WO2020026968A1 - Ａａｖベクターによる遺伝子発現を増強する方法 - Google Patents

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WO2020026968A1
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慎一 村松
直美 滝野
美加 伊藤
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株式会社遺伝子治療研究所
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    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a composition for gene transfer containing a recombinant virus vector. More specifically, the present invention relates to a composition for gene transfer comprising a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector and a sugar.
  • rAAV adeno-associated virus
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Adeno-associated virus (AAV) -based gene transfer vectors are used for cells such as neurons, hepatocytes (liver parenchymal cells), retinal cells, muscle cells, cardiomyocytes, endovascular cells, and adipocytes.
  • the gene can be introduced and expressed for a long time. For this reason, clinical application has been promoted as a vector for gene therapy for Parkinson's disease, hemophilia, retinitis pigmentosa, and the like (Patent Documents 1 to 4, Non-Patent Documents 2 to 4).
  • Non-Patent Documents 5 and 6 it is frequently used as a vector for gene transfer of sgRNA and CAS9 protein in gene editing and for gene transfer of light-sensitive proteins such as channelrhodopsin in optogenetics.
  • Non-Patent Documents 7, 8, and 9 in order to improve transduction efficiency and gene expression, genomic structure modification, mutation introduction into capsid proteins, promoter substitution, and the like have been performed (Non-Patent Documents 7, 8, and 9).
  • 10 four vector genome (vg substantially, copy number synonymous) per cell requires infection or more rAAV vectors Are often inefficient and require large amounts of vector purification.
  • the present inventors have conducted various trial and error studies, and by including a higher concentration of sugar in a gene introduction composition containing an rAAV vector as a recombinant virus vector, have been able to obtain various target cells (for example, hepatocytes, neural cells).
  • the present invention has been completed by finding a composition containing a recombinant virus vector that can more efficiently introduce genes into cells.
  • the present invention provides a recombinant virus vector, a composition for gene introduction containing a sugar and an aqueous medium, and the like.
  • a composition for gene transfer comprising a recombinant virus vector containing a gene for expression of interest, at least 40 mM saccharide, and an aqueous medium.
  • the recombinant virus vector is selected from the group consisting of an adeno-associated virus (AAV) vector, an adenovirus vector, a gamma retrovirus vector, and a lentivirus vector.
  • AAV adeno-associated virus
  • the recombinant virus vector is AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV-B1, AAV-PHP.B, or AAV-PHP.eB.
  • composition according to the above [1] or [2], which is derived from [4] The capsid wherein the recombinant virus vector comprises a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 to 4, or an amino acid sequence having about 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 4
  • the saccharide comprises a monosaccharide, a disaccharide or a combination thereof.
  • the monosaccharide contains D-form at 60% or more.
  • the disaccharide contains at least one selected from the group consisting of sucrose, trehalose, maltose, lactose, and combinations thereof. .
  • the composition according to any one of the above [1] to [9], wherein the aqueous medium is water for injection.
  • [15] (a) providing a composition comprising a recombinant virus and a saccharide at a concentration of 40 mM or more; and (b) culturing the composition with cultured cells in a medium containing a final concentration of 10 to 250 mM of the saccharide.
  • a gene transfer method comprising a step of contacting.
  • (16) (a) providing a composition for gene transfer containing a recombinant virus and containing or not containing sugar, (b) contacting the composition for gene transfer with cultured cells, and (c) A method for gene transfer comprising a step of culturing in a medium containing 10 to 250 mM saccharide immediately to 72 hours after step (b).
  • composition for gene introduction containing the recombinant virus vector, sugar and aqueous medium By using the composition for gene introduction containing the recombinant virus vector, sugar and aqueous medium according to the present invention, gene can be efficiently introduced into various target cells (for example, hepatocytes, nerve cells, etc.).
  • target cells for example, hepatocytes, nerve cells, etc.
  • the use of an AAV vector as a recombinant virus vector, a gene introduction composition containing a high concentration of sugar and an aqueous medium the expression enhancing effect of about 50 times or more compared to a control. Confirmed that you get.
  • FIG. 1A shows the results of in vitro infection of rAAV with and without sucrose. One day after infection, the GFP expression of the cells was measured.
  • FIG. 1B shows a fluorescence microscope image of the cells as a result of the experiment in FIG. 1A.
  • FIG. 2A shows the results of in vitro infection of rAAV with the addition of sucrose, mannitol, or glucose.
  • FIG. 2B shows a fluorescence microscope image of the cells as a result of the experiment in FIG. 2A.
  • FIG. 3 shows the results of in vitro infection of rAAV with the addition of sucrose.
  • FIG. 4A shows the results of in vitro infection immediately after, 10 minutes, or 1 hour after mixing the virus solution and sucrose.
  • FIG. 4A shows the results of in vitro infection immediately after, 10 minutes, or 1 hour after mixing the virus solution and sucrose.
  • FIG. 4B shows the results 1 day after mixing the virus solution with sucrose and immediately or 1 hour after in vitro infection.
  • FIG. 4C shows the results when infection was performed with a virus solution containing no sucrose for 3 hours, and thereafter, the medium was replaced with a medium containing sucrose.
  • FIG. 5A shows the results of in vitro infection of rAAV with D-glucose or L-glucose.
  • FIG. 5B shows the results at 1, 2, and 3 days after the experiment of FIG. 5A.
  • FIG. 6 shows the results of in vitro rAAV infection using various concentrations of sucrose.
  • FIG. 7 shows the results of in vitro rAAV infection using various concentrations of glucose.
  • FIG. 8A shows the results of in vitro rAAV infection using various concentrations of sucrose, trehalose, maltose, and lactose, respectively.
  • FIG. 8B shows a fluorescence microscope image of the cells after 3 days using the sugar concentration of 150 ⁇ mM in FIG. 8A.
  • FIG. 8C shows the results 1, 2, 3, and 6 days after the experiment in FIG. 8A.
  • FIG. 9A shows the results of rAAV infection in vitro using galactose, fructose, mannose, and glucose, respectively.
  • FIG. 9B shows a fluorescence microscope image of the cells after 3 days using the sugar concentration of 200 ⁇ mM in FIG. 9A.
  • the present invention provides a recombinant virus vector containing a gene for expression of interest, a sugar having a concentration of 40 mM or more, and a composition for gene transfer containing an aqueous medium.
  • the recombinant virus vector can be preferably selected from, but not limited to, an adeno-associated virus (AAV) vector, an adenovirus vector, a gamma retrovirus vector, and a lentivirus vector.
  • AAV adeno-associated virus
  • the recombinant virus vector used in the composition for gene transfer of the present invention infects eukaryotic cells, preferably mammalian cells.
  • eukaryotic cells preferably mammalian cells.
  • viral vectors examples include, for example, adeno-associated virus vector, adenovirus vector, retrovirus vector (including gamma retrovirus vector and lentivirus vector), herpes virus vector, poxvirus vector, Vaccinia virus vectors, Sendai virus vectors, Bornavirus vectors, and the like, but are not limited thereto.
  • the recombinant virus vector used in the present invention is an adeno-associated virus vector or an adenovirus vector, more preferably an adeno-associated virus vector.
  • Adeno-associated virus vector The native adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus and the viral genome contained in the adeno-associated virus vector must be present for a long time in the episome in the nucleus of infected host cells. It is characterized by. Utilizing these characteristics, various recombinant viral vectors have been produced to deliver desired genes for gene therapy (for example, WO2003 / 018821, WO2003 / 053476, WO2007 / 001010). , Pharmaceutical Journal 126 (11) 1021-1028, etc.).
  • Adeno-associated virus is known to have specificity or tropism for a target organ.
  • adeno-associated viruses exhibiting tropism to the liver include type 2, type 3 (including 3A and 3B), type 8 and the like (WO 2012/057363, WO 2008/124724, etc.).
  • examples of those exhibiting directivity to neurons include type 1, type 2, type 9, rh10, rh39, rh43, B-1, PHP.B, PHP.eB and the like (for example, Reference 10 below). ⁇ 13).
  • the adeno-associated virus used as a therapeutic virus vector in the present invention is not limited to these isolates, and it is also possible to use isolates and variants known in the art.
  • the wild-type AAV genome is a single-stranded DNA molecule having a total length of about 5 kb and a sense strand or an antisense strand.
  • the AAV genome generally has an inverted terminal repeat (ITR) sequence of about 145 nucleotides at both the 5 'and 3' ends of the genome. It is known that this ITR has various functions such as a function as an origin of replication of the AAV genome and a function as a packaging signal of the genome into virus particles (for example, Pharmaceutical Journal No. 126 (11) 1021). -1028).
  • ITR inverted terminal repeat
  • the internal region of the wild-type AAV genome flanked by ITRs includes an AAV replication (rep) gene and a capsid (cap) gene.
  • rep gene and cap gene encode a protein Rep involved in virus replication and a capsid protein (eg, at least one of VP1, VP2 and VP3) forming a capsomere which is an outer shell of an icosahedral structure, respectively.
  • a capsid protein eg, at least one of VP1, VP2 and VP3
  • capsomere which is an outer shell of an icosahedral structure, respectively.
  • the rAAV vector used in the present invention is a natural adeno-associated virus type 1 (AAV1), type 2 (AAV2), type 3 (AAV3a / AAV3b), type 4 (AAV4), type 5 (AAV5), type 6 (AAV6). , Type 7 (AAV7), type 8 (AAV8), type 9 (AAV9), rh10 (rhAAV10: Hu, C et al., Molecular Therapy vol. 22, no. 10, Oct. 2014, 1792-1802) Vector, but not limited to.
  • AAV1 AF063497.1
  • AAV2 AF043303
  • AAV3A NC_001729
  • U48704 AAV3A
  • AF028705.1 AAV3B
  • NC_001829 NC_001829
  • AAV4 NC_006152.1
  • AAV6 NC_006260.1
  • AAV7 NC_006261.1
  • AAV8 AY530579.1
  • AAV9 AY631965 (AAV10), etc.
  • the protein contained in the recombinant virus vector is at least 80%, preferably 85% or more, about 90% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1-4 or the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-4. , 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4 % Or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, having an amino acid sequence having an identity of 99.9% or more, and forming a viral vector under physiological conditions, or the capsid of the viral vector ( Outer shell).
  • a vector for gene therapy using an adenovirus (hereinafter also referred to as a recombinant adenovirus vector) can be said to be the vector most used in clinical trials of pharmaceuticals so far (Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 08-501686 and 08-501686). 10-506542, Non-Patent Document 1, and the following Documents 14 and 15).
  • a recombinant adenovirus vector incorporating the human tumor suppressor gene p53 was approved for the first time in the world as a gene therapy drug in 2003, and sold under the brand name "Gendicin". Have been.
  • Recombinant adenovirus vectors are known to have a wide host range (animal species of interest, cell tumors, etc.).
  • the adenovirus gene exists independently without being integrated into the chromosome in the cell nucleus of the target cell, this feature allows the recombinant adenovirus vector to transiently express the target gene.
  • the expression of a target gene can be lost usually in 1 to 2 weeks.
  • Disadvantages of recombinant adenovirus vectors include their high immunogenicity in vivo. Reference 14. Yokoda RT, et al .: Biomedicines. 6:33, 2018. Reference 15. Zhang C and Zhou D: Hum Vaccin Immunother. 12: 2064-2074, 2016.
  • the genome of adenovirus is a linear double-stranded DNA molecule of about 36 kb, and this genome encodes about 30 or more genes including early genes and late structural genes required for virus replication.
  • the outer shell of the adenovirus has a capsid composed of a capsid protein exposed, which is similar to the outer shell of the adeno-associated virus.
  • E1-E4 The early genes of adenovirus are divided into four regions in the adenovirus genome (E1-E4: E indicates early). They contain six transcription units and have their own promoter. The late genes (L1-L5: L stands for late) partially overlap the early transcription unit and are transcribed for the most part from the major late promoter (MLP).
  • MLP major late promoter
  • retroviral vectors are intended to include gammaretroviral vectors (or oncoviral vectors) and lentiviral vectors.
  • the gamma retrovirus vector includes a vector derived from Moloney murine leukemia virus (MoMLV).
  • MoMLV Moloney murine leukemia virus
  • lentivirus vectors include vectors derived from human immunodeficiency virus type 1 (HIV 1) and simian immunodeficiency virus (SIV).
  • the retrovirus vector can permanently express the target polynucleotide by integrating the target introduction polynucleotide into the chromosome of the target cell with high efficiency.
  • this retroviral vector since this retroviral vector is originally derived from a disease-causing virus such as leukemia or immunodeficiency syndrome, it has been pointed out that it may cause malignant neoplasms.
  • the size of the gene that can be introduced include those having a size of 9 kb or less (Toi et al., Virus, Vol. 65, No. 1, pp. 27-36, 2015, Vargas JE, et al .: J Transl Med. 14 : 288, 2016, Poletti V and Mavilio F: Mol Ther Methods Clin Dev. 8: 31-41, 2017).
  • Retroviruses have an envelope protein and an envelope membrane as the outer shell of the virus.
  • retroviruses often have RNA as their genome, and the genes encoded by this genome include gag / pol genes that encode precursor proteins that become viral structural proteins, proteases, reverse transcriptase, integrase, etc., and envelopes. Includes the env gene encoding glycoprotein. Both ends of the viral genome are flanked by LTR (long terminal repeat), which contains an enhancer, promoter, polyadenylation signal, and the like.
  • LTR long terminal repeat
  • the recombinant virus vector used in the present invention may contain the target expression gene (polynucleotide) for introduction into a target cell in the recombinant virus genome contained in the virus vector.
  • examples of such an expression gene to be introduced include a sequence having a function of the gene itself, a sequence having a function of a transcript, a sequence having a function translated into a protein, and a gene containing a combination of these sequences.
  • the present invention is not limited to these. That is, the target expression gene of the recombinant virus vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be mounted on the recombinant virus vector in consideration of the gene size and the like.
  • Examples of the target expression gene contained in the recombinant virus vector used in the present invention include, for example, a promoter sequence, a telomere sequence, a polyadenylation signal sequence, a target protein binding sequence, etc. .
  • sequences in which the transcript functions in the recombinant vector used in the present invention include endogenous target genes such as antisense molecules, ribozymes, interfering RNAs (iRNAs), and microRNAs (miRNAs). Or a polynucleotide for altering (eg, decreasing) the level of expression of an endogenous protein, such as, but not limited to, a polynucleotide.
  • endogenous target genes such as antisense molecules, ribozymes, interfering RNAs (iRNAs), and microRNAs (miRNAs).
  • a polynucleotide for altering (eg, decreasing) the level of expression of an endogenous protein such as, but not limited to, a polynucleotide.
  • sequences to be translated into proteins included in the recombinant vector used in the present invention include growth factors, trophic factors, cytokines, antigens, antibodies, tumor suppressors, metabolic enzymes, suicide genes, receptors, trans Sequences encoding proteins such as porters, growth inhibitors, genome editing and repair means, and combinations of these sequences. Further, it may be an expression cassette containing a known reporter gene such as green fluorescent protein (GFP).
  • the recombinant virus vector used in the present invention may include a plurality of vectors having the above-described target expression gene. In addition, the recombinant virus vector used in the present invention may contain a plurality of target expression genes in one kind of vector.
  • Examples of the target expression gene introduced by the recombinant virus vector of the present invention include hepatocyte growth factor (HGF), nerve cell growth factor (NGF), hemoglobin, interleukin-1, interleukin-2, and interleukin-2.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • NGF nerve cell growth factor
  • Examples include, but are not limited to, enzymes for cleaving specific sites above (eg, TALEN, CRISPR, and ZFN).
  • the polynucleotide of interest introduced by the recombinant viral vector of the present invention may be of a heterologous or homologous origin for the target cell, tissue or patient.
  • the promoter sequence that can be used in the present invention is not particularly limited as long as the target expression gene can be expressed in a target cell.
  • a general-purpose mammal-derived promoter or virus-derived promoter can be used.
  • Such promoters include, but are not limited to, PGK promoter, EF1- ⁇ promoter, ⁇ -globin promoter, CMV promoter, SV40 promoter, MMLV-LTR promoter, and HIV-LTR promoter.
  • a promoter specific to a target cell can be used.
  • the target cell is a cell of the nervous system
  • synapsin I promoter sequence myelin basic protein promoter sequence, neuron-specific enolase promoter sequence, calcium / calmodulin-dependent protein kinase II (CMKII) promoter sequence, tubulin ⁇ I promoter Sequence, platelet-derived growth factor ⁇ chain promoter sequence, glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter sequence, L7 promoter sequence (cerebellar Purkinje cell-specific promoter), glial fibrillary acidic protein (hGfa2) promoter sequence, glutamate receptor delta2 promoter (Cerebellar Purkinje cell-specific promoter) sequence, and glutamate decarboxylase (GAD65 / GAD67) promoter sequence, but are not limited thereto.
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • L7 promoter sequence cerebellar Purkinje cell-specific promoter
  • hGfa2 promoter glial fibrillary acidic
  • the target cells are hepatocytes in the present invention
  • ApoE promoter When the target cells are hepatocytes in the present invention, ApoE promoter, antitrypsin promoter, cKit promoter, liver-specific transcription factors (HNF-1, HNF-2, HNF-3, HNF-6, C / ERP, DBP) , An albumin promoter, a thyroxine binding globulin (TBG) promoter, and a synthetic promoter (HCRhAAT promoter, those described in WO2018 / 131551), but are not limited thereto.
  • TBG thyroxine binding globulin
  • HCRhAAT promoter those described in WO2018 / 131551
  • Target Disease Treatment methods using the composition of the present invention as a medicine include gene therapy, cancer virus therapy, and virus immunotherapy.
  • gene therapy congenital genetic diseases and diseases caused by functional deterioration with aging have been studied.
  • cancer virus therapy viruses that target cancer cells and induce lysis, apoptosis, etc., have been studied.
  • viral immunotherapy for example, a therapeutic method using a virus for inducing an immune response advantageous for the treatment of a target disease, such as CART therapy, has been studied.
  • diseases targeted for treatment using a viral vector include, specifically, congenital genetic diseases such as adenosine aminase deficiency (ADA-SCID), X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID), and chronic diseases.
  • congenital genetic diseases such as adenosine aminase deficiency (ADA-SCID), X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID), and chronic diseases.
  • congenital genetic diseases such as adenosine aminase deficiency (ADA-SCID), X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID), and chronic diseases.
  • congenital genetic diseases such as adenosine aminase deficiency (ADA-SCID), X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID), and chronic diseases.
  • examples include granulomatosis (CGD), beta thalassemia, Leber congenital amaurosis (LCA), and adren
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 2, Piguet Fet et al .: Hum Gene Ther. 28: 988-1003, 2017).
  • sugar The composition of the present invention is characterized by containing a saccharide together with the above-mentioned recombinant virus vector.
  • saccharide may be described as “sugar”.
  • Sugars that can be used in the composition of the present invention are sugars that are known to be usable in the pharmaceutical field.
  • the sugar used in the present invention is one that can be used in an injection or infusion.
  • Such sugars include monosaccharides (including trioses, tetroses, pentoses, hexoses) and disaccharides.
  • the sugar used in the composition of the present invention is preferably erythrose, threose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, talose, erythrulose, ribulose, xylulose, Psicose, fructose, sorbose, tagatose, sucrose, trehalose, maltose, lactose, and combinations thereof, but are not limited thereto.
  • the sugar used in the composition of the present invention may include stereoisomers.
  • the structure of each sugar (monosaccharide) contained in the composition of the present invention may be D-form, L-form, or a mixture thereof.
  • the monosaccharide included in the composition of the present invention may preferably be about 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more of the D-form.
  • the monosaccharide used in the composition of the present invention may have a cyclic structure or a linear structure.
  • Exemplary cyclic structures include a 6-membered pyranose type and a 5-membered furanose type. These ring structures have ⁇ -form or ⁇ -form depending on the position of the hydroxyl group bonded to the carbon atom (C1) at position 1.
  • the monosaccharide used in the composition of the present invention may be ⁇ -form, ⁇ -form, or a mixture thereof.
  • the ring structure of a monosaccharide includes an ⁇ -form, a ⁇ -form, and a combination thereof unless otherwise specified.
  • composition of the present invention may also contain a known sugar alcohol that can be used as a pharmaceutical.
  • Preferred sugar alcohols include, but are not limited to, erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, and combinations thereof.
  • the composition of the present invention may contain a known sugar-modified product that can be used as a pharmaceutical.
  • Modifications to obtain such modified sugars include pharmaceuticals such as acetylation, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialylation, glucuronidation, iduronidation, phosphorylation, sulfation, ribosylation, etc. Examples include, but are not limited to, known modifications.
  • Preferred modifications to sugars for use in the compositions of the present invention include, but are not limited to, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialylation, glucuronidation, iduronization, and combinations thereof.
  • the composition of the invention may be in the form of an aqueous solution containing at least 40 mM sugar.
  • This concentration of 40 mM corresponds to an aqueous solution of about 0.7% for a monosaccharide and about 1.4% for a disaccharide.
  • the concentration of the sugar in the composition of the present invention is included in the composition as a lower limit of glucose 40 mM, sucrose 80 mM, trehalose 40 mM, maltose 40 mM, lactose 40 mM or more, and an upper limit.
  • a composition of the invention may comprise a mono- or disaccharide at a concentration of 200 mM glucose, 160 mM sucrose, 160 mM rehalose, 160 mM maltose, 160 mM lactose.
  • the above sugars may be a combination of two or more sugars.
  • a combination of glucose and sucrose, a combination of sucrose and maltose, a combination of glucose and sucrose and maltose, a combination of sucrose and maltose, and the like can be given.
  • the sugar concentration for example, a concentration from the lower limit to the upper limit of each sugar, a lower limit to an upper limit concentration for one kind of sugar for the total concentration of each sugar, and a concentration suitable for target gene introduction are used. be able to.
  • the concentration of sugar is 1 to 4.5 g / L. This concentration corresponds to about 6 to 25 mM in terms of glucose.
  • the final sugar concentration is, for example, 40 to 240 mM glucose, 80 to 200 mM sucrose, 40 to 200 mM trehalose, 40 to 200 mM maltose, or 40 to 200 mM maltose. Lactose concentrations of 40-200 mM can be used.
  • These sugars may be a combination of two or more sugars as described above.
  • the final concentration of sugar in the case of ex vivo or in vitro gene transfer can be appropriately calculated according to the amount of medium used.
  • the lower limit is 80 to 100 mg / dL (for example, between meals or at the time of fasting), and the upper limit is 150 to 160 mg / dL (for example, after a meal).
  • Blood sugar levels are said to be in the narrow range of 5.0-8.5 mM.
  • the final concentration of each saccharide can be adjusted to be 10 mM or less.
  • These sugars may be a combination of two or more sugars as described above.
  • the final concentration of sugar in the case of gene transfer in vivo depends on the body weight, water content, blood volume, volume of the tissue to be transfected, blood, tissue fluid (eg, cerebrospinal fluid) ) Can be calculated.
  • tissue fluid eg, cerebrospinal fluid
  • a known amount such as about 60% as a water content and about 8% (about 5 L) as a blood volume can be used.
  • a surgical procedure aimed at increasing the local concentration of the recombinant viral vector and sugar in the gene transfer composition of the present invention can be used.
  • a specific organ, tissue or a part thereof to be transfected can be isolated from a living body and temporarily contacted with a higher concentration of sugar. More specifically, the blood flow, lymph, cerebrospinal fluid, etc. of the site to be transfected (eg, organ, tissue or part thereof) are temporarily stopped (isolated) using a clamp or the like, Replacement, perfusion, flushing with an aqueous medium available to the patient, such as saline, and then administering the composition of the invention to the flushed site.
  • a method of temporarily flushing portal vein blood in a liver with a physiological saline and administering an AAV vector thereto (Mimuro et al., Molecular Therapy vol.
  • examples of the final concentration of the sugar include, but are not limited to, concentrations of 50 to 100 mM, 60 to 90 mM, 70 to 80 mM, and the like.
  • a final concentration higher than the blood concentration may be used, given the medium volume of the cerebrospinal fluid (eg, about 150 mL in adults).
  • examples of the final concentration of the sugar include, but are not limited to, concentrations of 50 to 100 mM, 60 to 90 mM, 70 to 80 mM, and the like.
  • the sugar contained in the composition of the present invention may be used for a period from immediately before use (usually 5 minutes or less) to one day before use, for example, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours before , 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours (overnight), or 1 day before, the recombinant virus vector may be combined at the desired concentration.
  • the sugar concentration in the composition of the present invention may be, for example, 40 to 240 mM glucose, 80 to 200 mM sucrose, 40 to 200 mM trehalose, 40 to 200 mM maltose.
  • composition of the present invention can be prepared to contain sugar at a concentration of ⁇ 200 mM, lactose 40-200 mM. These concentrations may be used in amounts that take into account the final concentrations described above.
  • the composition of the present invention may be prepared by diluting the composition provided in the form of a concentrate before use (for example, immediately before use (5 minutes or less), 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, etc.). May be used.
  • the composition of the present invention may be cryopreserved in a state containing the above concentration of sugar. When stored frozen, it may or may not be in the form of a concentrate.
  • composition of the present invention is stored frozen, it is preferably stored for up to one month, two months, three months, six months, one year, two years, five years, ten years or more. obtain. Thereafter, it is thawed before use (for example, immediately before use (5 minutes or less), 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, overnight, etc.), and optionally diluted to a desired concentration.
  • the step of contacting a target cell or tissue with the composition of the present invention can also be performed temporarily.
  • contacting a target cell, tissue or organ with the composition of the present invention is performed at a culture temperature (or a temperature lower than the culture temperature such as an ambient temperature) for a certain period of time, for example, 30 minutes to several days (7 days). Days), more specifically, 1 hour, 1.5 hours, 2 hours, 2.5 hours, 3 hours, 6 hours, 12 hours (overnight), 18 hours, 24 hours (1 day), 2 days, etc. Can be done during the period.
  • the target cell, tissue or organ may be replaced with a fresh medium not containing the composition of the present invention, or the composition of the present invention may be repeatedly contacted with the target cell, tissue or organ. You may.
  • the sugar to be used and the final concentration thereof are the above-mentioned final concentrations, for example, glucose 40 to 240 mM, sucrose 80 to 200 mM, trehalose 40 to 240 in ex vivo or in vitro (eg, the final concentration in the medium).
  • Concentrations of 200 mM, maltose 40-200 mM, lactose 40-200 mM, 10 mM concentrations of mono- or disaccharides in vivo (eg in blood) can be used.
  • the composition of the present invention can set a shorter period of administration than conventionally used, for example, in the case of in vivo administration, thereby reducing the burden on the patient.
  • composition of the present invention contains a predetermined concentration of sugar.
  • amount of sugar to be administered may be restricted or reduced depending on the health condition of the patient.
  • the compositions of the present invention may be prepared at the point of use before use.
  • the composition of the present invention may be provided in the form of a solution containing a predetermined concentration of sugar.
  • the compositions of the present invention may be provided in a freshly prepared form.
  • Such a form may be, for example, a vial or ampoule containing a recombinant viral vector and a kit containing a vial or ampoule containing a saccharide.
  • the vector and the sugar in these vials or ampoules may be in the form of an aqueous solution or in a form dried by lyophilization or the like.
  • the kit according to the present invention may further include a solution (aqueous medium such as water for injection) for dissolving the recombinant virus vector and the saccharide.
  • the kit according to the present invention is packaged with instructions provided by the manufacturer.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is prepared at the time of use, it can be used immediately before use (5 minutes or less) to 12 hours (one night before), for example, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 1 hour before use. Can be prepared before, 2 hours, 3 hours, 6 hours, 12 hours (overnight). Further, the composition of the present invention may be provided in the form of a concentrate before use (for example, immediately before use (5 minutes or less before) to 12 hours before (overnight), for example, 10 minutes before use, 20 minutes before, 30 minutes before, etc.).
  • the composition of the present invention may contain the sugar at the above concentration or not, for example, for 1 month or less, 2 months, 3 months, 6 months, 1 year, 2 years, 5 years, 10 years Or longer, and then thawed before use (eg, immediately before use (5 minutes or less), 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, etc.), and optionally the final concentration of the desired sugar.
  • the temperature for the preparation as described above may be a temperature lower than or equal to the culture temperature, for example, an ambient temperature (room temperature), or a low temperature that does not freeze the solution of the composition of the present invention.
  • compositions of the invention can be contacted with cultured cells.
  • cultured cells include, but are not limited to, established cultured cells, primary cells collected from a living body, and the like.
  • Cells into which a target gene has been introduced by the composition of the present invention can be used for target uses such as treatment and research.
  • compositions of the present invention may be used in vitro or ex vivo, or in vivo.
  • the composition of the present invention is a pharmaceutical composition, and may be used when culturing cells to be taken out of the living body and returned to the living body, or may be directly administered to the living body.
  • the composition of the present invention may be in the form of a reagent containing, for example, a recombinant virus vector having a reporter gene.
  • compositions of the present invention can be administered in vivo (in vivo) as a pharmaceutical composition.
  • adeno-associated virus has the advantage of being tropic to various target tissues depending on the isolate (type).
  • the composition previously adjusted to the target sugar concentration can be administered to a living body using a dosage form such as an injection or an infusion.
  • the composition of the present invention can also be administered via known administration routes such as peripheral administration, intramuscular administration, intraportal administration, intrathecal administration, and intracerebral administration.
  • the composition of the present invention can be used in surgery for isolating an organ, tissue or a part thereof to be transfected.
  • the blood flow at the site to be introduced e.g., organ, tissue, part of an organ or tissue, etc.
  • Lymph fluid, cerebrospinal fluid and the like are temporarily isolated using a clamp or the like, and replaced with a pharmaceutically available aqueous medium (such as physiological saline), perfused, and flushed.
  • a pharmaceutically available aqueous medium such as physiological saline
  • the gene transfer composition of the present invention can be administered to the isolated site.
  • portal vein blood is temporarily flushed with physiological saline in the liver and an AAV vector is administered thereto (Mimuro et al., Molecular Therapy vol. 21 no. 2 feb. . 2013, 318-323).
  • composition dosage form When the composition of the present invention is used as a pharmaceutical composition, for example, oral, parenteral (intravenous), cerebrospinal fluid, muscle, buccal mucosa, rectum, vagina, transdermal, transnasal, or inhalation It can be administered via the parenteral route, but is preferably administered parenterally. Intravenous administration is more preferred.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention may be used alone or in combination.However, the active ingredient may be provided in the form of a formulation by adding a pharmaceutically acceptable carrier or formulation additive thereto. it can. In this case, the active ingredient of the present invention can be contained in the composition at, for example, 0.1 to 20% by weight, preferably 1 to 5% by weight in the preparation.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention may be used alone or in combination.However, the active ingredient may be provided in the form of a formulation by adding a pharmaceutically acceptable carrier or formulation additive thereto. it can. In this case, the active ingredient of the present invention can be contained in the composition in an amount of, for example, 0.1 to 20% by weight, preferably 1 to 5% by weight in the preparation. Further, as a pharmaceutically acceptable carrier or additive, for example, a diluent, a solubilizer, a solubilizer, an isotonic agent, a pH adjuster, a stabilizer, a dye, and the like can be used.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or additive for example, a diluent, a solubilizer, a solubilizer, an isotonic agent, a pH adjuster, a stabilizer, a dye, and the like can be used.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, injections, suppositories and the like.
  • the components such as the recombinant virus vector and the sugar used in the pharmaceutical composition of the present invention can be added to an aqueous medium (purified water, sterilized purified water, water for injection, physiological saline, etc.), sesame oil or peanut oil.
  • a solution dissolved in an aqueous propylene glycol solution can be used.
  • the aqueous solutions should be suitably buffered (preferably pH 8 or more) if necessary and the liquid diluent first rendered isotonic.
  • physiological saline can be used.
  • the prepared aqueous solutions are suitable for intravenous injection, while the oily solutions are suitable for intra-articular, intramuscular and subcutaneous injection.
  • the production of all these solutions under sterile conditions can be readily achieved by standard pharmaceutical techniques well known to those skilled in the art.
  • formulations suitable for oral administration include, for example, solutions and syrups.
  • high molecular weight polyethylene glycol can be mentioned in addition to lactose (lactose).
  • lactose lactose
  • the active ingredient may be combined with various sweetening or flavoring agents, coloring agents or dyes and, if necessary, emulsifiers and / or suspending agents. And can be used with water, ethanol, propylene glycol, glycerin, and the like, and diluents thereof in combination.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, and may be an appropriate dosage depending on various conditions such as the type of disease, the age and symptoms of the patient, the administration route, the purpose of treatment, and the presence or absence of a concomitant drug. It is possible to choose.
  • the dose of the pharmaceutical composition according to the present invention is, for example, but not limited to, 1 to 5000 mg, preferably 10 to 1000 mg per day for an adult (for example, a body weight of 60 kg). These daily doses may be administered in two to four divided doses.
  • vg vector genome
  • 10 9 to 10 14 vg preferably 10 10 to 10 13 vg, more preferably 10 10 to 10 12 vg per kg of body weight.
  • the dosage can be selected, but not limited to.
  • the unit and amount of the above amount can be changed depending on the virus used.
  • Such dosages can be used in the compositions of the present invention as long as they are known and generally used.
  • compositions of the invention may be in the form of reagents used ex vivo or in vitro on cultured cells.
  • the composition of the present invention may be a basal medium or a concentrated medium as an aqueous medium, in addition to the above-mentioned aqueous medium such as water for injection and physiological saline.
  • the recombinant virus vector of the present invention may contain a known reporter gene such as GFP. Such markers can be used, for example, to select transfected cells ex vivo or in vitro, and to verify transduction status in vivo.
  • the composition of the present invention may be provided in the form of a kit for preparing the composition.
  • the recombinant virus vector used in the present invention is, for example, an empty vector DNA, a helper virus or a helper virus DNA for packaging in the recombinant virus vector.
  • the first polynucleotide is a DNA for a user to incorporate a gene for expression (polynucleotide) of interest, and the second polynucleotide encodes a helper virus. DNA (eg, AdV helper).
  • the kit of the present invention may also further comprise a manufacturer's instructions describing the procedure for a user to prepare a recombinant viral vector using the kit of the present invention.
  • viral vector refers to a vector prepared by genetic recombination, even if not specified.
  • nucleic acid As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “nucleic acid,” “gene,” or “nucleic acid molecule,” and refers to a polymer of nucleotides.
  • nucleotide sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “base sequence” and refers to the sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C and T). As shown.
  • the“ viral genome ” may be in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA) or RNA (eg, mRNA).
  • a viral genome as used herein can be double-stranded or single-stranded DNA or RNA.
  • Single-stranded DNA or RNA may be the coding strand (ie, the sense strand) or the non-coding strand (ie, the antisense strand).
  • rAAV genome when the arrangement on a gene such as a promoter, a target gene, and a polyadenylation signal encoded by the rAAV genome is described, when the rAAV genome is a sense strand, the strand itself is used. Is described for its complementary strand when it is an antisense strand. In the present specification, when apparent from the context, "r" representing recombination may be omitted.
  • polypeptide a polymer of amino acids is intended.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • the partial peptide of the polypeptide of the present invention includes the partial peptide of the polypeptide of the present invention described above, and preferably the polypeptide of the present invention described above. It has the same properties as peptides.
  • the term "plasmid” refers to various known genetic elements, for example, plasmids, phages, transposons, cosmids, chromosomes, and the like. Plasmids are capable of replicating in a particular host and of transferring gene sequences between cells.
  • the plasmid contains various known nucleotides (DNA, RNA, PNA and a mixture thereof), and may be single-stranded or double-stranded, but is preferably double-stranded.
  • the term "rAAV vector plasmid" unless otherwise specified, is intended to include the duplex formed by the rAAV vector genome and its complement.
  • the plasmid used in the present invention may be linear or circular.
  • Both AAV vectors have an expression cassette consisting of the cytomegalovirus promoter (CMV) promoter, cDNA of green fluorescent protein (AcGFP), and SV40 poly (A) inserted between known AAV3A inverted terminal repeats (ITR). .
  • CMV cytomegalovirus promoter
  • AcGFP cDNA of green fluorescent protein
  • A SV40 poly
  • AAV3A GenBank Accession # U48704 (The amino acid sequence of the VP1 protein is shown in SEQ ID NO: 1.)
  • AAV3B GenBank Accession # AF028705.1 (The amino acid sequence of the VP1 protein is shown in SEQ ID NO: 2.)
  • AAV9 GenBank Accession # AY530579.1
  • yf2AAV9 (The amino acid sequence of the VP1 protein is shown in SEQ ID NO: 3.)
  • AAVGT4 (The amino acid sequence of the VP1 protein is shown in SEQ ID NO: 4.)
  • FCS fetal calf serum
  • Glucose 0 to 200 mM Other monosaccharides: 100 mM, 200 mM Sucrose: 0-187 mM Other disaccharides: 100 mM, 125 mM, 150 mM
  • (e) Evaluation of GFP expression The fluorescence intensity of GFP was measured with a plate reader (Biotech Japan) and compared. In addition, an image of a typical visual field was taken with a fluorescence microscope (Olympus IX83).
  • sucrose represented by (+)
  • sucrose increased the expression of GFP by 15.4-fold for AAV3B and 19.6-fold for yf2AAV9.
  • HEK293 cells 5 ⁇ 10 4 cells / well were seeded on a 96-well Optical bottom Plate, and the next day, AAV vector and sucrose were administered by various addition methods. In each case, after culturing in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 3 days, the fluorescence intensity of GFP was measured with a plate reader and compared. All AAV vectors were AAV3B-CMV-AcGFP at 1 ⁇ 10 8 vg / well, and the final concentration of sucrose was 125 mM.
  • sucrose was added immediately after administration of the AAV vector (5 minutes or less), and immediately after the sucrose was previously added to the cells (5 minutes or less), 10 minutes or 1 hour after administration of the AAV vector. It was administered in different ways. The same amount of medium as the sucrose solution was added to the control sucrose (-). In the sucrose-added group, the expression increasing effect of about 10 times was observed by any method (FIG. 4A).
  • sucrose As a second method, the AAV vector and sucrose are mixed in advance, and immediately after mixing (5 minutes or less) and left at room temperature for 1 hour, AAV3B-CMV-AcGFP is 1 ⁇ 10 8 vg / well, and the final concentration of sucrose is The cells were administered to a concentration of 125 mM.
  • Sucrose (-) refers to a mixture of the same amount of medium as the sucrose solution and the AAV vector and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After 3 days, the expression level of GPF was measured in the same manner as described above.
  • the expression enhancing effect of 12 times or more was obtained both immediately and 1 hour after administration (FIG.
  • sucrose (+) medium or a (-) medium was added immediately after administration of 1 ⁇ 10 8 vg / well of the AAV3B-CMV-AcGFP vector (5 minutes or less), and 3 hours later, 125 mM sucrose was added. The whole medium was replaced with the (+) medium or the (-) medium. After 3 days, the expression level of GPF was measured in the same manner as described above. As a result of these experiments, the effect of sucrose was 4.9-fold when sucrose was present immediately after AAV administration, but 2.8-fold when sucrose was added 3 hours after AAV infection was considered complete. The effect was obtained (FIG. 4C).
  • Experiment 5 Effect of enhancing expression by D-glucose and L-glucose L -glucose (Sigma) which is not found in nature and is not used by cells (not taken up by glycolysis), or D-glucose which is usually present in AAV3B
  • the cells were administered to the cells such that the AAV was 1 ⁇ 10 8 vg / well and the final concentration of each glucose was 132 mM.
  • the fluorescence intensity of GFP was measured with a plate reader and compared.
  • the cells were used the day after HEK293 cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well on a 96-well Optical bottom Plate.
  • the expression was enhanced about 17-fold by the addition of D-glucose, while the addition of L-glucose was observed to be 11-fold.
  • the reason for this is presumed that the metabolism of the cells was not activated by the mixed sugar, but the sugar was involved in the infection of the AAV vector itself (FIG. 5A).
  • the difference in expression intensity (D / L) between the D-form and the L-form was 1.5-fold after 1 day, but spread 2.1-fold after 3 days. It is speculated that the expression may also be enhanced (FIG. 5B).
  • the fluorescence intensity of GFP was measured with a plate reader and compared.
  • the cells were used the day after HEK293 cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well on a 96-well Optical bottom Plate.
  • a sucrose concentration of 80 mM in the medium showed a 5-fold or more enhancement effect.
  • the effect increased in a concentration-dependent manner, and a potentiating effect of about 30 times was observed at 145, 150, and 160 mM.
  • the optimal concentration after 3 days was 150 mM (FIG. 6).
  • the sucrose concentration was further increased to 187 mM, the cells were damaged and detached, and the GFP intensity was drastically reduced to about 20% (data not shown).
  • Experiment 7 Difference in expression enhancing effect depending on glucose concentration in medium AAV3B-CMV-AcGFP and various concentrations of glucose were mixed in advance, allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then administered to cells.
  • the final dose of AAV is 1 ⁇ 10 8 vg / well and the final concentration of glucose is between 40 mM and 200 mM.
  • Glucose (-) was mixed with the same amount of medium as the glucose solution.
  • the medium was replaced with a glucose solution of the same concentration adjusted with the medium 3 hours after administration. After culturing at 37 ° C.
  • Experiment 8 AAV expression enhancing effect of disaccharide HEK293 cells 5 ⁇ 10 4 cells / well were seeded on a 96-well Optical bottom plate, the next day, four disaccharides, sucrose, trehalose, maltose, lactose (all except sucrose, Sigma), After replacing the medium with a medium containing 100, 125, and 150 mM, AAV3B-CMV-AcGFP was administered at 1 ⁇ 10 8 vg / well. As a control, the same amount of medium as the sugar solution was added. After culturing at 37 ° C.
  • composition of the present invention can greatly improve the efficiency of gene transfer by a recombinant virus vector.
  • the composition of the present invention can be expected to be used as a drug for gene therapy.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of AAV3A VP1 protein
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of AAV3B VP1 protein
  • SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of yf2AAV9 VP1 protein (Y446F / Y731F mutant)
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of AAV GT4 VP1 protein

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Abstract

本発明は、組換えウイルスベクターを含む遺伝子導入用組成物に関し、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入効率を向上させる遺伝子導入用組成物を提供する。具体的には、目的の発現用遺伝子を含む組換えウイルスベクターおよび少なくとも40mMの濃度の糖を含む遺伝子導入用組成物を提供する。好ましくはウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。本発明の組成物を用いると、ウイルスベクターを用いる場合の遺伝子導入効率を約50倍以上に向上させることができる。

Description

ＡＡＶベクターによる遺伝子発現を増強する方法
　本発明は、組換えウイルスベクターを含む遺伝子導入用組成物に関する。より詳細には、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクター及び糖を含む遺伝子導入用組成物に関する。
　近年、ウイルスベクターを使用して外来遺伝子を細胞に導入されている。哺乳動物細胞に対して利用されるウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（レンチウイルス等）、ヘルペスウイルスなどが挙げられる。これらウイルスベクターは、疾患治療用のウイルスベクターとしても利用され、研究されている（非特許文献１）。
　アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus: AAV)を応用した遺伝子導入用ベクターは、神経細胞、肝細胞（肝実質細胞）、網膜細胞、筋肉細胞、心筋細胞、血管内細胞、脂肪細胞などの細胞に遺伝子を導入し、長期間発現させることができる。そのため、パーキンソン病、血友病、網膜色素変性症などの遺伝子治療用ベクターとして臨床応用が進んでいる（特許文献１～４、非特許文献2～4）。さらに、遺伝子編集におけるsgRNAとCAS9蛋白質の遺伝子導入や、光遺伝学（optogenetics）におけるチャネルロドプシンなどの光感受性蛋白質の遺伝子導入のベクターとして頻用されている（非特許文献5、6）。また、導入効率や遺伝子発現の向上のために、ゲノム構造の改変、キャプシド蛋白質への変異導入、プロモーターの置換などが行われている（非特許文献7、8、9）。しかし、多くの場合、有効な遺伝子発現を得るためには、例えばrAAVベクターの場合、細胞あたり104個のベクターゲノム (vgと略、コピー数と同義)以上のrAAVベクターの感染が必要であり、しばしば非効率的であり、大量のベクターの精製が必要となる。
国際公開第2003/018821号 国際公開第2003/053476号 国際公開第2007/001010号 国際公開第2012/057363号
谷 憲三朗、「2 日本の遺伝子治療」、遺伝子医学MOOK 30、38～49頁、2016年6月20日発行 Dunber CE et al.: Science. 359: eaan4672, 2018 村松慎一：「パーキンソン病の遺伝子治療」 日本臨床75:146-150, 2017 Hastie E, Samulski RJ:  Hum Gene Ther 26:257-265, 2015 Ohmori T et al.: Sci Rep. 7:4159. 2017 Prakash R et al.: Nat Methods. 9:1171-1179, 2012 McCarty DM, et al.: Gene Ther. 8:1248-1254, 2001 Ling C, et al.: Hum Gene Ther Methods. 27:143-149, 2016 Chen SJ, et al.: Hum Gene Ther Methods. 24:270-278, 2013
　そこで、組換えウイルスベクターとしてrAAVベクターを用いる場合に、より効率よく目的の遺伝子発現を実現するための組成物および手段を提供することが望まれている。
　本発明者らは、様々な試行錯誤の上、組換えウイルスベクターとしてrAAVベクターを含む遺伝子導入用組成物において、より高濃度の糖を含めることにより、種々の標的細胞（例えば、肝細胞、神経細胞など）により効率よく遺伝子導入できる組換えウイルスベクター含有組成物を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、組換えウイルスベクター、糖および水性媒体を含む遺伝子導入用組成物等を提供する。具体的には、以下の遺伝子導入用組成物、キットおよび方法を提供する。
[1] 目的の発現用遺伝子を含む組換えウイルスベクター、少なくとも40 mMの糖、および水性媒体を含む、遺伝子導入用組成物。
[2] 前記組換えウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、上記[1]に記載の組成物。
[3] 前記組換えウイルスベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV-B1、AAV-PHP.B、またはAAV-PHP.eBに由来する、上記[1]または[2]に記載の組成物。
[4] 前記組換えウイルスベクターが、配列番号１～４に記載のアミノ酸配列、または配列番号１～４に記載のアミノ酸配列と約90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含むカプシドを含む、上記[1]～[3]のいずれか１項に記載の組成物。
[5] 前記組成物が0.04～2 Mの濃度の糖を含む、上記[1]～[4]のいずれか１項に記載の組成物。
[6] 前記糖が、単糖、二糖またはその組合せを含む、上記[1]～[5]のいずれか１項に記載の組成物。
[7] 前記単糖が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、およびその組合せから選択される少なくとも１種を含む、上記[1]～[6]のいずれか１項に記載の組成物。
[8] 前記単糖がＤ体を60％以上含む、上記[1]～[7]のいずれか１項に記載の組成物。
[9] 前記二糖が、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１種を含む、上記[1]～[8]のいずれか１項に記載の組成物。
[10] 前記水性媒体が注射用水である、上記[1]～[9]のいずれか１項に記載の組成物。
[11] 注射剤または注入剤の形態の医薬である、上記[1]～[10]のいずれか１項に記載の組成物。
[12] エキソビボまたはインビトロで使用される薬剤である、上記[1]～[11]のいずれか１項に記載の組成物。
[13] 前記組成物が、凍結保存されて使用前に解凍される、上記[1]～[12]のいずれか１項に記載の組成物。
[14] 組換えウイルスベクター、および糖を含む、上記[1]～[13]のいずれか１項に記載の組成物を調製するためのキット。
[15] (a) 組換えウイルスおよび40 mM以上の濃度の糖を含む組成物を提供する工程、および(b) 糖を終濃度10～250 mM含む培地中で、前記組成物を培養細胞と接触させる工程を含む、遺伝子導入方法。
[16] (a) 組換えウイルスを含み、糖を含むまたは含まない遺伝子導入用組成物を提供する工程、(b) 前記遺伝子導入用組成物を培養細胞と接触させる工程、および(c) 前記工程(b)の直後～72時間後に糖を10～250 mM含む培地中で培養する工程を含む、遺伝子導入方法。
[17] 前記培養細胞が生体より採取された細胞または樹立された細胞である、上記[15]または[16]に記載の方法。
[18] 遺伝子導入対象の臓器、組織またはその一部を隔離する手術において使用するための、上記[1]～[13]のいずれか１項に記載の遺伝子導入用組成物。
　本発明に係る、組換えウイルスベクター、糖および水性媒体を含む遺伝子導入用組成物を用いることにより、種々の標的細胞（例えば、肝細胞、神経細胞など）により効率よく遺伝子導入できる。具体的には、本発明に係る、組換えウイルスベクターとしてAAVベクター、高濃度の糖および水性媒体を含む遺伝子導入用組成物を用いることにより、対照と比較して約50倍以上の発現増強効果を得ることを確認した。
図１Ａは、スクロースの有無によるrAAVのインビトロでの感染の結果を示す。感染１日後の細胞のGFP発現を測定した。 図１Ｂは、図１Ａの実験結果の細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。 図２Ａは、スクロース、マンニトール、またはグルコースの添加によるrAAVのインビトロでの感染の結果を示す。 図２Ｂは、図２Ａの実験結果の細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。 図３は、スクロース添加による、rAAVのインビトロでの感染の結果を示す。 図４Ａは、ウイルス溶液とスクロースとを混合して、直後、10分後、または１時間後にインビトロで感染させた結果を示す。 図４Ｂは、ウイルス溶液とスクロースとを混合して、直後、または１時間後にインビトロで感染させた1日後の結果を示す。 図４Ｃは、スクロースを含まないウイルス溶液による感染を3時間行い、その後にスクロースを含む培地に交換した場合の結果を示す。 図５Ａは、D-グルコースまたはL-グルコースを用いた場合のrAAVのインビトロでの感染の結果を示す。 図５Ｂは、図５Ａの実験の1日後、2日後及び3日後の結果を示す。 図６は、様々な濃度のスクロースを用いた、インビトロでのrAAVの感染の結果を示す。 図７は、様々な濃度のグルコースを用いた、インビトロでのrAAVの感染の結果を示す。 図８Ａは、種々の濃度のスクロース、トレハロース、マルトース、およびラクトースをそれぞれ用いた場合の、インビトロでのrAAVの感染の結果を示す。 図８Ｂは、図８Ａで糖濃度150 mMを用いた3日後の細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。 図８Ｃは、図８Ａの実験の1日後、2日後、3日後及び6日後の結果を示す。 図９Ａは、ガラクトース、フルクトース、マンノース、およびグルコースをそれぞれ用いた場合の、インビトロでのrAAVの感染の結果を示す。 図９Ｂは、図９Ａで糖濃度200 mMを用いた3日後の細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
　本発明は、目的の発現用遺伝子を含む組換えウイルスベクター、40 mM以上の濃度の糖、および水性媒体を含む遺伝子導入用組成物を提供する。この組換えウイルスベクターは、好ましくは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターから選択され得るがこれらに限定されない。
１．本発明の組成物に用いるウイルスベクターについて
　本発明の遺伝子導入用組成物（以下、「本発明の組成物」ともいう）に用いる組換えウイルスベクターは、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞に感染する公知ウイルスベクターを含むことができる。
　本発明の組成物に用いることができるウイルスベクターとしては、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含む）、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ボルナウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明に用いる組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターであり、より好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターである。
１．１．アデノ随伴ウイルスベクター
　天然のアデノ随伴ウイルス（AAV）は、非病原性ウイルスであること、およびアデノ随伴ウイルスベクター内に含まれるウイルスゲノムが感染した宿主細胞の核内のエピゾームに長期間、存在することを特徴とする。これらの特徴を利用して、種々の組換ウイルスベクターを作製して、遺伝子治療のために所望の遺伝子を送達することが行われている（例えば、WO2003/018821、WO2003/053476、WO2007/001010、薬学雑誌 126(11)1021-1028などを参照のこと）。
　公知のアデノ随伴ウイルス（AAV）には、多数の分離株（型）が存在する。アデノ随伴ウイルスは、標的とする臓器に対する特異性または指向性を有することが公知である。例えば、肝臓への指向性を示すアデノ随伴ウイルスとして、2型、3型（3A及び3Bを含む）、8型などが挙げられる（WO 2012/057363、WO 2008/124724など）。また、神経細胞への指向性を示すものとしては、1型、2型、9型、rh10、rh39、rh43、B-1、PHP.B、PHP.eBなどが挙げられる（例えば、下記文献10～13）。しかしながら、本発明において治療用ウイルスベクターとして用いるアデノ随伴ウイルスはこれらの分離株に限定されるものではなく、当該分野で公知の分離株や改変体を利用することも可能である。
　　　文献10. Sorrentino NC, et al.: Mol Ther. 24:276-286, 2016.
　　　文献11. Choudhury SR, et al.: Mol Ther. 24:1247-1257, 2016.
　　　文献12. Chan KY, et al.: Nat Neurosci. 20:1172-1179, 2017.
　　　文献13. Iida A, et al.: Biomed Res Int. 2013:974-819, 2013.
　野生型AAVゲノムは、全長が約5kbのヌクレオチド長を有する一本鎖DNA分子であり、センス鎖またはアンチセンス鎖である。AAVゲノムは、一般に、ゲノムの５'側および３'側の両末端に約145ヌクレオチド長のインバーテッドターミナルリピート（ITR）配列を有する。このITRは、AAVゲノムの複製起点としての機能及びこのゲノムのウイルス粒子内へのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有することが知られている（例えば、薬学雑誌 126(11)1021-1028など）。ITRに挟まれた野生型AAVゲノムの内部領域（以下、内部領域）は、AAV複製（rep）遺伝子及びカプシド（cap）遺伝子を含む。これらrep遺伝子及びcap遺伝子は、それぞれ、ウイルスの複製に関与するタンパク質Rep及び正20面体構造の外殻であるキャプソメアを形成するカプシドタンパク質（例えば、VP1、VP2及びVP3の少なくとも１つ）をコードする。さらなる詳細については、例えば、Human Gene Therapy, 13, pp.345-354, 2002、Neuronal Development 45, pp.92-103, 2001、実験医学 20,pp.1296-1300, 2002、薬学雑誌 126(11)1021-1028、Hum Gene Ther,16,541-550, 2005などを参照のこと。
　本発明で用いるrAAVベクターは、天然のアデノ随伴ウイルス１型（AAV1）、２型（AAV2）、３型（AAV3a/AAV3b）、４型（AAV4）、５型（AAV5）、６型（AAV6）、７型（AAV7）、８型（AAV8）、９型（AAV9）、rh10型（rhAAV10：Hu,Cら、Molecular Therapy vol.22,no.10, Oct.2014, 1792-1802）に由来するベクターであるが、これに限定されない。これらのアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、GenBank登録番号：AF063497.1（AAV1）、AF043303（AAV2）、NC_001729(AAV3)、U48704(AAV3A)、AF028705.1(AAV3B)、NC_001829.1（AAV4）、NC_006152.1（AAV5）、AF028704.1（AAV6）、NC_006260.1（AAV7）、NC_006261.1（AAV8）、AY530579.1（AAV9）、AY631965(AAV10)などのヌクレオチド配列を参照できる。
　本発明において、組換えウイルスベクターが含むタンパク質は、配列番号１～４に記載のアミノ酸配列、または配列番号１～４に記載のアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは85％以上、約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、生理条件下でウイルスベクターを形成するか、またはウイルスベクターのカプシド（外殻）を形成するタンパク質である。
１．２．アデノウイルスベクター
　アデノウイルスを用いた遺伝子治療用ベクター（以下、組換えアデノウイルスベクターともいう）は、これまでの医薬の治験において最も利用されたベクターといえる（特表平08-501686、特表平10-506542、非特許文献１、下記の文献14、15）。また、実用化されたものとして、ヒトのがん抑制遺伝子p53が組み込まれた組換えアデノウイルスベクターが、遺伝子治療薬として2003年に世界で初めて認可され、商品名「Gendicin（ゲンディシン）」として販売されている。組換えアデノウイルスベクターは、宿主範囲（対象となる動物種、細胞腫など）が広いことが公知である。また、アデノウイルスの遺伝子は標的細胞の細胞核内で染色体に組み込まれずに独立して存在するので、この特徴によって組換アデノウイルスベクターは目的遺伝子を一過性に発現できる。具体的には、生体に投与した組換えアデノウイルスベクターは、通常1～2週間で目的遺伝子の発現が消失し得る。組換えアデノウイルスベクターの欠点としては、生体において免疫原性が高いことが挙げられる。
　　　　　文献14. Yokoda RT, et al.: Biomedicines. 6:33, 2018.
　　　　　文献15. Zhang C and Zhou D: Hum Vaccin Immunother. 12:2064-2074, 2016.
　アデノウイルスのゲノムは約36kbの直鎖二本鎖DNA分子であり、このゲノムには、ウイルス複製に必要な初期遺伝子、後期構造遺伝子を含む約30以上の遺伝子がコードされている。また、アデノウイルスの外殻はカプシドタンパク質からなるカプシドが露出した状態であり、この点はアデノ随伴ウイルスの外殻と類似している。
　アデノウイルスの初期遺伝子は、アデノウイルスゲノム中の4つの領域に分けられる（E1‐E4：Eは初期を表す）。それらは6つの転写単位を含み、それら自体のプロモーターを有している。後期遺伝子（L1‐L5：Lは後期を表す）は初期転写単位と部分的に重複しており、ほとんどの部分について主要後期プロモーター（MLP）から転写される。
　アデノウイルスを利用した組換えウイルスベクターのさらなる詳細としては、例えば、上記文献14、15などを参照できる。
１．３．レトロウイルスベクター
　本明細書中で使用される場合、レトロウイルスベクターは、ガンマレトロウイルスベクター（またはオンコウイルスベクター）およびレンチウイルスベクターを含むことが意図される。ガンマレトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)に由来するベクターが挙げられる。また、レンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス１型(HIV 1)、サル免疫不全ウイルス(SIV)に由来するベクターが挙げられる。
　レトロウイルスベクターは、目的の導入用ポリヌクレオチドを標的細胞の染色体中に高効率で組み込むことによって、永続的に目的のポリヌクレオチドを発現させることができる。一方、このレトロウイルスベクターは、元々が白血病、免疫不全症候群などの疾患原因ウイルスに由来するため、悪性新生物などの原因となる可能性も指摘されている。導入可能な遺伝子のサイズとしては、例えば、9kb以下のものが挙げられる（土肥ら,ウイルス,第65巻,第1号,pp27-36,2015、Vargas JE, et al.: J Transl Med. 14:288, 2016、Poletti V and Mavilio F: Mol Ther Methods Clin Dev. 8:31-41, 2017）。
　レトロウイルスは、ウイルスの外殻としてエンベロープタンパク質及びエンベロープ膜を有する。また、レトロウイルスはRNAをゲノムとする場合が多く、このゲノムがコードする遺伝子には、ウイルスの構造タンパク質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼなどになる前駆蛋白をコードするgag/pol遺伝子、エンベロープ糖タンパク質をコードするenv遺伝子が含まれる。ウイルスゲノムの両端は、LTR (long terminal repeat）で挟まれており、このLTRには、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニレーションシグナルなどが含まれる。
　レトロウイルスベクターのさらなる特徴や性質などについては、例えば以下の文献も参照できる：Mannら、Cell 33：153-159(1983)、Cone and Mulligan，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 81: 6349-6353(1984)、Vargas JE, et al.: J Transl Med. 14:288, 2016、Poletti V and Mavilio F: Mol Ther Methods Clin Dev. 8:31-41, 2017。
１．４．目的の発現用遺伝子について
　本発明に用いる組換えウイルスベクターは、標的細胞に導入するための目的の発現用遺伝子（ポリヌクレオチド）を、ウイルスベクター内に収容される組換えウイルスゲノム中に含み得る。このような導入される目的の発現用遺伝子としては、遺伝子自体が機能を有する配列、転写物が機能する配列、タンパク質に翻訳されて機能する配列、及びこれら配列の組合せを含む遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、本発明に用いる組換えウイルスベクターが有する目的の発現用遺伝子は、遺伝子サイズなどを考慮して、組換えウイルスベクターに搭載可能なものであれば特には制限されない。
　本発明に用いる組換えウイルスベクターに含まれる目的の発現用遺伝子としては、遺伝子自体で機能する配列ものの例としては、プロモーター配列、テロメア配列、ポリアデニル化シグナル配列、目的のタンパク質結合配列などが挙げられる。
　本発明に用いる組換えベクターに含まれる、転写物が機能する配列の例としては、アンチセンス分子、リボザイム、干渉性RNA（iRNA）、マイクロRNA(miRNA)のような、標的とする内在性遺伝子の機能を変化（例えば、破壊、低下）させるためのポリヌクレオチド、または内在性タンパク質の発現レベルを変化（例えば、低下）させるためのポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。二重鎖RNA(dsRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.等参照）。
　本発明に用いる組換えベクターに含まれる、タンパク質に翻訳されるための配列の例としては、増殖因子、栄養因子、サイトカイン、抗原、抗体、癌抑制因子、代謝酵素、自殺遺伝子、受容体、トランスポーター、増殖阻害因子、ゲノム編集及び修復手段などのタンパク質をコードする配列、及びこれら配列の組合せなどが挙げられる。さらに、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの公知のレポーター遺伝子を含む発現カセットであってもよい。
　本発明に用いる組換えウイルスベクターは、上記の目的の発現用遺伝子を有する複数のベクターを含んでもよい。また、本発明に用いる組換えウイルスベクターはまた、１種のベクター中に目的の発現用遺伝子を複数種含んでもよい。
　本発明の組換えウイルスベクターによって導入される目的の発現用遺伝子の例としては、肝細胞増殖因子（HGF）、神経細胞増殖因子（NGF）、ヘモグロビン、インターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-6、インターロイキン-7、インターロイキン-8、インターロイキン-9、インターロイキン-10、インターロイキン-11、GM-CSF，G-CSF，M-CSF、ヒト成長因子、インスリン、第VIII因子、第IX因子、tPA，LDL受容体、腫瘍壊死因子（TNF）、PDGF、EGF、NGF、IL－1ra、EPO、β-グロビン、ゲノム上の特定の部位を切断するための酵素（例えば、TALEN、CRISPR、およびZFN）などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組換えウイルスベクターによって導入される目的のポリヌクレオチドは、標的の細胞、組織または患者に対して異種由来のものであっても同種由来のものであってもよい。
　本発明において使用可能なプロモーター配列は、上記の目的の発現用遺伝子を標的の細胞内で発現可能であれば特には限定されない。
　例えば、本発明において汎用的な哺乳動物由来のプロモーターやウイルス由来のプロモーターを使用できる。このようなプロモーターとしては、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１－αプロモーター、β－グロビンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＭＬＶ－ＬＴＲプロモーター、およびＨＩＶ－ＬＴＲプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
　また、本発明において、標的細胞に特異的なプロモーターを使用できる。標的細胞が神経系の細胞である場合、例えば、シナプシンIプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム/カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼII(CMKII)プロモーター配列、チュブリンαIプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーター配列、L7プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グリア線維酸性タンパク質(hGfa2)プロモーター配列、グルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）配列、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD65/GAD67）プロモーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において標的細胞が肝細胞である場合、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBP）のプロモーター、アルブミンプロモーター、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモータ、合成プロモーター（HCRhAATプロモーター、WO2018/131551などに記載のもの）が挙げられるが、これらに限定されない。
　これらのプロモーター配列は、標的細胞においてプロモーター機能を保持する限り、本発明において用いるために適宜改変され得る。
１．５．対象疾患について
　本発明の組成物を医薬として用いる治療方法としては、遺伝子治療、癌ウイルス療法、ウイルス免疫療法などが挙げられる。遺伝子治療では、先天性の遺伝子疾患、加齢に伴う機能低下に起因する疾患などについて研究されている。癌ウイルス療法としては、癌細胞を標的として、溶解、アポトーシスなどを誘発させるウイルスが研究されている。また、ウイルス免疫療法としては、例えば、CART療法など、対象疾患の治療に有利な免疫応答を誘発させるためのウイルスを用いる治療法が研究されている。
　ウイルスベクターを用いた治療の対象疾患の例としては、具体的には、先天性遺伝子疾患、例えばアデノシンアミナーゼ欠損症（ADA-SCID）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（X-SCID）、慢性肉芽腫症（CGD）、βサラセミア、レーバー先天性黒内障（LCA）、副腎白質ジストロフィー（ALD）などが挙げられる。癌ウイルス療法の対象の癌の例としては、肺がん、腎がん、前立腺がん、食道がん、脳腫瘍、黒色腫などが挙げられる。その他の疾患の例として、閉塞性動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、ALS、HIV、肝炎、加齢黄斑変性、糖尿病、関節リウマチなどが研究されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、Piguet F et al.: Hum Gene Ther. 28:988-1003, 2017）。
２．糖
　本発明の組成物は、上記の組換えウイルスベクターと一緒に糖を含むことを特徴とする。本明細書中、「糖」は「糖類」と記載される場合もある。
　本発明の組成物において使用可能な糖は、医薬品分野で利用可能であることが公知の糖である。好ましくは、本発明に使用する糖は、注射剤または注入剤において使用可能なものである。このような糖としては、単糖（トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソースを含む）および二糖のものが挙げられる。
　本発明の組成物に使用する糖としては、好ましくは、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の組成物に使用する糖は、立体異性体を含み得る。例えば、本発明の組成物は、含まれる各々の糖（単糖）の構造は、Ｄ体であっても、Ｌ体であっても、その混合物であってもよい。本発明の組成物が含む単糖は、好ましくは、約60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、または95％以上がＤ体であり得る。
　本発明の組成物に使用する単糖は、環状の構造であっても直鎖状の構造であってもよい。例示の環状の構造としては、6員環であるピラノース型、5員環であるフラノース型が挙げられる。これらの環構造は、1位の炭素原子（C1）に結合した水酸基の位置に依存して、α体またはβ体の形状を有する。本発明の組成物に使用する単糖は、α体であってもβ体であっても、その混合物であってもよい。本明細書中、単糖の環構造は、特に示されない場合、α体、β体、及びこれらの組合せを含む。
　また、本発明の組成物は、医薬品として使用可能である公知の糖アルコールを含んでもよい。好ましい糖アルコールとしては、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、及びこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の組成物は、医薬品として使用可能である公知の糖修飾物を含み得る。このような糖修飾物を得るための修飾には、アセチル化、Ｎ－アセチルグルコサミン化、Ｎ－アセチルガラクトサミン化、シアル酸化、グルクロン酸化、イズロン酸化、リン酸化、硫酸化、リボシル化など、医薬品に付される公知の修飾が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の組成物に用いられる好ましい糖への修飾としては、Ｎ－アセチルグルコサミン化、Ｎ－アセチルガラクトサミン化、シアル酸化、グルクロン酸化、イズロン酸化、及びこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の組成物は、少なくとも40 mMの糖を含む水溶液の形態であり得る。この濃度40 mMは、単糖であれば約0.7％、二糖であれば約1.4％の水溶液に相当する。例えば、本発明の組成物中の糖の濃度は、下限値としてグルコース 40 mM、スクロース 80 mM、トレハロース 40 mM、マルトース 40 mM、ラクトース 40 mM、またはそれ以上、上限値として、組成物中含まれる単糖若しくは二糖の水溶液飽和濃度、グルコース 240 mM、スクロース 200 mM、トレハロース 200 mM、マルトース 200 mM、ラクトース 200 mM、またはそれ以下の濃度の範囲（但し、下限値＜上限値を満たす組合せ）である。例えば、本発明の組成物は、単糖または二糖を、グルコース 200 mM、スクロース 160 mM、レハロース 160 mM、マルトース 160 mM、ラクトース160 mM、の濃度で含み得る。
　上記の糖は、２種以上の糖を組み合わせてもよい。例えば、グルコースとスクロースとの組合せ、スクロースとマルトースとの組合せ、グルコースとスクロースとマルトースとの組合せ、スクロースとマルトースとの組合せなどが挙げられる。この場合、糖濃度は、例えば、各々の糖の下限～上限の濃度、各々の糖の合計濃度について１種の糖に対する下限～上限濃度などを、目的の遺伝子導入のために好適な濃度を用いることができる。
　一般に、真核細胞、特に哺乳動物細胞の培養に用いられる基礎培地の場合、糖の濃度は1～4.5 g/Lとされる。この濃度は、グルコース換算で約6～25 mMに相当する。本発明の組成物を用いる場合、エキソビボまたはインビトロでの遺伝子導入において、糖の終濃度として、例えば、グルコース 40～240 mM、スクロース 80～200 mM、トレハロース 40～200 mM、マルトース 40～200 mM、ラクトース 40～200 mMの濃度を用いることができる。これらの糖は、上記のとおり２種以上の糖を組み合わせてもよい。
　本発明の組成物に関して、エキソビボまたはインビトロでの遺伝子導入の場合の糖の終濃度は、使用する培地量に応じて適宜計算できる。
　生体の血糖値について、通常のヒトの場合、下限は80～100 mg/dL（例えば、食間または絶食時）、上限は150～160 mg/dL(例えば、食後)であり、これらを併せると、血糖値は5.0～8.5 mMの狭い範囲にあるとされる。本発明の組成物を用いる場合、インビボ（生体内）では、各糖の終濃度が10 mM以下になるように調整することができる。これらの糖は、上記のとおり２種以上の糖を組み合わせてもよい。
　本発明の組成物に関して、インビボでの遺伝子導入の場合の糖の終濃度は、投与する対象患者の体重、水分量、血液量、遺伝子導入対象となる組織の体積、血液、組織液（例えば髄液）などを考慮して計算することができる。このような計算の際、例えば、体重60kgのヒト成人の場合、水分量としては約60%、血液量としては約8％（約5L）など、公知の量を使用できる。
　場合により、本発明の遺伝子導入組成物中の組換えウイルスベクター及び糖の局所濃度を上昇させることを目的とする術式を使用できる。例えば、遺伝子導入対象となる特定の臓器、組織またはその一部を生体から隔離して、一時的により高濃度の糖と接触させることができる。より具体的には、遺伝子導入対象の部位(例えば、臓器、組織またはその一部)の血流、リンパ液、髄液等を、クランプ等を用いて一時的に停止（隔離）させ、医薬学的に利用可能な水性媒体（生理食塩水等）で置換、潅流、フラッシュさせ、次いで、フラッシュさせた部位に対して本発明の組成物を投与することができる。このような手術の具体例として、肝臓において門脈血を生理食塩水で一時的にフラッシュして、そこにAAVベクターを投与する方法が知られている（Mimuroら、Molecular Therapy vol.21 no.2 feb. 2013, 318-323）。この場合の糖の終濃度としては、例えば50～100 mM、60～90 mM、70～80 mMなどの濃度が挙げられるが、これらに限定されない。
　さらに、本発明の組成物は、髄腔内投与において使用する場合、髄液の媒体量（例えば、成人で約150mL）を考慮して、血中濃度よりも高い終濃度を使用し得る。この場合の糖の終濃度としては、例えば50～100 mM、60～90 mM、70～80 mMなどの濃度が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の組成物に含まれる糖は、使用直前（通常、5分以下）～使用する１日前等の期間、例えば、10分前、20分前、30分前、1時間前、2時間前、3時間前、4時間前、5時間前、6時間前、12時間前（1晩前）、または1日前に、所望される濃度で組換えウイルスベクターと組み合わされてもよい。このように本発明の組成物が使用前に調製される場合、本発明の組成物中の糖濃度は、例えば、グルコース 40～240 mM、スクロース 80～200 mM、トレハロース 40～200 mM、マルトース 40～200 mM、ラクトース 40～200 mMの濃度の糖を含むように調製され得る。これらの濃度は、上記の終濃度を考慮した分量で使用され得る。
　また、本発明の組成物は、濃縮物の形態で提供されたものを、使用前（例えば、使用直前（5分前以下）、10分前、20分前、30分前など）に希釈して用いてもよい。
　あるいは、本発明の組成物は、上記の濃度の糖を含む状態で凍結保存されてもよい。凍結保存される場合、濃縮物の形態であっても濃縮物の形態でなくてもよい。本発明の組成物は、凍結保存される場合、好ましくは、1月以下の間、2月間、3月間、6月間、1年間、2年間、5年間、10年間またはそれ以上の間、保存され得る。その後、使用前（例えば、使用直前（5分前以下）、10分前、20分前、30分前、１晩前など）に解凍され、場合により目的の濃度に希釈される。
　標的の細胞または組織と本発明の組成物とを接触させる工程を一時的に行うこともできる。例えば、標的の細胞、組織または臓器と本発明の組成物との接触を、培養温度（または、周囲温度など培養温度よりも低い温度）において、一定時間の間、例えば30分～数日（7日）の間、より具体的には、１時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、6時間、12時間（一晩）、18時間、24時間（1日）、2日などの期間の間、行うことができる。その後、標的の細胞、組織または臓器は、本発明の組成物を含まない新鮮な培地と交換されてもよいし、新たに本発明の組成物と標的の細胞、組織または臓器とを繰り返し接触させてもよい。
　この操作において、使用する糖及びその終濃度としては、上記の終濃度、例えば、エキソビボやインビトロ（例えば、培地中の終濃度）でのグルコース 40～240 mM、スクロース 80～200 mM、トレハロース 40～200 mM、マルトース 40～200 mM、ラクトース 40～200 mMの濃度、インビボ（例えば血中）での単糖または二糖の10 mMの濃度、を用いることができる。
　本発明の組成物は、例えばインビボへの投与の場合に従来使用される投与期間よりも短い期間を設定でき、これによって患者の負担を軽減できる。
３．本発明の組成物のその他の特徴
３．１．用時調製について
　本発明の組成物は、所定の濃度の糖を含む。実際に医薬組成物として利用する場合、患者の健康状態に応じて投与する糖を制限または低減させたい場合が想定される。そのような場合、本発明の組成物を使用前の用時に調製され得る。
　１実施態様において、本発明の組成物は、所定の濃度の糖を含む溶液形態で提供され得る。別の実施態様において、本発明の組成物は、用時調製される形態で提供され得る。そのような形態としては、例えば、組換えウイルスベクターを含むバイアルまたはアンプル、および糖を含むバイアルまたはアンプルを含むキットの形態であり得る。これらのバイアルまたはアンプル中のベクターおよび糖は、水溶液の形態であっても、凍結乾燥などによって乾燥された形態であってもよい。さらに、本発明に係るキットは、組換えウイルスベクターおよび糖を溶解させるための溶液（注射用水などの水性媒体）をさらに含んでもよい。さらに、本発明に係るキットは、製造業者より提供される指示書と共にパッケージングされる。
　本発明の組成物は、用時調製される場合、使用する直前（5分前以下）～12時間前（1晩前）の間、例えば10分前、20分前、30分前、1時間前、2時間前、3時間前、6時間前、12時間前（1晩前）に調製することができる。
　また、本発明の組成物は、濃縮物の形態で提供されたものを、使用前（例えば、使用直前（5分前以下）～12時間前（1晩前）の間、例えば10分前、20分前、30分前など）に希釈して用いてもよい。
　あるいは、本発明の組成物は、上記の濃度の糖を含む状態または含まない状態で、例えば1月以下の間、2月間、3月間、6月間、1年間、2年間、5年間、10年間またはそれ以上の間、凍結保存されて、使用前（例えば、使用直前（5分前以下）、10分前、20分前、30分前など）に解凍され、場合により目的の終濃度の糖を含む組成物に希釈され得る。
　上記のように調製する場合の温度としては、培養温度以下の温度、例えば周囲温度（室温）であってもよいし、本発明の組成物の溶液が凍結しない程度の低温であってもよい。
３．２．インビボ、エキソビボまたはインビトロでの使用
　本発明の組成物は、培養細胞と接触させることができる。このような細胞としては、樹立された培養細胞、生体より採取した初代細胞等が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の組成物により目的の遺伝子が導入された細胞は、治療、研究などの目的の用途に利用できる。
　本発明の組成物は、インビトロまたはエキソビボで使用されてもよいし、インビボで使用されてもよい。好ましくは、本発明の組成物は、医薬組成物であり、生体より取り出して再度生体に戻すための細胞を培養する際に使用されてもよいし、生体に直接投与されてもよい。また、本発明の組成物は、例えばレポーター遺伝子を有する組換えウイルスベクターを含む、試薬の形態であってもよい。
　本発明の組成物は、医薬組成物として生体中に（インビボで）投与され得る。例えば、アデノ随伴ウイルスは、分離株（型）によって様々な標的組織に指向性を有するという利点を有する。この場合、予め目的の糖濃度に調製した組成物を、注射剤、注入剤などの剤型を用いて生体に投与することができる。
　また、本発明の組成物は、末梢投与、筋肉内投与、門脈内投与、髄腔内投与、脳内投与などの公知の投与経路を介して投与することもできる。
　さらに、本発明の組成物は、遺伝子導入対象の臓器、組織またはその一部を隔離する手術において使用することができる。このような手術において、本発明の組成物中の組換えウイルスベクター及び糖の局所濃度を上昇させる目的で、導入対象の部位(例えば、臓器、組織、臓器または組織の一部など)の血流、リンパ液、髄液等をクランプ等を用いて一時的に隔離させて、医薬学的に利用可能な水性媒体（生理食塩水等）で置換、潅流、フラッシュさせる。その後、隔離した部位に対して本発明の遺伝子導入組成物を投与できる。このような具体例として、肝臓において門脈血を生理食塩水で一時的にフラッシュして、そこにAAVベクターを投与する方法が知られている（Mimuroら、Molecular Therapy vol. 21 no. 2 feb. 2013, 318-323）。
３．３．医薬組成物の剤型
　本発明の組成物を医薬組成物として使用する場合、例えば、経口、非経口（静脈内）、髄液、筋肉、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などですることができるが、非経口的に投与するのが好ましい。静脈内投与がさらに好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、0.1～20重量％、好ましくは1～5重量％で組成物中に含有できる。
　本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、0.1～20重量％、好ましくは1～5重量％などの量で組成物中に含有できる。また、製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、pH調整剤、安定化剤、色素等を用いることができる。
　非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、注入剤、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の医薬組成物に用いる組換えウイルスベクター、糖などの成分を、水性媒体（精製水、滅菌精製水、注射用水、生理食塩水など）、ゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはpH8以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内注射に適し、一方、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。
　経口投与に適する製剤の例としては、例えば、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、ラクトース（乳糖）の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
　本発明に係る医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明に係る医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重60 kg）１日当たり1～5000 mg、好ましくは10～1000 mgであるが、これらに限定されない。これらの1日投与量は2回から4回に分けて投与されても良い。例えば、投与単位としてvg（vector genome）を利用する場合、例えば、体重1 kgあたり、109～1014 vg、好ましくは1010～1013 vg、さらに好ましくは1010～1012 vgの範囲の投与量を選択することが可能であるが、これらに限定されない。また、上記の量は、用いるウイルスによって単位や量が変更され得る。そのような投与量としては、一般に使用される公知の量であれば本発明の組成物において使用できる。
３．４．本発明の試薬およびキット
　本発明の組成物は、培養細胞にエキソビボまたはインビトロで用いられる試薬の形態であってもよい。この場合、本発明の組成物は、水性媒体として、上記の注射用水、生理食塩水などの水性媒体に加えて、基礎培地または濃縮培地であってもよい。さらに、本発明の組換えウイルスベクターは、GFPなどの公知のレポーター遺伝子を含むものであってもよい。このようなマーカーは、例えばエキソビボもしくはインビトロにおいて遺伝子導入細胞を選択するため、インビボにおいて導入状態を検証するために用いることができる。
　本発明の組成物は、この組成物を調製するためのキットの形態で提供されてもよい。このようなキット（本発明のキットともいう）において、本発明に用いられる組換えウイルスベクターは、例えば、組換えウイルスベクター中にパッケージングされるための空のベクターDNA、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルスDNAなどを含むことができる。より具体的には、例えばrAAVベクターの場合、第１のポリヌクレオチドは、使用者が目的の発現用遺伝子（ポリヌクレオチド）を組み込むためのDNAであり、第２のポリヌクレオチドは、ヘルパーウイルスをコードするDNA（例えば、AdVヘルパーなど）である。本発明のキットはまた、使用者が本発明のキットを使用して組換えウイルスベクターを調製するための手順を記載した、製造業者による指示書もさらに備え得る。
４．本明細書中のその他の用語について
　本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
　本明細書中で使用される場合、特に述べられない限り、「ウイルスベクター」、「ウイルスビリオン」、「ウイルス粒子」の各用語は、相互に交換可能に用いられる。また、「ウイルスベクター」は、特に明示されていなくても、遺伝子組換えによって調製されたベクターをいう。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
　本発明に係る「ウイルスゲノム」は、特に明示されない場合、DNAの形態（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）であっても、RNA（例えば、mRNA）の形態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノムは、二本鎖または一本鎖のDNAまたはRNAであり得る。一本鎖のDNAまたはRNAは、コード鎖（すなわちセンス鎖）であっても、非コード鎖（すなわちアンチセンス鎖）であってもよい。
　特に述べられない限り、本明細書中、rAAVゲノムがコードするプロモーター、目的遺伝子、ポリアデニレーションシグナルなどの遺伝子上の配置について説明される場合、rAAVゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセンス鎖である場合はその相補鎖について記載される。また、本明細書中、文脈より明らかな場合、組換えを表す「r」は省略されることもある。
　本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは相互に交換可能に用いられ、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端（アミノ末端）、右端がC末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましくは、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。
　本明細書において、用語「プラスミド」は、種々の公知の遺伝子要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書において、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（DNA、RNA、PNAおよびその混合物）を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。例えば、本明細書において、用語「rAAVベクタープラスミド」は、特に明記しない限り、rAAVベクターゲノムおよびその相補鎖により形成される二本鎖を含むことが意図される。本発明において使用されるプラスミドは、直鎖状であっても環状であってもよい。
　本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
A. 材料及び方法
(1) GFP発現AAVベクター
　３種類のAAVベクター（AAV3B、yf2AAV9、AAVGT4）を使用した。yf2AAV9は、AAV9の外被蛋白VP1の446番目及び731番目のチロシン(Y)をフェニルアラニン(F)で置換している（iidaら、BioMed Research International, Vol. 2013, Article ID 974819）。AAVGT4はAAV3BのVP1の587番目のセリン(S)をアラニン(A)で置換している（配列番号：4）。いずれのAAVベクターも、cytomegalovirus promoter (CMV)プロモーター、緑色蛍光蛋白質(AcGFP)のcDNA、SV40 poly(A)からなる発現カセットを、公知のAAV3Aのinverted terminal repeats (ITR)の間に挿入している。
 
AAV3A:  GenBank Accession # U48704（VP1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：1に示す。）
AAV3B:  GenBank Accession #AF028705.1（VP1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：2に示す。）
AAV9:   GenBank Accession # AY530579.1
yf2AAV9:（VP1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：3に示す。）
AAVGT4:（VP1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：4に示す。）
 
(b) 細胞培養
　1)HEK 293細胞
　 5×104/well(ウェル)のHEK293細胞を播き、10% ウシ胎仔血清（FCS）-DMEM/F12培地を使用して5% CO2、37℃で培養した。
　2)HepG2細胞
   5×104/wellのHepG2細胞を播き、10% FCS DMEM low glucose培地（Thermo Scientific）を使用して5% CO2、37℃で培養した。
 
(c) 糖類
　単糖類：グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース
　二糖類：スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース
　最終濃度が以下になるように培地に添加した。
　　グルコース：0～200 mM
　　その他の単糖類：100 mM、200 mM
　　スクロース：0～187 mM
　　その他の二糖類：100 mM、125 mM、150 mM
 
(d) ウイルスベクターによる感染
　上記(b)の培養細胞に (a)に記載した、GFPを発現するAAV3B-CMV-AcGFPを 6×107～5×108 vg/well、または、yf2AAV9-CMV-AcGFPを2×109 vg/well 添加し、3～6日間、培養した。
 
(e) GFP発現の評価
　プレートリーダー（バイオテックジャパン）でGFPの蛍光強度を測定し比較した。また、蛍光顕微鏡 (オリンパスIX83)で代表的な視野の画像を撮影した。
実験結果と考察
実験１　AAVの感染・発現に及ぼすスクロースの効果
　HEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom plate (ThermoFisher)に播種し、翌日、AAV3B-CMV-AcGFP 2×108vg/well、またはyf2AAV9-CMV-AcGFP 2×109 vg/well を培地中に加えた。続いて培地中の最終濃度が125 mM となるようスクロース（Wako）を添加した。具体的には培地に溶解した1.25 M スクロース溶液を培地全量の1/10量となるよう添加した。対照のスクロース(-)にはスクロース溶液と同量の培地を添加した。37℃、5％ CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダー（バイオテックジャパン）でGFPの蛍光強度を測定し比較した（図１A）。また、蛍光顕微鏡 オリンパスIX83で代表的な視野の画像を撮影した（図１B）。
　この実験の結果、スクロースの添加（(+)で表される）によりAAV3Bは15.4倍、yf2AAV9は19.6倍、GFPの発現が上昇した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実験２　スクロース、マンニトール、グルコース、NaClの発現上昇効果の有無
　HEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種し、翌日、AAV3B-CMV-AcGFP 6×107vg/wellを培地中に加えた。続いて125 mM スクロースと、浸透圧がほぼ同等になる濃度のグルコース (Sigma)、マンニトール (日本製薬)、またはNaCl（Wako）を添加した。最終濃度はそれぞれ125.0 mM、132.3 mM、132.3 mM、71.5 mMである。添加物溶液と同量の培地を添加して対照とした。37℃、5％ CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した（図２Ａ）。また、蛍光顕微鏡 オリンパスIX83で代表的な視野の画像を撮影した（図２Ｂ）。
　この実験の結果、スクロース、グルコース、マンニトールの添加により、それぞれ11倍、8倍、2倍の発現上昇がみられた。なお、NaClを添加した場合は発現が極端に低下した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実験３　HepG2細胞における発現上昇効果
　HepG2細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom plateに播種した。翌日、AAVGT4-CMV-AcGFP 5×108vg/well、またはAAV3B-CMV-AcGFP 5×108 vg/wellを培地中に加えた。続いて培地中の最終濃度が125 mM となるようスクロースを添加した。対照のスクロース (-)にはスクロース溶液と同量の培地を添加した。37℃、5％ CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した。
　この実験の結果、ヒト肝癌由来細胞株のHepG2細胞でも、スクロース添加によってAAV3Bで16.1倍、AAVGT4で19.1倍発現が上昇した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実験４　種々の添加方法によるスクロースの発現増強効果
　HEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種し、翌日、AAVベクターとスクロースを種々の添加方法で投与した。いずれも37℃、5％ CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した。AAVベクターはいずれもAAV3B-CMV-AcGFP 1×108 vg/well、スクロースの終濃度は125 mMとした。
　第１の手法として、AAVベクター投与直後（5分以下）にスクロースを添加、スクロースをあらかじめ細胞に添加した直後（5分以下）、10分後、または1時間後でのAAVベクターを投与の4種類の方法で投与した。対照のスクロース(-)にはスクロース溶液と同量の培地を添加した。
　スクロース添加群ではいずれの方法でも10倍程度の発現上昇効果が見られた（図４Ａ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　第２の手法として、AAVベクターとスクロースとをあらかじめ混和し、混和直後（5分以下）と室温1時間静置後、AAV3B-CMV-AcGFPが1×108 vg/well、スクロースの終濃度が125 mMとなるように細胞に投与した。スクロース(-)は、スクロース溶液と同量の培地をAAVベクターと混和し室温1時間静置したものを指す。上記と同様に3日後にGPF発現量を測定した。
　この実験の結果、AAVベクターをスクロースと混和してから投与する方法の場合も、直後及び1時間後投与のどちらも12倍以上の発現増強効果が得られた（図４Ｂ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　第３の手法として、AAV3B-CMV-AcGFPベクター1×108 vg/wellの投与直後（5分以下）にスクロース(+)培地もしくは(-)培地を添加し、その3時間後に125 mMのスクロース(+)培地又は(-)培地で全量培地交換した。上記と同様に3日後にGPF発現量を測定した。
　これらの実験の結果、AAV投与直後からスクロースが存在する状態では4.9倍の増強効果であったが、AAVの感染が完了しているとみられる3時間後にスクロースを添加した場合でも2.8倍の発現増強効果が得られた(図４Ｃ)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実験５　D-グルコースとL-グルコースによる発現増強効果
　自然界に存在せず細胞に利用されない（解糖系に取り込まれない）とされるL-グルコース (Sigma)、または通常存在するD-グルコースをAAV3B-CMV-AcGFPと混和・室温1時間静置後、AAVが1×108vg/well 、各グルコースの終濃度が132 mM となるよう細胞に投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで1、2、3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した。細胞はHEK293細胞  5×104cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日に用いた。
　この実験の結果、投与1日後では、D-グルコース添加により17倍程度の発現増強が見られ、一方、L-グルコースの添加でも11倍の増強が見られた。この理由は、混和した糖によって細胞の代謝が賦活されたのではなく、AAVベクターの感染自体に糖が関与したと推察される（図５Ａ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　一方、Ｄ体とＬ体の発現強度の差（D/L）が1日後1.5倍であったのに対し3日後には2.1倍に広がっていることから、糖は細胞の活性を高めることによっても発現を増強させている可能性が推察される（図５Ｂ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実験６　培地中のスクロース濃度による発現増強効果の違い
　AAV3B-CMV-AcGFPと種々の濃度のスクロースをあらかじめ混和し、室温で1時間静置後、細胞に投与した。最終的なAAVベクターの投与量は1×108 vg/well、スクロースの終濃度は80 mM～160 mMである。スクロース (-)はスクロース溶液と同量の培地を混和した。対照として、スクロース希釈時のバッファーによる細胞傷害を防ぐため、投与3時間後、培地で調整した同濃度のスクロース溶液で培地交換を行った。37℃、5％ CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した。細胞はHEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日に用いた。
　この実験の結果、培地中スクロース濃度 80 mMで5倍以上の増強効果がみられた。効果は濃度依存的に上昇し、145、150、160 mMで30倍程度の高い増強効果が見られた。3日後の至適濃度は150 mMであった（図６）。なお、スクロース濃度をさらに上げ、187 mMにすると細胞が傷害を受けて剥がれ、GFP強度が2割程度と激減した（データは示さず）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実験７　培地中のグルコース濃度による発現増強効果の違い
　AAV3B-CMV-AcGFPと種々の濃度のグルコースをあらかじめ混和し、室温に1時間静置後、細胞に投与した。最終的なAAVの投与量は1×108 vg/well、グルコースの最終濃度は40ｍM～200 mMである。グルコース(-)はグルコース溶液と同量の培地を混和した。グルコース希釈時のバッファーによる細胞障害を防ぐため、投与3時間後に培地で調整した同濃度のグルコース溶液で培地交換を行った。37℃、5％ CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した。細胞はHEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日に用いた。
　この実験の結果、培地中グルコース濃度 80 mMで3倍以上の増強効果がみられた。この増強効果は濃度依存的に上昇し、200 mMで60倍近い増強効果が得られた（図７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実験８　二糖類のAAVの発現増強効果
　HEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日、4種の二糖類、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース(スクロース以外すべてSigma)、100、125、150 mMを含む培地で培地交換したのち、AAV3B-CMV-AcGFP 1×108 vg/well を投与した。対照には糖液と同量の培地を添加した。37℃、5％ CO2インキュベーターで1、2、3、6日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した（図８Ａ）。また、蛍光顕微鏡 オリンパスIX83で代表的な視野の画像を撮影した（図８Ｂ）。
　この実験の結果、投与3日後には何れの糖も濃度依存的に2～6倍の増強効果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　糖濃度150mMで比較すると、ラクトースが最も効果が高かったが、ラクトースは溶解度が他の糖に比べて極端に低く実際の使用には適さない可能性がある。6日後にはマルトースで発現が強くなり、糖により発現増強の現れ方に違いがあった（図８Ｃ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
実験９　単糖類のAAVの発現増強効果
　HEK293細胞 5×104 cell/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日、AAV3B-CMV-AcGFP を2種の濃度の単糖類、グルコース、ガラクトース、フルクトース、及びマンノース（全てSigma）と混和し室温に1時間静置後、細胞に投与した。最終的なAAVの投与量は1×108 vg/well、糖の濃度は100および200 mMである。対照には糖液と同量の培地を混和した。37℃、5％ CO2インキュベーターで3日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定し比較した（図９Ａ）。また、投与3日後に蛍光顕微鏡 オリンパスIX83で代表的な視野の画像を撮影した（図９Ｂ）。
　この実験の結果、これらグルコース、ガラクトース、フルクトース、及びマンノースの単糖の中ではグルコースが圧倒的に高い増強効果を示し、その効果は200 mMで120倍であった。フルクトース及びマンノースの効果はスクロースと同程度であった。ガラクトースは他の糖より効果が低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　本発明の組成物は、組換えウイルスベクターによる遺伝子導入効率を大きく向上させることができる。本発明の組成物は、遺伝子治療用の医薬として利用されることが期待できる。
　配列番号１：AAV3A VP1タンパク質のアミノ酸配列
　配列番号２：AAV3B VP1タンパク質のアミノ酸配列
　配列番号３：yf2AAV9 VP1タンパク質（Y446F／Y731F 変異体）のアミノ酸配列
　配列番号４：AAV GT4 VP1タンパク質のアミノ酸配列

Claims (15)

  1. 　目的の発現用遺伝子を含む組換えウイルスベクター、少なくとも40 mMの糖、および水性媒体を含む、遺伝子導入用組成物。
  2. 　前記組換えウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記組換えウイルスベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV-B1、AAV-PHP.B、またはAAV-PHP.eBに由来する、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 　前記組換えウイルスベクターが、配列番号１～４に記載のアミノ酸配列、または配列番号１～４に記載のアミノ酸配列と約90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含むカプシドを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 　前記組成物が0.04～2 Mの濃度の糖を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 　前記糖が、単糖、二糖またはその組合せを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 　前記単糖が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、およびその組合せから選択される少なくとも１種を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 　前記単糖がＤ体を60％以上含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 　前記二糖が、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 　前記水性媒体が注射用水である、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 　注射剤または注入剤の形態の医薬である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 　エキソビボまたはインビトロで使用される薬剤である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 　前記組成物が、凍結保存されて使用前に解凍される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 　組換えウイルスベクター、および糖を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物を調製するためのキット。
  15. 　(a) 組換えウイルスおよび40 mM以上の濃度の糖を含む組成物を提供する工程、および
    　(b) 糖を終濃度10～250 mM含む培地中で、前記組成物を培養細胞と接触させる工程、
    を含む、遺伝子導入方法。
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