WO2020090708A1 - 有機化合物封入フェリチンの製造方法 - Google Patents

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WO2020090708A1
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ferritin
organic compound
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seq
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一平 井之上
祐一 中原
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味の素株式会社
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ferritin encapsulating an organic compound and the like.
  • Ferritin is a globular protein with a lumen composed of multiple monomers that is ubiquitously present in animals and plants to microorganisms. In animals such as humans, two kinds of monomers, H chain and L chain, exist as ferritin, and ferritin is a multimer composed of 24 monomers (often, H chain and L chain). It is known to have a cage-like shape with an outer diameter of 12 nm and a lumen with an inner diameter of 7 nm. It is known that ferritin is deeply involved in homeostasis of iron element in a living body or a cell, and can retain iron in its lumen, and thus plays a role of physiological functions such as transport and storage of iron.
  • Ferritin is also being studied for application as a DDS carrier that encapsulates a drug in its lumen, and is also used for the production of electronic devices.
  • several methods for encapsulating organic compounds in ferritin have been reported. Specifically, as such a method, (1) a method of adjusting the disassociation and reassociation of ferritin by changing the pH of the solution, (2) a method of denaturing ferritin with a denaturing agent, and performing refolding , And (3) pressure method has been reported.
  • Non-Patent Document 1 ferritin is dissociated under acidic conditions of pH 2, and then the pH of the solution is changed to 7 to 9 to reassociate ferritin, whereby about 28 doxorubicin are encapsulated in ferritin. It is reported that it was possible.
  • Non-patent Document 2 while improving the stability of ferritin by modifying ferritin, the pH of the solution is changed to pH 2 by addition of HCl to control the disassociation and reassociation of ferritin, thereby adjusting the pH of ferritin to about 30 to 90. It has been reported that individual doxorubicin could be encapsulated in ferritin.
  • Non-Patent Document 3 first, when ferritin is denatured with a denaturing agent such as urea, and then the denatured ferritin in the solution is removed after mixing the denatured ferritin with the drug, when ferritin is restored to its natural folding structure. It was reported that about 33 doxorubicin could be encapsulated in ferritin. Patent Document 1 reports that about 10 to 20 doxorubicin could be encapsulated in ferritin by leaving a mixed solution of ferritin and doxorubicin under high pressure (200 to 800 MPa) for 6 to 20 hours.
  • a denaturing agent such as urea
  • the above-mentioned conventional method has a low recovery rate of ferritin and a low encapsulation efficiency of ferritin to an organic compound, and is complicated in operation, requires a predetermined device, and has a high ferritin surface in order to increase the encapsulation rate. There is a problem that it becomes a burden in that it needs to be specially modified. More specifically, in the above methods (1) and (2), it is necessary to destroy the ferritin structure (disassociation / denaturation) with an acidic buffer solution or a denaturant, but once the ferritin structure is destroyed.
  • the above method (1) it is necessary to replace the buffer solution because the pH condition needs to be changed.
  • the method (2) not only the denaturant needs to be removed for refolding, but also the ferritin surface needs to be specially modified to increase the encapsulation rate. Therefore, the above methods (1) and (2) are complicated. Further, the above method (3) is burdensome in that a special device capable of achieving a very high pressure condition is required.
  • metal atoms and metal compounds are small in size, so that metal atoms and metal compounds can be encapsulated in ferritin under conditions that do not cause destruction (disassociation / denaturation) of the ferritin structure.
  • destruction disassociation / denaturation
  • Non-Patent Document 1 disassociates ferritin by intentionally adopting a strongly acidic condition (pH about 2.5 or less) capable of causing disassociation of ferritin when encapsulating doxorubicin in ferritin. ..
  • a strongly acidic condition pH about 2.5 or less
  • the present inventors have made a simple method of using a buffer solution having a suitable pH in accordance with the acid dissociation constant (pKa) of an organic compound, which is within a pH range that does not destroy the ferritin structure. As a result, they found that an organic compound can be encapsulated in ferritin, and completed the present invention.
  • a method for producing an organic compound-encapsulated ferritin comprising: (1) mixing an organic compound with ferritin in a buffer to obtain a mixture of an organic compound and ferritin; and (2) incubating the mixture in a buffer,
  • the buffer has a pH of 3 or more and less than 13, and the buffer has a pH of 3 or more and less than 7 when the pKa of the organic compound is less than 7, and 6 or more when the pKa of the organic compound is 7 or more.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein 10 molecules or more and 200 molecules or less of an organic compound is encapsulated in one molecule of ferritin.
  • [7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the total time of mixing and incubation is 30 minutes or more.
  • [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the weight ratio of the organic compound to ferritin (organic compound / ferritin) in the mixture is 0.20 or more and 0.36 or less.
  • the organic compound has a positive charge portion or a positive chargeable portion.
  • the positive charge portion is (a) ammonium group (eg, primary, secondary, tertiary or quaternary), guanidinium group, imidazolium group, oxazolium group, thiazolium group, oxadiazo.
  • a cationic nitrogen-containing group selected from the group consisting of a lithium group, a triazolium group, a pyrrolidinium group, a pyridinium group, a piperidinium group, a pyrazolium group, a pyrimidinium group, a pyrazinium group, and a triazinium group, or (b) a phosphonium group, [9 ⁇ the method of.
  • the positively chargeable portion is a nitrogen-containing group selected from the group consisting of (a ′) amino group, guanidino group, nitro group, amide group, hydrazide group, imide group, azido group, and diazo group, Alternatively, the method of [9] or [10], wherein (b ′) is a phosphino group.
  • the ferritin is (1) a natural ferritin, or (2) a ferritin composed of a recombinant ferritin monomer having any one of the modifications (a) to (c) below, [1] to [ 11] Either method: (A) A ferritin monomer having a functional peptide inserted in the flexible linker region between the second and third positions from the N-terminal of the six ⁇ -helices constituting the ferritin monomer; (B) a ferritin monomer having a functional peptide added to the N-terminus; or (c) a ferritin monomer having a functional peptide added to the C-terminus.
  • a buffer solution containing an organic compound-encapsulated ferritin The buffer solution has a pH of 3 or more and less than 7 when the pKa of the organic compound is less than 7, and has a pH of 6 or more and less than 12 when the pKa of the organic compound is 7 or more.
  • the buffer solution according to [13] which has a pH of 6 or more and 9 or less.
  • An organic compound-encapsulated ferritin comprising: The organic compound is selected from the group consisting of anthracyclines, histamine H2 receptor antagonists, piguanides, ATP-sensitive potassium channel openers, ⁇ 2 adrenergic receptor agonists, imidazolines, vitamins, and labeling substances, An organic compound-encapsulated ferritin in which the number of molecules of the organic compound encapsulated in one molecule of ferritin is as follows: (1) When the organic compound is an anthracycline-based substance and the ferritin is a natural ferritin, 40 molecules or more and 200 molecules or less; (2) When the organic compound is an anthracycline-based substance and ferritin is a recombinant ferritin, 100 or more molecules and 200 or less molecules; or (3) the organic compound is a histamine H2 receptor antagonist, piguanide-based substance, ATP In the case of a sensitive potassium channel opener, a ⁇ 2 adrenergic receptor agonist, an imidazolines
  • the anthracycline-based substance is doxorubicin
  • the histamine H2 receptor antagonist is famotidine
  • the piguanide substance is metformin
  • the ATP-sensitive potassium channel opener is minoxidil
  • the ⁇ 2 adrenergic receptor agonist is terbutaline
  • the imidazoline substance is creatinine
  • the vitamin is thiamine, riboflavin, or nicotinamide
  • the organic compound is selected from the group consisting of anthracyclines, histamine H2 receptor antagonists, piguanides, ATP-sensitive potassium channel openers, and ⁇ 2 adrenoceptor agonists [16] or [16] [17]
  • Ferritin encapsulated in an organic compound [19]
  • the ferritin is (1) natural ferritin, or (2) ferritin composed of a recombinant ferritin monomer having any one of the modifications (a) to (c) below, [16] to [ 18] any of the organic compound-encapsulated ferritin: (A) A ferritin monomer having a functional peptide inserted in the flexible linker region between the second and third positions from the N-terminal of the six ⁇ -helices constituting the ferritin monomer; (B) a ferritin monomer having a functional peptide added to the N-terminus; or (c) a ferritin monomer having a functional peptide added to the C-terminus.
  • an organic compound can be encapsulated in ferritin by a simple method of using a buffer solution having an appropriate pH according to the pKa of the organic compound.
  • the method of the present invention is also excellent in the production efficiency of ferritin encapsulating an organic compound.
  • the method of the present invention does not require destruction of ferritin structure (disassociation / denaturation)
  • the conventional method requiring destruction of ferritin structure (disassociation / denaturation) and recovery process (providing a recovery process)
  • a part of ferritin remains destroyed and does not return to its original state), compared to ferritin recovery rate.
  • the method of the present invention utilizes the electrochemical potential difference between the lumen and the outer shell of ferritin in an environment in which the supramolecular structure of ferritin can be maintained, thereby converting the organic compound into ferritin above the concentration in the solution. Since it can be encapsulated, compared to the conventional method (method of incorporating the solution into the ferritin lumen along with the recovery of the ferritin structure) in which it is difficult to encapsulate the organic compound in ferritin above the concentration in the solution, Organic compounds can be efficiently encapsulated in ferritin. Unlike the conventional methods, the method of the present invention is simple in that no buffer replacement, denaturant removal, or special equipment is required.
  • FIG. 1 is a diagram showing the drug introduction rate (% by weight) to ferritin at each reaction pH.
  • FIG. 2 is a diagram showing the drug introduction rate (% by weight) to ferritin at each temperature.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes over time in the drug introduction rate (% by weight) to ferritin.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the drug / ferritin (protein) concentration ratio in the reaction solution and the drug introduction rate (% by weight).
  • FIG. 5 is a diagram showing the agreement of the column elution peaks of ferritin and the drug (that is, encapsulation of the drug in ferritin) after the drug encapsulation reaction in ferritin.
  • FIG. 1 is a diagram showing the drug introduction rate (% by weight) to ferritin at each reaction pH.
  • FIG. 2 is a diagram showing the drug introduction rate (% by weight) to ferritin at each temperature.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes over time in the drug introduction rate (% by weight
  • FIG. 6 is a diagram showing confirmation of a drug-encapsulated ferritin complex (aqueous solution dispersible nanoparticles) by Zetasizer Nano ZS (Malvern).
  • FIG. 7 is a diagram showing that ferritin not encapsulated with doxorubicin and drug-encapsulated ferritin have similar surface charges (thus, doxorubicin is not complexed by adsorption of doxorubicin on the surface).
  • FIG. 8 is a diagram showing the pH stability of drug-encapsulated ferritin.
  • FIG. 9 is a diagram showing the relationship between the leaving time after deassociation of ferritin and the drug introduction rate in the conventional disassociation / reassociation process.
  • FIG. 10 is a diagram showing a comparison of the recovery rate of ferritin by the one-step process of the present invention and the conventional disassociation / reassociation process.
  • FIG. 12 is a diagram showing the ratio of the drug introduction amount in the one-step process of the present invention to the drug introduction amount in the conventional disassociation / reassociation process.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of measuring the size of ferritin at each pH by the dynamic light scattering (DLS) method using Zetasizer Nano ZS.
  • FIG. 14 is a figure which shows the stability evaluation result of the uranin inclusion ferritin in plasma.
  • FIG. 15 is a diagram showing the measurement results of uptake of uranin-encapsulating ferritin into transferrin receptor TfR-presenting cells (SKBR-3 cells) by fluorescence activated cell sorting (FACS).
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of measurement of uptake of uranine-encapsulating ferritin into transferrin receptor TfR-presenting cells (SKBR-3 cells) by a two-photon excitation fluorescence microscope.
  • the present invention provides a method for producing an organic compound-encapsulated ferritin, which comprises: (1) mixing an organic compound with ferritin in a buffer to obtain a mixture of an organic compound and ferritin; and (2) incubating the mixture in a buffer,
  • the buffer has a pH of 3 or more and less than 13, and the buffer has a pH of 3 or more and less than 7 when the pKa of the organic compound is less than 7, and 6 or more when the pKa of the organic compound is 7 or more.
  • Ferritin (24 multimeric protein) is universally present in various higher organisms such as mammals.
  • the ferritin monomer that constitutes ferritin has six ⁇ -helices that are highly conserved among various higher organisms, and two types of monomers, H chain and L chain, are used as ferritin monomers of higher organisms. It is known that the body exists.
  • a mammalian ferritin monomer can be used as the ferritin monomer that constitutes ferritin.
  • mammals include primates (eg, humans, monkeys, chimpanzees), rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits), livestock and working mammals (eg, cows, pigs, Sheep, goats, horses).
  • rodents eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits
  • livestock and working mammals eg, cows, pigs, Sheep, goats, horses.
  • the ferritin monomer either H chain or L chain, or a mixture thereof can be used.
  • ferritin monomer either a natural fetilin monomer or a gene recombinant fetilin monomer capable of forming a 24 multimer can be used.
  • the recombinant fetilin monomer may be modified in the flexible linker region between the six ⁇ -helices that make up the ferritin monomer.
  • examples of such a recombinant fetilin monomer include, for example, between the 1st and 2nd positions and the 2nd and 3rd positions of the six ⁇ -helices constituting the ferritin monomer, counted from the N-terminus.
  • the flexible linker region of human ferritin H chain is the flexible linker region between the 1st and 2nd regions (region consisting of amino acid residues 43 to 49), and between the 2nd and 3rd regions.
  • Flexible linker region region consisting of amino acid residues 78 to 96
  • 3rd and 4th flexible linker region region consisting of amino acid residues 125 to 127
  • 4th and 5th region The flexible linker region (position of amino acid residue at position 138) or the flexible linker region between the 5th and 6th positions (region of amino acid residue at positions 160 to 164).
  • the flexible linker region of human ferritin L chain is a flexible linker region between the 1st and 2nd positions (region consisting of amino acid residues at positions 38 to 45), and between 2nd and 3rd positions.
  • Flexible linker region region consisting of amino acid residues 74 to 92
  • 3rd and 4th flexible linker region region consisting of amino acid residues 121 to 123
  • 4th and 5th region The flexible linker region (position of amino acid residue at position 134) or the flexible linker region between the 5th and 6th positions (region of amino acid residue at positions 155 to 159).
  • the recombinant fetilin monomer may be modified in its N-terminal region and / or C-terminal region.
  • the N-terminus of the ferritin monomer is exposed on the surface of the multimer and its C-terminus cannot be exposed on the surface.
  • the peptide moiety added to the N-terminus of the ferritin monomer is exposed on the surface of the multimer and can interact with target material that is external to the multimer (eg, WO 2006/126595). issue).
  • the C-terminal of the ferritin monomer can interact with an organic compound in the lumen of ferritin by modifying its amino acid residue (eg, YJ Kang, Biomacromolecules. 2012, vol. 13 (12), 4057).
  • Examples of such a recombinant fetilin monomer include a ferritin monomer having a functional peptide added to the N-terminus or C-terminus.
  • ferritin is human ferritin from the viewpoint of clinical application to humans.
  • the ferritin monomer constituting human ferritin any of human ferritin H chain, human ferritin L chain, or a mixture thereof can be used.
  • one molecule (or one unit) of ferritin means a complex (24-mer) composed of 24 ferritin monomers, and one ferritin monomer is one molecule (or one unit) of ferritin. Not applicable.
  • the ferritin heavy chain may be: (A1) a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (B1) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, including an amino acid sequence containing one or several amino acid residue modifications selected from the group consisting of amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and additions, and A protein having the ability to form a multimer (eg, 24-mer); or (C1) an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and having a multimer (eg, 24-mer) Body) A protein with the ability to form.
  • A1 a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • B1 In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, including an amino acid sequence containing one or several amino acid residue modifications selected from the group consisting of amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and additions, and A protein having the ability to form a multimer (eg, 24-mer); or (C1) an amino acid sequence having 90% or more
  • the ferritin light chain may be: (A2) a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (B2) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, comprising an amino acid sequence containing one or several amino acid residue modifications selected from the group consisting of amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and additions, and A protein capable of forming a multimer (eg, a 24-mer); or (C2) containing an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and having a multimer (eg, a 24-mer) Body) A protein with the ability to form.
  • one or several amino acid residues are modified by 1, 2, 3 or 4 modifications selected from the group consisting of deletion, substitution, addition and insertion of amino acid residues. It can be modified.
  • the amino acid residue modification may be introduced in one region in the amino acid sequence, or may be introduced in a plurality of different regions.
  • the term "one or several” indicates a number that does not significantly impair the activity of the protein.
  • the number indicated by the term “1 or several” is, for example, 1 to 50, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30, even more preferably 1 to 20, particularly preferably 1 to 10 or 1 to 5 (eg, 1, 2, 3, 4, or 5). ..
  • the degree of identity with the amino acid sequence of interest is preferably 92% or higher, more preferably 95% or higher, even more preferably 97% or higher, and most preferably Is 98% or more or 99% or more.
  • the position of the amino acid residue into which a mutation should be introduced in the amino acid sequence is clear to those skilled in the art, but may be specified by further referring to the sequence alignment. Specifically, one of skill in the art will 1) compare multiple amino acid sequences, reveal 2) relatively conserved regions, and relatively unconserved regions, and then 3) relatively. From the conserved region and the relatively unconserved region, it is possible to predict the region that can play an important role in the function and the region that can not play an important role in the function. Can be recognized.
  • a person skilled in the art can identify the position in the amino acid sequence at which a mutation should be introduced by utilizing the sequence alignment, and the known secondary and tertiary structure information can be used in combination to identify the amino acid at which the mutation should be introduced in the amino acid sequence. It is also possible to specify the position of the residue. ..
  • the substitution of the amino acid residue may be a conservative substitution.
  • conservative substitution refers to the substitution of a given amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains are well known in the art. For example, such a family includes amino acids having basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids having acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids having uncharged polar side chains.
  • amino acid having a nonpolar side chain eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • amino acid having an aromatic side chain eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine
  • amino acid having a side chain containing a hydroxyl group eg, alcoholic, phenolic
  • amino acids e.g.
  • the conservative amino acid substitutions are aspartic acid and glutamic acid substitutions, arginine and lysine and histidine substitutions, tryptophan and phenylalanine substitutions, and phenylalanine and valine substitutions.
  • the ferritin used in the present invention is composed of (1) natural ferritin or (2) a recombinant ferritin monomer having any one of the modifications (a) to (c) below. It may be ferritin: (A) A ferritin monomer having a functional peptide inserted in the flexible linker region between the second and third positions from the N-terminal of the six ⁇ -helices constituting the ferritin monomer; (B) a ferritin monomer having a functional peptide added to the N-terminus; or (c) a ferritin monomer having a functional peptide added to the C-terminus.
  • a peptide that can add an arbitrary function to the target protein when fused with the target protein can be used.
  • a peptide capable of binding to a target material examples include a protease degrading peptide, a cell penetrating peptide, and a stabilizing peptide.
  • the functional peptide may be only one peptide having a desired function, or a plurality of homologous or heterologous peptides (eg, several such as 2, 3, or 4) having a desired function. It may be a peptide.
  • the functional peptide is a plurality of peptides as described above, the plurality of functional peptides can be inserted in any order and fused with the ferritin monomer. Fusion of ferritin monomer and functional peptide can be accomplished via an amide bond. Such a fusion may be achieved by directly linking the ferritin monomer and the functional peptide via an amide bond, or it may be one amino acid residue (eg methionine) or several (eg methionine).
  • the functional peptide is a peptide consisting of 20 or less (preferably 18 or less, more preferably 15 or less, even more preferably 12 or less, particularly preferably 10 or less) amino acid residues. ..
  • examples of the target material include organic substances and inorganic substances (eg, conductors, semiconductors and magnetic substances). More specifically, such target materials include bio-organic molecules, metal materials, silicon materials, carbon materials, protein purification tags (eg, histidine tag, maltose binding protein tag, glutathione-S-transferase), and the like. Hydrophobic materials such as materials (eg, nickel, maltose, glutathione), labeling substances (eg, radioactive substances, fluorescent substances, dyes), polymers (eg, polymethylmethacrylate, polystyrene, polyethylene oxide or poly (L-lactic acid)) Organic polymers or conductive polymers).
  • organic substances and inorganic substances eg, conductors, semiconductors and magnetic substances. More specifically, such target materials include bio-organic molecules, metal materials, silicon materials, carbon materials, protein purification tags (eg, histidine tag, maltose binding protein tag, glutathione-S-transferase), and the like. Hydrophobic
  • bioorganic molecules examples include proteins (eg, oligopeptides or polypeptides), nucleic acids (eg, DNA or RNA, or nucleosides, nucleotides, oligonucleotides or polynucleotides), sugars (eg, monosaccharides, oligosaccharides, or Polysaccharides) and lipids.
  • the bioorganic molecule may also be a cell surface antigen (eg, cancer antigen, heart disease marker, diabetes marker, neurological disease marker, immune disease marker, inflammation marker, hormone, infectious disease marker).
  • the bioorganic molecule may also be a disease antigen (eg, cancer antigen, heart disease marker, diabetes marker, neurological disease marker, immune disease marker, inflammation marker, hormone, infectious disease marker).
  • peptides have been reported as peptides having the ability to bind to such bioorganic molecules.
  • a peptide capable of binding to a protein eg, F. Danhier et al., Mol. Pharmaceuticals, 2012, vol. 9, No. 11, p. 2961., CH Wu et al., Sci. Transl. Med., 2015, vol. 7, No. 290, 290ra91.
  • peptides having binding ability to nucleic acid see for example, R. Tan et. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, p. 5282, R. Tan et. al. Cell, 1993, vol. 73, p. 1031, R. Talanaian et. al. Biochemistry. 1992, vol.31, p.6871), a peptide having a binding ability to a carbohydrate (eg, K. Oldenburg et. Al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, No. 89). 12, p. 5393-5397., K. Yamamoto et.
  • the peptide capable of binding to a bioorganic molecule may be a peptide capable of binding to a protein.
  • Peptides capable of binding to proteins include, for example, Danhier et al. , Mol. Pharmaceuticals, 2012, vol. 9, No. 11, p.
  • RGD-containing peptide and modified sequences thereof eg, RGD (SEQ ID NO: 19), ACDCRGDCFCG (SEQ ID NO: 20), CDCRGDCFC (SEQ ID NO: 21), GRGDS (SEQ ID NO: 22), and ASDRGDFSG (SEQ ID NO: 23)
  • RGD SEQ ID NO: 19
  • ACDCRGDCFCG SEQ ID NO: 20
  • CDCRGDCFC SEQ ID NO: 21
  • GRGDS SEQ ID NO: 22
  • ASDRGDFSG SEQ ID NO: 23
  • EILDV SEQ ID NO: 24
  • REDV SEQ ID NO: 25
  • L. Vannucci et. al. Int. J. Nanomedicine. 2012, vol. 7, p. Peptides disclosed in 1489 eg, SYSMEHFRWGKP (SEQ ID NO: 26)
  • J. Cutrera et al. Mol. Ther.
  • CHHALTHAC SEQ ID NO: 34
  • SPRPRHTRLSL SEQ ID NO: 35
  • TMGFTAPRFPHY SEQ ID NO: 36
  • NGYEIEWYSWVTHGMY SEQ ID NO: 37
  • FRSFESCLAKSH SEQ ID NO: 38
  • YHWYGYTPQNVI SEQ ID NO: 39
  • QH SEQ ID NO: 39
  • QHVQR QHVQR.
  • QRHKPRE SEQ ID NO: 41
  • HSQAAVP SEQ ID NO: 42
  • AGNWTPI SEQ ID NO: 43
  • PLLQATL SEQ ID NO: 44
  • LSITRL SEQ ID NO: 45
  • CRGDCL SEQ ID NO: 46
  • CRRETAWAC SEQ ID NO: 47
  • RTDLDSLRTYTL SEQ ID NO: 48
  • CTTHWGFTLC SEQ ID NO: 49
  • APSPMIW SEQ ID NO: 50
  • LQNAPRS SEQ ID NO: 51
  • SWTLYTPSGQSK SEQ ID NO: 52
  • SWELYPLRANL SEQ ID NO: 53
  • WQPDTAHHWATL SEQ ID NO: 54
  • CSDSWHYWC SEQ ID NO: 55
  • WHWLPNLRHYAS SEQ ID NO: 56
  • WHTEILKSYPHE SEQ ID NO: 57
  • LPAQ QA
  • SEQ ID NO: 58 YNTNHVPLSPKY (SEQ ID NO: 59), YSAYPDSVPMMS (SEQ ID NO: 60), TNYLFSPNG IA (SEQ ID NO: 61), CLSYPSYC (SEQ ID NO: 62), CVGVLPSQDAIGIC (SEQ ID NO: 63), CEWKFDPGLGQARC (SEQ ID NO: 64), CDYMTDGRAASKIC (SEQ ID NO: 65), KCCYSL (SEQ ID NO: 66), MARSGL (SEQ ID NO: 14), MARAKE.
  • SEQ ID NO: 67 MSRTMS (SEQ ID NO: 68), WTGWCLNPEEESTWGFCTS (SEQ ID NO: 69), MCGVCLSAQRWT (SEQ ID NO: 70), SGLWWWLVVDILG (SEQ ID NO: 71), NPGTCKDKWIECLLNG (SEQ ID NO: 72), ANTPCGPIVYSWWRA73 (SEQ ID NO: 72), ANTPCGPYWHWSWRA, SEQPC NO: SEQ ID NO: 74), CGLIIQKNEC (SEQ ID NO: 75), MQLPLAT (SEQ ID NO: No.
  • CTVRTSADC (SEQ ID NO: 84), AAAPLAQPMHWA (SEQ ID NO: 85), SHSLLSS (SEQ ID NO: 86), ALWPPNLHAWVP (SEQ ID NO: 87), LTVSPWY (SEQ ID NO: 88), SSMDIVLRAPLM (SEQ ID NO: 89), FMPFNHWEQWPP (SEQ ID NO: 90).
  • SYPIPDT SEQ ID NO: 91
  • HTSDQTN SEQ ID NO: 92
  • CLFMRLAWC SEQ ID NO: 93
  • DMPGTVLP SEQ ID NO : 4
  • DWRGDSMDS SEQ ID NO: 95
  • VPTDTDYS SEQ ID NO: 96
  • VEEGGYIAA SEQ ID NO: 97
  • VTWTPQAWFQWV SEQ ID NO: 98
  • AQYLNPS SEQ ID NO: 99
  • CSSRTMHHC SEQ ID NO: 100
  • CPLDIDFYC SEQ ID NO: 101
  • CPIDERPMC SEQ ID NO: 102
  • RGDLATLRQLAQEDGVVG SEQ ID NO: 103
  • SPRGDLAVLGHK SEQ ID NO: 104
  • SPRGDLAVLGGHKY SEQ ID NO: 105
  • CQQSNRGDRKRC SEQ ID NO: 106
  • CMGNKCRSAKRP SEQ ID NO: 107W
  • GFRFGALHEYNS (SEQ ID NO: 109), CTLPHLKMC (SEQ ID NO: 110), ASGAL PSRLDT (SEQ ID NO: 111), SWDIAWPLPKVP (SEQ ID NO: 112), CTVALPGGYVRVC (SEQ ID NO: 113), ETAPLSTMSPY (SEQ ID NO: 114), GIRLRG (SEQ ID NO: 115), CPGPEGAGC (SEQ ID NO: 116), CGRRAGGSC (SEQ ID NO: 117), CRGRRST.
  • SEQ ID NO: 118 CNGRCVSGCAGRC (SEQ ID NO: 119), CGNKRTRGC (SEQ ID NO: 120), HVGGSSV (SEQ ID NO: 121), RGDGSSV (SEQ ID NO: 122), SWKLPPS (SEQ ID NO: 123), CRGDKRGPDC (SEQ ID NO: 124), GGKRPAR (SEQ ID NO: 124).
  • VECYLIRDNLCIY SEQ ID NO: 136
  • CGGRRLGGC SEQ ID NO: 137
  • WFCSWYGGDTCVQ SEQ ID NO: 138
  • NQQLIEEIIQILHKIFEIL SEQ ID NO: 139
  • KMVIYWKAG SEQ ID NO: 140
  • LNIVRQRGN RNIVRSVNG:
  • And QDGRMGF SEQ ID NO: 143
  • mutant peptides thereof eg, , Conservative substitutions, etc. mutations 2, 3, 4 or 5 amino acid residues, or include peptides having one or more of such amino acid sequences.
  • the peptide capable of binding to a bioorganic molecule may be a peptide capable of binding to a nucleic acid.
  • the peptide capable of binding to a nucleic acid include those described in R. Tan et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, p.
  • TRQARR SEQ ID NO: 17
  • TRQARRN SEQ ID NO: 144
  • TRQARRRNRRRWRRRQR SEQ ID NO: 145
  • TRRQRTRRRRRRNR SEQ ID NO: 146
  • NAKTRHERRRKLAIER SEQ ID NO: 147QRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQRAQAQAQRAKRA.
  • 1031 peptide eg, TRQARRRNRRRWRERRQR (SEQ ID NO: 150)), Talanian et. al. Biochemistry. 1992, vol. 31, p. 6871 (eg, KRARNTEAARRSRARK (SEQ ID NO: 151)), or mutant peptides thereof (eg, mutations such as conservative substitution of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues), or Examples include peptides having one or more such amino acid sequences.
  • the peptide capable of binding to a bioorganic molecule may be a peptide capable of binding to a carbohydrate.
  • peptides having the ability to bind to sugars include K. Oldenburg et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, No12, p. 5393-5397.
  • Peptides eg, DVFYPYPYASGS (SEQ ID NO: 152), and RVWYPYGSYLTASGS (SEQ ID NO: 153)
  • Peptides disclosed in 436 eg, DTWPNTEWS (SEQ ID NO: 154), DSYHNIW (SEQ ID NO: 155), DTYFGKAYNPW (SEQ ID NO: 156), and DTIGSPVNFW (SEQ ID NO: 157)
  • A. Baimiev et. al. Mol. Biol. (Moscow), 2005, vol. 39, No. 1, p. 90 (TYCNPGWDPRDR (SEQ ID NO: 158), and TFYNEEWDLVIKDEH (SEQ ID NO: 159)
  • mutant peptides thereof eg, conservative substitutions of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues. Mutation
  • a peptide having one or more such amino acid sequences eg, conservative substitutions of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues.
  • the peptide capable of binding to a bioorganic molecule may be a peptide capable of binding to a lipid.
  • the peptide capable of binding to lipids include O. Kruse et. al. , Z. Natureforsch. , 1995, vol. 50c, p. Peptides disclosed in 380 (eg, MTLILELVVI (SEQ ID NO: 160), MTSILEREQR (SEQ ID NO: 161), and MTTILQQRES (SEQ ID NO: 162)), O.I. Silva et. al. , Sci. Rep. , 2016, vol.
  • the metal material includes, for example, metals and metal compounds.
  • the metal include titanium, gold, chromium, zinc, lead, manganese, calcium, copper, calcium, germanium, aluminum, gallium, cadmium, iron, cobalt, silver, platinum, palladium, hafnium, and tellurium.
  • metal compounds include oxides, sulfides, carbonates, arsenides, chlorides, fluorides and iodides of such metals, and intermetallic compounds.
  • Various peptides have been reported as peptides having the ability to bind to such metal materials (eg, WO 2005/010031; WO 2012/0866647; K. Sano et al., Langmuir, 2004, vol. 21, p.
  • the peptide having a binding ability to a metal material is a peptide having a binding ability to a titanium material such as titanium or a titanium compound (eg, titanium oxide), and a peptide having a binding ability to a gold material such as gold or a gold compound. It may be.
  • a titanium material such as titanium or a titanium compound (eg, titanium oxide)
  • a gold material such as gold or a gold compound. It may be.
  • Examples of the peptide having a binding ability to the titanium material include peptides disclosed in Examples described later and WO 2006/126595 (eg, RKLPDA (SEQ ID NO: 165)), M.I. J. Pender et al. , Nano Lett. , 2006, vol. 6, No. 1, p.
  • Peptides disclosed in 40-44 eg, SSKKSGSYSGSKGSKRRIL (SEQ ID NO: 166)), I.S. Inoue et al. J. Biosci. Bioeng. , 2006, vol. 122, No. 5, p. 528 (eg, AYPQKFNNNNMS (SEQ ID NO: 167)), and WO2006 / 126595 (eg, RKLPDAPGMHTW (SEQ ID NO: 168), and RALPDA (SEQ ID NO: 169)), or Such mutant peptides (eg, mutations such as conservative substitution of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues) or peptides having one or more such amino acid sequences are included.
  • mutant peptides eg, mutations such as conservative substitution of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues
  • peptides having one or more such amino acid sequences are included.
  • Examples of the peptide capable of binding to the gold material include those described in Examples and S. Brown, Nat. Biotechnol. 1997, vol. 15, p. 269 (eg, MHGKTQATSGTIQS (SEQ ID NO: 170)), J. Kim et. al. , Acta Biomater. , 2010, Vol. 6, No. 7, p. 2681 (eg, TGTSVLIATPYV (SEQ ID NO: 171), and TGTSVLIATPGV (SEQ ID NO: 172)); Nam et. al. , Science, 2006, vol. 312, No. 5775, p. 885.
  • LKAHLPPSRPLS SEQ ID NO: 173
  • mutant peptides thereof eg, mutations such as conservative substitutions of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues
  • Examples include peptides having one or more amino acid sequences. ..
  • Examples of the silicon material include silicon and silicon compounds.
  • Examples of the silicon compound include oxides of silicon (eg, silicon monoxide (SiO), silicon dioxide (SiO2)), silicon carbide (SiC), silane (SiH4), and silicone rubber.
  • Various peptides have been reported as such peptides having the ability to bind to silicon materials (eg, International Publication No. 2006/126595; International Publication No. 2006/126595; MJ Pender et al., Nano Lett., 2006, vol. 6, No. 1, p. 40-44). Therefore, in the present invention, such various peptides can be used. ..
  • the peptide capable of binding to a silicon material may be a peptide capable of binding to silicon or a silicon compound (eg, silicon oxide).
  • silicon compounds eg, silicon oxide.
  • peptides include the peptides disclosed in WO 2006/126595 (eg, RKLPDA (SEQ ID NO: 165)), M.I. J. Pender et al. , Nano Lett. , 2006, vol. 6, No. 1, p.
  • Peptides disclosed in 40-44 eg, SSKKSGSYSGSKGSKRRRIL (SEQ ID NO: 174)
  • peptides disclosed in WO 2006/126595 MSPHPHPRHHHT (SEQ ID NO: 175), TGRRRRLSCRLL (SEQ ID NO: 176), and KPSHHHHTHTAN (SEQ ID NO: 176).
  • SEQ ID NO: 177) or a variant peptide thereof (eg, a mutation such as a conservative substitution of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues), or a peptide having one or more such amino acid sequences Is mentioned. ..
  • carbon materials examples include carbon nanomaterials (eg, carbon nanotubes (CNT), carbon nanophones (CNH)), fullerenes (C60), graphene sheets, and graphite.
  • CNT carbon nanotubes
  • CNH carbon nanophones
  • C60 fullerenes
  • graphite graphite.
  • Various peptides have been reported as peptides having the ability to bind to such carbon materials (eg, JP 2004-121154 A; JP 2004-121154 A; MJ Pender et al., Nano Lett., 2006, vol. 6, No. 1, p. 40-44). Therefore, in the present invention, such various peptides can be used. ..
  • the peptide capable of binding to a carbon material may be a peptide capable of binding to a carbon nanomaterial such as carbon nanotube (CNT) or carbon nanophone (CNH).
  • a carbon nanomaterial such as carbon nanotube (CNT) or carbon nanophone (CNH).
  • Examples of such a peptide include peptides disclosed in Examples described later and Japanese Patent Laid-Open No. 2004-121154 (eg, DYFSSPYYEQLF (SEQ ID NO: 178)), M.I. J. Pender et al. , Nano Lett. , 2006, vol. 6, No. 1, p.
  • HSSYWYAFAFNNKT SEQ ID NO: 179
  • the peptide disclosed in JP 2004-121154 A eg, YDPFHII (SEQ ID NO: 180)
  • a mutant peptide thereof eg, 1 Mutations such as conservative substitutions of 2, 3, 4 or 5 amino acid residues
  • peptides having one or more such amino acid sequences eg, 1 Mutations such as conservative substitutions of 2, 3, 4 or 5 amino acid residues
  • protease-degrading peptide When a protease-degrading peptide is used as the functional peptide, examples of the protease include cysteine proteases such as caspase and cathepsin (D. McIlwain 1 et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 2013, vol. 5, a008656, V). Stoka et al., IUBMB Life. 2005, vol. 57, No. 4-5 p. 347), collagenase (G. Lee et al., Eur J Pharm Biopharm., 2007, vol. 67, No. 3, p. .646), thrombin and factor Xa (R. Jenny et al., Protein Expr. Purif., 2003, vol.
  • cysteine proteases such as caspase and cathepsin (D. McIlwain 1 et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 2013, vol. 5, a008656
  • protease-degradable peptides examples include E. Lee et al. , Adv. Funct. Mater. , 2015, vol. 25, p. 1279 (e.g. GRRGKGG (SEQ ID NO: 181)), G.I. Lee et al. , Eur J Pharm Biopharm. , 2007, vol. 67, No. 3, p. Peptides disclosed in 646 (eg, GPLGV (SEQ ID NO: 182), and GPLGVRG (SEQ ID NO: 183)), Y. Kang et al. , Biomacromolecules, 2012, vol. 13, No. 12, p.
  • ELSLSRLRDSA SEQ ID NO: 191
  • ELSLSRLR SEQ ID NO: 192
  • DNYTRLRK SEQ ID NO: 193
  • YTRLRKQM SEQ ID NO: 194
  • APSGRVSM SEQ ID NO: 195
  • VSMIKNLQ SEQ ID NO: 196
  • RIRPKLKW (SEQ ID NO: 197), NFFWKTFT (SEQ ID NO: 198), KMYPRGNH (SEQ ID NO: 199), QTYPRTNT (SEQ ID NO: 200), GVYARVTA (SEQ ID NO: 201), SGLSRIVN (SEQ ID NO: 202), NSRVA (SEQ ID NO: 203), QVRLG (SEQ ID NO: 204), MKSRNL (SEQ ID NO: 205), RCKPVN (SEQ ID NO: 206), and SSKYPN (SEQ ID NO: 207)), H.264. Xu et al. J. Virol. , 2010, vol. 84, No. 2, p.
  • a peptide disclosed in 1076 eg, LVPRGS (SEQ ID NO: 208)
  • a mutant peptide thereof eg, a mutation such as a conservative substitution of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues
  • Examples include peptides having one or more amino acid sequences. ..
  • examples of the stabilizing peptide include X. Meng et al. , Nanoscale, 2011, vol. 3, No. 3, p. 977 (e.g., CCALNN (SEQ ID NO: 209)), and E. Falvo et al. , Biomacromolecules, 2016, vol. 17, No. 2, p. 514 (eg, PAS (SEQ ID NO: 210)) or mutant peptides thereof (eg, mutations such as conservative substitutions of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues), or Peptides having one or more of these amino acid sequences are listed. ..
  • examples of the cell-penetrating peptide include Z. Guo et al. Biomed. Rep. , 2016, vol. 4, No. 5, p. Peptide disclosed in 528 (eg, GRKKRRQRRRPPPQ (SEQ ID NO: 211), RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 212), CGYGPKKKRRKVGG (SEQ ID NO: 213), RRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 214), KKKKFKGFGA (SEQ ID NO: 215L), SEQ ID NO: 215L, SEQ ID NO: 215L, SEQ ID NO: 215L.
  • 528 eg, GRKKRRQRRRPPPQ (SEQ ID NO: 211), RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 212), CGYGPKKKRRKVGG (SEQ ID NO: 213), RRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 214), KKKKFKGFGA (
  • GAWSQPKKKKRKV (SEQ ID NO: 217), LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 218), MVRRFLVTL (SEQ ID NO: 219), RIRRACGPPRVRVV (SEQ ID NO: 220), MVKSKIGSWILVLFV (SEQ ID NO: 221K), SDVGLRK (SEQ ID NO: 221), SDVGLRK2.
  • PPARPARSASPRPRPVQ sequence No.
  • SDLWEMMMVSLACQY SEQ ID NO: 232
  • PIEVCMYREP SEQ ID NO: 233
  • mutant peptides thereof eg, mutations such as conservative substitutions of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acid residues
  • Examples include peptides having one or more such amino acid sequences.
  • the functional peptide is preferably a peptide capable of binding to the target material.
  • a preferred example of the peptide capable of binding to the target material is a peptide capable of binding to an organic substance.
  • a peptide capable of binding to an organic substance a peptide capable of binding to a bioorganic molecule is preferable, and a peptide having a binding ability to a protein is more preferable.
  • Ferritin can be obtained by causing a host cell to produce ferritin using a host cell containing a polynucleotide encoding ferritin.
  • host cells include, for example, cells derived from animals, insects, fish, or plants, and microorganisms.
  • mammals or birds eg, chicken
  • mammals are more preferable.
  • mammals include primates (eg, humans, monkeys, chimpanzees), rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits), livestock and working mammals (eg, cows, pigs, Sheep, goats, horses).
  • the host cell is a human cell or a cell generally used for the production of human protein from the viewpoint of clinical application (eg, Chinese hamster ovary (CHO) cell, human embryonic kidney-derived HEK293 cell). Good.
  • CHO Chinese hamster ovary
  • HEK293 cell human embryonic kidney-derived HEK293 cell
  • the host cell may be a microorganism in terms of mass production of ferritin and the like.
  • Microorganisms include, for example, bacteria and fungi.
  • any bacterium used as a host cell can be used.
  • a bacterium of the genus Bacillus eg, Bacillus subtilis
  • a bacterium of the genus Corynebacterium eg, Corynebacterium glutamicum]
  • Escherichia bacteria eg, Escherichia coli
  • Pantoea is an anatis (Panto an anatis).
  • any fungus used as a host cell can be used, and examples thereof include Saccharomyces (Saccharomyces).
  • Ces) fungus eg, Saccharomyces cerevisiae
  • Schizosaccharomyces fungus eg, Schizosaccharomyces pombe (or Schizosaccharomyces), microorganisms such as Schizosaccharomyces pomebe, pomycetes, etc.
  • filamentous fungi include the genus Acremonium / Talaromyces, Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Fusarium, Fusarium. Chrysosporium, Humicola (Hu icola), Emericella sp (Emericella), and bacteria and the like belonging to the Hypocrea sp (Hypocrea).
  • organic compound can be used as the organic compound.
  • organic compounds include low molecular weight compounds, sugar compounds, peptide compounds, and nucleic acid compounds (eg, DNA, RNA, artificial nucleic acids), and low molecular weight compounds are preferable.
  • the term “low molecular weight compound” refers to an organic compound having a molecular weight of 100 to 1000.
  • the organic compound which is a low molecular weight compound, may have a molecular weight of 150 or more, 200 or more, 250 or more, or 300 or more.
  • the molecular weight may also be 950 or less, 900 or less, 850 or less, or 800 or less. More specifically, the molecular weight may be 150-950, 200-900, 250-850, or 300-800.
  • low molecular weight compounds include drugs, vitamins, labeling substances, amino acids, oligopeptides, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, monosaccharides, lipids, fatty acids, and their metabolites.
  • the medicament used in the present invention is an anthracycline, a histamine H2 receptor antagonist, a piguanide, an ATP-sensitive potassium channel opener, a ⁇ 2 adrenergic receptor agonist, an imidazoline, a vitamin, Alternatively, it may be a labeling substance.
  • the anthracycline-based substance include doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, valrubicin, and mitoxantrone. Of these, doxorubicin is preferred.
  • histamine H2 receptor antagonists include famotidine, cimetidine, ranitidine, nizatidine, roxatidine acetate, and lafutidine. Of these, famotidine is preferred.
  • the piguanide-based substance include metformin, buformin, phenformin, proguanil, chloroproguanil, chlorhexidine, and alexidine. Of these, metformin is preferred.
  • the ATP-sensitive potassium channel opener include minoxidil, nicorandil, pinacidil, diazoxide, cromakalim, levocromakalim, and remacarim. Of these, minoxidil is preferable.
  • Examples of the ⁇ 2 adrenergic receptor agonist include terbutaline, salbutamol, levosalbutamol, pirbuterol, procaterol, metaproterenol, fenoterol, bitolterol, salmeterol, formoterol, vilanterol, bambuterol, clenbuterol, and indacaterol. Among them, terbutaline is preferable.
  • Examples of the imidazoline-based substance include creatinine, oxymetazoline, clonidine, cibenzoline, tizanidine, tetrahydrozoline, naphazoline, phentolamine, brimonidine, and moxonidine. Among them, creatinine is preferable.
  • vitamins examples include vitamin B1 (eg, thiamine), vitamin B2 (eg, riboflavin), vitamin B3 (eg, niacin, nicotinamide), vitamin B5 (eg, pantothenic acid), vitamin B6 (eg, pyridoxal, pyridoxamine).
  • vitamin B1 eg, thiamine
  • vitamin B2 eg, riboflavin
  • vitamin B3 eg, niacin, nicotinamide
  • vitamin B5 eg, pantothenic acid
  • vitamin B6 eg, pyridoxal, pyridoxamine
  • vitamin B7 eg biotin
  • vitamin B9 eg folic acid
  • vitamin B12 eg cyanocobalamin, hydroxocobalamin
  • vitamin C eg ascorbic acid
  • vitamin A eg retinol, ⁇ -carotene
  • vitamin E eg, tocopherol, tocotrienol
  • vitamin K eg, phylloquinone, menaquinone.
  • vitamin B1, vitamin B2 and vitamin B3 are preferable.
  • the labeling substance examples include rhodamine (eg, rhodamine B, 6G, 6GP, 3GO, 123), fluorescent substances such as uranine, dyes and dyes such as Congo red, and luminescent substances.
  • rhodamine B, uranine, or Congo red is preferable.
  • amino acids examples include ⁇ -amino acids (eg, alanine, asparagine, cysteine, glutamine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, histidine, lysine. , Glycine), ⁇ -amino acids (eg, ⁇ -alanine, pantothenic acid), and ⁇ -amino acids (eg, ⁇ -aminobutyric acid).
  • the amino acid may be L-form or D-form.
  • the pKa of the organic compound may be 2 or more and 13 or less.
  • the pKa of the organic compound is 2 or more and 13 or less, it is possible to more efficiently encapsulate the organic compound in ferritin by using a buffer solution having an appropriate pH according to the pKa. More specifically, when the pKa of the organic compound is 2 or more and less than 7 (preferably 3 or more and less than 6), the buffer solution preferably has a pH of 3 or more and less than 7 (preferably 3 or more and less than 6).
  • the buffer solution has a pH of 6 or more and less than 13 (preferably 6 or more and less than 12, more preferably 6 or more and less than 11 and even more preferably 6 or more and less than 10). It is preferable to have.
  • the pKa of an organic compound can be determined by the neutralization titration method (Chemical Handbook, Basic Edition, I, II (Revised 4th Edition), The Chemical Society of Japan, Maruzen, 1993).
  • a 0.1 mol / L solution of each molecule is prepared, and 0.1 mol / L sodium hydroxide aqueous solution or hydrochloric acid aqueous solution is titrated to the solution at 25 ° C. to measure the pH. Can be calculated.
  • an organic compound has a single pKa value, that value is adopted as the pKa of the organic compound.
  • the organic compound has a plurality of pKa values (for example, 2 to 6, preferably 2 to 5, more preferably 2 to 4, even more preferably 2 or 3), the average value thereof is used as the pKa of the organic compound. Adopted.
  • the organic compound may have a positively charged moiety and / or a positively chargeable moiety.
  • the organic compound has a positively charged moiety.
  • a positively charged moiety means a group that is positively charged in the solid state.
  • Positively charged moieties include, for example, cationic nitrogen-containing groups, and cationic phosphorus-containing groups.
  • “Cationic nitrogen-containing group” means a group having a positively charged nitrogen atom.
  • the cationic nitrogen-containing group include an ammonium group (eg, primary, secondary, tertiary or quaternary), guanidinium group, imidazolium group, oxazolium group, thiazolium group, oxadiazolium group, Examples thereof include triazolium group, pyrrolidinium group, pyridinium group, piperidinium group, pyrazolium group, pyrimidinium group, pyrazinium group, and triazinium group.
  • “Cationic phosphorus-containing group” means a group having a positively charged phosphorus atom.
  • Examples of the cationic phosphorus-containing group include a phosphonium group (eg, primary, secondary, tertiary or quaternary).
  • the organic compound has a moiety that can be positively charged.
  • the positively chargeable portion is not positively charged in a solid state, but acts as a hydrogen atom acceptor in a state of being dissolved in an aqueous solution and can be positively charged depending on the pH of the aqueous solution.
  • Positively chargeable moieties include, for example, positively chargeable nitrogen-containing groups, and positively chargeable phosphorus-containing groups.
  • nitrogen-containing group that can be positively charged include, for example, an amino group (eg, primary, secondary, or tertiary), guanidino group, nitro group, amide group, hydrazide group, imido group, azido group, A diazo group is mentioned.
  • the phosphorus-containing group that can be positively charged include a phosphino group (eg, primary, secondary, or tertiary).
  • Organic compounds have, in addition to positively charged or positively chargeable moieties, negatively charged moieties (eg, oxide groups in amine oxides) or negatively chargeable moieties (eg, sulfate groups) Good. If the organic compound has negatively charged or negatively chargeable moieties in addition to positively or positively chargeable moieties, the total number of positively charged and / or positively chargeable moieties will be , Greater than the total number of negatively charged moieties and / or moieties that can be negatively charged (ie, they are generally positively charged or are likely to be positively charged overall depending on the desired pH conditions of the solution) Is preferred).
  • negatively charged moieties eg, oxide groups in amine oxides
  • negatively chargeable moieties eg, sulfate groups
  • the coefficient of variation is preferably 0.3.
  • the organic compound may have a pKa of 6 or more and 9 or less.
  • the buffer solution eg, pH 6 or more and 9 or less
  • an organic compound having a pKa of 6 or more and 9 or less can be preferably used.
  • a mixture of an organic compound and ferritin is obtained by mixing the organic compound with ferritin in a buffer solution.
  • Mixing can be done in any manner.
  • the organic compound may be dissolved in the ferritin-containing buffer, or the organic compound may be dissolved in the organic compound-containing buffer, or by combining the organic compound-containing buffer with the ferritin-containing buffer. May be done.
  • the weight ratio of the organic compound to ferritin in the mixing is not particularly limited as long as the organic compound can be encapsulated in ferritin, but may be, for example, 0.05 to 0.45. From the viewpoint of efficiently encapsulating the organic compound in ferritin, such a weight ratio may be, for example, 0.20 or more and 0.36 or less.
  • the buffer solution used in the present invention has a pH of 3 or more and less than 13. When the pH is within such a range, the destruction (disassociation and denaturation) of the ferritin structure can be prevented.
  • the pH of the buffer solution may be 4 or higher, 5 or higher, 6 or higher, or 7 or higher, depending on factors such as the pKa of the organic compound.
  • the pH of the buffer may also be less than 13, less than 12, less than 11, less than 10, less than 9, less than 8, or less than 7, depending on factors such as the pKa of the organic compound.
  • As the pH of the buffer solution a value measured at 25 ° C. by the glass electrode method can be used.
  • an appropriate buffer solution can be selected according to the target pH.
  • buffer solutions that can be suitably used when the target pH is 3 or more and less than 7 include, for example, phosphate buffer solution, acetate buffer solution, citrate buffer solution, citrate phosphate buffer solution, borate buffer solution, and tartaric acid.
  • buffers include buffers, phthalate buffers, glycine hydrochloride buffers, MES-NaOH buffers, MOPS buffers, HEPES-NaOH buffers, PIPES-NaOH buffers, and Bis-Tris hydrochloride buffers.
  • buffers that can be suitably used when the target pH is 6 or more and less than 13 include, for example, Tris hydrochloride buffer, sodium carbonate buffer, MOPS buffer, HEPES-NaOH buffer, PIPES-NaOH buffer, Examples thereof include glycine-NaOH buffer, CAPS-NaOH buffer, potassium chloride-sodium hydroxide buffer.
  • the pH of the buffer may be 6 or higher and 9 or lower.
  • a buffer solution having a pH of 6 or more and 9 or less can be preferably used.
  • the above mixture is then incubated in a buffer solution.
  • Incubation can be done in any manner.
  • the incubation is performed by allowing the above mixture to stand or stirring in a buffer solution.
  • the incubation temperature is not particularly limited as long as the organic compound can be enclosed in ferritin, and is, for example, 10 ° C or higher and 60 ° C or lower.
  • the incubation temperature may be 15 ° C or higher, or 20 ° C or higher.
  • the temperature of incubation may also be below 55 ° C, or below 50 ° C.
  • the total time of mixing and incubation is not particularly limited as long as the organic compound can be encapsulated in ferritin, and may be, for example, 5 minutes or more, 10 minutes or more, 15 minutes or more, or 20 or more.
  • the total time of mixing and incubation may be 30 minutes or more.
  • the number of organic compounds encapsulated in one ferritin molecule is not particularly limited, but for example, 10 or more and 200 or less organic compounds can be encapsulated in one ferritin molecule.
  • the number of organic compounds encapsulated in one molecule of ferritin is preferably 20 molecules or more, more preferably 30 molecules or more, even more preferably 40 molecules or more, still more preferably 50 molecules or more, particularly preferably 60 molecules or more, 70
  • the number of molecules may be 80 or more, 90 or more, 90 or more, 100 or more, 110 or more, 120 or more, 130 or more, 140 or more, or 150 or more.
  • the number of organic compounds encapsulated in one molecule of ferritin is also preferably 190 molecules or less, more preferably 180 molecules or less, even more preferably 170 molecules or less, still more preferably 160 molecules or less, particularly preferably 150 molecules or less, 140 or less, 130 or less, 120 or less, 110 or less, 100 or less, 90 or less, 80 or less, 70 or less, 60 or less, 50 or less, 40 or less, 30 or less, 20 It may be less than or equal to 15 molecules.
  • the number of anthracycline-based materials encapsulated in one ferritin molecule is such that ferritin is (a) a natural ferritin composed of natural ferritin monomers, or (B) It may vary depending on the case of a genetically modified ferritin composed of a genetically modified ferritin monomer.
  • the number of anthracycline-based substances encapsulated in one molecule of natural ferritin may be 40 or more and 200 or less.
  • the number of anthracycline-based substances encapsulated in one molecule of natural ferritin is preferably 50 molecules or more, more preferably 60 molecules or more, even more preferably 70 molecules or more, still more preferably 80 molecules or more, particularly preferably 90 molecules. It may be more than.
  • the number of anthracycline-based substances encapsulated in one molecule of natural ferritin may also be preferably 170 molecules or less, more preferably 140 molecules or less.
  • the number of the anthracycline-based substances enclosed in one molecule of the genetically modified ferritin is 100 or more and 200 or less.
  • the number of anthracycline substances encapsulated in one molecule of genetically modified ferritin is preferably 110 molecules or more, more preferably 120 molecules or more, even more preferably 130 molecules or more, still more preferably 140 molecules or more, particularly preferably It may be 150 molecules or more.
  • the number of anthracycline substances encapsulated in one molecule of recombinant ferritin may also be preferably 190 molecules or less, more preferably 180 molecules or less.
  • the number of anthracycline-based substances encapsulated in one ferritin molecule should be defined regardless of whether (a) natural ferritin or (b) genetically modified ferritin. Can also In such a case, the number of anthracycline-based substances encapsulated in one molecule of ferritin may be 100 or more and 200 or less.
  • the number of anthracycline-based substances encapsulated in one molecule of ferritin is preferably 110 molecules or more, more preferably 120 molecules or more, even more preferably 130 molecules or more, still more preferably 140 molecules or more, particularly preferably 150 molecules or more. May be
  • the number of anthracycline-based substances encapsulated in one molecule of ferritin may also be preferably 190 molecules or less, more preferably 180 molecules or less.
  • the number of histamine H2 receptor antagonists encapsulated in one molecule of ferritin may be 10 or more and 200 or less.
  • the number of histamine H2 receptor antagonists encapsulated in one molecule of ferritin may be preferably 20 or more, more preferably 30 or more.
  • the number of histamine H2 receptor antagonists encapsulated in one molecule of ferritin may also preferably be 150 molecules or less, more preferably 100 molecules or less, even more preferably 50 molecules or less.
  • the number of piguanide-based substances encapsulated in one molecule of ferritin may be 10 or more and 200 or less.
  • the number of piguanide-based substances encapsulated in one molecule of ferritin is preferably 20 molecules or more, more preferably 30 molecules or more, even more preferably 40 molecules or more, still more preferably 50 molecules or more, particularly preferably 60 molecules or more, Alternatively, it may be 70 molecules or more.
  • the number of piguanide-based substances encapsulated in one molecule of ferritin may also be preferably 150 molecules or less, more preferably 100 molecules or less.
  • the number of ATP-sensitive potassium channel openers encapsulated in one molecule of ferritin may be 10 or more and 200 or less.
  • the number of ATP-sensitive potassium channel openers encapsulated in one molecule of ferritin is preferably 20 or more, more preferably 30 or more, even more preferably 40 or more, still more preferably 50 or more, particularly preferably 60 or more. It may be more than a molecule.
  • the number of ATP-sensitive potassium channel openers encapsulated in one molecule of ferritin may also be preferably 150 molecules or less, more preferably 100 molecules or less.
  • the number of ⁇ 2 adrenergic agonist encapsulated in one molecule of ferritin may be 10 molecules or more and 200 molecules or less.
  • the number of ⁇ 2 adrenergic receptor agonists encapsulated in one molecule of ferritin is preferably 20 or more, more preferably 30 or more, still more preferably 40 or more, still more preferably 50 or more, and particularly preferably 60.
  • the number of molecules may be 70 or more, 70 or more, 80 or more, 90 or more, 100 or more, 110 or more, or 120 or more.
  • the number of ⁇ 2 adrenergic receptor agonists encapsulated in one molecule of ferritin may also preferably be 150 molecules or less.
  • the number of imidazoline-based substances encapsulated in one molecule of ferritin may be 10 or more and 200 or less.
  • the number of imidazoline-based substances encapsulated in one molecule of ferritin may be preferably 15 or more, more preferably 20 or more.
  • the number of imidazoline-based substances encapsulated in one molecule of ferritin may also be preferably 150 molecules or less, more preferably 100 molecules or less, and even more preferably 50 molecules or less.
  • the number of vitamins enclosed in one molecule of ferritin may be 10 molecules or more and 200 molecules or less.
  • the number of vitamins enclosed in one molecule of ferritin is preferably 150 molecules or less, more preferably 100 molecules or less, even more preferably 50 molecules or less, still more preferably 30 molecules or less, particularly preferably 20 molecules or less. Good.
  • the number of labeling substances encapsulated in one molecule of ferritin may be 10 or more and 200 or less.
  • the number of labeling substances encapsulated in one molecule of ferritin is preferably 150 molecules or less, more preferably 100 molecules or less, even more preferably 50 molecules or less, still more preferably 30 molecules or less, particularly preferably 20 molecules or less. You may.
  • Confirmation of inclusion of organic compounds in ferritin can be performed by measuring absorption peaks of ferritin and organic compounds.
  • Other methods may be used in combination to confirm the encapsulation of organic compounds in ferritin. Such other methods include, for example, measuring the surface charge and / or size of ferritin.
  • the surface charge of ferritin can be measured by an electrophoretic light scattering method.
  • the measurement by the electrophoretic light scattering method can be performed using Zetasizer Nano ZS (Malvern).
  • the pKa of the organic compound that is preferably used for the measurement of the surface charge of ferritin is, for example, 1 to 4 (preferably 1 to 3) and 6 to 14 (preferably 7-14). In the present invention, it is also preferable to use an organic compound having such a pKa value.
  • the size of ferritin in the buffer solution after the incubation is equal to the size of ferritin without the encapsulation treatment of the organic compound (outer diameter of about 12 nm). Size equality can be achieved by the dynamic light scattering method.
  • the measurement by the dynamic light scattering method can be performed using Zetasizer Nano ZS (Malvern Co.).
  • the number of molecules enclosed in an organic compound in ferritin can be determined as follows. (1) Separate ferritin and organic compounds in the buffer after incubation (eg, use of desalting column). (2) Ferritin is disassociated (eg, adjusted to pH 2.3), and the organic compound in ferritin is released into the solution. (3) The concentration (weight / volume) of the organic compound in the solution is determined by a calibration curve based on the absorbance. (4) The concentration (weight / volume) of ferritin in the solution is determined by a standard protein quantification method (eg, using a bovine albumin-standardized protein assay CBB solution). (5) The rate of introduction of the organic compound into ferritin (the weight of the organic compound relative to the total weight of the organic compound and ferritin) is determined.
  • the concentration (mol / volume) of the organic compound in the solution is determined from the concentration (weight / volume) of the organic compound in the solution.
  • the concentration (mol / volume) of ferritin in the solution is determined from the concentration (weight / volume) of ferritin in the solution.
  • the number of organic compounds introduced into ferritin is determined.
  • the present invention also provides certain organic compound-encapsulated ferritin.
  • the organic compound is an anthracycline substance, a histamine H2 receptor antagonist, a piguanide substance, an ATP-sensitive potassium channel opener, a ⁇ 2 adrenergic receptor agonist, an imidazoline substance, a vitamin, and Selected from the group consisting of labeling substances,
  • the number of molecules of the organic compound encapsulated in one molecule of ferritin is as follows: (1) When the organic compound is an anthracycline-based substance and the ferritin is a natural ferritin, 40 molecules or more and 200 molecules or less; (2) When the organic compound is an anthracycline-based substance and ferritin is a recombinant ferritin, 100 or more molecules and 200 or less molecules; or (3) the organic compound is a histamine H2 receptor antagonist, piguanide-based substance, ATP In the case of a sensitive potassium channel opener, a
  • the organic compound is selected from the group consisting of anthracyclines, histamine H2 receptor antagonists, piguanides, ATP-sensitive potassium channel openers, and ⁇ 2 adrenergic receptor agonists. It may be selected.
  • the present invention further provides a buffer solution containing an organic compound-encapsulated ferritin. Details of the components such as the organic compound, ferritin, the buffer solution, and the number of encapsulated molecules in the buffer solution of the present invention are as described above.
  • Example 1 Preparation of ferritin> A DNA encoding a human-derived ferritin H chain (FTH (SEQ ID NO: 1)) monomer was totally synthesized. PCR was performed using the fully synthesized DNA as a template and 5'-GAAGGAGATATACATATGACGACCCGCTCCACTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3' (SEQ ID NO: 4) as primers.
  • FTH human-derived ferritin H chain
  • PCR was carried out using pET20 (Merck) as a template and 5′-TTTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTTAAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and 5′-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 6) as primers.
  • pET20 Merck
  • 5′-TTTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTTAAAC-3 ′ SEQ ID NO: 5′-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3 ′
  • SEQ ID NO: 6 5′-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3 ′
  • Escherichia coli BL21 (DE3) into which the constructed pET20-FTH was introduced contained LB medium (10 g / l Bacto-typtone, 5 g / l Bacto-yeast extract, 5 g / l NaCl, and 100 mg / l ampicillin. ) 100 ml, flask culture was carried out at 37 ° C. for 24 hours. The obtained cells were ultrasonically disrupted, and the supernatant was heated at 60 ° C for 20 minutes.
  • LB medium 10 g / l Bacto-typtone, 5 g / l Bacto-yeast extract, 5 g / l NaCl, and 100 mg / l ampicillin.
  • FTH ferritin composed of FTH monomer
  • the solution was injected into a HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column (GE healthcare) equilibrated with 10 mM TrisHCl buffer (pH 8.0), and FTH ferritin was separated and purified according to size.
  • the solution containing FTH ferritin was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare), and the protein concentration was determined using protein assay CBB solution (Nacalai Tesque) with bovine albumin as the standard. did. As a result, 1 ml of a solution containing 5 mg / ml FTH ferritin could be obtained.
  • Example 2 Examination of pH conditions> In order to establish a method (one-step process) of introducing a low molecule into FTH ferritin without going through the disassociation / reassociation process, the pH conditions were examined.
  • the final concentration of FTH ferritin and Doxorubicin hydrochloride (DOX, CAS No. 25316-40-9, molecular weight 579.98) in 0.1 ml of 50 mM buffer (pH 3 to 9) are 1 mg / ml and 0.1 mg / ml, respectively. Were mixed so that each of them was mixed, and the mixture was left at 25 ° C. for 60 minutes. In this reaction, acetate buffer was used at pH 3, 4, 5 and 6, and Tris hydrochloride buffer was used at pH 7, 8 and 9.
  • the concentrations of DOX and FTH ferritin were determined by a calibration curve prepared from the absorbances of various concentrations of DOX and FTH ferritin at 280 nm and 480 nm. Based on the concentration, the drug introduction rate (weight of DOX in the total weight of DOX and FTH ferritin) was determined.
  • the drug introduction rate was 0.5% (wt) or less at pH 6 or lower, suggesting that DOX was slightly incorporated (Fig. 1).
  • the drug introduction rate increased as the pH increased, and at pH 9 the drug introduction rate was 1% (wt) or higher. From the above, it was suggested that DOX may be introduced into FTH ferritin at pH 7 or higher.
  • Example 3 Examination of temperature conditions> In order to establish a method (one-step process) for introducing a small molecule into FTH ferritin without going through the disassociation / reassociation process, the temperature conditions were examined.
  • the final concentrations of FTH ferritin and Doxorubicin hydrochloride were 1 mg / ml and 0.1 mg / ml, respectively, in 0.1 ml of 50 mM Tris hydrochloride buffer (pH 9). And mixed for 10 minutes at 10 ° C to 60 ° C. After standing, 0.5 ml of water was added and centrifuged (15,000 rpm, 1 minute), and the supernatant was equilibrated with 10 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 8) PD-10 (Sephadex G-).
  • the total amount of the solution (3.5 ml) was concentrated to 0.1 ml by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare) and 280 nm with a spectrophotometer (DU-800, Beckman Coulter). Absorption at 480 nm was measured. From the obtained absorbances, the concentrations of DOX and FTH ferritin were determined by a calibration curve prepared from the absorbances of various concentrations of DOX and FTH ferritin at 280 nm and 480 nm. Based on the concentration, the drug introduction rate (weight of DOX in the total weight of DOX and FTH ferritin) was determined.
  • the drug introduction rate increased with the increase in reaction temperature, and at 60 ° C, the drug introduction rate was 5% (wt) or more (Fig. 2). From this, it was suggested that DOX was efficiently introduced into FTH ferritin at room temperature or higher.
  • reaction time The reaction time conditions were examined in order to establish a method (one-step process) for introducing a small molecule into FTH ferritin without going through the disassociation / reassociation process.
  • the protein concentration in the solution was determined using a protein assay CBB solution (Nacalai Tesque, Inc.) with bovine albumin as a standard. Based on the concentration, the drug introduction rate (weight of DOX in the total weight of DOX and FTH ferritin) was determined.
  • Doxorubicin hydrochloride (DOX, cas no. 25316-40-9, molecular weight 579.98) were mixed and left at 60 ° C. for 60 minutes. After standing, 0.5 ml of water was added and centrifuged (15,000 rpm, 1 minute), and the supernatant was equilibrated with 10 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 8) PD-10 (Sephadex G-). 25 filled products, GE Healthcare Co., Ltd.), and the drug and protein that were not encapsulated were separated. The total amount of the solution (3.5 ml) was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare).
  • Glycine hydrochloride buffer pH 2.3 was added to the solution so that the final concentration was 100 mM, and the volume was adjusted to 0.5 ml.
  • the solution was measured for absorbance at 480 nm with a spectrophotometer (DU-800, Beckman Coulter, Inc.) to determine the concentration of DOX.
  • the protein concentration in the solution was determined using a protein assay CBB solution (Nacalai Tesque, Inc.) with bovine albumin as a standard. Based on the concentration, the drug introduction rate (weight of DOX in the total weight of DOX and FTH ferritin) was determined.
  • DOX was mixed with 1 ml of 50 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 9) containing FTH ferritin at a final concentration of 1 mg / ml to a final concentration of 0.1 mg / l, and the mixture was left at 60 ° C for 60 minutes. After standing, centrifugation (15,000 rpm, 1 minute), the supernatant was equilibrated with 10 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8), a desalting column PD-10 (Sephadex G-25 packed product, GE Healthcare) Company) and separated the drug and protein that were not encapsulated. The total amount of the solution (3.5 ml) was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare).
  • Example 7 Surface charge of DTH-encapsulated FTH ferritin> The encapsulation of the low-molecular-weight drug by the low-molecular-weight drug-encapsulated FTH ferritin obtained by the one-step process was confirmed by evaluation of the surface charge.
  • DOX was mixed with 1 ml of 50 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 8) containing FTH ferritin at a final concentration of 1 mg / ml to a final concentration of 0.3 mg / l, and the mixture was left at 40 ° C for 60 minutes. After standing and centrifugation (15,000 rpm, 1 minute), the supernatant was equilibrated with 10 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 8), a desalting column PD-10 (Sephadex G-25 packed product, GE Healthcare) ) And separated the drug and protein that were not encapsulated. The total amount of the solution (3.5 ml) was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare) to obtain a complex of DOX and FTH ferritin suspended in 1 ml of water.
  • Tris-hydrochloride buffer pH 8
  • PD-10 desalting column
  • the DOX-FTH ferritin complex was treated with a final concentration of 50 mM phosphate buffer (pH 3, 6 or 7), acetate buffer ((pH 4 or 5), tris hydrochloride buffer (pH 8 or 9), or carbonate).
  • a final concentration of 50 mM phosphate buffer (pH 3, 6 or 7), acetate buffer ((pH 4 or 5), tris hydrochloride buffer (pH 8 or 9), or carbonate Suspension in sodium buffer (pH 10)) to a final concentration of 0.1 g / l as the amount of FTH ferritin, and the surface charge at 25 ° C. in the buffer was measured by Zetasizer Nano ZS (Malvern). did.
  • this DOX-FTH ferritin complex obtained in one step by leaving DOX and FTH ferritin in an aqueous solution is equivalent to that of FTH ferritin, and basic DOX is adsorbed on the surface of FTH ferritin. Rather, it was considered to have a structure in which DOX was encapsulated inside FTH ferritin.
  • Example 8 Stability evaluation of DTH-encapsulated FTH ferritin> The stability of the low molecular weight drug-encapsulating FTH ferritin obtained by the one-step process was evaluated.
  • DOX was mixed with 1 ml of 50 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 8) containing FTH ferritin at a final concentration of 1 mg / ml to a final concentration of 0.3 mg / l, and the mixture was left at 40 ° C for 60 minutes. After standing, centrifugation (15,000 rpm, 1 minute), the supernatant was equilibrated with 10 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8), a desalting column PD-10 (Sephadex G-25 packed product, GE Healthcare) Company) and separated the drug and protein that were not encapsulated.
  • Tris hydrochloride buffer pH 8
  • PD-10 desalting column
  • the total amount of the solution (3.5 ml) was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare) to obtain a complex of DOX and FTH ferritin suspended in 1 ml of water. Then, the contained protein concentration was determined with a protein assay CBB solution (Nacalai Tesque, Inc.) using bovine albumin as a standard.
  • a spectrophotometer DU-800, Beckman Coulter, Inc.
  • Example 9 Estimation of DOX state in FTH ferritin>
  • Ferritin has a cage shape with a diameter of 12 nm, and the diameter of its internal cavity is 7 nm. Ideally, the volume of the lumen is 0.18 zl (zl: Zepto little, 10 ⁇ 21 liter). If one molecule of DOX (molecular weight 579.98) was present in the ferritin lumen, the concentration of DOX in the ferritin lumen would be 5.4 g / l. It has been confirmed that the solubility of DOX in water at room temperature is 60 g / l or more.
  • Example 10 Comparison between one-step process and disassociation / reassociation process (1)> The DOX-encapsulated amounts of DOX-encapsulated FTH ferritin obtained by the one-step process and the disassociation / reassociation process were compared.
  • the concentrations of DOX and FTH ferritin were determined by a calibration curve prepared from the absorbances of various concentrations of DOX and FTH ferritin at 280 nm and 480 nm. Based on the concentration, the drug introduction rate (weight of DOX in the total weight of DOX and FTH ferritin) was determined.
  • Example 11 Comparison between one-step process and disassociation / reassociation process (2)> The recovery rates of FTH ferritin obtained by the one-step process and the disassociation / reassociation process were compared.
  • the recovery rate of FTH ferritin obtained by the one-step process of leaving at 60 ° C. for 60 minutes was 97% of that of untreated FTH ferritin.
  • the recovery rate of FTH ferritin obtained by the disassociation / reassociation process was 72% of that of untreated FTH ferritin, and FTH ferritin monomer that could not be reassembled was also confirmed in the latter half of the elution.
  • Example 12 Introduction of low molecular weight drug by one-step process (1)> Various small molecules were introduced into FTH ferritin in a one-step process.
  • Table 1 shows the low-molecular drugs introduced this time.
  • Phosphate buffer solution pH 3, 6 or 7
  • acetate buffer solution pH 4 or 5
  • Tris hydrochloride buffer solution pH 8 or 9
  • sodium carbonate buffer solution containing FTH ferritin at a final concentration of 1 mg / ml and having a final concentration of 50 mM.
  • the liquid pH 10) was mixed with various low molecular weight agents so that the final concentration was 0.2 mM to 5 mM, and the mixture was allowed to stand at 20 ° C to 60 ° C for 60 minutes. All reactions were run in a volume of 0.1 ml.
  • Tables 4 and 5 show the relationship between the pKa of each low-molecular-weight drug and the pH of the buffer solution used in the reaction that introduced the most amount into ferritin. The correlation between them is shown in FIG. The correlation coefficient was 0.84, which was a significant positive correlation (t-test, p ⁇ 1%). Molecules having a pKa lower than neutral (pH 7) are efficiently introduced into ferritin under acidic conditions (pH 6 or less), and molecules having a pKa higher than neutral are from weakly acidic conditions to alkaline conditions (pH 6 or more). It was suggested to be done.
  • the amount of the low molecular weight drug introduced into ferritin by the one-step process was compared with the amount of the low molecular weight drug introduced into ferritin by the disassociation / reassociation process.
  • FIG. 12 shows the ratio of the drug introduction amount in the one-step process and the drug introduction amount in the disassociation / reassociation process.
  • the comparison of the introduced amount of DOX was calculated using Example 5 and Example 10.
  • the one-step process can introduce more drugs into ferritin, and the difference in the amount introduced was 2.5 times, and the difference in the amount introduced was the largest. With DOX, a difference of 30 times could be confirmed.
  • ferritin Since various drugs were introduced while maintaining the supramolecular structure of ferritin, it is presumed that drug introduction into ferritin is carried out through a three-fold symmetric channel similarly to metal ions ( T Douglas and DR Ripoll Protein Sci, 7, 1083-1091. (1998), MA Carrondo EMBO J. 22, 1959-1968. (2003)). The reason is that the structure of ferritin other than the channel is tight, and even metal ions cannot pass through it. It is thought that organic molecules with a larger excluded volume cannot pass through it. Then, in a neutral buffer solution, the three-fold symmetrical channel is negatively charged, and like the inflow of metal ions due to the electrostatic gradient, organic molecules are also actively incorporated into ferritin and negatively charged.
  • the one-step process can introduce more drugs than the conventional disassociation / reassociation process.
  • Example 13 Construction of mutant FTH ferritin containing DOX (1)> A one-step process was used to introduce a drug into ferritin displaying a peptide aptamer.
  • a titanium recognition peptide (minTBP1: RKLPDA (SEQ ID NO: 7) was inserted and fused in the flexible linker region between the 2nd and 3rd positions from the N-terminal of the 6 ⁇ -helices forming the ferritin monomer.
  • the DNA encoding the human-derived ferritin H chain (FTH-BC-TBP) monomer was totally synthesized. PCR was performed using the fully synthesized DNA as a template with 5'-GAAGGAGATATACATATGACGACCCGCGTCCACTCG-3 '(SEQ ID NO: 8) and 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTTCATTATCACTGTC-3' (SEQ ID NO: 9) as primers.
  • PCR was carried out using pET20 (Merck) as a template and 5'-TTTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAAGTTAAAC-3 '(SEQ ID NO: 10) and 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCGTCG-3' (SEQ ID NO: 11) as primers.
  • FTH-BC is treated with In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) at 50 ° C for 15 minutes.
  • An expression plasmid (pET20-FTH-BC-TBP) carrying a gene encoding -TBP monomer was constructed.
  • Ferritin composed of FTH-BC-TBP monomer is abbreviated as FTH-BC-TBP ferritin, if necessary.
  • 5'-TTTGGATCCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3 '(SEQ ID NO: 12) and 5'-TTTGGATCCTTAACAGCTTTCATTACTACTG-3' were prepared using pET20-FTH carrying a DNA encoding human-derived ferritin H chain monomer as a template.
  • the obtained PCR product was purified by Wizard DNA Clean-Up System (Promega), treated with restriction enzymes DpnI and BamHI (Takara Bio), and self-ligated to obtain FTHc having a cysteine at the C-terminus.
  • An expression plasmid (pET20-FTHc) carrying a gene encoding a monomer was constructed. Ferritin composed of FTHc monomer is abbreviated as FTHc ferritin as necessary.
  • the vector pET20-FTH-BC-TBP or pET20-FTHc carrying the constructed mutant ferritin monomer was respectively introduced into Escherichia coli BL21 ( DE3) was subjected to flask culture at 37 ° C. for 24 hours in 100 ml of LB medium (containing 10 g / l of Bacto-typtone, 5 g / l of Bacto-yeast extract, 5 g / l of NaCl and 100 mg / l of ampicillin).
  • the obtained cells were ultrasonically disrupted, and the supernatant was heated at 60 ° C for 20 minutes.
  • the supernatant obtained after heating was injected into a HiPerp Q HP column (GE healthcare) equilibrated with 50 mM TrisHCl buffer (pH 8.0), and 50 mM TrisHCl buffer (pH 8.0) containing 0 mM to 500 mM NaCl.
  • the target protein was separated and purified by applying a salt concentration gradient in 0).
  • the solvent of the solution containing the protein was replaced with 10 mM TrisHCl buffer (pH 8.0) by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare).
  • the solution was injected into a HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column (GE healthcare) equilibrated with 10 mM TrisHCl buffer (pH 8.0), and each mutant ferritin was separated and purified depending on the size.
  • the solution containing each mutant ferritin was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare), and the protein concentration was measured using protein assay CBB solution (Nacalai Tesque) and bovine albumin as standard. Was decided as.
  • 1 ml of a solution containing 0.2 mg / ml FTH-BC-TBP ferritin and 1 ml of a solution containing 5 mg / ml FTHc ferritin could be obtained.
  • DOX was mixed with 1 ml of 50 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 8) containing each mutant ferritin at a final concentration of 1 mg / ml so that the final concentration would be 0.3 mg / l, and the mixture was left at 50 ° C for 60 minutes. After standing, centrifugation (15,000 rpm, 1 minute), the supernatant was equilibrated with 10 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8), a desalting column PD-10 (Sephadex G-25 packed product, GE Healthcare) Company) and separated the drug and protein that were not encapsulated.
  • Tris hydrochloride buffer pH 8
  • PD-10 desalting column
  • the total amount of the solution (3.5 ml) was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare) to obtain a complex of DOX and each mutant ferritin suspended in 1 ml of water. Then, the contained protein concentration was determined with a protein assay CBB solution (Nacalai Tesque, Inc.) using bovine albumin as a standard. Also, the DOX concentration was determined by absorption spectroscopy at 480 nm.
  • Example 14 Construction of mutant FTH containing DOX (2)> A one-step process was used to introduce a drug into ferritin displaying a peptide aptamer.
  • HER2a MARSGL (SEQ ID NO: 14); M Hoimel et. Al., Int. J. Cancer 92, 748-755. (2001)) was inserted and fused at the N-terminal of the ferritin monomer.
  • pET20-FTH carrying a DNA encoding a human-derived ferritin H chain monomer was used as a template and 5′-TTTTCATATGGCAGTTAGTGGTTAACGACCGCGTCCACCCTCG- PCR was performed using 3 '(SEQ ID NO: 15) and 5'-TTTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTTAAAC-3' (SEQ ID NO: 16) as primers.
  • the resulting PCR product is purified by Wizard DNA Clean-Up System (Promega), treated with restriction enzymes DpnI and NdeI (Takara Bio), and self-ligated to carry the gene encoding HER2a-FTH.
  • the expressed expression plasmid (pET20-HER2a-FTH) was constructed.
  • Ferritin composed of HER2a-FTH monomer is abbreviated as HER2a-FTH ferritin, if necessary.
  • RNA recognition peptide U2AF: TRQAR (SEQ ID NO: 17) R Tan and AD Frankel, Proc Natl Acad Sci USA 92, 5282-5286. (1995)
  • U2AF TRQAR
  • 5'-TTTGGATCCTTATCTGCGTGCTTGACGTGTTGCTTTCATCATTCATTG-3 '(sequence No. 18) and 5′-TTTGGATCCTTAACAGCTTTCATTATCACTG-3 ′ SEQ ID NO: 13
  • the obtained PCR product is purified by Wizard DNA Clean-Up System (Promega), treated with restriction enzymes DpnI and NdeI (Takara Bio), and self-ligated to encode FTH-U2AF monomer.
  • An expression plasmid (pET20-FTH-U2AF) carrying a gene was constructed.
  • Ferritin composed of FTH-U2AF monomer is abbreviated as FTH-U2AF ferritin, if necessary.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) into which pET20 loaded with the constructed mutant ferritin monomer (HER2a-FTH monomer or FTH-U2AF monomer) was introduced into LB medium (10 g / l Bacto- typetone, 5 g / l Bacto-yeast extract, containing 5 g / l NaCl and 100 mg / l ampicillin) 100 ml, and cultured in a flask at 37 ° C. for 24 hours. The obtained cells were ultrasonically disrupted, and the supernatant was heated at 60 ° C for 20 minutes.
  • LB medium 10 g / l Bacto- typetone, 5 g / l Bacto-yeast extract, containing 5 g / l NaCl and 100 mg / l ampicillin
  • the supernatant obtained after heating was injected into a HiPerp Q HP column (GE healthcare) equilibrated with 50 mM TrisHCl buffer (pH 8.0), and 50 mM TrisHCl buffer (pH 8.0) containing 0 mM to 500 mM NaCl.
  • the target protein was separated and purified by applying a salt concentration gradient in 0).
  • the solvent of the solution containing the protein was replaced with 10 mM TrisHCl buffer (pH 8.0) by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare).
  • the solution was injected into a HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column (GE healthcare) equilibrated with 10 mM TrisHCl buffer (pH 8.0), and each mutant ferritin was separated and purified according to size.
  • the solution containing each mutant ferritin was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare), and the protein concentration was adjusted with protein assay CBB solution (Nacalai Tesque) using bovine albumin as a standard. Were determined.
  • DOX was mixed in 1 ml of 50 mM Tris hydrochloride buffer (pH 9) containing each mutant ferritin at a final concentration of 1 mg / ml so that the final concentration would be 0.3 mg / l, and the mixture was allowed to stand at 50 ° C for 60 minutes. After standing, centrifugation (15,000 rpm, 1 minute), the supernatant was equilibrated with 10 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8), a desalting column PD-10 (Sephadex G-25 packed product, GE Healthcare) Company) and separated the drug and protein that were not encapsulated.
  • Tris hydrochloride buffer pH 8
  • PD-10 desalting column
  • the total amount of the solution (3.5 ml) was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare) to obtain a complex of DOX and mutant ferritin suspended in 1 ml of water. Then, the contained protein concentration was determined with a protein assay CBB solution (Nacalai Tesque, Inc.) using bovine albumin as a standard. Also, the DOX concentration was determined by absorption spectroscopy at 480 nm.
  • DOX could be introduced into any mutant ferritin.
  • the drug introduction rates at this time were 14.6% (wt) for HER2a-FTH ferritin and 17.9% (wt) for FTH-U2AF ferritin. That is, it was found that a drug can be introduced using a one-step process even in a ferritin functionalized by inserting a peptide.
  • Example 15 pH dependence of FTH ferritin structure>
  • FTH ferritin was suspended in a solution of each pH to a final concentration of 1 mg / ml, left at 25 ° C for 30 minutes, and then Zetasizer Nano ZS was used.
  • the size of ferritin at each pH was measured by the dynamic light scattering (DLS) method. The measurement was carried out at 25 ° C.
  • the solutions used were 0.1 N HCl (pH 1.7), 20 mM phosphoric acid (pH 2.6, pH 3.2, pH 5.6, pH 6.7, pH 7.7), 20 mM acetic acid (pH 4.2, pH 4.
  • pH 5.3 1 mM NaOH (pH 11.1), 10 mM NaOH (pH 12.3) and 100 mM NaOH (pH 12.8) were used. Further, for the solution of pH 2.0 to pH 2.4, HCl was added dropwise to 10 mM TrisHCl to adjust the pH.
  • the average particle size of DLS was 8 nm or less, and it was suggested that ferritin was disassociated and the cage structure was broken (Fig. 13).
  • the average particle size from pH 2.6 to pH 12.8 was 11 nm or more, and it was found that the cage structure was maintained. In other words, it was found that the one-pot method of this time could introduce the drug into ferritin under the condition that the cage structure was maintained.
  • Example 16 Construction of FTL ferritin encapsulating DOX> Drug introduction into L chain ferritin was performed using a one-step process. A DNA encoding a human-derived ferritin L chain (FTL (SEQ ID NO: 2)) monomer was totally synthesized. PCR was carried out using the fully synthesized DNA as a template and 5'-GAAGGAGATATACATATGAGCTCCCAGATTCGTCAG-3 '(SEQ ID NO: 234) and 5'-CTCGAATTCGGATCCCTTAGCGTGCTTGAGAGTGAG-3' (SEQ ID NO: 235) as primers.
  • FTL human-derived ferritin L chain
  • PCR was carried out using pET20 (Merck) as a template and 5′-TTTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTTAAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and 5′-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 6) as primers.
  • pET20 Merck
  • 5′-TTTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTTAAAC-3 ′ SEQ ID NO: 5′-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3 ′
  • SEQ ID NO: 6 5′-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3 ′
  • Escherichia coli BL21 (DE3) into which the constructed pET20-FTL had been introduced contained LB medium (10 g / l Bacto-typtone, 5 g / l Bacto-yeast extract, 5 g / l NaCl, and 100 mg / l ampicillin. ) 100 ml, flask culture was carried out at 37 ° C. for 24 hours. The obtained cells were ultrasonically disrupted, and the supernatant was heated at 60 ° C for 20 minutes.
  • LB medium 10 g / l Bacto-typtone, 5 g / l Bacto-yeast extract, 5 g / l NaCl, and 100 mg / l ampicillin.
  • FTL ferritin composed of FTL monomer
  • the solution was injected into a HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column (GE healthcare) equilibrated with 10 mM TrisHCl buffer (pH 8.0), and FTL ferritin was separated and purified according to size.
  • the solution containing the FTL ferritin was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare), and the protein concentration was determined with protein assay CBB solution (Nacalai Tesque) using bovine albumin as a standard. did. As a result, 1 ml of a solution containing 3 mg / ml of FTL ferritin could be obtained.
  • the total amount of the solution (3.5 ml) was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspin 20-100K (GE healthcare) to obtain a complex of DOX and FTL ferritin suspended in 1 ml of water. Then, the contained protein concentration was determined with a protein assay CBB solution (Nacalai Tesque, Inc.) using bovine albumin as a standard. Also, the DOX concentration was determined by absorption spectroscopy at 480 nm.
  • Uranine was mixed at a final concentration of 300 mM with a phosphate buffer (pH 3 or 7) having a final concentration of 50 mM containing FTH ferritin at a final concentration of 3 mg / ml or an acetate buffer (pH 5), and the mixture was mixed at 30 ° C. or 60 ° C. Each was left at 60 ° C. for 60 minutes. All reactions were run in a volume of 1 ml.
  • uranin was introduced into ferritin through the disassociation / reassociation process. That is, 0.5 ml of 50 mM glycine hydrochloride buffer (pH 2.3) containing FTH ferritin at a final concentration of 5 mg / ml and a final concentration of 1 mM to 300 mM, respectively, was allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Then, 10 ⁇ l of 1M Tris hydrochloride buffer (pH 9.0) was added to neutralize, and the mixture was left at room temperature for 15 minutes.
  • Example 18 Stability of dye-encapsulated ferritin constructed by one-step process> The stability of uranine-encapsulating FTH ferritin constructed in a one-step process in plasma was evaluated. First, in 40 ul of human plasma (standard human plasma for blood coagulation test, GCH-100A, SIEMENS, sold by Sysmex, Lot503264B), UTHF-encapsulated FTH ferritin with a final concentration of 1 mg / ml was allowed to stand at 37 ° C. in the dark. Immediately after the start of the reaction, after leaving for 24 hours or 48 hours, 3 tubes each were collected and immediately stored in a refrigerator.
  • human plasma standard human plasma for blood coagulation test, GCH-100A, SIEMENS, sold by Sysmex, Lot503264B
  • UTHF-encapsulated FTH ferritin with a final concentration of 1 mg / ml was allowed to stand at 37 ° C. in the dark. Immediately after the start of the reaction, after leaving for 24 hours or
  • Example 19 Cell introduction of dye-encapsulating ferritin constructed by one-step process> Ferritin is known to be transported into cells in a transferrin receptor (TfR) -dependent manner. In order to evaluate the intracellular transferability of drug-encapsulating ferritin constructed by the one-step process, the intracellular uptake activity of uranine-encapsulating FTH ferritin was evaluated using uranine as a model compound.
  • TfR transferrin receptor
  • Evaluation medium (Opti-MEM TM (Thermo Fisher Scientific)) + 1% non-essential amino acid solution (Thermo Fisher Scientific) + 1% Penicillin-streptomycin (Nacalai Tesque) with a final concentration of uranin-encapsulated FTH fernin at 0. 0 ⁇ M) to 800 nM (uranine concentration concentration: 67.9 ⁇ M) in 100 ⁇ l of each medium added to human breast cancer-derived SKBR-3 cells (20,000 cells / well, 96-well plate) The cells were cultured at 37 ° C. The SKBR-3 cells express the transferrin receptor TfR.
  • the cells were washed twice with 100 ⁇ l of phosphate buffered saline, and left to stand at 37 ° C. for 10 minutes in 50 ⁇ l of Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich). Then, 100 ⁇ l of Opti-MEM TM medium was added, the cells were transferred to a plate for fluorescence activated cell sorting (FACS), and centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes. Each cell was suspended in a buffer for FACS (Attune TM Focusing Fluid, Thermo Fisher Scientific) and analyzed by FACS (Attune NxT, Thermo Fisher Scientific).
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the method of the present invention holds promise, for example, in the production of organic compound-encapsulated ferritin, which is expected as a novel drug delivery system (DDS) or utilized in the production of electronic devices.
  • DDS novel drug delivery system
  • the ferritin monomer in the fusion protein constituting the multimer of the present invention is a human ferritin monomer
  • the multimer of the present invention is useful as DDS.
  • the buffer solution of the present invention is useful, for example, in the production of ferritin encapsulating an organic compound.
  • Organic compound-encapsulated ferritin is useful, for example, as a novel drug delivery system (DDS).

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Abstract

本発明は、有機化合物封入フェリチンの代替的な製造方法を提供する。より具体的には、本発明は、有機化合物封入フェリチンの製造方法であって、 （１）緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合して、有機化合物およびフェリチンの混合物を得ること；ならびに （２）緩衝液中で前記混合物をインキュベートすることを含み、　緩衝液は、ｐＨ３以上１３未満であり、かつ　緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１３未満のｐＨを有する、方法を提供する。

Description

有機化合物封入フェリチンの製造方法
　本発明は、有機化合物封入フェリチンの製造方法などに関する。
　フェリチンは、動植物から微生物まで普遍的に存在する、複数の単量体から構成される内腔を有する球状タンパク質である。ヒト等の動物では、フェリチンとしてＨ鎖およびＬ鎖の２種の単量体が存在すること、ならびにフェリチンは２４個の単量体から構成される多量体（多くの場合、Ｈ鎖およびＬ鎖の混合物）であって、外径１２ｎｍのカゴ状の形態および内径７ｎｍの内腔を有することが知られている。フェリチンは、生体あるいは細胞中の鉄元素のホメオスタシスに深く関わっており、その内腔中に鉄を保持できるため、鉄の輸送・貯蔵等の生理学的機能の役割を担うことが知られている。
　フェリチンはまた、その内腔中に薬剤を封入するＤＤＳ担体としての応用が検討されており、また、電子デバイスの作製にも利用されている。フェリチンのこのような用途に関連して、フェリチンに有機化合物を封入する方法が幾つか報告されている。具体的には、このような方法として、（１）溶液のｐＨを変更することによりフェリチンの脱会合および再会合を調節する方法、（２）変性剤によるフェリチンの変性、および再フォールディングを行う方法、ならびに（３）圧力による方法が報告されている。
　例えば、非特許文献１では、フェリチンをｐＨ２の酸性条件下で脱会合させ、次いで溶液のｐＨを７～９に変更することでフェリチンを再会合させることにより、約２８個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
　非特許文献２では、フェリチンを改変することによりフェリチンの安定性を向上させつつ、溶液のｐＨをＨＣｌ添加でｐＨ２に変更してフェリチンの脱会合および再会合を調節することにより、約３０～９０個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
　非特許文献３では、先ず、尿素等の変性剤によりフェリチンを変性させ、次いで、変性フェリチンを薬剤と混合した後、溶液中の変性剤を抜くことにより、フェリチンが天然のフォールディング構造に回復する際に約３３個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
　特許文献１では、フェリチンおよびドキソルビシンの混合液を高圧（２００～８００ＭＰａ）下で６～２０時間放置することにより、約１０～２０個のドキソルビシンをフェリチンに封入できたことが報告されている。
中国特許出願公開第１０６１１０３３３号明細書
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　１９６（２０１４）　１８４－１９６ Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２０１６，１７，５１４－５２２ Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．　２０１４　１１１（４１）：１４９００－５
　上記の従来方法は、フェリチンの回収率やフェリチンへの有機化合物への封入効率が低く、また、操作が煩雑である点や、所定の装置を必要とする点、封入率を上げるためにフェリチン表面を特別に改変する必要がある点で負担になるという課題がある。
　より具体的には、上記（１）および（２）の方法では、酸性緩衝液または変性剤によるフェリチン構造の破壊（脱会合／変性）が必要であるところ、一旦フェリチン構造を破壊してしまうと、その後に構造の回復プロセス（再会合／再フォールディング）を設けても、フェリチンの一部が破壊されたままの状態となり元に戻らないため、フェリチンの回収率が低下するという課題がある。加えて、フェリチン構造を破壊し、その後に構造を回復させるという上記（１）および（２）の方法は、溶液（反応場）中に分布する有機化合物を取込みフェリチンに封入するに過ぎないものであることから、溶液の濃度以上の有機化合物をフェリチンに封入することができず、フェリチンに封入できる有機化合物の量が少ないという封入効率上の課題がある。
　また、上記（１）の方法については、ｐＨ条件の変更を要するために緩衝液の置換が必要である。上記（２）の方法については、再フォールディングのために変性剤の除去が必要であるのみならず、封入率を上げるためにフェリチン表面を特別に改変する必要がある。したがって、上記（１）（２）の方法は、煩雑である。
　さらに、上記（３）の方法については、非常に高い圧力条件を達成できる特殊な装置を必要とする点で負担になる。
　したがって、本発明の目的は、上記のような１以上の課題を解決することができる、有機化合物封入フェリチンの代替的な製造方法を提供することである。
　従来、金属原子および金属化合物（例、金属酸化物）については、サイズが小さいため、フェリチン構造の破壊（脱会合／変性）を引き起こさない条件下で、金属原子および金属化合物をフェリチンに封入できることが知られていた。
　しかし、有機化合物については、サイズが相対的に大きく、フェリチン構造におけるフェリチン透過能を有しないと考えられていたため、フェリチン構造の破壊を引き起こさない条件下では、有機化合物をフェリチンに封入できないと考えられていた。実際、非特許文献１は、ドキソルビシンのフェリチンへの封入に際して、フェリチンの脱会合を引き起こすことができる強酸性条件下（ｐＨ約２．５以下）をあえて採用して、フェリチンを脱会合させている。
　今回、本発明者らは、鋭意検討した結果、フェリチン構造を破壊しないｐＨ範囲内にある、有機化合物の酸解離定数（ｐＫａ）に応じた適切なｐＨを有する緩衝液を使用するという簡便な方法により、有機化合物をフェリチンに封入できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕有機化合物封入フェリチンの製造方法であって、
（１）緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合して、有機化合物およびフェリチンの混合物を得ること；ならびに
（２）緩衝液中で前記混合物をインキュベートすることを含み、
　緩衝液は、ｐＨ３以上１３未満であり、かつ
　緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１３未満のｐＨを有する、方法。
〔２〕緩衝液のｐＨと有機化合物のｐＫａが、式：ｐＨ＝２．６＋０．６ｐＫａ±０．４ｐＫａの関係を満たす、〔１〕の方法。
〔３〕インキュベートの温度が１０℃以上６０℃以下である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕有機化合物の分子量が１００以上１０００未満である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕有機化合物のｐＫａが２以上１３以下である、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕１０分子以上２００分子以下の有機化合物がフェリチン１分子に封入されている、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕混合およびインキュベートの合計時間が３０分以上である、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕前記混合におけるフェリチンに対する有機化合物の重量比（有機化合物／フェリチン）が０．２０以上０．３６以下である、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕有機化合物が、正の架電部分、または正に架電し得る部分を有する、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕正の架電部分が、（ａ）アンモニウム基（例、第一級、第二級、第三級または第四級）、グアニジウム基、イミダゾリウム基、オキサゾリウム基、チアゾリウム基、オキサジアゾリウム基、トリアゾリウム基、ピロリジニウム基、ピリジニウム基、ピペリジニウム基、ピラゾリウム基、ピリミジニウム基、ピラジニウム基、およびトリアジニウム基からなる群より選ばれるカチオン性窒素含有基、または（ｂ）ホスホニウム基である、〔９〕の方法。
〔１１〕正に架電し得る部分が、（ａ’）アミノ基、グアニジノ基、ニトロ基、アミド基、ヒドラジド基、イミド基、アジド基、およびジアゾ基からなる群より選ばれる窒素含有基、または（ｂ’）ホスフィノ基である、〔９〕または〔１０〕の方法。
〔１２〕フェリチンが（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンである、〔１〕～〔１１〕のいずれかの方法：
（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
〔１３〕有機化合物封入フェリチンを含む緩衝液であって、
　緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１２未満のｐＨを有する、緩衝液。
〔１４〕緩衝液が、６以上９以下のｐＨを有する、〔１３〕の緩衝液。
〔１５〕有機化合物が、６以上９以下のｐＫａを有する、〔１３〕または〔１４〕の緩衝液。
〔１６〕有機化合物封入フェリチンであって、
　有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、および標識物質からなる群より選ばれ、
　フェリチン１分子への有機化合物の封入分子数が以下である、有機化合物封入フェリチン：
（１）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンである場合、４０分子以上２００分子以下；
（２）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが遺伝子組換えフェリチンである場合、１００分子以上２００分子以下；または
（３）有機化合物がヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、または標識物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンまたは遺伝子組換えフェリチンである場合、１０分子以上２００分子以下。
〔１７〕アントラサイクリン系物質がドキソルビシンであり、
　ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬がファモチジンであり、
　ピグアナイド系物質がメトホルミンであり、
　ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬がミノキシジルであり、
　β２アドレナリン受容体作動薬がテルブタリンであり、
　イミダゾリン系物質がクレアチニンであり、
　ビタミンがチアミン、リボフラビン、またはニコチンアミドであり、
　標識物質がローダミンＢ、ウラニン、またはコンゴレッドである、〔１６〕の有機化合物封入フェリチン。
〔１８〕有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、およびβ２アドレナリン受容体作動薬からなる群より選択される、〔１６〕または〔１７〕の有機化合物封入フェリチン。
〔１９〕フェリチンが（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンである、〔１６〕～〔１８〕のいずれかの有機化合物封入フェリチン：
（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
　本発明の方法によれば、有機化合物のｐＫａに応じた適切なｐＨを有する緩衝液を使用するという簡便な方法により、有機化合物をフェリチンに封入することができる。
　本発明の方法はまた、有機化合物封入フェリチンの作製効率に優れる。先ず、本発明の方法は、フェリチン構造の破壊（脱会合／変性）を必要としないため、フェリチン構造の破壊（脱会合／変性）および回復プロセスを必要とする従来の方法（回復プロセスを設けても、フェリチンの一部が破壊されたままの状態となり元に戻らない）に比し、フェリチンの回収率に優れる。次に、本発明の方法は、フェリチンの超分子構造が維持可能な環境下でフェリチンの内腔と外殻の電気化学ポテンシャル差を利用することにより、溶液中の濃度以上に有機化合物をフェリチンに封入できることから、溶液中の濃度以上で有機化合物をフェリチンに封入することが困難である従来の方法（フェリチン構造の回復に伴い、溶液をフェリチン内腔中に取り込む方法）に比し、より多くの有機化合物をフェリチンに効率的に封入できる。
　本発明の方法はさらに、従来の方法とは異なり、緩衝液の置換、変性剤の除去、または特殊な装置が不要である点で簡便である。
図１は、各反応ｐＨにおけるフェリチンへの薬剤導入率（重量％）を示す図である。 図２は、各温度におけるフェリチンへの薬剤導入率（重量％）を示す図である。 図３は、フェリチンへの薬剤導入率（重量％）の経時的変化を示す図である。 図４は、反応溶液中の薬剤・フェリチン（タンパク質）濃度比と薬剤導入率（重量％）の関係を示す図である。 図５は、フェリチンへの薬剤の封入反応後におけるフェリチンおよび薬剤のカラム溶出ピークの一致（すなわち、フェリチンへの薬剤の封入）を示す図である。 図６は、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）による薬剤封入フェリチン複合体（水溶液分散性ナノ粒子）の確認を示す図である。 図７は、ドキソルビシン封入処理されていないフェリチンと薬剤封入フェリチンの表面電荷が同等であること（それ故、フェリチン表面にドキソルビシンが吸着することで複合化しているわけではないこと）を示す図である。 図８は、薬剤封入フェリチンのｐＨ安定性を示す図である。 図９は、従来の脱会合・再会合プロセスにおけるフェリチンの脱会合後の放置時間と薬剤導入率との関係を示す図である。 図１０は、本発明のワンステッププロセスと従来の脱会合・再会合プロセスによるフェリチンの回収率の比較を示す図である。 図１１は、各低分子薬剤のｐＫａと最もフェリチン内に導入量の多かった反応で用いた緩衝液ｐＨ（最適ｐＨ）との相関を示す図である。近似直線は、図１１の中央にある直線（ｐＨ＝２．６＋０．６ｐＫａ）である。各低分子薬剤のｐＫａと最適ｐＨとは、式：ｐＨ＝２．６＋０．６ｐＫａ±０．４ｐＫａ（切片：２．６；傾き：０．６；変動係数：０．４）の範囲内にある。 図１２は、本発明のワンステッププロセスでの薬剤導入量と従来の脱会合・再会合プロセスでの薬剤導入量の比を示す図である。 図１３は、ゼータサイザーナノＺＳを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）法による各ｐＨでのフェリチンのサイズの測定結果を示す図である。 図１４は、血漿中でのウラニン内包フェリチンの安定性評価結果を示す図である。 図１５は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による、トランスフェリン受容体ＴｆＲ提示細胞（ＳＫＢＲ－３細胞）内へのウラニン内包フェリチンの取込みの測定結果を示す図である。 図１６は、二光子励起蛍光顕微鏡による、トランスフェリン受容体ＴｆＲ提示細胞（ＳＫＢＲ－３細胞）内へのウラニン内包フェリチンの取込みの測定結果を示す図である。
　本発明は、以下を含む、有機化合物封入フェリチンの製造方法を提供する：
（１）緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合して、有機化合物およびフェリチンの混合物を得ること；ならびに
（２）緩衝液中で前記混合物をインキュベートすることを含み、
　緩衝液は、ｐＨ３以上１３未満であり、かつ
　緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１３未満のｐＨを有する、方法。
　フェリチン（２４多量体タンパク質）は、哺乳動物等の種々の高等生物に普遍的に存在する。フェリチンを構成するフェリチン単量体は、種々の高等生物間で高度に保存された６つのα－ヘリックスを有すること、および高等生物のフェリチン単量体としてＨ鎖およびＬ鎖の２種の単量体が存在することが知られている。
　本発明では、フェリチンを構成するフェリチン単量体として、哺乳動物のフェリチン単量体を使用することができる。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役用の哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。フェリチン単量体としては、Ｈ鎖もしくはＬ鎖、またはそれらの混合物のいずれも使用することができる。フェリチン単量体としては、天然フェチリン単量体、または２４多量体の形成能を有するその遺伝子組換えフェチリン単量体のいずれも使用することができる。
　一実施形態では、遺伝子組換えフェチリン単量体は、フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックス間のフレキシブルリンカー領域において改変されていてもよい。このような遺伝子組換えフェチリン単量体としては、例えば、フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて１番目と２番目の間、２番目と３番目の間、３番目と４番目の間、４番目と５番目の間、または５番目と６番目の間（好ましくは２番目と３番目の間）のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されたフェリチン単量体が挙げられる（本願実施例、ならびに米国特許出願公開第２０１６／００６０３０７号；Ｊａｅ　Ｏｇ　Ｊｅｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＣＳ　Ｎａｎｏ（２０１３），７（９），７４６２－７４７１；Ｓｏｏｊｉ　Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１６），１７（３），１１５０－１１５９；Ｙｏｕｎｇ　Ｊｉ　Ｋａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１２），１３（１２），４０５７－４０６４）。例えば、ヒトフェリチンＨ鎖（配列番号１）、およびヒトフェリチンＬ鎖（配列番号２）では、６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて１～６番目のα－ヘリックスは、表Ａに示されるとおりである。したがって、ヒトフェリチンＨ鎖（配列番号１）のフレキシブルリンカー領域は、１番目と２番目の間のフレキシブルリンカー領域（４３～４９位のアミノ酸残基からなる領域）、２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域（７８～９６位のアミノ酸残基からなる領域）、３番目と４番目の間のフレキシブルリンカー領域（１２５～１２７位のアミノ酸残基からなる領域）、４番目と５番目の間のフレキシブルリンカー領域（１３８位のアミノ酸残基の位置）、または５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域（１６０～１６４位のアミノ酸残基の領域）である。また、ヒトフェリチンＬ鎖（配列番号２）のフレキシブルリンカー領域は、１番目と２番目の間のフレキシブルリンカー領域（３８～４５位のアミノ酸残基からなる領域）、２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域（７４～９２位のアミノ酸残基からなる領域）、３番目と４番目の間のフレキシブルリンカー領域（１２１～１２３位のアミノ酸残基からなる領域）、４番目と５番目の間のフレキシブルリンカー領域（１３４位のアミノ酸残基の位置）、または５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域（１５５～１５９位のアミノ酸残基の領域）である。
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　別の実施形態では、遺伝子組換えフェチリン単量体は、そのＮ末端領域および／またはＣ末端領域において改変されていてもよい。フェリチン単量体のＮ末端は多量体の表面上に露出され、そのＣ末端は表面上に露出し得ない。したがって、フェリチン単量体のＮ末端に付加されるペプチド部分は多量体の表面に露出して、多量体の外部に存在する標的材料と相互作用することができる（例、国際公開第２００６／１２６５９５号）。一方、フェリチン単量体のＣ末端は、そのアミノ酸残基を改変することで、フェリチン内腔中の有機化合物と相互作用することができる（例、Ｙ．Ｊ．Ｋａｎｇ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１２，ｖｏｌ．１３（１２），４０５７）。このような遺伝子組換えフェチリン単量体としては、例えば、Ｎ末端またはＣ末端に機能性ペプチドが付加されたフェリチン単量体が挙げられる。
　好ましくは、フェリチンは、ヒトへの臨床応用の観点より、ヒトフェリチンである。ヒトフェリチンを構成するフェリチン単量体としては、ヒトフェリチンＨ鎖、もしくはヒトフェリチンＬ鎖、またはそれらの混合物のいずれも使用することができる。
　本発明では、フェリチン１分子（または１単位）とは、２４個のフェリチン単量体から構成される複合体（２４量体）をいい、フェリチン単量体はフェリチン１分子（または１単位）に該当しないものとする。
　特定の実施形態では、フェリチンＨ鎖は、以下であってもよい：
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質。　
　好ましくは、フェリチンＬ鎖は、以下であってもよい：
（Ａ２）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ２）配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、多量体（例、２４量体）形成能を有するタンパク質。　
　タンパク質（Ｂ１）および（Ｂ２）では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の修飾により、１個または数個のアミノ酸残基を改変することができる。アミノ酸残基の修飾は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１または数個」が示す数は、例えば１～５０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～３０個、さらにより好ましくは１～２０個、特に好ましくは１～１０個または１～５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。　
　タンパク質（Ｃ１）または（Ｃ２）では、対象のアミノ酸配列に対する同一性の程度は、好ましくは９２％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、さらにより好ましくは９７％以上であり、最も好ましくは９８％以上または９９％以上である。タンパク質の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。より具体的には、タンパク質の同一性の算定％は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ　Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｓｃｏｒｅ　ｍａｔｒｉｘ　ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。
　アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして特定されてもよい。具体的には、当業者は、１）複数のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、配列アライメントを利用することによりアミノ酸配列において変異を導入すべき位置を特定でき、また、既知の二次および三次構造情報を併用して、アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置を特定することもできる。　
　アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
　特定の実施形態では、本発明で用いられるフェリチンは、（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンであってもよい：
（ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
（ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
（ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
　機能性ペプチドとしては、目的タンパク質と融合された場合に任意の機能を目的タンパク質に付加することができるペプチドを用いることができる。このようなペプチドとしては、標的材料に対する結合能を有するペプチド、プロテアーゼ分解性ペプチド、細胞透過性ペプチド、安定化ペプチドが挙げられる。
　機能性ペプチドは、所望の機能を有する１個のペプチドのみであってもよいし、または所望の機能を有する同種もしくは異種の複数（例、２個、３個もしくは４個等の数個）のペプチドであってもよい。機能性ペプチドが上記のような複数のペプチドである場合、複数の機能性ペプチドは、任意の順序で挿入されて、フェリチン単量体と融合することができる。フェリチン単量体および機能性ペプチドの融合は、アミド結合を介して達成することができる。このような融合は、アミド結合により、フェリチン単量体および機能性ペプチドを直接的に連結することにより達成されてもよいし、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２～２０個、好ましくは２～１０個、より好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により間接的に達成されてもよい。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。好ましくは、上記機能性ペプチドは、２０個以下（好ましくは１８個以下、より好ましくは１５個以下、さらにより好ましくは１２個以下、特に好ましくは１０個以下）のアミノ酸残基からなるペプチドである。
　機能性ペプチドとして、標的材料に対する結合能を有するペプチドを用いる場合、標的材料としては、例えば、有機物および無機物（例、導体、半導体および磁性体）が挙げられる。より具体的には、このような標的材料としては、生体有機分子、金属材料、シリコン材料、炭素材料、タンパク質精製用タグ（例、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）と相互作用できる材料（例、ニッケル、マルトース、グルタチオン）、標識物質（例、放射性物質、蛍光物質、色素）、ポリマー（例、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレンオキシドまたはポリ（Ｌ－乳酸）等の疎水性有機ポリマーまたは伝導性ポリマー）が挙げられる。
　生体有機分子としては、例えば、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）、糖質（例、モノサッカリド、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド）、脂質が挙げられる。生体有機分子はまた、細胞表面抗原（例、癌抗原、心疾患マーカー、糖尿病マーカー、神経疾患マーカー、免疫疾患マーカー、炎症マーカー、ホルモン、感染症マーカー）であってもよい。生体有機分子はまた、疾患抗原（例、癌抗原、心疾患マーカー、糖尿病マーカー、神経疾患マーカー、免疫疾患マーカー、炎症マーカー、ホルモン、感染症マーカー）であってもよい。このような生体有機分子に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている。例えば、タンパク質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｆ．Ｄａｎｈｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１２，ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１１，ｐ．２９６１．、Ｃ－Ｈ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１５，ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２９０，２９０ｒａ９１．Ｌ．Ｖａｎｎｕｃｃｉ　ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２，ｖｏｌ．７，ｐ．１４８９、Ｊ．Ｃｕｔｒｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，ｖｏｌ．１９（８），ｐ．１４６８、Ｒ．Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１７，ｖｏｌ．１１０－１１１，ｐ．１３を参照）、核酸に対する結合能を有するペプチド（例、Ｒ．Ｔａｎ　ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５、ｖｏｌ．９２，ｐ．５２８２、Ｒ．Ｔａｎ　ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ、１９９３、ｖｏｌ．７３，　ｐ．１０３１、Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ　ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２，ｖｏｌ．３１，ｐ．６８７１を参照）、糖質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｋ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ　ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．１２，ｐ．５３９３－５３９７．，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．１１１，ｐ．４３６，Ａ．Ｂａｉｍｉｅｖ　ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｃｏｗ），２００５，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１，ｐ．９０．を参照）、脂質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｏ．Ｋｒｕｓｅ　ｅｔ．ａｌ．，Ｂ　Ｚ．　Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９５，ｖｏｌ．５０ｃ，ｐ．３８０，Ｏ．Ｓｉｌｖａ　ｅｔ．ａｌ．，　Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．６，２７１２８．，　Ａ．Ｆｉｌｏｔｅｏ　ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．１７，ｐ．１１８００を参照）等の種々のペプチドが報告されている。
　好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、タンパク質に対する結合能を有するペプチドであってもよい。タンパク質に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｄａｎｈｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１２，ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１１，ｐ．２９６１に開示されるＲＧＤ含有ペプチドやその改変配列（例、ＲＧＤ（配列番号１９）、ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ（配列番号２０）、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号２１）、ＧＲＧＤＳ（配列番号２２）、およびＡＳＤＲＧＤＦＳＧ（配列番号２３））、ならびにその他のインテグリン認識配列（例、ＥＩＬＤＶ（配列番号２４）、およびＲＥＤＶ（配列番号２５））、Ｌ．Ｖａｎｎｕｃｃｉ　ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２，ｖｏｌ．７，ｐ．１４８９に開示されるペプチド（例、ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰ（配列番号２６））、Ｊ．Ｃｕｔｒｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．８，ｐ．１４６８に開示されるペプチド（例、ＶＮＴＡＮＳＴ（配列番号２７））、Ｒ．Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１７，ｖｏｌ．１１０－１１１，ｐ．１３に開示されるペプチド（例、ＤＨＬＡＳＬＷＷＧＴＥＬ（配列番号２８）、およびＮＹＳＫＰＴＤＲＱＹＨＦ（配列番号２９）、ＩＰＬＰＰＰＳＲＰＦＦＫ（配列番号３０）、ＬＭＮＰＮＮＨＰＲＴＰＲ（配列番号３１）、ＣＨＨＮＬＴＨＡＣ（配列番号３２）、ＣＬＨＨＹＨＧＳＣ（配列番号３３）、ＣＨＨＡＬＴＨＡＣ（配列番号３４）、ＳＰＲＰＲＨＴＬＲＬＳＬ（配列番号３５）、ＴＭＧＦＴＡＰＲＦＰＨＹ（配列番号３６）、ＮＧＹＥＩＥＷＹＳＷＶＴＨＧＭＹ（配列番号３７）、ＦＲＳＦＥＳＣＬＡＫＳＨ（配列番号３８）、ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（配列番号３９）、ＱＨＹＮＩＶＮＴＱＳＲＶ（配列番号４０）、ＱＲＨＫＰＲＥ（配列番号４１）、ＨＳＱＡＡＶＰ（配列番号４２）、ＡＧＮＷＴＰＩ（配列番号４３）、ＰＬＬＱＡＴＬ（配列番号４４）、ＬＳＬＩＴＲＬ（配列番号４５）、ＣＲＧＤＣＬ（配列番号４６）、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号４７）、ＲＴＤＬＤＳＬＲＴＹＴＬ（配列番号４８）、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ（配列番号４９）、ＡＰＳＰＭＩＷ（配列番号５０）、ＬＱＮＡＰＲＳ（配列番号５１）、ＳＷＴＬＹＴＰＳＧＱＳＫ（配列番号５２）、ＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（配列番号５３）、ＷＱＰＤＴＡＨＨＷＡＴＬ（配列番号５４）、ＣＳＤＳＷＨＹＷＣ（配列番号５５）、ＷＨＷＬＰＮＬＲＨＹＡＳ（配列番号５６）、ＷＨＴＥＩＬＫＳＹＰＨＥ（配列番号５７）、ＬＰＡＦＦＶＴＮＱＴＱＤ（配列番号５８）、ＹＮＴＮＨＶＰＬＳＰＫＹ（配列番号５９）、ＹＳＡＹＰＤＳＶＰＭＭＳ（配列番号６０）、ＴＮＹＬＦＳＰＮＧＰＩＡ（配列番号６１）、ＣＬＳＹＹＰＳＹＣ（配列番号６２）、ＣＶＧＶＬＰＳＱＤＡＩＧＩＣ（配列番号６３）、ＣＥＷＫＦＤＰＧＬＧＱＡＲＣ（配列番号６４）、ＣＤＹＭＴＤＧＲＡＡＳＫＩＣ（配列番号６５）、ＫＣＣＹＳＬ（配列番号６６）、ＭＡＲＳＧＬ（配列番号１４）、ＭＡＲＡＫＥ（配列番号６７）、ＭＳＲＴＭＳ（配列番号６８）、ＷＴＧＷＣＬＮＰＥＥＳＴＷＧＦＣＴＧＳＦ（配列番号６９）、ＭＣＧＶＣＬＳＡＱＲＷＴ（配列番号７０）、ＳＧＬＷＷＬＧＶＤＩＬＧ（配列番号７１）、ＮＰＧＴＣＫＤＫＷＩＥＣＬＬＮＧ（配列番号７２）、ＡＮＴＰＣＧＰＹＴＨＤＣＰＶＫＲ（配列番号７３）、ＩＶＷＨＲＷＹＡＷＳＰＡＳＲＩ（配列番号７４）、ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（配列番号７５）、ＭＱＬＰＬＡＴ（配列番号７６）、ＣＲＡＬＬＲＧＡＰＦＨＬＡＥＣ（配列番号７７）、ＩＥＬＬＱＡＲ（配列番号７８）、ＴＬＴＹＴＷＳ（配列番号７９）、ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ（配列番号８０）、ＴＨＥＮＷＰＡ（配列番号８１）、ＷＨＰＷＳＹＬＷＴＱＱＡ（配列番号８２）、ＶＬＷＬＫＮＲ（配列番号８３）、ＣＴＶＲＴＳＡＤＣ（配列番号８４）、ＡＡＡＰＬＡＱＰＨＭＷＡ（配列番号８５）、ＳＨＳＬＬＳＳ（配列番号８６）、ＡＬＷＰＰＮＬＨＡＷＶＰ（配列番号８７）、ＬＴＶＳＰＷＹ（配列番号８８）、ＳＳＭＤＩＶＬＲＡＰＬＭ（配列番号８９）、ＦＰＭＦＮＨＷＥＱＷＰＰ（配列番号９０）、ＳＹＰＩＰＤＴ（配列番号９１）、ＨＴＳＤＱＴＮ（配列番号９２）、ＣＬＦＭＲＬＡＷＣ（配列番号９３）、ＤＭＰＧＴＶＬＰ（配列番号９４）、ＤＷＲＧＤＳＭＤＳ（配列番号９５）、ＶＰＴＤＴＤＹＳ（配列番号９６）、ＶＥＥＧＧＹＩＡＡ（配列番号９７）、ＶＴＷＴＰＱＡＷＦＱＷＶ（配列番号９８）、ＡＱＹＬＮＰＳ（配列番号９９）、ＣＳＳＲＴＭＨＨＣ（配列番号１００）、ＣＰＬＤＩＤＦＹＣ（配列番号１０１）、ＣＰＩＥＤＲＰＭＣ（配列番号１０２）、ＲＧＤＬＡＴＬＲＱＬＡＱＥＤＧＶＶＧ（配列番号１０３）、ＳＰＲＧＤＬＡＶＬＧＨＫ（配列番号１０４）、ＳＰＲＧＤＬＡＶＬＧＨＫＹ（配列番号１０５）、ＣＱＱＳＮＲＧＤＲＫＲＣ（配列番号１０６）、ＣＭＧＮＫＣＲＳＡＫＲＰ（配列番号１０７）、ＣＧＥＭＧＷＶＲＣ（配列番号１０８）、ＧＦＲＦＧＡＬＨＥＹＮＳ（配列番号１０９）、ＣＴＬＰＨＬＫＭＣ（配列番号１１０）、ＡＳＧＡＬＳＰＳＲＬＤＴ（配列番号１１１）、ＳＷＤＩＡＷＰＰＬＫＶＰ（配列番号１１２）、ＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ（配列番号１１３）、ＥＴＡＰＬＳＴＭＬＳＰＹ（配列番号１１４）、ＧＩＲＬＲＧ（配列番号１１５）、ＣＰＧＰＥＧＡＧＣ（配列番号１１６）、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ（配列番号１１７）、ＣＲＧＲＲＳＴ（配列番号１１８）、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号１１９）、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号１２０）、ＨＶＧＧＳＳＶ（配列番号１２１）、ＲＧＤＧＳＳＶ（配列番号１２２）、ＳＷＫＬＰＰＳ（配列番号１２３）、ＣＲＧＤＫＲＧＰＤＣ（配列番号１２４）、ＧＧＫＲＰＡＲ（配列番号１２５）、ＲＩＧＲＰＬＲ（配列番号１２６）、ＣＧＦＹＷＬＲＳＣ（配列番号１２７）、ＲＰＡＲＰＡＲ（配列番号１２８）、ＴＬＴＹＴＷＳ（配列番号１２９）、ＳＳＱＰＦＷＳ（配列番号１３０）、ＹＲＣＴＬＮＳＰＦＦＷＥＤＭＴＨＥＣ（配列番号１３１）、ＫＴＬＬＰＴＰ（配列番号１３２）、ＫＥＬＣＥＬＤＳＬＬＲＩ（配列番号１３３）、ＩＲＥＬＹＳＹＤＤＤＦＧ（配列番号１３４）、ＮＶＶＲＱ（配列番号１３５）、ＶＥＣＹＬＩＲＤＮＬＣＩＹ（配列番号１３６）、ＣＧＧＲＲＬＧＧＣ（配列番号１３７）、ＷＦＣＳＷＹＧＧＤＴＣＶＱ（配列番号１３８）、ＮＱＱＬＩＥＥＩＩＱＩＬＨＫＩＦＥＩＬ（配列番号１３９）、ＫＭＶＩＹＷＫＡＧ（配列番号１４０）、ＬＮＩＶＳＶＮＧＲＨ（配列番号１４１）、ＱＭＡＲＩＰＫＲＬＡＲＨ（配列番号１４２）、およびＱＤＧＲＭＧＦ（配列番号１４３））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
　好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、核酸に対する結合能を有するペプチドであってもよい。核酸に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｒ．Ｔａｎ　ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５、ｖｏｌ．９２，ｐ．５２８２に開示されるペプチドおよびその部分ペプチド（例、ＴＲＱＡＲＲ（配列番号１７）、ＴＲＱＡＲＲＮ（配列番号１４４）、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号１４５）、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ（配列番号１４６）、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ（配列番号１４７）、ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡ（配列番号１４８）、およびＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１４９））、Ｒ．Ｔａｎ　ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ、１９９３、ｖｏｌ．７３，ｐ．１０３１に開示されるペプチド（例、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号１５０））、Ｔａｌａｎｉａｎ　ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２，ｖｏｌ．３１，ｐ．６８７１に開示されるペプチド（例、ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫ（配列番号１５１））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
　好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、糖質に対する結合能を有するペプチドであってもよい。糖質に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｋ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ　ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，ｖｏｌ．８９，No１２，ｐ．５３９３－５３９７．に開示されるペプチド（例、ＤＶＦＹＰＹＰＹＡＳＧＳ（配列番号１５２）、およびＲＶＷＹＰＹＧＳＹＬＴＡＳＧＳ（配列番号１５３））、Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．１１１，ｐ．４３６に開示されるペプチド（例、ＤＴＷＰＮＴＥＷＳ（配列番号１５４）、ＤＳＹＨＮＩＷ（配列番号１５５）、ＤＴＹＦＧＫＡＹＮＰＷ（配列番号１５６）、およびＤＴＩＧＳＰＶＮＦＷ（配列番号１５７））、Ａ．Ｂａｉｍｉｅｖ　ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｃｏｗ），２００５，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１，ｐ．９０に開示されるペプチド（ＴＹＣＮＰＧＷＤＰＲＤＲ（配列番号１５８）、およびＴＦＹＮＥＥＷＤＬＶＩＫＤＥＨ（配列番号１５９））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
　好ましくは、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドは、脂質に対する結合能を有するペプチドであってもよい。脂質に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、Ｏ．Ｋｒｕｓｅ　ｅｔ．ａｌ．，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９５，ｖｏｌ．５０ｃ，ｐ．３８０に開示されるペプチド（例、ＭＴＬＩＬＥＬＶＶＩ（配列番号１６０）、ＭＴＳＩＬＥＲＥＱＲ（配列番号１６１）、およびＭＴＴＩＬＱＱＲＥＳ（配列番号１６２））、Ｏ．Ｓｉｌｖａ　ｅｔ．ａｌ．，　Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．６，２７１２８に開示されるペプチド（例、ＶＦＱＦＬＧＫＩＩＨＨＶＧＮＦＶＨＧＦＳＨＶＦ（配列番号１６３））、Ａ．Ｆｉｌｏｔｅｏ　ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．２６７（１７），ｐ．１１８００に開示されるペプチド（例、ＫＫＡＶＫＶＰＫＫＥＫＳＶＬＱＧＫＬＴＲＬＡＶＱＩ（配列番号１６４））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
　金属材料としては、例えば、金属および金属化合物が挙げられる。金属としては、例えば、チタン、金、クロム、亜鉛、鉛、マンガン、カルシウム、銅、カルシウム、ゲルマニウム、アルミニウム、ガリウム、カドミウム、鉄、コバルト、銀、プラチナ、パラジウム、ハフニウム、テルルが挙げられる。金属化合物としては、例えば、このような金属の酸化物、硫化物、炭酸化物、砒化物、塩化物、フッ化物およびヨウ化物、ならびに金属間化合物が挙げられる。このような金属材料に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、国際公開第２００５／０１００３１号；国際公開第２０１２／０８６６４７号；Ｋ．Ｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．；Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．；Ｋ．Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，ｖｏｌ．６６．ｐ．１０．；Ｕｍｅｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１－２５７５（２００５）；Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，ｖｏｌ．１５．ｐ．１７７６．；Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．）。したがって、本発明では、このような種々のペプチドを用いることができる。
　好ましくは、金属材料に対する結合能を有するペプチドは、チタンまたはチタン化合物（例、酸化チタン）等のチタン材料に対する結合能を有するペプチド、および金または金化合物等の金材料に対する結合能を有するペプチドであってもよい。チタン材料に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、後述する実施例および国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（例、ＲＫＬＰＤＡ（配列番号１６５））、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｎｏ　Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０－４４に開示されるペプチド（例、ＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬ（配列番号１６６））、Ｉ．Ｉｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００６，ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．５，ｐ．５２８に開示されるペプチド（例、ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号１６７））、ならびに国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（例、ＲＫＬＰＤＡＰＧＭＨＴＷ（配列番号１６８）、およびＲＡＬＰＤＡ（配列番号１６９））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。金材料に対する結合能を有するペプチドとしては、例えば、後述する実施例およびＳ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１９９７，ｖｏｌ．１５，　ｐ．２６９に開示されるペプチド（例、ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳ（配列番号１７０））、Ｊ．Ｋｉｍ　ｅｔ．ａｌ．，Ａｃｔａ　Ｂｉｏｍａｔｅｒ．，２０１０，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．７，ｐ．２６８１に開示されるペプチド（例、ＴＧＴＳＶＬＩＡＴＰＹＶ（配列番号１７１）、およびＴＧＴＳＶＬＩＡＴＰＧＶ（配列番号１７２））、ならびにＫ．Ｎａｍ　ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，ｖｏｌ．３１２，Ｎｏ．５７７５，ｐ．８８５．に開示されるペプチド（例、ＬＫＡＨＬＰＰＳＲＬＰＳ（配列番号１７３））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。　
　シリコン材料としては、例えば、シリコンまたはシリコン化合物が挙げられる。シリコン化合物としては、例えば、シリコンの酸化物（例、一酸化ケイ素（ＳｉＯ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２））、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、シラン（ＳｉＨ４）、シリコーンゴムが挙げられる。このようなシリコン材料に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、国際公開第２００６／１２６５９５号；国際公開第２００６／１２６５９５号；Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｎｏ　Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０－４４）。したがって、本発明では、このような種々のペプチドを用いることができる。　
　好ましくは、シリコン材料に対する結合能を有するペプチドは、シリコンまたはシリコン化合物（例、シリコンの酸化物）に対する結合能を有するペプチドであってもよい。このようなペプチドとしては、例えば、国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（例、ＲＫＬＰＤＡ（配列番号１６５））、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｎｏ　Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０－４４に開示されるペプチド（例、ＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬ（配列番号１７４））、ならびに国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるペプチド（ＭＳＰＨＰＨＰＲＨＨＨＴ（配列番号１７５）、ＴＧＲＲＲＲＬＳＣＲＬＬ（配列番号１７６）、およびＫＰＳＨＨＨＨＨＴＧＡＮ（配列番号１７７））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。　
　炭素材料としては、例えば、カーボンナノ材料（例、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、カーボンナノホン（ＣＮＨ））、フラーレン（Ｃ６０）、グラフェンシート、グラファイトが挙げられる。このような炭素材料に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、特開２００４－１２１１５４号公報；特開２００４－１２１１５４号公報；Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｎｏ　Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０－４４）。したがって、本発明では、このような種々のペプチドを用いることができる。　
　好ましくは、炭素材料に対する結合能を有するペプチドは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）またはカーボンナノホン（ＣＮＨ）等のカーボンナノ材料に対する結合能を有するペプチドであってもよい。このようなペプチドとしては、例えば、後述する実施例および特開２００４－１２１１５４号公報に開示されるペプチド（例、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１７８））、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｎｏ　Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０－４４に開示されるペプチド（ＨＳＳＹＷＹＡＦＮＮＫＴ（配列番号１７９））、ならびに特開２００４－１２１１５４号公報に開示されるペプチド（例、ＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号１８０））、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
　機能性ペプチドとしてプロテアーゼ分解性ペプチドが用いられる場合、プロテアーゼとしては、例えば、カスパーゼやカテプシンなどのシステインプロテアーゼ（Ｄ．　ＭｃＩｌｗａｉｎ１　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ　Ｂｉｏｌ．，２０１３，ｖｏｌ．５，ａ００８６５６、Ｖ．Ｓｔｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．，ＩＵＢＭＢ　Ｌｉｆｅ．２００５，ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．４－５ｐ．３４７）、コラゲナーゼ（Ｇ．Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３，ｐ．６４６）、トロンビンやＸａ因子（Ｒ．Ｊｅｎｎｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１、Ｈ．Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，　２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６）、ウイルス由来プロテアーゼ（Ｃ．Ｂｙｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ．　Ｒｅｓ．，２００６，ｖｏｌ．６７，ｐ．５０１）が挙げられる。　
　プロテアーゼ分解性ペプチドとしては、例えば、Ｅ．Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２０１５，ｖｏｌ．２５，ｐ．１２７９に開示されるペプチド（例、ＧＲＲＧＫＧＧ（配列番号１８１））、Ｇ．Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３，ｐ．６４６に開示されるペプチド（例、ＧＰＬＧＶ（配列番号１８２）、およびＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号１８３））、Ｙ．Ｋａｎｇ　ｅｔ　　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１２，ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１２，ｐ．４０５７に開示されるペプチド（例、ＧＧＬＶＰＲＧＳＧＡＳ（配列番号１８４））、Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，ｖｏｌ．２７２，ｐ．９６７７に開示されるペプチド（例、ＹＥＶＤＧＷ（配列番号１８５）、ＬＥＶＤＧＷ（配列番号１８６）、ＶＤＱＭＤＧＷ（配列番号１８７）、ＶＤＶＡＤＧＷ（配列番号１８８）、ＶＱＶＤＧＷ（配列番号１８９）、およびＶＤＱＶＤＧＷ（配列番号１９０））、Ｊｅｎｎｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１に開示されるペプチド（例、ＥＬＳＬＳＲＬＲＤＳＡ（配列番号１９１）、ＥＬＳＬＳＲＬＲ（配列番号１９２）、ＤＮＹＴＲＬＲＫ（配列番号１９３）、ＹＴＲＬＲＫＱＭ（配列番号１９４）、ＡＰＳＧＲＶＳＭ（配列番号１９５）、ＶＳＭＩＫＮＬＱ（配列番号１９６）、ＲＩＲＰＫＬＫＷ（配列番号１９７）、ＮＦＦＷＫＴＦＴ（配列番号１９８）、ＫＭＹＰＲＧＮＨ（配列番号１９９）、ＱＴＹＰＲＴＮＴ（配列番号２００）、ＧＶＹＡＲＶＴＡ（配列番号２０１）、ＳＧＬＳＲＩＶＮ（配列番号２０２）、ＮＳＲＶＡ（配列番号２０３）、ＱＶＲＬＧ（配列番号２０４）、ＭＫＳＲＮＬ（配列番号２０５）、ＲＣＫＰＶＮ（配列番号２０６）、およびＳＳＫＹＰＮ（配列番号２０７））、Ｈ．Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６に開示されるペプチド（例、ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２０８））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。　
　機能性ペプチドとして安定化ペプチドが用いられる場合、安定化ペプチドとしては、例えば、Ｘ．Ｍｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１１，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，ｐ．９７７に開示されるペプチド（例、ＣＣＡＬＮＮ（配列番号２０９））、ならびにＥ．Ｆａｌｖｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１６，ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２，ｐ．５１４に開示されるペプチド（例、ＰＡＳ（配列番号２１０））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。　
　機能性ペプチドとして細胞透過性ペプチドが用いられる場合、細胞透過性ペプチドとしては、例えば、Ｚ．Ｇｕｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５，ｐ．５２８に開示されるペプチド（例、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２１１）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２１２）、ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（配列番号２１３）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２１４）、ＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号２１５）、ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭ（配列番号２１６）、ＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２１７）、ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号２１８）、ＭＶＲＲＦＬＶＴＬ（配列番号２１９）、ＲＩＲＲＡＣＧＰＰＲＶＲＶ（配列番号２２０）、ＭＶＫＳＫＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶ（配列番号２２１）、ＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰ（配列番号２２２）、ＮＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＱＲ（配列番号２２３）、ＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＱ（配列番号２２４）、ＤＰＫＧＤＰＫＧＶＴＶＴ（配列番号２２５）、ＶＴＶＴＶＴＧＫＧＤＰＫＰＤ（配列番号２２６）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫ（配列番号２２７）、ＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２２８）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧ（配列番号２２９）、ＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２３０）、ＲＬＳＧＭＮＥＶＬＳＦＲＷ（配列番号２３１）、ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ（配列番号２３２）、およびＰＩＥＶＣＭＹＲＥＰ（配列番号２３３））またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
　機能性ペプチドとしては、標的材料に対する結合能を有するペプチドが好ましい。標的材料に対する結合能を有するペプチドの好ましい例は、有機物に対する結合能を有するペプチドである。有機物に対する結合能を有するペプチドとしては、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドが好ましく、タンパク質に対する結合能を有するペプチドがより好ましい。
　フェリチンは、フェリチンをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を用いて、フェリチンを宿主細胞に産生させることで入手することができる。このような宿主細胞としては、例えば、動物、昆虫、魚類、または植物に由来する細胞、および微生物が挙げられる。動物としては、哺乳動物または鳥類（例、ニワトリ）が好ましく、哺乳動物がより好ましい。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役用の哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。
　好ましい実施形態では、宿主細胞は、臨床応用の観点から、ヒト細胞、またはヒトタンパク質の産生に汎用されている細胞（例、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞）であってもよい。
　別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、フェリチンの大量生産等の観点より、微生物であってもよい。微生物としては、例えば、細菌および真菌が挙げられる。細菌としては、宿主細胞として用いられている任意の細菌を使用することができ、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌〔例、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌〔（例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌〔例、シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）〕、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌（例、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ））が挙げられる。真菌としては、宿主細胞として用いられている任意の真菌を使用することができ、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌〔例、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌〔例、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）〕が挙げられる。あるいは、微生物として、糸状菌を用いてもよい。糸状菌としては、例えば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）／タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アルペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、およびハイポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）に属する細菌が挙げられる。
　有機化合物としては、任意の有機化合物を用いることができる。このような有機化合物としては、例えば、低分子化合物、糖化合物、ペプチド化合物、核酸化合物（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸）が挙げられるが、低分子化合物が好ましい。
　本発明では、用語「低分子化合物」とは、分子量１００～１０００の有機化合物をいう。低分子化合物である有機化合物の分子量は、１５０以上、２００以上、２５０以上、または３００以上であってもよい。分子量はまた、９５０以下、９００以下、８５０以下、または８００以下であってもよい。より具体的には、分子量は、１５０～９５０、２００～９００、２５０～８５０、または３００～８００であってもよい。
　低分子化合物としては、例えば、医薬、ビタミン、標識物質、アミノ酸、オリゴペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、脂質、脂肪酸、およびそれらの代謝物が挙げられる。
　特定の実施形態では、本発明で用いられる医薬は、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、または標識物質であってもよい。
　アントラサイクリン系物質としては、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロンが挙げられる。なかでも、ドキソルビシンが好ましい。
　ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬としては、例えば、ファモチジン、シメチジン、ラニチジン、ニザチジン、ロキサチジンアセテート、ラフチジンが挙げられる。なかでも、ファモチジンが好ましい。
　ピグアナイド系物質としては、例えば、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン、プログアニル、クロロプログアニル、クロルヘキシジン、アレキシジンが挙げられる。なかでも、メトホルミンが好ましい。
　ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬としては、例えば、ミノキシジル、ニコランジル、ピナシジル、ジアゾキシド、クロマカリム、レブクロマカリム、レマカリムが挙げられる。なかでも、ミノキシジルが好ましい。
　β２アドレナリン受容体作動薬としては、例えば、テルブタリン、サルブタモール、レボサルブタモール、ピルブテロール、プロカテロール、メタプロテレノール、フェノテロール、ビトルテロール、サルメテロール、フォルモテロール、ビランテロール、バンブテロール、クレンブテロール、インダカテロールが挙げられる。なかでも、テルブタリンが好ましい。
　イミダゾリン系物質としては、例えば、クレアチニン、オキシメタゾリン、クロニジン、シベンゾリン、チザニジン、テトラヒドロゾリン、ナファゾリン、フェントラミン、ブリモニジン、モクソニジンが挙げられる。なかでも、クレアチニンが好ましい。
　ビタミンとしては、例えば、ビタミンＢ１（例、チアミン）、ビタミンＢ２（例、リボフラビン）、ビタミンＢ３（例、ナイアシン、ニコチンアミド）、ビタミンＢ５（例、パントテン酸）、ビタミンＢ６（例、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキシン）、ビタミンＢ７（例、ビオチン）、ビタミンＢ９（例、葉酸）、ビタミンＢ１２（例、シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン）、ビタミンＣ（例、アスコルビン酸）、ビタミンＡ（例、レチノール、β－カロテン、α－カロテン、β－クリプトキサンチン）、ビタミンＤ（例、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（例、トコフェロール、トコトリエノール）、ビタミンＫ（例、フィロキノン、メナキノン）が挙げられる。なかでも、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３が好ましい。
　標識物質としては、例えば、ローダミン（例、ローダミンＢ、６Ｇ、６ＧＰ、３ＧＯ、１２３）、ウラニン等の蛍光物質、コンゴレッド等の色素および染料、ならびに発光物質が挙げられる。なかでも、ローダミンＢ、ウラニン、またはコンゴレッドが好ましい。
　アミノ酸としては、例えば、α－アミノ酸（例、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、グリシン）、β－アミノ酸（例、β－アラニン、パントテン酸）、γ－アミノ酸（例、γ－アミノ酪酸）が挙げられる。アミノ酸は、Ｌ体であってもＤ体であってもよい。
　有機化合物のｐＫａは、２以上１３以下であってもよい。有機化合物のｐＫａが２以上１３以下である場合、当該ｐＫａに応じた適切なｐＨを有する緩衝液を使用することで、フェリチンに有機化合物をより効率的に封入することができる。より具体的には、有機化合物のｐＫａが２以上７未満（好ましくは３以上６未満）の場合、緩衝液は、３以上７未満（好ましくは３以上６未満）のｐＨを有することが好ましい。また、有機化合物のｐＫａが７以上１３以下の場合、緩衝液は、６以上１３未満（好ましくは６以上１２未満、より好ましくは６以上１１未満、さらにより好ましくは６以上１０未満）のｐＨを有することが好ましい。
　有機化合物のｐＫａは、中和滴定法により求めることができる（化学便覧　基礎編　Ｉ、ＩＩ（改訂４版）、日本化学会編、丸善、１９９３）。中和滴定法では、各分子の０．１モル／Ｌ溶液を調製し、２５℃でその溶液に０．１モル／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液または塩酸水溶液を滴定し、ｐＨを測定することで計算することができる。有機化合物が単一のｐＫａ値を有する場合、その値を有機化合物のｐＫａとして採用される。一方、有機化合物が複数（例えば２～６、好ましくは２～５、より好ましくは２～４、さらにより好ましくは２または３）のｐＫａ値を有する場合、それらの平均値が有機化合物のｐＫａとして採用される。
　好ましくは、有機化合物は、正の荷電部分および／または正に荷電し得る部分を有していてもよい。
　一実施形態では、有機化合物は、正の荷電部分を有する。正の荷電部分とは、固体の状態で正に荷電している基を意味する。正の荷電部分としては、例えば、カチオン性窒素含有基、およびカチオン性リン含有基が挙げられる。
　カチオン性窒素含有基とは、正に荷電した窒素原子を有する基を意味する。カチオン性窒素含有基としては、例えば、アンモニウム基（例、第一級、第二級、第三級または第四級）、グアニジウム基、イミダゾリウム基、オキサゾリウム基、チアゾリウム基、オキサジアゾリウム基、トリアゾリウム基、ピロリジニウム基、ピリジニウム基、ピペリジニウム基、ピラゾリウム基、ピリミジニウム基、ピラジニウム基、およびトリアジニウム基が挙げられる。
　カチオン性リン含有基とは、正に荷電したリン原子を有する基を意味する。カチオン性リン含有基としては、例えばホスホニウム基（例、第一級、第二級、第三級または第四級）が挙げられる。
　別の実施形態では、有機化合物は、正に荷電し得る部分を有する。正に荷電し得る部分とは、固体の状態では正に荷電していないものの、水溶液中に溶解した状態では水素原子アクセプターとして作用して、水溶液のｐＨに依存して正に荷電することができる基を意味する。正に荷電し得る部分としては、例えば、正に荷電し得る窒素含有基、および正に荷電し得るリン含有基が挙げられる。正に荷電し得る窒素含有基としては、例えば、アミノ基（例、第一級、第二級、または第三級）、グアニジノ基、ニトロ基、アミド基、ヒドラジド基、イミド基、アジド基、ジアゾ基が挙げられる。正に荷電し得るリン含有基としては、例えば、ホスフィノ基（例、第一級、第二級、または第三級）が挙げられる。
　有機化合物は、正の荷電部分または正に荷電し得る部分に加えて、負の荷電部分（例、アミンオキシドにおけるオキシド基）または負に荷電し得る部分（例、硫酸基）を有していてもよい。有機化合物が、正の荷電部分または正に荷電し得る部分に加えて、負の荷電部分または負に荷電し得る部分を有する場合、正の荷電部分および／または正に荷電し得る部分の総数が、負の荷電部分および／または負に荷電し得る部分の総数に比し多いこと（すなわち、全体として正の電荷を帯びているか、または溶液の所望のｐＨ条件によって全体として正の電荷を帯び易くなっていること）が好ましい。
　特定の実施形態では、有機化合物のｐＫａとｐＨは、相関式：ｐＨ＝２．６＋０．６ｐＫａ±０．４ｐＫａの範囲内であってもよい（図１１）。変動係数は、好ましくは０．３である。
　別の特定の実施形態では、有機化合物は、６以上９以下のｐＫａを有していてもよい。この場合、有機化合物封入フェリチンの製造方法に用いた緩衝液（例、ｐＨ６以上９以下）をそのまま保存に用いることで、有機化合物封入フェリチンの製造後に有機化合物封入フェリチンを安定的に保存することができる。したがって、本発明では、６以上９以下のｐＫａを有する有機化合物を好適に使用することができる。
　本発明の方法では、先ず、緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合することにより、有機化合物およびフェリチンの混合物が得られる。混合は、任意の様式により行うことができる。例えば、フェリチン含有緩衝液中に有機化合物を溶解してもよく、または有機化合物含有緩衝液中に有機化合物を溶解してもよく、あるいは、有機化合物含有緩衝液をフェリチン含有緩衝液と合わせることにより行われてもよい。混合におけるフェリチンに対する有機化合物の重量比（有機化合物／フェリチン）は、フェリチンに有機化合物を封入できる限り特に限定されないが、例えば、０．０５～０．４５であってもよい。フェリチンに有機化合物を効率的に封入する観点から、このような重量比は、例えば、０．２０以上０．３６以下であってもよい。
　本発明で用いられる緩衝液は、３以上１３未満のｐＨを有する。このような範囲のｐＨであれば、フェリチン構造の破壊（脱会合および変性）を防ぐことができる。緩衝液のｐＨは、有機化合物のｐＫａ等の因子に応じて、４以上、５以上、６以上、または７以上であってもよい。緩衝液のｐＨはまた、有機化合物のｐＫａ等の因子に応じて、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、または７未満であってもよい。緩衝液のｐＨは、ガラス電極法により２５℃で測定される値を用いることができる。
　緩衝液としては、目的のｐＨに応じて適切なものを選択することができる。目的のｐＨが３以上７未満である場合に好適に使用できる緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フタル酸緩衝液、グリシン塩酸塩緩衝液、ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液、ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液、ビストリス塩酸塩緩衝液が挙げられる。目的のｐＨが６以上１３未満である場合に好適に使用できる緩衝液としては、例えば、トリス塩酸塩緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液、ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液、グリシン－ＮａＯＨ緩衝液、ＣＡＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液、塩化カリウム－水酸化ナトリウム緩衝液が挙げられる。
　特定の実施形態では、緩衝液のｐＨは、６以上９以下であってもよい。この場合、有機化合物封入フェリチンの製造方法に用いた緩衝液をそのまま保存に用いることで、有機化合物封入フェリチンの製造後に有機化合物封入フェリチンを安定的に保存することができる。したがって、本発明では、６以上９以下のｐＨを有する緩衝液を好適に使用することができる。
　本発明の方法では、次いで、緩衝液中で上記混合物がインキュベートされる。インキュベートは、任意の様式により行うことができる。例えば、インキュベートは、緩衝液中で上記混合物を静置または撹拌することにより、行われる。インキュベートの温度は、有機化合物をフェリチンに封入できる限り特に限定されず、例えば１０℃以上６０℃以下である。インキュベートの温度は、１５℃以上、または２０℃以上であってもよい。インキュベートの温度はまた、５５℃以下、または５０℃以下であってもよい。
　混合およびインキュベートの合計時間は、有機化合物をフェリチンに封入できる限り特に限定されず、例えば、５分以上、１０分以上、１５分以上、または２０以上であってもよい。好ましくは、有機化合物をフェリチンに十分に封入する観点からは、混合およびインキュベートの合計時間は、３０分以上であってもよい。
　本発明において、フェリチン１分子に封入される有機化合物の数は特に限定されないが、例えば、１０分子以上２００分子以下の有機化合物をフェリチン１分子に封入することができる。フェリチン１分子に封入される有機化合物の数は、好ましくは２０分子以上、より好ましくは３０分子以上、さらにより好ましくは４０分子以上、なおさらにより好ましくは５０分子以上、特に好ましくは６０分子以上、７０分子以上、８０分子以上、９０分子以上、１００分子以上、１１０分子以上、１２０分子以上、１３０分子以上、１４０分子以上、または１５０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入される有機化合物の数はまた、好ましくは１９０分子以下、より好ましくは１８０分子以下、さらにより好ましくは１７０分子以下、なおさらにより好ましくは１６０分子以下、特に好ましくは１５０分子以下、１４０分子以下、１３０分子以下、１２０分子以下、１１０分子以下、１００分子以下、９０分子以下、８０分子以下、７０分子以下、６０分子以下、５０分子以下、４０分子以下、３０分子以下、２０分子以下または１５分子以下であってもよい。
　特定の実施形態では、有機化合物がアントラサイクリン系物質である場合、フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、フェリチンが（ａ）天然フェリチン単量体から構成される天然フェリチン、または（ｂ）遺伝子組換えフェリチン単量体から構成される遺伝子組換えフェリチンである場合に応じて変動してもよい。
　例えば、有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンである場合、天然フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、４０分子以上２００分子以下であってもよい。天然フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、好ましくは５０分子以上、より好ましくは６０分子以上、さらにより好ましくは７０分子以上、なおさらにより好ましくは８０分子以上、特に好ましくは９０分子以上であってもよい。天然フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数はまた、好ましくは１７０分子以下、より好ましくは１４０分子以下であってもよい。
　一方、有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが遺伝子組換えフェリチンである場合、遺伝子組換えフェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、１００分子以上２００分子以下であってもよい。遺伝子組換えフェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、好ましくは１１０分子以上、より好ましくは１２０分子以上、さらにより好ましくは１３０分子以上、なおさらにより好ましくは１４０分子以上、特に好ましくは１５０分子以上であってもよい。遺伝子組換えフェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数はまた、好ましくは１９０分子以下、より好ましくは１８０分子以下であってもよい。
　あるいは、有機化合物がアントラサイクリン系物質である場合、フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、（ａ）天然フェリチン、または（ｂ）遺伝子組換えフェリチンの別によらず、規定することもできる。このような場合、フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、１００分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数は、好ましくは１１０分子以上、より好ましくは１２０分子以上、さらにより好ましくは１３０分子以上、なおさらにより好ましくは１４０分子以上、特に好ましくは１５０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるアントラサイクリン系物質の数はまた、好ましくは１９０分子以下、より好ましくは１８０分子以下であってもよい。
　特定の実施形態では、有機化合物がヒスタミンＨ２受容体拮抗薬である場合、フェリチン１分子に封入されるヒスタミンＨ２受容体拮抗薬の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるヒスタミンＨ２受容体拮抗薬の数は、好ましくは２０分子以上、より好ましくは３０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるヒスタミンＨ２受容体拮抗薬の数はまた、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下、さらにより好ましくは５０分子以下であってもよい。
　特定の実施形態では、有機化合物がピグアナイド系物質である場合、フェリチン１分子に封入されるピグアナイド系物質の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるピグアナイド系物質の数は、好ましくは２０分子以上、より好ましくは３０分子以上、さらにより好ましくは４０分子以上、なおさらにより好ましくは５０分子以上、特に好ましくは６０分子以上、または７０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるピグアナイド系物質の数はまた、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下であってもよい。
　特定の実施形態では、有機化合物がＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬である場合、フェリチン１分子に封入されるＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬の数は、好ましくは２０分子以上、より好ましくは３０分子以上、さらにより好ましくは４０分子以上、なおさらにより好ましくは５０分子以上、特に好ましくは６０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬の数はまた、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下であってもよい。
　特定の実施形態では、有機化合物がβ２アドレナリン受容体作動薬である場合、フェリチン１分子に封入されるβ２アドレナリン受容体作動薬の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるβ２アドレナリン受容体作動薬の数は、好ましくは２０分子以上、より好ましくは３０分子以上、さらにより好ましくは４０分子以上、なおさらにより好ましくは５０分子以上、特に好ましくは６０分子以上、７０分子以上、８０分子以上、９０分子以上、１００分子以上、１１０分子以上、または１２０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるβ２アドレナリン受容体作動薬の数はまた、好ましくは１５０分子以下であってもよい。
　特定の実施形態では、有機化合物がイミダゾリン系物質である場合、フェリチン１分子に封入されるイミダゾリン系物質の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるイミダゾリン系物質の数は、好ましくは１５分子以上、より好ましくは２０分子以上であってもよい。フェリチン１分子に封入されるイミダゾリン系物質の数はまた、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下、さらにより好ましくは５０分子以下であってもよい。
　特定の実施形態では、有機化合物がビタミンである場合、フェリチン１分子に封入されるビタミンの数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入されるビタミンの数は、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下、さらにより好ましくは５０分子以下、なおさらにより好ましくは３０分子以下、特に好ましくは２０分子以下であってもよい。
　特定の実施形態では、有機化合物が標識物質である場合、フェリチン１分子に封入される標識物質の数は、１０分子以上２００分子以下であってもよい。フェリチン１分子に封入される標識物質の数は、好ましくは１５０分子以下、より好ましくは１００分子以下、さらにより好ましくは５０分子以下、なおさらにより好ましくは３０分子以下、特に好ましくは２０分子以下であってもよい。
　フェリチンへの有機化合物の封入の確認は、フェリチンおよび有機化合物の吸収ピークの測定により行うことができる。
　フェリチンおよび有機化合物の吸収ピークの測定について説明する。先ず、インキュベート後の緩衝液中のフェリチンをゲル濾過カラムにより精製する。次いで、精製後の溶出液についてフェリチンの吸収ピーク（２８０ｎｍの吸光度）および有機化合物の吸収ピーク（例えば、ドキソルビシンであれば４８０ｎｍの吸光度）を同時計測する。このとき、双方の吸収ピークの溶出位置が一致するのであれば、有機化合物がフェリチンに封入されていると判別することができる。本発明の方法によれば、有機化合物がフェリチンの表面に吸着されるのではなく、フェリチンの内腔に再現良く封入されることが確認されているので、吸収ピークの溶出位置の一致により有機化合物がフェリチンに封入されていると考えることができる。
　フェリチンへの有機化合物の封入の確認では、他の方法が併用されてもよい。このような他の方法としては、例えば、フェリチンの表面電荷および／またはサイズの測定が挙げられる。
　フェリチンの表面電荷の測定について説明する。インキュベート後の緩衝液中のフェリチンの表面電荷（ゼータ電位）が、有機化合物の封入処理がされていないフェリチンの表面電荷と同等であれば、有機化合物がフェリチンの表面に吸着することで複合化しているわけではない（すなわち、有機化合物がフェリチンに封入されている）と判別することができる。表面電荷の測定は、電気泳動光散乱法により行うことができる。好ましくは、電気泳動光散乱法による測定は、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）を用いて行うことができる。フェリチンの表面電荷の測定が好適に利用される有機化合物のｐＫａは、例えば、１～４（好ましくは１～３）、および６～１４（好ましくは７～１４）である。本発明では、このようなｐＫａ値を有する有機化合物を使用することもまた好ましい。
　フェリチンのサイズの測定について説明する。この場合、インキュベート後の緩衝液中のフェリチンのサイズが、有機化合物の封入処理がされていないフェリチンのサイズ（外径　約１２ｎｍ）と同等であることがさらに確認されてもよい。サイズの同等性は、動的光散乱法により行うことができる。好ましくは、動的光散乱法による測定は、ゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）を用いて行うことができる。
　フェリチンへの有機化合物への封入分子数は、以下のように決定することができる。（１）インキュベート後の緩衝液中のフェリチンおよび有機化合物を分離する（例、脱塩カラムの使用）。（２）フェリチンを脱会合させ（例、ｐＨ２．３に調整）、フェリチン中の有機化合物を溶液中に放出させる。（３）溶液中の有機化合物の濃度（重量／体積）を、吸光度に基づき検量線により決定する。（４）溶液中のフェリチンの濃度（重量／体積）を、標準的なタンパク質定量法（例、ウシアルブミンを標準とするプロテインアッセイＣＢＢ溶液の使用）により決定する。（５）フェリチンへの有機化合物の導入率（有機化合物とフェリチンの総重量に占める有機化合物の重量）を求める。（６）有機化合物の分子量を用いて、溶液中の有機化合物の濃度（重量／体積）から溶液中の有機化合物の濃度（モル／体積）を決定する。（７）フェリチンの分子量を用いて、溶液中のフェリチンの濃度（重量／体積）から溶液中のフェリチンの濃度（モル／体積）を決定する。（８）フェリチンへの有機化合物の導入数（フェリチンの１モルに占める有機化合物のモル数）を求める。
　本発明はまた、特定の有機化合物封入フェリチンを提供する。本発明の有機化合物封入フェリチンでは、有機化合物は、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、および標識物質からなる群より選ばれ、
　フェリチン１分子への有機化合物の封入分子数が以下である：
（１）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンである場合、４０分子以上２００分子以下；
（２）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが遺伝子組換えフェリチンである場合、１００分子以上２００分子以下；または
（３）有機化合物がヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、または標識物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンまたは遺伝子組換えフェリチンである場合、１０分子以上２００分子以下。
　好ましくは、本発明の有機化合物封入フェリチンでは、有機化合物は、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、およびβ２アドレナリン受容体作動薬からなる群より選択されてもよい。
　本発明の有機化合物封入フェリチンにおける特定の有機化合物、フェリチン、および封入分子数等の構成要素の詳細は、上記のとおりである。
　本発明はさらに、有機化合物封入フェリチンを含む緩衝液を提供する。本発明の緩衝液における有機化合物、フェリチン、緩衝液、および封入分子数等の構成要素の詳細は、上記のとおりである。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下で用いた薬剤（低分子）は全て有機化合物である。また、緩衝液のｐＨは、ガラス電極法により２５℃で測定される値を用いた。
＜実施例１：フェリチンの調製＞
　ヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ（配列番号１））単量体をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ－３’（配列番号３）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣ－３’（配列番号４）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号５）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＨ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨ）を構築した。
　続いて、構築したｐＥＴ２０－ＦＴＨを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ　Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ　Ｑ　ＨＰカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、ＦＴＨ単量体から構成されるフェリチン（以下、ＦＴＨフェリチンと略記する）を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　２６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００　ＨＲカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＴＨフェリチンを分離精製した。そのＦＴＨフェリチンを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む溶液１ｍｌを得ることができた。
＜実施例２：ｐＨ条件の検討＞
　脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、ｐＨ条件の検討を行った。
　５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ３から９）　０．１ｍｌ中に、ＦＴＨフェリチンおよびＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＸ、ＣＡＳ　Ｎｏ．２５３１６－４０－９、分子量５７９．９８）の終濃度が各々１ｍｇ／ｍｌと０．１ｍｇ／ｍｌとなるように混合し、各々２５℃で６０分間放置した。この反応において、ｐＨ３、４、５および６では酢酸緩衝液、ｐＨ７、８および９ではトリス塩酸塩緩衝液を用いた。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮し、分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光を測定した。得られた吸光度から、各種濃度のＤＯＸやＦＴＨフェリチンの２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光度から作成された検量線にてＤＯＸとＦＴＨフェリチンの濃度を決定した。その濃度を元に、薬剤導入率（ＤＯＸとＦＴＨフェリチンの総重量に占めるＤＯＸの重量）を求めた。
　その結果、ｐＨ６以下では、薬剤導入率０．５％（ｗｔ）以下であり、ＤＯＸが若干取り込まれていることが示唆された（図１）。一方、ｐＨ７以上では、ｐＨの上昇と共に、薬剤導入率が上昇し、ｐＨ９では薬剤導入率１％（ｗｔ）以上であった。以上のことから、ｐＨ７以上でＦＴＨフェリチン内にＤＯＸが導入されている可能性が示唆された。
＜実施例３：温度条件の検討＞
　脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、温度条件の検討を行った。
　５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９）　０．１ｍｌ中に、ＦＴＨフェリチンおよびＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＸ、ｃａｓ番号２５３１６－４０－９、分子量５７９．９８）の終濃度が各々１ｍｇ／ｍｌと０．１ｍｇ／ｍｌとなるように混合し、１０℃から６０℃で各々６０分間放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮し、分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光を測定した。得られた吸光度から、各種濃度のＤＯＸやＦＴＨフェリチンの２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光度から作成された検量線にてＤＯＸとＦＴＨフェリチンの濃度を決定した。その濃度を元に、薬剤導入率（ＤＯＸとＦＴＨフェリチンの総重量に占めるＤＯＸの重量）を求めた。
　その結果、２０℃以上では、反応温度の上昇と共に薬剤導入率が上昇し、６０℃では薬剤導入率５％（ｗｔ）以上であった（図２）。このことから、室温以上で効率的にＦＴＨフェリチン内にＤＯＸが導入されていることが示唆された。
＜実施例４：反応時間の検討＞
　脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、反応時間条件の検討を行った。
　５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９）　０．５ｍｌ中に、ＦＴＨフェリチンおよびＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＸ、ｃａｓ番号２５３１６－４０－９、分子量５７９．９８）の終濃度が各々１ｍｇ／ｍｌと０．１ｍｇ／ｍｌとなるように混合し、６０℃で５分間から６０分間放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮した。その溶液に終濃度１００ｍＭとなるようにグリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）を添加し、容量０．２ｍｌに調整した。ここで、ｐＨ２．３にすることで、ＦＴＨフェリチンは脱会合し、ＦＴＨフェリチン内に取り込まれたＤＯＸは、溶液中に放出される。その溶液を、分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて４８０ｎｍの吸光を測定し、ＤＯＸの濃度を決定した。また、溶液中のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。その濃度を元に、薬剤導入率（ＤＯＸとＦＴＨフェリチンの総重量に占めるＤＯＸの重量）を求めた。
　その結果、放置時間３０分までは、放置時間と共にＤＯＸ取り込み量の上昇が確認され、フェリチン１ｇあたり１．７ｍｇ－ＤＯＸ／分の速度でＤＯＸが取り込まれていた（図３）。また、３０分以降は薬剤導入率に大きな変化は確認されなかった。この時の最大薬剤導入率は５％（ｗｔ）で、ＦＴＨフェリチン１個当たりに取り込まれたＤＯＸの分子数は平均５０個と推定された。
＜実施例５：反応液中のＦＴＨフェリチンとＤＯＸ量比の検討＞
　脱会合・再会合プロセス経ずにＦＴＨフェリチン内に低分子を導入する方法（ワンステッププロセス）を確立すべく、量比条件の検討を行った。
　終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９）　０．５ｍｌ中に、終濃度が０．０５ｍｇ／ｌから０．５ｍｇ／ｌとなるようにＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＸ、ｃａｓ番号２５３１６－４０－９、分子量５７９．９８）を混合し、６０℃で６０分間放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮した。その溶液に終濃度１００ｍＭとなるようにグリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）を添加し、容量０．５ｍｌに調整した。その溶液を、分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて４８０ｎｍの吸光を測定し、ＤＯＸの濃度を決定した。また、溶液中のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。その濃度を元に、薬剤導入率（ＤＯＸとＦＴＨフェリチンの総重量に占めるＤＯＸの重量）を求めた。
　その結果、ＦＴＨフェリチンとＤＯＸの濃度比が１０：３までは、濃度比と共にＤＯＸ取り込み量の上昇が確認され、最大で薬剤導入率１６％（ｗｔ）となっていた（図４）。この時のＦＴＨフェリチン１個当たりに取り込まれたＤＯＸの平均分子数は１６５個と推定された。一方、ＦＴＨフェリチンとＤＯＸの濃度比が１０：４では取り込み量が低下し、１０：５ではタンパク質を回収できなかった。これは、高濃度域でＤＯＸが析出し、そのＤＯＸ沈殿と共にＦＴＨフェリチンも沈殿したためと考えられた。
　このとき、先行知見（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　１９６　（２０１４）　１８４－１９６、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　２０１４　１１１（４１）：１４９００－５）で報告されたデータから計算されていた従来法でのフェリチン内への薬剤導入率は３％（ｗｔ）から４％（ｗｔ）であり、今回の手法は従来法より４倍から５倍以上の多くの薬剤が導入できていた。また、既に販売されているドキソルビジン封入リポソームであるドキシル（承認番号：２１９００ＡＭＸ００００１０００）の薬剤導入率は１１％（ｗｔ）であり、今回の手法はドキシルよりも１．４倍以上多くの薬剤が導入できていた。
＜実施例６：ＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンの分散性＞
　ワンステッププロセスで得られた低分子封入ＦＴＨフェリチンが実際に低分子を封入していることを確認した。
　終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９）１ｍｌ中に、終濃度が０．１ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、６０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮した。同様に調製された５ｍｌ分のＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）を混合し、さらに限外ろ過により容量１ｍｌとし、その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　２６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００　ＨＲカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって分離精製しながら、２８０ｎｍの吸光と４８０ｎｍの吸光を同時計測した。
　その結果、ＤＯＸを含有しないＦＴＨフェリチンと同じ溶出位置にＤＯＸ由来と推定される４８０ｎｍの吸光ピークが観察され、ＤＯＸとＦＴＨフェリチンは、限外ろ過による希釈洗浄やゲルろ過カラムでは分離できないほど、強固に複合化していることが分かった（図５）。
　このＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体の溶液分散性はゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）でも測定されたことから、このＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体は、野生型ＦＴＨフェリチンと同等の直径１２ｎｍの水溶液分散性ナノ粒子であることが確認できた（図６）。この測定は、ＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体をＦＴＨフェリチン量として１ｍｇ/ｍｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌをＺＥＮ００４０セルに入れ、Ｍａｔｅｒｉａｌ設定（ＲＩ：１．４５０、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：０．００１）、Ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ設定（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５℃、Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ：０．８８７２ｃＰ、ＲＩ：１．３３０、Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｃｏｎｓｔａｎｔ：７８．５）、Ｍａｒｋ－Ｈｏｕｗｉｎｋ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ａ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒ：０．４２８、Ｋ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒ：７．６７×１０－５ｃｍ２／ｓ）、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ａｎｇｌｅは１７３°Ｂａｃｋｓｃａｔｔｅｒにて２５℃で行われた。
＜実施例７：ＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンの表面電荷＞
　ワンステッププロセスで得られた低分子薬剤封入ＦＴＨフェリチンによる低分子薬剤の封入を、表面電荷の評価により確認した。
　終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌ中に、終濃度が０．３ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、４０℃で６０分間放置した。放置および遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、１ｍｌの水に懸濁したＤＯＸとＦＴＨフェリチンの複合体を得た。
　続いて、そのＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体を終濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３、６あるいは７）、酢酸緩衝液（（ｐＨ４あるいは５）、トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８あるいは９）、あるいは炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０））に各々ＦＴＨフェリチン量として終濃度０．１ｇ／ｌとなるように懸濁し、その緩衝液中、２５℃での表面電荷をゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）にて測定した。測定は、サンプル７５０μｌをＤＴＳ１０７０セルに入れ、Ｍａｔｅｒｉａｌ設定（ＲＩ：１．４５０、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：０．００１）、Ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ設定（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５℃、Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ：０．８８７２ｃＰ、ＲＩ：１．３３０、Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｃｏｎｓｔａｎｔ：７８．５）、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ　ｍｏｄｅｌ（Ｆκａ　ｖａｌｕｅ：１．５０）にて行われた。その結果、ＤＯＸ封入処理されていないＦＴＨフェリチンとＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体の表面電荷は同等であり、ＦＴＨフェリチン表面にＤＯＸが吸着することで複合化しているわけではないことが分かった（図７）。
　すなわち、ＤＯＸとＦＴＨフェリチンを水溶液中で放置してワンステップで得られたこのＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体の表面電荷はＦＴＨフェリチンと同等であり、ＦＴＨフェリチン表面に塩基性のＤＯＸが吸着しているのではなく、ＦＴＨフェリチンの内部にＤＯＸが封入されている構造をとっていると考えられた。
＜実施例８：ＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンの安定性評価＞
　ワンステッププロセスで得られた低分子薬剤封入ＦＴＨフェリチンの安定性を評価した。
　終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌ中に、終濃度が０．３ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、４０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、１ｍｌの水に懸濁したＤＯＸとＦＴＨフェリチンの複合体を得た。そして、その含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。
　そのＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体を含有タンパク質濃度として終濃度１．５ｇ／ｌとなるように、終濃度５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）、５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９）、あるいはＤ－ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４、富士フイルム和光純薬株式会社製）に各々懸濁し、各０．１ｍｌを冷暗所（４℃）で保管した。その後、数日おきに各条件のサンプルを３本ずつ回収し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　５００－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）でＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体と緩衝液を分離した。各々４８０ｎｍの吸光度を分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて測定し、緩衝液中に流出せずに、ＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体に維持されているＤＯＸの量を定量した。
　その結果、２週間以上放置した後も、ｐＨ６からｐＨ９の緩衝液中で保管されたＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体からはほとんどＤＯＸが流出していないことが分かった（図８、平均値±標準偏差）。一方、ｐＨ４では放置直後、３０％（ｗｔ）程度のＤＯＸが流出するものの、その後の流出は緩やかであった。すなわち、ＤＯＸ－ＦＴＨフェリチン複合体は、適切なｐＨ条件下では、安定的に維持されることが分かった。
＜実施例９：ＦＴＨフェリチン中のＤＯＸ状態の推定＞
　フェリチンは直径１２ｎｍのかご状をしており、その内部空腔の直径は７ｎｍである。理想的には、内腔の容積は０．１８ｚｌ（ｚｌ：Ｚｅｐｔｏ　ｌｉｔｔｌｅ、１０の－２１乗リットル）である。もしも１分子のＤＯＸ（分子量５７９．９８）がフェリチンの内腔に存在した場合、ＤＯＸのフェリチン内腔での濃度は５．４ｇ／ｌとなる。ＤＯＸの室温での水への溶解性は６０ｇ／ｌ以上であることが確認できている。今回、最大でＦＴＨフェリチン１個当たり１６５個のＤＯＸ分子が導入されており、その時のＤＯＸのフェリチン内腔での濃度は８９０ｇ／ｌとなる。この濃度は室温でのＤＯＸの水溶解度を大きく上回り、フェリチン内腔で析出、ナノ粒子を形成している可能性が高い。そのため、フェリチンに取り込まれたＤＯＸの定量には一度フェリチンを脱会合し、ＤＯＸを放出させた後に、分光評価する必要がある。
＜実施例１０：ワンステッププロセスと脱会合・再会合プロセスの比較（１）＞
　ワンステッププロセスと脱会合・再会合プロセスで各々得られるＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンのＤＯＸ封入量を比較した。
　脱会合・再会合プロセスでは、終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンと終濃度０．２ｍｇ／ｌのＤＯＸを含む５０ｍＭ　グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）　０．５ｍｌを、室温で５分間から１２０分間放置した。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）１０μｌを加え中和し、５分間から１２０分間室温で放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮し、分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光を測定した。得られた吸光度から、各種濃度のＤＯＸやＦＴＨフェリチンの２８０ｎｍおよび４８０ｎｍの吸光度から作成された検量線にてＤＯＸとＦＴＨフェリチンの濃度を決定した。その濃度を元に、薬剤導入率（ＤＯＸとＦＴＨフェリチンの総重量に占めるＤＯＸの重量）を求めた。
　その結果、１５分放置されたＦＴＨフェリチンで最も高い薬剤導入率が確認されたが、２％（ｗｔ）程度であった（図９）。一方、終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンと終濃度０．２ｍｇ／ｌのＤＯＸを用いたワンステッププロセスで得られるＤＯＸ封入ＦＴＨフェリチンの薬剤導入率はその５倍高かった（図４）。したがって、ワンステッププロセスにより、より高い薬剤封入率を持つＦＴＨフェリチンを得られることが分かった。
＜実施例１１：ワンステッププロセスと脱会合・再会合プロセスの比較（２）＞
　ワンステッププロセスと脱会合・再会合プロセスで各々得られるＦＴＨフェリチンの回収率を比較した。
　ワンステッププロセスでは、１０ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９）　０．１ｍｌを、６０℃で６０分間放置した。その後、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）２．９ｍｌを加え、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　１６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００　ＨＲカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって分離精製しながら、２８０ｎｍの吸光を計測した。
　脱会合・再会合プロセスでは、１０ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む５０ｍＭ　グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）　０．１ｍｌを、室温で１５分間放置することでＦＴＨフェリチンを単量体に脱会合させた。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）１０μｌを加え中和し、１５分間室温放置することでＦＴＨフェリチンを再会合させた。その後、１０ｍＭのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）２．９ｍｌを加え、１０ｍＭのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　１６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００　ＨＲカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって分離精製しながら、２８０ｎｍの吸光を計測した。
　また、対照として、６０℃放置や脱会合・再会合処理を行っていない等量のＦＴＨフェリチンも１０ｍＭのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　１６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００　ＨＲカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって分離精製しながら、２８０ｎｍの吸光を計測した。
　その結果、６０℃で６０分間放置されるワンステッププロセスで得られたＦＴＨフェリチンの回収率は未処理ＦＴＨフェリチンの９７％であった。一方、脱会合・再会合プロセスで得られたＦＴＨフェリチンの回収率は未処理ＦＴＨフェリチンの７２％であり、再会合できなかったＦＴＨフェリチン単量体も溶出後半に確認できた。
　以上のことから、ＦＴＨフェリチンの超分子構造を積極的に壊さないワンステッププロセスは、ＦＴＨフェリチンの超分子構造を一度壊してしまう脱会合・再会合プロセスと比較して、格段に処理後回収されるＦＴＨフェリチン量が多く、効率的な手法であることが分かった（図１０）。
＜実施例１２：ワンステッププロセスによる低分子薬剤導入（１）＞
　ワンステッププロセスで各種の低分子をＦＴＨフェリチン内に導入した。
　今回導入された低分子薬剤を表１に示す。終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む終濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３、６あるいは７）、酢酸緩衝液（ｐＨ４あるいは５）、トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８あるいは９）、あるいは炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）に、終濃度が０．２ｍＭから５ｍＭとなるように各種低分子薬剤を混合し、２０℃から６０℃で６０分間各々放置した。全ての反応は容量０．１ｍｌで反応させた。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）し、上清を１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供することで、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮した。
　また、対照として、表１に示す一部の低分子薬剤の脱会合・再会合プロセスでのフェリチン内への導入も行った。すなわち、終濃度１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンと終濃度０．２ｍｇ／ｌの各種低分子薬剤を各々含む５０ｍＭ　グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）　０．５ｍｌを、室温で１５分間放置した。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）１０μｌを加え中和し、１５分間室温で放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　それら溶液の吸光度を分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて測定すると共に、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　ＢとＣｏｎｇｏ　Ｒｅｄは２８０ｎｍと４８０ｎｍの吸光度、Ｆａｍｏｔｉｄｉｎｅ、Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ、Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ、Ｔｅｒｂｕｔａｌｉｎｅ、Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ、ＲｉｂｏｆｌａｖｉｎおよびＴｈｉａｍｉｎｅは２５０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定した。その後、プロテインアッセイＣＢＢ溶液にて定量されたタンパク質含有量から推定されるタンパク質由来の吸光度で補正した後、各分子の吸光度から作成された検量線にて低分子薬剤の濃度を決定した。
　ワンステッププロセスでの各低分子薬剤の導入条件（反応ｐＨ、反応温度および反応時間）と封入数（フェリチン２４量体の１カゴあたりに封入された低分子の数）、導入率（低分子とフェリチンの総重量に占める低分子の重量、重量％）を表２、３に示す。その結果、分子量やｐＫａなどの物性の異なる各種低分子薬剤もワンステッププロセスで簡便にフェリチン内に導入することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、各低分子薬剤のｐＫａと最もフェリチン内に導入量の多かった反応で用いた緩衝液ｐＨとの関係を表４、５に示す。それらの相関を図１１に示す。この相関係数は０．８４で優位に正の相関があった（ｔ－検定、ｐ＜１％）。そして、ｐＫａが中性（ｐＨ７）よりも低い分子は酸性条件（ｐＨ６以下）、ｐＫａが中性よりも高い分子は、弱酸性条件からアルカリ性条件（ｐＨ６以上）で、効率的にフェリチン内に導入されることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　さらに、ワンステッププロセスでフェリチン内に導入された低分子薬剤の量と脱会合・再会合プロセスでフェリチン内に導入された低分子薬剤の量を比較した。図１２はワンステッププロセスでの薬剤導入量と脱会合・再会合プロセスでの薬剤導入量の比を示す。ＤＯＸの導入量比較は、実施例５と実施例１０を用いて計算した。いずれの低分子薬剤の場合でも、ワンステッププロセスの方が多くの薬剤をフェリチン内に導入することができ、導入量の差が最も小さかったＭｅｔｆｏｒｍｉｎでも２．５倍、導入量の差が最も大きかったＤＯＸでは３０倍の差を確認できた。脱会合・再会合プロセスでは、フェリチンが再会合する際に、反応液中の低分子を巻き込み封入させるため、反応液中の低分子以上の濃度での封入は難しい。また、酸性条件下でフェリチン単量体に脱会合させる際に、フェリチン単量体構造が一部変性し、再会合後も内部の薬剤が漏れ出てしまう危険性がある。
　一方で、ワンステッププロセスではフェリチンの超分子構造が維持可能な環境下で、薬剤をフェリチン内部に導入できている。そのため、反応終了後もフェリチン自体へのダメージは少なく、リークもほとんどないと考えられる。フェリチンの超分子構造が維持されたまま様々な薬剤が導入されたことから、フェリチンへの薬剤導入は、金属イオンと同様に、３回対称チャネルを通過して行われていると推定される（Ｔ　Ｄｏｕｇｌａｓ　ａｎｄ　ＤＲ　Ｒｉｐｏｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ，７，１０８３－１０９１．（１９９８）、ＭＡ　Ｃａｒｒｏｎｄｏ　ＥＭＢＯ　Ｊ．２２，１９５９－１９６８．（２００３））。理由として、チャネル以外のフェリチンの構造はタイトで金属イオンですら通過できないと考えており、それよりも排除体積の大きな有機分子は通過できないと考えらえる。そして、中性の緩衝液下で、３回対称チャネルは負に帯電しており、その静電勾配による金属イオンの流入と同様に、有機分子もフェリチン内部に能動的に取り込まれ、負に帯電したフェリチン内部に蓄積されるため、反応液中の低分子以上の濃度での封入が可能となったと考えられる。また、負に帯電したフェリチン表面の穴から、その静電勾配により内部に導入されるのであれば、アミノ基を多く持ち正に帯電しやすい有機分子の方がより取り込まれやすいと推定される。
　このことから、ワンステッププロセスは、従来の脱会合・再会合プロセスよりも多くの薬剤を導入できることが分かった。
＜実施例１３：ＤＯＸ封入変異型ＦＴＨフェリチンの構築（１）＞
　ワンステッププロセスを用いて、ペプチドアプタマーを提示したフェリチンへの薬剤導入を行った。
　はじめに、フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域にチタン認識ペプチド（ｍｉｎＴＢＰ１：ＲＫＬＰＤＡ（配列番号７））が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰ）単量体をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ－３’（配列番号８）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣ－３’（配列番号９）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号１０）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号１１）をプライマーとしてＰＣＲを行った。それらＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰ）を構築した。ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰ単量体から構成されるフェリチンを、必要に応じて、ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰフェリチンと略記する。
　また、ヒト由来フェリチンＨ鎖単量体をコードするＤＮＡが搭載されたｐＥＴ２０－ＦＴＨを鋳型として、５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号１２）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧ－３’（配列番号１３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で処理し、セルフライゲーションすることで、Ｃ末端にシステインが付与されたＦＴＨｃ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨｃ）を構築した。ＦＴＨｃ単量体から構成されるフェリチンを、必要に応じて、ＦＴＨｃフェリチンと略記する。
　続いて、構築した変異フェリチン単量体（ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰ単量体、またはＦＴＨｃ単量体）が搭載されたベクターｐＥＴ２０－ＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰあるいはｐＥＴ２０－ＦＴＨｃを各々導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）をそれぞれＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ　Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた各菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ　Ｑ　ＨＰカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　２６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００　ＨＲカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって各変異フェリチンを分離精製した。その各変異フェリチンを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて各々濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、０．２ｍｇ／ｍｌのＦＴＨ－ＢＣ－ＴＢＰフェリチンを含む溶液１ｍｌと５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨｃフェリチンを含む溶液１ｍｌを各々得ることができた。
　終濃度１ｍｇ／ｍｌの各変異フェリチンを含む５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌ中に、終濃度が０．３ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、５０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、１ｍｌの水に懸濁したＤＯＸと各変異フェリチンの複合体を得た。そして、その含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。また、ＤＯＸ濃度を４８０ｎｍの吸光分析によって決定した。
　その結果、どちらの変異フェリチンにもＤＯＸを導入することができた。この時の薬剤導入率は、ＦＴＨ－ＤＥ－ＴＢＰフェリチンは６．５％（ｗｔ）、ＦＴＨｃフェリチンは８．６％（ｗｔ）であった。すなわち、ペプチドが挿入され機能化したフェリチンにおいてもワンステッププロセスを用いて薬剤が導入できることが分かった。
＜実施例１４：ＤＯＸ封入変異型ＦＴＨの構築（２）＞
　ワンステッププロセスを用いて、ペプチドアプタマーを提示したフェリチンへの薬剤導入を行った。
　はじめに、フェリチン単量体のＮ末端に癌認識ペプチド（ＨＥＲ２ａ：ＭＡＲＳＧＬ（配列番号１４）；Ｍ　Ｈｏｕｉｍｅｌ　ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　９２，７４８－７５５．（２００１））が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨ）単量体をコードするＤＮＡを得るために、ヒト由来フェリチンＨ鎖単量体をコードするＤＮＡが搭載されたｐＥＴ２０－ＦＴＨを鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＣＡＣＧＴＡＧＴＧＧＴＴＴＡＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ－３’（配列番号１５）および５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号１６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、制限酵素ＤｐｎＩとＮｄｅＩ（タカラバイオ社）で処理し、セルフライゲーションすることで、ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨ）を構築した。ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨ単量体から構成されるフェリチンを、必要に応じて、ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨフェリチンと略記する。
　フェリチン単量体のＣ末端にＲＮＡ認識ペプチド（Ｕ２ＡＦ：ＴＲＱＡＲＲ（配列番号１７）Ｒ　Ｔａｎ　ａｎｄ　ＡＤ　Ｆｒａｎｋｅｌ，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　９２，　５２８２－５２８６．（１９９５）））が挿入融合されたヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦ）をコードするＤＮＡを得るために、ヒト由来フェリチンＨ鎖単量体がコードするＤＮＡが搭載されたｐＥＴ２０－ＦＴＨを鋳型として、５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＴＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧ－３’（配列番号１８）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧ－３’（配列番号１３）をプライマーとしてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、制限酵素ＤｐｎＩとＮｄｅＩ（タカラバイオ社）で処理し、セルフライゲーションすることで、ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦ）を構築した。ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦ単量体から構成されるフェリチンを、必要に応じて、ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦフェリチンと略記する。
　続いて、構築した変異フェリチン単量体（ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨ単量体、またはＦＴＨ－Ｕ２ＡＦ単量体）が搭載されたｐＥＴ２０を導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ　Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ　Ｑ　ＨＰカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　２６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００　ＨＲカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによって各変異フェリチンを分離精製した。その各変異フェリチンを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、０．８ｍｇ／ｍｌのＨＥＲ２ａ－ＦＴＨフェリチンを含む溶液１ｍｌと１．１ｍｇ／ｍｌのＦＴＨ－Ｕ２ＡＦフェリチンを含む溶液１ｍｌを各々得ることができた。
　終濃度１ｍｇ／ｍｌの各変異フェリチンを含む５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９）１ｍｌ中に、終濃度が０．３ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、５０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、１ｍｌの水に懸濁したＤＯＸと変異フェリチンの複合体を得た。そして、その含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。また、ＤＯＸ濃度を４８０ｎｍの吸光分析によって決定した。
　その結果、いずれの変異フェリチンにもＤＯＸを導入することができた。この時の薬剤導入率は、ＨＥＲ２ａ－ＦＴＨフェリチンは１４．６％（ｗｔ）、ＦＴＨ－Ｕ２ＡＦフェリチンは１７．９％（ｗｔ）であった。すなわち、ペプチドが挿入され機能化したフェリチンにおいてもワンステッププロセスを用いて薬剤が導入できることが分かった。
＜実施例１５：ＦＴＨフェリチン構造のｐＨ依存性＞
　フェリチンのカゴ状構造のｐＨ依存的な変化を調べるために、ＦＴＨフェリチンを終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように各ｐＨの溶液に懸濁し２５℃で３０分放置した後、ゼータサイザーナノＺＳを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）法で各ｐＨでのフェリチンのサイズを測定した。測定は２５℃で実施された。使用された溶液は、０．１Ｎ　ＨＣｌ（ｐＨ１．７），２０ｍＭリン酸（ｐＨ２．６、ｐＨ３．２，ｐＨ５．６，ｐＨ６．７，ｐＨ７．７）、２０ｍＭ　酢酸（ｐＨ４．２，ｐＨ４．９，ｐＨ５．３）、１ｍＭ　ＮａＯＨ（ｐＨ１１．１）、１０ｍＭ　ＮａＯＨ（ｐＨ１２．３）および１００ｍＭ　ＮａＯＨ（ｐＨ１２．８）を用いた。また、ｐＨ２．０からｐＨ２．４の溶液は１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌにＨＣｌを滴下してｐＨを調製した。
　その結果、ｐＨ１．７からｐＨ２．４の範囲では、ＤＬＳでの平均粒径は８ｎｍ以下で、フェリチンが脱会合し、カゴ状構造が壊れていることが示唆された（図１３）。一方、ｐＨ２．６からｐＨ１２．８での平均粒径は１１ｎｍ以上であり、カゴ状構造が維持されていることが分かった。すなわち、今回のワンポット法では、カゴ状構造が維持された条件で薬剤をフェリチン内部に導入できていることが分かった。
＜実施例１６：ＤＯＸ封入ＦＴＬフェリチンの構築＞
　ワンステッププロセスを用いて、Ｌ鎖フェリチンへの薬剤導入を行った。
ヒト由来フェリチンＬ鎖（ＦＴＬ（配列番号２））単量体をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＧＴＣＡＧ－３’（配列番号２３４）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧ－３’（配列番号２３５）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号５）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＬ単量体をコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＬ）を構築した。
　続いて、構築したｐＥＴ２０－ＦＴＬを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ　Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ　Ｑ　ＨＰカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、ＦＴＬ単量体から構成されるフェリチン（以下、ＦＴＬフェリチンと略記する）を分離精製した。そのＦＴＬフェリチンを含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　２６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００　ＨＲカラム（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＴＬフェリチンを分離精製した。そのＦＴＬフェリチンを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、３ｍｇ／ｍｌのＦＴＬフェリチンを含む溶液１ｍｌを各々得ることができた。
　終濃度１ｍｇ／ｍｌの各変異ＦＴＬフェリチンを含む５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌ中に、終濃度が０．３ｍｇ／ｌとなるようにＤＯＸを混合し、５０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、１ｍｌの水に懸濁したＤＯＸとＦＴＬフェリチンの複合体を得た。そして、その含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。また、ＤＯＸ濃度を４８０ｎｍの吸光分析によって決定した。
　その結果、ＦＴＬフェリチンにＤＯＸを導入することができた。この時の薬剤導入率は、７．０％（ｗｔ）であった。すなわち、ＦＴＬフェリチンにおいてもワンステッププロセスにより薬剤が導入できることが分かった。
＜実施例１７：ワンステッププロセスによる低分子薬剤導入（２）＞
　ワンステッププロセスにより、負に帯電する官能基を持つウラニン（Ｃａｓ　ｎｏ．　５１８－４７－８、分子量３７６、ｐＫａ＝２．２，４．４，６．７）をＦＴＨ内に導入した。
　終濃度３ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む終濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ３あるいは７）、あるいは酢酸緩衝液（ｐＨ５）に、終濃度が３００ｍＭとなるようにウラニンを混合し、３０℃あるいは６０℃で６０分間各々放置した。全ての反応は容量１ｍｌで反応させた。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）し、上清を１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供することで、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離し、サンプル溶液３．５ｍｌを得た。それら溶液の４３０ｎｍの吸光度を分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて測定しウラニンの濃度を決定すると共に、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。
　その結果を表６に示す。今回ウラニンのｐＫａの平均値４．４から予測される反応ｐＨの最適値はｐＨ５前後であり、実際、６０℃、ｐＨ３とｐＨ５で効率よくフェリチン内に導入することができていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　また、対照として、ウラニンを脱会合・再会合プロセスでフェリチン内へ導入した。すなわち、終濃度５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンと終濃度１ｍＭから３００ｍＭで各々含む５０ｍＭ　グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）　０．５ｍｌを、室温で１５分間放置した。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）　１０μｌを加え中和し、１５分間室温で放置した。放置後、水０．５ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を１０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。その溶液全量（３．５ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮した。
　その結果、反応液中のウラニンが１００ｍＭの場合に最も効率的な内包が確認された（表７）。ワンステップと脱会合・再会合プロセスで各々得られたウラニン内包ＦＴＨフェリチンのウラニン内包量を比較したところ、ワンステップで構築されたサンプルの方が２．７倍多くのウラニンを内包しており、ワンステップでより効率的な薬剤内包が実現されていることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
＜実施例１８：ワンステッププロセスで構築された色素内包フェリチンの安定性＞
　ワンステッププロセスで構築されたウラニン内包ＦＴＨフェリチンの血漿中での安定性を評価した。はじめに、ヒト血漿（血液凝固試験用標準ヒト血漿、ＧＣＨ－１００Ａ、ＳＩＥＭＥＮＳ、シスメックス販売。Ｌｏｔ５０３２６４Ｂ）４０ｕｌ中、終濃度１ｍｇ／ｍｌのウラニン内包ＦＴＨフェリチンで、３７℃で遮光静置した。反応開始直後、２４時間あるいは４８時間放置後に各々３本ずつ回収し、すぐさま冷蔵保存した。得られた各サンプルを水で５倍希釈し、ゲルろ過カラム分析にてＦＴＨフェリチンと血漿蛋白質を分離しながら、４３０ｎｍの分光を測定し、ＦＴＨフェリチン内のウラニンを定量した。ゲルろ過カラム分析の条件として、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００　ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア社）とＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、流速０．８ｍｌ／分を用いた。
　その結果、内包されたウラニンの内９４％が４８時間後でもＦＴＨフェリチン内に内包されており、ウラニン内包ＦＴＨフェリチンが血漿中で安定であることが分かった（図１４）。
＜実施例１９：ワンステッププロセスで構築された色素内包フェリチンの細胞導入＞
　フェリチンはトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）依存的に細胞内に輸送されることが知られている。ワンステッププロセスで構築された薬物内包フェリチンの細胞内移行性を評価するため、ウラニンをモデル化合物として、ウラニン内包ＦＴＨフェリチンの細胞内取り込み活性を評価した。
　終濃度３ｍｇ／ｍｌのＦＴＨフェリチンを含む終濃度５０ｍＭの酢酸緩衝（ｐＨ５）２ｍｌに、終濃度が１００ｍＭとなるようにウラニンを混合し、４０℃で６０分間放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）し、上清を１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供することで、封入されなかった薬剤とタンパク質とを分離した。得られたサンプル溶液３．５ｍｌを、ＰＢＳで平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　１６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００　ＨＲに供し、ＰＢＳで、流速０．５ｍｌ／分でウラニン内包ＦＴＨフェリチンを溶出し精製した。精製後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０－１００ｋ（ＧＥヘルスケア社）を用いた限外ろ過により濃縮されたウラニン内包ＦＴＨフェリチンの４３０ｎｍの吸光度を分光光度計（ＤＵ－８００、ベックマンコールター社）にて測定しウラニンの濃度を決定すると共に、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。その結果、溶液ウラニンを５６９μＭ、およびＦＴＨフェリチンを６．７μＭで含有するウラニン内包ＦＴＨフェリチン水溶液１ｍｌを得られた。
　評価用培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）＋１％非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ナカライテスク社））にウラニン内包ＦＴＨフェリチンの終濃度が０ｎＭ（ウラニン濃度０μＭ）から８００ｎＭ（ウラニン濃度濃度６７．９μＭ）となるように各々添加された培地１００μｌ中で、ヒト乳癌由来であるＳＫＢＲ－３細胞（２０，０００　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、９６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）に添加し、３７℃で培養した。このＳＫＢＲ－３細胞はトランスフェリン受容体ＴｆＲが発現している。各々２４時間培養後、リン酸緩衝生理食塩水１００μｌにて２回洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）５０μｌ中で３７℃、１０分間放置した。その後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ培地１００μｌを加え、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）用プレートに細胞を移し、４００ｘｇ、５分間遠心分離した。各細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（ＡｔｔｕｎｅＴＭ　Ｆｏｃｕｓｉｎｇ　Ｆｌｕｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に懸濁し、ＦＡＣＳ（Ａｔｔｕｎｅ　ＮｘＴ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で分析した。
　その結果、ウラニン内包ＦＴＨフェリチンの濃度依存的な蛍光強度の変化が確認され、濃度依存的に細胞への取り込み量が増加していることが示唆された（図１５）。
　同じ条件で調整された細胞を二光子励起蛍光顕微鏡（ＣＱ－１、横川電機株式会社）で観察したところ、濃度依存的なウラニン内包ＦＴＨフェリチンの細胞への取り込みを確認することができた（図１６）。
　以上の結果から、薬物を内包したフェリチンは、天然型フェリチンと同様に、細胞内への輸送能力を持つことが示唆された。
　本発明の方法は、例えば、新規薬物送達系（ＤＤＳ）として期待される、または電子デバイスの作製に利用される有機化合物封入フェリチンの製造に有望である。例えば、本発明の多量体を構成する融合タンパク質におけるフェリチン単量体がヒトフェリチン単量体である場合、本発明の多量体は、ＤＤＳとして有用である。また、ヒトフェリチン単量体がヒトに対する抗原性および免疫原性を有しないことに照らすと、本発明の多量体は、臨床応用において安全性に優れるという利点も有する。
　本発明の緩衝液は、例えば、有機化合物封入フェリチンの製造に有用である。
　有機化合物封入フェリチンは、例えば、新規薬物送達系（ＤＤＳ）として有用である。

Claims (19)

  1. 　有機化合物封入フェリチンの製造方法であって、
    （１）緩衝液中で有機化合物をフェリチンと混合して、有機化合物およびフェリチンの混合物を得ること；ならびに
    （２）緩衝液中で前記混合物をインキュベートすることを含み、
    　緩衝液は、ｐＨ３以上１３未満であり、かつ
    　緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１３未満のｐＨを有する、方法。
  2. 　緩衝液のｐＨと有機化合物のｐＫａが、式：ｐＨ＝２．６＋０．６ｐＫａ±０．４ｐＫａの関係を満たす、請求項１記載の方法。
  3. 　インキュベートの温度が１０℃以上６０℃以下である、請求項１または２記載の方法。
  4. 　有機化合物の分子量が１００以上１０００未満である、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
  5. 　有機化合物のｐＫａが２以上１３以下である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 　１０分子以上２００分子以下の有機化合物がフェリチン１分子に封入されている、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
  7. 　混合およびインキュベートの合計時間が３０分以上である、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  8. 　前記混合におけるフェリチンに対する有機化合物の重量比（有機化合物／フェリチン）が０．２０以上０．３６以下である、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
  9. 　有機化合物が、正の架電部分、または正に架電し得る部分を有する、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
  10. 　正の架電部分が、（ａ）アンモニウム基、グアニジウム基、イミダゾリウム基、オキサゾリウム基、チアゾリウム基、オキサジアゾリウム基、トリアゾリウム基、ピロリジニウム基、ピリジニウム基、ピペリジニウム基、ピラゾリウム基、ピリミジニウム基、ピラジニウム基、およびトリアジニウム基からなる群より選ばれるカチオン性窒素含有基、または（ｂ）ホスホニウム基である、請求項９記載の方法。
  11. 　正に架電し得る部分が、（ａ’）アミノ基、グアニジノ基、ニトロ基、アミド基、ヒドラジド基、イミド基、アジド基、およびジアゾ基からなる群より選ばれる窒素含有基、または（ｂ’）ホスフィノ基である、請求項９または１０記載の方法。
  12. 　フェリチンが（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンである、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法：
    （ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
    （ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
    （ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
  13. 　有機化合物封入フェリチンを含む緩衝液であって、
    　緩衝液は、有機化合物のｐＫａが７未満の場合には３以上７未満のｐＨを有し、有機化合物のｐＫａが７以上の場合には６以上１２未満のｐＨを有する、緩衝液。
  14. 　緩衝液が、６以上９以下のｐＨを有する、請求項１３記載の緩衝液。
  15. 　有機化合物が、６以上９以下のｐＫａを有する、請求項１３または１４記載の緩衝液。
  16. 　有機化合物封入フェリチンであって、
    　有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、および標識物質からなる群より選ばれ、
    　フェリチン１分子への有機化合物の封入分子数が以下である、有機化合物封入フェリチン：
    （１）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンである場合、４０分子以上２００分子以下；
    （２）有機化合物がアントラサイクリン系物質であり、かつフェリチンが遺伝子組換えフェリチンである場合、１００分子以上２００分子以下；または
    （３）有機化合物がヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、β２アドレナリン受容体作動薬、イミダゾリン系物質、ビタミン、または標識物質であり、かつフェリチンが天然フェリチンまたは遺伝子組換えフェリチンである場合、１０分子以上２００分子以下。
  17. 　アントラサイクリン系物質がドキソルビシンであり、
    　ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬がファモチジンであり、
    　ピグアナイド系物質がメトホルミンであり、
    　ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬がミノキシジルであり、
    　β２アドレナリン受容体作動薬がテルブタリンであり、
    　イミダゾリン系物質がクレアチニンであり、
    　ビタミンがチアミン、リボフラビン、またはニコチンアミドであり、
    　標識物質がローダミンＢ、ウラニン、またはコンゴレッドである、請求項１６記載の有機化合物封入フェリチン。
  18. 　有機化合物が、アントラサイクリン系物質、ヒスタミンＨ２受容体拮抗薬、ピグアナイド系物質、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル開口薬、およびβ２アドレナリン受容体作動薬からなる群より選択される、請求項１６または１７記載の有機化合物封入フェリチン。
  19. 　フェリチンが（１）天然フェリチン、または（２）下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの改変を有する遺伝子組換えフェリチン単量体から構成されるフェリチンである、請求項１６～１８のいずれか一項記載の有機化合物封入フェリチン：
    （ａ）フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されているフェリチン単量体；
    （ｂ）Ｎ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体；または
    （ｃ）Ｃ末端に機能性ペプチドが付加されているフェリチン単量体。
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