckchem)的RPMI-1640。从培养第4天至第7天，将细胞暴露于RPMI-1640Ec培养基(含有2％B-27(减去胰岛素)加上50ng/ml人血管内皮生长因子(VEGF；R&D Systems,Minneapolis,MN)、10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(FGFb；R&D Systems)、10μM Y-27632(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和1μM SB 431542(Sigma-Aldrich)的RPMI-1640)。从第7天开始可见内皮细胞簇，并且将细胞维持在内皮细胞基础培养基2(PromoCell,Heidelberg,Germany)加上补充物、10％FCS hi(Gibco)、1％pen/strep、25ng/ml VEGF、2ng/ml FGFb、10μM Y-27632(Sigma-Aldrich)和1μM SB431542(Sigma-Aldrich)中。分化方案在14天后完成；未分化的细胞在分化过程中脱落。TrypLEExpress(Gibco)用于每3至4天以1:3的比例对细胞进行传代。然后用表达CD52的慢病毒载体转化HIP衍生的上皮细胞：对于转染实验，将1.5×10⁵个人B2M^-/-CIITA^-/-CD47 tg EC铺在6孔板的每个孔中。将细胞在细胞培养箱中于37℃孵育过夜。第二天，以3:2的比例使用Fugene(Promaga,Fitchburg,WI)和5μg的CD52表达颗粒(Origene,Rockville,Md，目录号：RC200493L2V)进行转染。将转染试剂溶液移液至OptiMEM(Gibco)，混合，并在室温下孵育10分钟。将DNA转染复合物置于2ml细胞培养基中。24h后，停止转染，并将细胞在内皮细胞培养基(Gibco)中再生长48h。通过流式细胞术分析证实了成功转染，并通过在FACS Aria(CD52APC：克隆HI186,Biolegend)上进行的FACS分选富集CD52阳性细胞。

用慢病毒进一步转化CD52+B2M^-/-CIITA^-/-CD47 tg EC的一个亚群，以使用同一方案表达CD64。以3:2的比例使用Fugene(Promaga)和5μg的CD64表达质粒(Origene,Rockville,MD，目录号：RC207487L2V)进行转染。如上所述停止转染，并将细胞再扩增48小时。通过流式细胞术分析证实了成功转染，并通过在FACS Aria(CD64PE：克隆10.1，BD)上进行的FACS分选富集CD64阳性细胞。然后将该CD52/CD64双阳性群体进行培养扩增。

在XCelligence测定中评估了两个EC系。在图4的顶排上显示了CD52赋予显著的ADCC易感性。下排中表达CD64的CD52 tg EC受到了明显更好的免受ADCC的保护作用，尤其是在较低的阿仑珠单抗浓度下。

使用不同的测定，再次显示CD64在用抗CD52抗体攻击时保护CD52+小鼠内皮细胞免受ADCC。如下从小鼠HIP iPSC分化出内皮细胞。将小鼠HIP iPSC铺在6孔板中的明胶上，并维持在小鼠iPSC培养基中。在细胞达到60％汇合后，开始分化，并将培养基更换为含有2％B-27(减去胰岛素)(两者均来自Gibco)和5μM CHIR-99021(Selleckchem,Munich,Germany)的RPMI-1640。第2天，将培养基更换为简化培养基：含有2％B-27(减去胰岛素)(两者均来自Gibco)和2μM CHIR-99021(Selleckchem)的RPMI-1640。从第4天至第7天，将细胞暴露于RPMI-1640EC培养基(含有2％B-27(减去胰岛素)加上50ng/mL小鼠血管内皮生长因子(mVEGF；R&D Systems,Minneapolis,MN)、10ng/mL小鼠碱性成纤维细胞生长因子(mFGFb；R&D Systems)、10μM Y-27632(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)和1μM SB 431542(Sigma-Aldrich)的RPMI-1640)。从第7天开始可见内皮细胞簇，将细胞维持在EGM-2SingleQuots培养基(Lonza)加上10％FCS hi(Gibco)、25ng/mL mVEGF、2ng/mL mFGFb、10μM Y-27632(Sigma-Aldrich)和1μM SB 431542中。21天后分化过程完成，未分化的细胞在分化过程中脱落。为了进行纯化，使用抗CD15单克隆抗体包被的磁性微珠(Miltenyi,Auburn,CA)按照制造商的方案对细胞进行MACS纯化，用于负选择。在EGM-2SingleQuots培养基加补充剂和10％FCS hi中培养流通液中的高度纯化的miEC。每3至4天以1∶3用TrypLE对细胞进行传代。通过CD31(ab28364，Abcam)和VE-钙粘蛋白(sc-6458，Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)的免疫荧光(IF)来确认它们的表型。

用表达CD52的慢病毒载体转导一些HIP衍生的小鼠iEC：对于转染实验，将1.5×10⁵个小鼠HIP iEC铺在6孔板的每个孔中。将细胞在细胞培养箱中于37℃孵育过夜。第二天，使用Fugene(Promaga,Fitchburg,WI)和5μg的CD52表达颗粒(Origene,Rockville,MD，目录号：RC200493L2V)以3：2的比例进行转染。将转染试剂溶液移液至OptiMEM(Gibco)，混合，并在室温下孵育10分钟。将DNA转染复合物加入到2ml细胞培养基中。24小时后，停止转染，并将细胞在内皮细胞培养基(Gibco)中再生长48小时。

使用同一方案，用慢病毒进一步转化一个小鼠HIP iEC(Cd52)亚群，以表达CD64。以3:2的比例使用Fugene(Promaga)和5μg的CD64表达质粒(Origene,Rockville,Md，目录号：RC207487L2V)进行转染。如上所述停止转染，并将细胞再扩增48小时。

根据上述方案，对一些HIP衍生的小鼠iEC进行转导以仅表达CD64。

图6A-图6C显示了具有转基因的强表达的成功转染。显示了小鼠HIP iECS(CD52,图6A)、小鼠HIP iEC(CD52 CD64，图6B)和小鼠HIP iEC(CD64，图6C)的流式细胞术直方图。使用针对CD52(CD52APC：克隆HI186，Biolegend)和CD64(CD64 PE：克隆10.1，BD)的抗体进行流式细胞术分析。对所有iEC池进行培养扩增，用于后续测定。

使用流式细胞仪评估iEC结合阿仑珠单抗Fc的能力。将细胞与浓度为0.0001μg/ml至1.0μg/ml的阿仑珠单抗(目录号MCA6101,BioRad,Hercules,CA)一起孵育。使用山羊抗人IgG(H+L)F(ab')2二抗(目录号Q-11221MP,Qdot 655tag,Invitrogen)来定量阿仑珠单抗Fc结合。该分析在LSRFortessa细胞计数器(BD Biosciences)上进行。

图7A显示小鼠HIP iEC不结合任何阿仑珠单抗。然而，小鼠HIP iEC(CD64)能够以浓度依赖的方式结合阿仑珠单抗Fc(图7B)。

在XCelligence测定中用具有ADCC能力的不同同系B6效应免疫细胞评估小鼠B6iEC(CD52)和小鼠B6 iEC(CD52，CD64)。图8上排显示CD52+iEC经受了浓度依赖的阿仑珠单抗介导的NK细胞ADCC。在所有测试浓度下，下排中表达CD64的CD52 tg iEC都受到保护而免于NK细胞杀伤。

图9显示了用同系B6巨噬细胞作为效应细胞的Xcelligence测定。CD52+iEC经受了浓度依赖性阿仑珠单抗介导的巨噬细胞ADCC。在所有测试浓度下，下排中表达CD64的cCD52tg iEC都受到保护而免于巨噬细胞的杀伤。

图10显示了用同系B6多形核细胞(PMN)作为效应细胞的Xcelligence测定。CD52+iEC经受了浓度依赖性仑珠单抗介导的PMN ADCC。在所有测试浓度下，下排中的CD64共表达保护了靶标免受PMN杀伤。因此，即使在1.0μg/ml的高阿仑珠单抗浓度下，iEC上的CD64表达也能抵抗所有ADCC。

为了进一步证实表达CD64的HIP细胞仍然受到保护而免受同种异体NK细胞、巨噬细胞和PMN的杀伤，对同种异体效应免疫细胞重复上述分析。在这些测定中，通过靶细胞抗体结合或通过经由直接细胞间相互作用检测的同种异体抗原来刺激效应细胞。

图11上排显示CD52+B6 HIP iEC经受通过同种异体BALB/cNK细胞进行的浓度依赖性阿仑珠单抗介导的ADCC。在所有测试浓度下，下排中表达CD64的CD52 tg HIP iEC均受到保护而免受同种异体NK细胞杀伤。同种异体NK细胞没有额外的直接杀伤作用。

图12显示了用同种异体BALB/c巨噬细胞作为效应细胞的Xcelligence测定。CD52+HIP iEC经受通过同种异体巨噬细胞进行的浓度依赖性阿仑珠单抗介导的ADCC。在所有测试浓度下，下排中表达CD64的CD52 tg HIP iEC都受到保护而免受同种异体巨噬细胞的杀伤。同种异体巨噬细胞没有额外的直接杀伤作用。

图13显示了用同种异体BALB/c PMN作为效应细胞的Xcelligence测定。CD52+HIPiEC经受通过同种异体PMN进行的浓度依赖性阿仑珠单抗介导的ADCC。在所有测试浓度中，下排中的CD64共表达再次保护靶标免受同种异体PMN的杀伤。同种异体PMN没有额外的直接杀伤作用。因此，表达CD64的HIP iEC受到保护而免受同系和同种异体先天免疫细胞通过ADCC和直接细胞毒性两者的杀伤。

图14显示了将Xcelligence平台上的小鼠B6 HIP iEC(CD52)与相容的同系B6血清和浓度递增的阿仑珠单抗一起孵育。甚至在0.0001μg/ml的非常低的阿仑珠单抗浓度下，CD52+小鼠B6 HIP iEC对阿仑珠单抗介导的CDC易感(上排)。因为这些靶标不表达CD64，所以针对CD64的封闭抗体不影响靶细胞杀伤(下排)。

图15显示共表达CD64的CD52+小鼠B6 HIP iEC在所有测试的阿仑珠单抗浓度下都受到保护而免受CDC(上排)。针对CD64的封闭抗体消除了所述保护作用，并使靶标易受CDC(下排)。

实施例4：CD64保护工程改造的人内皮细胞免受ADCC和CDC杀伤

将人HIP iPCS分化为内皮细胞(iEC)。分化方案在60％HIP iPSC汇合时开始，并将培养基换成含有2％B-27(减去胰岛素)(两者均来自Gibco，a Thermo Fisher ScientificBrand)和5μM CHIR-99021(Selleckchem,Munich,Germany)的RPMI-1640。第2天，将培养基换成简化培养基：含有2％的B-27(减去胰岛素)(Gibco)和2μMCHIR-99021(Selleckchem)的RPMI-1640。从培养第4天至第7天，将细胞暴露于RPMI-1640EC培养基(含有2％B-27(减去胰岛素)加上50ng/ml人血管内皮生长因子(VEGF；R&D Systems,Minneapolis,MN)、10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(FGFb；R&D Systems)、10μM Y-27632(Sigma-Aldrich)和1μM SB431542(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的RPMI-1640)。从第7天开始可见内皮细胞簇，并且将细胞维持在内皮细胞基础培养基2(PromoCell,Heidelberg,Germany)加上补充物、10％FCS hi(Gibco)、1％pen/strep、25ng/ml VEGF、2ng/ml FGFb、10μM Y-27632(Sigma-Aldrich)和1μM SB 431542(Sigma-Aldrich)中。分化方案在14天后完成；未分化的细胞在分化过程中脱落。TrypLE Express(Gibco)用于每3至4天以1:3的比例对细胞进行传代。

然后用表达CD52的慢病毒载体转化一些人HIP iEC：对于转染分析，将1.5×10⁵个人HIP iEC铺在6孔板的每个孔中。将细胞在细胞培养箱中于37℃孵育过夜。第二天，以3:2的比例使用Fugene(Promaga,Fitchburg,WI)和5μg的CD52表达颗粒(Origene,Rockville,MD，目录号：RC200493L2V)进行转染。将转染试剂溶液移液至OptiMEM(Gibco)，混合，并在室温下孵育10分钟。将DNA转染复合物加入到2ml细胞培养基中。24小时后，停止转染，并将细胞在内皮细胞培养基(Gibco)中再生长48小时。

使用同一方案，用慢病毒进一步转染一个人HIP iEC(CD52)亚群以表达CD64。以3:2的比例使用Fugene(Promaga)和5μg的CD64表达质粒(Origene,Rockville,MD，目录号：RC207487L2V)进行转染。如上所述停止转染，并将细胞再扩增48小时。

按照上述方案，转导一些HIP来源的人IEC以仅表达CD64。

图16A-16C显示了转基因强表达的成功转染。显示了人HIP iEC(CD52,图16A)、人HIP iEC(CD52 CD64，图16B)和小鼠HIP iEC(CD64，图16C)的流式细胞术直方图。使用针对CD52(CD52 APC：克隆HI186，Biolegend)和CD64(CD64 PE：克隆10.1，BD)的抗体进行流式细胞术分析。对所有iEC池进行培养扩增，用于后续测定。

使用流式细胞术评估人HIP iEC结合阿仑珠单抗Fc的能力。将细胞与浓度为0.0001μg/ml至1.0μg/ml的阿仑珠单抗(目录号MCA6101,BioRad,Hercules,CA)一起孵育。使用山羊抗人IgG(H+L)F(ab')2二抗(目录号Q-11221MP,Qdot 655tag,Invitrogen)来定量阿仑珠单抗Fc结合。该分析在LSRFortessa细胞计数器(BD Biosciences)上进行。

图17A显示人HIP iEC不结合任何阿仑珠单抗。然而，人HIP iEC(CD64)能够以浓度依赖性方式结合阿仑珠单抗Fc(图17B)。

由于巨噬细胞组成性表达CD64，因此它们被用作对照来比较人HIP iEC的阿仑珠单抗Fc结合能力。通过Ficoll分离从新鲜志愿者血液中分离出PBMC，并将其重悬于含有10％FCS hi、1％pen-strep(均来自Gibco)和10ng/ml人M-CSF(Peprotech)的RPMI 1640中。将细胞以1×10⁶个细胞/ml(1ml/24孔板)的浓度铺在24孔板中，并且每隔一天更换培养基，直至第6天。从第6天开始用1μg/ml人IL2(Peprotech)刺激巨噬细胞24小时，然后将细胞用于测定。

图18显示了人巨噬细胞结合阿仑珠单抗Fc的能力。阿仑珠单抗Fc结合是浓度依赖性的。

图19上排显示CD52+人HIP iEC经受通过同种异体NK细胞进行的浓度依赖性阿仑珠单抗介导的ADCC。下排中表达CD64的CD52tg HIP iEC在很大程度上受到保护而免受同种异体NK细胞杀伤。仅在1.0μg/ml的抗CD52抗体(阿仑珠单抗)下发生杀伤。同种异体NK细胞没有额外的直接杀伤作用。

图20上排显示CD52+人HIP iEC经受同种异体巨噬细胞引起的浓度依赖性阿仑珠单抗介导的ADCC。下排中表达CD64的CD52 tg HIP iEC在很大程度上受到保护而免受同种异体NK细胞的杀伤。仅在1.0μg/ml的抗CD52抗体(阿仑珠单抗)下发生杀伤。同种异体巨噬细胞没有额外的直接杀伤作用。因此，表达CD64的人HIP iEC受到保护而免受同种异体NK细胞和巨噬细胞通过ADCC和直接细胞毒性两者的杀伤。

图21显示了XCelligence平台上的人HIP iEC(CD52)与相容的、ABO匹配的同种异体血清和浓度递增的阿仑珠单抗的孵育。甚至在0.001μg/ml的极低阿仑珠单抗浓度下，CD52+人HIP iEC对阿仑珠单抗介导的CDC易感(上排)。因为这些靶标不表达CD64，因此针对CD64的封闭抗体不影响靶细胞杀伤(下排)。

图22显示了共表达CD64的CD52+人HIP iEC在很大程度上受到保护而免受CDC(上排)。仅在1.0μg/ml的抗CD52抗体(阿仑珠单抗)下发生杀伤。针对CD64的封闭抗体消除了所述保护作用，并使靶标易受CDC的攻击(下排)。

实施例5：甲状腺上皮细胞上的CD64表达隔离IgG抗体Fc

在甲状腺上皮细胞中进行了靶细胞上的CD64表达以隔离IgG Fc、从而保护所述细胞免受ADCC和CDC的研究。在桥本氏病中，这些细胞通常受到自身免疫抗体的攻击，因此是临床相关的细胞类型。购买了小鼠B6甲状腺上皮细胞(目录号：mGFP-6040，CellBiologics，Chicago，IL)和永生化人甲状腺上皮细胞(目录号：IINS-CI-1017,InSCREENeX,Braunschweig,Germany)。如上所概述的那样实现CD64表达。

图23显示CD64在人甲状腺上皮细胞(epiC，图23A)和小鼠epiC(图23B)中的成功表达。如上所述，在结合测定中评估所述细胞结合阿仑珠单抗Fc的能力。人epiC不能结合阿仑珠单抗Fc，但CD64+人epiC显示IgG Fc的浓度依赖性结合(图23C)。类似地，小鼠epiC不能结合阿仑珠单抗Fc，但CD64+小鼠epiC显示IgG Fc的浓度依赖性结合(图23D)。

接着，分析了表达CD64的人和小鼠epiC对抗TPO Fc的隔离作用。自身免疫性甲状腺炎(桥本氏病)中诱导的抗TPO抗体是人中甲状腺细胞的破坏和甲状腺功能减退症形成的原因。设计了使用兔抗小鼠TPO抗体(多克隆，目录号：ab203057，Abcam,Cambridge,MA)的疾病模型。这种抗体识别小鼠甲状腺上皮细胞上的TPO，并能通过Fc与人CD64结合。

使用流式细胞术评估人和小鼠甲状腺epiC结合抗TPO Fc的能力。将细胞与浓度为0.0001μg/ml至1.0μg/ml的抗TPO(多克隆，目录号：ab203057，Abcam,Cambridge,MA)一起孵育。使用山羊抗兔IgG(H+L)F(ab’)2二抗(目录号Q11422MP，Qdot 655tag，Invitrogen)来定量抗TPO Fc结合。该分析在LSRFortessa细胞计数器(BD Biosciences)上进行。

图24A和图24B显示了人epiC不能结合抗TPO Fc，但CD64+人epiC显示了抗TPO Fc的浓度依赖性结合(图24A)。类似地，小鼠epiC不能结合抗TPO Fc，但CD64+小鼠epiC显示抗TPO Fc的浓度依赖性结合(图23B)。因此，Fc隔离的概念在临床相关的细胞类型中得到证实。

图25显示了XCelligence平台上C57BL/6甲状腺epiC的体外杀伤。将靶细胞与不同浓度的抗TPO(0.001μg/ml至1.0μg/ml)和作为ADCC效应细胞的同系巨噬细胞一起孵育。在0.01μg/ml至1.0μg/ml的抗TPO浓度下观察到靶细胞杀伤。这表明小鼠epiC在体外对抗TPOADCC易感。

图26显示了相同的分析设计，但使用表达CD64的C57BL/6甲状腺epiC。当与抗TPO和同系巨噬细胞一起孵育时，在任何抗TPO浓度下都没有观察到杀伤作用。CD64的表达被证明能有效地保护小鼠甲状腺epiC免受抗TPO ADCC。

实施例6：CD64表达保护小鼠内皮细胞免受体内杀伤

体内模型显示CD64保护小鼠内皮细胞免受抗体介导的排斥。选择同系C57BL/6小鼠作为C57BL/6HIP iEC的受体，以避免同种异体细胞排斥，因此，该模型是纯抗体驱动的。皮下移植一百万表达CD52的小鼠HIP iEC。在腹膜内移植后的第0天和第3天以1mg剂量施用阿仑珠单抗。每天使用BLI对动物成像以评估移植细胞存活。

图27A和图27B显示了移植物在体内的存活。图27A显示了不用阿仑珠单抗处理(左)和用阿仑珠单抗治疗处理(右)的C57BL/6HIP iEC(CD52)的存活率。阿仑珠单抗施用导致第5天100％的移植物丢失。图27B显示了不使用阿仑珠单抗(左)和使用阿仑珠单抗处理(右)的C57BL/6HIP iEC(CD52,CD64)的存活。所有移植物受到保护而免受抗体介导的排斥，并且所有移植物在研究期间都存活，而没有BLI信号的相关下降。该分析证实了CD64表达使靶细胞对抗体介导的排斥反应具有抗性。该体内模型结合了ADCC和CDC的杀伤机制。

示例性序列：

SEQ ID NO:1–人β-2-微球蛋白

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDI

SEQ ID NO:2–人CIITA蛋白，N端160个氨基酸

MRCLAPRPAGSYLSEPQGSSQCATMELGPLEGGYLELLNSDADPLCLYHFYDQMDLAGEEEIELYSEPDTDTINCDQFSRLLCDMEGDEETREAYANIAELDQYVFQDSQLEGLSKDIFKHIGPDEVIGESMEMPAEVGQKSQKRPFPEELPADLKHWKP

SEQ ID NO:3–人CD47

MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVE

SEQ ID NO:4–单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)

MASYPCHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRLEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWQVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHVGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWWEDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN

SEQ ID NO:5–大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)

MSNNALQTIINARLPGEEGLWQIHLQDGKISAIDAQSGVMPITENSLDAEQGLVIPPFVEPHIHLDTTQTAGQPNWNQSGTLFEGIERWAERKALLTHDDVKQRAWQTLKWQIANGIQHVRTHVDVSDATLTALKAMLEVKQEVAPWIDLQIVAFPQEGILSYPNGEALLEEALRLGADVVGAIPHFEFTREYGVESLHKTFALAQKYDRLIDVHCDEIDDEQSRFVETVAALAHHEGMGARVTASHTTAMHSYNGAYTSRLFRLLKMSGINFVANPLVNIHLQGRFDTYPKRRGITRVKEMLESGINVCFGHDDVFDPWYPLGTANMLQVLHMGLHVCQLMGYGQINDGLNLITHHSARTLNLQDYGIAAGNSANLIILPAENGFDALRRQVPVRYSVRGGKVIASTQPAQTTVYLEQPEAIDYKR

SEQ ID NO:6–截短的人半胱天冬酶9

GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS

SEQ ID NO:7–人CD64

NM_000566

MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHVLFYLAVGIMFLVNTVLWVTIRKELKRKKKWDLEISLDSGHEKKVISSLQEDRHLEEELKCQEQKEEQLQEGVHRKEPQGAT

SEQ ID NO:8–人CD52

NM_001803

MKRFLFLLLTISLLVMVQIQTGLSGQNDTSQTSSPSASSNISGGIFLFFVANAIIHLFCFS

SEQ ID NO:9–人CD16 FCGR3A

NM_001803

MAEGTLWQILCVSSDAQPQTFEGVKGADPPTLPPGSFLPGPVLWWGSLARLQTEKSDEVSRKGNWWVTEMGGGAGERLFTSSCLVGLVPLGLRISLVTCPLQCGIMWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK

SEQ ID NO:10–人CD16 FCGR3B

NM_001803

MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYSVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNENLISSQASSYFIDAATVNDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKDRKYFHHNSDFHIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFSPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNI

SEQ ID NO:11–人CD32 FCGR2A

NM_001803

MTMETQMSQNVCPRNLWLLQPLTVLLLLASADSQAAAPPKAVLKLEPPWINVLQEDSVTLTCQGARSPESDSIQWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYTCQTGQTSLSDPVHLTVLSEWLVLQTPHLEFQEGETIMLRCHSWKDKPLVKVTFFQNGKSQKFSHLDPTFSIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLFSSKPVTITVQVPSMGSSSPMGIIVAVVIATAVAAIVAAVVALIYCRKKRISANSTDPVKAAQFEPPGRQMIAIRKRQLEETNNDYETADGGYMTLNPRAPTDDDKNIYLTLPPNDHVNSNN

SEQ ID NO:12–人CD32 FCGR2B

NM_001803

MGILSFLPVLATESDWADCKSPQPWGHMLLWTAVLFLAPVAGTPAAPPKAVLKLEPQWINVLQEDSVTLTCRGTHSPESDSIQWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYTCQTGQTSLSDPVHLTVLSEWLVLQTPHLEFQEGETIVLRCHSWKDKPLVKVTFFQNGKSKKFSRSDPNFSIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLYSSKPVTITVQAPSSSPMGIIVAVVTGIAVAAIVAAVVALIYCRKKRISALPGYPECREMGETLPEKPANPTNPDEADKVGAENTITYSLLMHPDALEEPDDQNRI

SEQ ID NO:13–人CD32 FCGR2C

NM_001803

MGILSFLPVLATESDWADCKSPQPWGHMLLWTAVLFLAPVAGTPAAPPKAVLKLEPQWINVLQEDSVTLTCRGTHSPESDSIPWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYTCQTGQTSLSDPVHLTVLSEWLVLQTPHLEFQEGETIVLRCHSWKDKPLVKVTFFQNGKSKKFSRSDPNFSIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLYSSKPVTITVQAPSSSPMGIIVAVVTGIAVAAIVAAVVALIYCRKKRISANSTDPVKAAQFEPPGRQMIAIRKRQPEETNNDYETADGGYMTLNPRAPTDDDKNIYLTLPPNDHVNSNN

在本文公开或提及的所有出版物和专利文件都通过引用以其整体并入。前面的描述仅仅是为了说明和描述的目的。该描述并不旨在将本发明限制于所公开的精确形式。本发明的范围旨在由其所附的权利要求来限定。

Claims (42)

1.一种经修饰的多能细胞，其中当与所述经修饰的多能细胞的亲代形式相比时，所述经修饰的多能细胞具有提高的CD16、CD32或CD64蛋白表达水平，其中所述提高的蛋白质表达导致所述经修饰的多能细胞对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)更不敏感。

2.根据权利要求1所述的经修饰的多能细胞，其中所述提高的蛋白质表达是CD64蛋白，并且其中所述CD64蛋白与SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性。

3.根据权利要求2所述的经修饰的多能细胞，其中所述CD64蛋白具有SEQ ID NO:7的序列。

4.根据权利要求1所述的经修饰的多能细胞，其中所述经修饰的细胞衍生自人低免疫原性多能(HIP)细胞。

5.根据权利要求1所述的经修饰的多能细胞，其中所述经修饰的细胞衍生自人低免疫原性多能ABO血型O型恒河猴因子阴性(HIPO-)细胞。

6.根据权利要求1所述的经修饰的多能细胞，其中所述经修饰的细胞衍生自人诱导多能干细胞(iPSC)。

7.根据权利要求1所述的经修饰的多能细胞，其中所述经修饰的细胞衍生自人胚胎干细胞(ESC)。

8.根据权利要求1所述的经修饰的多能细胞，其中所述经修饰的细胞来自选自人、猴、牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠和豚鼠的物种。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的经修饰的多能细胞，所述多能细胞还包含由引起所述经修饰的细胞死亡的引发剂激活的自杀基因。

10.根据权利要求9所述的经修饰的多能细胞，其中所述自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk),并且所述引发剂是更昔洛韦。

11.根据权利要求10所述的经修饰的多能细胞，其中所述HSV-tk基因编码与SEQ IDNO:4具有至少90％序列同一性的蛋白质。

12.根据权利要求11所述的经修饰的多能细胞，其中所述HSV-tk基因编码包含SEQ IDNO:4的序列的蛋白质。

13.根据权利要求9所述的经修饰的多能细胞，其中所述自杀基因是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(EC-CD),并且所述引发剂是5-氟胞嘧啶(5-FC)。

14.根据权利要求13所述的经修饰的多能细胞，其中所述EC-CD基因编码与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的蛋白质。

15.根据权利要求14所述的经修饰的多能细胞，其中所述EC-CD基因编码包含SEQ IDNO:5的序列的蛋白质。

16.根据权利要求9所述的经修饰的多能细胞，其中所述自杀基因编码可诱导的半胱天冬酶蛋白，并且所述引发剂是二聚化的化学诱导剂(CID)。

17.根据权利要求16所述的经修饰的多能细胞，其中所述基因编码与SEQ ID No:6具有至少90％序列同一性的可诱导的半胱天冬酶蛋白。

18.根据权利要求17所述的经修饰的多能细胞，其中所述基因编码包含SEQ ID No:6的序列的可诱导的半胱天冬酶蛋白。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的经修饰的多能细胞，其中所述CID是AP1903。

20.一种细胞，其衍生自权利要求1-19中任一项所述的经修饰的多能细胞，其中所述衍生细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。

21.根据权利要求20所述的经修饰的多能细胞，其中所述CAR细胞是CAR-T细胞。

22.一种方法，其包括将衍生自权利要求1-19中任一项的所述经修饰的多能细胞的细胞移植到受试者中，其中所述受试者是人、猴、牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠。

23.根据权利要求22所述的方法，其中衍生自所述经修饰的多能细胞的所述细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞和视网膜色素内皮细胞。

24.一种治疗疾病的方法，所述方法包括施用衍生自权利要求1-19中任一项所述的经修饰的多能细胞的细胞。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述衍生细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病选自I型糖尿病、心脏病、神经性疾病、癌症、眼病、血管疾病和甲状腺疾病。

27.一种用于产生权利要求1-19中任一项所述的经修饰的多能细胞的方法，其包括增加所述多能细胞的所述亲代非修饰形式中CD16、CD32或CD64的表达。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述经修饰的细胞具有人、猴、牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠或豚鼠来源。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述经修饰的多能细胞衍生自HIP细胞。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述经修饰的多能细胞衍生自HIPO-细胞。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述经修饰的多能细胞衍生自iPSC。

32.根据权利要求27所述的方法，其中所述经修饰的多能细胞衍生自ESC。

33.根据权利要求27所述的方法，其中所述增加的CD16、CD32或CD64表达是由于将处于启动子控制下的至少一个拷贝的人CD16、CD32或CD64基因引入所述经修饰的多能细胞的所述亲本形式中。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子。

35.一种用于治疗疾病的药物组合物，所述药物组合物包含衍生自权利要求1-19中任一项所述的经修饰的多能细胞的细胞和药学上可接受的载体。

36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述衍生细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。

37.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述疾病选自I型糖尿病、心脏病、神经性疾病、癌症、眼病、血管疾病和甲状腺疾病。

38.一种用于治疗疾病的药物，所述药物包含衍生自权利要求1-19中任一项所述的经修饰的多能细胞的细胞。

39.根据权利要求38所述的药物，其中所述衍生细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。

40.根据权利要求38所述的药物，其中所述疾病选自I型糖尿病、心脏病、神经性疾病、癌症、眼病、血管疾病和甲状腺疾病。

41.一种经修饰的细胞，当与所述经修饰的细胞的亲代形式相比时，所述经修饰的细胞包含提高水平的CD16、CD32或CD64蛋白表达，其中所述提高的蛋白质表达导致所述经修饰的细胞对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)更不敏感。

42.根据权利要求41所述的经修饰的细胞，其中所述细胞选自嵌合抗原受体(CAR)细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、心肌细胞、视网膜色素内皮细胞和甲状腺细胞。

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