WO2020008606A1 - 細胞培養装置、細胞培養方法及びプログラム - Google Patents

Abstract

超音波振動子（１０）は、培養容器（１）に細胞（２）とともに保持された培養液（３）に向かって超音波を照射する。取得部は、培養液（３）における細胞（２）の沈降状態を示す情報を取得する。制御部は、細胞（２）の沈降状態を示す情報に基づいて超音波振動子（１０）の動作を制御する。

Description

細胞培養装置、細胞培養方法及びプログラム

　本発明は、細胞培養装置、細胞培養方法及びプログラムに関する。

　再生医療で用いられる動物細胞の培養方法として、浮遊系培養技術の適用が検討されている。例えば、特許文献１には、撹拌翼で培養液を撹拌しながら、細胞塊を細分化するために細胞塊に超音波を照射する細胞培養装置が開示されている。当該細胞培養装置において培養液を撹拌する目的は、培養液内の栄養成分及び溶解酸素の偏在を緩和すること、及び細胞の沈降に起因する細胞の密集を抑制することである。

　特許文献１に開示された細胞培養装置のように撹拌翼で培養液を撹拌すると、撹拌翼によって細胞を傷めてしまうおそれがある。撹拌翼で細胞を傷めることを避けるために、特許文献２には、超音波を照射することで細胞懸濁液を撹拌する培養装置が開示されている。

国際公開第２０１７／０５６６９５号 実開昭６３－０１３６００号公報

　特許文献２に開示された培養装置では、細胞懸濁液を撹拌するために超音波が常時照射される。超音波を常時照射すると、細胞懸濁液に含まれる細胞への影響が懸念されるうえ、培養液の温度が上昇し、細胞に悪影響を及ぼすおそれがある。

　本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、超音波による撹拌において培養液への不要な超音波の照射を防いで細胞を効率よく培養することを目的とする。

　上記目的を達成するため、本発明に係る細胞培養装置は、照射部と、取得部と、制御部と、を備える。照射部は、培養容器に細胞とともに保持された培養液に向かって超音波を照射する。取得部は、培養液における細胞の沈降状態を示す情報を取得する。制御部は、細胞の沈降状態を示す情報に基づいて照射部の動作を制御する。

　本発明によれば、培養液における細胞の沈降状態に応じて超音波が培養液に照射される。これにより、細胞が沈降している場合には超音波によって培養液が撹拌され、細胞が十分に浮遊している場合には超音波が照射されない。よって、超音波による撹拌において培養液への不要な超音波の照射を防いで細胞を効率よく培養することができる。

本発明の実施の形態１に係る細胞培養装置の構成を示す図 図１に示す細胞培養装置の一部を示す斜視図 図１に示す制御装置のハードウエア構成を示すブロック図 図１に示す細胞培養装置において超音波振動子に印加される駆動電圧の波形を示す図 図１に示す制御装置が備えるＣＰＵが実現する機能を示すブロック図 画像解析による沈降速度の算出の概念図 図１に示す細胞培養装置による撹拌処理のフローチャート 図１に示す細胞培養装置で培養開始から超音波を間欠的に照射して培養した場合及び超音波を全く照射しない場合の培養時間に対する細胞の個数を示す図 図１に示す細胞培養装置による回収処理のフローチャート 培養容器の一例としての細胞培養フラスコを示す斜視図 本発明の実施の形態１に係る他の細胞培養装置の構成を示す図 本発明の実施の形態２に係る細胞培養装置の構成を示す図 培養液を撮像した画像を示す図 図１２に示す細胞培養装置による撹拌処理のフローチャート 図１２に示す細胞培養装置による回収処理のフローチャート 本発明の実施の形態３に係る細胞培養装置の構成を示す図 蛍光物質を含む培養液を撮像した画像を示す図 図１６に示す細胞培養装置による撹拌処理のフローチャート 本発明の実施の形態４に係る細胞培養装置による撹拌処理のフローチャート 本発明の実施の形態４に係る他の細胞培養装置の構成を示す図 本発明の実施の形態５に係る細胞培養装置の構成を示す図 本発明の実施の形態６に係る細胞培養装置の構成を示す図 図２２に示す細胞培養装置による撹拌処理のフローチャート 本発明の実施の形態７に係る細胞培養装置の構成を示す図

　以下、本発明の実施の形態に係る細胞培養装置について図面を参照して詳細に説明する。なお図面中、同一又は同等の部分には同一の符号を付す。

　（実施の形態１）
　図１は、本発明の実施の形態１に係る細胞培養装置１００の構成を示す図である。細胞培養装置１００は、培養容器１に保持された細胞２を培養するための装置である。細胞２の培養において、細胞培養装置１００は、培養容器１に細胞２とともに保持された培養液３を撹拌する。培養容器１は、底面が円である円筒状で、上面が開口している。培養容器１はポリカーボネート製である。

　細胞２は、浮遊系で培養できる動物細胞である。細胞２は、細胞分裂後に複数の細胞２が凝集して細胞塊４を形成することがある。培養液３は、細胞２の培養に適した組成である。培養液３には、液体培地の他、有機物、ｐＨ緩衝液、血清、各種ミネラル、抗生物質及びｐＨ指示薬等が含まれている。以下において、細胞２には、細胞塊４が含まれるものとする。

　図２に示すように、培養容器１は、上面が開口した水槽５の内部に配置される。水槽５は液体６で満たされる。液体６は、水又は油である。開口した水槽５の上面は蓋７で覆われる。

　細胞培養装置１００は、培養液３を撮像する光学センサ８と、酸素の濃度を測定する培養液センサ９と、超音波を照射する超音波振動子１０と、制御装置１１と、細胞２を回収する細胞回収装置１２と、を備える。制御装置１１は、光学センサ８、培養液センサ９、超音波振動子１０及び細胞回収装置１２の動作を制御する。なお、以下では、超音波振動子を単に「振動子」と表記する。

　光学センサ８は、制御装置１１に接続されている。光学センサ８は、培養容器１に保持された細胞２を含む培養液３を撮像する。光学センサ８によって撮像された画像に対応する画像データは、制御装置１１に伝送される。

　培養液センサ９は、蓋７を貫通して、培養液３に浸されている。培養液センサ９は、培養液３に溶解している酸素の濃度を測定する。培養液センサ９は、制御装置１１に接続されている。培養液センサ９によって測定された酸素の濃度を示す情報は制御装置１１に伝送される。

　振動子１０は水槽５の底面に取り付けられた粘弾性体に埋め込まれることで、水槽５に設置されている。振動子１０は圧電素子を備える。駆動電圧を印加された圧電素子が振動子１０の中心軸の方向に振動することで、振動子１０は超音波（疎密波）を照射する。照射された超音波は中心軸に沿って伝搬する。振動子１０から照射される超音波の中心軸は、水槽５の底面に対して垂直である。振動子１０は培養液３に向かって超音波を照射する照射部として機能する。ここでの超音波とは、周波数が２０ｋＨｚ以上の弾性振動波である。

　振動子１０は制御装置１１に接続されている。図３に示すように、制御装置１１は、超音波振動子制御回路１１０、記憶部１１１、ＲＡＭ（Random Access Memory）１１２、ＣＰＵ（Central Processing Unit）１１３及びバス１１４を備える。超音波振動子制御回路１１０、記憶部１１１、ＲＡＭ１１２及びＣＰＵ１１３は、バス１１４で接続されている。

　超音波振動子制御回路１１０は、振動子１０から照射される超音波の周波数及び振幅に対応する駆動電圧を生成する。制御装置１１は、超音波振動子制御回路１１０で生成した駆動電圧を振動子１０に印加する。振動子１０は、駆動電圧に応じて振動する。なお、細胞２の死滅及び減少を抑制するため、制御装置１１は、駆動電圧の振幅を制御し、超音波に起因して培養容器１内に生じる音圧を３００ｋＰａ以下にする。

　制御装置１１は、図４に示すように、間欠的に駆動電圧を振動子１０に印加する。これにより、振動子１０は、一定の間隔で駆動及び停止を繰り返す。より詳細には、制御装置１１は、振動子１０を３０秒間駆動させた後、９０秒間停止させる。超音波の周波数は１５８ｋＨｚである。

　記憶部１１１は、ＲＯＭ、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）、フラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体を備え、制御プログラム１１５の他、各種データを記憶している。

　ＲＡＭ１１２は、ＣＰＵ１１３のメインメモリとして機能する。ＣＰＵ１１３による制御プログラム１１５の実行に際し、ＲＡＭ１１２で制御プログラム１１５が展開される。

　ＣＰＵ１１３が制御プログラム１１５の他、記憶部１１１に記憶された各種ソフトウェアプログラムをＲＡＭ１１２に読み出し、ソフトウェアプログラムを実行することで、制御装置１１は、光学センサ８、培養液センサ９、振動子１０及び細胞回収装置１２に以下の動作を実行させる。

　図５は、ＣＰＵ１１３が実現する機能を示すブロック図である。制御プログラム１１５は、ＣＰＵ１１３に、培養液３中の細胞２を検出する検出部１３、培養液３における細胞２の沈降状態を示す情報を取得する取得部１４、細胞２の沈降状態を示す情報に基づいて振動子１０の動作を制御する制御部１５、としての機能を実現させる。

　検出部１３は、光学センサ８によって撮像された画像に対して画像認識手法であるエッジ検出法を用いて、画像における細胞２と培養液３との境界面を抽出する。検出部１３は、境界面を縁とする形状と、あらかじめ記憶部１１１に記憶された細胞２とみなされる形状との間に一定以上の相似性が認められた場合に、当該境界面を縁とする形状を細胞２として検出する。

　検出部１３は、画像データ及び当該画像データに対応する画像における細胞２と培養液３との境界面に関する情報を、当該画像が撮像された時刻に関連付けて記憶部１１１に記憶させる。

　また、検出部１３は、培養液センサ９を介して培養液３に含まれる酸素の濃度を検出する。検出部１３は、酸素の濃度を示す情報を制御部１５に出力する。

　取得部１４は、光学センサ８によって撮像された画像に含まれる細胞２の培養容器１内での位置情報を取得する。位置情報の取得において、取得部１４は、記憶部１１１に記憶された画像データに対応する画像上に、培養容器１の底面からの高さ方向及び水平方向それぞれに対応する座標軸を設定する。取得部１４は、画像における座標平面上での細胞２の座標を位置情報として取得する。細胞２の位置情報は、例えば、細胞２として検出された形状の縁の座標平面上における座標の範囲である。

　取得部１４は、画像データに関連付けて、当該画像データに対応する画像に含まれる細胞２の位置情報を記憶部１１１に記憶させる。画像データに対応する画像に含まれる細胞２が複数個の場合、取得部１４は、各細胞２に識別番号を付与し、識別番号に対応させて位置情報を記憶部１１１に記憶させる。

　取得部１４は、細胞２の沈降状態を示す情報として、検出部１３によって検出された細胞２の単位時間あたりの沈降距離、すなわち沈降速度を算出する。ここで、図６を参照して沈降速度の算出について説明する。取得部１４は、記憶部１１１に記憶された時刻ｔ１に撮像された画像ｐ１に対応する画像データ及び時刻ｔ２に撮像された画像ｐ２に対応する画像データを参照する。取得部１４は、画像ｐ１及び画像ｐ２それぞれに、培養容器１の水平断面における中心を基準とするｘ軸及び培養容器１の底面を基準とする高さ方向であるｙ軸を設定する。画像ｐ１及び画像ｐ２に設定されたｘ軸及びｙ軸は、尺度が等しい座標軸である。

　取得部１４は、画像ｐ１に含まれる細胞２の位置情報、すなわち座標（ｘ１，ｙ１）と、画像ｐ２に含まれる細胞２の座標（ｘ２，ｙ２）とから細胞２の底面方向への移動距離を沈降距離として算出する。続いて、取得部１４は、沈降距離をｔ２からｔ１を減じた経過時間ｔで除して細胞２の沈降速度を算出する。取得部１４は、算出した沈降速度を示す情報を制御部１５に出力する。

　また、取得部１４は、検出部１３によって検出された細胞２の大きさを測定する。詳細には、取得部１４は、記憶部１１１に記憶された画像データを参照し、画像の倍率及び細胞２の画像上の直径又は面積から細胞２の大きさを測定する。取得部１４は、得られた細胞２の大きさを示す情報を制御部１５に出力する。

　制御部１５は、細胞２の沈降状態を示す情報に基づいて振動子１０の動作を制御する。制御部１５は、細胞２の沈降状態を示す情報としての細胞２の沈降速度と、あらかじめ記憶部１１１に記憶された閾値Ｎ_ｖとを比較する。細胞２の沈降速度がＮ_ｖ以上の場合、沈降が進み、細胞２を浮遊させないと細胞２が培養容器１の底面に密集してしまい、細胞２の増殖が抑制され得る。よって、細胞２の沈降速度がＮ_ｖ以上の場合、制御部１５は、駆動電圧を振動子１０に印加する。

　制御部１５が振動子１０に駆動電圧を印加すると、超音波が培養液３に向かって照射される。より詳細には、振動子１０の振動によって生じた音響放射圧が、振動子１０の端面に接する液体６中を伝搬する。音響放射圧は、培養容器１の底面を介して培養液３にさらに伝搬する。培養液３には、音響放射圧に基づく音響流が生じる。この結果、音響流によって培養容器１内の細胞２の沈降が抑制され、あるいは細胞２が浮遊し、培養容器１の底面に密集することを防ぐことができる。

　制御部１５は、細胞２の大きさを示す情報に基づいて振動子１０の動作を制御する。細胞２が大きくなると、沈降速度が速くなる傾向がある。このため、細胞２の大きさに伴い、超音波の照射時間を長くすることで、細胞２の沈降を効果的に抑制することができる。制御部１５は、細胞２の大きさに応じて振動子１０から超音波が照射される時間を長くする。より詳細には、細胞２の大きさの範囲と超音波の照射時間と対応付けられたテーブルが記憶部１１１に記憶されている。当該テーブルでは、細胞２の大きさに比例して長い照射時間が対応付けられている。制御部１５は、テーブルを参照し、取得部１４によって取得された細胞２の大きさに対応する照射時間の間、振動子１０を介して超音波を照射する。

　制御部１５は、酸素の濃度を示す情報に基づいて照射部の動作を制御する。具体的には、制御部１５は、検出部１３によって検出された酸素の濃度と、あらかじめ記憶部１１１に記憶された閾値Ｎ_ｏｘｙとを比較する。酸素の濃度がＮ_ｏｘｙ以下の場合、酸素が不足し、細胞２の増殖効率が低下するおそれがある。よって、酸素の濃度がＮ_ｏｘｙ以下の場合、制御部１５は振動子１０を介して超音波を照射する。超音波の照射によって培養液３に生じる音響流によって、培養液３は撹拌される。これにより、雰囲気中の酸素の培養液３への取り込みを促進させることができる。培養液３の撹拌によっても培養液３への酸素の取り込みが不十分な場合には、散気管を培養液３に浸して強制的にエアレーションを行うことで培養液３に酸素を供給してもよい。

　制御部１５は、振動子１０の他に、光学センサ８、培養液センサ９及び細胞回収装置１２を制御する。

　細胞回収装置１２は、管１２０と、吸引ポンプ１２１と、吸引ポンプコントローラ１２２と、回収用バッグ１２３と、開閉弁１２４と、を備える。細胞回収装置１２は、吸引ポンプコントローラ１２２を介して制御装置１１に接続されている。制御部１５は、細胞回収装置１２を介して細胞２を回収する回収部として機能する。

　両端が開口した管１２０の一端は吸入口１２５である。管１２０は、蓋７を貫通しており、吸入口１２５が培養液３内に入っている。管１２０の他端は吸引ポンプ１２１に接続されている。吸引ポンプ１２１は吸引ポンプコントローラ１２２に接続されている。

　吸引ポンプコントローラ１２２は、図示しないＣＰＵと、外部記憶装置と、ＲＡＭと、を備える。制御部１５による制御のもと、ＣＰＵが外部記憶装置に記憶されたソフトウェアプログラムをＲＡＭに読み出し、ソフトウェアプログラムを実行制御することで、吸引ポンプコントローラ１２２は吸引ポンプ１２１の動作を制御する。

　回収用バッグ１２３は、開閉弁１２４を介して吸引ポンプ１２１に接続されている。開閉弁１２４を閉めると、吸引ポンプ１２１から回収用バッグ１２３への空気の流入が遮断される。一方、開閉弁１２４を開けると、吸引ポンプ１２１から回収用バッグ１２３への空気の流入が可能になる。

　開閉弁１２４が開いた状態で、吸引ポンプコントローラ１２２が吸引ポンプ１２１を駆動すると、吸引ポンプ１２１は吸入口１２５から吸引する。吸入口１２５は培養液３に入っているため、培養容器１内の細胞２が培養液３とともに吸入口１２５から吸引される。吸引された培養液３及び細胞２は、回収用バッグ１２３に移送される。これにより、細胞培養装置１００は細胞２を回収することができる。

　細胞２の回収にあたって、取得部１４は、検出部１３によって検出された培養液３に含まれる細胞２の個数の変化を示す情報を取得する。具体的には、取得部１４が画像ｐ１に含まれる細胞２の個数及び画像ｐ２に含まれる細胞２の個数を計数する。続いて、取得部１４は、画像ｐ１に含まれる細胞２の個数と画像ｐ２に含まれる細胞２の個数とから経過時間ｔにおける細胞２の個数の変化率を算出する。取得部１４は、細胞２の個数の変化を示す情報として細胞２の個数の変化率を示す情報を制御部１５に出力する。

　制御部１５は、細胞２の個数の変化を示す情報に基づいて細胞２を回収する。ここでは、制御部１５は、変化率とあらかじめ記憶部１１１に記憶された閾値Ｎ_ｒとを比較する。変化率がＮ_ｒ以下の場合、細胞２の個数の変動が小さくなっており、培養液３における細胞２の増殖が定常期となっている。定常期には細胞２は大幅に増加することはない。よって、制御部１５は、吸引ポンプコントローラ１２２に、細胞２の回収を指示する指示データを伝送する。

　制御部１５から指示データを受けて、吸引ポンプコントローラ１２２は、細胞２を回収する。吸引ポンプコントローラ１２２は、回収用バッグ１２３に回収された培養液３が規定の量になったら、吸引ポンプ１２１による吸引を停止する。開閉弁１２４を閉めると、細胞２を保持する回収用バッグ１２３が得られる。

　次に、本実施の形態における細胞培養装置１００の使用方法及び動作について説明する。細胞培養装置１００は、二酸化炭素の濃度が５％に維持された３７℃の空気の雰囲気下に設置される。また、細胞培養装置１００は、培養液３が外部から汚染されないために密閉空間内に設置される。

　細胞培養装置１００を設置し、水槽５内に配置された培養容器１に保持された培養液３が雰囲気下で安定するのを待つ。続いて、１０^７個以上の細胞２を滅菌ピペットで培養液３に播種する。

　図７は、細胞培養装置１００による撹拌処理のフローチャートである。培養開始から一定時間経過後、検出部１３は、培養液３中の細胞２を検出する（ステップＳ１）。取得部１４は、位置情報に基づいて沈降速度を算出する（ステップＳ２）。制御部１５は、細胞２の沈降速度がＮ_ｖ以上であるか否かを判定する（ステップＳ３）。沈降速度がＮ_ｖ未満の場合（ステップＳ３；Ｎｏ）、制御部１５は、ステップＳ６に進む。

　一方、沈降速度がＮ_ｖ以上の場合（ステップＳ３；Ｙｅｓ）、取得部１４は、細胞２の大きさを測定する（ステップＳ４）。制御部１５は、超音波の照射時間を細胞２の大きさに対応する照射時間として、振動子１０を介して超音波を培養液３に向かって照射する（ステップＳ５）。

　次に、制御部１５は、培養液センサ９を介して培養液３に溶解している酸素の濃度を測定する（ステップＳ６）。制御部１５は、酸素の濃度がＮ_ｏｘｙ閾値以下であるか否かを判定する（ステップＳ７）。酸素の濃度がＮ_ｏｘｙ以下の場合（ステップＳ７；Ｙｅｓ）、制御部１５は、振動子１０を介して超音波を培養液３に向かって照射する（ステップＳ８）。一方、酸素の濃度がＮ_ｏｘｙを超える場合（ステップＳ７；Ｎｏ）、制御部１５は、撹拌処理を終了する。

　細胞培養装置１００を用いて、培養開始から超音波を間欠的に照射して培養した場合と、超音波を全く照射しない場合の細胞２の個数の経時変化を図８に示す。細胞２は、０日目に培養液３に播種され、３日目に回収された。回収後、交換した培養液３に細胞２が播種され、６日目に回収された。超音波を全く照射せずに培養した場合と比較して、細胞培養装置１００で超音波を間欠的に照射して培養した場合に、細胞２の増殖効率が向上した。

　続いて、図９を参照しながら、細胞培養装置１００による細胞２の回収処理について説明する。まず、検出部１３は、培養液３中の細胞２を検出する（ステップＳ１１）。取得部１４は、画像ｐ１に含まれる細胞２の個数と画像ｐ２に含まれる細胞２の個数を計数する（ステップＳ１２）。

　続いて取得部１４は、細胞２の個数の変化率を算出する（ステップＳ１３）。制御部１５は、細胞２の個数の変化率がＮ_ｒ以下であるか否かを判定する（ステップＳ１４）。細胞２の個数の変化率がＮ_ｒ以下の場合（ステップＳ１４；Ｙｅｓ）、制御部１５は、細胞２の回収を指示し（ステップＳ１５）、回収処理を終了する。これにより、細胞２が回収用バック１２３に回収される。一方、細胞２の個数の変化率がＮ_ｒを超える場合（ステップＳ１４；Ｎｏ）、制御部１５は、ステップＳ１１に戻る。

　以上説明したとおり、本実施の形態１に係る細胞培養装置１００によれば、培養液３における細胞２の沈降状態に応じて超音波が培養液３に照射される。これにより、細胞２が沈降している場合には培養液３が撹拌され、細胞２が十分に浮遊している場合には撹拌されない。細胞２の培養においては、常時撹拌しなくても、細胞２の沈降を抑制する程度に撹拌すれば十分である。よって、培養液３への不要な超音波の照射を防ぐことができる。

　細胞培養装置１００によれば、培養液３における細胞２の沈降状態に応じて超音波が培養液３に照射されるため、超音波を常時照射した場合の液体６及び培養液３の温度上昇を抑制し、培養液３の温度を細胞２の培養に適した３７℃付近に維持することができる。これにより、細胞２に過度なストレスを与えることなく、細胞２の増殖率及び生存率の低下を抑えることができる。

　また、細胞培養装置１００は、経過時間ｔにおける細胞２の個数の変化率に応じて、細胞２を回収する。これにより、細胞２の対数増殖期であって増殖が不十分である場合には培養が継続され、細胞２が十分に増殖した定常期に細胞２を回収することができるので、効率よく細胞２を培養することができる。なお、上記の経過時間ｔは、任意であって、細胞２の増殖速度及び特性を考慮して決定される。

　また、細胞培養装置１００は、培養液３の撹拌に撹拌翼を使用せずに超音波を用いる。このため、撹拌翼の使い回しによる汚染の発生を抑制することができる。

　なお、本実施の形態では、培養容器１の材質はポリカーボネートに限定されず、オートクレーブによる滅菌が可能な他のプラスチック又はガラスでもよい。例えば、培養容器１の材質としては、ポリスチレンが挙げられる。

　なお、本実施の形態では、培養容器１は、底面が円である円筒状としたが、培養容器１は、特に限定されず、例えば図１０に示される細胞培養フラスコ７ａでもよい。水槽５の形状は、培養容器１の形状に合わせて適宜変更される。

　また、液体６は水又は油としたが、液体６の代わりに音響インピーダンスが培養容器１に近い物質を用いてもよい。例えば、当該物質の音響インピーダンスは水の音響インピーダンスと等しい。

　なお、本実施の形態では、培養液３に１０^７個以上の細胞２を播種したが、播種する細胞２の個数は、培養容器１の容量及び細胞２の増殖速度に応じて適宜調整すればよい。

　なお、光学センサ８は、紫外領域から赤外領域に対応するものであればよく、有感波長帯は任意である。光学センサ８は、ＣＣＤカメラ等の画像を撮像できるセンサが望ましいが、必ずしも画像を撮像できるセンサでなくてもよい。細胞培養装置１００は、光学センサ８の代わりに、細胞２の濃度を測定する濁度法に用いられる分光光度計を備えてもよい。分光光度計を用いる場合、細胞２の濃度の測定に適した波長の吸光度を、培養容器１の底面付近及び培養液３の液面付近において測定する。この場合、例えば、培養液３における細胞２の沈降状態を示す情報として、液面付近の吸光度から算出される細胞２の濃度Ｄ１に対する底面付近の吸光度から算出される細胞２の濃度Ｄ２の割合Ｄ２／Ｄ１を用いることができる。Ｄ２／Ｄ１が閾値よりも大きい場合に、制御部１５は、超音波を培養液３に照射すればよい。

　なお、細胞２の沈降速度は、光学センサ８で撮像される画像における細胞２の沈降距離をリアルタイムに計測することで算出してもよい。

　なお、光学センサ８による画像の撮像は、常時でも間欠的であってもよい。光学センサ８による画像データのＣＰＵ１１３への伝送は、逐次でもよいし間欠的であってもよい。取得部１４は、記憶部１１１に記憶された、任意の画像データから培養液３における細胞２の沈降状態を示す情報を取得することができる。また、本実施の形態では、撹拌処理を開始するタイミングを培養開始から一定時間経過後としたが、当該一定時間は、細胞２の播種数、増殖速度及び特性に応じて設定される。撹拌処理は、使用者の指示を契機に開始してもよい。

　なお、上記撹拌処理では、沈降速度がＮ_ｖ未満の場合（ステップＳ３；Ｎｏ）、ステップＳ６に進むようにしたが、制御部１５は、ステップＳ１に戻ってもよい。

　回収処理を開始するタイミングも任意に設定できる。例えば、撹拌処理において超音波が照射され、培養液３が撹拌された直後に、制御部１５は回収処理を開始してもよい。こうすることで、撹拌によって培養液３中にばらけた状態で細胞２が撮像されているため、検出部１３による細胞２の検出精度が高くなる。また、回収処理において、細胞２の個数の変化率がＮ_ｒを超える場合（ステップＳ１４；Ｎｏ）、制御部１５はステップＳ１１に戻ることとしたが、制御部１５は回収処理を終了してもよい。

　また、本実施の形態では、細胞培養装置１００を密閉空間内に設置したが、培養容器１内に温度調整装置を設置し、培養容器１内の二酸化炭素濃度を調整する手段を講じることで密閉空間内に細胞培養装置１００を設置しなくてもよい。

　また、本実施の形態では、振動子１０から照射される超音波の中心軸を、水槽５の底面に対して垂直としたが、これに限らない。振動子１０の設置に際し、超音波の中心軸を水槽５の底面に対して任意の角度に調整すればよい。超音波の照射によって細胞２の沈降を抑えるために、振動子１０から照射される超音波の中心軸が水槽５の底面に平行とならないほうがよい。なお、本実施の形態では、超音波の周波数を１５８ｋＨｚとしたが、これに限定されず、使用する振動子１０の特性に応じて、任意の周波数を用いればよい。

　なお、本実施の形態では、制御部１５が振動子１０の間欠照射の条件を３０秒間駆動させた後、９０秒間停止させることとしたが、間欠照射の条件は限定されない。例えば、間欠照射の条件として、１回の超音波の照射後、当該照射時間の９倍の時間にわたって超音波の照射を停止することが挙げられる。

　なお、制御部１５は、細胞２の沈降速度に応じて、照射時間に限らず、振動子１０の駆動電圧、駆動時間及び駆動電圧の印加頻度を適宜調整することで、柔軟に振動子１０を制御すればよい。

　また、本実施の形態では、細胞２の沈降速度に加え、培養液３に含まれる物質（第３の物質）としての酸素の濃度に応じて超音波の照射を制御することとした。この他、培養液３に含まれる物質として、水素イオン（ｐＨ）、細胞２から排出される老廃物、例えば二酸化炭素、アンモニア、尿素及び乳酸の濃度に応じて、超音波の照射を制御してもよい。培養液３における老廃物の過度の蓄積は、細胞２の増殖速度に大きな影響を与えるため、例えば、老廃物の偏在を検出した場合に、超音波を照射することで、老廃物の偏在を解消し、細胞２が増殖しやすい環境を構築することができる。

　なお、本実施の形態では、取得部１４は、画像の倍率及び細胞２の画像上の直径又は面積から細胞２の大きさを測定するようにしたが、細胞２の最大径を測定してもよい。また、取得部１４は、細胞２の大きさとして、複数の細胞２の大きさの平均値及び中央値等の代表値を取得してもよい。

　また、検出部１３は、境界面を縁とする形状と、細胞２とみなされる形状との間の相似性に基づいて細胞２を検出することとした。細胞２とみなされる形状は、細胞２の形状であってもよいし、例えば、細胞２の形状に近似する形状として、円形、楕円形、四角及びひし形でもよい。また、検出部１３による細胞２の検出では、エッジ検出法を用いて細胞２と培養液３との境界面を抽出したが、エッジ検出法以外の公知の画像認識手法を用いてもよい。

　また、制御部１５は、細胞２の沈降速度及び培養液３における酸素の濃度に基づいて振動子１０を順次制御するようにしたが、細胞２の沈降速度のみに基づいて振動子１０を制御してもよい。また、制御部１５による細胞２の沈降速度及び培養液３における酸素の濃度に基づく制御の順序は任意である。また、制御部１５は、超音波の照射する基準として、細胞２の沈降速度に加えて、培養液３における酸素の濃度を合わせて用いてもよい。この場合、例えば、制御部１５は、細胞２の沈降速度がＮ_ｖ以上、かつ培養液３における酸素の濃度がＮ_ｏｘｙ以下の場合に振動子１０を介して超音波を照射する。

　なお、本実施の形態では、制御部１５は、細胞２の個数の変化率に基づいて細胞２を回収することとしたが、使用者の判断で細胞２を回収してもよい。また、細胞培養装置１００は、細胞回収装置１２を備えず、細胞２の増殖特性に応じて、十分な増殖が見込める時間経過後に細胞２を使用者が手作業で回収してもよい。

　また、振動子１０は、１個に限らず、複数個であってもよい。例えば、図１１は、細胞培養装置１００の構成に、振動子１０と同じ振動子１０ａを１個追加した細胞培養装置２００の構成の一部を示す。制御部１５は、振動子１０及び振動子１０ａを制御することで、より柔軟に培養液３を撹拌できる。例えば、制御部１５は、振動子１０及び振動子１０ａそれぞれから交互に超音波を照射させる。

　なお、振動子１０は、水槽５の底面ではなく、側面に配置してもよい。水槽５の側面に複数個の振動子１０を配置する場合、好ましくは、各振動子１０が培養容器１の中心を対称の中心とする回転対称の位置関係に配置される。振動子１０を側面に配置する場合も、超音波の照射によって細胞２の沈降を有効に抑えるために、振動子１０から照射される超音波の中心軸が水槽５の底面に平行とならないほうがよい。

　（実施の形態２）
　本発明の実施の形態２に係る細胞培養装置３００について、上記実施の形態１に係る細胞培養装置１００と異なる点を主に説明する。図１２に示すように、細胞培養装置３００は、細胞培養装置１００の構成に加えて出力部１６を備える。

　出力部１６は、制御装置１１に接続されている。出力部１６は、制御部１５によって制御される。出力部１６は、スピーカを備え、制御部１５から伝送される指示データに基づいて、スピーカから警告音及び通知音を発する。警告音は、培養容器１内の細胞２の個数が下限値Ｎ_ｍｉｎに達していないことを警告するための音である。通知音は、培養容器１内の細胞２の個数が上限値Ｎ_ｍａｘに達したことを通知するための音である。記憶部１１１は、Ｎ_ｍｉｎ及びＮ_ｍａｘを記憶している。

　取得部１４は、細胞２の沈降状態を示す情報として、検出部１３によって検出された細胞２の培養容器１における分布から培養容器１における細胞２の沈降度合いを示す情報を取得する。取得部１４は、記憶部１１１に記憶された時刻ｔ３に撮像された画像ｐ３に対応する画像データを参照する。図１３に示す画像ｐ３の上端は培養液３の液面で、下端は培養容器１の底面であって、画像ｐ３には培養容器１内の培養液３の全体が示されている。取得部１４は、画像ｐ３全体に検出された細胞２の個数Ｎ１及び画像ｐ３の下端から上端までの高さの５０％に設定した高さ以下に存在する細胞２の個数Ｎ２を計数する。取得部１４は、Ｎ２をＮ１で除することで得られるｎを細胞２の沈降度合いを示す情報として取得する。培養容器１において底面付近に存在する細胞２の割合が増加するにつれて、ｎは大きくなる。取得部１４は、ｎ及びＮ１を示す情報を制御部１５に出力する。

　取得部１４は、検出部１３によって検出された培養液３における細胞２の個数に相関する情報も取得する。細胞２の個数に相関する情報は、画像ｐ３に含まれる細胞２の個数、すなわち上記Ｎ１である。なお、細胞２の個数に相関する情報は、細胞２の画像上の面積の総和であってもよいし、細胞２の濃度であってもよい。

　制御部１５は、細胞２の濃度に相関する情報に基づいて使用者に通知を行う。より詳細には、制御部１５は、Ｎ１とあらかじめ記憶部１１１に記憶されたＮ_ｍｉｎ及びＮ_ｍａｘとを比較する。Ｎ１がＮ_ｍｉｎ以下の場合、細胞２の増殖が進んでおらず、培養条件が細胞２に適していないおそれがある。Ｎ１がＮ_ｍｉｎ以下の場合、制御部１５は、出力部１６を介して警告音を出力する。Ｎ１がＮ_ｍａｘ以上の場合、細胞２が十分に増殖しているため、制御部１５は、出力部１６を介して警告音とは異なる通知音を出力する。

　制御部１５は、細胞２の沈降度合いを示す情報に基づいて振動子１０の動作を制御する。制御部１５は、ｎとあらかじめ記憶部１１１に記憶された閾値Ｎ０とを比較する。ｎがＮ０以上の場合、沈降の度合いが高く、細胞２を浮遊させないと細胞２の増殖が抑制され得る。よって、ｎが閾値以上の場合、制御部１５は、振動子１０を介して超音波を培養液３に向かって照射する。

　制御部１５は、細胞２の沈降状態を示す情報、すなわちｎの変化率に基づいて細胞２を回収する。制御部１５は、画像３ｐから取得されたｎ及び画像ｐ３よりもｔ分前に撮像された画像ｐ４から同様に取得されたｎからｎの変化率を算出する。制御部１５は、ｎの変化率とあらかじめ記憶部１１１に記憶された閾値Ｎｃとを比較する。ｎの変化率がＮｃ以下の場合、細胞２の沈降度合いがほとんど変化していない、すなわち細胞２の分布が変動しておらず、細胞２がすでに十分に増殖している。このため、制御部１５は、吸引ポンプコントローラ１２２に細胞２の回収を指示する。制御部１５からの指示を受けて、吸引ポンプコントローラ１２２は、細胞２を回収する。一方、変化率がＮｃを超えている場合、細胞２が対数増殖期にあって十分に増殖していないため、制御部１５は細胞２を回収せずに培養を継続する。

　次に、本実施の形態における細胞培養装置３００の動作について説明する。図１４は、細胞培養装置３００による撹拌処理のフローチャートである。培養中、検出部１３は、培養液３中の細胞２を検出する（ステップＳ２１）。取得部１４は、Ｎ１及びＮ２を計数する（ステップＳ２２）。続いて、取得部１４は、ｎを取得する（ステップＳ２３）。制御部１５は、Ｎ１がＮ_ｍｉｎ以下であるか否かを判定する（ステップＳ２４）。Ｎ１がＮ_ｍｉｎ以下である場合（ステップＳ２４；Ｙｅｓ）、制御部１５は、出力部１６を介して警告音を出力し（ステップＳ２５）、撹拌処理を終了する。

　一方、Ｎ１がＮ_ｍｉｎを超える場合（ステップＳ２４；Ｎｏ）、制御部１５は、Ｎ１がＮ_ｍａｘ以上であるか否かを判定する（ステップＳ２６）。Ｎ１がＮ_ｍａｘ以上である場合（ステップＳ２６；Ｙｅｓ）、制御部１５は、出力部１６を介して通知音を出力し（ステップＳ２７）、撹拌処理を終了する。

　Ｎ１がＮ_ｍａｘ未満である場合（ステップＳ２６；Ｎｏ）、制御部１５は、ｎがＮ０以上であるか否かを判定する（ステップＳ２８）。ｎがＮ０以上である場合（ステップＳ２８；Ｙｅｓ）、制御部１５は、振動子１０を介して超音波を培養液３に向かって照射し（ステップＳ２９）、撹拌処理を終了する。一方、ｎがＮ０未満の場合（ステップＳ２８；Ｎｏ）、制御部１５はステップＳ２１に戻る。

　続いて、図１５を参照しながら、細胞培養装置３００による細胞２の回収処理について説明する。検出部１３は、ステップＳ２１をステップＳ３１として実行し、取得部１４は、ステップＳ２２及びステップＳ２３をステップＳ３２及びステップＳ３３として実行する。続いて、制御部１５は、ｎの変化率を算出する（ステップＳ３４）。制御部１５は、ｎの変化率がＮｃ以上であるか否かを判定する（ステップＳ３５）。ｎの変化率がＮｃ以下の場合（ステップＳ３５；Ｙｅｓ）、制御部１５は、細胞回収装置１２を介して細胞２を回収し（ステップＳ３６）、培養処理を終了する。これにより、細胞２が回収用バック１２３に回収される。一方、ｎの変化率がＮｃを超える場合（ステップＳ３５；Ｎｏ）、制御部１５は、ステップＳ３１に戻る。

　以上説明したとおり、本実施の形態に係る細胞培養装置３００によれば、培養容器１内における細胞２の沈降度合いが高い場合に超音波が照射され、低い場合には照射されない。こうすることで、培養液３中で沈降している細胞２を浮遊させて、細胞２の培養に最適な状態を維持することができる。

　また、細胞培養装置３００では、画像ｐ３で検出された細胞２の個数Ｎ１がＮ_ｍｉｎ以下の場合に、警告音を出力することとした。これにより、使用者は、細胞２の増殖が促進されておらず、細胞２の培養条件に不具合があることを知ることができる。また、細胞２の個数Ｎ１がＮ_ｍａｘ以上の場合に、通知音を出力することとした。Ｎ１がＮ_ｍａｘ以上であることは細胞２が十分に増殖していることを示す。したがって、使用者は、通知音を契機に培養液３を交換したり、細胞２を回収したりすることができる。なお、出力部１６は、スピーカとともに、あるいはスピーカに代えて、表示灯を備えてもよい。この場合、出力部１６は、制御部１５から伝送される指示データに基づいて、表示灯を点灯させる。

　また、細胞培養装置３００では、細胞２の沈降状態を示す情報に基づいて細胞２を回収することとした。こうすることで、細胞２が十分に増殖した適切なタイミングで細胞２を回収することができる。

　なお、Ｎ_ｍａｘ、Ｎ_ｍｉｎ及びＮｃは、培養容器１、培養対象である細胞２及び培養液３に応じて予備実験を行うことで使用者が任意に決定することができる。また、本実施の形態では、画像ｐ３の上端から下端までの高さの５０％に設定した高さ以下に存在する細胞２の個数を計数してＮ２を取得したが、設定した高さは、細胞２の種類によって適宜調整される。

　また、取得部１４は、画像ｐ３全体に検出された細胞２の個数Ｎ１に対する画像ｐ３の下端から上端までの高さの５０％に設定した高さ以下に存在する細胞２の個数Ｎ２の割合ｎを、細胞２の沈降度合いを示す情報として取得したが、画像ｐ３全体に検出された細胞２の面積に対する画像ｐ３の下端から所定の高さ以下に存在する細胞２の面積の割合を細胞２の沈降度合いを示す情報として取得してもよい。また、細胞２の回収処理において、制御部１５は、ｎの変化率がＮｃ以上であるか否かを判定したが、画像ｐ３全体に検出された細胞２の面積に対する画像ｐ３の下端から所定の高さ以下に存在する細胞２の面積の割合に基づいて細胞２を回収してもよい。

　なお、制御部１５は、細胞２の沈降速度に応じて、振動子１０による超音波の照射時間をさらに調整してもよい。また、本実施の形態に係る撹拌処理において、超音波を照射する際も、制御部１５は、細胞２の大きさに基づいて超音波の照射時間を調整してもよい。

　また、本実施の形態では、撹拌処理と回収処理とを独立して実行したが、撹拌処理に続けて回収処理を実行してもよい。例えば、撹拌処理において、ｎがＮ０未満の場合（ステップＳ２８；Ｎｏ）、制御部１５は、回収処理のステップＳ３４に進んでもよい。こうすることで、培養液３において細胞２が飽和しているために沈降の度合いが低い場合に、細胞２を適切なタイミングで回収することができる。

　なお、細胞培養装置３００では、撹拌処理のステップＳ２３の後、ステップＳ２４～Ｓ２９と並行して回収処理のＳ３４以降を実行してもよい。

　（実施の形態３）
　本発明の実施の形態３に係る細胞培養装置４００は、図１６に示すように、上記実施の形態１に係る細胞培養装置１００の構成に、さらに光源１７を備える。以下では、細胞培養装置４００について、上記実施の形態２に係る細胞培養装置１００と異なる点を主に説明する。

　細胞培養装置４００は、制御装置１１に接続された光源１７をさらに備える。光源１７は、制御部１５に制御されて培養容器１全体に紫外線等の励起光を照射する。

　培養液３には、蛍光物質１８が含まれる。蛍光物質１８の比重は細胞２の比重と同じで、蛍光物質１８の体積も細胞２と同程度である。このため、蛍光物質１８は、培養液３において細胞２と同じ分布となる。ここで、同じ分布とは、培養液３に細胞２と蛍光物質１８とが同数含まれている状態で、培養液３の撹拌直後に培養容器１内の任意の位置で採取した培養液３に含まれる細胞２の個数と、蛍光物質１８の個数と、が同程度であることを意味する。蛍光物質１８は、励起光が照射されることによって発光する。

　光源１７から照射される励起光の波長帯は、励起光の照射によって蛍光物質１８から発光する光の波長帯と重ならない波長帯である。光学センサ８は、蛍光物質１８が発光する光の波長に適した受光素子を備える。

　検出部１３は、培養液３に含まれる蛍光物質１８を検出する。より詳細には、光源１７が励起光を培養容器１に照射した状態で光学センサ８によって撮像された細胞２及び培養液３を含む画像に対応する画像データについて、検出部１３は、エッジ検出法を用いて、画像における蛍光物質１８を検出する。

　検出部１３は、画像データと、当該画像データに対応する画像における蛍光物質１８の位置に関する情報とを関連付けて記憶部１１１に記憶させる。

　取得部１４は、細胞２の沈降状態を示す情報として、検出部１３によって検出された蛍光物質１８の培養容器１における分布から培養容器１における蛍光物質１８の沈降度合いを示す情報を取得する。まず、取得部１４は、記憶部１１１に記憶された画像データを参照する。図１７に示す時刻ｔ４に撮像された画像ｐ４には、上記画像ｐ３と同様に培養液３の全体が示されている。取得部１４は、画像ｐ４全体に検出された蛍光物質１８の個数Ｎ３及び画像ｐ４の下端から上端までの高さの５０％に設定した高さ以下に存在する蛍光物質１８の個数Ｎ４を計数する。取得部１４は、Ｎ４をＮ３で除することで得られる値ｍを、培養容器１における蛍光物質１８の沈降度合いを示す情報として取得する。蛍光物質１８は、培養液３中で細胞２と同じ分布となるため、蛍光物質１８の沈降度合いを示す情報は、細胞２の沈降状態を示す情報として用いることができる。

　制御部１５は、ｍとあらかじめ記憶部１１１に記憶された閾値Ｎ_ｍとを比較する。ｍがＮ_ｍ以上か否かを判定する。制御部１５は、ｐがＮ_ｍ以上の場合、振動子１０を介して超音波を培養容器１に照射する。

　次に、細胞培養装置４００の撹拌処理について図１８に示したフローチャートを参照して説明する。培養液３に１０^７個以上の細胞２を播種するとともに、蛍光物質１８を培養液３に添加する。培養開始から一定時間経過後、制御部１５は、光源１７を介して励起光を培養容器１に照射する（ステップＳ４１）。検出部１３は、培養液３中の蛍光物質１８を検出する（ステップＳ４２）。取得部１４は、Ｎ３及びＮ４を計数する（ステップＳ４３）。

　続いて、取得部１４は、ｍを取得する（ステップＳ４４）。制御部１５は、ｍがＮ_ｍ以上であるか否かを判定する（ステップＳ４５）。ｍがＮ_ｍ以上である場合（ステップＳ４５；Ｙｅｓ）、制御部１５は、振動子１０を介して超音波を培養液３に向かって照射し（ステップＳ４６）、撹拌処理を終了する。一方、ｍがＮ_ｍ未満の場合（ステップＳ４５；Ｎｏ）、制御部１５はステップＳ４１に戻る。

　以上説明したとおり、本実施の形態に係る細胞培養装置４００によれば、培養容器１における細胞２と同じ分布となる蛍光物質１８の沈降度合いを示す情報を取得することで、培養容器１における細胞２の沈降状態を示す情報を間接的に取得できる。励起光の照射に対して蛍光物質１８から発せられる光は感度よく検出することができるため、細胞２の分布を正確に推定することができる。蛍光物質１８の位置から把握される培養容器１内の細胞２の沈降度合いが高い場合に超音波が照射されるため、沈降している細胞２を浮遊させて、細胞２の培養に最適な状態を維持することができる。

　なお、本実施の形態に係る細胞培養装置４００においても、上記細胞培養装置３００と同様に、画像ｐ３において検出される細胞２の個数Ｎ１に基づいて警告音及び通知音を出力することとしてもよい。また、警告音及び通知音に限らず、細胞培養装置４００において、検出される細胞２の個数Ｎ１に基づいて、表示灯を点灯させてもよい。また、本実施の形態に係る細胞培養装置４００においても、上記細胞培養装置３００と同様に、ｎの変化率に基づいて細胞２の回収処理を行ってもよい。

　また、光源１７による励起光の照射によって、細胞２が損傷又は劣化する場合、常時照射でなく、光学センサ８による撮像のタイミングに光源１７による励起光の照射を同期させるのが好ましい。

　本実施の形態では、画像ｐ４の上端から下端までの高さの５０％に設定した高さ以下に存在する細胞２の個数を計数してＮ４を取得したが、設定した高さは、細胞２の種類によって適宜設定される。

　細胞２と同じ分布となる物質（第１の物質）は、蛍光物質１８に限らず、当該物質は、例えば、細胞２の表面に吸着する性質を有する蛍光色素含有物質であってもよいし、細胞２内に取り込まれ、細胞２の増殖に影響を与えないマーカー物質又は発光体であってもよい。

　（実施の形態４）
　本発明の実施の形態４に係る細胞培養装置５００は、上記実施の形態１に係る細胞培養装置１００の構成と同様の構成である。したがって、細胞培養装置５００の構成に関しては、細胞培養装置１００を細胞培養装置５００に読み替えた図１を参照する。以下では、細胞培養装置５００について、細胞培養装置１００と異なる点を主に説明する。

　細胞２は増殖する過程において酸素を消費する。このため、培養液３において酸素の濃度が小さい領域では細胞２の濃度が大きく、酸素の濃度が大きい領域では細胞２の濃度が小さい。すなわち、培養液３における酸素の濃度と細胞２の濃度とは反比例の関係にある。よって、培養液３における酸素の濃度分布を計測すれば、培養容器１における細胞２の分布を間接的に取得できる。細胞培養装置５００は、培養液３における酸素の濃度分布に基づいて超音波の照射を制御する。

　培養液３における酸素の濃度の計測には、インジゴカルミンを用いる。インジゴカルミンは、水に溶解すると青色であるが中性条件で酸素と結合すると波長５５０ｎｍに吸収を持ち、緑色に変化する。このため、インジゴカルミンを含む培養液３において細胞２を培養すると、緑色に着色した領域は青色に着色した領域よりも酸素の濃度が高い、つまり、青色に着色した領域のほうが緑色に着色した領域よりも細胞２の濃度が高いことを示す。

　検出部１３は、培養液３における細胞２の分布に応じて培養液３に分布する酸素を検出する。検出部１３は、公知の色解析手法を用いて、光学センサ８によって撮像された画像における青色に着色した領域を検出する。

　検出部１３は、画像データと、当該画像データに対応する画像における青色に着色した領域の位置に関する情報とを関連付けて記憶部１１１に記憶させる。

　取得部１４は、記憶部１１１に記憶された画像データを参照する。当該画像データに対応する画像には、上記画像ｐ３と同様に培養液３の全体が示されている。取得部１４は、画像の下端から上端までの高さの５０％に設定した高さ以下の領域の内、青色に着色した領域の割合ｒを細胞２の沈降状態を示す情報として取得する。ｒは、培養液３における酸素の分布を示す情報である。

　制御部１５は、ｒとあらかじめ記憶部１１１に記憶された閾値Ｂとを比較する。制御部１５は、ｒがＢ以上か否かを判定する。制御部１５は、ｒがＢ以上の場合、振動子１０を介して超音波を培養液３に向かって照射する。

　続いて、細胞培養装置５００の撹拌処理について図１９に示したフローチャートを参照して説明する。培養液３に１０^７個以上の細胞２を播種するとともに、インジゴカルミンを０．１重量％の濃度で培養液３に添加する。まず、制御部１５が振動子１０を介して超音波を培養容器１に照射する（ステップＳ５１）。これにより、培養液３には、音響放射圧に基づく音響流が生じる。音響流によって細胞２を培養液３中で拡散させることができる。振動子１０が停止した後、時間経過につれて細胞２は次第に培養容器１の底部に沈降する。これに伴い、培養液３の液面付近に比べて培養液３の底部が青色に着色する。

　検出部１３は、光学センサ８によって撮像された画像における青色に着色した領域を検出する（ステップＳ５２）。次に、取得部１４はｒを取得する（ステップＳ５３）。制御部１５は、ｒがＢ以上であるか否かを判定する（ステップＳ５４）。ｒがＢ以上である場合（ステップＳ５４；Ｙｅｓ）、制御部１５は、振動子１０を介して超音波を培養液３に向かって照射し（ステップＳ５５）、撹拌処理を終了する。超音波の照射により、細胞２が培養溶３全体に拡散される。一方、ｒがＢ未満の場合（ステップＳ５４；Ｎｏ）、制御部１５はステップＳ５２に戻る。

　以上説明したとおり、本実施の形態に係る細胞培養装置５００によれば、培養容器１における細胞２の分布に応じて培養液３に分布する酸素の濃度が低い領域を示す情報を取得することで、培養容器１における細胞２の位置に関する情報を間接的に取得できる。細胞２を直接検出するよりも容易に検出できる物質を用いることで、培養容器１における細胞２の分布を把握することができる。

　なお、培養液３における細胞２の分布に応じて培養液３に分布する物質（第２の物質）は、例えば、細胞２の濃度に比例して増加する物質であってもよいし、細胞２の濃度に反比例して増加する物質であってもよい。本実施の形態では、細胞２の分布に応じて培養液３に分布する物質としての酸素をインジゴカルミンで検出したが、培養液３の水素イオンの濃度の分布、すなわちｐＨの分布を検出してもよい。例えば、ｐＨ指示薬としてフェノールフタレインを用いた場合、通常はｐＨ８．３以上で赤色となっているが、細胞２の近傍は酸性となり無色となることから、無色になっている領域は細胞２が多いことを示す。この場合、検出部１３は、培養液３における細胞２の分布に応じて培養液３に分布するｐＨを検出し、取得部１４は、画像の下端から上端までの高さの５０％に設定した高さ以下の領域の内、無色の領域の割合を細胞２の沈降状態を示す情報として取得すればよい。

　なお、本実施の形態では、インジゴカルミンを０．１重量％の濃度で培養液３に添加したが、インジゴカルミンの濃度は適宜調整される。

　また、他の実施の形態では、培養液３における細胞２の分布に応じて培養液３に分布する物質の検出には、光学センサ８を用いるのではなく、培養液センサ９を用いる。例えば、図２０に示すように、細胞培養装置６００は、細胞培養装置１００の構成に培養液センサ９ａを加えた構成である。培養液センサ９は、培養液３の上部のｐＨを測定する。培養液センサ９ａは、培養液３の下部のｐＨを測定する。培養液センサ９、９ａによって測定されたｐＨを示す情報は制御装置１１に伝送される。制御部１５は、培養液３の上部のｐＨよりも下部のｐＨが酸性を示す場合に、超音波を培養液３に向かって照射すればよい。これにより、細胞培養装置６００は、培養容器１における細胞２の沈降を簡便に防ぐことができる。

　なお、培養液センサ９、９ａはｐＨを測定可能な電極でもよいし、酸素濃度を計測可能な電極であってもよい。また、培養液センサ９、９ａは細胞２が排出する老廃物を計測可能なセンサであってもよい。また、細胞培養装置６００は、他の実施の形態で説明した機能を併用してもよい。

　（実施の形態５）
　本発明の実施の形態５に係る細胞培養装置７００の構成は、図２１に示すように、光学センサ８を備えていない点を除いて、細胞培養装置１００と同じ構成である。以下では、細胞培養装置７００について、上記実施の形態１に係る細胞培養装置１００と異なる点を主に説明する。

　取得部１４は、沈降状態を示す情報として、細胞２の終端速度を算出する。ここでの終端速度は、細胞２が体積力と速度に依存する抗力を受けるときに、それらの力がつりあって変化しなくなったときの速度をいう。終端速度は細胞２の観測初期分布状態からストークスの式（式１）で求めることができる。ストークスの式は小さな粒子が流体中を沈降する際の終端速度を表す。

　　Ｖ_ｓ＝Ｄ_ｐ ^２（ρ_ｐ－ρ_ｆ）・ｇ／１８η　　（式１）
　ここでＶ_ｓ：終端速度［ｍ／ｓ］、Ｄ_ｐ：粒子径［ｍ］、ρ_ｐ：粒子の密度［ｋｇ／ｍ^３］、ρ_ｆ：流体の密度［ｋｇ／ｍ^３］、ｇ：重力加速度［ｍ／ｓ^２］、η：流体の粘度［Ｐａ・ｓ］である。

　Ｄ_ｐ、ρ_ｐ、ρ_ｆ、ｇ及びηは、予備実験又は理論値であらかじめ決定できる値である。取得部１４は、あらかじめ与えられたＤ_ｐ、ρ_ｐ、ρ_ｆ、ｇ及びηの値から算出された終端速度Ｖ_ｓ及び培養液３の高さに基づいて細胞２が沈降するまでの時間を算出することができる。ここで、細胞２の観測初期分布状態とは、培養の開始直後又は培養液３を撹拌した直後の細胞２の培養液３内での分布をいう。観測初期分布状態では、培養容器１内に細胞２が一様に分布するものとする。

　観測初期分布状態から一定の時間経過後、培養液３中の細胞２の沈降速度は一定となるため、取得部１４は、経時的な細胞２の分布を推定できる。制御部１５は、推定された細胞２の分布において細胞２が沈降するタイミングで、振動子１０を介して培養液３に超音波を照射する。

　超音波の照射によって、沈降している細胞２を浮遊させることができるので、培養容器１内の細胞２の過度の沈降を防ぐことができる。

　以上説明したとおり、本実施の形態に係る細胞培養装置７００によれば、光学センサ８を備えていなくても、沈降状態を示す情報を取得することができる。このため、細胞培養装置７００の構成を簡略化しつつ、超音波による撹拌において培養液３への不要な超音波の照射を防ぐことができ、効率よく細胞２を培養することができる。

　なお、細胞培養装置７００は、培養液センサ９を備えなくてもよい。また、細胞培養装置７００は、光学センサ８を備え、他の実施の形態で説明した機能を併用してもよい。

　（実施の形態６）
　本発明の実施の形態６に係る細胞培養装置８００について、上記実施の形態１に係る細胞培養装置１００と異なる点を主に説明する。図２２に示すように、細胞培養装置８００は、細胞培養装置１００の構成に加えて、容器情報設定部１９を備える。

　容器情報設定部１９は、使用者が培養容器１の容量に関する情報を入力する入力装置を備える。容器情報設定部１９は、制御装置１１に接続されている。容器情報設定部１９は、使用者によって入力装置を介して入力された培養容器１に関する情報を制御装置１１に伝送する。

　ここでの培養容器１に関する情報は、培養容器１の高さ及び底面積である。取得部１４は、培養容器１の高さ及び底面積から、培養容器１の容量に関する情報として、培養容器１の容量を算出する。制御部１５は、培養容器１の容量に基づいて振動子１０の動作を制御する。制御部１５は、培養容器１の容量に応じて、超音波の照射時間を調整する。例えば、制御部１５は、培養容器１の容量があらかじめ記憶部１１１に記憶された閾値Ｃ以上の場合には、超音波の照射時間をＴ１として超音波を照射し、培養容器１の容量がＣ未満の場合には、超音波の照射時間をＴ１よりも短いＴ２として超音波を照射する。

　続いて、細胞培養装置８００の撹拌処理について図２３に示したフローチャートを参照して説明する。なお、培養の開始前に容器情報設定部１９を介して培養容器１に関する情報が細胞培養装置８００にあらかじめ入力されているものとする。取得部１４は、入力された培養容器１に関する情報から培養容器１の容量を算出し、培養容器１の容量を記憶部１１１に記憶させている。

　培養中、検出部１３は、培養液３中の細胞２を検出する（ステップＳ６１）。取得部１４は、位置情報に基づいて沈降速度を取得する（ステップＳ６２）。制御部１５は、細胞２の沈降速度がＮ_ｖ以上であるか否かを判定する（ステップＳ６３）。沈降速度がＮ_ｖ以上の場合（ステップＳ６３；Ｙｅｓ）、制御部１５は、記憶部１１１を参照し、培養容器１の容量がＣ以上か否かを判定する（ステップＳ６４）。

　培養容器１の容量がＣ以上の場合（ステップＳ６４；Ｙｅｓ）、制御部１５は、照射時間をＴ１として超音波を培養液３に向かって照射し（ステップＳ６５）、撹拌処理を終了する。一方、培養容器１の容量がＣ未満の場合（ステップＳ６４；Ｎｏ）、制御部１５は、照射時間をＴ２として超音波を培養液３に向かって照射し（ステップＳ６６）、撹拌処理を終了する。

　以上説明したとおり、本実施の形態に係る細胞培養装置８００によれば、培養容器１の容量に応じて培養液３に照射される超音波の照射時間が調整される。培養容器１の容量が多い場合には、細胞２を浮遊させるために必要な超音波が照射される一方で、培養容器１の容量が少ない場合には、可能な限り超音波の照射を抑えて、細胞２を浮遊させることができる。よって、培養液３への不要な超音波の照射を防ぎつつ、細胞２の培養に適した培養液３の状態を維持することができる。

　なお、培養容器１に関する情報は、細胞培養に汎用される培養容器を識別するコードであってもよい。この場合、取得部１４は、あらかじめ記憶部１１１に記憶されたコードと当該コードで識別される培養容器の容量とが対応付けられたテーブルを参照し、使用者によって入力されたコードから培養容器の容量を取得する。細胞培養装置８００は、他の実施の形態で説明した機能を併用してもよい。

　（実施の形態７）
　本発明の実施の形態７に係る細胞培養装置９００について、上記実施の形態１に係る細胞培養装置１００と異なる点を主に説明する。図２４に示すように、細胞培養装置９００は、細胞培養装置１００の構成に加えて、定在波を生成する定在波生成部２０をさらに備える。

　定在波は、波の進行があたかも止まっているように観測される波である。定在波で、「腹」の位置で振幅が最大となり、振動が繰り返し行われ、「節」の位置で振幅が最小となる。培養液３に生じた定在波の節に細胞２を留めることができる。

　定在波生成部２０の動作は制御部１５によって制御される。制御部１５は、定在波生成部２０から照射される超音波の波長、周波数及び振幅を調整することで、定在波の節を培養液３の任意の位置に生じさせる。吸入口１２５の近くに定在波の節を生じさせることで、節に集められた細胞２を細胞回収装置１２で効率よく回収できる。

　次に、細胞培養装置９００の動作について説明する。制御部１５によって細胞２の沈降状態を示す情報に基づいて振動子１０の動作が制御されながら、細胞２が培養される。培養が終了したら、制御部１５は、定在波生成部２０を介して定在波を照射する。そして、定在波の節に細胞２が留まるまで待つ。

　吸入口１２５は、細胞２が集まる定在波の節の位置付近に配置されている。吸引ポンプコントローラ１２２が吸引ポンプ１２１を駆動することで、定在波の節に集められた細胞２が回収用バッグ１２３に回収される。

　以上説明したように、本実施の形態に係る細胞培養装置９００では、定在波を用いて細胞２を任意の位置に集めることができる。したがって、吸入口１２５の位置に細胞２を集めることで、細胞２を効率的に回収することができる。なお、細胞培養装置９００は、吸入口１２５を培養容器１内の任意の位置に移動させる駆動機構を備えてもよい。細胞培養装置９００は、駆動機構を介して、吸入口１２５を定在波によって細胞２が集められる位置に移動させることで、効率よく細胞２を回収できる。

　定在波生成部２０は、細胞培養装置２００における構成において、振動子１０から照射される超音波Ｕ１の進行方向と、振動子１０ａから照射される超音波Ｕ２の進行方向とを対向させることでも実現できる。この場合、超音波Ｕ１の波長、周波数及び振幅と、Ｕ２の波長、周波数及び振幅とがそれぞれ等しい場合、超音波Ｕ１と超音波Ｕ２とが干渉して、定在波が合成される。

　また、振動子１０から照射される超音波を振動子１０に向けて反射する反射部材を配置することでも、定在波生成部２０を実現できる。振動子１０から照射される超音波と、反射部材によって反射された超音波とで、定在波を生じさせることができる。

　なお、上記すべての実施の形態における振動子１０又は１０ａの超音波の照射方向は、手動又はモータ等を用いた自動の位置決め機構で変えることとしてもよい。

　また、上記すべての実施の形態における振動子１０の駆動及び停止を繰り返す制御において、制御部１５は、駆動の時間と停止の時間との比率を細胞２の沈降状態を示す情報及び細胞２の大きさを示す情報に基づいて変更してもよい。例えば、制御部１５は、細胞２が大きくなるにつれて、駆動の時間に対して停止の時間を短くすればよい。

　制御装置１１で用いられる制御プログラム１１５及び各種ソフトウェアプログラムは、ＣＤ－ＲＯＭ（Compact Disc Read Only Memory）、ＤＶＤ（Digital Versatile Disc）、光磁気ディスク（Magneto-Optical Disc）、ＵＳＢ（Universal Serial Bus）メモリ、メモリカード、ＨＤＤ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納して配布することが可能である。そして、制御プログラム１１５及び各種ソフトウェアプログラムを特定の又は汎用のコンピュータにインストールすることによって、当該コンピュータを制御装置１１として機能させることが可能である。

　また、制御プログラム１１５及び各種ソフトウェアプログラムをインターネット上の他のサーバが有する記憶装置に格納しておき、当該サーバから制御プログラム１１５及び各種ソフトウェアプログラムがダウンロードされるようにしてもよい。

　本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。

　１　培養容器、２　細胞、３　培養液、４　細胞塊、５　水槽、６　液体、７　蓋、７ａ　細胞培養フラスコ、８　光学センサ、９，９ａ　培養液センサ、１０，１０ａ　振動子、１１　制御装置、１２　細胞回収装置、１３　検出部、１４　取得部、１５　制御部、１６　出力部、１７　光源、１８　蛍光物質、１９　容器情報設定部、２０　定在波生成部、１１０　超音波振動子制御回路、１１１　記憶部、１１２　ＲＡＭ、１１３　ＣＰＵ、１１４　バス、１１５　制御プログラム、１２０　管、１２１　吸引ポンプ、１２２　吸引ポンプコントローラ、１２３　回収用バッグ、１２４　開閉弁、１２５　吸入口、１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００　細胞培養装置、ｐ１，ｐ２，ｐ３，ｐ４　画像。

Claims (15)

1. 　培養容器に細胞とともに保持された培養液に向かって超音波を照射する照射部と、
   　前記培養液における前記細胞の沈降状態を示す情報を取得する取得部と、
   　前記細胞の前記沈降状態を示す情報に基づいて前記照射部の動作を制御する制御部と、
   　を備える、細胞培養装置。
2. 　前記取得部は、
   　前記沈降状態を示す情報として、前記細胞の終端速度を算出する、
   　請求項１に記載の細胞培養装置。
3. 　前記培養液中の前記細胞を検出する検出部をさらに備え、
   　前記取得部は、
   　前記沈降状態を示す情報として、前記検出部によって検出された前記細胞の沈降速度を算出する、
   　請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
4. 　前記取得部は、
   　前記検出部によって検出された前記細胞の大きさを示す情報を取得し、
   　前記制御部は、
   　前記細胞の大きさを示す情報に基づいて前記照射部の動作を制御する、
   　請求項３に記載の細胞培養装置。
5. 　前記取得部は、
   　前記細胞の前記沈降状態を示す情報として、前記検出部によって検出された前記細胞の前記培養容器における分布から前記培養容器における前記細胞の沈降度合いを示す情報を取得する、
   　請求項３又は４に記載の細胞培養装置。
6. 　前記培養液は、
   　該培養液において前記細胞又は該細胞が凝集した細胞塊と同じ分布となる第１の物質を含み、
   　前記検出部は、
   　前記培養液における前記第１の物質を検出し、
   　前記取得部は、
   　前記細胞の前記沈降状態を示す情報として、前記検出部によって検出された前記第１の物質の前記培養容器における分布から前記培養容器における前記第１の物質の沈降度合いを示す情報を取得する、
   　請求項３から５のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
7. 　前記検出部は、
   　前記培養液における前記細胞又は該細胞が凝集した細胞塊の分布に応じて前記培養液に分布する第２の物質を検出し、
   　前記取得部は、
   　前記細胞の前記沈降状態を示す情報として、前記培養液における前記第２の物質の分布を示す情報を取得する、
   　請求項３から６のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
8. 　前記取得部は、
   　前記検出部によって検出された前記培養液における前記細胞の個数に相関する情報を取得し、
   　前記制御部は、
   　前記細胞の個数に相関する情報に基づいて使用者に通知を行う、
   　請求項３から７のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
9. 　前記検出部は、
   　前記培養液に含まれる第３の物質の濃度を検出し、
   　前記制御部は、
   　前記第３の物質の濃度に基づいて前記照射部の動作を制御する、
   　請求項３から８のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
10. 　前記培養容器内の前記細胞を回収する回収部をさらに備え、
    　前記回収部は、
    　前記細胞の前記沈降状態を示す情報に基づいて前記細胞を回収する、
    　請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
11. 　前記培養容器内の前記細胞を回収する回収部をさらに備え、
    　前記取得部は、
    　前記検出部によって検出された前記培養液に含まれる前記細胞の個数の変化を示す情報を取得し、
    　前記回収部は、
    　前記細胞の個数の変化を示す情報に基づいて前記細胞を回収する、
    　請求項３から９のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
12. 　定在波を生成する定在波生成部をさらに備え、
    　前記回収部は、
    　前記定在波で集められた前記細胞を回収する、
    　請求項１０又は１１に記載の細胞培養装置。
13. 　前記取得部は、
    　前記培養容器の容量に関する情報を取得し、
    　前記制御部は、
    　前記培養容器の容量に関する情報に基づいて前記照射部の動作を制御する、
    　請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
14. 　培養容器に細胞とともに保持された培養液における前記細胞の沈降状態を示す情報を取得する取得ステップと、
    　前記細胞の前記沈降状態を示す情報に基づいて、前記培養液に向かって超音波を照射する照射部の動作を制御する制御ステップと、
    　を含む、細胞培養方法。
15. 　培養容器に細胞とともに保持された培養液に向かって超音波を照射する照射部を制御するコンピュータを、
    　前記培養液における前記細胞の沈降状態を示す情報を取得する取得部、
    　前記細胞の前記沈降状態を示す情報に基づいて前記照射部の動作を制御する制御部、
    　として機能させる、プログラム。

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