WO2020008972A1 - 反応処理装置 - Google Patents

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WO2020008972A1
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optical head
sample
light
excitation light
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小木　秀也
福澤　隆
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日本板硝子株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a reaction processing apparatus used for a polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Genetic testing is widely used for testing in various medical fields, identifying crops and pathogenic microorganisms, evaluating food safety, and testing for pathogenic viruses and various infectious diseases.
  • a method of analyzing a product obtained by amplifying a part of DNA there is known a method of analyzing a product obtained by amplifying a part of DNA.
  • the method using PCR is a technology of interest for selectively amplifying a certain portion of a very small amount of DNA collected from a living body or the like.
  • PCR a predetermined thermal cycle is applied to a sample obtained by mixing a biological sample containing DNA and a PCR reagent composed of primers, enzymes, and the like, and denaturation, annealing, and elongation reactions are repeatedly caused to cause a specific portion of the DNA. It is to amplify selectively.
  • PCR it is common to put a target sample in a predetermined amount in a reaction processing container such as a PCR tube or a microplate (microwell) having a plurality of holes formed therein. It has been put to practical use to perform the reaction using a reaction processing vessel (also called a chip) having a fine channel (for example, Patent Document 1).
  • a reaction processing vessel also called a chip
  • a fluorescence detection device may be used for the purpose of detecting a quantitative change of a sample or the like.
  • a fluorescent dye is added to the sample, the sample is irradiated with excitation light using a fluorescence detector during PCR, and the fluorescence emitted from the sample is detected. Since the intensity of the fluorescence emitted from the sample increases as the DNA amplification proceeds, the intensity value of the fluorescence can be used as an index as a material for determining the progress of the PCR or the end of the reaction.
  • a reagent in which a plurality of fluorescent dyes are mixed is often used, and in this case, it is necessary to install a plurality of fluorescence detection devices.
  • the cross-sectional area passes through one flow path of, for example, 2 mm 2 or less.
  • VT1 and VT2 are measured at the same time.
  • the test kit (FIK-362) of Toyobo Co., Ltd. It is a fluorescent dye that emits substantially red fluorescence. Such a property of fluorescence is hereinafter referred to as “green excitation / red fluorescence” and Cy5 (red excitation / infrared fluorescence). In this case, two fluorescence detection devices are required.
  • G1 and G2 are measured simultaneously.
  • both the test kit (RR255A) of Takara Bio Inc. and the test kit (FIK-253) of Toyobo Co., Ltd. Blue excitation / green fluorescence
  • ROX green excitation / red fluorescence
  • Cy5 red excitation / infrared fluorescence
  • the wavelength range of light corresponding to substantially green of the excitation light applied to excite ROX and the green color of the fluorescence emitted from FAM may partially overlap.
  • a photodetector such as a photoelectric conversion element for detecting fluorescence emitted from the FAM
  • the amount of excitation light is several tens of ⁇ W, while the amount of fluorescence to be detected is on the order of several pW or less. This is because the fluorescence detecting device is configured to detect such a weak amount of fluorescent light, but if even a small portion of the excitation light reaches the photodetector, it appears as a large noise. .
  • the wavelength range of the substantially red light of the excitation light irradiated to excite Cy5 corresponds to the substantially red color of the fluorescence emitted from the ROX.
  • the light wavelength ranges may partially overlap. Also in this case, when a part of the excitation light irradiated to excite Cy5 enters the photodetector for detecting the fluorescence emitted from the ROX, it becomes noise and high-sensitivity fluorescence measurement cannot be performed. There is a fear.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a technique capable of suppressing interference between fluorescence detection devices in a reaction processing device including a plurality of fluorescence detection devices.
  • a reaction processing apparatus includes a substrate having a flow path for moving a sample formed on a first main surface and a first main surface which seals the flow path.
  • a reaction processing container provided with a flow path sealing film provided on the sample, irradiates the sample in the flow path with the first excitation light, and collects first fluorescence generated from the sample by the irradiation of the first excitation light.
  • a first optical head having a first objective lens, and a second objective lens that irradiates the sample in the flow path with the second excitation light and condenses the second fluorescence generated from the sample by the irradiation of the second excitation light.
  • a second optical head and a holding member that holds the first optical head and the second optical head.
  • the first optical head and the second optical head are arranged side by side in the longitudinal direction of the flow path, and the wavelength range of the first fluorescence and the wavelength range of the second excitation light at least partially overlap with each other.
  • the distance P further satisfies 1.1 ⁇ (2 ⁇ P 0 + 2 ⁇ P 1 + 4 ⁇ P 2 + 4 ⁇ P 3 ) ⁇ P, and more preferably 1.2 ⁇ (2 ⁇ P 0 + 2 ⁇ P 1 + 4 ⁇ ). P 2 + 4 ⁇ P 3 ) ⁇ P.
  • the distance P may satisfy P ⁇ S ⁇ 2 ⁇ ⁇ S (where S is the length of a linear portion of the flow path where the first optical head and the second optical head are arranged, and ⁇ S is 1 mm).
  • a light absorbing layer that absorbs excitation light may be provided between the bottom of the flow path and the second main surface of the substrate.
  • This apparatus is a reaction processing container including a substrate having a flow path for moving a sample formed on a first main surface, and a flow path sealing film provided on the first main surface so as to seal the flow path.
  • a first optical head including a first objective lens that irradiates the sample in the flow path with the first excitation light and collects first fluorescence generated from the sample by the irradiation of the first excitation light;
  • a second optical head including a second objective lens for irradiating the sample in the flow path with light and condensing second fluorescence generated from the sample by the irradiation of the second excitation light; a first optical head and a second optical head A holding member for holding the head.
  • the first optical head and the second optical head are arranged side by side in the longitudinal direction of the flow path, and the wavelength range of the first fluorescence and the wavelength range of the second excitation light at least partially overlap each other.
  • a light absorbing layer for absorbing light is provided.
  • the light absorption layer may be formed so that the absorption coefficient ⁇ satisfies ⁇ ⁇ 0.58 / t 3 ′ (where t 3 ′ is the thickness of the light absorption layer).
  • the light absorption layer may be formed such that the absorption coefficient ⁇ satisfies ⁇ ⁇ 0.75 / t 3 ′ (where t 3 ′ is the thickness of the light absorption layer).
  • the light absorption layer may be formed such that the absorption coefficient ⁇ satisfies ⁇ ⁇ 1.15 / t 3 ′ (where t 3 ′ is the thickness of the light absorption layer).
  • the light absorbing layer may be provided between the bottom of the flow path and the second main surface of the substrate.
  • the light absorbing layer may be provided on the second main surface of the substrate.
  • the present invention it is possible to provide a technology capable of suppressing interference between fluorescence detection devices in a reaction processing device including a plurality of fluorescence detection devices.
  • FIGS. 1A and 1B are views for explaining a reaction processing container that can be used in the reaction processing apparatus according to the embodiment of the present invention. It is a schematic diagram for explaining the reaction processing apparatus concerning the embodiment of the present invention. It is a figure for explaining composition of a fluorescence detecting device.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a state where a first optical head of a first fluorescence detection device and a second optical head of a second fluorescence detection device are arranged. It is a figure showing a model of optical simulation.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining derivation of a center-to-center distance between two optical heads.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a change in a relative noise amount when a distance between centers of two optical heads is changed in the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram illustrating a change in a relative noise amount when a distance between centers of two optical heads is changed in the second embodiment of the present invention.
  • FIGS. 1A and 1B are diagrams for explaining a reaction processing container 10 that can be used in the reaction processing apparatus according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 1A is a plan view of the reaction processing container 10
  • FIG. 1B is a front view of the reaction processing container 10.
  • the reaction processing container 10 includes a substrate 14 and a flow path sealing film 16.
  • the substrate 14 is preferably formed of a material that is stable against temperature changes and hardly corroded by a sample solution to be used. Further, the substrate 14 is preferably formed of a material having good moldability, good transparency and good barrier properties, and low autofluorescence. As such a material, inorganic materials such as glass and silicon (Si), as well as resins such as acryl, polypropylene, polyester, and silicone, among them, cycloolefin are preferable.
  • An example of the dimensions of the substrate 14 is a long side 75 mm, a short side 25 mm, and a thickness 4 mm.
  • a groove-shaped flow path 12 is formed in the first main surface 14a of the substrate 14, and the flow path 12 is sealed with a flow path sealing film 16.
  • An example of the dimensions of the flow path 12 formed on the first main surface 14a of the substrate 14 is 0.7 mm in width and 0.7 mm in depth.
  • a first communication port 17 communicating with the outside is formed at one end of the flow path 12 in the substrate 14.
  • a second communication port 18 is formed at the other end of the flow path 12 in the substrate 14.
  • a pair of first communication ports 17 and second communication ports 18 formed at both ends of the flow path 12 are formed so as to be exposed on the second main surface 14b (the surface opposite to the first main surface 14a) of the substrate 14. Have been.
  • Such a substrate can be produced by injection molding or cutting by an NC machine.
  • a flow path sealing film 16 is adhered on the first main surface 14a of the substrate 14.
  • most of the channel 12 is formed in a groove shape exposed on the first main surface 14 a of the substrate 14. This is to enable easy molding by injection molding using a mold or the like.
  • a flow path sealing film 16 is attached on the first main surface 14a of the substrate 14.
  • the flow path sealing film 16 may have one main surface having tackiness or adhesiveness, or a functional layer exhibiting tackiness or adhesiveness by pressing, irradiating energy such as ultraviolet rays, heating, or the like. It may be formed on the main surface, and has a function of being easily brought into close contact with and integrated with the first main surface 14a of the substrate 14.
  • the channel sealing film 16 is desirably formed of a material having low autofluorescence including an adhesive.
  • a transparent film made of a resin such as cycloolefin, polyester, polypropylene, polyethylene or acrylic is suitable, but not limited thereto.
  • the channel sealing film 16 may be formed from a plate-like glass or resin. In this case, since rigidity can be expected, it is useful for preventing the reaction processing container 10 from warping or deforming.
  • the flow path 12 has a reaction region in which the temperature can be controlled at a plurality of levels by a reaction processing device described later.
  • a thermal cycle can be given to a sample by moving the sample so as to continuously reciprocate in a reaction region where a plurality of levels of temperatures are maintained.
  • the reaction region of the flow channel 12 shown in FIGS. 1A and 1B includes a meandering flow channel that is continuously folded and combines a curved portion and a straight portion.
  • the right side of the flow path 12 in the drawing becomes a relatively high temperature (about 95 ° C.) area (hereinafter, referred to as a “high temperature area”).
  • the left side is expected to be a lower temperature region (about 60 ° C.) (hereinafter, referred to as “low temperature region”).
  • the reaction region of the flow path 12 includes a connection region connecting the high temperature region and the low temperature region. This connection region may be a straight channel.
  • the effective area of a heater or the like constituting a temperature control unit described later can be effectively used, and the temperature variation in the reaction region can be improved.
  • the sample to be subjected to the thermal cycle is introduced into the flow channel 12 from one of the first communication port 17 and the second communication port 18.
  • the method of introduction is not limited to these methods.
  • an appropriate amount of sample may be directly introduced from the communication port using a pipette, a dropper, a syringe, or the like.
  • an introduction method may be adopted in which contamination is prevented through a cone-shaped needle tip having a built-in filter made of porous PTFE or polyethylene.
  • Many types of such needle tips are generally sold and readily available, and can be used by being attached to the tip of a pipette, dropper, syringe, or the like.
  • the sample may be moved to a predetermined position in the flow path by further pressing and pushing.
  • a primer that specifically reacts with the DNA to be subjected to the reaction treatment, and, in some cases, a fluorescent probe such as TaqMan are mixed (TaqMan / Tacman is a registered trademark of Roche Diagnostics Deutschen Mits Bechlenkterquestioned).
  • a commercially available reagent kit for real-time PCR can also be used.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining the reaction processing apparatus 30 according to the embodiment of the present invention.
  • the reaction processing device 30 includes a reaction processing container mounting portion (not shown) on which the reaction processing container 10 is mounted, a temperature control system 32, and a CPU 36.
  • the temperature control system 32 applies a temperature of about 95 ° C. to a region on the right side of the flow path 12 of the reaction processing container 10 with respect to the reaction processing container 10
  • the high-temperature area) and the area on the left side of the drawing can be accurately maintained and controlled at about 60 ° C. (low-temperature area).
  • the temperature control system 32 maintains the temperature of each temperature region of the reaction region.
  • the temperature control system 32 includes a high-temperature heater 60 for heating the high-temperature region of the flow channel 12 and a low-temperature region of the flow channel 12.
  • a temperature sensor (not shown) such as a thermocouple for measuring the actual temperature of each temperature region, and a high-temperature heater driver 33 for controlling the temperature of the high-temperature heater 60.
  • a low-temperature heater driver 35 for controlling the temperature of the low-temperature heater 62.
  • the actual temperature information measured by the temperature sensor is sent to the CPU 36.
  • the CPU 36 controls each heater driver based on the actual temperature information of each temperature region so that the temperature of each heater becomes a predetermined temperature.
  • Each heater may be, for example, a resistance heating element, a Peltier element, or the like.
  • the temperature control system 32 may further include other component parts for improving the temperature controllability of each temperature region.
  • the reaction processing apparatus 30 further includes a liquid sending system 37 for moving the sample 20 introduced into the flow channel 12 of the reaction processing container 10 within the flow channel 12.
  • the liquid feeding system 37 includes a first pump 39, a second pump 40, a first pump driver 41 for driving the first pump 39, a second pump driver 42 for driving the second pump 40, A first tube 43 and a second tube 44 are provided.
  • One end of the first tube 43 is connected to the first communication port 17 of the reaction processing container 10. It is preferable that a packing 45 and a seal for ensuring airtightness are arranged at a connection portion between the first communication port 17 and one end of the first tube 43. The other end of the first tube 43 is connected to the output of the first pump 39. Similarly, one end of a second tube 44 is connected to the second communication port 18 of the reaction processing container 10. It is preferable that a packing 46 and a seal for ensuring airtightness are arranged at a connection portion between the second communication port 18 and one end of the second tube 44. The other end of the second tube 44 is connected to the output of the second pump 40.
  • the first pump 39 and the second pump 40 may be, for example, micro-blower pumps including a diaphragm pump.
  • a micro blower pump model MZB1001T02 manufactured by Murata Manufacturing Co., Ltd. can be used. This micro-blower pump can increase the pressure on the secondary side from the primary side during operation, but the pressure on the primary side and the pressure on the secondary side become equal at the moment of stop or at the time of stop.
  • the CPU 36 controls the blowing and pressurization from the first pump 39 and the second pump 40 via the first pump driver 41 and the second pump driver 42. Ventilation and pressurization from the first pump 39 and the second pump 40 act on the sample 20 in the flow path through the first communication port 17 and the second communication port 18 to move the sample 20 as a propulsive force. More specifically, by operating the first pump 39 and the second pump 40 alternately, the pressure applied to one of the end faces of the sample 20 becomes larger than the pressure applied to the other end, so that the propulsion related to the movement of the sample 20 is performed. Power is gained.
  • the sample 20 can be reciprocated in the flow path and stopped at each temperature region of the flow path 12 of the reaction processing container 10, As a result, a thermal cycle can be given to the sample 20.
  • the target DNA in the sample 20 is selectively amplified by repeatedly giving each step of denaturation in the high temperature region and annealing / extension in the low temperature region.
  • the high temperature region can be regarded as the denaturation temperature region
  • the low temperature region can be regarded as the annealing / elongation temperature region.
  • the time during which the sample 20 stays in each temperature region can be appropriately set by changing the time during which the sample 20 stops at a predetermined position in each temperature region.
  • the reaction processing device 30 further includes a first fluorescence detection device 50 and a second fluorescence detection device 54.
  • the predetermined fluorescent dye is added to the sample 20. Since the intensity of the fluorescent signal emitted from the sample 20 increases as the amplification of the DNA proceeds, the intensity value of the fluorescent signal can be used as an index as a material for determining the progress of the PCR or the end of the reaction.
  • the first fluorescence detection device 50 and the second fluorescence detection device 54 are Nippon Sheet Glass, which can measure quickly and detect fluorescence regardless of whether it is a bright place or a dark place with very compact optical system.
  • An optical fiber type fluorescence detector FLE-510 manufactured by Co., Ltd. can be used.
  • the wavelength characteristics of the excitation light / fluorescence can be tuned in advance so as to be suitable for the fluorescence characteristics emitted from the sample 20, and an optimal optical / detection system for samples having various characteristics is provided. It can be provided, and is suitable for detecting fluorescence from a sample present in a small or narrow area such as a flow path due to the small diameter of the light beam provided by the fiber optic fluorescence detector.
  • the first fluorescence detection device 50 connects the first optical head 51, the first excitation light source / detector module 52 for fluorescence detection, and the first optical head 51 and the first excitation light source / detector module 52 for fluorescence detection. And an optical fiber F12.
  • the second fluorescence detection device 54 includes a second optical head 55, a second excitation light source / detector module 56 for fluorescence detection, a second optical head 55, and a second excitation light source / detector module 56 for fluorescence detection.
  • the first excitation light source / detector module 52 for detecting fluorescence and the second excitation light source / detector module 56 for detecting fluorescence respectively include a light source for excitation light, a wavelength multiplexer / demultiplexer, and a fluorescence detector for controlling these. Drivers etc. are included.
  • the first optical head 51 and the second optical head 55 are each composed of an optical system such as a lens, and have a function of directional irradiation of the sample with the excitation light and a function of collecting fluorescence emitted from the sample.
  • the fluorescent light collected by the first optical head 51 and the second optical head 55 passes through optical fibers F12 and F22, respectively, and the first excitation light source / detector module 52 for detecting fluorescence and the second excitation light source / detector module for detecting second fluorescence.
  • the light is separated from the excitation light by the wavelength multiplexer / demultiplexer in 56 and is converted into an electric signal by the fluorescence detector. Details of the configuration of the fluorescence detection device will be described later.
  • the fluorescence from the sample 20 passing through a part of the region 12a (referred to as the “first fluorescence detection region 12a”) in the connection region connecting the high temperature region and the low temperature region is obtained.
  • the first optical head 51 is arranged so as to be able to detect.
  • the second optical head 55 is arranged so as to be able to detect fluorescence from the sample 20 passing through another part of the connection region 12b (referred to as “second fluorescence detection region 12b”).
  • the reaction proceeds, and the predetermined DNA contained in the sample 20 is amplified.
  • the progress of the DNA amplification is monitored. Can be known in real time.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the configuration of the fluorescence detection device.
  • FIG. 3 illustrates the configuration of the first fluorescence detection device 50, but the second fluorescence detection device 54 has the same configuration except that the center wavelength of the bandpass filter is different.
  • the first fluorescence detection device 50 includes a first optical head 51, a first excitation light source for fluorescence detection / detector module 52, a first optical head 51, and a first excitation light source for fluorescence detection / An optical fiber F12 for connecting to the detector module 52.
  • the first fluorescence detection excitation light source / detector module 52 includes a first excitation light source 64, a first wavelength multiplexer / demultiplexer 65, and a first fluorescence detector 66, and these functional elements are optical fibers. The excitation light and the fluorescent light propagate in the optical fiber.
  • a bandpass filter A1 is arranged near the first excitation light source 64 so that the excitation light emitted from the first excitation light source 64 is transmitted.
  • the first wavelength multiplexer / demultiplexer 65 has a bandpass filter B1.
  • a band-pass filter C1 is arranged near the first fluorescence detector 66 so that the fluorescence incident on the first fluorescence detector 66 is transmitted.
  • the wavelength characteristics of these bandpass filters are designed according to the wavelength characteristics related to excitation / fluorescence of a fluorescent dye such as FAM.
  • Each bandpass filter transmits light in a specific wavelength range with high efficiency (for example, transmittance of 75% or more) and reflects light of other wavelengths with high efficiency (for example, reflectance of 75% or more; (Preferably 85% or more).
  • the first fluorescence detection device 50 is configured to be able to detect fluorescence from a sample containing FAM as a fluorescent dye.
  • the first excitation light source 64 is not particularly limited as long as it is a light source capable of separating light having a desired wavelength later.
  • a light source capable of separating light having a desired wavelength later.
  • an LD, an LED, a white light source or the like can be used.
  • Excitation light emitted from the first excitation light source 64 is separated by the band-pass filter A1, and only light within a predetermined range having a center wavelength of about 470 nm (hereinafter referred to as “excitation light OE1”) is transmitted through the optical fiber F11. Is propagated.
  • the pumping light OE1 enters the first wavelength multiplexer / demultiplexer 65, and reaches the bandpass filter B1 after being collimated by the lens L1. Since the bandpass filter B1 is designed to reflect the excitation light OE1, the excitation light OE1 is condensed again by the lens L1 and enters the optical fiber F12. The pumping light OE1 propagates through the optical fiber F12 and reaches the first optical head 51.
  • the first optical head 51 is provided with a first objective lens OB1, and the excitation light OE1 irradiates the sample 20 as excitation light at a predetermined working distance.
  • FIG. 3 shows an example in which a gradient index lens is used as the first objective lens OB1.
  • the fluorescent dye in the sample 20 is excited, and the sample 20 emits the fluorescent OF1.
  • the fluorescent light OF1 is collected by the first objective lens OB1 of the first optical head 51, enters the optical fiber F12, and propagates in the optical fiber F12.
  • the fluorescent light OF1 enters the first wavelength multiplexer / demultiplexer 65, and reaches the bandpass filter B1 after being collimated by the lens L1.
  • the wavelength of the fluorescent light generated by the irradiation of the excitation light is longer than the wavelength of the excitation light. That is, when the center wavelength of the excitation light is ⁇ e and the center wavelength of the fluorescence is ⁇ f, ⁇ e ⁇ f. Therefore, in order to guide only the fluorescence OF1 to the first fluorescence detector 66, a bandpass filter B1 having a spectral characteristic of reflecting light of the wavelength ⁇ e and transmitting light of the wavelength ⁇ f is used as the bandpass filter B1.
  • the bandpass filter B1 is designed to transmit light of a wavelength that does not overlap with the wavelength of the excitation light OE1 of the fluorescence OF1.
  • the fluorescence OF1 that has passed through the band-pass filter B1 is condensed by the lens L2 and enters the optical fiber F13. Further, since the band-pass filter B1 has a function of reflecting the excitation light and transmitting the fluorescence, it reflects light in the wavelength range including ⁇ e and transmits light in the wavelength range including ⁇ f, corresponding to the center wavelength. Edge filters that can be used can be used instead of bandpass filters.
  • the fluorescence OF1 that has propagated in the optical fiber F13 reaches the first fluorescence detector 66.
  • the fluorescence OF1 may pass through the band-pass filter C1 before entering the first fluorescence detector 66 in order to strictly adjust the wavelength range. Only light having a center wavelength of about 530 nm and having a wavelength within a predetermined range, which has passed through the band-pass filters B1 and C1, is incident on the first fluorescence detector 66.
  • the first fluorescence detector 66 is a photoelectric conversion element such as a PD, an APD, and a photomultiplier (photomultiplier). The signal converted into an electric signal by the first fluorescence detector 66 is subjected to signal processing described later.
  • each element may include a lens for efficiently transmitting and coupling light or improving the use efficiency of a bandpass filter.
  • a lens for efficiently transmitting and coupling light or improving the use efficiency of a bandpass filter.
  • a gradient index lens, a ball lens, an aspheric lens, or the like can be used.
  • a single mode fiber or a multi mode fiber can be used as the optical fibers F11, F12 and F13.
  • the first fluorescence detection device 50 configured as described above irradiates the sample with light having a center wavelength of 470 nm and a wavelength range of about 450 to 490 nm as the first excitation light OE1, and emits the center wavelength emitted from the sample. Is 530 nm and the first fluorescence OF1 having a wavelength range of about 510 to 550 nm is detected. Those skilled in the art can understand that the characteristics related to the wavelength are determined by the combination of the transmission or reflection characteristics of each band-pass filter as described above, and these can be changed or customized.
  • the second fluorescence detection device 54 is configured to be able to detect fluorescence from a sample containing ROX as a fluorescent dye.
  • the second fluorescence detector 54 irradiates the sample with light having a center wavelength of 530 nm and a wavelength range of about 510 to 550 nm as the second excitation light OE2, and has a center wavelength of 610 nm and a wavelength range of about 580 to 640 nm.
  • the second fluorescent OF2 is detected.
  • FIG. 4 shows a state where the first optical head 51 of the first fluorescence detection device 50 and the second optical head 55 of the second fluorescence detection device 54 are arranged.
  • the first optical head 51 is arranged so as to detect fluorescence from the sample 20 passing through the first fluorescence detection area 12a of the flow channel 12.
  • the second optical head 55 is arranged so that fluorescence can be detected from the sample 20 passing through the second fluorescence detection region 12b of the flow channel 12.
  • the first optical head 51 and the second optical head 55 are held by a holding member (not shown in FIG. 4, but see FIG. 5).
  • the first optical head 51 condenses the first excitation light OE1 propagated in the optical fiber F12 by the first objective lens OB1, and irradiates the sample 20 passing through the first fluorescence detection area 12a. Then, the first fluorescent light OF1 generated from the sample 20 is condensed by the first objective lens OB1, and is incident on the optical fiber F12.
  • the second optical head 55 condenses the second excitation light OE2 propagated in the optical fiber F22 with the second objective lens OB2, irradiates the second excitation light OE2 onto the sample 20 passing through the second fluorescence detection region 12b, and Is collected by the second objective lens OB2 and is incident on the optical fiber F22.
  • first objective lens OB1 and the second objective lens OB2 a lens or a lens group having a positive power, for example, a SELFOC (registered trademark) microlens that is a refractive index distribution lens can be used.
  • SELFOC registered trademark
  • first objective lens OB1 and the second objective lens OB2 for example, those having a diameter of 1.8 mm, a numerical aperture (NA) of 0.23, and a working distance (WD) of 1 mm to 3 mm can be used.
  • the first excitation light source of the first fluorescence detection device 50 is modulated by the first modulation signal and emits light in a blinking manner.
  • the second excitation light source of the second fluorescence detection device 54 is modulated by the second modulation signal and emits light in a blinking manner.
  • the first optical head 51 and the second optical head 55 are arranged side by side in the longitudinal direction of the flow channel 12 in order to detect the sample 20 passing through one flow channel 12.
  • the first fluorescence detection device 50 irradiates the first excitation light OE1 having a center wavelength of 470 nm and a wavelength range of about 450 to 490 nm, and has a center wavelength of 530 nm and a wavelength range of about 510 to 550 nm. A certain first fluorescence OF1 is detected.
  • the second fluorescence detector 54 irradiates the second excitation light OE2 having a center wavelength of 530 nm and a wavelength range of about 510 to 550 nm, and a second excitation light OE2 having a center wavelength of 610 nm and a wavelength range of about 580 to 640 nm.
  • the fluorescent OF2 is detected. Therefore, the wavelength range of the second excitation light OE2 (about 510 to 550 nm) and the wavelength range of the first fluorescence OF1 (about 510 to 550 nm) overlap.
  • the second excitation light OE2 when a part of the second excitation light OE2 emitted from the second optical head 55 is detected by the first optical head 51, the second excitation light OE2 is supplied to a band-pass filter at the subsequent stage of the first optical head 51. There is a possibility that the light is not removed by B1 and C1 and reaches the first fluorescence detector 66.
  • the second excitation light OE2 is noise in the first fluorescence detector 66, and there is a possibility that the first fluorescence OF1, which should be detected, cannot be detected.
  • FIG. 5 is a diagram showing a model of the optical simulation.
  • the first objective lens OB1 and the second objective lens OB2 have a diameter of 1.8 mm, a central refractive index of 1.616 (@ 530 nm), ⁇ A (optical constant) of 0.346 mm ⁇ 1 (@ 530 nm), A gradient index lens having a lens length of 4.45 mm was used.
  • the optical fibers F12 and F22 were multimode fibers having a core diameter of 200 ⁇ m, a cladding diameter of 220 ⁇ m, and an NA of 0.3.
  • the working distance between the objective lens and the multimode fiber was 1.8 mm.
  • the first objective lens OB1 and the second objective lens OB2 are held by a holding member 61 made of stainless steel.
  • the distance between the optical axis of the first objective lens OB1 and the optical axis of the second objective lens OB2 is referred to as “center-to-center distance P”.
  • Side surfaces of the first objective lens OB1 and the second objective lens OB2 are fixed to the holding member 61 via an epoxy adhesive layer having a thickness of 10 ⁇ m.
  • the upper surface 61a of the holding member 61 is flush with the end faces on the excitation light emission side of the first objective lens OB1 and the second objective lens OB2.
  • a 4 mm-thick cycloolefin polymer substrate (refractive index 1.53) was used as the substrate 14.
  • a channel 12 having a square cross section with a width of 0.7 mm and a depth of 0.7 mm is formed, and the lower surface of the channel 12 is sealed with a channel sealing film 16 (cycloolefin) having a thickness of 0.1 mm. It was made of polymer and sealed with a refractive index of 1.53).
  • the distance between the objective lens and the sample is based on a working distance of 1.8 mm (matched with the working distance between the objective lens and the multi-mode fiber), which is the same magnification imaging system, and the flow path is sealed in the optical path.
  • the light beam (corresponding to the excitation light) emitted from the second objective lens OB2 of the second optical head 55 is transmitted through the flow path 12, reflected by the second main surface 14b of the substrate 14, and The reflected light passes through the flow path 12 in the opposite direction. Thereafter, the light beam is reflected on the upper surface 61a of the holding member 61 between the two objective lenses, passes through the flow path 12 again, and is reflected on the second main surface 14b of the substrate 14. The reflected light again passes through the flow path 12 in the reverse direction, is received by the first objective lens OB1 of the first optical head 51, and is emitted through the optical fiber F12. From this optical simulation, it was found that the excitation light emitted from one optical head circulated as noise to the other optical head due to such an optical path.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the derivation of the center distance P between two optical heads.
  • the light beam emitted from the second objective lens OB2 of the second optical head 55 and received by the first objective lens OB1 of the first optical head 51 Is the angle between the optical axis of the second objective lens OB2 (the incident angle with respect to the flow path sealing film 16) and ⁇ , the air layer 63 between the second objective lens OB2 and the flow path sealing film 16 and the flow path sealing film.
  • the angle of refraction at the interface with the channel 16 is ⁇ 1
  • the angle of refraction at the interface between the channel sealing film 16 and the channel 12 is ⁇ 2
  • the angle of refraction at the interface between the channel 12 and the substrate 14 is ⁇ 3
  • the refractive index of the flow path sealing film 16 is n 1
  • the refractive index of the flow path 12 is n 2 (differs depending on whether a sample exists in the flow path 12 or not (ie, in the case of air))
  • the refractive index and n 3 the Snell's law for each interface
  • the center-to-center distance P between the two optical heads can be expressed as the following equation (2) as the sum of the longitudinal components of the optical path in the flow path.
  • P (L ⁇ tan ⁇ + t 1 ⁇ tan ⁇ 1 + 2 ⁇ t 2 ⁇ tan ⁇ 2 + 2 ⁇ t 3 ⁇ tan ⁇ 3 )
  • ⁇ 2 2 ⁇ L ⁇ tan ⁇ + 2 ⁇ t 1 ⁇ tan ⁇ 1 + 4 ⁇ t 2 ⁇ tan ⁇ 2 + 4 ⁇ t 3 ⁇ tan ⁇ 3 (2)
  • L is the distance from the upper surface 61a of the holding member 61 to the flow path seal film 16 (mm)
  • the thickness of t 1 is the flow path seal film 16 (mm)
  • t 2 is the channel 12 depth (mm)
  • t 3 is the thickness from the bottom of the channel 12 to the second main surface 14b of the substrate 14 (mm).
  • Equation (1) 2 ⁇ L ⁇ sin ⁇ / ⁇ (1 ⁇ sin 2 ⁇ ) + 2 ⁇ t 1 ⁇ sin ⁇ 1 / ⁇ (1 ⁇ sin 2 ⁇ 1 ) + 4 ⁇ t 2 ⁇ sin ⁇ 2 / ⁇ (1 ⁇ sin 2 ⁇ 2 ) + 4 ⁇ t 3 ⁇ sin ⁇ 3 / ⁇ (1 ⁇ sin 2 ⁇ 3 ) (5)
  • the third term on the right side becomes large when n 2 is small (that is, when the sample is not contained in the flow channel 12 and the air is air), and the center-to-center distance P becomes ⁇ at the maximum value ⁇ .
  • the maximum value P max is obtained.
  • P max 2 ⁇ P 0 + 2 ⁇ P 1 + 4 ⁇ P 2 + 4 ⁇ P 3 (7)
  • P 0 L ⁇ NA / ⁇ (1 ⁇ NA 2 )
  • P 1 t 1 ⁇ NA / ⁇ (n 1 2 -NA 2)
  • P 2 t 2 ⁇ NA / ⁇ (1-NA 2 )
  • P 3 t 3 ⁇ NA / ⁇ (n 3 2 -NA 2 )
  • the center distance P satisfies the following expression (8).
  • P max 2 ⁇ P 0 + 2 ⁇ P 1 + 4 ⁇ P 2 + 4 ⁇ P 3 ⁇ P (8)
  • 1.1 ⁇ P max ⁇ P that is, safety factor 1.1
  • 1.2 ⁇ P max ⁇ P that is, safety factor 1.2
  • the upper limit of the center-to-center distance P can be determined according to the length S (mm) of the linear portion of the flow path 12 where the two optical heads are arranged.
  • the length S of the straight portion of the flow channel 12 is the length of the connection region in the flow channel 12 (see FIG. 1).
  • each of the first optical head 51 and the second optical head 55 is disposed such that the optical axis is located inside by a predetermined length ⁇ S (mm) from the end of the linear portion of the flow channel 12. That is, the two optical heads are preferably arranged so that the center-to-center distance P satisfies P ⁇ S ⁇ 2 ⁇ ⁇ S.
  • ⁇ S may be 1 mm.
  • the flow path 12 has a square cross section.
  • the cross section of the flow path 12 may be, for example, a rectangle, a trapezoid, a semicircle, or any other shape.
  • a point intersecting with the optical axis of the channel 12 can be treated as the bottom of the flow channel 12 in the same manner as described above.
  • a light absorbing layer that absorbs excitation light may be provided between the bottom of the flow channel 12 in the substrate 14 and the second main surface 14b.
  • excitation light circulating from one optical head (second optical head 55) to the other optical head (first optical head 51) as noise light is applied to the bottom of the flow channel 12 in the substrate 14 and the second optical head.
  • the light passes through the gap with the main surface 14b four times. Therefore, by providing the light absorbing layer between the bottom of the flow path 12 in the substrate 14 and the second main surface 14b, noise light circulating from one optical head to the other optical head can be attenuated. It is possible to reliably suppress interference between the fluorescence detection devices.
  • Example 1 In the first embodiment, in the configuration shown in FIG. 5, the upper surface 61a of the holding member 61 between the two objective lenses is mirror-finished (light reaching the upper surface 61a is reflected according to Snell's law in order to emphasize and evaluate the reflected light.
  • FIG. 7 shows a change in the relative intensity of the light beam when the distance P between the centers of the two optical heads is changed in the range of 2.5 mm to 8.0 mm.
  • a gradient index lens having a specification capable of effectively capturing light emitted from a multi-mode fiber with an NA of 0.3 is used as an objective lens.
  • the configuration is such that the working distances on the emission side are equal (equal-magnification imaging system). Therefore, the NA corresponding to the opening angle, which is the angle at which the incident light is viewed from the focal position on the optical axis in the absence of the flow path sealing film 16, may be considered to be substantially equal to the NA of the light emitted from the multimode fiber. it can.
  • Example 2 In Example 2, a pinhole of ⁇ 0.8 mm was arranged on the emission end face of the second objective lens OB2 of the second optical head 55. Other conditions were the same as in Example 1, and the intensity of the light beam reaching the evaluation surface was determined by optical simulation.
  • FIG. 8 shows a change in the relative intensity of the light beam when the distance P between the centers of the two optical heads is changed in the range of 2.5 mm to 6.0 mm.
  • L 1.735 mm
  • NA 0.22
  • t 1 0.1 mm
  • t 2 0.7 mm
  • t 3 3.3 mm
  • the absorbance of a substance can be represented by ⁇ ln (I / I 0 ).
  • the absorbance of the light absorbing layer may be set to --1 ⁇ ln (0.1) ⁇ 0.58. Therefore, if the absorbance A of the light absorbing layer of the substrate 14 satisfies A ⁇ 0.58, the intensity of the noise light circulating from one optical head to the other optical head can be reduced to 10% or less.
  • the actual rays, as shown in FIG 6, is incident at an angle theta 3 to light-absorbing layer of the substrate 14.
  • the thickness of the light absorbing layer is t 3 ′
  • the optical path length when transmitted once through the light absorbing layer is t 3 ′ / cos ⁇ 3 , but with a margin
  • the minimum value t 3 ′ is treated as the optical path length.
  • the light absorbing layer may be provided so as to satisfy the absorption coefficient ⁇ ⁇ 0.58 / t 3 ′ at the thickness t 3 ′.
  • the light absorbing layer that reduces the noise light to 10% has been described. However, it is more preferable that the noise light can be reduced to 5%, and it is more preferable that the noise light can be reduced to 1%.
  • the light is adjusted so as to satisfy the absorption coefficient ⁇ ⁇ ⁇ / ⁇ ln (0.05) / t 3 ⁇ ⁇ 0.75 / t 3 ′ ”for the target wavelength. What is necessary is just to provide an absorption layer.
  • the absorption coefficient ⁇ ⁇ ⁇ / ⁇ ln (0.01) / t 3 ′ ⁇ 1.15 / t 3 ′ should be satisfied for the target wavelength. May be provided with a light absorbing layer.
  • the light-absorbing layer may be provided on the entire surface of the substrate 14 between the bottom of the flow path 12 and the second main surface 14b by forming the substrate 14 itself from a light-absorbing material. May be provided in a part of the vertical direction.
  • a light absorbing layer may be separately provided on the second main surface 14b of the substrate 14 in a state where the refractive index is matched with that of the substrate 14.
  • “a state in which the refractive index is matched” means that the difference in the refractive index before and after the interface is 0.025 or less.
  • the third embodiment is an embodiment in which a light absorbing layer is provided on the whole of the substrate 14 between the bottom of the flow channel 12 and the second main surface 14b.
  • L 1.735 mm
  • NA 0.3
  • t 1 0.1 mm
  • t 2 0.7 mm
  • t 3 3.3 mm
  • n 1 1. 53
  • n 3 1.53.
  • the intensity of a light beam reaching the evaluation surface was determined by optical simulation in the same manner as in Example 1.
  • Example 3 As a result of the optical simulation, in Example 3, the relative noise amount was 0.02 when no sample was present in the flow channel 12 and was 0.03 when the sample was present in the flow channel 12.
  • the relative noise amount when the sample does not exist in the flow channel 12 is 0.19. Since the relative noise amount when present was 0.31, it was confirmed that the third embodiment in which the light absorbing layer was provided on the substrate 14 could reduce the noise amount to about 10% as compared with the first embodiment.
  • Embodiment 4 is an embodiment in which a light absorbing layer is provided on the second main surface 14b of the substrate 14.
  • a 0.8 mm pinhole is arranged on the emission end face of the second objective lens OB2 of the second optical head 55.
  • a refractive index of 1.53 and a thickness of 0.1 mm are provided on the second main surface 14b of the substrate 14 via a substantially non-absorbing resin layer having a refractive index of 1.53 and a thickness of 0.1 mm.
  • Example 4 As a result of the optical simulation, in Example 4, the relative noise amount was 0.1. From FIG. 8, in the second embodiment, when the distance P between the center points is 2.75 mm, the relative noise amount when the sample exists in the flow channel 12 is 0.85. It was confirmed that Example 4 in which the light absorbing layer was provided on the surface 14b could reduce the noise amount to about 12% as compared with Example 2.
  • Example 5 In the fifth embodiment, only the absorption coefficient of the light absorption layer provided on the second main surface 14b of the substrate 14 is changed from the fourth embodiment.
  • Example 5 in which the absorption coefficient ⁇ of the light absorbing layer was 7.5 cm ⁇ 1 , the refractive index of the resin layer provided between the substrate 14 and the light absorbing layer was 1.530 to 1.505 (refractive index). (Difference: 0.025), and the same optical simulation was performed. The maximum intensity of the light beam reaching the evaluation surface was 2% as compared with the case where the refractive index of the resin layer was 1.530. It was only increasing.
  • Example 6 Also in Example 6, only the absorption coefficient of the light absorption layer provided on the second main surface 14b of the substrate 14 was changed from Example 4.
  • the intensity of the light beam that reaches the evaluation surface is obtained by optical simulation as in the above-described embodiment.
  • the present invention can be used for the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction

Abstract

反応処理装置は、反応処理容器１０と、第１励起光を試料に照射するとともに、試料から生じた第１蛍光を集光する第１対物レンズＯＢ１を備える第１光学ヘッド５１と、第２励起光を試料に照射するとともに、試料から生じた第２蛍光を集光する第２対物レンズＯＢ２を備える第２光学ヘッド５５と、第１光学ヘッド５１および第２光学ヘッド５５を保持する保持部材６１を備える。第１蛍光の波長範囲と第２励起光の波長範囲は、少なくとも一部が重複している。第１対物レンズＯＢ１の光軸と第２対物レンズＯＢ２の光軸との間の距離Ｐは、２・Ｐ０＋２・Ｐ１＋４・Ｐ２＋４・Ｐ３＜Ｐ、Ｐ０＝Ｌ・ＮＡ／√（１－ＮＡ２）、Ｐ１＝ｔ１・ＮＡ／√（ｎ１ ２－ＮＡ２）、Ｐ２＝ｔ２・ＮＡ／√（１－ＮＡ２）、Ｐ３＝ｔ３・ＮＡ／√（ｎ３ ２－ＮＡ２）を満たす。

Description

反応処理装置
　本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）に使用される反応処理装置に関する。
　遺伝子検査は、各種医学分野における検査、農作物や病原性微生物の同定、食品の安全性評価、さらには病原性ウィルスや各種感染症の検査にも広く活用されている。微小量のＤＮＡを高感度に検出するために、ＤＮＡの一部を増幅して得られたものを分析する方法が知られている。中でもＰＣＲを用いた方法は、生体等から採取されたごく微量のＤＮＡのある部分を選択的に増幅する注目の技術である。
　ＰＣＲは、ＤＮＡを含む生体サンプルと、プライマーや酵素などからなるＰＣＲ試薬とを混合した試料に、所定のサーマルサイクルを与え、変性、アニーリングおよび伸長反応を繰り返し起こさせて、ＤＮＡの特定の部分を選択的に増幅させるものである。
　ＰＣＲにおいては、対象の試料をＰＣＲチューブまたは複数の穴が形成されたマイクロプレート（マイクロウェル）などの反応処理容器に所定量入れて行うことが一般的であるが、近年、基板に形成された微細な流路を備える反応処理容器（チップとも呼ばれる）を用いて行うことが実用化されてきている（例えば特許文献１）。
特開２００９－２３２７００号公報
　上記のような流路を備える反応処理容器を用いたＰＣＲでは、試料の定量的な変化を検出するなどの目的のために蛍光検出装置が用いられる場合がある。試料に蛍光色素を添加し、ＰＣＲの間に蛍光検出装置を用いて試料に励起光を照射し、試料から発せられる蛍光を検出する。ＤＮＡの増幅が進むにつれ試料から発せられる蛍光の強度が増加するので、その蛍光の強度値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。
　ＰＣＲでは、増幅対象によっては複数の蛍光色素を混ぜた試薬をもちいることが多く、この場合は蛍光検出装置を複数設置する必要がある。特に板状の反応処理容器内に形成された流路中を移動させながら、試料からの蛍光を検出するような反応処理装置においては、断面積が例えば２ｍｍ２以下の一本の流路を通過する試料からの蛍光を検出するために、流路の延長方向に複数の蛍光検出装置を配列する必要がある。
　例えば、ＰＣＲでＯ－１５７を増幅する場合は、ＶＴ１，ＶＴ２を同時に測定することになり、例えば東洋紡株式会社の検査キット（ＦＩＫ－３６２）は、蛍光色素にＲＯＸ（略緑色光の照射により励起され、略赤色の蛍光を発する蛍光色素であり、以下このような蛍光の特性を「緑励起／赤蛍光」と称する）、Ｃｙ５（赤励起／赤外蛍光）を使用している。この場合、２つの蛍光検出装置が必要となる。
　また、ノロウイルスを検出する場合にはＧ１，Ｇ２を同時に測定することになり、例えばタカラバイオ株式会社の検査キット（ＲＲ２５５Ａ）および東洋紡株式会社の検査キット（ＦＩＫ－２５３）は共に、蛍光色素にＦＡＭ（青励起／緑蛍光）、ＲＯＸ（緑励起／赤蛍光）、Ｃｙ５（赤励起／赤外蛍光）を使用している。この場合は３つの蛍光検出装置が必要となる。
　このように複数の蛍光検出装置を用いて流路を通過する試料に対して蛍光検出を行う場合、蛍光検出装置間で干渉が生じる可能性がある。以下、例を挙げて説明する。
　蛍光色素として、ＦＡＭとＲＯＸを同時に試料に添加して使用する場合、ＲＯＸを励起するために照射する励起光の略緑色に相当する光の波長範囲と、ＦＡＭから発せられる蛍光の略緑色に相当する光の波長範囲が一部重なることがある。その場合、ＲＯＸを励起するために照射した励起光の一部が、ＦＡＭから発せられる蛍光を検出するための光電変換素子などの光検出器に入ると、ノイズになり、高感度の測定をすることができない虞がある。通常、励起光の光量は数十μＷであり、一方、検出対象の蛍光の光量は数ｐＷ以下のオーダである。蛍光検出装置はこのような微弱な光量の蛍光を検出するように構成されているところ、励起光がほんの一部でも該光検出器に到達してしまうと、大きなノイズとなって現れるからである。
　また、蛍光色素としてＲＯＸとＣｙ５を同時に試料に添加して使用する場合、Ｃｙ５を励起するために照射する励起光の略赤色の光の波長範囲と、ＲＯＸから発せられる蛍光の略赤色に相当する光の波長範囲が一部重なることがある。この場合も、Ｃｙ５を励起するために照射した励起光の一部が、ＲＯＸから発せられる蛍光を検出するための光検出器に入ると、ノイズになり、高感度の蛍光測定を行うことができない虞がある。
　本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、複数の蛍光検出装置を備える反応処理装置において、蛍光検出装置間の干渉を抑制できる技術を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明のある態様の反応処理装置は、試料が移動する流路が第１主面に形成された基板と、流路を封止するように第１主面上に設けられた流路封止フィルムとを備える反応処理容器と、第１励起光を流路中の試料に照射するとともに、第１励起光の照射により試料から生じた第１蛍光を集光する第１対物レンズを備える第１光学ヘッドと、第２励起光を流路中の試料に照射するとともに、第２励起光の照射により試料から生じた第２蛍光を集光する第２対物レンズを備える第２光学ヘッドと、第１光学ヘッドおよび第２光学ヘッドを保持する保持部材とを備える。第１光学ヘッドおよび第２光学ヘッドは、流路の長手方向に並んで配置され、第１蛍光の波長範囲と第２励起光の波長範囲は、少なくとも一部が重複しており、第１対物レンズの光軸と第２対物レンズの光軸との間の距離Ｐは、２・Ｐ０＋２・Ｐ１＋４・Ｐ２＋４・Ｐ３＜Ｐ、ここでＰ０＝Ｌ・ＮＡ／√（１－ＮＡ２）、Ｐ１＝ｔ１・ＮＡ／√（ｎ１ ２－ＮＡ２）、Ｐ２＝ｔ２・ＮＡ／√（１－ＮＡ２）、Ｐ３＝ｔ３・ＮＡ／√（ｎ３ ２－ＮＡ２）を満たす（ただし、Ｌは保持部材から流路封止フィルムまでの距離、ｔ１は流路封止フィルムの厚さ、ｔ２は流路の深さ、ｔ３は流路の底部から基板の第２主面までの厚さ、ＮＡは第１対物レンズおよび第２対物レンズの開口数、ｎ１は流路封止フィルムの屈折率、ｎ３は基板の屈折率）。
　距離Ｐは、さらに１．１×（２・Ｐ０＋２・Ｐ１＋４・Ｐ２＋４・Ｐ３）≦Ｐを満たし、さらに好ましくは１．２×（２・Ｐ０＋２・Ｐ１＋４・Ｐ２＋４・Ｐ３）≦Ｐを満たしてもよい。
　距離Ｐは、Ｐ≦Ｓ－２×ΔＳ（ただし、Ｓは第１光学ヘッドおよび第２光学ヘッドが配置される流路の直線部分の長さ、ΔＳは１ｍｍ）を満たしてもよい。
　基板における流路の底部と第２主面との間に、励起光を吸収する光吸収層を備えてもよい。
　本発明の別の態様もまた、反応処理装置である。この装置は、試料が移動する流路が第１主面に形成された基板と、流路を封止するように第１主面上に設けられた流路封止フィルムとを備える反応処理容器と、第１励起光を流路中の試料に照射するとともに、第１励起光の照射により試料から生じた第１蛍光を集光する第１対物レンズを備える第１光学ヘッドと、第２励起光を流路中の試料に照射するとともに、第２励起光の照射により試料から生じた第２蛍光を集光する第２対物レンズを備える第２光学ヘッドと、第１光学ヘッドおよび第２光学ヘッドを保持する保持部材と、を備える。第１光学ヘッドおよび第２光学ヘッドは、流路の長手方向に並んで配置され、第１蛍光の波長範囲と第２励起光の波長範囲は、少なくとも一部が重複しており、基板に励起光を吸収する光吸収層が設けられる。
　光吸収層は、吸収係数αがα≧０．５８／ｔ３’（ただしｔ３’は光吸収層の厚さ）を満たすように形成されてもよい。
　光吸収層は、吸収係数αがα≧０．７５／ｔ３’（ただしｔ３’は光吸収層の厚さ）を満たすように形成されてもよい。
　光吸収層は、吸収係数αがα≧１．１５／ｔ３’（ただしｔ３’は光吸収層の厚さ）を満たすように形成されてもよい。
　光吸収層は、流路の底部と基板の第２主面との間に設けられてもよい。光吸収層は、基板の第２主面上に設けられてもよい。
　本発明によれば、複数の蛍光検出装置を備える反応処理装置において、蛍光検出装置間の干渉を抑制できる技術を提供できる。
図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器を説明するための図である。 本発明の実施形態に係る反応処理装置を説明するための模式図である。 蛍光検出装置の構成を説明するための図である。 第１蛍光検出装置の第１光学ヘッドと第２蛍光検出装置の第２光学ヘッドが配置された状態を示す図である。 光学シミュレーションのモデルを示す図である。 ２つの光学ヘッドの中心間距離の導出を説明するための図である。 本発明の実施例１において、２つの光学ヘッドの中心間距離を変えたときの相対ノイズ量の変化を示す図である。 本発明の実施例２において、２つの光学ヘッドの中心間距離を変えたときの相対ノイズ量の変化を示す図である。
　以下、本発明の実施形態に係る反応処理装置について説明する。各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。
　図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の実施形態に係る反応処理装置で使用可能な反応処理容器１０を説明するための図である。図１（ａ）は、反応処理容器１０の平面図であり、図１（ｂ）は、反応処理容器１０の正面図である。
　図１（ａ）および図１（ｂ）に示すように、反応処理容器１０は、基板１４と、流路封止フィルム１６とから成る。
　基板１４は、温度変化に対して安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１４は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス、シリコン（Ｓｉ）等の無機材料をはじめ、アクリル、ポリプロピレン、ポリエステル、シリコーンなどの樹脂、中でもシクロオレフィンが好適である。基板１４の寸法の一例は、長辺７５ｍｍ、短辺２５ｍｍ、厚み４ｍｍである。
　基板１４の第１主面１４ａには溝状の流路１２が形成されており、この流路１２は、流路封止フィルム１６により封止されている。基板１４の第１主面１４ａに形成される流路１２の寸法の一例は、幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍである。基板１４における流路１２の一端の位置には、外部と連通する第１連通口１７が形成されている。基板１４における流路１２の他端の位置には、第２連通口１８が形成されている。流路１２の両端に形成された一対の第１連通口１７および第２連通口１８は、基板１４の第２主面１４ｂ（第１主面１４ａと反対側の面）に露出するように形成されている。このような基板は射出成形やＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。
　図１（ｂ）に示すように、基板１４の第１主面１４ａ上には、流路封止フィルム１６が貼られている。実施形態に係る反応処理容器１０において、流路１２の大部分は基板１４の第１主面１４ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１４の第１主面１４ａ上に流路封止フィルム１６が貼られる。
　流路封止フィルム１６は、一方の主面が粘着性や接着性を備えていてもよいし、押圧や紫外線などのエネルギー照射、加熱等により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１４の第１主面１４ａと密着して一体化できる機能を備える。流路封止フィルム１６は、粘着剤も含めて低い自己蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、流路封止フィルム１６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、反応処理容器１０の反りや変形防止に役立つ。
　流路１２は、後述する反応処理装置により複数水準の温度の制御が可能な反応領域を備える。複数水準の温度が維持された反応領域を連続的に往復するように試料を移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる。
　図１（ａ）および図１（ｂ）に示す流路１２の反応領域は、曲線部と直線部とを組み合わせた連続的に折り返す蛇行状の流路を含んでいる。後述の反応処理装置に反応処理容器１０が搭載された際に、流路１２の紙面右側が比較的高温（約９５℃）の領域（以下、「高温領域」と称する）となり、流路１２の左側がそれより低温（約６０℃）の領域（以下、「低温領域」と称する）となることが予定されている。また流路１２の反応領域は、高温領域と低温領域の間に両者を接続する接続領域を含む。この接続領域は、直線状の流路であってよい。
　本実施形態のように高温領域および低温領域を蛇行状の流路とした場合、後述の温度制御手段を構成するヒータ等の実効面積を有効に使うことができ、反応領域内での温度のばらつきを低減することが容易であるとともに、反応処理容器の実体的な大きさを小さくでき、反応処理装置を小さくできるという利点がある。
　サーマルサイクルに供される試料は、第１連通口１７および第２連通口１８のいずれか一方から流路１２に導入される。導入の方法はこれらに限られないが、例えばピペットやスポイト、シリンジ等で該連通口から適量の試料を直接導入してもよい。あるいは、多孔質のＰＴＦＥやポリエチレンからなるフィルタが内蔵してあるコーン形状のニードルチップを介してコンタミネーションを防止しながらの導入方法であってもよい。このようなニードルチップは一般的に数多くの種類のものが販売され容易に入手でき、ピペットやスポイト、シリンジ等の先端に取り付けて使用することが可能である。さらにピペットやスポイト、シリンジ等による試料の吐出、導入後、さらに加圧して推すことにより流路の所定の場所まで試料を移動させてもよい。
　試料としては、例えば、一または二以上の種類のＤＮＡを含む混合物に、ＰＣＲ試薬として蛍光色素、耐熱性酵素および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものがあげられる。さらに反応処理対象のＤＮＡに特異的に反応するプライマー、さらに、場合によってはＴａｑＭａｎ等の蛍光プローブを混合する（ＴａｑＭａｎ／タックマンはロシュ　ダイアグノスティックスゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツングの登録商標）。市販されているリアルタイムＰＣＲ用試薬キット等も使用することができる。
　図２は、本発明の実施形態に係る反応処理装置３０を説明するための模式図である。
　本実施形態に係る反応処理装置３０は、反応処理容器１０が載置される反応処理容器載置部（図示せず）と、温度制御システム３２と、ＣＰＵ３６とを備える。温度制御システム３２は、図２に示すように、反応処理容器載置部に載置される反応処理容器１０に対して、反応処理容器１０の流路１２における紙面右側の領域を約９５℃（高温領域）、紙面左側の領域を約６０℃（低温領域）に精度よく維持、制御できるように構成されている。
　温度制御システム３２は、反応領域の各温度領域の温度を維持するものであって、具体的には、流路１２の高温領域を加熱するための高温用ヒータ６０と、流路１２の低温領域を加熱するための低温用ヒータ６２と、各温度領域の実温度を計測するための例えば熱電対等の温度センサ（図示せず）と、高温用ヒータ６０の温度を制御する高温用ヒータドライバ３３と、低温用ヒータ６２の温度を制御する低温用ヒータドライバ３５とを備える。温度センサによって計測された実温度情報は、ＣＰＵ３６に送られる。ＣＰＵ３６は、各温度領域の実温度情報に基づいて、各ヒータの温度が所定の温度となるよう各ヒータドライバを制御する。各ヒータは例えば抵抗加熱素子やペルチェ素子等であってよい。温度制御システム３２はさらに、各温度領域の温度制御性を向上させるための他の要素部品を備えてもよい。
　本実施形態に係る反応処理装置３０は、さらに、反応処理容器１０の流路１２内に導入された試料２０を流路１２内で移動させるための送液システム３７を備える。送液システム３７は、第１ポンプ３９と、第２ポンプ４０と、第１ポンプ３９を駆動するための第１ポンプドライバ４１と、第２ポンプ４０を駆動するための第２ポンプドライバ４２と、第１チューブ４３と、第２チューブ４４とを備える。
　反応処理容器１０の第１連通口１７には、第１チューブ４３の一端が接続される。第１連通口１７と第１チューブ４３の一端の接続部には、気密性を確保するためのパッキン４５やシールが配置されることが好ましい。第１チューブ４３の他端は、第１ポンプ３９の出力に接続される。同様に、反応処理容器１０の第２連通口１８には、第２チューブ４４の一端が接続される。第２連通口１８と第２チューブ４４の一端の接続部には、気密性を確保するためのパッキン４６やシールが配置されることが好ましい。第２チューブ４４の他端は、第２ポンプ４０の出力に接続される。
　第１ポンプ３９、第２ポンプ４０は、例えばダイアフラムポンプからなるマイクロブロアポンプであってよい。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０としては、例えば株式会社村田製作所製のマイクロブロアポンプ（型式ＭＺＢ１００１Ｔ０２）などを使用することができる。このマイクロブロアポンプは、動作時に一次側より二次側の圧力を高めることができるが、停止した瞬間または停止時には一次側と二次側の圧力が等しくなる。
　ＣＰＵ３６は、第１ポンプドライバ４１、第２ポンプドライバ４２を介して、第１ポンプ３９、第２ポンプ４０からの送風や加圧を制御する。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０からの送風や加圧は、第１連通口１７、第２連通口１８を通じて流路内の試料２０に作用し、推進力となって試料２０を移動させる。より詳細には、第１ポンプ３９、第２ポンプ４０を交互に動作させることにより、試料２０のいずれかの端面にかかる圧力が他端にかかる圧力より大きくなるため、試料２０の移動に係る推進力が得られる。第１ポンプ３９、第２ポンプ４０を交互に動作させることによって、試料２０を流路内で往復式に移動させて、反応処理容器１０の流路１２の各温度領域で停止させることができ、その結果、試料２０にサーマルサイクルを与えることが可能となる。より具体的には、高温領域において変性、低温領域においてアニーリング・伸長の各工程を繰り返し与えることにより、試料２０中の目的のＤＮＡを選択的に増幅させる。言い換えれば高温領域は変性温度域、低温領域はアニーリング・伸長温度域とみなすことができる。また各温度領域に滞留する時間は、試料２０が各温度領域の所定の位置で停止する時間を変えることによって適宜設定することができる。
　本実施形態に係る反応処理装置３０は、さらに、第１蛍光検出装置５０および第２蛍光検出装置５４を備える。上述したように、試料２０には所定の蛍光色素が添加されている。ＤＮＡの増幅が進むにつれ試料２０から発せられる蛍光信号の強度が増加するので、その蛍光信号の強度値をＰＣＲの進捗や反応の終端の判定材料としての指標とすることができる。
　第１蛍光検出装置５０および第２蛍光検出装置５４としては、非常にコンパクトな光学系で、迅速に測定でき、かつ明るい場所か暗い場所かにもかかわらず、蛍光を検出することができる日本板硝子株式会社製の光ファイバ型蛍光検出器ＦＬＥ－５１０を使用することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、その励起光／蛍光の波長特性を試料２０の発する蛍光特性に適するようにチューニングしておくことができ、様々な特性を有する試料について最適な光学・検出系を提供することが可能であり、さらに光ファイバ型蛍光検出器によってもたらされる光線の径の小ささから、流路などの小さいまたは細い領域に存在する試料からの蛍光を検出するのに適している。
　第１蛍光検出装置５０は、第１光学ヘッド５１と、第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２と、第１光学ヘッド５１と第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２とを接続する光ファイバＦ１２とを備える。同様に、第２蛍光検出装置５４は、第２光学ヘッド５５と、第２蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５６と、第２光学ヘッド５５と第２蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５６とを接続する光ファイバＦ２２とを備える。
　第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２、第２蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５６にはそれぞれ、励起光用光源、波長合分波器、蛍光検出器、これらを制御するためのドライバ等が含まれている。第１光学ヘッド５１、第２光学ヘッド５５はそれぞれ、レンズ等の光学系からなり、励起光の試料への指向性照射と試料から発せられる蛍光の集光の機能を担う。第１光学ヘッド５１、第２光学ヘッド５５で集光された蛍光はそれぞれ、光ファイバＦ１２、Ｆ２２を通じて第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２、第２蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５６内の波長合分波器により励起光と分けられ、蛍光検出器によって電気信号に変換される。蛍光検出装置の構成の詳細については後述する。
　本実施形態に係る反応処理装置３０においては、高温領域と低温領域とを接続する接続領域内の一部の領域１２ａ（「第１蛍光検出領域１２ａ」と称する）を通過する試料２０から蛍光を検出することができるように第１光学ヘッド５１が配置される。また、接続領域内の別の一部の領域１２ｂ（「第２蛍光検出領域１２ｂ」と称する）を通過する試料２０から蛍光を検出することができるように第２光学ヘッド５５が配置される。試料２０は流路内を繰り返し往復移動させられることで反応が進み、試料２０に含まれる所定のＤＮＡが増幅するので、検出された蛍光の量の変動をモニタリングすることで、ＤＮＡの増幅の進度をリアルタイムで知ることができる。
　図３は、蛍光検出装置の構成を説明するための図である。図３では、第１蛍光検出装置５０の構成を説明するが、第２蛍光検出装置５４もバンドパスフィルタの中心波長が異なる点を除き、同じ構成である。
　図３に示すように、第１蛍光検出装置５０は、第１光学ヘッド５１と、第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２と、第１光学ヘッド５１と第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２とを接続する光ファイバＦ１２とを備える。第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール５２は、第１励起光源６４と、第１波長合分波器６５と、第１蛍光検出器６６とを備え、これらの機能性要素は光ファイバで接続されており、励起光および蛍光は光ファイバ内を伝搬する。
　第１励起光源６４の近傍には、第１励起光源６４から出射された励起光が透過するようにバンドパスフィルタＡ１が配置される。第１波長合分波器６５は、バンドパスフィルタＢ１を有している。第１蛍光検出器６６の近傍には、第１蛍光検出器６６に入射する蛍光が透過するようにバンドパスフィルタＣ１が配置される。これらのバンドパスフィルタの波長特性は、例えばＦＡＭなどの蛍光色素の励起／蛍光に関わる波長特性に応じて設計される。それぞれのバンドパスフィルタは、特定の波長の範囲の光を高い効率で透過（例えば透過率７５％以上）させ、それ以外の波長の光を高い効率で反射させる（例えば反射率が７５％以上；望ましくは８５％以上）分光機能を有する。
　本実施形態において第１蛍光検出装置５０は、ＦＡＭを蛍光色素として含有する試料からの蛍光を検出可能に構成される。
　第１励起光源６４は、後に目的の波長の光を分光することができる光源であれば特に限定されず、例えばＬＤやＬＥＤ、白色光源などを用いることができる。第１励起光源６４から出射した励起光は、バンドパスフィルタＡ１によって分光され、中心波長を約４７０ｎｍとする所定の範囲の波長の光（以下「励起光ＯＥ１」と称する）のみが光ファイバＦ１１内を伝搬する。
　励起光ＯＥ１は、第１波長合分波器６５に入射し、レンズＬ１によってコリメートされたのちにバンドパスフィルタＢ１に到達する。バンドパスフィルタＢ１は励起光ＯＥ１を反射するように設計されているので、励起光ＯＥ１はレンズＬ１によって再び集光され、光ファイバＦ１２に入射する。励起光ＯＥ１は光ファイバＦ１２内を伝搬し、第１光学ヘッド５１に到達する。第１光学ヘッド５１には第１対物レンズＯＢ１が備えられており、励起光ＯＥ１は所定の作動距離で試料２０に励起光として照射される。図３では、第１対物レンズＯＢ１として、屈折率分布型レンズを用いた例を示している。
　励起光ＯＥ１が試料２０に照射されると、試料２０内の蛍光色素が励起され、試料２０から蛍光ＯＦ１が出射される。蛍光ＯＦ１は第１光学ヘッド５１の第１対物レンズＯＢ１によって集光され、光ファイバＦ１２に入射し、光ファイバＦ１２内を伝搬する。蛍光ＯＦ１は、第１波長合分波器６５に入射し、レンズＬ１によってコリメートされたのちにバンドパスフィルタＢ１に到達する。
　一般的に、励起光の照射により生じる蛍光の波長は、励起光の波長よりも長くなる。すなわち、励起光の中心波長をλｅとし、蛍光の中心波長をλｆとすると、λｅ＜λｆである。そこで、蛍光ＯＦ１のみを第１蛍光検出器６６に導くために、バンドパスフィルタＢ１として、波長λｅの光を反射し、波長λｆの光を透過させるようなスペクトル特性を有するものを用いる。バンドパスフィルタＢ１は、蛍光ＯＦ１のうち励起光ＯＥ１の波長と重ならない範囲の波長の光を透過するように設計されている。バンドパスフィルタＢ１を通過した蛍光ＯＦ１は、レンズＬ２によって集光され光ファイバＦ１３に入射する。また、バンドパスフィルタＢ１は、励起光を反射し蛍光を透過させる機能を有するので、それらの中心波長に対応して、λｅを含む波長範囲の光を反射しλｆを含む波長範囲の光を透過させることのできるエッジフィルタをバンドパスフィルタの代わりに使用することができる。
　光ファイバＦ１３内を伝搬した蛍光ＯＦ１は、第１蛍光検出器６６に到達する。波長域を厳密に調整するために、蛍光ＯＦ１は第１蛍光検出器６６に入射する前にバンドパスフィルタＣ１を通過してもよい。第１蛍光検出器６６には、バンドパスフィルタＢ１とＣ１を通過した、中心波長を約５３０ｎｍとする所定の範囲の波長の光のみが入射する。第１蛍光検出器６６は、例えばＰＤやＡＰＤ、フォトマル（フォトマルチプライヤー）などの光電変換素子である。第１蛍光検出器６６によって電気的信号に変換された信号は、後述の信号処理がなされる。
　図３に示す第１蛍光検出装置５０において、各要素は、光を効率よく伝送や結合をさせたり、バンドパスフィルタの利用効率を向上させるためのレンズを含んでもよい。レンズとしては屈折率分布レンズ、ボールレンズや非球面レンズなどを用いることができる。また、図３に示す第１蛍光検出装置５０において、光ファイバＦ１１、Ｆ１２およびＦ１３はシングルモードファイバまたはマルチモードファイバなどを用いることができる。
　上記のように構成された第１蛍光検出装置５０は、中心波長が４７０ｎｍであり波長範囲が約４５０～４９０ｎｍの光を第１励起光ＯＥ１として試料に照射し、試料から発せられた、中心波長が５３０ｎｍであり波長範囲が約５１０～５５０ｎｍである第１蛍光ＯＦ１を検出する。波長に関する特性は、上記のように各バンドパスフィルタの透過または反射特性の組み合わせによって決定され、それらの変更やカスタマイズも可能であることは当業者が理解できるところである。
　一方、本実施形態において第２蛍光検出装置５４は、ＲＯＸを蛍光色素として含有する試料からの蛍光を検出可能に構成される。第２蛍光検出装置５４は、中心波長が５３０ｎｍであり波長範囲が約５１０～５５０ｎｍの光を第２励起光ＯＥ２として試料に照射し、中心波長が６１０ｎｍであり波長範囲が約５８０～６４０ｎｍである第２蛍光ＯＦ２を検出する。
　図４は、第１蛍光検出装置５０の第１光学ヘッド５１と第２蛍光検出装置５４の第２光学ヘッド５５が配置された状態を示す。第１光学ヘッド５１は、流路１２の第１蛍光検出領域１２ａを通過する試料２０から蛍光を検出できるように配置される。第２光学ヘッド５５は、流路１２の第２蛍光検出領域１２ｂを通過する試料２０から蛍光を検出できるように配置される。第１光学ヘッド５１および第２光学ヘッド５５は、保持部材（図４には図示せず、図５参照）により保持される。
　図４に示すように、第１光学ヘッド５１は、光ファイバＦ１２内を伝搬した第１励起光ＯＥ１を第１対物レンズＯＢ１で集光して第１蛍光検出領域１２ａを通過する試料２０に照射し、試料２０から発生した第１蛍光ＯＦ１を第１対物レンズＯＢ１で集光して光ファイバＦ１２に入射させる。同様に、第２光学ヘッド５５は、光ファイバＦ２２内を伝搬した第２励起光ＯＥ２を第２対物レンズＯＢ２で集光して第２蛍光検出領域１２ｂを通過する試料２０に照射し、試料２０から発生した第２蛍光ＯＦ２を第２対物レンズＯＢ２で集光して光ファイバＦ２２に入射させる。
　第１対物レンズＯＢ１、第２対物レンズＯＢ２としては、パワーが正のレンズまたはレンズ群、例えば屈折率分布レンズであるセルフォック（登録商標）マイクロレンズを使用することができる。第１対物レンズＯＢ１、第２対物レンズＯＢ２は、例えば直径が１．８ｍｍ、開口数（ＮＡ）が０．２３、作動距離（ＷＤ）が１ｍｍ～３ｍｍのものを使用できる。
　本実施形態において、第１蛍光検出装置５０の第１励起光源は、第１変調信号によって変調され、点滅発光する。同様に、第２蛍光検出装置５４の第２励起光源は、第２変調信号によって変調され、点滅発光する。
　本実施形態では、一本の流路１２を通過する試料２０を検出するために、第１光学ヘッド５１および第２光学ヘッド５５が流路１２の長手方向に並んで配置される。上述したように、第１蛍光検出装置５０は、中心波長が４７０ｎｍであり波長範囲が約４５０～４９０ｎｍの第１励起光ＯＥ１を照射し、中心波長が５３０ｎｍであり波長範囲が約５１０～５５０ｎｍである第１蛍光ＯＦ１を検出する。また、第２蛍光検出装置５４は、中心波長が５３０ｎｍであり波長範囲が約５１０～５５０ｎｍの第２励起光ＯＥ２を照射し、中心波長が６１０ｎｍであり波長範囲が約５８０～６４０ｎｍである第２蛍光ＯＦ２を検出する。したがって、第２励起光ＯＥ２の波長範囲（約５１０～５５０ｎｍ）と、第１蛍光ＯＦ１の波長範囲（約５１０～５５０ｎｍ）は、重複している。この場合、第２光学ヘッド５５から照射された第２励起光ＯＥ２の一部が第１光学ヘッド５１で検出されると、この第２励起光ＯＥ２は第１光学ヘッド５１の後段のバンドパスフィルタＢ１、Ｃ１では除去されず、第１蛍光検出器６６に到達する虞がある。この第２励起光ＯＥ２は第１蛍光検出器６６においてはノイズであり、本来検出すべき第１蛍光ＯＦ１を検出できない虞がある。
　第１光学ヘッド５１と第２光学ヘッド５５を十分離間して配置すればこのような問題は生じないが、この場合は反応処理装置３０のサイズが大型化する。本発明者は、このような背反する課題を解決すべく、２つの光学ヘッドを並べて配置した場合に一方の光学ヘッドから照射された励起光が他方の光学ヘッドにノイズとして回り込む現象を、光学シミュレーションにより解析した。
　図５は、光学シミュレーションのモデルを示す図である。本光学シミュレーションでは、第１対物レンズＯＢ１および第２対物レンズＯＢ２は、直径１．８ｍｍ、中心屈折率１．６１６（＠５３０ｎｍ）、√Ａ（光学定数）０．３４６ｍｍ－１（＠５３０ｎｍ）、レンズ長４．４５ｍｍの屈折率分布型レンズとした。光ファイバＦ１２、Ｆ２２は、コア径２００μｍ、クラッド径２２０μｍ、ＮＡ０．３のマルチモードファイバとした。対物レンズとマルチモードファイバとの間の作動距離は１．８ｍｍとした。
　また図５に示すように、第１対物レンズＯＢ１および第２対物レンズＯＢ２は、ステンレス製の保持部材６１により保持されるものとした。第１対物レンズＯＢ１の光軸と第２対物レンズＯＢ２の光軸との間の距離を「中心間距離Ｐ」と呼ぶ。第１対物レンズＯＢ１、第２対物レンズＯＢ２の側面は、厚さ１０μｍのエポキシ接着剤層を介して保持部材６１に固定される。また、保持部材６１の上面６１ａは、第１対物レンズＯＢ１、第２対物レンズＯＢ２の励起光出射側端面と面一となっている。
　反応処理容器１０に関しては、基板１４として、厚み４ｍｍのシクロオレフィンポリマ製基板（屈折率１．５３）を用いた。基板１４の下面には、幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍの断面正方形状の流路１２を形成し、流路１２の下面を厚さ０．１ｍｍの流路封止フィルム１６（シクロオレフィンポリマ製、屈折率１．５３）で封止した。本光学シミュレーションでは、流路１２中に、流路が空の場合は屈折率１の物質(空気に対応)が存在し、流路に試料がある場合は屈折率１．３３３の物質(水に対応)が存在するモデルを採用した。
　対物レンズと試料との間の距離は、等倍結像系となる作動距離１．８ｍｍ（対物レンズとマルチモードファイバとの間の作動距離と合わせる）を基準とし、光路中に流路封止フィルム１６が存在することによる結像位置のずれ分だけ補正して(遠ざけて)、流路１２の下面（流路封止フィルム１６の上面）が結像位置となるようにした。
　以上のようなモデルを構成して、光ファイバＦ２２の第２対物レンズＯＢ２と逆側の端面に光を入射させて第２対物レンズＯＢ２から光を照射した場合について、光学シミュレーションを行った。光学シミュレーションの結果が図５に図示されている。
　図５に示すように、第２光学ヘッド５５の第２対物レンズＯＢ２から発せられた光線(励起光に対応)は、流路１２を透過して基板１４の第２主面１４ｂで反射され、その反射光が流路１２を逆向きに透過する。その後、光線は２つの対物レンズ間の保持部材６１の上面６１ａで反射され、再び流路１２を透過して基板１４の第２主面１４ｂで反射される。その反射光が再度流路１２を逆向きに透過して第１光学ヘッド５１の第１対物レンズＯＢ１で受光され、光ファイバＦ１２を通って出射される。本光学シミュレーションから、このような光路により、一方の光学ヘッドから照射された励起光が他方の光学ヘッドにノイズとして回り込むことが分かった。
　図６は、２つの光学ヘッドの中心間距離Ｐの導出を説明するための図である。図５で説明したように、第２光学ヘッド５５の第２対物レンズＯＢ２から出射して第１光学ヘッド５１の第１対物レンズＯＢ１で受光される光線について、第２対物レンズＯＢ２から出射する光線が第２対物レンズＯＢ２の光軸となす角（流路封止フィルム１６に対する入射角)をθ、第２対物レンズＯＢ２と流路封止フィルム１６の間の空気層６３と流路封止フィルム１６との界面での屈折角をθ１、流路封止フィルム１６と流路１２との界面での屈折角をθ２、流路１２と基板１４との界面での屈折角をθ３、流路封止フィルム１６の屈折率をｎ１、流路１２の屈折率をｎ２（流路１２内に試料が存在する場合と存在しない場合（すなわち空気の場合）で異なる）、基板１４の屈折率をｎ３とすると、各界面に対してスネルの法則を適用することにより、以下の（１）式が成り立つ。
　ｓｉｎθ＝ｎ１・ｓｉｎθ１＝ｎ２・ｓｉｎθ２＝ｎ３・ｓｉｎθ３　・・・（１）
　また、幾何学的対称性を考慮して、２つの光学ヘッドの中心間距離Ｐは、光路の流路長手方向成分の和として以下の（２）式のように表すことができる。
Ｐ＝（Ｌ・ｔａｎθ＋ｔ１・ｔａｎθ１＋２・ｔ２・ｔａｎθ２＋２・ｔ３・ｔａｎθ３）×２
　＝２・Ｌ・ｔａｎθ＋２・ｔ１・ｔａｎθ１＋４・ｔ２・ｔａｎθ２＋４・ｔ３・ｔａｎθ３　・・・（２）
　（２）式において、Ｌは保持部材６１の上面６１ａから流路封止フィルム１６までの距離（ｍｍ）、ｔ１は流路封止フィルム１６の厚さ（ｍｍ）、ｔ２は流路１２の深さ（ｍｍ）、ｔ３は流路１２の底部から基板１４の第２主面１４ｂまでの厚さ（ｍｍ）である。
　ｓｉｎθとｔａｎθとの間には、以下の（３）式の関係が成り立つ。
　１／ｔａｎ２θ＋１＝１／ｓｉｎ２θ　・・・（３）
　（３）式を変形すると、以下の（４）式が得られる。
　ｔａｎθ＝ｓｉｎθ／√（１－ｓｉｎ２θ）　・・・（４）
　（４）式の関係を（２）式に適用すると、以下の（５）式が得られる。
　Ｐ＝２・Ｌ・ｓｉｎθ／√（１－ｓｉｎ２θ）＋２・ｔ１・ｓｉｎθ１／√（１－ｓｉｎ２θ１）＋４・ｔ２・ｓｉｎθ２／√（１－ｓｉｎ２θ２）＋４・ｔ３・ｓｉｎθ３／√（１－ｓｉｎ２θ３）　・・・（５）
　（５）式に（１）式を代入すると、以下の（６）式が得られる。
　Ｐ＝２・Ｌ・ｓｉｎθ／√（１－ｓｉｎ２θ）＋２・ｔ１・ｓｉｎθ／（√（ｎ１ ２－ｓｉｎ２θ））＋４・ｔ２・ｓｉｎθ／√（ｎ２ ２－ｓｉｎ２θ）＋４・ｔ３・ｓｉｎθ／√（ｎ３ ２－ｓｉｎ２θ）　・・・（６）
　（６）式において、右辺の第３項は、ｎ２が小さいとき（すなわち流路１２に試料が入っておらず、空気のとき）に大きくなり、中心間距離Ｐは、θが最大値θｍａｘ(開き角)のとき、すなわち光学ヘッドの対物レンズのＮＡに対応するθのときに最大値Ｐｍａｘとなる。
　以上より、θｍａｘに対応する開口数をＮＡとすると、Ｐｍａｘは、以下の（７）式のように表すことができる。
　Ｐｍａｘ＝２・Ｐ０＋２・Ｐ１＋４・Ｐ２＋４・Ｐ３　・・・（７）
　ただし、Ｐ０＝Ｌ・ＮＡ／√（１－ＮＡ２）
　　　　　Ｐ１＝ｔ１・ＮＡ／√（ｎ１ ２－ＮＡ２）
　　　　　Ｐ２＝ｔ２・ＮＡ／√（１－ＮＡ２）
　　　　　Ｐ３＝ｔ３・ＮＡ／√（ｎ３ ２－ＮＡ２）
　２つの光学ヘッドの中心間距離Ｐを（７）式で表されるＰｍａｘよりも大きくすれば、一方の光学ヘッド（第２光学ヘッド５５）から照射された励起光の他方の光学ヘッド（第１光学ヘッド５１）への回り込みを回避できる。すなわち、本実施形態に係る反応処理装置３０において、中心間距離Ｐは以下の（８）式を満たす。
　Ｐｍａｘ＝２・Ｐ０＋２・Ｐ１＋４・Ｐ２＋４・Ｐ３＜Ｐ　・・・（８）
　中心間距離Ｐが（８）式を満たすように光学ヘッドを配置することにより、一方の光学ヘッドから照射された励起光の他方の光学ヘッドへの回り込みを回避できるので、蛍光検出装置間の干渉を抑制できる。その結果、安定した蛍光信号が得られ、良好な測定精度を有する反応処理装置を実現することができる。
　ここで、各パラメータの誤差等を考慮して、１．１×Ｐｍａｘ≦Ｐ（すなわち安全率１．１）とすることが好ましく、１．２×Ｐｍａｘ≦Ｐ（すなわち安全率１．２）とすることがさらに好ましい。
　上記では、中心間距離Ｐの下限について説明したが、中心間距離Ｐの上限は、２つの光学ヘッドを配置する流路１２の直線部分の長さＳ（ｍｍ）に応じて定めることができる。流路１２の直線部分の長さＳは、流路１２における接続領域の長さである（図１参照）。第１光学ヘッド５１および第２光学ヘッド５５はそれぞれ、流路１２の直線部分の端から所定長ΔＳ（ｍｍ）だけ内側に光軸が位置するように配置されることが好ましい。すなわち、２つの光学ヘッドは、中心間距離ＰがＰ≦Ｓ－２×ΔＳを満たすように配置されることが好ましい。例えばΔＳは１ｍｍであってよい。このように光学ヘッドを配置することにより、安定した蛍光検出を行うことができる。
　なお、上述の実施形態では、流路１２を断面正方形状の流路としたが、流路１２の断面形状は、例えば長方形、台形、半円形、その他の任意の形状であってよく、光学ヘッドの光軸と交わる点を流路１２の底部として、上記と同様に扱うことができる。
　上述の実施形態において、基板１４における流路１２の底部と第２主面１４ｂとの間に、励起光を吸収する光吸収層を設けてもよい。図５に示すように、一方の光学ヘッド（第２光学ヘッド５５）からノイズ光として他方の光学ヘッド（第１光学ヘッド５１）に回り込む励起光は、基板１４における流路１２の底部と第２主面１４ｂとの間を４回透過している。従って、基板１４における流路１２の底部と第２主面１４ｂとの間に光吸収層を設けることにより、一方の光学ヘッドから他方の光学ヘッドに回り込むノイズ光を減衰させることができるので、より確実に蛍光検出装置間の干渉を抑制できる。
　次に、本発明の実施例を説明する。
（実施例１）
　実施例１では、図５に示す構成において、反射光を強調して評価するために２つの対物レンズ間の保持部材６１の上面６１ａを鏡面（上面６１ａに到達した光がスネルの法則に従って反射する面）とし、第２光学ヘッド５５の光ファイバＦ２２の端面の近傍から、φ２００μｍ(マルチモードファイバのコア径に対応)且つランバシャン１７．５°（マルチモードファイバのＮＡ（０．３）に対応）の条件で、光ファイバＦ２２に向けて２５０００本の光線（波長５３０ｎｍ）を出射させ、第１光学ヘッド５１の光ファイバＦ１２の端面の近傍に配置した評価面に到達する光線の強度を光学シミュレーションにより求めた。２つの光学ヘッドの中心間距離Ｐを２．５ｍｍ～８．０ｍｍの範囲で変えたときの光線の相対強度の変化を図７に示す。
　上記（７）式にＬ＝１．７３５ｍｍ、ＮＡ＝０．３、ｔ１＝０．１ｍｍ、ｔ２＝０．７ｍｍ、ｔ３＝３．３ｍｍ、ｎ１＝１．５３、ｎ３＝１．５３の各パラメータを代入すると、Ｐｍａｘ＝４．６５ｍｍと求められる。上記において、Ｐｍａｘ＜Ｐとすることで一方の光学ヘッドからの励起光が他方の光学ヘッドに回り込むことを防止できることを説明したが、図７に示すシミュレーション結果から、Ｐｍａｘ＝４．６５ｍｍ＜Ｐのときに、ノイズを十分小さく抑えられる（相対ノイズ量が約０．１以下）ことが確認できた。また、１．１×Ｐｍａｘ＝５．１２ｍｍ≦Ｐのときに、ノイズをより小さく抑えることができ（相対ノイズ量が約０．１未満）、１．２×Ｐｍａｘ＝５．５８ｍｍ≦Ｐのときに、確実にノイズの発生を抑えることができる（相対ノイズ量が０．０５未満）ことが確認できた。
　なお、実施例１では、対物レンズとしてＮＡ＝０．３のマルチモードファイバからの出射光を有効に取り込むことのできる仕様の屈折率分布型レンズを用いており、且つ、対物レンズの入射側・出射側の作動距離が等しくなるような構成(等倍結像系)にしている。したがって、流路封止フィルム１６がない状態で光軸上の焦点位置から入射光線を見込む角度である開き角に対応するＮＡは、マルチモードファイバからの出射光のＮＡと概略等しいと見なすことができる。
（実施例２）
　実施例２では、第２光学ヘッド５５の第２対物レンズＯＢ２の出射端面にφ０．８ｍｍのピンホールを配置した。それ以外の条件は実施例１と同様とし、評価面に到達する光線の強度を光学シミュレーションにより求めた。２つの光学ヘッドの中心間距離Ｐを２．５ｍｍ～６．０ｍｍの範囲で変えたときの光線の相対強度の変化を図８に示す。
　実施例２におけるＮＡは、流路封止フィルム１６がない状態での光軸上の焦点位置からピンホールの開口を見込む角度の正弦として、ＮＡ＝ｓｉｎθ＝ｓｉｎ（ｔａｎ－１（０．４／１．８））＝０．２２と求められる。上記（７）式にＬ＝１．７３５ｍｍ、ＮＡ＝０．２２、ｔ１＝０．１ｍｍ、ｔ２＝０．７ｍｍ、ｔ３＝３．３ｍｍ、ｎ１＝１．５３、ｎ３＝１．５３の各パラメータを代入すると、Ｐｍａｘ＝３．３６ｍｍと求められる。図８に示すシミュレーション結果から、Ｐｍａｘ＝３．３６ｍｍ＜Ｐのときに、ノイズを十分小さく抑えられる（相対ノイズ量が約０．１以下）ことが確認できた。また、１．１×Ｐｍａｘ＝３．７０ｍｍ≦Ｐのときに、ノイズをより小さく抑えることができ（相対ノイズ量が約０．１未満）、１．２×Ｐｍａｘ＝４．０３ｍｍ≦Ｐのときに、確実にノイズの発生を抑えることができる（相対ノイズ量が０．０５未満）ことが確認できた。
　次に、本発明の別の実施形態について説明する。上述の実施形態では、励起光波長と蛍光波長とが互いに重なる２つの光学ヘッドを並べて配置する場合に、２つの光学ヘッドの中心間距離Ｐが（８）式を満たすように構成することで、一方の光学ヘッドから照射された励起光の他方の光学ヘッドへの回り込みを抑制している。しかしながら、図７、図８に示す光学シミュレーションの結果から、基板１４に設けた光吸収層によりノイズ光の強度を一桁低減（すなわち１０％に低減）することができれば、２つの光学ヘッドの中心間距離Ｐが（７）式に示すＰｍａｘ以下の場合でも、ノイズ量を許容レベルにすることが期待できる。
　一般に、入射光強度をＩ０、出射光強度をＩとすると、物質の吸光度は、－ｌｎ（Ｉ／Ｉ０）で表すことができる。基板１４の光吸収層を４回透過してノイズ光を１０％とするためには、光吸収層の吸光度を－１／４・ｌｎ（０．１）≒０．５８とすればよい。したがって、基板１４の光吸収層の吸光度Ａが、Ａ≧０．５８を満たしていれば、一方の光学ヘッドから他方の光学ヘッドに回り込むノイズ光の強度を１０％以下に低減できることになる。実際の光線は、図６に示すように、基板１４の光吸収層に対してθ３の角度で入射する。光吸収層の厚さをｔ３’とすると、光吸収層を１回透過する際の光路長はｔ３’／ｃｏｓθ３となるが、余裕をみて最小値ｔ３’を光路長として扱い、厚さｔ３’で吸収係数α≧０．５８／ｔ３’を満たすように光吸収層を設ければよい。このような光吸収層を基板１４に設けることにより、一方の光学ヘッドから他方の光学ヘッドに回り込むノイズ光を減らすことができるので、蛍光検出装置間の干渉を抑制できる。
　上記ではノイズ光を１０％まで低減する光吸収層を説明したが、ノイズ光を５％まで低減できればより好ましく、１％まで低減できればさらに好ましい。ノイズ光を５％程度まで低減するためには、対象波長に対して吸収係数α≧－１／４・ｌｎ（０．０５）／ｔ３’≒０．７５／ｔ３’を満たすように光吸収層を設ければよい。また、ノイズ光を１％程度まで低減するためには、対象波長に対して吸収係数α≧－１／４・ｌｎ（０．０１）／ｔ３’≒１．１５／ｔ３’を満たすように光吸収層を設ければよい。
　光吸収層は、基板１４自体を光吸収性の材料で形成することにより、基板１４における流路１２の底部と第２主面１４ｂとの間の全体に設けてもよいし、基板１４の厚さ方向の一部に設けてもよい。あるいは、基板１４の第２主面１４ｂ上に、基板１４と屈折率のマッチングのとれた状態で別体として光吸収層が設けられてもよい。ここで、「屈折率のマッチングのとれた状態」とは、界面前後の屈折率差が０．０２５以下であることを意味する。
　以下、上述した本発明の別の実施形態に関し、実施例を説明する。
（実施例３）
　実施例３は、基板１４における流路１２の底部と第２主面１４ｂとの間の全体に光吸収層を設けた実施例である。実施例３では、実施例１と同様に、Ｌ＝１．７３５ｍｍ、ＮＡ＝０．３、ｔ１＝０．１ｍｍ、ｔ２＝０．７ｍｍ、ｔ３＝３．３ｍｍ、ｎ１＝１．５３、ｎ３＝１．５３とした。実施例３では、中心点間距離Ｐを３．５ｍｍとし、実施例１で求めたＰｍａｘ＝４．６５ｍｍよりも小さい値とした。基板１４における流路１２の底部と第２主面１４ｂとの間に、厚みｔ３’＝３．３ｍｍで吸収係数α＝０．５８／０．３３＝１．７６ｃｍ－１の光吸収層を設け、実施例１と同様に評価面に到達する光線の強度を光学シミュレーションにより求めた。
　光学シミュレーションの結果、実施例３では、流路１２内に試料が存在しない場合に相対ノイズ量が０．０２となり、流路１２内に試料が存在する場合に相対ノイズ量が０．０３となった。図７から、実施例１においては、中心点間距離Ｐが３．５ｍｍのとき、流路１２内に試料が存在しない場合の相対ノイズ量が０．１９であり、流路１２内に試料が存在する場合の相対ノイズ量が０．３１であるので、基板１４に光吸収層を設けた実施例３は、実施例１と比較してノイズ量を約１０％に低減できることが確認できた。
（実施例４）
　実施例４は、基板１４の第２主面１４ｂ上に光吸収層を設けた実施例である。実施例４では、実施例２と同様に、第２光学ヘッド５５の第２対物レンズＯＢ２の出射端面にφ０．８ｍｍのピンホールを配置した構成とした。実施例４では、中心点間距離Ｐを２．７５ｍｍとし、実施例２で求めたＰｍａｘ＝３．３６ｍｍよりも小さい値とした。また、実施例４では、基板１４の第２主面１４ｂ上に、屈折率１．５３で厚さ０．１ｍｍの実質的に吸収のない樹脂層を介して、屈折率１．５３、厚さ１．０ｍｍで吸収係数α＝０．５８／０．１＝５．８ｃｍ－１の光吸収層を設け、流路１２内に試料が存在する条件で上記実施例と同様に評価面に到達する光線の強度を光学シミュレーションで求めた。
　光学シミュレーションの結果、実施例４では、相対ノイズ量が０．１となった。図８から、実施例２においては、中心点間距離Ｐが２．７５ｍｍのとき、流路１２内に試料が存在する場合の相対ノイズ量が０．８５であるので、基板１４の第２主面１４ｂ上に光吸収層を設けた実施例４は、実施例２と比較してノイズ量を約１２％に低減できることが確認できた。
（実施例５）
　実施例５では、基板１４の第２主面１４ｂ上に設ける光吸収層の吸収係数のみ実施例４から変更した。実施例５では、光吸収層の吸収係数αを、α＝０．７５／０．１＝７．５ｃｍ－１とし、上記実施例と同様に評価面に到達する光線の強度を光学シミュレーションで求めた。
　光学シミュレーションの結果、実施例５では、相対ノイズ量が０．０５となった。実施例２（中心点間距離Ｐ＝２．７５ｍｍ）のときの相対ノイズ量（０．８５）と比較すると、実施例５はノイズ量を約６％に低減できることが確認できた。
　また、光吸収層の吸収係数αを７．５ｃｍ－１とした実施例５において、基板１４と光吸収層との間に設けた樹脂層の屈折率を１．５３０～１．５０５（屈折率差：０．０２５）の範囲で変化させて同様の光学シミュレーションを実施したところ、評価面に到達する光線の最大強度は、樹脂層の屈折率を１．５３０とした場合と比較して２％程度の増加に止まっていた。
（実施例６）
　実施例６においても、基板１４の第２主面１４ｂ上に設ける光吸収層の吸収係数のみ実施例４から変更した。実施例６では、光吸収層の吸収係数αを、α＝１．１５／０．１＝１１．５ｃｍ－１とし、上記実施例と同様に評価面に到達する光線の強度を光学シミュレーションで求めた。
　光学シミュレーションの結果、実施例６では、相対ノイズ量が０．０１となった。実施例２（中心点間距離Ｐ＝２．７５ｍｍ）のときの相対ノイズ量（０．８５）と比較すると、実施例６はノイズ量を約１％に低減できることが確認できた。
　以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
　本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に利用できる。
　１０　反応処理容器、　１２　流路、　１４　基板、　１６　流路封止フィルム、　１７　第１連通口、　１８　第２連通口、　２０　試料、　３０　反応処理装置、　３２　温度制御システム、　３３　高温用ヒータドライバ、　３５　低温用ヒータドライバ、　３６　ＣＰＵ、　３７　送液システム、　３９　第１ポンプ、　４０　第２ポンプ、　４１　第１ポンプドライバ、　４２　第２ポンプドライバ、　４３　第１チューブ、　４４　第２チューブ、　４５，４６　パッキン、　５０　第１蛍光検出装置、　５１　第１光学ヘッド、　５２　第１蛍光検出用励起光源／検出器モジュール、　５４　第２蛍光検出装置、　５５　第２光学ヘッド、　５６　第２蛍光検出用励起光源／検出器モジュール、　６０　高温用ヒータ、　６１　保持部材、　６２　低温用ヒータ、　６４　第１励起光源、　６５　第１波長合分波器。

Claims (10)

  1. 　試料が移動する流路が第１主面に形成された基板と、前記流路を封止するように前記第１主面上に設けられた流路封止フィルムとを備える反応処理容器と、
    　第１励起光を前記流路中の試料に照射するとともに、前記第１励起光の照射により試料から生じた第１蛍光を集光する第１対物レンズを備える第１光学ヘッドと、
    　第２励起光を前記流路中の試料に照射するとともに、前記第２励起光の照射により試料から生じた第２蛍光を集光する第２対物レンズを備える第２光学ヘッドと、
    　前記第１光学ヘッドおよび前記第２光学ヘッドを保持する保持部材と、
    　を備える反応処理装置であって、
    　前記第１光学ヘッドおよび前記第２光学ヘッドは、前記流路の長手方向に並んで配置され、
    　前記第１蛍光の波長範囲と前記第２励起光の波長範囲は、少なくとも一部が重複しており、
    　前記第１対物レンズの光軸と前記第２対物レンズの光軸との間の距離Ｐが、以下の式：
    　２・Ｐ０＋２・Ｐ１＋４・Ｐ２＋４・Ｐ３＜Ｐ
    　Ｐ０＝Ｌ・ＮＡ／√（１－ＮＡ２）
    　Ｐ１＝ｔ１・ＮＡ／√（ｎ１ ２－ＮＡ２）
    　Ｐ２＝ｔ２・ＮＡ／√（１－ＮＡ２）
    　Ｐ３＝ｔ３・ＮＡ／√（ｎ３ ２－ＮＡ２）
    　を満たす（ただし、Ｌは前記保持部材から前記流路封止フィルムまでの距離、ｔ１は前記流路封止フィルムの厚さ、ｔ２は前記流路の深さ、ｔ３は前記流路の底部から前記基板の第２主面までの厚さ、ＮＡは前記第１対物レンズおよび前記第２対物レンズの開口数、ｎ１は前記流路封止フィルムの屈折率、ｎ３は前記基板の屈折率）ことを特徴とする反応処理装置。
  2. 　前記距離Ｐが、さらに１．１×（２・Ｐ０＋２・Ｐ１＋４・Ｐ２＋４・Ｐ３）≦Ｐを満たし、さらに好ましくは１．２×（２・Ｐ０＋２・Ｐ１＋４・Ｐ２＋４・Ｐ３）≦Ｐを満たすことを特徴とする請求項１に記載の反応処理装置。
  3. 　前記距離Ｐが、Ｐ≦Ｓ－２×ΔＳ（ただし、Ｓは前記第１光学ヘッドおよび前記第２光学ヘッドが配置される流路の直線部分の長さ、ΔＳは１ｍｍ）を満たすことを特徴とする請求項１または２に記載の反応処理装置。
  4. 　前記基板における前記流路の底部と前記第２主面との間に、励起光を吸収する光吸収層を備えることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の反応処理装置。
  5. 　試料が移動する流路が第１主面に形成された基板と、前記流路を封止するように前記第１主面上に設けられた流路封止フィルムとを備える反応処理容器と、
    　第１励起光を前記流路中の試料に照射するとともに、前記第１励起光の照射により試料から生じた第１蛍光を集光する第１対物レンズを備える第１光学ヘッドと、
    　第２励起光を前記流路中の試料に照射するとともに、前記第２励起光の照射により試料から生じた第２蛍光を集光する第２対物レンズを備える第２光学ヘッドと、
    　前記第１光学ヘッドおよび前記第２光学ヘッドを保持する保持部材と、
    　を備える反応処理装置であって、
    　前記第１光学ヘッドおよび前記第２光学ヘッドは、前記流路の長手方向に並んで配置され、
    　前記第１蛍光の波長範囲と前記第２励起光の波長範囲は、少なくとも一部が重複しており、
    　前記基板に励起光を吸収する光吸収層が設けられることを特徴とする反応処理装置。
  6. 　前記光吸収層は、吸収係数αがα≧０．５８／ｔ３’（ただしｔ３’は前記光吸収層の厚さ）を満たすように形成されることを特徴とする請求項５に記載の反応処理装置。
  7. 　前記光吸収層は、吸収係数αがα≧０．７５／ｔ３’（ただしｔ３’は前記光吸収層の厚さ）を満たすように形成されることを特徴とする請求項５に記載の反応処理装置。
  8. 　前記光吸収層は、吸収係数αがα≧１．１５／ｔ３’（ただしｔ３’は前記光吸収層の厚さ）を満たすように形成されることを特徴とする請求項５に記載の反応処理装置。
  9. 　前記光吸収層は、前記流路の底部と前記基板の第２主面との間に設けられることを特徴とする請求項５から８のいずれかに記載の反応処理装置。
  10. 　前記光吸収層は、前記基板の第２主面上に設けられることを特徴とする請求項５から８のいずれかに記載の反応処理装置。
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