JP6998387B2 - 分散流体における光学的または電気的測定のための方法およびシステム - Google Patents

分散流体における光学的または電気的測定のための方法およびシステム Download PDF

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Description

本発明は、概して、分散流体における光学的または電気的測定のための方法およびシステムの分野に関する。さらに、本発明は、詳細には、粒子および／または細胞を含まない流体の一部において吸光度を測定する、生体液における吸光度測定の分野に関する。
分散流体は、１つ以上の連続相、例えば流体に分散した粒子からなる。特に対象となる１つの分散流体は、約４５％の赤血球（red blood cells or erythrocytes）、約０．７％の白血球（white blood cells or leukocytes）からなり、残りの約５４．３％が血漿である血液であるが、これらの値は個体間で異なり得、これらの値は、一部の疾患においても大きく異なり得、この場合、赤血球の体積分率は、血液の体積の２５～６０％であり得る。
血液試料に対して行われる光学的または電気的測定には、血液試料中の遊離ヘモグロビンの濃度を測定するための吸光度測定が挙げられ、この測定値は、破裂して血漿中にヘモグロビンを放出した赤血球の量に関する指標である。溶血度、すなわち破裂した赤血球の量は、患者の健康状態を直接評価するための重要な診断パラメータである。溶血、および付随する赤血球の内容物の血漿中への放出が、血液試料に対して行われた他の測定の結果に影響を与えるため、溶血度、すなわち破裂した赤血球の量は、さらに着目される。
典型的には血液試料は血液ガス分析を使用して分析され、酸素および二酸化炭素の分圧、ならびに試料の他の多くのパラメータ、例えばｐＨ、ＨＣＯ３－、ｐ５０、ｓＯ２、塩基過剰、ｃｔＨｂ、ＣＯＨｂ、ＭｅｔＨｂ、Ｃａ２＋、およびＫ＋が測定される。非溶血血液試料から得られた値と比較して、これらの一般的に測定されるパラメータのうち８つ以上が影響を受け、ｐＨ、ｐＯ２、ｓＯ２、ＣＯＨｂ、およびＣａ２＋では低い値を返し、ｐＣＯ２、ＨＣＯ３ －、およびＫ＋では高い値を返す。
遊離ヘモグロビンの量は、血液の無細胞部分における吸光度測定によって測定され得る。この無細胞部分は、赤血球および白血球を重力下で自然に、または遠心分離機中で沈降させ、それにより血液試料を透明な血漿を含む第１部分と血球を含む第２部分とに分割することによって作製される。
しかしながら、これらの方法は、かなりの時間（自然沈降）を必要とするか、または高価な装置（遠心分離機）を必要とし、少量の血液を取り扱う自動化システムに統合することが現実的ではないという欠点を有する。
特許文献１は、無菌容器、すなわち血液バッグ中の溶血度を測定する方法を提案しており、この方法では、血液バッグに接続されたチューブ内の血球の沈降を生じさせるかまたは促進させ、それにより、光学的にヘモグロビンの濃度を測定するために血漿の光学的に透明な領域を形成することを目的として、超音波を使用する。実施例が提供されていないため、超音波を提案されているように実際に使用することができるかどうかは疑わしいままである－特に、本発明者らは、血液バッグおよびチューブが規格化寸法ではないために、提案されているように血球を血漿から分離することができるかどうかが疑わしいことに気付いた。さらに、当該アプローチは、採血またはフィンガープリックからの少量試料には適していない。
特許文献２は、粒子含有流体中の粒子を分離しながら１以上の粒子含有流体分析物を分析するための、検出器と一体化された、流体から粒子を分離するための、音波トランスデューサなどの機器を有する、全血などの粒子含有流体中の分析物検出および分析物のための装置および方法を開示する。
非特許文献１は、連続フローマイクロシステムにおける音響泳動（Acoustophoresis）の応用を開示している。
特許文献３は、ヘマトクリット値を測定するための超音波装置を開示しており、当該装置では、マイクロヘマトクリットキャピラリーチューブに入れた血液の試料を用い、特定の周波数で作動させる超音波トランスデューサにこの管を接続して赤血球をバンドに詰め、このバンドの厚さが残りの血漿のバンドの厚さとの関連で、血球のヘマトクリット値の指標となる。
非特許文献２は、障壁なしに粒子を濾過するためにマイクロチャネルを通して粒子を移動させる、周波数が変動する超音波、超音波定在波の周波数掃引を使用するフロースルー粒子濾過（flow-through particle filtration）を開示している。
非特許文献３は、いくつかの材料の平均音響特性を開示している。
発明の目的
本発明は、血液などの分散流体における光学的または電気的測定のための公知の方法の前述の不利な点および欠点、特に、測定のための透明部分を得る際に重力または遠心分離を用いることに伴う不利な点を取り除くことを目的とする。
したがって、本発明の主な目的は、分散流体における光学的または電気的測定を実施する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、分散流体における光学的または電気的測定を実施するためのマイクロ流体システムを提供することである。
ドイツ第１０２００４０１３９６０号 米国第２０１６／２０２２３７Ａ１号 米国第４８５４１７０Ａ号
Andreas Lenshof et al: "Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems", LAB ON A CHIP, vol. 12, no. 7, 7 March 2012 Dae-Cheol Seo et al: ″Ultrasonix flow-through filtration of microparticles in a microfluidic channel using frequency sweep technique" Journal of mechanical Science and technology vol. 27, no. 3, 1 March 2013) Mark V. Brooks: "2.2.2 Acoustic Properties of Crystal Materials" In: "Ultrasonic Inspection Technology Development and Search Unit Design" 1 January 2012, John Wiley & Sons
以下の説明から明らかになる上述の目的の少なくとも１つまたはさらなる目的の少なくとも１つは、本発明の第１の態様に従って、分散流体の試料における光学的または電気的測定を実施する方法によって達成され、前記試料は粒子および流体を含み、前記方法は以下の工程を含む：
ａ）共振周波数を有するマイクロ流体キャビティ内に前記試料を配置する工程と、
ｂ）前記キャビティ内で、前記キャビティの少なくとも１つの第１領域に前記粒子を集合させ、それによって前記流体が前記キャビティの少なくとも１つの第２領域を占めるようにするように構成された音響定在波を前記試料に照射する工程であって、前記音響定在波の周波数を、前記共振周波数より低い周波数と前記共振周波数より高い周波数との間で繰り返し変動させる工程と、
ｃ）前記キャビティの前記少なくとも１つの第２領域のうちの少なくとも１つにおいて、前記流体における光学的または電気的測定を実施する工程。
したがって、本発明は、通常、粒子の適切な集合または分離を達成するために、非常に高精度に形成されたマイクロ流体キャビティおよび音響定在波の周波数の適切な微調整の必要性があるが、本発明の第１の態様による方法で定義されるように周波数を繰り返し変動させることによって、これらの要件は大部分不要となり得るという、本発明者らによる発見に基づいている。したがって、共振周波数より低い周波数と共振周波数より高い周波数との間で周波数を変動させることによって、キャビティの少なくとも１つの第１領域での粒子のより安定した集合が達成される。これは予想外であり、マイクロ流体キャビティ内の微小の凸凹または音響定在波の周波数のわずかな誤調整が不充分な集合／分離をもたらした単一周波数での初期の実験と比較して、著しい進歩を表す。さらに、周波数を変動させると、最適な周波数での作動はほんのわずかな時間しか実行できないため、粒子の集合または分離があまり効果的でなくなることが予想され得るにもかかわらず、粒子の迅速で再現性のある集合が達成されたことは、驚くべきことである。したがって、本発明の第１の態様による方法は、キャビティを有する基体がより大きい公差で製造され、そのため個々の基体間で共振周波数が異なる場合であっても、粒子の効率的な集合を提供し、結果的に安価な使い捨ての基体の使用を提供するため、有用である。これは、分散流体におけるポイントオブケア光学的または電気的測定を実施することをより容易かつ安価にし、時間のかかる遠心分離を必要としない。このアプローチは、音速が試料の種類に依存していることを補償するため、本来なら必要なチップ／基体ごとおよび測定ごとの較正ルーチンまたは作動中の粒子集合の視覚的もしくは他の方法による監視を不要にする。これにより、さらに、試料に音響定在波を照射したときに、キャビティに対してより予測可能で再現可能な位置に少なくとも１つの第２領域が形成されるようになる。これは、光学的または電気的測定を実施することをより容易にし、さらに、試料に音響定在波を照射する前に少なくとも１つの第２領域のうちの１つに向けられるように検出器を配置することを可能にする。これにより、基体が大きい公差で製造される場合も、光学的または電気的測定が実施される第２領域が、毎回、キャビティの寸法に対してほぼ同じ位置に形成されることが予想され得るため、例えば単一光源および単一光検出器もしくはフォトダイオードなどの単純な検出器、または単純な電極を使用することが可能になり、これは作動が単一周波数で行われるときには当てはまらないことが多いことである。
光学的測定には、吸光度測定、蛍光測定、ラマン分光法、化学発光および散乱が挙げられる。電気測定には、電気インピーダンス（分光）測定、電気化学測定、ボルタンメトリー、導電率が挙げられる。
好ましくは、光学的または電気的測定は吸光度測定である。吸光度測定は、光吸収率の測定、光透過率の測定、１以上の波長における吸光度の測定、１以上の波長における透過率の測定を含み得る。
試料は流体の形態であり、かつ、キャビティ内に配置されるのに適した粘度である必要がある。
分散流体は、例えば、未希釈または希釈全血、細胞内液、間質液、滑液、腹水、尿、酵母細胞培養物、骨髄、支質、正常またはがん性組織からの解離細胞、乳汁を含み得る。
粒子は、赤血球、白血球、血小板、がん細胞、細菌細胞、ウイルス、酵母細胞、ダスト粒子、シリカ粒子およびポリマー粒子を含み得る。
流体は、血漿、水、尿、酵母細胞培養液、細胞培養液、食塩水、リン酸緩衝食塩水、細胞内液または間質液、乳漿であり得る。
本発明の第１の態様による方法のいくつかの実施形態は、分散流体の光学的性質に影響を及ぼす目的で、分散流体をキャビティ内に配置する前に、分散流体と混合させるために、試薬、ｐＨ調整剤（酸、塩基）などの他の分子成分を分散流体に加えるさらなる工程を含み得る。
試料は、ポンピングによって、圧力によって、吸引によって、電界の作用によって、重力によって、および毛管作用によって、キャビティ内に配置され得る。
マイクロ流体キャビティは環境に対して閉じられていてもよい。マイクロ流体キャビティは、好ましくは、正方形または長方形の断面を有するチャネルである。マイクロ流体キャビティは、例えば、断面高さの１～１００倍、例えば１～２０倍などの断面幅を有し得る。この場合、マイクロ流体キャビティの長さは少なくとも幅と同じである。幅は、例えば、０．３ｍｍ～５ｍｍであり得る。高さは、例えば、０．０２５ｍｍ～１ｍｍであり得る。
マイクロ流体キャビティの共振周波数は、定在波が周波数に反比例する波の波長λを形成するためには、ｎλ／２でなければならないため、寸法に依存し、ここでｎは正の整数である。
以下は、キャビティの幅寸法に沿った定在波の第１の３つの共振である：
第１共振周波数ｆは、第１高調波ｗに対応する音響定在波λ／２に対応し、ここで定在波の圧力腹はキャビティの壁の近くに位置し、単一の圧力節がキャビティの中央に形成され、これにより粒子をキャビティの中央に集合させ、これが第１領域となり、キャビティの側壁付近の領域が第２領域となる。したがって、壁１－流体１－粒子１－流体２－壁２を得る。
第２高調波では、第１共振周波数の２倍の共振周波数、すなわち２ｆに対応して、２つの節と３つの腹とを有する定在波λが形成され、これにより全体的に粒子をキャビティの中央の両側の２つのバンドに集合させ、これが第１領域となり、キャビティの中央および側面が第２領域となる。したがって、壁１－流体１－粒子１－流体２－粒子２－流体３－壁２を得る。これが好ましい共振周波数である。
第３高調波に対応する第３の共振周波数は、第１共振周波数の３倍、すなわち３ｆであり、３つの節と４つの腹を有する定在波３λ／２と対応し、これにより粒子をキャビティ内の３つの位置に集合させ、これらの３つは第１領域となり、これらの位置は互いにおよびキャビティの壁から離間して３つの第２領域を形成する。したがって、壁１－流体１－粒子１－流体２－粒子２－流体３－粒子３－流体４－壁２を得る。
したがって、共振周波数という用語は、キャビティ内に定在波が形成され得る任意の周波数を含むものと理解され、定在波の形成を引き起こす周波数は、粒子を少なくとも１つの第１領域に集合させるように構成された周波数と見なされる。さらに、たとえ共振、ひいては定在波が主に幅寸法にあったとしても、キャビティの長さ寸法に沿って共振の成分が常に存在し、高さ寸法にも存在する可能性があることを述べておかなければならない。これらの三次元共振は一次元共振周波数に近いいくつかの共振周波数をもたらし、各々は対応する集束パターンを有する。これらの共振周波数のうちのいくつかにわたって作動周波数を掃引することは、それらの全てを利用し、結果として得られる別個の共振についての音場の加重平均と、そのようにして合成された集束パターンにより生じる、より予測可能で均一な音響集束を作り出すことを可能にする。
したがって、音響共振が一次元に単純化されるだけではなく三次元で理解される必要があるという理解は、予測可能、再現可能、かつロバストな音響集束パターンおよび粒子の集合を生じさせることによって、実用上重要な効果を生み出す。その結果、単一周波数作動では不可能である、システム内の予測可能で再現可能な位置での検出が可能になる。
したがって、キャビティの共振周波数、ひいては音響定在波の周波数は、０．１５ＭＨｚ～１０ＭＨｚであり得る。
周波数を共振周波数より２０％低い周波数から共振周波数より２０％高い周波数まで変動させ得る。周波数を共振周波数より１０％低い周波数から共振周波数より１０％高い周波数まで変動させることが好ましい。周波数は、連続的に、あるいは試料／分散流体に音響定在波を照射している間のある時間中にのみ変動させ得る。周波数を直線的、または対数関数的に変動させ得る。
共振周波数で得られる数とは異なる数の節および腹をもたらすことになるキャビティの異なる共振周波数に周波数が相当するほど低い周波数から、または高い周波数まで変動させてはならない。
言い換えれば、本発明の態様に従って周波数ｆＤＮを変動させる場合、ｆＤＮに対応する音響定在波のＮ半波長に対応するある次元Ｄを有するキャビティの少なくとも１つの第１領域に粒子を集まらせるために、周波数ｆＤＮは、常に（ｃ＊（Ｎ－１））／（２＊Ｄ）より高く、（ｃ＊（Ｎ＋１））／（２Ｄ）より低い必要があり、ここで、ｃは流体における音速である。
実際には、ｆＤＮの１％～４０％の掃引範囲、すなわち、ｆＤＮの±０．５～２０％の範囲にわたって変動させる周波数は、特定の数の圧力節に対応する共振周波数ならびにチャネルの製造公差および試料音速の変動をカバーするのに充分である。
超音波トランスデューサ用の作動信号は、好ましくは、１０００Ｈｚの繰返し率、および約１５Ｖｐｐ（電圧ピーク－ピーク）の振幅を有する線形チャープ正弦波であり得る。
言い換えれば、超音波トランスデューサ用の作動信号は、例えば、掃引時間が１ｍｓの線形チャープ正弦波であり得る。信号の振幅は１５Ｖｐｐ（電圧ピーク－ピーク）であり得る。
掃引時間は、集合が起こる時間枠よりはるかに短い必要がある。したがって、掃引時間が集合が起こる時間枠よりもはるかに短くなるように、繰返し率は充分に高い必要がある。一例として、５秒の時間枠にわたって粒子がキャビティ内に集合させられる場合、掃引の繰返し率を、周波数が１００回以上サイクルするように設定することができ、すなわち、５０ｍｓ以下の掃引時間に対応して毎秒２０回以上の繰返しを設定することができる。
したがって、掃引時間は、例えば、１００ｎｓ～５０ｍｓ、例えば１ｍｓ～５０ｍｓであり得る。掃引時間が遅すぎると、測定時間中、すなわち試料に音響定在波を照射する時間中に、第１および第２領域の形状が変化する。
作動周波数を掃引するという概念は、共振キャビティに特有のものではないが、例えばシステム内の表面音響波または他の共振により発生する定在波にも適用可能である。ここで、掃引は、試料の音響特性または温度の変動を補償し、製造公差および温度膨張などに起因するシステムの寸法の変動を補償し、いくつかの定在波を利用してより均一で予測可能な集束パターンを生じさせるという同じ作用を有する。
光学的または電気的測定は、単純化のために、第２領域のうちの１つで実施するだけであることが好ましいが、当該方法の正確度およびロバスト性を高めるために第２領域の全てにおいて光学的または電気的測定を実施することも可能である。吸光度測定の場合、全キャビティの吸光度画像または透過画像を取得することができ、全ての清澄化領域、すなわち第２領域を適当な画像解析アルゴリズムで解析することができる。
本発明の第１の態様による方法の好ましい実施形態では、音響定在波は、粒子をキャビティの１つまたは２つの第１領域に集合させるように構成されている。これは、光学的または電気的測定を実施するための大きな第２領域をもたらし、それにより測定が粒子による影響を受けない可能性を高めるため、有利である。これは、キャビティの関連する寸法、典型的には幅と同じまたはその１／２である音響定在波の波長に対応する周波数に相当する。
本発明の第１の態様による方法の代替実施形態では、音響定在波、および／またはキャビティは、粒子をキャビティの３つ以上の第１領域に集合させるように構成されている。これは、光学的または電気的測定を実施するためのさらなる第２領域を提供するため、有利であり得る。当該周波数は、第１共振周波数の４倍またはそれ以上に増加させることによって構成され得る。当該キャビティは、キャビティの寸法を大きくすることによって構成され得る。
本発明の第１の態様による方法の好ましい実施形態では、当該方法は、以下の工程：
ｄ）キャビティを通る試料の流れを発生させる工程、をさらに含む。これは、当該方法をインラインおよびオンラインの光学的または電気的測定に使用することを可能にするため、有利である。
流れを、ポンピングによって、圧力によって、吸引によって、電界の作用によって、重力によって、および毛管作用によって発生させ得る。
キャビティは、試料がキャビティ内に導入される際に通る入口に流体接続され、試料がキャビティから出ていく際に通る出口に流体接続されていてもよい。試料の異なる部分を異なる出口に導くために、２つ以上の出口がキャビティに流体接続されていてもよい。
本発明の第１の態様による方法の好ましい実施形態では、キャビティは細長く、一端で入口に、他端で出口に流体接続されている。これは、キャビティを提供するために単純なガラスキャピラリーを使用することを可能にするため、有利である。典型的には、キャビティの長さは、キャビティの幅の５倍以上である必要がある。いくつかの実施形態では、キャビティの横方向の寸法は、キャビティへの入口および出口の横方向の寸法よりも大きい。
本発明の第１の態様による方法の好ましい実施形態では、キャビティを基体内に形成する。基体はシリコン製でもよいが、プラスチックなどのポリマー材料製、あるいはガラス製でもよい。セラミックおよび金属などの他の材料も可能である。これらの材料は安価であり、そのため使い捨て消耗品としてポイントオブケア設定で現場において光学的または電気的測定を実施するのに適している。
基体はチップのように平面状であってもよく、あるいは基体はキャピラリーとして形成されてもよい。
本発明の第１の態様による方法の好ましい実施形態では、音響定在波を生じさせるための超音波エネルギーは、超音波トランスデューサと基体とに接続されたガラス結合部材のみを介して、少なくとも１つの超音波トランスデューサから基体に伝達される。これは、特に光学的測定を実施するためにキャビティへアクセスすることを容易にするため、有利である。ガラス結合部材を超音波トランスデューサおよび基体に、接着剤によって、または互いに接触するように配置することによって、接続してもよい。
本発明の第１の態様による方法の好ましい実施形態では、試料は全血試料であり、そのため、粒子は少なくとも赤血球を含み、流体は少なくとも血漿を含む。粒子は白血球をさらに含み得る。
本発明の第１の態様による方法の好ましい実施形態では、光学的または電気的測定は、血漿中の遊離ヘモグロビンの量または濃度を測定することを含む吸光度測定である。遊離ヘモグロビンの量または濃度は、溶血度、すなわち、とりわけヘモグロビンを溶解および放出した試料中の赤血球のパーセンテージに関連する。とりわけ吸光値または透過値であり得る吸光度測定の結果に基づいて、遊離ヘモグロビンの対応する量または濃度は、例えば、この値を、既知の溶血度を有する参照試料の測定から得られた値と比較することによって求め得る。
本発明の第１の態様による方法の一実施形態において、当該方法では、試料が全血試料であり、かつ／または吸光度測定が血漿中の遊離ヘモグロビンの量または濃度を測定することを含み、当該方法は、以下の工程：
ｄ）少なくとも１つの第１領域内の赤血球の体積と少なくとも１つの第２領域内の血漿の体積との間の関係を決定する工程と、ｅ）前記関係に基づいて血液試料のヘマトクリット値を決定する工程、をさらに含む。
関係の決定およびヘマトクリット値の決定は、以下でさらに説明されている本発明の第３および第４の態様に関して論じられているように実施するべきである。
したがって、関係の決定は、少なくとも１つの第１領域の体積および少なくとも１つの第２領域の体積を測定することによって行い得る。
関係を決定するために、全ての第１領域の合計体積および全ての第２領域の合計体積を測定し得る。
体積の関係は、少なくとも１つの第１領域の面積および少なくとも１つの第２領域の面積を測定することによって決定し得、面積は、キャビティの２つの直交次元（ＸＹ、長さ－幅）からなる平面において求められるが、ただし、領域がキャビティの第３の次元（Ｚ、高さ）で同じ広がりを有すること、または測定が深さの変動に対して調整されていることを条件とする。
上述の目的の少なくとも１つ、または以下の説明から明らかになる他の目的の少なくとも１つは、本発明の第２の態様に従って、分散流体の試料における光学的または電気的測定を実施するためのマイクロ流体システムによって達成され、前記試料は粒子および流体を含み、前記システムは、
基体であって、前記基体内に形成されたマイクロ流体キャビティを有し、前記マイクロ流体キャビティが、前記試料を前記マイクロ流体キャビティ内に入れるための入口を有する、前記基体と、
前記マイクロ流体キャビティ内に音響定在波を発生させるための、前記基体に接続可能な超音波トランスデューサと、
前記超音波トランスデューサに接続可能であり、前記マイクロ流体キャビティの共振周波数より低い周波数と前記共振周波数より高い周波数との間で繰返し変動する周波数で前記超音波トランスデューサを駆動し、前記キャビティの少なくとも１つの第１領域に前記粒子を集合させ、それによって前記流体が前記キャビティの少なくとも１つの第２領域を占めるようにするように構成された駆動回路、
前記キャビティの前記少なくとも１つの第２領域のうちの少なくとも１つにおいて前記流体における光学的または電気的測定を実施するように配置された検出器と、
を含む。
本発明の第１の態様による方法について上述したように、超音波トランスデューサの周波数を変動させることによって、キャビティの少なくとも１つの第１領域での粒子のより安定した集合が達成される。
マイクロ流体システムは、試料を保存するための容器、試料をキャビティ内に入れるためのポンプまたは他の装置、必要に応じて基体を加熱または冷却するための温度制御装置、および光学的または電気的測定が実施された後に試料を受け取るためのレセプタクルをさらに含み得る。
上記のように、基体は、シリコン製、プラスチックなどのポリマー製、またはガラス製であり得る。
上記のように、マイクロ流体キャビティは、細長いことが好ましい。
超音波トランスデューサは、圧電アクチュエータであることが、好ましい。超音波トランスデューサは基体に接続され得る。音響定在波は、超音波トランスデューサ内の振動が基体に伝達されてキャビティの壁を振動させることによって発生する。
駆動回路は、超音波トランスデューサに電気的に接続された関数発生器を含み得る。駆動回路は、関数発生器を備えることによって、変動する周波数で超音波トランスデューサを駆動するように構成されている。上記のように、周波数はいくつかの方法で変動させ得る。
検出器は、一点のみで光学的または電気的測定を実施するように配置されていてもよい。検出器が光学的検出器である場合、検出器が、光源と、光源からの光を検出するための単一検出器またはセンサーとを含み得るか、あるいは、センサーが、光源からの光をキャビティに対して複数の空間位置で検出し得る。したがって、検出器またはセンサーは、複数の感光ダイオード、カメラ、ＣＣＤ、ＣＭＯＳなどを含み得る。光検出器は単一の光源または複数の光源を含み得、その各々は単一波長、有限数の波長で、または連続スペクトルとして光を放射し得る。光源は単一波長または有限数の波長で光を放射することが好ましい。電気検出器は、キャビティ内に設けられた電極を含み得る。
本発明の第２の態様によるシステムの好ましい実施形態では、前記システムは、
前記基体の少なくとも一部を収容するように配置されたレセプタクルを含むハウジングであって、
前記超音波トランスデューサが、前記ハウジング内に設けられおり、前記基体が前記レセプタクル内に収容されたときに前記基体に接続するように配置され、
前記検出器が、前記ハウジング内に設けられており、前記基体が前記レセプタクル内に収容されたときに前記基体に対して所定の位置に配置され、
前記所定の位置が、前記キャビティの前記少なくとも１つの第２領域の少なくとも１つにおいて検出器が前記光学的または電気的測定を実施できるように配置されている、前記ハウジング
をさらに含む。
これは、検出器が第２領域の少なくとも１つにおいて光学的または電気的測定を実施することができるように、キャビティを有する基体と検出器を有するハウジングとの相対位置を調整し得るため、単純な検出器の使用を提供することから、有利である。基体に対する１つ以上の第２領域の位置は、キャビティの寸法および基体上のキャビティの位置に基づいて、さらに、どの高調波、すなわちキャビティの第１、第２、第３などの共振周波数のうちのどれで音響定在波の周波数が変動するかに基づいて決定することができる。粒子の安定で再現可能な集合の達成が周波数の変動によって保証されるため、光学的または電気的測定に適した第２領域を予測し、それに応じて検出器を配置することができる。
ハウジングは、現場またはポイントオブケアの光学的または電気的測定用のハンドヘルドハウジングを含み得る。
レセプタクルは、ハウジングの内側またはハウジングの表面に設けられ得る。基体をハウジングに対して定位置に保持することができるように、基体の少なくとも一部はレセプタクル内に収容される必要がある。
超音波トランスデューサがキャビティ内に音響定在波を発生させることができるためには、超音波トランスデューサは基体に接続しなければならない。この接続は、物理的な接触によって確立され得る。
本発明の第２の態様によるシステムの好ましい実施形態では、システムは、超音波トランスデューサに取り付けられた、超音波トランスデューサを基体に接続するためのガラス結合部材をさらに含む。これは、超音波トランスデューサを基体から離して配置することを可能にし、それにより、第２領域へのアクセスを得るために光検出器を配置することをより容易にするため、有利である。
本発明の第２の態様によるシステムのいくつかの実施形態では、上述のように、キャビティは細長く、一端で入口に、他端で出口に流体接続されている。
本発明の第２の態様によるシステムのいくつかの実施形態では、検出器はさらに、少なくとも１つの第１領域内の粒子の体積と少なくとも１つの第２領域内の流体の体積との間の関係を決定するように配置される。
検出器は、以下でさらに説明されている本発明の第３および第４の態様に関して論じられているように配置されてもよい。あるいは、システムは、光学的または電気的測定のための第１検出器と、関係を決定するための第２検出器とを含み得る。
検出器は、少なくとも１つの第１領域の体積および少なくとも１つの第２領域の体積を測定するように構成されることによって、関係を決定するように構成されてもよい。
上記のように、全領域の体積を測定してもよく、あるいは関係を領域の面積から決定することができる。
本発明の他の利点および特徴は、他の従属請求項、および以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになる。
本発明の上記および他の特徴および利点のより完全な理解は、添付の図面と共に以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになる。
本発明の第１および第２の態様による方法およびシステムの第１の実施形態の上方からの概略図である。 音響定在波の周波数を変動させた場合と変動させない場合の赤血球の集合を示す写真である。 本発明の第１の態様による方法の第２の実施形態の上方からの概略図である。 本発明の第２の態様によるシステムの第１の実施形態の概略部分断面図である。 本発明の第４の態様によるシステムの第１の実施形態を使用して実施される本発明の第３の態様による方法の一実施形態の概略図である。 赤血球が占める面積対血漿が占める面積を求めるために使用されるマイクロ流体キャビティおよびそれに続くしきい値化技術の写真を示す。 音響充填細胞容積（Acoustically Packed Cell Volume）（ＡＰＣＶ）と充填細胞容積（Packed Cell Volume）（ＰＣＶ）との間の相関を示すグラフである。 赤血球が占める面積対血漿が占める面積との間の関係の時間発展を示す。 様々な時点で得られたＡＰＣＶとＰＣＶとの間の相関を示すグラフである。
図面および説明では、同じ特徴を指すために同じ符号が使用されている。符号に付けられた’は、そのような符号で示された特徴が、’なしの符号を有する特徴と類似の機能、構造または重要性を有するが、この特徴と同一ではないことを示す。
図１ＡおよびＢは、本発明の第１および第２の態様による方法およびシステムの第１の実施形態の上方からの概略図である。図１Ａは、入口１４、中央出口１６、ならびに２つの側方出口１８および２０を有するキャビティを画定するマイクロ流体チャネル１２をその中に形成したシリコン基体１０を示す。超音波トランスデューサ２２は基体１０の下面に取り付けられ、チャネルは基体１０の上面に接着されたガラスシート２４によって垂直方向に画定されている。超音波トランスデューサ２２は基体１０の側面に取り付けられてもよい。全血試料２は、入口１４を通ってチャネル１２に入り、すなわち、図１Ｂの工程１０００によって示されるように配置され、出口１６、１８、および２０に向かって流され、すなわち、図１Ｂの任意の工程１００６によって示されるように流れを生じさせる。超音波トランスデューサ２２は、チャネル１２の横方向共振周波数より低い周波数から共振周波数より高い周波数まで変動する周波数で作動する。これにより、試料に定在波を照射する図１Ｂの工程１００２に対応する２６で表される音響定在波が生じ、全血２中の、粒子を表す符号４でその１つが示されている赤血球を、音響定在波の圧力中央節に集合させ、それにより、赤血球４をチャネル１２の中央部分に相当する第１領域に集合させる。次いで、全血２が超音波トランスデューサ２２を通過すると、赤血球４を含む流れの中央部分は中央出口１６を通って出る一方、残りの血液、すなわち血漿６は、側方出口１８および２０を通って出る。そして、例えば、ヘモグロビンの濃度を求め、それによって溶解した赤血球４のパーセンテージ、すなわち全血試料中の溶血度を求めるために、光学的または電気的測定、特に吸光度測定を、図１Ｂの工程１００４によって示されるように、側方出口１８の付近で、円２８によって示される領域で実施することができるようになる。
図１を検討することから明らかになるように、側方出口１８を通って流れる血漿６が赤血球４から除去されることになる場合、非常に低濃度の赤血球でも吸光度測定を妨げるため、赤血球４をチャネル１２の中央部分に集合させる効率は特に重要である。したがって、基体１０およびチャネル１２が、広い公差で、または狭い公差を許容しないポリマー材料などの材料から製造されていることなどのため、超音波トランスデューサ２２がチャネル１２の共振周波数に対応しない単一の周波数で駆動される場合、赤血球４を中央出口１６に集合させる効率が低くなり、吸光度測定が妨げられることになる。これは異なる試料２が使用される場合にも当てはまり、チャネル１２内の共振周波数が、試料内の音速、ならびにチャネル１２の温度および長さなどの他の要因にも依存するためである。
図１では全血試料において吸光度測定を行っているが、他の分散流体を同様に処理して、粒子が他の領域に集合させられた後に粒子が占めない流体の領域で光学的または電気的測定を行い得る。
さらに、試料が全血である本発明の第１の態様による方法の特定の実施形態では、少なくとも１つの第１領域３２内の赤血球の体積（図２Ａ参照）と、図２Ａの少なくとも１つの第２領域３６、３８内の血漿の体積との間の関係は、工程１００８で明記されているように、少なくとも１つの第１領域３２の体積および少なくとも１つの第２領域３６、３８の体積を測定することによって決定され、その後、工程１０１０によって示されているように、ヘマトクリット値が決定され得る。
図２は、音響定在波の周波数を変動させた場合と変動させない場合の赤血球の集合を示す、様々な時間に撮影された写真である。したがって、図２Ａおよび図２Ｂは、単一周波数の定在波を使用するときのチャネルの同じ断面を示す。赤血球はチャネルの中央、すなわち第１領域３２に集合し、血漿はチャネルの中央に隣接する第２領域３６および３８を占める。第一に、第１領域３２は均一な断面ではなく、むしろこの領域の幅はチャネルに沿って変動することに留意すべきである。第二に、図２Ａと図２Ｂとを比較すると分かるように、約５秒後にとられた図２Ｂでは、第１領域３２の広がった部分が左に移動しているため、第１領域は経時的に均一ではない。第１領域３２内の赤血球が選択された領域を不明瞭にする恐れがあるため、光学的測定を実施することが常に可能となる第２領域３６および３８の領域を選択することが困難であろうことが明らかである。
図２Ｃおよび図２Ｄはチャネルの同じ断面を示すが、今度は、チャネルの幅寸法の定在波の共振周波数より低い周波数とこの周波数より高い周波数との間で、周波数が変動、すなわち掃引される。図２Ｃおよび図２Ｄを比較すると分かるように、第１領域は空間的にも、すなわちチャネルに沿って、時間的にも均一である（写真は約０．８秒間隔で撮影されている）。したがって、この場合、破線の円２８’によって示されるように、第２領域の面積を選択することができる。
したがって、音響定在波の周波数を変動させることにより、空間的にも時間的にも、より均一な赤血球の集合が生じ、それにより赤血球／粒子を含まない少なくとも１つの第２領域が確実に形成され、それにより、遊離ヘモグロビンの量または濃度の吸光度または透過率測定などの光学的または電気的測定を行うことができる。
周波数は、例えば１８５０ｋＨｚ～２０５０ｋＨｚの間で掃引されてもよい。透過光を測定して、４２０ｎｍで遊離ヘモグロビンを測定してもよい。
図３は、本発明の第１の態様による方法の第２の実施形態の上方からの概略図である。図３は、その中に幅２ｍｍ、高さ２００μｍのチャネル１２’が形成された細長いガラス基体１０’を示す。チャネル１２’への入口１４’が基体１０’の一端に設けられ、反対側の出口１６’が他端に設けられている。したがって、基体１０’はガラスキャピラリーに似ている。超音波トランスデューサ２２’はガラスシート３０を介して基体１０’に接続され、当該ガラスシートは超音波トランスデューサ２２’から基体１０’へ音響エネルギーを伝達するための結合部材として働く。ガラスシート３０を使用すると、超音波トランスデューサがもはやチャネルの下の基体に取り付けられていないため、チャネル１２’で吸光度測定を実施することがより容易になる。図３において、トランスデューサ２２’は、チャネル１２’の最低共振周波数の高倍数付近で変動する周波数で駆動され、２６’で示される音響定在波を発生させ、当該音響定在波は２つの圧力節を有する。したがって、全血の試料２がチャネル１２’に導入されると、赤血球は、少なくとも音響定在波２６’の近傍で、各圧力節に対して１つずつの第１領域３２’および３４’の２つのバンドに集合し、残りの３つの第２領域３６’、３８’および４０’を占める血漿６、すなわち流体から離れる。したがって、これらの第２領域のうちの１つにおいて光学的または電気的測定を実施することが可能である。
図４は、本発明の第２の態様によるシステムの第１の実施形態の概略部分断面図である。図４Ａは、一方において、入口１４’’および出口１６’’を有するチャネル１２’’を有する基体１０’’と、他方において、基体１０’’の少なくとも一部を収容するためのレセプタクルまたは開口部５２ならびに基体１０’’を位置決めするための当接部５４、５６、５８、および６０を有するハウジング５０とを含むシステムを示す。ハウジング５０は、基体がレセプタクル５２内に収容されたときに超音波エネルギーを基体１０’’に伝達するための結合部材として作用するガラスシート３０’を有する超音波トランスデューサ２２’’をさらに収容する。光源６２は、レセプタクル５２および当接部５４、５６、５８、６０に対して所定の位置でガラスシート３０’の下に配置されており、センサー６４は上方に配置されており（図３Ｂを参照）、光源６２からの光を基体１０’’、光源６２および検出器を表すセンサー６４を介して受ける。バッテリーなどの電源６６、ならびに超音波トランスデューサ２２’用の制御回路６８および駆動回路７０も、ハウジング５０内に収容されている。
使用時には、分散流体の試料、例えば血液を、第１の入口１４’’を通してチャネル１２’’に流れ込ませる。次に、基体１０’’をレセプタクル５２に挿入し、それによって当接部５４、５６、５８および６０が基体１０’’に接触して基体１０’’を所定の位置に位置決めする。次に、制御回路６８は駆動回路７０を制御して超音波トランスデューサ２２’’を通電させる。この位置において、基体１０’’はガラスシート３０’と接触しているため、超音波エネルギーが基体１０’’内に伝達され、分散流体中の粒子、この場合は赤血球をチャネル１２’’の少なくとも１つの第１領域に集合させることができる。基体に対するチャネル１２’’の位置および寸法、ならびに光源６２およびセンサー６４の位置は、赤血球を含まない第２領域が常に形成されて吸光度測定を実施することができるように配置されている。これは、駆動回路７０がチャネルの共振周波数付近で変動する周波数で超音波トランスデューサ２２’’を駆動するように構成されているためであり、したがって、基体１０’’の製造に起因してチャネル１２’’の幅にばらつきがあり得る場合でも、赤血球４は、吸光度測定のための赤血球を含まない第２領域を離れて適切に集合する。制御回路６８は、センサー６４から吸光度測定の結果を受け取り、直接、または既知の溶血度を有する試料の測定から導き出されたルックアップテーブルもしくは関数を使用して、吸光度測定の結果（結果は透過値の形式である）を溶血度の値に変換した後に、結果または溶血レベルをハウジングに設けられたディスプレイ（図示せず）に表示し得るか、または後で検索するために、結果もしくは溶血レベルを制御回路６８内に保存し得る。
本発明の第３および第４の態様
上記の説明および開示から示されるように、マイクロ流体キャビティ内の音響定在波の周波数を変動させることは有利である。本発明者らは、これらの利点を他の測定にも活かし得ることを見出した。
したがって、本発明の第３および第４の対応する態様は、全血中のヘマトクリット値を決定するための方法およびシステムに関する。
ヘマトクリット（ＨＣＴ）は血液中の赤血球の体積分率であり、患者の血液状態の重要な指標である。ＨＣＴの測定は、貧血、赤血球増加症、脱水症および出血による失血などのいくつかの疾患および状態の診断に有用である。従来、マイクロヘマトクリット法がＨＣＴを測定するために使用されてきた。この方法では、血液充填キャピラリーを遠心分離し、充填細胞容積（ＰＣＶ）としても知られている充填細胞分画の相対的な高さを測定する。マイクロヘマトクリット法は、ほとんどの近代的な病院で（多くの場合、中央実験施設で）、電気インピーダンス測定（コールター原理）に基づく機器である全血分析装置に置き換えられている。しかしながら、マイクロヘマトクリット法は、低コストおよび簡単な読み出しのために、小規模の病院および診療所ではまだ採用されている。
マイクロフルイディクスはＨＣＴ測定に推奨されているが、正確度は２．６％ＨＣＴ以下で、サンプリングから回答の時間が５分であるため、ＨＣＴのより高速でより正確な測定が依然として必要とされている。
したがって、全血中のヘマトクリット値を測定するための高速かつ／またはより正確な方法およびシステムを提供することが、本発明のさらなる目的である。
自動化することができ、かつ／またはさらなる化学物質を必要としない、全血中のヘマトクリット値の測定方法およびシステムを提供することが、本発明のさらなる他の目的である。
これらの目的の少なくとも１つ、または以下の説明から明らかになるさらなる目的の少なくとも１つは、本発明の対応する第３および第４の態様に従い、血液試料のヘマトクリット値を測定する方法であって、前記血液試料が少なくとも赤血球および少なくとも血漿を含み、
ａ）共振周波数を有するマイクロ流体キャビティ内に前記血液試料を配置する工程と、
ｂ）前記キャビティ内で、前記キャビティの少なくとも１つの第１領域に前記赤血球を集合させ、それによって前記血漿が前記キャビティの少なくとも１つの第２領域を占めるようにするように構成された音響定在波を前記血液試料に照射する工程であって、前記音響定在波の周波数を、前記共振周波数より低い周波数と前記共振周波数より高い周波数との間で変動させる工程と、
ｃ）前記少なくとも１つの第１領域内の前記赤血球の体積と前記少なくとも１つの第２領域内の前記血漿の体積との間の関係を決定する工程と、
ｄ）前記関係に基づいて前記血液試料の前記ヘマトクリット値を決定する工程、
を含む、前記方法と、
血液試料のヘマトクリット値を決定するためのマイクロ流体システムであって、前記血液試料が、少なくとも赤血球および少なくとも血漿を含み、
基体であって、前記基体内に形成されたマイクロ流体キャビティを有し、前記マイクロ流体キャビティが、前記血液試料を前記マイクロ流体キャビティ内に入れるための入口を有する、前記基体と、
前記マイクロ流体キャビティ内に音響定在波を発生させるための、前記基体に接続された超音波トランスデューサと、
前記超音波トランスデューサに作動可能に接続され、前記マイクロ流体キャビティの共振周波数より低い周波数と前記共振周波数より高い周波数との間で変動する周波数で前記超音波トランスデューサを駆動し、前記キャビティの少なくとも１つの第１領域に前記赤血球を集合させ、それによって前記血漿が前記キャビティの少なくとも１つの第２領域を占めるようにするように構成された駆動回路と、
前記少なくとも１つの第１領域内の前記赤血球の体積と前記少なくとも１つの第２領域内の前記血漿の体積との間の関係を決定するように配置または構成された検出器と、
前記関係に基づいて血液試料の前記ヘマトクリット値を決定するためのコンピュータと
を含む、前記システムとによって達成される。
血液試料は、希釈または未希釈の全血試料であり得る。
血液試料は、ポンピングによって、圧力によって、吸引によって、電界の作用によって、重力によって、および毛管作用によって、キャビティ内に配置され得る。
マイクロ流体キャビティは環境に対して閉じられていてもよい。マイクロ流体キャビティは、好ましくは、正方形または長方形の断面を有するチャネルである。マイクロ流体キャビティは、例えば、断面高さの１～２０倍の断面幅を有し得る。この場合、マイクロ流体キャビティの長さは少なくとも幅と同じである。幅は、例えば、０．３ｍｍ～５ｍｍであり得る。高さは、例えば、０．０２５ｍｍ～１ｍｍであり得る。
マイクロ流体キャビティの共振周波数は、定在波が周波数に反比例する波の波長λを形成するためには、ｎλ／２でなければならないため、寸法に依存し、ここでｎは正の整数である。
以下は、キャビティの幅寸法に沿った定在波の第１の３つの共振である：
第１共振周波数ｆは、第１高調波ｗに対応する音響定在波λ／２に対応し、ここで定在波の圧力腹はキャビティの壁の近くに位置し、単一の圧力節がキャビティの中央に形成され、これにより粒子をキャビティの中央に集合させ、これが第１領域となり、キャビティの側壁付近の領域が第２領域となる。したがって、壁１－流体１－粒子１－流体２－壁２を得る。
第２高調波では、第１共振周波数の２倍の共振周波数、すなわち２ｆに対応して、２つの節と３つの腹とを有する定在波λが形成され、これにより全体として粒子をキャビティの中央の両側の２つのバンドに集合させ、これが第１領域となり、キャビティの中央および側面が第２領域となる。したがって、壁１－流体１－粒子１－流体２－粒子２－流体３－壁２を得る。これが好ましい共振周波数である。
第３高調波に対応する第３の共振周波数は、第１共振周波数の３倍、すなわち３ｆであり、３つの節と４つの腹を有する定在波３λ／２と対応し、これにより粒子をキャビティ内の３つの位置に集合させ、これらの３つは第１領域となり、これらの位置は互いにおよびキャビティの壁から離間して３つの第２領域を形成する。したがって、壁１－流体１－粒子１－流体２－粒子２－流体３－粒子３－流体４－壁２を得る。
したがって、共振周波数という用語は、キャビティ内に定在波が形成され得る任意の周波数を含むものと理解され、定在波の形成を引き起こす周波数は、粒子を少なくとも１つの第１領域に集合させるように構成された周波数と見なされる。さらに、たとえ共振、ひいては定在波が主に幅寸法にあったとしても、キャビティの長さ寸法に沿って共振の成分が常に存在し、高さ寸法にも存在する可能性があることを述べておかなければならない。これらの三次元共振は一次元共振周波数に近いいくつかの共振周波数をもたらし、各々は対応する集束パターンを有する。これらの共振周波数のうちのいくつかにわたって作動周波数を掃引することは、それらの全てを利用し、結果として得られる別個の共振についての音場の加重平均と、そのようにして合成された集束パターンにより生じる、より予測可能で均一な音響集束を作り出すことを可能にする。
したがって、音響共振が一次元に単純化されるだけではなく三次元で理解される必要があるという理解は、予測可能、再現可能、かつロバストな音響集束パターンを生じさせることによって、実用上重要な効果を生み出す。その結果、単一周波数作動では不可能である、システム内の予測可能で再現可能な位置での検出が可能になる。
したがって、キャビティの共振周波数、ひいては音響定在波の周波数は、０．１５Ｍｈｚ～１０ＭＨｚであり得る。
周波数を共振周波数より２０％低い周波数から共振周波数より２０％高い周波数まで変動させ得る。周波数を共振周波数より１０％低い周波数から共振周波数より１０％高い周波数まで変動させることが好ましい。周波数は、連続的に、あるいは試料／分散流体に音響定在波を照射している間のある時間中にのみ変動させ得る。周波数を直線的、または対数関数的に変動させ得る。
共振周波数で得られる数とは異なる数の節および腹をもたらすことになるキャビティの異なる共振周波数に周波数が相当するほど低い周波数から、または高い周波数まで変動させてはならない。
言い換えれば、本発明の態様に従って周波数ｆＤＮを変動させる場合、ｆＤＮに対応する音響定在波のＮ半波長に対応するある次元Ｄを有するキャビティの少なくとも１つの第１領域に粒子を集合させるために、周波数ｆＤＮは、常に（ｃ＊（Ｎ－１））／（２＊Ｄ）より高く、（ｃ＊（Ｎ＋１））／（２Ｄ）より低い必要があり、ここで、ｃは流体における音速である。
実際には、ｆＤＮの１％～４０％の掃引範囲、すなわち、ｆＤＮの±０．５～２０％の範囲にわたって変動させる周波数は、特定の数の圧力節に対応する共振周波数ならびにチャネルの製造公差および試料音速の変動をカバーするのに充分である。
超音波トランスデューサ用の作動信号は、好ましくは、１０００Ｈｚの繰返し率、および約１５Ｖｐｐ（電圧ピーク－ピーク）の振幅を有する線形チャープ正弦波であり得る。
言い換えれば、超音波トランスデューサ用の作動信号は、例えば、掃引時間が１ｍｓの線形チャープ正弦波であり得る。信号の振幅は１５Ｖｐｐ（電圧ピーク－ピーク）であり得る。
掃引時間は、集合が起こる時間枠よりはるかに短い必要がある。したがって、掃引時間が集合が起こる時間枠よりもはるかに短くなるように、繰返し率は充分に高い必要がある。一例として、５秒の時間枠にわたって粒子がキャビティ内に集合させられる場合、掃引の繰返し率を、周波数が１００回以上サイクルするように設定することができ、すなわち、５０ｍｓ以下の掃引時間に対応して毎秒２０回以上の繰返しを設定することができる。したがって、掃引時間は、例えば、１００ｎｓ～５０ｍｓ、例えば１～５０ｍｓであり得る。
掃引時間が遅すぎると、測定時間中、すなわち試料に音響定在波を照射する時間中に、第１および第２領域の形状が変化する。
関係は、例えば、赤血球の体積または面積の比率またはパーセンテージであり得る。
関係は、例えば、カメラまたは感光センサーアレイなどの検出器を使用して決定され得る。光源は、カメラまたは感光アレイから見てキャビティの反対側に設けられてもよい。関係は、キャビティの少なくとも一部の画像をしきい値処理し、しきい値を下回る値を有する画素数対全画素数の計数を割り当てることによって決定され得る。
少なくとも１つの第１領域内の赤血球の体積および少なくとも１つの第２領域内の血漿の体積は、関係の決定が実施されるキャビティが一定の寸法である限り、計算する必要はない。
したがって、体積の関係は、少なくとも１つの第１領域の面積および少なくとも１つの第２領域の面積を測定することによって決定され得、面積は、キャビティの２つの直交次元（ＸＹ）からなる平面において求められるが、ただし、領域がキャビティの第３の次元（Ｚ）で同じ広がりを有すること、または測定がＺ方向の深さの変動に対して調整されていることを条件とする。
関係を決定するために、全第１領域の合計体積および全第２領域の合計体積を測定し得る。
ヘマトクリット値は、既知のヘマトクリット値の試料について当該方法を使用し、これらの試料についての関係を決定してヘマトクリット値と関係との間の相関を作成することによって、関係から求められ得る。
コンピュータは、好ましくは、最初に駆動回路を作動させ、次いで検出器を作動させるようにさらに配置およびプログラムされている。
本発明の第３および第４の態様による方法およびシステムは、細胞内液、間質液、滑液、腹腔液、尿、酵母細胞培養物、骨髄および支質などの他の分散流体中の粒子の体積分率を決定するためにも使用され得る。
本発明の第３の態様による方法の好ましい実施形態では、少なくとも１つの第１領域内の赤血球の体積と少なくとも１つの第２領域内の血漿の体積との間の関係を決定する工程を実施する前に、２０秒以下、例えば５秒または２秒の間、血液試料に音響定在波を照射する。
それに対応して、検出器および／またはコンピュータは、血液試料に２０秒以下、例えば５秒または２秒の間音響定在波を照射した後に、少なくとも１つの第１領域における赤血球の体積と少なくとも１つの第２領域における血漿の体積との間の関係を決定するように配置または構成され得る。
検出器は、これらの時間に読み取り値もしくは画像を取得するように構成されることによって、またはこれらの時間にコンピュータに画像もしくは読み取り値を提供することによって、関係を決定するように構成され得る。
検出器は、これらの時間に検出器から画像または読み取り値を取得するようにプログラムまたは構成され、関係を決定するように構成され得る。
さらに、駆動回路は、これらの時間中に音響定在波を提供するように構成され得る。
本発明の対応する第３および第４の態様による方法およびシステムの好ましい実施形態では、キャビティを基体内に形成する。基体はシリコン製でもよいが、プラスチックなどのポリマー材料製、あるいはガラス製でもよい。セラミックおよび金属などの他の材料も可能である。これらの材料は安価であり、そのため使い捨て消耗品としてポイントオブケア設定で現場において光学的または電気的測定を実施するのに適している。
ここで、本発明の第３および第４の態様による方法およびシステムを、図５～９を参照してさらに説明する。
図５ＡおよびＢは、本発明の第４の態様によるシステムの第１の実施形態を使用して実施される本発明の第３の態様による方法の一実施形態の概略図である。したがって、図５Ａは、入口１１４および出口１１６を有するチャネル１１２を有するガラス基体１１０を含むシステム１００を示す。超音波トランスデューサ１２２は、図５Ｂの工程１０２２で示されるように試料に定在波を照射するために、例えば基体１１０への接着によって、基体１１０に接続されている。光源１６２はチャネル１１２の下に配置されており、カメラ１６４は、、例えば、図５Ｂの工程１０２４によって示されるように少なくとも１つの第１領域の体積および少なくとも１つの第２領域の体積を測定することによって、少なくとも１つの第１領域の赤血球の体積と少なくとも１つの第２領域の血漿の体積との間の関係を決定するために、輪郭１７２に従ってチャネル１１２の透過画像を取得することができるように配置されており、図５Ｂの工程１０２６によって示されるように、この関係に基づいてヘマトクリット値を求めるために、コンピュータ１６８に接続されている。コンピュータ１６８はさらに、チャネル１１２の幅寸法の共振周波数より低い周波数からこの共振周波数より高い周波数まで変動する周波数で超音波トランスデューサを作動させるように構成されている関数発生器１７０を制御するように接続されている。血液試料１０２は、シリンジ１７６によって吸引され、チャネル１１２を通る、すなわち、図５Ｂの工程１０２０によって示されるようにキャビティに配置され、２つの三方弁１７８および１８０は、血液試料をチャネル１１２を通して送るために、または代替的に洗浄溶液をチャネル１１２を通して試料の間に送るために設けられている。バイパスチャネル１８２も弁１７８と１８０との間に設けられている。
システム１００を評価するために、以下の実験仕様を使用した：
マイクロ流体チャネル１１２は、Micronit Microfluidics（オランダのエンスヘーデ）が製造し、フォトリソグラフィーおよび等方性ウェットエッチングを使用してホウケイ酸ガラス基体１１０内に製作した。マイクロ流体チャネルは、幅４００μｍ、深さ１５０μｍであった。チャネルの端部に穴をサンドブラストすることによって流体アクセスが可能になり、シリコーン接着剤（Elastosil A07， Wacker Elastics）を使用してシリコーンチューブを穴の上に取り付け、流体ポート１１４、１１６を設けた。超音波トランスデューサ１２２は、シアノアクリレート接着剤（Loctite）を使用してチップ／基体１１０に接着された圧電セラミックトランスデューサ（Ｆerroperm AS，デンマーク）であった。
全ての参加者からのインフォームドコンセントの後、血液試料１０２を健康なドナーから得た。標準系列を得るために、自己由来の血漿または血球のいずれかをドナー試料に添加することによって様々なＨＣＴレベルを得た。実験的には、１人の健康なドナーからの全血を２つの部分に分けた。一方の部分を遠心分離（１０分間２０００×ｇ）して分離した血漿および血球を生じさせ、次にそれらを遠心分離していないドナー血液と所定量混合して、試料を得、ヘマトクリットレベルを試験に用いた。
製造元のプロトコルに従って、ヘマトクリット遠心分離機（Hematokrit 210，Hettich GMBH，ドイツ）を使用して、全ての試料の参照測定を行った。血液で満たされたキャピラリーを１３０ｋｒｐｍで２分間遠心分離し、ＰＣＶ値を１パーセントポイント（ｐ．ｐ）刻みでスケールバーから手動で読み取り、最も近い整数値に丸め、＋－０．５ｐ．ｐの丸め誤差を得た。各試料を３回測定し、方法の精度は丸め誤差内であった。
シリンジポンプ１７６（NeMESYS，Cetoni GMBH，ドイツ）を使用して、２００μＬの試料を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブからマイクロ流体チャネル１１２に吸引した。２つの二位置三方弁１７８、１８０（NeMESYS）を用いて入口と出口を短絡させることによって流れを止めた。
圧電セラミックトランスデューサ１２２を、関数発生器１７０（Tectronix AFG3022B）によって発生させた増幅信号（AR 75A250，Amplifier Research，米国ペンシルベニア州サウダートン）によって作動させた。作動信号は、１ミリ秒のデューティサイクル、および約１５Ｖのピークトゥピーク振幅を有する１．８～２．１ＭＨｚの範囲の線形チャープ正弦波であった。自社開発LabVIEWソフトウェアが、関数発生器を制御した。
マイクロ流体チャネル１１２を、８ビットグレースケールＣＣＤカメラ１６４（EoSens mini MC - 1370，Mikrotron GmbH，Unterschleisheim，ドイツ）を備える顕微鏡（DM2500 M，Leica Microsystems CMS GmbH，ドイツ）を用いてイメージングした。白色ＬＥＤアレイを光源１６２として使用し、透過イメージングのためにチップ／基体１１０の下に配置した。マイクロ流体チャネル１１２の約３．５ｍｍ×０．６ｍｍのセグメントをイメージングした。２０Ｈｚでの画像取得は、超音波作動の起動時にハードウェアトリガした。
音響充填細胞容積ＡＰＣＶを、MatLabに実装された基本的な画像解析アルゴリズムを使用して、取得された画像から測定した。手短に言えば、赤血球は、透過モード顕微鏡法で強く吸収し、画像で暗い画素として表される。血漿は透明で、明るい画素として表される。画像を、ユーザが最初に設定した境界を使用してチャネル壁に沿ってトリミングし、最大画素値の３０％のしきい値レベルを使用するしきい値処理によって１ビット２進数に変換した。このしきい値は、ユーザが未処理画像において血液－血漿境界として認識したものと同様の結果を生じるため、このしきい値を最初に選択した。画像を反転させ、ＡＰＣＶ値を、画像内の全画素数（画像サイズ）で割った明るい画素数（二値画像の合計）として計算した。
図６は、赤血球が占める面積対血漿が占める面積を求めるためのマイクロ流体キャビティ技術およびそれに続くしきい値化技術の写真を示す。したがって、図６のパネルＡは、血液試料に音響定在波を照射する前の全血で満たされたマイクロ流体チャネルを示し、破線はチャネルの壁を示している。パネルＢは、２０秒間の超音波作動後に全血（４０％ＰＣＶ）がチャネルの中央に集合していることを示す。音響定在波は砂時計の形状の破線で示されている。パネルＣは、ＡＰＣＶ測定に使用された反転しきい値画像を示す。
実験を実施して図６の写真を取得すると、超音波トランスデューサ１２２の作動のために線形周波数掃引を使用する効果は明らかに顕著であった。第一に、当該効果は、チャネル長方向を向く共振を平均化し、音響場がチャネルに沿って不変になるという音響「ホットスポット」の存在を減少させた。第二に、チャープ信号は、作動周波数の試料固有の調整を不要にした。血中の音速はヘマトクリットレベルに依存するため、オペレータは本来なら、要求される１／２λ条件に合うように作動周波数を調整しなければならないであろう。
図７は、音響充填細胞容積（ＡＰＣＶ）と充填細胞容積（ＰＣＶ）との間の相関を示すグラフである。このグラフは、測定方法の線形性を試験するために得られたものである。様々なヘマトクリットレベルを有する血液試料の希釈標準系列を調製した。標準系列は、２．５パーセントポイント（ｐ．ｐ）刻みで、２０％～６０％の範囲のＨＣＴを有する合計１７個の血液試料を含んでいた。各試料のＨＣＴを、本発明の第３の態様による方法で３回測定し、対照として遠心分離で３回測定した。遠心分離測定は１ｐ．ｐの分解能を有していた。
標準系列の試料のＡＰＣＶ値を、２０秒の音響作動後に測定し、ＰＣＶ値に対して線形相関を示した。線形回帰（ｙ＝０．９８６ｘ＋４．１２）は０．９８７のＲ２値をもたらす。残差については、ＳＩ．２を参照されたい。試料ローディング、細胞の音響充填、画像分析およびチャネルの洗浄を含む単一試料の測定プロセス全体は、６０秒未満で実行できた。
図８は、赤血球が占める面積対血漿が占める面積との間の関係の時間発展を示す。これにより、２０秒の音響作動後に光学的読み出しを行い、得られた信号が定常状態に達したことを確認することが好ましいが、約５秒後に測定値はプラトーに達したことが分かった。さらに、高いＰＣＶを有する血液では定常状態に達するまでの時間が増加したことを観察した。パネルＡを参照されたい。パネルＢ～Ｅは、様々な時点でのチャネルの写真を示す。
方法およびシステムの正確度を評価するためにさらなる試験を行った。そのため、１人の男性（Ｙ１）および４人の女性（Ｘ１～４）の健康なドナーからの血液試料のＡＰＣＶ値を測定した。比較のために、標準系列から得られたＡＰＣＶ値とＰＣＶ値との間の線形関係を使用して（図７参照）、ＰＣＶＥとして表されるＡＰＣＶ値のＰＣＶ換算値を計算し、以下の表に結果を示す：
Figure 0006998387000001
各試料を３回測定した（ｎ＝３）。各試料の測定誤差（平均ＰＣＶＥ－平均ＰＣＶとして計算）は、試料Ｘ３を除く全ての試料について＜１ｐ．ｐであり、ここで本発明者らの方法は平均して試料のＰＣＶを２．２４ｐ．ｐ低く見積もった。３回の測定の標準偏差は全ての試料について１ｐ．ｐ未満であった。システムの正確度の指標として、平均絶対誤差は１．１３ｐ．ｐであると計算され、平均誤差は０．９５ｐ．ｐであった。
図９は、様々な時点で得られたＡＰＣＶとＰＣＶとの間の相関を示すグラフである。したがって、このグラフは、ＰＣＶ換算値の正確な予測を、２秒の音響作動の後に既に実施することができることを示す。図７の２０秒のＡＰＣＶ標準系列ＡＰＣＶとの比較として、ＡＰＣＶ値を２秒および５秒の音響作動後にも得、ＰＣＶとの線形相関を示した。図９を参照されたい。以下の表は、ＡＰＣＶ読み出しの３つの時点についての線形パラメーターを示す：
Figure 0006998387000002
３つ全てのＡＰＣＶ時点は、正確なＨＣＴ推定を可能にする線形性を示した。しかしながら、音響集束の非常に初期の段階でのＡＰＣＶの推定は、測定手順をシステムの変動、すなわち音響エネルギーのばらつき、およびデータ収集のタイミングに対してより敏感にする。集束の初期の段階でデータを収集することによって、経時的ＡＰＣＶ曲線の時間微分値が大きくなり、そのため音響エネルギーまたはタイミングのいずれかにおける変動は、細胞が高充填された微分値が低い領域よりも大きな影響を読み出しに及ぼす。５つの臨床試料についてＡＰＣＶを２秒および５秒の時点で推定すると、約１％の誤差範囲内であるが、わずかに高いＰＣＶＥが得られる。以下の表を参照されたい。
Figure 0006998387000003
本発明の実施可能な変更
本発明は、上記の、および図面に示した実施形態のみに限定されるものではなく、これらは主に図示および例示的な目的を有する。本特許出願は、本明細書に記載の好ましい実施形態の全ての修正および変形を包含することが意図されており、したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の記載およびその均等物によって定義される。したがって、装置は、添付の特許請求の範囲内であらゆる種類の方法で変更され得る。
例えば、本発明の第１の態様による方法の実施形態の構造的態様は、本発明の第２の態様によるシステムの実施形態に適用可能であると見なされるべきであり、逆に、本発明の第２の態様によるシステムの実施形態の方法的態様は、本発明の第１の態様による方法の実施形態に適用可能であると見なされるべきであることを指摘しなければならない。
また、上、下、上位、下位などの用語についての／関する全ての情報は、図面に従って装置を方向付け、符号を正しく読むことができるように図面を方向付けて解釈／読解されるべきであることを指摘しなければならない。したがって、当該用語は、示された実施形態における相互関係を単に示すものであり、本発明の装置が別の構造／デザインを備える場合には、その関係は変更されてもよい。
したがって、特定の実施形態からの特徴が別の実施形態からの特徴と組み合わされ得ることが明確に述べられていなくても、その組み合わせが可能であるならば、その組み合わせは自明であるとみなされるべきであることも指摘しなければならない。
本明細書および本明細書に続く特許請求の範囲を通して、文脈上別段の解釈を必要としない限り、用語「含む（comprise）」、および「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」などの変形は、述べられた整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の包含を暗示するが、任意の他の整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の排除を暗示するものではないと理解される。

Claims (21)

  1. 分散流体の試料（２）における光学的または電気的測定を実施する方法であって、前記試料が粒子（４）および流体（６）を含み、
    ａ）共振周波数を有するマイクロ流体キャビティ（１２）内に前記試料（２）を配置する工程（１０００）と、
    ｂ）前記キャビティ内（１２）で、前記キャビティ（１２）の少なくとも１つの第１領域（３２）に前記粒子（４）を集合させ、それによって前記流体（６）が前記キャビティ（１２）の少なくとも１つの第２領域（３６，３８）を占めるようにするように構成された音響定在波を生じさせる超音波を前記試料（２）に照射する工程であって、前記キャビティ（１２）内に前記音響定在波が形成される一の前記共振周波数より低い周波数と一の前記共振周波数より高い周波数との間で前記超音波の周波数を繰り返し変動させる工程（１００２）と、
    ｃ）前記キャビティの前記少なくとも１つの第２領域のうちの少なくとも１つにおいて、前記流体における光学的または電気的測定を実施する工程（１００４）と、
    を含む、前記方法。
  2. 前記音響定在波が、前記キャビティ（１２）の１つまたは２つの第１領域（３２’，３４’）に前記粒子（４）を集合させるように構成されている、請求項１に記載の方法。
  3. ｄ）前記キャビティ（１２）を通る前記試料（２）の流れを発生させる工程（１００６）
    をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記キャビティ（１２）が細長く、一端で入口（１４）に、他端で出口（１６）に流体接続されている、請求項３に記載の方法。
  5. 前記キャビティ（１２）が基体（１０）内に形成される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記音響定在波を生じさせるための超音波エネルギーが、少なくとも１つの超音波トランスデューサ（２２’）から前記基体（１０）に、前記超音波トランスデューサおよび前記基体に接続されたガラス結合部材（３０）のみを介して伝達される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記試料（２）が血液試料であり、そのため前記粒子が少なくとも赤血球（４）を含み、前記流体が少なくとも血漿（６）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記光学的または電気的測定が、前記血漿（６）中の遊離ヘモグロビンの量または濃度を測定することを含む吸光度測定である、請求項７に記載の方法。
  9. ｄ）前記少なくとも１つの第１領域（３２）内の前記赤血球（４）の体積と前記少なくとも１つの第２領域（３６、３８）内の前記血漿（６）の体積との間の関係を、前記少なくとも１つの第１領域（３２）の体積および前記少なくとも１つの第２領域（３６、３８）の体積を測定することによって決定する工程（１００８）と、
    ｅ）前記関係に基づいて前記血液試料のヘマトクリット値を決定する工程（１０１０）と、
    をさらに含む、請求項７または８に記載の方法：
  10. 分散流体の試料（２）における光学的または電気的測定を実施するためのマイクロ流体システムであって、前記試料が粒子（４）および流体（６）を含み、
    基体（１０）であって、前記基体内に形成されたマイクロ流体キャビティ（１２）を有し、前記マイクロ流体キャビティが、前記試料を前記マイクロ流体キャビティ内に入れるための入口（１４）を有する、前記基体と、
    前記マイクロ流体キャビティ内に音響定在波を生じさせる超音波を発生させるための、前記基体に接続された超音波トランスデューサ（２２’）と、
    前記超音波トランスデューサ（２２’’）に作動可能に接続され、前記マイクロ流体キャビティ内に前記音響定在波が形成される一の共振周波数より低い周波数と一の前記共振周波数より高い周波数との間で繰り返し変動する前記超音波の周波数で前記超音波トランスデューサを駆動し、前記キャビティの少なくとも１つの第１領域（３２）に前記粒子を集合させ、それによって前記流体が前記キャビティの少なくとも１つの第２領域（３６、３８）を占めるようにするように構成された駆動回路（７０）、
    前記キャビティの前記少なくとも１つの第２領域のうちの少なくとも１つにおいて前記流体における光学的または電気的測定を実施するように配置された検出器（６４）と、
    を含む、前記システム。
  11. 前記基体（１０’’）の少なくとも一部を収容するように配置されたレセプタクル（５２）を含むハウジング（５０）であって、
    前記超音波トランスデューサ（２２’’）が、前記ハウジング内に設けられおり、前記基体が前記レセプタクル内に収容されたときに前記基体に接続するように配置され、
    前記検出器（６４）が、前記ハウジング内に設けられており、前記基体が前記レセプタクル内に収容されたときに前記基体に対して所定の位置に配置され、
    前記所定の位置が、前記キャビティ（１２’’）の前記少なくとも１つの第２領域（３６、３８）の少なくとも１つにおいて検出器が前記光学的または電気的測定を実施できるように配置されている、前記ハウジング、
    をさらに含む、請求項１０に記載のマイクロ流体システム。
  12. 前記超音波トランスデューサ（２２’’）に取り付けられた、前記超音波トランスデューサを前記基体（１０’’）に接続するためのガラス結合部材（３０’）をさらに含む、請求項１０～１１のいずれか一項に記載のシステム。
  13. 前記検出器が、前記少なくとも１つの第１領域（３２）の体積および前記少なくとも１つの第２領域（３６、３８）の体積を測定するように構成されることによって、前記少なくとも１つの第１領域（３２、３４）内の前記粒子（４）の体積と、前記少なくとも１つの第２領域（３６、３８）内の前記流体（６）の体積との間の関係を決定するようにさらに配置されている、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のシステム。
  14. 血液試料（２）のヘマトクリット値を測定する方法であって、前記血液試料が少なくとも赤血球（４）および少なくとも血漿（６）を含み、
    ａ）共振周波数を有するマイクロ流体キャビティ（１０）内に前記血液試料を配置する工程（１０２０）と、
    ｂ）前記キャビティ内で、前記キャビティの少なくとも１つの第１領域（３２）に前記赤血球を集合させ、それによって前記血漿が前記キャビティの少なくとも１つの第２領域（３６，３８）を占めるようにするように構成された音響定在波を生じさせる超音波を前記血液試料に照射する工程であって、前記キャビティ内に前記音響定在波が形成される一の前記共振周波数より低い周波数と一の前記共振周波数より高い周波数との間で前記超音波の周波数を繰り返し変動させる工程（１０２２）と、
    ｃ）前記少なくとも１つの第１領域内の前記赤血球の体積と前記少なくとも１つの第２領域内の前記血漿の体積との間の関係を決定する工程（１０２４）と、
    ｄ）前記関係に基づいて前記血液試料の前記ヘマトクリット値を決定する工程（１０２６）と、
    を含む、前記方法。
  15. 前記少なくとも１つの第１領域（３２）内の前記赤血球（４）の体積と前記少なくとも１つの第２領域（３６、３８）内の前記血漿（６）の体積との間の関係を決定する工程を実施する前に、前記血液試料（２）に２０秒以下の間前記音響定在波を照射する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの第１領域（３２）内の前記赤血球（４）の体積と前記少なくとも１つの第２領域（３６、３８）内の前記血漿（６）の体積との間の関係を決定する工程を実施する前に、前記血液試料（２）に５秒または２秒間、前記音響定在波を照射する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記関係をカメラまたは感光センサーアレイ（６４）を使用して決定する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 血液試料（１０２）のヘマトクリット値を測定するためのマイクロ流体システム（１００）であって、前記血液試料が、少なくとも赤血球（４）と少なくとも血漿（６）とを含み、
    基体（１１０）であって、前記基体内に形成されたマイクロ流体キャビティ（１１２）を有し、前記マイクロ流体キャビティが、前記血液試料を前記マイクロ流体キャビティ内に入れるための入口（１１４）を有する、前記基体と、
    前記マイクロ流体キャビティ内に音響定在波を生じさせる超音波を発生させるための、前記基体に接続された超音波トランスデューサ（１２２）と、
    前記超音波トランスデューサに作動可能に接続され、前記マイクロ流体キャビティ内に前記音響定在波が形成される一の共振周波数より低い周波数と一の前記共振周波数より高い周波数との間で繰り返し変動する前記超音波の周波数で前記超音波トランスデューサを駆動し、前記キャビティの少なくとも１つの第１領域（３２）に前記赤血球（４）を集合させ、それによって前記血漿（６）が前記キャビティの少なくとも１つの第２領域（３６、３８）を占めるようにするように構成された駆動回路と（１７０）と、
    前記少なくとも１つの第１領域内の前記赤血球の体積と前記少なくとも１つの第２領域内の前記血漿の体積との間の関係を決定するように構成された検出器（１６４）と、
    前記関係に基づいて前記血液試料の前記ヘマトクリット値を決定するためのコンピュータ（１６８）と、
    を含む、前記システム。
  19. 前記検出器（１６４）および／またはコンピュータ（１６８）が、前記血液試料に２０秒以下の間前記音響定在波を照射した後の、前記少なくとも１つの第１領域（３２）内の前記赤血球（４）の体積と前記少なくとも１つの第２領域（３６）内の前記血漿（６）の体積との間の関係を決定するように構成されている、請求項１８に記載のシステム（１００）。
  20. 前記検出器（１６４）および／またはコンピュータ（１６８）が、前記血液試料に５秒または２秒間前記音響定在波を照射した後の、前記少なくとも１つの第１領域（３２）内の前記赤血球（４）の体積と前記少なくとも１つの第２領域（３６）内の前記血漿（６）の体積との間の関係を決定するように構成されている、請求項１９に記載のシステム（１００）。
  21. 前記検出器（１６４）がカメラまたは感光センサーアレイである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のシステム。
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