WO2020026704A1 - 光散乱検出装置 - Google Patents

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WO2020026704A1
WO2020026704A1 PCT/JP2019/026854 JP2019026854W WO2020026704A1 WO 2020026704 A1 WO2020026704 A1 WO 2020026704A1 JP 2019026854 W JP2019026854 W JP 2019026854W WO 2020026704 A1 WO2020026704 A1 WO 2020026704A1
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detector
light
sample cell
width
aperture
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亨 山口
敦 笠谷
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株式会社島津製作所
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    • G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
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    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
    • G01N21/53—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid within a flowing fluid, e.g. smoke

Definitions

  • the present invention relates to a light scattering detection device used for a particle detection device for measuring a molecular weight, a turning radius (size), and the like of fine particles dispersed in a liquid sample.
  • SEC size exclusion chromatography
  • GPC gel filtration chromatography
  • MALS multi-angle light scattering detector
  • FIG. 12 is a plan view of a basic configuration example of the MALS detection device
  • FIG. 13 is a side view.
  • reference numeral 110 denotes a sample cell
  • 111 denotes a liquid sample
  • 120 denotes a light source
  • 170 denotes a detector
  • 180 denotes a beam damper.
  • a liquid sample 111 is passed through a cylindrical sample cell 110, and light is emitted from a light source 120 so as to pass through the sample cell 110 and the center of the flow channel.
  • the light source 120 a visible laser beam is usually used.
  • the angle ⁇ from the light traveling direction is defined as the scattering angle on the horizontal plane (on the XY plane), and the detector is located on the horizontal plane (on the XY plane) passing through the sample cell 110 and the center of the channel so as to detect different scattering angles. 170 are arranged.
  • the cylindrical sample cell has the feature that the detector arrangement angle and the scattering angle match.
  • 14A to 14C are explanatory diagrams showing the relationship between the scattered light intensity and the scattering angle.
  • 14A shows a case where the particle diameter is 10 nm
  • FIG. 14B shows a case where the particle diameter is 100 nm
  • FIG. 14C shows a case where the particle diameter is 1000 nm.
  • the wavelength of the incident light is 660 nm
  • the refractive index of the particles is 1.6
  • the refractive index of the solvent is 1.33.
  • the relationship between the scattered light intensity and the scattering angle depends on the particle size of the sample.
  • the scattered light When the sample is sufficiently smaller than the wavelength of the incident light, the scattered light is generated isotropically, and the scattered light intensity does not depend on the scattering angle. As the particle size of the sample increases, the scattered light is more strongly scattered forward. By extrapolating the scattered light intensity of a plurality of detectors to a scattering angle of 0 degree, the particle diameter and molecular weight can be calculated (see Non-Patent Document 1).
  • the MALS detector can measure a sample with a lower concentration and has a high S / N ratio.
  • an optical system that allows a detector to efficiently receive scattered light generated from a sample is required. That is, the solid angle of the scattered light entering each detector needs to be large.
  • the solid angle of the detector is increased, if the solid angle in the horizontal direction (on the optical axis plane) is increased, the angular resolution of each detector deteriorates. Therefore, it is desirable to set a large solid angle in the vertical direction. Increasing the size of the detector to increase the solid angle is not preferable because the dark current increases.
  • a method of condensing light with a lens or the like is adopted. That is, a configuration is adopted in which scattered light generated in the flow path of the sample cell forms an image on the detector via the imaging lens.
  • Patent Documents 1 and 2 As a basic configuration of another MALS detection device, there is a method disclosed in Patent Documents 1 and 2. In this method, a flow path is formed so as to penetrate the side surface of a cylindrical sample cell, and light is incident parallel to the flow path. Since the side surface of the cylindrical sample cell acts as a lens, the solid angle in the horizontal direction can be set large without deteriorating the angular resolution. However, since light is incident on the flow channel in parallel, it is susceptible to the disturbance of the flow field in the flow channel, and it has been pointed out that the accuracy is deteriorated at a low scattering angle.
  • the size of the scattered light image formed on the light receiving surface of the detector varies depending on the angle at which the detector is arranged.
  • the scattered light from the sample is generated with a length corresponding to the inner diameter L of the sample cell.
  • the arrangement angle of the detector is ⁇
  • the magnification of the imaging optical system including the cell and the imaging lens is M
  • the length of the scattered light image formed on the detector is MLsin ⁇ .
  • the scattered light output increases as the detectors receive a wider area.
  • the sample is uniformly distributed in the sample cell, it is possible to correct the output of the detector in the scattered light generation region where light is received. However, if the sample is unevenly distributed in the sample cell, this correction will be inaccurate. That is, since the angular profile of the scattered light output becomes inaccurate, the calculated particle diameter and molecular weight become inaccurate.
  • the peak of the same sample has a temporally wide peak shape.
  • the concentration at the center of the flow channel is high at the rise of the peak, and the concentration distribution decreases as the distance from the center increases.
  • the profile has a lower concentration at the center. For this reason, if the scattered light generation region to be received is different depending on the arrangement angle of the detector, the peak shape of the sample in the chromatogram will be different, and the molecular weight accuracy and the particle size accuracy will be deteriorated.
  • the present invention provides a light scattering detection device that can maintain the molecular weight accuracy and the particle size calculation accuracy without affecting the peak shape when the sample cell flows through the detector cell regardless of the arrangement angle of the detector. Aim.
  • a light scattering detection device is a light scattering detection device for detecting fine particles in a liquid sample, and irradiates the sample cell with a transparent sample cell holding the liquid sample and coherent light.
  • a plurality of detection optical systems from the sample cell to the detector are arranged around the sample cell at equal intervals from the center axis of the sample cell, and the plurality of detectors are How the coherent light is incident on the sample cell
  • the angular reference position the position of 90 °
  • a first detector arranged at a position closer to the reference position
  • a second detector located farther by said reference position with respect to
  • the aperture width of the aperture of the first detector is larger than the aperture width of the aperture of the second detector.
  • the aperture width of each aperture plate is a value obtained by multiplying a distance from the central axis of the sample cell to the detector by a sine value of an arrangement angle of each detector. Is preferred.
  • the opening of the aperture plate has a straight side at least along a vertical direction.
  • the aperture plate is arranged to be rotatable in the horizontal direction so as to finely adjust the opening width.
  • the aperture plate includes a control device for controlling a rotation angle of the aperture plate based on refractive index information of a solvent in the liquid sample.
  • the aperture plate includes a rotating device for rotating the aperture plate, and a storage unit for storing refractive index information of a solvent in the liquid sample.
  • each of the slit plates is formed with an opening, and has a slit for limiting the scattering angle range, It is preferable that the width of each slit is maximum when the arrangement angle of the coherent light with respect to the incident direction to the sample cell is 90 °, and decreases as the arrangement angle increases from 90 °.
  • the width of each slit is a value obtained by multiplying the width of the slit when the arrangement angle is 90 ° by the sine value of the arrangement angle of each detector 70.
  • the light source is arranged such that an optical axis of coherent light incident on the sample cell from the light source is inclined at a predetermined angle from a plane including the sample cell and the detector.
  • a light scattering detection device capable of maintaining the molecular weight accuracy and the particle diameter calculation accuracy satisfactorily, with the peak shape at the time of the passage of the sample cell not depending on the arrangement angle of the detector. it can.
  • FIG. 2 is a side view of the light scattering detection device according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a plan view of the light scattering detection device (MALS) according to the first embodiment.
  • MALS light scattering detection device
  • FIG. 3 is a plan view of a basic configuration example of the MALS detection device.
  • FIG. 3 is a side view of a basic configuration example of the MALS detection device. It is explanatory drawing which shows the relationship between the scattered light intensity of 10 nm of particle diameters, and a scattering angle. It is explanatory drawing which shows the relationship between the scattered light intensity and scattering angle of a particle diameter of 100 nm. It is explanatory drawing which shows the relationship between the scattered light intensity and scattering angle of a particle diameter of 1000 nm.
  • FIG. 1 is a side view of a first embodiment of the light scattering detection device according to the present invention.
  • FIG. 2 is a side view of the light scattering detection device according to the first embodiment.
  • the light scattering detection device 1 according to the present embodiment is a device that detects the molecular weight and the radius of gyration (size) of fine particles such as proteins dispersed in a liquid sample.
  • the light scattering detection device 1 includes a sample cell 10, a light source 20, a beam damper 80, a slit plate 40, an imaging optical system 50, an aperture plate 60, and a detector 70.
  • each component will be described.
  • the sample cell 10 is a transparent cylindrical cell that holds a liquid sample in an internal flow path.
  • the sample cell 10 is formed of, for example, colorless and transparent quartz glass.
  • the light source 20 irradiates the sample cell 10 with coherent light.
  • coherent light means that the phase relationship of light waves at any two points in a light beam is invariant in time and is kept constant. After splitting the light beam by an arbitrary method, a large optical path difference is given and the light beam is superimposed again. Light that shows perfect coherence even when combined.
  • a laser light source for irradiating a visible light laser is employed as the light source 20. There is no perfect coherent light in the natural world, and laser light oscillating in a single mode is light close to a coherent state.
  • a condensing optical system 21 is disposed on the optical path L1 of the incident light from the light source 20 to the sample cell 10.
  • the condenser optical system 21 for example, a single condenser lens is employed. This condensing lens is a plano-convex lens, and the incident side of the light from the light source 20 is formed as a convex surface, and the emitting side is formed as a flat surface.
  • a single condenser lens is used as the condenser optical system 21, but the condenser optical system 21 may be configured by combining a plurality of compound lenses or condenser mirrors.
  • the light source 20 and the condensing optical system 21 are arranged such that the optical axis of the coherent light incident on the sample cell 10 from the light source 20 is at a predetermined angle (tilt angle ⁇ ) from a plane (XY plane) including the sample cell 10 and the detector 50. It is arranged to be inclined. Specifically, the light source 20 and the condensing optical system 21 are arranged so that the incident light enters the sample cell 10 from obliquely above. By tilting the incident light with respect to the sample cell 10 (angle ⁇ ), the interface between the glass and the air and the interface between the glass and the flow path of the sample cell 10 (hereinafter, collectively referred to as “cell interface”). Stray light due to reflected light can be reduced.
  • the laser light emitted from the light source 20 passes through the focusing optical system 21 and is focused near the central axis of the sample cell 10.
  • the ⁇ ⁇ beam damper 80 is a device that shields the laser light transmitted through the sample cell 10.
  • the beam damper 80 is disposed at a position where the laser beam that enters the sample cell 10 and passes through the sample cell 10 goes straight.
  • the beam damper 80 is also called a beam trap, and reflects the laser beam infinitely inside the damper device to minimize the reflection outside the damper device.
  • a detection optical system 30 is disposed on the optical path L2 of the light emitted from the sample cell 10.
  • the detection optical system 30 of the present embodiment includes a slit plate 40, an imaging optical system 50, an aperture plate 60, and a detector 70.
  • the imaging optical system 50 collects light scattered from the sample cell 10 to the surroundings at different scattering angles.
  • a single imaging lens is employed as the imaging optical system 50.
  • This imaging lens is a plano-convex lens, and the incident side of the scattered light from the sample cell 10 is formed as a plane, and the emission side is formed as a convex surface.
  • a single imaging lens is employed as the imaging optical system 50, but the imaging optical system 50 may be configured by combining a plurality of compound lenses or imaging mirrors.
  • the slit plate 40 is arranged between the sample cell 10 and the imaging optical system 50 on the optical path L2 of the light emitted from the sample cell 10.
  • the slit plate 40 limits the scattering angle range incident on the imaging optical system 50. That is, the slit 41 opened in the slit plate 40 limits the scattering angle in the horizontal direction, and in order to take in a large amount of light flux in the vertical direction, the slit 41 is vertically long in the vertical direction, and at least the side along the vertical direction is formed. It is straight.
  • the slit 41 has a vertically long rectangular shape or a long hole shape in the vertical direction.
  • the aperture plate 60 is arranged on the optical path L2 of the light emitted from the sample cell 10 on the imaging optical system side with respect to the detector 70.
  • the aperture plate 60 has a function of restricting stray light, and its opening 61 is open in front of the light receiving surface of the detector 70. At least the side of the opening of the aperture plate 60 along the vertical direction is straight.
  • the opening 61 of the aperture plate 60 has a vertically long rectangular shape or a long hole shape in the vertical direction.
  • a plurality of detection optical systems 30 from the sample cell 10 to the detector 70 are arranged around the sample cell 10 at equal intervals d from the center axis S.
  • the angle ⁇ from the traveling direction of light is defined as a scattering angle on a horizontal plane (on an XY plane).
  • a plurality of detectors 70 are arranged on a horizontal plane (XY plane) passing through the central axis S of the sample cell 10 so that different scattering angles can be detected.
  • two detection optical systems 30 and 31 are arranged at arrangement angles of ⁇ 1 and ⁇ 2. Further, in the embodiment of FIG.
  • the detector 70 of the detection optical system 30 is arranged at a position closer to the reference position. That is, the first detector is located at the arrangement angle ⁇ 1, and the detector 70 of the detection optical system 31 is arranged at a position farther from the reference position, that is, at the arrangement angle ⁇ 2 larger than the arrangement angle ⁇ 1.
  • the second detector is located.
  • 14 detectors 70 are arranged around the sample cell 10 at equal intervals d.
  • FIG. 3 omits the light-collecting optical system, the slit plate, the imaging optical system, and the aperture plate.
  • the opening width of each aperture plate 60 is made different depending on the arrangement angle of each detector 70 with respect to the sample cell 10. That is, the opening width of each aperture plate 60 is maximum when the arrangement angle with respect to the direction of incidence of the coherent light on the sample cell 10 is 90 °, and becomes smaller as the arrangement angle is further away from 90 °.
  • the opening width of each aperture plate 60 is a value set by multiplying the distance from the central axis of the sample cell 10 to the detector 70 by the sine value of the arrangement angle of each detector 70. It has become. It should be noted that, as long as the object of the present invention can be achieved, a value with a slight correction is included in the scope of the present invention.
  • the inner diameter of the sample cell 10 is L
  • the arrangement angle of the detector 70 is ⁇
  • the magnification of the imaging optical system including the cell and the coupling lens is M
  • the scattering imaged on the detector 70 The length of the light image is ML sin ⁇ .
  • the inner diameter L of the sample cell 10 and the magnification M of the imaging optical system are the same for all the detection optical systems 30, 31,. Therefore, when a plurality of detection optical systems 30 and 31 are arranged at equal intervals d around the sample cell 10, the opening width of the aperture plate 60 in front of each detector depends on the arrangement of each detector 70 with respect to the sample cell 10. .. Are different depending on the angles ⁇ 1, ⁇ 2,.
  • the opening width of the aperture plate 60 is set by multiplying the distance d from the central axis S of the sample cell 10 to the detector 70 by the sine values of the arrangement angles ⁇ 1 and ⁇ 2 of each detector 70. Specifically, the opening width of the aperture plate 60 at the arrangement angle ⁇ 1 is set by the width of dsin ⁇ 1. The opening width of the aperture plate 60 at the arrangement angle ⁇ 2 is set by the width of dsin ⁇ 2.
  • the detector 70 receives the condensed light from the imaging optical system 50. That is, the light receiving surface of the detector 70 is located at the focal point of the imaging optical system 50.
  • a photodiode PD
  • an array detector such as a two-dimensional CMOS may be employed.
  • the liquid sample 11 is passed through the flow path of the cylindrical sample cell 10.
  • visible light which is coherent light
  • the visible laser light travels along the optical path L1 so that the laser light is incident on the liquid sample 11 in the flow path of the sample cell 10.
  • the laser light hits the fine particles contained in the liquid sample 11 and scatters at a predetermined scattering angle.
  • the scattered light emitted from the sample cell 10 passes through the slit 41 of the slit plate 40, passes through the imaging optical system 50 and the aperture plate 60, and is received on the light receiving surface of the detector 70.
  • the laser light that has entered the sample cell 10 transmitted, and traveled straight is absorbed by the beam damper 80.
  • the reflected light RL is generated as stray light at the interface between the air and the glass and the interface between the glass and the liquid in the sample cell 10.
  • the slit plate 40 limits the scattering angle range of the scattered light incident on the imaging optical system 50 by the vertically elongated slit 41.
  • the image forming optical system 50 collects the scattered light and forms an image on the light receiving surface of the detector 70. Before the detector, the light receiving width to the detector 70 is further reduced by the opening width of the opening 61 of the aperture plate 60. Restrict.
  • a plurality of detection optical systems 30 from the sample cell 10 to the detector 70 are arranged around the sample cell 10 at equal intervals d.
  • the size of the scattered light image formed on the light receiving surface of the detector 70 differs depending on the angle at which the detector 70 is arranged.
  • the inner diameter of the sample cell 10 is L
  • the arrangement angle of the detector is ⁇
  • the imaging optics constituted by the cell and the imaging lens Assuming that the magnification of the system is M, the length of the scattered light image formed on the detector is ML sin ⁇ .
  • the opening width of the aperture plate 60 in front of each detector is In accordance with the arrangement angles ⁇ 1 and ⁇ 2 of the detectors 70 with respect to. That is, the opening width of the aperture plate 60 is set by multiplying the distance d from the central axis S of the sample cell 10 to the detector 70 by the sine values of the arrangement angles ⁇ 1 and ⁇ 2 of each detector 70. As described above, by making the opening width of the aperture plate 60 different according to the arrangement angles ⁇ 1 and ⁇ 2 of the detectors 70, the light receiving width to the detectors 70 can be set to an optimum width.
  • FIG. 4 is an observation photograph of a scattered light image on the light receiving surface of the detector at an arrangement angle of 60 degrees.
  • FIG. 5 is an observation photograph of a scattered light image on the light receiving surface of the detector at an arrangement angle of 90 degrees. 4 and 5, SL represents scattered light derived from the solvent, and GL represents scattered light derived from glass.
  • the imaging conditions were set as follows.
  • the sample cell 10 is, for example, a transparent cylindrical cell having an inner diameter of 1.6 mm and an outer diameter of 8.0 mm.
  • An imaging lens (plano-convex lens) is arranged at a position 50 mm from the central axis S of the sample cell 10.
  • the imaging lens has, for example, a convex diameter of 12.7 mm and a focal length of 38 mm.
  • An aperture plate 60 and a detector (PD) 70 are arranged at a position 100 mm from the central axis S of the sample cell 10.
  • a scattered light image of water on a light receiving surface of a detector (PD) at an arrangement angle of 90 degrees and 60 degrees in a state where water is sealed as a solvent is captured and observed.
  • the length of the scattered light image has the relationship of ML sin ⁇ , and the opening width of the aperture plate 60 in front of the detector having the arrangement angle of 60 degrees is shorter by the sine of the arrangement angle ⁇ .
  • FIG. 6A and 6B are explanatory diagrams of the chromatographic measurement when the opening width of the aperture plate is constant regardless of the arrangement angle. That is, the output of the detector (PD) at the arrangement angles ⁇ 1 and ⁇ 2 corresponding to the BSA (bovine serum albumin) monomer in the size exclusion chromatography measurement is shown.
  • FIG. 6A shows the result normalized by the maximum value of the monomer peak (1030 sec).
  • FIG. 6B shows the result of dividing the output of ⁇ 2 by the output of ⁇ 1.
  • 6A the peak shapes of ⁇ 1 and ⁇ 2 are equal, and in FIG. 6B, it is ideal that the value of ⁇ 2 has a slope of 0.
  • the result is a rise.
  • FIGS. 7A and 7B are explanatory diagrams of the chromatographic measurement when the opening width of the aperture plate is changed depending on the arrangement angle. That is, this is the result of adjusting the aperture width of the aperture plate so that the detector (PD) receives the scattered light from the same sample region.
  • PD detector
  • the opening width of the aperture plate 60 in front of each detector is changed according to the arrangement angles ⁇ 1 and ⁇ 2 of each detector 70 with respect to the sample cell 10. Therefore, the light receiving width to the detector 70 can be set to an optimum width. Therefore, according to the light scattering detection device 1 of the first embodiment, the peak shape when the sample cell 10 flows through does not depend on the arrangement angle of the detector 70, and the molecular weight accuracy and the particle size calculation accuracy are maintained favorably. be able to.
  • FIG. 8 is a side view of the light scattering detection device according to the second embodiment. Note that components denoted by the same reference numerals as those in the first embodiment have the same or similar configurations.
  • the light scattering detection device 2 is different from the first embodiment in that the aperture plate 260 is horizontally rotatably arranged to finely adjust the opening width. And different. That is, the aperture plate 260 is supported, for example, by a rotation shaft (not shown) at the center in the vertical direction, and is configured to be rotatable in the horizontal direction.
  • the aperture plate 260 includes a rotation device 210 for rotating the aperture plate 260, a storage unit 230 for storing refractive index information of a solvent in the liquid sample, and an aperture based on the refractive index information of the solvent.
  • a control device 220 for controlling the rotation angle of the plate 260.
  • the rotation shaft is connected to a rotation device 210 such as a stepping motor, and drives the rotation shaft to rotate the aperture plate 260.
  • the storage unit 230 stores the refractive index information of the solvent in various liquid samples.
  • the control device 220 extracts the refractive index information of the solvent of the liquid sample 110 to be analyzed from the storage unit 230.
  • the control device 220 drives the rotation device 210 based on the extracted refractive index information of the solvent, and controls the rotation angle of the aperture plate 260. By controlling the rotation angle of the aperture plate 260, the aperture plate 260 is inclined in the horizontal direction, and the aperture width is substantially finely adjusted.
  • the light scattering detection device 2 according to the second embodiment basically has the same operation and effect as the light scattering detection device 1 according to the first embodiment.
  • the aperture plate 260 is arranged to be rotatable in the horizontal direction so as to finely adjust the opening width.
  • the aperture plate 260 is based on a rotation device 210 for rotating the aperture plate 260, a storage unit 230 for storing refractive index information of the solvent in the liquid sample, and the refractive index information of the solvent.
  • a control device 220 for controlling the rotation angle of the aperture plate.
  • the opening width of the aperture plate 260 can be finely adjusted according to the refractive index information of the solvent in the liquid sample.
  • the magnification M of the imaging optical system depends on the refractive index of the solvent.
  • FIG. 9 is a plan view of the light scattering detection device according to the third embodiment.
  • FIG. 10A is an explanatory diagram of the chromatographic measurement in the case where the aperture width of the aperture plate is varied depending on the arrangement angle and the slit width of the slit plate is constant regardless of the arrangement angle (the scattering received by each detector at each arrangement angle).
  • 3 is a graph showing relative values of light intensity.
  • FIGS. 10A and 10B are explanatory diagram of the chromatographic measurement in the case where the aperture width of the aperture plate is changed depending on the arrangement angle and the slit width of the slit plate is also changed according to the arrangement angle (scattered light received by each detector at each arrangement angle).
  • 3 is a graph showing relative values of intensity.
  • a description will be given focusing on differences from the above-described first embodiment, and a description of similar items will be omitted.
  • components denoted by the same reference numerals as those in the first embodiment have the same or similar configurations.
  • each slit plate 340 becomes maximum when the arrangement angle with respect to the incident direction of the coherent light to the sample cell 10 is 90 °, similarly to the opening width of each aperture plate 60, and the arrangement angle is 90 °. The angle decreases with increasing distance from °.
  • the width of each slit 341 is a value set by multiplying the width of the slit 341 when the arrangement angle is 90 ° by the sine value of the arrangement angle of each detector 70.
  • the width of the slit 341 at the arrangement angle of 90 ° is w0
  • the width of the slit 341 at the arrangement angle ⁇ 1 is set as w0 ⁇ sin ⁇ 1.
  • the width of the slit 341 at the arrangement angle ⁇ 2 is set by the width of w0 ⁇ sin ⁇ 2.
  • the width of the slit 341 is made different depending on the arrangement angles ⁇ 1 and ⁇ 2 of the detectors 70.
  • the value set by multiplying the width of the slit 341 when the arrangement angle is 90 ° by the sine value of the arrangement angle of each detector 70 is set as long as the object of the present invention can be achieved. Values with some corrections are also included in the scope of the present invention.
  • each aperture plate 60 is made different depending on the arrangement angle.
  • the width of each slit 341 is constant regardless of the arrangement angle, that is, the width of each slit 341 is made different according to the arrangement angle. Is omitted, a result as shown in the graph of FIG. 10A is obtained.
  • the light intensity at each detector 70 decreases as the arrangement angle decreases (for example, when the arrangement angle is 15 degrees or 30 degrees), the light when the arrangement angle is large. It can be seen that there is a tendency for divergence to occur for the intensity. When the detector 70 having a small arrangement angle is not used, this divergence is prevented from affecting the detection results of the molecular weight and the radius of gyration of the fine particles such as proteins.
  • the light scattering detection device 3 changes the opening width of each aperture plate 60 depending on the arrangement angle and also arranges the width of each slit 341 as described above, in order to prevent a difference in light intensity between the arrangement angles. It is configured to vary depending on the angle. In this case, a result like the graph shown in FIG. 10B is obtained. As is clear from the graph shown in FIG. 10B, the graphs of the light intensity corresponding to each arrangement angle almost overlap each other irrespective of the magnitude of the arrangement angle, and the occurrence of the divergence is prevented. Thereby, the molecular weight and the radius of gyration of the fine particles such as proteins can be detected with high accuracy regardless of the location of the detector 70.
  • FIG. 11 is a side view of the light scattering detection device according to the fourth embodiment.
  • the following description focuses on differences from the third embodiment described above, and a description of similar items will not be repeated. Also, components denoted by the same reference numerals as those in the third embodiment have the same or similar configurations.
  • the light scattering detection device 4 according to the fourth embodiment is different from the third embodiment in that the light scattering detection device 4 is rotatably arranged in a horizontal direction in order to finely adjust the width of each slit 341.
  • the slit plate 340 is supported by a rotating shaft (not shown) at the center in the vertical direction, and is configured to be rotatable in the horizontal direction.
  • the slit plate 340 includes a rotation device 410 for rotating the slit plate 340 and a control device 420 for controlling the rotation angle of the slit plate 340.
  • the rotating shaft is connected to, for example, a rotating device 410 such as a stepping motor, and drives the rotating shaft to rotate the slit plate 340.
  • the control device 420 drives the rotation device 410 to control the rotation angle of the slit plate 340.
  • the attitude of each slit plate 340 changes.
  • the width of each slit 341 can be varied according to the arrangement angle.
  • the respective slit plates 340 are configured to rotate, fine adjustment of the width of each slit 341 is also possible.
  • the above embodiments are intended to facilitate understanding of the present invention, and are not intended to limit the present invention.
  • Each element included in the embodiment and the arrangement, material, condition, shape, size, and the like of the embodiment are not limited to those illustrated but can be appropriately changed. It is also possible to partially replace or combine the configurations shown in the different embodiments.
  • the light scattering detection device of the present invention may be a combination of any two or more configurations (features) of the above embodiments.

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Abstract

【課題】試料セルの通液時のピーク形状が検出器の配置角度に依存せず、分子量精度および粒子径算出精度を良好に維持することができる光散乱検出装置を提供する。 【解決手段】光散乱検出装置１は、液体試料を保持する透明な試料セル１０と、試料セル１０にコヒーレント光を照射する光源２０と、試料セル１０から周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を集光する結像光学系５０と、結像光学系５０の入射側に配され、散乱角範囲を制限するためのスリット板４０と、結像光学系５０からの集光を受光する検出器７０と、結像光学系５０の焦点距離よりも検出器側に配され、開口幅によって検出器７０への受光幅を制限するアパーチャ板６０と、を備え、試料セル１０から検出器７０に至る検出光学系３０は、試料セル１０の周囲に、該試料セル１０の中心軸から等間隔で複数配されており、各アパーチャ板６０の開口幅は、試料セル１０に対する各検出器７０の配置角度θに応じて異なっている。

Description

光散乱検出装置
　本発明は、液体試料中に分散している微粒子の分子量や回転半径（サイズ）等を測定するための微粒子検出装置に利用される光散乱検出装置に関する。
　液体試料中に分散しているタンパク質等の微粒子を分離するための手法として、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）やゲルろ過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）が知られている。近年、クロマトグラフィ検出装置としては、紫外線（ＵＶ）吸光度検出装置や示差屈折率検出装置に加え、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出装置が用いられている。ＭＡＬＳ検出装置は、測定試料の分子量や粒子径が算出可能であるという特長がある（特許文献１および２参照）。
　図１２は、ＭＡＬＳ検出装置の基本構成例の平面図を、図１３は側面図を示している。図１２および図１３において、１１０は試料セル、１１１は液体試料、１２０は光源、１７０は検出器、１８０はビームダンパである。図１２および図１３に示すように、円筒体状の試料セル１１０の内部に液体試料１１１を通液し、試料セル１１０および流路中心を通るように光源１２０から光を照射する。光源１２０としては、通常、可視レーザ光が用いられる。光の進行方向からの角度θが水平面上（ＸＹ平面上）の散乱角として定義され、異なる散乱角を検出するように試料セル１１０および流路中心を通る水平面上（ＸＹ平面上）に検出器１７０が複数配置される。
　円筒状の試料セルで、検出器の配置角度と散乱角が一致するという特長がある。図１４Ａから図１４Ｃは、散乱光強度と散乱角の関係を示す説明図である。図１４Ａは粒子径１０ｎｍ、図１４Ｂは粒子径１００ｎｍ、図１４Ｃは粒子径１０００ｎｍの場合である。入射光の波長は６６０ｎｍ、粒子の屈折率１．６、溶媒の屈折率１．３３として、Ｍｉｅ散乱理論から算出した結果である。図１４Ａから図１４Ｃに示すように、散乱光強度と散乱角の関係は試料の粒子径に依存する。試料が入射光の波長に比べて十分小さい場合、散乱光は等方的に発生し、散乱光強度の散乱角依存性はない。試料の粒子径が大きくなるに従い、散乱光は前方への散乱が強くなる。複数配置した検出器の散乱光強度について、散乱角０度へ外挿することにより、粒子径や分子量を算出することができる（非特許文献１参照）。
　ＭＡＬＳ検出装置は、より低い濃度の試料が測定でき、かつ、高いＳ／Ｎ比を有することが望ましい。そのためには、試料から発生する散乱光を効率的に検出器に受光させる光学系が求められる。つまりは、各検出器に入る散乱光の立体角が大きい必要がある。検出器の立体角を大きくする際に、水平方向（光軸面上）の立体角を大きくすると、各検出器の角度分解能が悪くなるため、鉛直方向の立体角を大きく設定することが望ましい。立体角を大きくすべく、検出器のサイズを大きくすることは、暗電流が増加するため、好ましくない。検出器サイズを大きくすることなく、立体角を大きく設定するためには、レンズ等で集光する方法が採られる。すなわち、試料セルの流路で発生した散乱光が結像レンズを介して、検出器上で結像する構成が採用される。
　別のＭＡＬＳ検出装置の基本構成として、特許文献１および２に開示されている方式が挙げられる。この方式では、円柱状の試料セルの側面を貫通するように流路を形成し、流路に平行に光が入射する。円柱状の試料セルの側面がレンズの働きをすることで、水平方向の立体角について角度分解能を悪くせずに大きく設定することができる。しかしながら、流路に平行に光を入射するため、流路内での流れ場の乱れの影響を受けやすく、低散乱角において精度悪化が指摘されている。
特開平０７－７２０６８号公報 特開２０１５－１１１１６３号公報 「光散乱法によるタンパク質の絶対分子量と複合体形成の解析」、尾高雅文、生物工学８９巻
　検出器の受光面上に結像される散乱光の像は、検出器を配置する角度によって大きさが異なる。試料セル内で試料が均一に分布している場合、試料由来の散乱光は試料セルの内径Ｌに一致する長さで発生する。検出器の配置角度をθ、セルおよび結像レンズで構成される結像光学系の倍率をＭとすると、検出器上に結像する散乱光像の長さはＭＬｓｉｎθとなる。検出器の大きさが同一の場合、検出器の配置角度によって、検出器が受光する散乱光の発生領域が異なることになる。試料セルにおいて、空気とガラスとの界面およびガラスと液体との界面で散乱光が発生するため、試料全域を補う大きな検出器を用いることは望ましくない。
　各検出器で受光する散乱光発生領域が異なる場合、広い領域を受光する検出器ほど高い散乱光出力となってしまう。試料セル内で試料が均一に分布している場合、受光する散乱光発生領域で検出器の出力を補正することは可能である。しかしながら、試料セル内で試料が不均一に分布している場合、この補正は不正確となる。すなわち、散乱光出力の角度プロファイルが不正確となるため、算出する粒子径や分子量が不正確となる。
　一般的なクロマトグラムでは、同一試料のピークは時間的に幅をもったピーク形状である。内部に流路を有する円筒状の試料セルの場合、ピークの立ち上がりでは流路の中心の濃度が高く、中心から離れるに従って濃度が低下する濃度分布となる。ピークの立ち下がりでは、流路の中心ほど移動相溶媒との置換が早く進むため、中心の濃度が低いプロファイルとなる。このため、検出器の配置角度により受光する散乱光発生領域が異なると、クロマトグラムにおける試料のピーク形状が異なることとなり、分子量精度や粒子径精度が悪化する。
　そこで、本発明は、試料セルの通液時のピーク形状が検出器の配置角度に依存せず、分子量精度および粒子径算出精度を良好に維持することができる光散乱検出装置を提供することを目的とする。
　本発明の一態様に係る光散乱検出装置は、液体試料中の微粒子を検出するための光散乱検出装置であって、液体試料を保持する透明な試料セルと、上記試料セルにコヒーレント光を照射する光源と、上記試料セルから周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を集光する結像光学系と、上記結像光学系の入射側に配され、散乱角範囲を制限するためのスリット板と、上記結像光学系からの集光を受光する検出器と、上記結像光学系の焦点距離よりも上記検出器側に配され、開口幅によって上記検出器への受光幅を制限するアパーチャ板と、を備え、上記試料セルから上記検出器に至る検出光学系は、上記試料セルの周囲に、該試料セルの中心軸から等間隔で複数配されており、前記複数の検出器は、前記試料セルへの前記コヒーレント光の入射方向に対する角度が９０°の位置を基準位置として、前記基準位置により近い位置に配置された第１検出器と、前記基準位置により遠い位置に配置された第２検出器とを含み、
　前記第１検出器のアパーチャの開口幅は、前記第２検出器のアパーチャの開口幅よりも大きいことを特徴とする。
　上記光散乱検出装置の構成において、各アパーチャ板の開口幅は、上記試料セルの中心軸から上記検出器までの距離と、各検出器の配置角度の正弦値と、を乗じた値であることが好ましい。
　また、上記アパーチャ板の開口部は、少なくとも鉛直方向に沿った辺が直状であることが好ましい。
　さらに、上記アパーチャ板は、上記開口幅を微調整すべく、水平方向に回動可能に配されていることが好ましい。
　また、上記アパーチャ板は、上記液体試料中の溶媒の屈折率情報に基づいて、上記アパーチャ板の回動角を制御するための制御装置を備えることが好ましい。
　また、上記アパーチャ板は、該アパーチャ板を回動させるための回動装置と、上記液体試料中の溶媒の屈折率情報を記憶するための記憶部と、を備えることが好ましい。
　また、前記各スリット板は、開口して形成され、前記散乱角範囲を制限するスリットを有し、
　前記各スリットの幅は、前記コヒーレント光の前記試料セルへの入射方向に対する配置角度が９０°のところで最大となり、配置角度が９０°から離れるにつれて小さくなることが好ましい。
　さらに、前記各スリットの幅は、配置角度が９０°のときの前記スリットの幅に、各検出器７０の配置角度の正弦値を乗じた値であることが好ましい。
　加えて、上記光源は、該光源から前記試料セルに入射するコヒーレント光の光軸が、上記試料セルおよび上記検出器を含む平面から所定の角度傾斜するように配置されていることが好ましい。
　本発明によれば、試料セルの通液時のピーク形状が検出器の配置角度に依存せず、分子量精度および粒子径算出精度を良好に維持することができる光散乱検出装置を提供することができる。
本発明に係る光散乱検出装置の第１実施形態の平面図である。 第１実施形態に係る光散乱検出装置の側面図である。 第１実施形態に係る光散乱検出装置（ＭＡＬＳ）の平面図である。 配置角度６０度の検出器の受光面上の散乱光像の観察写真である。 配置角度９０度の検出器の受光面上の散乱光像の観察写真である。 アパーチャ板の開口幅が配置角度によらず一定の場合のクロマトグラフィ測定の説明図である。 アパーチャ板の開口幅が配置角度によらず一定の場合のクロマトグラフィ測定の説明図である。 アパーチャ板の開口幅を配置角度によって異ならせた場合のクロマトグラフィ測定の説明図である。 アパーチャ板の開口幅を配置角度によって異ならせた場合のクロマトグラフィ測定の説明図である。 第２実施形態に係る光散乱検出装置の平面図である。 第３実施形態に係る光散乱検出装置の平面図である。 アパーチャ板の開口幅を配置角度によって異ならせ、かつ、スリット板のスリット幅が配置角度によらず一定の場合のクロマトグラフィ測定の説明図（各配置角度における各検出器が受光する散乱光強度の相対値を示すグラフ）である。 アパーチャ板の開口幅を配置角度によって異ならせ、かつ、スリット板のスリット幅も配置角度によって異ならせた場合のクロマトグラフィ測定の説明図（各配置角度における各検出器が受光する散乱光強度の相対値を示すグラフ）である。 第４実施形態に係る光散乱検出装置の平面図である。 ＭＡＬＳ検出装置の基本構成例の平面図である。 ＭＡＬＳ検出装置の基本構成例の側面図である。 粒子径１０ｎｍの散乱光強度と散乱角の関係を示す説明図である。 粒子径１００ｎｍの散乱光強度と散乱角の関係を示す説明図である。 粒子径１０００ｎｍの散乱光強度と散乱角の関係を示す説明図である。
　以下、本発明に係る光散乱検出装置の第１および第２実施形態について図面を参照して説明する。なお、各図において、同一の符号を付したものは、同一又は同様の構成を有する。
　［第１実施形態］
　〔光散乱検出装置の構成〕
　まず、図１から図３を参照して、本発明に係る光散乱検出装置の第１実施形態の構成について説明する。図１は、本発明に係る光散乱検出装置の第１実施形態の側面図である。図２は、第１実施形態に係る光散乱検出装置の側面図である。図１および図２に示すように、本実施形態に係る光散乱検出装置１は、液体試料中に分散しているタンパク質等の微粒子の分子量や回転半径（サイズ）を検出する装置である。光散乱検出装置１は、試料セル１０、光源２０、ビームダンパ８０、スリット板４０、結像光学系５０、アパーチャ板６０および検出器７０を備える。以下、各構成要素ごとに説明する。
　試料セル１０は、内部の流路に液体試料を保持する透明な円筒体状のセルである。試料セル１０は、例えば、無色透明な石英ガラスによって形成されている。
　光源２０は、試料セル１０にコヒーレント光を照射する。「コヒーレント光」とは、光束内の任意の２点における光波の位相関係が時間的に不変で一定に保たれており、任意の方法で光束を分割した後、大きな光路差を与えて再び重ね合わせても完全な干渉性を示す光をいう。光源２０としては、例えば、可視光レーザを照射するためのレーザ光源が採用される。自然界には完全なコヒーレント光は存在せず、シングルモードで発振するレーザ光はコヒーレント状態に近い光である。
　光源２０から試料セル１０に至る入射光の光路Ｌ１には、集光光学系２１が配置されている。集光光学系２１としては、例えば、単一の集光レンズが採用されている。この集光レンズは、平凸レンズであり、光源２０からの光の入射側が凸面で、出射側が平面に形成されている。本実施形態では、集光光学系２１として、単一の集光レンズを採用しているが、集光光学系２１は複数の複合レンズや集光ミラーを組み合わせて構成してもよい。
　光源２０および集光光学系２１は、光源２０から試料セル１０に入射するコヒーレント光の光軸が、試料セル１０及び検出器５０を含む平面（ＸＹ平面）から所定の角度（チルト角度α）で傾斜するように配置されている。具体的には、試料セル１０に対して入射光が斜め上方から入射するように、光源２０および集光光学系２１が配置されている。試料セル１０に対して入射光をチルト（角度α）させることによって、試料セル１０のガラスと空気との界面及びガラスと流路との界面（以下、「セル界面」と総称する。）での反射光による迷光を低減させることができる。光源２０から照射されたレーザ光は、集光光学系２１を通過した後、試料セル１０の中心軸付近に集光する。
　ビームダンパ８０は、試料セル１０を透過したレーザ光を遮蔽する機器である。ビームダンパ８０は、試料セル１０に入射し、該試料セル１０を透過したレーザ光が直進する位置に配置されている。ビームダンパ８０は、ビームトラップとも称され、ダンパ器内で無限にレーザ光を反射させることにより、ダンパ器外への反射を最低限に抑える。
　試料セル１０からの出射光の光路Ｌ２上には、検出光学系３０が配置されている。本実施形態の検出光学系３０は、スリット板４０、結像光学系５０、アパーチャ板６０及び検出器７０から構成されている。
　結像光学系５０は、試料セル１０から周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を集光する。結像光学系５０としては、例えば、単一の結像レンズが採用されている。この結像レンズは、平凸レンズであり、試料セル１０からの散乱光の入射側が平面で、出射側が凸面に形成されている。本実施形態では、結像光学系５０として、単一の結像レンズを採用したが、結像光学系５０は複数の複合レンズや結像ミラーを組み合わせて構成してもよい。
　スリット板４０は、試料セル１０からの出射光の光路Ｌ２上において、試料セル１０と結像光学系５０との間に配置されている。スリット板４０は、結像光学系５０に入射する散乱角範囲を制限する。すなわち、スリット板４０に開口されたスリット４１は、水平方向の散乱角を制限し、且つ、鉛直方向の光束を多く取り込むために、鉛直方向に縦長であって、少なくとも鉛直方向に沿った辺が直状である。具体的には、スリット４１は、鉛直方向に縦長の長方形状や長孔形状を呈している。
　アパーチャ板６０は、試料セル１０からの出射光の光路Ｌ２上において、検出器７０よりも結像光学系側に配置されている。アパーチャ板６０は迷光を制限する機能を有し、その開口部６１は検出器７０の受光面前で開口している。アパーチャ板６０の開口部は、少なくとも鉛直方向に沿った辺が直状である。具体的には、アパーチャ板６０の開口部６１は、鉛直方向に縦長の長方形状や長孔形状を呈している。
　図１および図３に示すように、試料セル１０から検出器７０に至る検出光学系３０は、試料セル１０の周囲に、その中心軸Ｓから等間隔ｄで複数配されている。光の進行方向からの角度θが水平面上（ＸＹ平面上）の散乱角として定義される。異なる散乱角を検出できるように、試料セル１０の中心軸Ｓを通る水平面上（ＸＹ平面上）に検出器７０が複数配置される。図１の態様では、θ１，θ２の配置角度で検出光学系３０、３１が２系配置されている。また、図１の態様では、試料セル１０のコヒーレント光の入射方向に対する角度が９０°の位置を基準位置とした場合、検出光学系３０の検出器７０は、基準位置により近い位置に配置された、すなわち、配置角度θ１に位置する第１検出器となっており、検出光学系３１の検出器７０は、基準位置により遠い位置に配置された、すなわち、配置角度θ１よりも大きい配置角度θ２に位置する第２検出器となっている。図３の態様では、試料セル１０の周囲に等間隔ｄで１４個の検出器７０が配置されている。なお、図３では、集光光学系、スリット板、結像光学系およびアパーチャ板を省略図示している。
　このように試料セル１０の周囲に複数の検出器７０が配置されているので、各アパーチャ板６０の開口幅は、試料セル１０に対する各検出器７０の配置角度に応じて異ならせている。すなわち、各アパーチャ板６０の開口幅は、試料セル１０へのコヒーレント光の入射方向に対する配置角度が９０°のところで最大となり、配置角度が９０°から離れるにつれて小さくなっている。そして、本実施形態では、各アパーチャ板６０の開口幅は、試料セル１０の中心軸から検出器７０までの距離と、各検出器７０の配置角度の正弦値と、を乗じて設定された値となっている。なお、この値には、本発明の目的を達成することができるのであれば、若干の補正を加えた値も、本発明の範囲内に含まれる。
　上述したように、試料セル１０の内径をＬ、検出器７０の配置角度をθ、セルと結合レンズで構成される結像光学系の倍率をＭとすると、検出器７０上に結像する散乱光像の長さはＭＬｓｉｎθとなる。ここで、試料セル１０の内径Ｌおよび結像光学系の倍率Ｍは、全ての検出光学系３０、３１…で同じである。したがって、試料セル１０の周囲に検出光学系３０、３１が等間隔ｄで複数配されている場合に、各検出器前のアパーチャ板６０の開口幅は、試料セル１０に対する各検出器７０の配置角度θ１、θ２…に応じて異ならせている。アパーチャ板６０の開口幅は、試料セル１０の中心軸Ｓから検出器７０までの距離ｄと、各検出器７０の配置角度θ１、θ２の正弦値と、を乗じて設定される。具体的には、配置角度θ１のアパーチャ板６０の開口幅は、ｄｓｉｎθ１の幅で設定される。また、配置角度θ２のアパーチャ板６０の開口幅は、ｄｓｉｎθ２の幅で設定される。
　検出器７０は、結像光学系５０からの集光を受光する。すなわち、結像光学系５０の焦点に、検出器７０の受光面が位置している。本実施形態の検出器７０としては、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）を採用しているが、２次元ＣＭＯＳ等のアレイ検出器を採用してもよい。
　〔光散乱検出装置の作用〕
　次に、図１から図８を参照して、本実施形態に係る光散乱検出装置の作用について説明する。
　図１に示すように、円筒体状の試料セル１０の流路に液体試料１１が通液される。液体試料１１の通液が完了すると、光源２０から集光光学系２１を介してコヒーレント光である可視レーザ光が照射される。可視レーザ光は、光路Ｌ１に沿って進むことにより、レーザ光が試料セル１０の流路内の液体試料１１に入射する。液体試料にレーザ光が入射されると、その光は液体試料１１に含まれる微粒子に当たって所定の散乱角を以て散乱する。そして、試料セル１０から出射した散乱光は、スリット板４０のスリット４１を通過した後、結像光学系５０およびアパーチャ板６０を経て、検出器７０の受光面上に受光される。他方、試料セル１０に入射し、透過して直進したレーザ光は、ビームダンパ８０によって吸収される。
　試料セル１０から散乱光が出射する際、試料セル１０の空気とガラスとの界面およびガラスと液体との界面において、反射光ＲＬが迷光として生じる。スリット板４０は、鉛直方向に縦長のスリット４１によって結像光学系５０へ入射する散乱光の散乱角範囲を制限する。結像光学系５０は散乱光を集光し、検出器７０の受光面上に結像するが、検出器前においてさらにアパーチャ板６０の開口部６１の開口幅によって検出器７０への受光幅を制限する。
　図１および図３に示すように、試料セル１０から検出器７０に至る検出光学系３０は、試料セル１０の周囲に等間隔ｄで複数配されている。検出器７０の受光面上に結像される散乱光の像は、検出器７０を配置する角度によって大きさが異なる。上述したように、試料セル１０内で液体試料１１が均一に分布している場合、試料セル１０の内径をＬ、検出器の配置角度をθ、セルと結像レンズで構成される結像光学系の倍率をＭとすると、検出器上に結像する散乱光像の長さはＭＬｓｉｎθとなる。
　ここで、試料セル１０の内径Ｌおよび結像光学系の倍率Ｍは、全ての検出光学系３０、３１…で同じであるので、各検出器前のアパーチャ板６０の開口幅は、試料セル１０に対する各検出器７０の配置角度θ１、θ２に応じて異ならせている。すなわち、アパーチャ板６０の開口幅は、試料セル１０の中心軸Ｓから検出器７０までの距離ｄと、各検出器７０の配置角度θ１、θ２の正弦値と、を乗じて設定される。このようにアパーチャ板６０の開口幅を各検出器７０の配置角度θ１、θ２に応じて異ならせることにより、検出器７０への受光幅を最適な幅に設定することができる。
　〔検出器の受光面上の散乱光像の観察〕
　第１実施形態の作用効果を確認すべく、検出器に結像された散乱光像を撮像観察した。図４は、配置角度６０度の検出器の受光面上の散乱光像の観察写真である。図５は、配置角度９０度の検出器の受光面上の散乱光像の観察写真である。図４および図５において、ＳＬは溶媒由来の散乱光、ＧＬはガラス由来の散乱光である。
　撮像条件は、次のように設定した。試料セル１０は、例えば、内径が１．６ｍｍで、外径が８．０ｍｍの透明な円筒体状のセルである。試料セル１０の中心軸Ｓから５０ｍｍの位置には、結像レンズ（平凸レンズ）が配置されている。結像レンズは、例えば、凸径がφ１２．７ｍｍで、焦点距離が３８ｍｍに形成されている。試料セル１０の中心軸Ｓから１００ｍｍの位置には、アパーチャ板６０および検出器（ＰＤ）７０が配置されている。
　図４および図５に示すように、溶媒として水を封入した状態での配置角度９０度および６０度の検出器（ＰＤ）の受光面上での水の散乱光像を撮像観察している。散乱光像の長さは上述の通りＭＬｓｉｎθの関係があり、配置角度６０度の検出器前のアパーチャ板６０の開口幅は配置角度θの正弦分だけ短くなっている。
　〔クロマトグラフィ測定〕
　図６Ａおよび図６Ｂは、アパーチャ板の開口幅が配置角度によらず一定の場合のクロマトグラフィ測定の説明図である。すなわち、サイズ排除クロマトグラフィ測定におけるＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）単量体に相当する、配置角度θ１とθ２の検出器（ＰＤ）の出力を示す。図６Ａは、単量体ピークの最大値（１０３０ｓｅｃ）で規格化した結果である。図６Ｂはθ２の出力をθ１の出力で除算した結果である。カラムで分離された同一特性の試料であるため、図６Ａにおいθ１とθ２のピーク形状は等しくなり、図６Ｂにおいてθ２の値は傾き０となることが理想であるが、時間の経過とともに右肩上がりの結果となっている。この結果から、分子量や粒子径を算出すると、ピーク内で算出結果が異なることとなり、算出精度が悪化する。
　他方、図７Ａおよび図７Ｂは、アパーチャ板の開口幅を配置角度によって異ならせた場合のクロマトグラフィ測定の説明図である。すなわち、検出器（ＰＤ）が同一の試料領域からの散乱光を受光するようにアパーチャ板の開口幅を調整した結果である。図６Ａおよび図６Ｂと比較して、θ２の変動は小さく、分子量および粒子径の算出値のピーク内での変動は小さくなる効果がある。
　以上説明したように、第１実施形態の光散乱検出装置１は、各検出器前のアパーチャ板６０の開口幅を試料セル１０に対する各検出器７０の配置角度θ１、θ２に応じて異ならせているので、検出器７０への受光幅を最適な幅に設定することができる。したがって、第１実施形態の光散乱検出装置１によれば、試料セル１０の通液時のピーク形状が検出器７０の配置角度に依存せず、分子量精度および粒子径算出精度を良好に維持することができる。
　［第２実施形態］
　次に、図８を参照して、第２実施形態に係る光散乱検出装置２について説明する。図８は、第２実施形態に係る光散乱検出装置の側面図である。なお、第１実施形態と同一の符号を付したものは、同一又は同様の構成を有する。
　図８に示すように、第２実施形態に係る光散乱検出装置２は、アパーチャ板２６０が開口幅を微調整すべく、水平方向に回動可能に配されている点が、第１実施形態と異なる。すなわち、アパーチャ板２６０には、例えば、鉛直方向の中心部に不図示の回動軸で支持されており、水平方向に回動可能に構成されている。アパーチャ板２６０は、当該アパーチャ板２６０を回動させるための回動装置２１０と、液体試料中の溶媒の屈折率情報を記憶するための記憶部２３０と、溶媒の屈折率情報に基づいて、アパーチャ板２６０の回動角を制御するための制御装置２２０と、を備える。
　回動軸は、例えば、ステッピングモータ等の回動装置２１０に接続され、回動軸を駆動することにより、アパーチャ板２６０を回動させる。記憶部２３０には、各種の液体試料中の溶媒の屈折率情報が記憶されている。制御装置２２０は、記憶部２３０から分析対象となる液体試料１１０の溶媒の屈折率情報を抽出する。制御装置２２０は、抽出した溶媒の屈折率情報に基づいて、回動装置２１０を駆動し、アパーチャ板２６０の回動角を制御する。アパーチャ板２６０の回動角を制御することにより、当該アパーチャ板２６０が水平方向に傾斜して、実質的に開口幅が微調整される。
　第２実施形態に係る光散乱検出装置２は、基本的に第１実施形態に係る光散乱検出装置１と同様の作用効果を奏する。特に、第２実施形態に係る光散乱検出装置２は、アパーチャ板２６０が開口幅を微調整すべく、水平方向に回動可能に配されている。また、アパーチャ板２６０は、当該アパーチャ板２６０を回動させるための回動装置２１０と、液体試料中の溶媒の屈折率情報を記憶するための記憶部２３０と、溶媒の屈折率情報に基づいて、アパーチャ板の回動角度を制御するための制御装置２２０と、を備える。したがって、第２実施形態に係る光散乱検出装置２によれば、液体試料中の溶媒の屈折率情報に応じて、アパーチャ板２６０の開口幅を微調整することができる。結像光学系の倍率Ｍは、溶媒の屈折率に依存する。屈折率に応じて、アパーチャ開口幅を調整することで、溶媒に依らず、流路内の同一領域の散乱光を受光することができる。したがって、分子量精度および粒子径算出精度を良好に維持することができるという有利な効果を奏する。
　［第３実施形態］
　次に、図９、図１０Ａおよび図１０Ｂを参照して、第３実施形態に係る光散乱検出装置３について説明する。図９は、第３実施形態に係る光散乱検出装置の平面図である。図１０Ａは、アパーチャ板の開口幅を配置角度によって異ならせ、かつ、スリット板のスリット幅が配置角度によらず一定の場合のクロマトグラフィ測定の説明図（各配置角度における各検出器が受光する散乱光強度の相対値を示すグラフ）である。図１０Ｂは、アパーチャ板の開口幅を配置角度によって異ならせ、かつ、スリット板のスリット幅も配置角度によって異ならせた場合のクロマトグラフィ測定の説明図（各配置角度における各検出器が受光する散乱光強度の相対値を示すグラフ）である。本実施形態では、前述した第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項はその説明を省略する。また、第１実施形態と同一の符号を付したものは、同一又は同様の構成を有する。また、図１０Ａおよび図１０Ｂ示すグラフは、いずれも、セル中心（Ｘ＝０）で発生する散乱光を受光する光強度を１とし、受光する散乱光強度相対値のセル位置依存性（Ｘ依存性）を計算した結果である。
　図９に示すように、第３実施形態に係る光散乱検出装置３では、試料セル１０の周囲に複数のスリット板３４０が配置されている。そして、各スリット板３４０の各スリット３４１の幅は、各アパーチャ板６０の開口幅と同様に、コヒーレント光の試料セル１０への入射方向に対する配置角度が９０°のところで最大となり、配置角度が９０°から離れるにつれて小さくなっている。また、本実施形態では、各スリット３４１の幅は、配置角度が９０°のときのスリット３４１の幅に、各検出器７０の配置角度の正弦値を乗じて設定された値となっている。例えば、配置角度が９０°のときのスリット３４１の幅をｗ０としたとき、配置角度θ１のスリット３４１の幅は、ｗ０×ｓｉｎθ１の幅で設定される。また、配置角度θ２のスリット３４１の幅は、ｗ０×ｓｉｎθ２の幅で設定される。このように本実施形態では、スリット３４１の幅を各検出器７０の配置角度θ１、θ２に応じて異ならせている。なお、配置角度が９０°のときのスリット３４１の幅に、各検出器７０の配置角度の正弦値を乗じて設定された値には、本発明の目的を達成することができるのであれば、若干の補正を加えた値も、本発明の範囲内に含まれる。
　ところで、各アパーチャ板６０の開口幅を配置角度によって異ならせるが、各スリット３４１の幅については、配置角度によらず一定の場合、すなわち、各スリット３４１の幅を配置角度に応じて異ならせるのを省略した場合、図１０Ａに示すグラフのような結果が得られる。図１０Ａに示すグラフから明らかなように、各検出器７０での光強度は、配置角度が小さくなれば小さくなるほど（例えば配置角度が１５度や３０度の場合）、配置角度が大きいときの光強度に対して乖離が生じる傾向にあることが分かる。なお、前記配置角度が小さい検出器７０を用いない場合には、この乖離が、タンパク質等の微粒子の分子量や回転半径の検出結果に対して、影響を与えるのが防止される。
　そこで、光散乱検出装置３は、配置角度の大小における光強度の乖離を防止するべく、前述したように、各アパーチャ板６０の開口幅を配置角度によって異ならせるとともに、各スリット３４１の幅も配置角度によって異ならせる構成となっている。この場合、図１０Ｂに示すグラフのような結果が得られる。図１０Ｂに示すグラフから明らかなように、配置角度の大小によらず、各配置角度に対応する光強度のグラフは、互いにほぼ重なっており、前記乖離が生じるのが防止されている。これにより、検出器７０の配置箇所によらず、タンパク質等の微粒子の分子量や回転半径を高精度に検出することができる。
　［第４実施形態］
　次に、図１１を参照して、第４実施形態に係る光散乱検出装置４について説明する。図１１は、第４実施形態に係る光散乱検出装置の側面図である。前述した第３実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項はその説明を省略する。また、第３実施形態と同一の符号を付したものは、同一又は同様の構成を有する。
　図１１に示すように、第４実施形態に係る光散乱検出装置４は、各スリット３４１幅を微調整すべく、水平方向に回動可能に配されている点が、第３実施形態と異なる。すなわち、スリット板３４０には、例えば、鉛直方向の中心部に不図示の回動軸で支持されており、水平方向に回動可能に構成されている。スリット板３４０は、当該スリット板３４０を回動させるための回動装置４１０と、スリット板３４０の回動角を制御するための制御装置４２０と、を備える。
　回動軸は、例えば、ステッピングモータ等の回動装置４１０に接続され、回動軸を駆動することにより、スリット板３４０を回動させる。制御装置４２０は、回動装置４１０を駆動し、スリット板３４０の回動角を制御する。そして、各スリット板３４０に同じスリット板３４０を用いて、当該各スリット板３４０の回動角を制御することにより、当該各スリット板３４０の姿勢が変化する。これにより、各スリット３４１の幅を配置角度に応じて異ならせることができる。また、各スリット板３４０を回動させるよう構成されていることにより、各スリット３４１の幅の微調整も可能となる。
　上記の実施形態は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。実施形態が備える各要素並びにその配置、材料、条件、形状及びサイズ等は、例示したものに限定されるわけではなく適宜変更することができる。また、異なる実施形態で示した構成同士を部分的に置換し又は組み合わせることが可能である。
　また、本発明の光散乱検出装置は、前記各実施形態のうちの、任意の２以上の構成（特徴）を組み合わせたものであってもよい。
　１、２、３、４…光散乱検出装置
１０…試料セル
２０…光源
３０…検出光学系
４０、３４０…スリット板
４１、３４１…スリット
５０…結像光学系
６０、２６０…アパーチャ板
６１…開口部
７０…検出器
２１０、４１０…回動装置
２２０、４２０…制御装置
２３０…記憶部

Claims (9)

  1. 　液体試料中の微粒子を検出するための光散乱検出装置であって、
    　液体試料を保持する透明な試料セルと、
    　前記試料セルにコヒーレント光を照射する光源と、
    　前記試料セルから周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を集光する結像光学系と、
    　前記結像光学系の入射側に配され、散乱角範囲を制限するためのスリット板と、
    　前記結像光学系からの集光を受光する検出器と、
    　前記結像光学系の焦点距離よりも前記検出器側に配され、開口幅によって前記検出器への受光幅を制限するアパーチャ板と、
    を備え、
    　前記試料セルから前記検出器に至る検出光学系は、前記試料セルの周囲に、該試料セルの中心軸から等間隔で複数配されており、
    　前記複数の検出器は、前記試料セルへの前記コヒーレント光の入射方向に対する角度が９０°の位置を基準位置として、前記基準位置により近い位置に配置された第１検出器と、前記基準位置により遠い位置に配置された第２検出器とを含み、
    　前記第１検出器のアパーチャの開口幅は、前記第２検出器のアパーチャの開口幅よりも大きいことを特徴とする光散乱検出装置。
  2. 　各アパーチャ板の開口幅は、前記試料セルの中心軸から前記検出器までの距離と、各検出器の配置角度の正弦値と、を乗じた値である、請求項１に記載の光散乱検出装置。
  3. 　前記アパーチャ板の開口部は、少なくとも鉛直方向に沿った辺が直状である、請求項１または請求項２に記載の光散乱検出装置。
  4. 　前記アパーチャ板は、前記開口幅を微調整すべく、水平方向に回動可能に配されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の光散乱検出装置。
  5. 　前記アパーチャ板は、前記液体試料中の溶媒の屈折率情報に基づいて、前記アパーチャ板の回動角を制御するための制御装置を備える、請求項４に記載の光散乱検出装置。
  6. 　前記アパーチャ板は、該アパーチャ板を回動させるための回動装置と、前記液体試料中の溶媒の屈折率情報を記憶するための記憶部と、を備える、請求項５に記載の光散乱検出装置。
  7. 　前記各スリット板は、開口して形成され、前記散乱角範囲を制限するスリットを有し、
    　前記各スリットの幅は、前記コヒーレント光の前記試料セルへの入射方向に対する配置角度が９０°のところで最大となり、配置角度が９０°から離れるにつれて小さくなる、請求項１から６のいずれか１項に記載の光散乱検出装置。
  8. 　前記各スリットの幅は、配置角度が９０°のときの前記スリットの幅に、各検出器７０の配置角度の正弦値を乗じた値である、請求項７に記載の光散乱検出装置。
  9. 　前記光源は、該光源から前記試料セルに入射するコヒーレント光の光軸が、前記試料セルおよび前記検出器を含む平面から所定の角度傾斜するように配置されている、請求項１から８のいずれか１項に記載の光散乱検出装置。
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