JP2023512659A - 複雑な生物学的流体のインビトロスクリーニングのための装置、システムおよび方法 - Google Patents

Abstract

開示された装置、システムおよび方法は、掃引周波数を浮揚する試料に印加することによる非接触音響ツイージング装置による試料の重合、例えば、全血または血漿凝固の評価および抽出された試料パラメータの対応する評価のための方法を提供する技術に関する。

Description

[001]関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月２７日提出の、「複雑な生物学的流体のインビトロスクリーニングのための新規の装置および方法」と題する米国特許仮出願第６２／９６６，３１６号の優先権を主張するものであり、前記特許文献は、これにより３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、参照によりその全体が組み込まれる。

[002]開示されている技術は一般には、音響ツイージング（ｔｗｅｅｚｉｎｇ）分光学による複雑な生物学的流体のインビトロスクリーニングのための装置、方法およびシステムに関する。

[003]血液検査は、今日世界で最も一般的な患者の医学的状態のいくつかを診断するための、医師たちにとっての最も充実したツールの１つである。医師により指図される血液検査は、赤血球が正常な量の酸素を組織に送達しているかどうか、血管中をどんな種類のホルモンがどれくらい循環しているのか、適切な濃度の電解物が存在するかどうか、およびさらに多くのことについての情報を伝えられる。歴史を通して、血液検査は、科学界の最も重大な病理知見（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の発見、このために１９８５年に輸血スクリーニングが始まった）に適応し、世界中の国々で施設の方針を方向づけてきた。

[004]血液検査は患者の健康に関して重大な情報を提供することができるが、適切な結論を引き出すためにはいくつかの異なるタイプの検査が必要であるために、患者の医療費が増加することがある。さらに、いくつかの検査を実施するための、ならびに、検査中のエラー（血液分画の困難さなどの）の可能性を軽減するための血液の取り過ぎは、患者の貧血症になるリスクを増やすことが明らかにされている。患者がすでに弱っているもしくは他の点で免疫無防備状態であるまたはすでに大量の失血をしているまたはほとんど血液がない幼児、新生児、もしくは小児である場合はこのリスクは数倍に増える。いくつかの検査を実施するために採取する必要がある血液試料の量を減らすことにより血液検査を単純化する差し迫った必要性が存在する。科学と最新技術は進歩しているが、この問題は大部分が依然として満たされていない。

[005]本開示の方法、システムおよび装置は、試料または生体物質の組成物に対する血液凝固分析のための新規の非接触方法に関する。
ヒト血液の化学組成
[006]血液は、血漿と呼ばれる液体中の細胞成分およびタンパク質の混合物である。血液は、第一に酸素と必須栄養素をあらゆる組織に送達する。血液は、恒常性を維持する、免疫応答を発生させる、等を担当するいくつかのタンパク質および細胞が存在する場ともなっている。

[007]図１に示されるように、血液の主要な細胞成分は、赤血球および白血球である。赤血球と白血球の間の主な違いは、その機能以外は、白血球が有核であることである。赤血球および白血球につぐ第３の車輪は血小板であり、これは、白血球が侵入した細菌を排除した後、血管の損傷部位（傷）をふさぐために動員されるタンパク質である。

[008]赤血球の役割は、酸素を身体中の組織に送達することである。赤血球は両凹円盤形を有し、この形状のおかげで赤血球は組織中の小さい血管中および窮屈な毛細管接合部に割り込むことができる。鎌状赤血球貧血を有する患者に見られる鎌形などの誤形成赤血球形は、その形状が赤血球の弾性率を著しく増加させ、変形する能力を制限して、その循環を妨害する。ヘモグロビンと呼ばれるタンパク質中の鉄分子は、赤血球中では高濃度を有し、毛細血管中へのその送達のために酸素分子と結合する。

[009]白血球は身体の免疫系の重要な一部として機能する。白血球の主要な３つのカテゴリーは、顆粒球（好塩基球、好中球、および好酸球を含む）、単球およびリンパ球であり、その務めは身体中で外来細胞を認識し、それを食作用を通じて取り除くことである。感染中、これらの細胞は、その手助けが必要な組織まで到達するための輸送手段として血液を使用するので、血液中のその濃度は増加する。

[010]血液中に他の細胞および分子が存在するせいで、診断目的での血液検査の開発がもたらされてきた。血管は身体の輸送系として機能するので、生命に必要な多くの異なる成分を血液試料から抽出することができる。血液をタイプ（Ｒｈ因子に加えて、Ａ、Ｂ、ＡＢ、およびＯ）により分類することが可能になる血液中の抗原についての検査以上に、酵素、分子、および抗体についての血液検査により、心筋組織が損傷を受けたかどうか、血糖レベル、またはコレステロールレベル、またはカルシウムレベルが高すぎるまたは低すぎるかどうか、および患者がウイルスに感染したかどうかの検査が可能になる。

[011]腫瘍細胞などの極めて低濃度の成分は、全血試料中で分離し追跡するのが困難である。図２に示されるように、循環している腫瘍細胞（「ＣＴＣ」）は、がん転移の主因、がんが身体中で広がる第一の方法と考えられている。腫瘍細胞は組織上皮層を通って突き出てきて、血管中に漏れ出て、血流に入り新たな目的地に進む。これらの細胞はその新しい棲家で何年間も休止状態のままでいる場合があり、誤ったがんキュレーション感をもたらし、結局がんは将来において再び生じてしまう。血流中で循環している腫瘍細胞が希少であるため、それを検出する簡単で正確な血液検査機構を関発する上での障害となっている。

[012]ウイルスおよびウイルスからの防御をもたらす、身体の免疫系が作り出すその抗ウイルス抗体の検出には、それ独自の限界がある。ウイルスの濃度は免疫系応答の完全な発現前の感染の最初の週で最高になり、抗体の濃度は宿主が最初に感染するほぼ３週間後に最高になる。濃度ピークにこのような違いがあるために、ウイルスか抗体のどちらかの出現について検査する血液検査を考案するのは困難になり、患者が免疫応答のある特定の段階を超えて進んでしまった場合は誤診をする可能性を抑えられなくなる。

[013]生物学的流体をスクリーニングすることは、献血を選択し血液銀行に預けるのに不可欠である。２０１７年、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、合衆国で輸血の結果として３７名の死亡を報告した。７つの症例では、間違った血液型が患者に与えられ、５つの症例では血液が細菌で汚染されていた。しかし、１９８０年代にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の発見後、輸血用の血液をスクリーニングすることがはるかに重視されるようになったことならびに血液銀行でタイプにより血液にラベルを張るバーコード技術が導入されたせいで、輸血の直接の結果としての死亡はこの数十年で激減した。

[014]非接触音響ツイージング分光学による全血または血漿凝固のリアルタイム評価のためのならびにレオロジー測定および重合動力学を含むがこれらに限定されない試料の重合特徴を測定するための方法、システムおよび装置に関連する種々の装置、システムおよび方法が本明細書で考察される。他の応用は、細胞を検出すること、構造／分子量の違いを検出すること、タンパク質の存在を検出すること、および同類のものを含む。

[015]例１では、生体試料を分析する非接触インビトロ方法であって、試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、搬送波信号を生体試料に印加するステップ、生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および変調信号を一定範囲の周波数にわたって掃引するステップを含む、ステップと、試料からの生データおよび／または画像を記録するステップと、振幅周波数応答（ＡＦＲ）についての生データおよび／または画像を分析するステップとを含む方法。

[016]例２では、ＡＦＲ曲線からパラメータを抽出するステップをさらに含み、抽出されたパラメータが、ＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）およびｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、不安定性の帯域幅ならびに不安定性のＡＵＣである、例１の方法。

[017]例３では、抽出したパラメータから粘度、表面張力および弾性のうちの１つまたは複数を計算するステップをさらに含む、例２の方法。
[018]例４では、変調信号掃引が約１５０Ｈｚ～約５０Ｈｚの範囲を含む、例１の方法。

[019]例５では、分析がピーク振幅を利用して粘度および／または弾性率を確立する、例１の方法。
[020]例６では、分析が曲線下面積（ＡＵＣ）を利用して粘度および／または弾性率を確立する、例１の方法。

[021]例７では、分析がＡ＿ｍｉｎおよび／またはＡ＿ｍａｘを利用して粘度および／または弾性率を確立する、例１の方法。
[022]例８では、分析が品質係数（ＱＦ）を利用して粘度および／または弾性率を確立する、例１の方法。

[023]例９では、帯域幅上の共振周波数により見い出されるＱＦは、最大振幅の半分を利用して帯域幅を確立する、例８の方法。
[024]例１０では、帯域幅上の共振周波数により見い出されＱＦは、最大振幅の約３０％～約７０％を利用して帯域幅を確立する、例８の方法。

[025]例１１では、分析はピーク周波数を利用して弾性率を確立する、例１の方法。
[026]例１２では、分析が２つまたはそれよりも多いパラメータを利用して粘度および／または弾性率を確立するステップを含む、例１の方法。

[027]例１３では、２つまたはそれよりも多いパラメータが、ＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）およびｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、不安定性の帯域幅ならびに不安定性のＡＵＣからなる群から選択される、例１２の方法。

[028]例１４では、分析が、粘性ツイゾーグラフまたは弾性ツイゾーグラフからパラメータを抽出するステップを含む、例２の方法。
[029]例１５では、分子量の違いを検出して定量化するステップをさらに含む、例２の方法。

[030]例１６では、大きなタンパク質を検出して定量化するステップをさらに含む、例２の方法。
[031]例１７では、存在する細胞の数を検出して定量化するステップをさらに含む、例２の方法。

[032]例１８では、分析が粘性ツイゾーグラフからパラメータを抽出するステップを含み、全血フィブリン動力学を測定するステップをさらに含む、例１の方法。
[033]例１９では、Ａ＿ｐｅａｋおよび／またはｆ＿ｐｅａｋから分子量および／または細胞の数を測定するステップをさらに含む、例１の方法。

[034]例２０では、ＡＵＣから分子量および／または細胞の数を測定するステップをさらに含む、例１の方法。
[035]例２１では、周波数の範囲が約１５０Ｈｚ～約５０Ｈｚであり、規定された時間が約１秒～約６０秒である、例１の方法。

[036]例２２では、生体試料を分析する非接触インビトロ方法であって、試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、搬送波信号を生体試料に印加するステップ、生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および変調信号を掃引するステップを含む、ステップと、試料からの生データおよび／または画像を記録するステップと、試料パラメータについての生データおよび／または画像を分析するステップとを含む方法。

[037]例２３では、生体試料が全血または血漿である、例２２の方法。
[038]例２４では、周波数の範囲が約１５０Ｈｚ～約５０Ｈｚである、例２２の方法。
[039]例２５では、周波数の範囲が規定された時間にわたって印加される、例２２の方法。

[040]例２６では、規定された時間が約１秒～約６０秒である、例２５の方法。
[041]例２７では、周波数の範囲が約１５０Ｈｚ～約５０Ｈｚであり、規定された時間が約１秒～約６０秒である、例２５の方法。

[042]例２８では、試料パラメータが、ＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）およびｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、不安定性の帯域幅ならびに不安定性のＡＵＣのうちの１つまたは複数を含む、例２２の方法。

[043]例２９では、凝固開始時間（ＣＩＴ）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ）、凝固時間（ＣＴ）、凝固速度（ＣＲ）、最大凝固硬度（ＭＣＦ）およびピークに到達するまでの時間（ＴＲＰ）、反応時間（ＲＴ）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ）ならびに最大フィブリンレベル（ＭＦＬ）のうちの１つまたは複数を確立するステップをさらに含む、例２２の方法。

[044]例３０では、凝固開始時間（ＣＩＴ）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ）、凝固時間（ＣＴ）、凝固速度（ＣＲ）、最大凝固硬度（ＭＣＦ）およびピークに到達するまでの時間（ＴＲＰ）、反応時間（ＲＴ）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ）ならびに最大フィブリンレベル（ＭＦＬ）のうちの１つまたは複数を確立するステップをさらに含む、例１４の方法。

[045]例３１では、変調信号掃引が、約１０００Ｈｚ～約１０Ｈｚの範囲を含む、例１の方法。
[046]例３２では、変調信号掃引が、約１０００Ｈｚ～約１０Ｈｚの範囲を含む、例２２の方法。

[047]例３３では、生体試料を分析する非接触インビトロ方法であって、試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、搬送波信号を生体試料に印加するステップ、生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および変調信号を掃引するステップを含む、ステップと、試料から生データおよび／または画像を記録するステップと、ＡＦＲ曲線からパラメータを抽出するために生データおよび／または画像を分析するステップとを含み、抽出されたパラメータがＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）およびｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、不安定性の帯域幅ならびに不安定性のＡＵＣである方法。

[048]例３４では、全血を分析する非接触インビトロ方法であって、試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、搬送波信号を生体試料に印加するステップ、生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および変調信号を一定範囲の周波数にわたって掃引するステップを含む、ステップと、試料から生データおよび／または画像を記録するステップと、ＡＦＲ曲線からパラメータを抽出するために生データおよび／または画像を分析するステップとを含み、抽出されたパラメータがＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）およびｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、不安定性の帯域幅ならびに不安定性のＡＵＣである方法。

[049]例３５では、分析が粘性ツイゾーグラフからパラメータを抽出するステップを含み、全血フィブリン動力学を測定するステップをさらに含む、例３４の方法。
[050]例３６では、変調信号掃引が、約１０Ｈｚ～約１０００Ｈｚの範囲を含む、例１の方法。

[051]例３７では、変調信号掃引が、約１０Ｈｚ～約１０００Ｈｚの範囲を含む、例２２の方法。
[052]例３８では、掃引が単一周波数においてである、例２２の方法。

[053]例３９では、凝固開始時間（ＣＩＴ）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ）、凝固時間（ＣＴ）、凝固速度（ＣＲ）、最大凝固硬度（ＭＣＦ）およびピークに到達するまでの時間（ＴＲＰ）、反応時間（ＲＴ）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ）ならびに最大フィブリンレベル（ＭＦＬ）のうちの１つまたは複数を確立するステップをさらに含む、例３３の方法。

[054]例４０では、凝固開始時間（ＣＩＴ）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ）、凝固時間（ＣＴ）、凝固速度（ＣＲ）、最大凝固硬度（ＭＣＦ）およびピークに到達するまでの時間（ＴＲＰ）、反応時間（ＲＴ）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ）ならびに最大フィブリンレベル（ＭＦＬ）のうちの１つまたは複数を確立するステップをさらに含む、例３４の方法。

[055]例４１では、生体試料を測定する非接触方法であって、試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、搬送波信号を生体試料に印加するステップ、生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および変調信号を掃引するステップを含む、ステップと、試料からの生データおよび／または画像を記録するステップと、生体試料の分子量を検出するために生データおよび／または画像を分析するステップとを含む方法。

[056]例４２では、生体試料を測定する非接触方法であって、試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、搬送波信号を生体試料に印加するステップ、生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および変調信号を掃引するステップを含む、ステップと、試料からの生データおよび／または画像を記録するステップと、大きなタンパク質を検出し定量化するために生データおよび／または画像を分析するステップとを含む方法。

[057]例４３では、生体試料を測定する非接触方法であって、試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、搬送波信号を生体試料に印加するステップ、生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および変調信号を掃引するステップを含む、ステップと、試料からの生データおよび／または画像を記録するステップと、存在する細胞の数を検出し定量化するために生データおよび／または画像を分析するステップとを含む方法。

[058]語句「例えば」、「などの」、「を含む」および同類のもののいずれかが本明細書で使用されるところではどこでも、別段明白に述べられなければ、語句「および限定なしで」が後に続くと理解されている。同様に「例」、「例示的な」および同類のものは非限定的であると理解されている。

[059]用語「実質的に」は、意図された目的に否定的な影響を及ぼさない記述語からの逸脱を許す。記述用語は、たとえ単語「実質的に」が明白に唱えられていなくとも、用語「実質的に」により修飾されていると理解されている。したがって、例えば、語句「そこではレバーが垂直に伸びている」は、レバーがその機能を果たすのに正確な垂直配置が必要でない限り「そこではレバーが実質的に垂直に伸びている」を意味する。

[060]用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」（ならびに同様に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」および「含む（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」）および同類のものは互換的に使用され、同じ意味を有する。具体的には、用語のそれぞれが「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の一般的米国特許法定義に一致して定義されており、したがって、「少なくとも以下のもの」を意味するオープンタームであると解釈され、追加の特長、制限、態様、等を排除しないとも解釈される。したがって、例えば、「ステップａ、ｂ、およびｃを含む工程」は、工程が少なくともステップａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。用語「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」が使用されるところではどこでも、「１つまたは複数の」という解釈が文脈で無意味でなければ、そのように理解される。

[061]本明細書で考察されるある特定の例および実施では、弾性または硬度に言及されるが、当業者であれば容易に理解すると考えられるように、これは一般に、弾性率に関して測定されるまたは本明細書で他の方法で確立される特性としての機械的弾性を指すことができる。

[062]複数の実施形態が開示されているが、以下の詳細な説明から本開示のさらに他の実施形態が当業者には明らかになり、この説明は開示された装置、システムおよび方法の例示的実施形態を明らかにし記載している。了解されるように、開示された装置、システムおよび方法は、すべて本開示の精神および範囲から逸脱することなく種々の明白な態様において改変することができる。したがって、図面および詳細な説明は事実上説明的であって、限定するものではない。

[063]図１は、全血の３つの主な細胞組成物、赤血球、白血球および血小板を描いている。 [064]図２は、がんは転移という過程により身体に広がると広く考えられていることを示している。腫瘍由来の細胞が血流中に脱落し、身体の異なる領域まで遊走する。 [065]図３は、クロマトグラフィーの一種であるペーパークロマトグラフィーの簡単な例を示している。葉抽出液が短冊の上に置かれ、プロパノンと反応する。ここで、その役割は留保される。葉抽出液成分の色素沈着を明らかにするため、プロパノン（移動相）は上昇して抽出液（固定相）の中を取って移動し、それに続く反応が色素の組成を明らかにする。 [066]細胞は、電極を通過するとき、システムの音響インピーダンスを変化させる。次に、容積は電圧のパルスとして記録されるので、これらの変化は記録されて細胞容積を決定する。値が同じままであるように懸濁液の量を正確に制御されるのであれば、これは再現可能な方法である。 [067]細胞粒子サイズは、光電子増倍管（ＰＭＴ）に向けられた前方散乱光（ＦＳＣ）の任務から生じた信号により決定され、これらの粒子の粒度は放たれた側方散乱光（ＳＳＣ）により決定される。 [068]基本周波数の倍数は高調波と呼ばれる。しかし、すべての共振周波数が必ず高調波というわけではない。信号にとってきわめて不可欠でもある偽のピークが発生する場合がある。これらは倍音であるが、基本周波数の倍数ではないので、高調波ではない。 [069]（Ａ）細胞除去およびエキソソーム単離モジュールの模式図、（Ｂ）マイクロ流体チップ自体の画像、（Ｃ）細胞の分離のための圧力ノードのマッピング。 [070]浮揚した液体に対する音波放射の効果 [071]図９Ａは、スペクトルの例示的実施を描いている。 [072]図９Ｂは、スペクトル写真の例示的実施を描いている。 [073]図１０は、周波数応答グラフを描いており、共振回路では、Ｑ係数が高いほど、減衰は低くなり、共振ピークは鋭くなることを示している。 [074]図１１は、１つの実施に従ったシステムのモデル模式図を描いている。 [075]駆動（搬送波）信号は正弦波により調節され、正弦波は変調信号としての役割を果たす。変調出力は浮揚液滴から振動を誘導し、この振動は光検出装置により記録される。 駆動（搬送波）信号は正弦波により調節され、正弦波は変調信号としての役割を果たす。変調出力は浮揚液滴から振動を誘導し、この振動は光検出装置により記録される。 駆動（搬送波）信号は正弦波により調節され、正弦波は変調信号としての役割を果たす。変調出力は浮揚液滴から振動を誘導し、この振動は光検出装置により記録される。 駆動（搬送波）信号は正弦波により調節され、正弦波は変調信号としての役割を果たす。変調出力は浮揚液滴から振動を誘導し、この振動は光検出装置により記録される。 駆動（搬送波）信号は正弦波により調節され、正弦波は変調信号としての役割を果たす。変調出力は浮揚液滴から振動を誘導し、この振動は光検出装置により記録される。 駆動（搬送波）信号は正弦波により調節され、正弦波は変調信号としての役割を果たす。変調出力は浮揚液滴から振動を誘導し、この振動は光検出装置により記録される。 駆動（搬送波）信号は正弦波により調節され、正弦波は変調信号としての役割を果たす。変調出力は浮揚液滴から振動を誘導し、この振動は光検出装置により記録される。 駆動（搬送波）信号は正弦波により調節され、正弦波は変調信号としての役割を果たす。変調出力は浮揚液滴から振動を誘導し、この振動は光検出装置により記録される。 駆動（搬送波）信号は正弦波により調節され、正弦波は変調信号としての役割を果たす。変調出力は浮揚液滴から振動を誘導し、この振動は光検出装置により記録される。 [076]図１３は、さらなる実施に従ったシステムのモデル模式図を描いている。浮揚システム－スタンドに置かれた自動化した注射器を使用して、浮揚装置のプレート－変換器と反射器の間に挟まれたノード中に溶液から６μＬの試料を注入する。懐中電灯はカメラ用の光源として使用され、このカメラを使用して浮揚した試料の写真を撮る。加湿器（カメラの背後）は、部屋の湿度を制御するのに使用できる。 図１３は、さらなる実施に従ったシステムのモデル模式図を描いている。浮揚システム－スタンドに置かれた自動化した注射器を使用して、浮揚装置のプレート－変換器と反射器の間に挟まれたノード中に溶液から６μＬの試料を注入する。懐中電灯はカメラ用の光源として使用され、このカメラを使用して浮揚した試料の写真を撮る。加湿器（カメラの背後）は、部屋の湿度を制御するのに使用できる。 [077]図１４は、記載されたシステムの１つの実施による小試料の浮揚を描いている。 [078]図１５は、信号、フィルターおよびＦＦＴの間の関係を描いている模式図である。 [079]図１６は、包絡線、ピーク検出およびフォルマント分析の間の関係を描いている模式図である。 [080]図１７Ａは、生波形を示す一連の電圧／時間グラフを描いている。図１７Ｂは、フィルターされた信号を示す一連の電圧／時間グラフを描いている。図１７Ｃは、ＦＦＴを示す一連の電圧／時間グラフを描いている。 [081]図１８Ａは、ＦＦＴを示す一連の振幅／周波数グラフを描いている。図１８Ｂは、スペクトル包絡線を示す一連の振幅／周波数グラフを描いている。図１８Ｃは、フォルマントを示す一連の振幅／周波数グラフを描いている。 [082]図１９は、１％、３％および５％濃度のいくつかのデキストラン試料の振幅－周波数応答を描いている。 [083]図２０Ａは、５％デキストランおよび１０％ＰＳＭＰの振幅－周波数応答を描いている。図２０Ｂは、５％デキストランおよび１０％ＰＳＭＰの振幅－周波数応答を描いている。 [084]図２１Ａは、５％デキストランおよび種々の濃度のＰＳＭＰの振幅－周波数応答を描いている。図２１Ｂは、５％デキストランおよび種々の濃度のＰＳＭＰの振幅－周波数応答を描いている。 [085]図２２は、直接比較のために選択された振幅による最高のフォルマント周波数値（Ｆ０は最高値を、およびＦ１は上から２番目の値を）について、ＰＳＭＰおよびデキストラン濃度と周波数の経時的な比較を描いている。 [086]図２３Ａは、一定範囲のデキストランおよびＰＳＭＰ濃度についての経時的なＱ係数分析を描いている。図２３Ｂは、一定範囲のデキストランおよびＰＳＭＰ濃度についての経時的なＱ係数分析を描いている。図２３Ｃは、一定範囲のデキストランおよびＰＳＭＰ濃度についての経時的なＱ係数分析を描いている。図２３Ｄは、一定範囲のデキストランおよびＰＳＭＰ濃度についての経時的なＱ係数分析を描いている。 [087]図２４Ａは、それぞれの時点での異なる濃度のＦ０共振ピークのＱ係数の平均のプロットを描いている。図２４Ｂでは、Ｆ０についてのＱ係数値の平均は、濃度とＱ係数の間で線形傾向を示していた（Ｒ２＝０．８８５）。 [088]図２５Ａは、音響ツイージング装置の模式図。図２５Ｂは、液滴を浮揚させるのに必要な搬送波（非変調）信号（黒色）および液滴の形状振動を誘導する掃引変調信号（ピンク色）からなる試料液滴上の駆動信号の例。図２５Ｃは、形状振動中の浮揚血液滴の一連の画像。図２５Ｄは、掃引変調信号（ピンク色）により誘導される落高の代表的な変化（光検出装置出力の電圧の変化から測定される）。濃青色と淡青色曲線は、ドロップ応答の上および下包絡線である。図２５Ｅは、浮揚液滴の振幅－周波数応答（ＡＦＲ）および応答から測定される以下の特性：曲線下面積（ＡＵＣ）、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ_１／２右、ｆ_１／２左。 [089]図２６Ａは、医学的標準流体ＭＳＦ１．２（黒色）、ＭＳＦ１．６（ピンク色）、ＭＳＦ２（緑色）、ＭＳＦ４（紫色）、ＭＳＦ６（ラベンダー色）、ＭＳＦ１０（青色）の振幅周波数応答曲線。図２６Ｂは、分子量２００００００（ピンク色）、２００００（青色）のデキストラン５％（ｗ／ｖ）溶液の振幅周波数応答曲線。図２６Ｃは、時間０分（青色）、２．５分（ピンク色）および５分（緑色）での市販の血漿（点線）ならびにＡＰＴＴおよびＣａＣｌ_２で処理された市販の血漿（実線）の振幅周波数応答曲線。 [090]図２７Ａは、ピーク振幅。図２７Ｂは、正規化最大周波数（ω）。図２７Ｃは、開示されたシステムおよび方法により測定された医学標準流体の正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）：ＭＳＦ１．２（黒色、ｎ＝９）、ＭＳＦ１．６（ピンク色、ｎ＝９）、ＭＳＦ２（緑色、ｎ＝９）、ＭＳＦ４（紫色、ｎ＝９）、ＭＳＦ６（ラベンダー色、ｎ＝９）、ＭＳＦ１０（青色、ｎ＝９）。図２７Ｄは、理論的モデルから測定された正規化されたＡＵＣ対実験から測定された正規化されたＡＵＣ。 [091]図２８Ａは、ピーク振幅。図２８Ｂは、正規化された最大周波数（ω）。図２８Ｃは、正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）。図２８Ｄは、開示されたシステムおよび方法により測定されたデキストラン溶液の推定粘度および報告された参照値（黒色の破線）：デキストラン１％（ｗ／ｖ）（黒色、ｎ＝１０）、デキストラン２％（ｗ／ｖ）（ピンク色、ｎ＝１０）、デキストラン３％（ｗ／ｖ）（緑色、ｎ＝２５）、デキストラン４％（ｗ／ｖ）（紫色、ｎ＝２５）、デキストラン５％（ｗ／ｖ）（ラベンダー色、ｎ＝２６）。図２８Ｅは、開示されたシステムおよび方法により測定されたデキストラン溶液の品質係数：デキストラン３％（ｗ／ｖ）（緑色、ｎ＝２５）、デキストラン４％（ｗ／ｖ）（紫色、ｎ＝２５）、デキストラン５％（ｗ／ｖ）（ラベンダー色、ｎ＝２６）。 [092]図２９Ａは、正規化された最大周波数（ω）。図２９Ｂは、０分および５分での推定弾性率。図２９Ｃは、正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）。図２９Ｄは、開示されたシステムおよび方法により測定されたキサンタンガム溶液の推定粘度：キサンタンガム０．１％（ｗ／ｖ）（黒色、ｎ＝１２）、キサンタンガム０．２％（ｗ／ｖ）（ピンク色、ｎ＝１１）、キサンタンガム０．３％（ｗ／ｖ）（緑色、ｎ＝１０）。 [093]図３０Ａは、正規化された最大周波数（ω）。図３０Ｂは、推定弾性率。図３０Ｃは、正規化された曲線下面積（ＡＵＣ）。図３０Ｄは、開示されたシステムおよび方法により測定されたゼラチン溶液の推定粘度対時間：ゼラチン２％（ｗ／ｖ）（黒色、６液滴の平均）、ゼラチン３％（ｗ／ｖ）（ピンク色、５液滴の平均）、ゼラチン４％（ｗ／ｖ）（緑色、５液滴の平均）。 [094]図３１Ａは、血漿または弾性ツイゾーグラフ（対照、ピンク色、ｎ＝３）、ＡＰＴＴおよびＣａＣｌ_２で処理された血漿（凝固、黒色、ｎ＝３）ならびに推定弾性率（緑色、ｎ＝３）についての時間による弾性率の変化。図３１Ｂは、血漿（対照、ピンク色、ｎ＝３）ならびにＡＰＴＴおよびＣａＣｌ_２で処理された血漿（凝固、黒色、ｎ＝３）についての時間による粘度の変化または粘性ツイゾーグラフ。図３１Ｃは、凝固に起因する時間による粘度の変化（緑色、ｎ＝３）。図３１Ｄは、粘性ツイゾーグラフから得られる凝固パラメータ－反応時間（ＲＴ、緑色、ｎ＝３）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ、暗い青緑色、ｎ＝３）、最大フィブリンレベル（ＭＦＬ、ピンク色、ｎ＝３）。図３１Ｅは、弾性ツイゾーグラフから得られる凝固パラメータ－凝固開始時間（ＣＩＴ、緑色、ｎ＝３）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ、オレンジ色、ｎ＝３）、凝固時間（ＣＴ、青色、ｎ＝３）、凝固速度（ＣＲ、灰色、ｎ＝３）、最大凝固硬度（ＭＣＦ、ピンク色、ｎ＝３）、ピーク凝固に到達するまでの時間（ＴＲＰ、黒色、ｎ＝３）。 [095]図３２Ａは、ＡＰＴＴおよびＣａＣｌ_２で処理されたクエン酸塩加全血（緑色、ｎ＝１８）の弾性ツイゾーグラフ（対照、ピンク色、ｎ＝３）。図３２Ｂは、ＡＰＴＴおよびＣａＣｌ_２で処理されたクエン酸塩加全血の粘性ツイゾーグラフ（赤色、黒色、ｎ＝１８）。図３２Ｃは、弾性ツイゾーグラフから得られる凝固パラメータ－凝固開始時間（ＣＩＴ、黒色、ｎ＝１８）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ、ピンク色、ｎ＝１８）、凝固時間（ＣＴ、暗い青緑色、ｎ＝１８）、凝固速度（ＣＲ、紫色、ｎ＝１８）、最大凝固硬度（ＭＣＦ、ラベンダー色、ｎ＝１８）。図３２Ｄは、粘性ツイゾーグラフから得られる凝固パラメータ－反応時間（ＲＴ、黒色、ｎ＝１８）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ、ピンク色、ｎ＝１８）、最大フィブリンレベル（ＭＦＬ、暗い青緑色、ｎ＝１８）。 [096]図３３Ａは、水（対照群、ＭＷなし、緑色）の試料振幅周波数応答曲線。図３３Ｂは、５％（ｗ／ｖ）デキストランＭＷ３５０００～４５０００溶液（低ＭＷ、青色）の試料振幅周波数応答曲線。図３３Ｃは、５％（ｗ／ｖ）デキストランＭＷ２００００００溶液（高ＭＷ、ピンク色）の試料振幅周波数応答曲線。図３３Ｄは、ＭＷなし（緑色）、低ＭＷ（青色）、高ＭＷ（ピンク色）についてのＡｐｅａｋの合計、ＡＵＣ、不安定性のＡＵＣおよび不安定性の帯域幅を含む、振幅周波数応答（ＡＦＲ）曲線から抽出されるパラメータ。 [097]図３４Ａは、ＭＳＦ１．２（緑色）および血漿（ピンク色）の試料振幅周波数応答曲線。図３４Ｂは、ＭＳＦ１．２（緑色）および血漿（ピンク色）についてのＡｐｅａｋの合計、ＡＵＣ、不安定性のＡＵＣおよび不安定性の帯域幅を含む、ＡＦＲ曲線から抽出されるパラメータ。 [098]図３５Ａは、０％ヒツジＲＢＣの試料振幅周波数応答曲線（緑色）。図３５Ｂは、５％ヒツジＲＢＣの試料振幅周波数応答曲線（青色）。図３５Ｃは、１０％ヒツジＲＢＣの試料振幅周波数応答曲線（ピンク色）。図３５Ｄは、０％ＲＢＣ（緑色）、５％ＲＢＣ（青色）および１０％ＲＢＣ（ピンク色）についてのＡ_ｐｅａｋの合計、ＡＵＣ、不安定性のＡＵＣおよび不安定性の帯域幅を含む、ＡＦＲ曲線から抽出されるパラメータ。 [099]図３６Ａは、血漿（対照、黒色）、ならびにＡＰＴＴおよびＣａＣｌ_２で処理された血漿（凝固、ピンク色）についての時間による全振幅の変化。図３６Ｂは、血漿（対照、黒色）、ならびにＡＰＴＴおよびＣａＣｌ_２で処理された血漿（凝固、ピンク色）についての時間によるＡＵＣの変化。図３６Ｃは、凝固している血漿の振幅ツイゾーグラフ（緑色）。図３６Ｄは、凝固している血漿のＡＵＣツイゾーグラフ（緑色）。

[0100]本明細書で開示されるまたは意図される種々の実施形態は、血液などのある特定の生体試料の浮揚および分析のための装置、システムおよび方法に関する。
[0101]生物学的流体または生物流体は、いくつかの構成部分を含むことができることが理解されている。例えば、血液は、血漿、細胞、タンパク質、および血小板を含み、これらは独自の固有周波数を有する。血液の多面的組成を考慮すると、血液滴の振動は複雑な波形になるはずである。言い換えると、全血液滴の振動は血液中の細胞とタンパク質の振動の集合体である。サイズと形状により区別される細胞およびタンパク質は駆動周波数を課せられると異なる周波数で振動し、全血液滴の主振動に異なった寄与をする。開示されたシステム１０は、いくつかの特徴について試料を分析することができる装置上で用いられる音響ツイージング流動測定法に関し、ある特定の非限定的例は、他の応用の中でも、生物学的流体のレオロジー特性を測定すること；凝固中のレオロジー特性の測定された変化から血液および血漿の凝固パラメータを抽出すること；構造および／または分子量の違いを検出し定量化すること；試料中の細胞および／またはタンパク質を検出し定量化することである。

[0102]本開示およびツイージング流動測定法またはシステム１０は、生物学的流体のレオロジー特性の評価のための新規の非接触法に関し、音響ツイージング流動測定と呼ばれる。方法は音響浮揚を使用して、容積がわずか６μＬの流体のレオロジー特性を測定する。物体を浮揚させるため、定在音響波動場が変換器と反射器設定により生み出される（図２５Ａ）。音響放射力が、物体を引き下げる重力とバランスが取れて液滴浮揚を可能にする圧力ノードのわずかに下でホスト流体（例えば、空気）中の試料液滴を捕らえる。この音響ツイージング設定は、２種のレジーム－準静的（ＱＡＴＴ）および振動レジームで操作することができる。振動レジームは、自由振動と強制振動にさらに分けることができる。本明細書で考察される音響ツイージング流動測定法は、強制振動レジームに属する。ここでは、試料液滴変形は、搬送波信号の振幅変調を使用して強制的形状振動を誘導することにより達成される（図２５Ｂ）。変調信号を特定の周波数でまたは一定範囲の周波数にわたりさらに掃引して、試料液滴の振幅周波数応答（ＡＦＲ）を得た。この振幅周波数応答はそれぞれの流体にとって特有であり、粘度、弾性、表面張力および同類のものなどのそのレオロジー特性、ならびにその構成成分に依存している。振幅周波数応答からいくつかのパラメータを抽出することができ、このパラメータをさらに使用して複雑な生物学的流体のレオロジー特性および構造特性を決定することができる。

[0103]物理学では周知であり容易に認識されるように、流体を含むすべての物体は、固有周波数を有しており、この周波数はその物体の機械的特性である。浮揚液滴に課せられた駆動周波数がその固有周波数に近い場合には、液滴は他の周波数よりも高い振幅で振動する。これは共振と呼ばれる。全血のような流体の振動パターンは、その固有周波数近くに一次ピークが存在することを示唆している。二次ピークは倍音で発生する場合があり、この倍音は、一次固有周波数よりも高い固有周波数である。

[0104]異なるサイズおよび形状の細胞およびタンパク質の存在ならびに血液凝固などの過程は、粘度および弾性などのレオロジー特性の変化を引き起こす。粘度または弾性原因のこれらの変化はＡＦＲの変化をもたらす。例えば、流体の粘度が高いほど、流体は振動にそれだけよく抵抗して、振動の振幅を減少させ、凝固中弾性が増加すると血液の固有周波数を増やし、共振周波数のシフトを引き起こす。さらに、血液関連疾患に起因する血液中のある特定の細胞および／またはタンパク質のいかなる異常もレオロジー特性に影響を及ぼす（例えば、血栓症、血友病、鎌状赤血球症および同類のもの）。したがって、血液滴のＡＦＲの抽出は、健康な全血試料と病気の全血試料を区別するステップへの経路を提供しうる。

[0105]本明細書に記載される音響ツイージング流動測定システムは、血液などのある特定の生物学的流体試料の粘度および弾性率（または弾性）を抽出するのに使用することができ成功している。このシステムおよび方法が凝固中の凝固全血および血漿に適用される場合、臨床的に関連のある包括的な凝固プロファイルを作成できる。このシステムは、流体内部の細胞、構造または分子量、および構成成分を検出し定量化するのに使用することも可能である。

[0106]種々の実施が全血および血漿に関して開示された技術の適用を考察しているが、バイオポリマー溶液、唾液、滑液、リンパ液、硝子体液（ｖｉｔｒｉｏｕｓ ｆｌｕｉｄ）、および同類のものなどのいかなる数の他の生体試料でも利用できることは認識されている。

[0107]開示されている方法、システムおよび装置の種々の実施形態は、２０１６年３月１１日提出の米国特許出願公開第１５／０６８，１２６号、および２０１４年９月１５日提出の特許協力条約に基づく国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５５５９、両方とも表題は「生体物質の非接触レオロジー測定のための装置、システムおよび方法」、ならびに２０１９年７月１６日提出の米国特許出願公開第１６／４７８，２４９号、および特許協力条約に基づく国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／１４８７９、両方とも表題は「重合の非接触測定のための組込みフォト光学／機械的検査用の装置、システムおよび方法」、で開示されている装置および方法を使用して実施することができ、前記特許文献はすべて参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
Ｉ．生物学的流体を評価するための診断方法
[0108]臨床的には、生物学的流体の組成を評価するためのゴールドスタンダードは、免疫アッセイ技法のある使用を含む。免疫アッセイは、固定化した抗体を使用して検査試料中の所望の抗原を捕捉することにより機能する。もっと高いレベルの特異性では、別の抗体を使用して捕捉した抗原を標識してもよく、次にトレーサーを使用して検出に適した分析シグナルを発する。この技法を使用して、抗体または他のナノスケールの分子を求めてスクリーニングし、これらの抗体または分子は血漿血清（凝固後血液から分離する液体）中のウイルスまたは腫瘍マーカーを検出するのに使用することができる。

[0109]しかし、免疫アッセイは一般には、特異的で高価で複雑な計測手段を用いてのみ使用することができる。第二に、単一分析物免疫アッセイは、臨床使用に十分高い処理量を提供せず、単一の腫瘍マーカーは異なる種類のがんにマークすることができるので、特定種のがんを診断するのに十分特異的ではない。血清学ベースの検査は、ウイルスに対する免疫応答も調べ、ウイルスの存在にとりフットプリントの役割を果たす抗体を探求する。しかし、血清学ベースの検査は、今発生しているウイルスに対応する抗体とこれまでにすでに排除されたウイルスに対応する抗体を区別することができない。さらに、臨床現場では、一度に１つのウイルスしか検査できない。これらの検査を実施するかどうかの決定は、完全に臨床医の仮定に基づく。仮定が間違っていれば、患者の状態を引き起こしている重要な要因を見逃す可能性があるためさらに深刻な結果をもたらすおそれがある。生物学的流体試料から広範囲なウイルスおよび他の分子成分について検査できれば、とてつもない価値があることになる。これは、患者を誤診する人的ミスを補うだけではなく、臨床検査用に抜き取る必要がある流体の量を減らし、患者が貧血などの状態を被るリスクを減らすことにもなる。簡単で安価であるが単一分析物免疫アッセイの特異性および感度も保つ、多分析物免疫アッセイの開発は臨床的に必要である。

[0110]免疫アッセイは、特殊なタイプのクロマトグラフィーであるアフィニティークロマトグラフィーのもっと広い範疇の一部である。アフィニティークロマトグラフィーは、液体の組成を分離するための抗体と抗原の結合などの生物学的反応を使用する。一般に、クロマトグラフィーは、物質をその化学的成分に分離するために有機化学および生化学応用で使用される技法である。カラムには固定相要素、すなわち、所望の分析物（検査している試料）と反応する任意の要素が充填されている。固定相は、分離のために使用される要因（すなわち、極性、サイズ、生化学結合、沸点）に基づいて選択される。分析物（移動相）は固定相中を通過し、反応し、その個々の成分の異なる反応に基づいて分離する。最も簡単な例が、葉の色素またはマーカーを分離するためのクロマトグラフィーの使用である。分離が生じた後は、分離の要因に応じて、シグナル検出について分析しうる。

[0111]図３は、クロマトグラフィーの一種－ペーパークロマトグラフィーの簡単な例を描いている。葉抽出物は一枚の紙の上に置かれ、プロパノンと反応する。ここで、役割は保たれる。葉抽出物成分の色素形成を明らかにするため、プロパノン（移動相）は上昇し抽出物（固定相）の中を移動し、それに続く反応は色素組成を明らかにする。

[0112]生物学的流体の成分の分析を実施するための自動化技術は、分光法のような標識検出技術と連結させたフローサイトメトリーを中心に展開する。フローサイトメーターは、ナノスケールレベルでだけではなく、マイクロスケールレベル－血液細胞でも成分の存在を診断するのに使用することができる。コールターカウンターなどの血液学分析器は、粒子が電流と同時に管の中を流れている場合インピーダンスの変化を誘導するという原理を適用するが、赤血球の存在および白血球の異なるタイプを検出するのに使用される。これらの変化は評価されている流体中の粒子体積に正比例してる。

[0113]図４は、音響インピーダンスの変化の評価の様式化された表示を描いている。細胞が電極を通過するとき、細胞はシステムの音響インピーダンスを変化させる。次に、これらの変化を記録して、細胞体積を決定する。体積は電圧のパルスとして記録されるからである。これは、懸濁液の量が、値が同じままであるように正確に制御されるのであれば、再現可能な方法である。

[0114]コールターカウンターは、生細胞と死細胞を区別せず、細胞数を確認する画像も提供せず、検出された細胞の形態をさらにはっきり発音することもしないので、フローサイトメトリー光散乱または蛍光検出技法をコールターカウンターと連結してその弱点を補い、細胞成分に関するもっと詳細な情報を得てもよい。

[0115]図５に示されているように、細胞粒子サイズは、光電子増倍管（ＰＭＴ）に向けられた前方散乱光（ＦＳＣ）のミッションから生み出されるシグナルにより決定され、これらの粒子の粒度は放たれた側方散乱光（ＳＳＣ）により決定される。

[0116]血液学分析器は、分析器が抗原マーカーを検出する能力を獲得するにしたがってフローサイトメーターそれ自体になり始めていることが理解されている。しかし、システムの費用およびシステムを使用する専門化が、格上げされた検出および診断のための装置および方法のさらなる開発の余地を当分野に作り出している。
ＩＩ．音響学原理
[0117]音波はいかなる媒体の中でも動くことができる。音波は圧力波であり、それが通過する媒体に粒子変位を引き起こす。媒体の特性により、媒体は圧力波を増幅するまたは減衰することができる。物質の弾性は、変位した粒子がその元の位置に戻る能力を決定し、これは弾かれた時のギターの弦または最初に押された時のブランコに類似している。

[0118]しかし、音波を考えた場合、粒子変位はブランコのような円弧状の形態では起こらない。むしろ、粒子は波形伝播の方向に単振動で動く。単振動での変位が起こると、粒子は、たとえどのようなレベルの力が最初に粒子に加えられようとも、１秒当たり一定の回数で動く。変位と最初の位置への復帰は振動の周期として起こり、１秒当たりの周期の数は振動数と呼ばれる。音叉などのいくつかの物体は、ほとんどもっぱら１つの振動数で振動するように設計されている。物体が複雑であるほど、その振動数セットはそれだけ広範囲になる。

[0119]音叉は１つの周波数で振動するが、ほとんどの振動が音叉の振動よりも複雑である。圧力波は大部分が正弦波であり、ゼロで開始して、その周期の最大ピークおよび最小ピークに到達し、その後ゼロに戻る。音叉のような物体は、特定の周波数で１つの圧力波のみを経験する。しかし、２つ以上の単純な正弦波を互いに加えると複雑な波形が生じる。複合波は正弦波ではないが、周期で繰り返すので周期的である。複合波が繰り返す最低の周波数は基本周波数と呼ばれる。

[0120]図６に示されるように、基本周波数の倍数は高調波と呼ばれる。しかし、すべての共振周波数が高調波でなければならないわけではない。信号にきわめて不可欠でもある偽ピークが生じる場合がある。これらは倍音であるが、基本周波数の倍数ではないので高調波ではない。

[0121]基本周波数は自然共振周波数としても知られる。なぜならば、基本周波数はペースメーカーに似ており、ペースメーカーは複合音中の他の周波数が従うペースを定めるからである。血液のような流体試料を含む、空気に取り囲まれた物体はすべて固有周波数を有する。系の固有周波数は、駆動力が止まった後その系がその最大の振動を経験する基本周波数である。（振動が外部の力により動かされている場合、最大振動の周波数は自然共振周波数と呼ばれ、この例は押されているブランコの周波数または人の声がワイングラスを割ることができる周波数である）。声がワイングラスを割ることができるのは、音声周波数の駆動力がワイングラスの自然共振周波数に一致すると、最大振動（振幅）を引き起こし、ついにはグラスが粉々になるからである。
ＩＩＩ．生物医学応用での音響学
[0122]音響応答に分化を引き起こす構成成分の物理的特性（すなわち、サイズ、形状）は、音響流体工学で大いに使用されている概念である。研究者たちは、戦略的に置かれた変換器と流路定位を使用して血液試料から構成成分を分離することができるマイクロ流体装置を設計してきた。Ｄｉｎｇらは、血液試料でよく見られる粒子上で経験される音響放射力の分化の概念を使用することができ、良性のヒト白血球からＭＣＦ－７ヒト乳がん細胞を分離することができるマイクロ流体装置を設計した。細胞除去と次にエキソソーム除去モジュールを組み合わせて１つのマイクロ流体発明にして無希釈の全血試料からエキソソームを分離することが可能である。音響放射力の異なる経験は、Ｄｉｎｇが述べているように、「圧力ノードへ移動する異なる時間」を引き起こし、「したがって、分離のためのはっきりした識別子を提供する」。

[0123]図７Ａは、細胞除去およびエキソソーム単離モジュールの模式図を描いており、図７Ｂは、マイクロ流体チップそのもののイメージであり、図７Ｃは、細胞の分離のための圧力ノードのマッピングである。

[0124]その音響特性による細胞成分の分類は、現在では３７５ＭＨｚ中心周波数の変換器およびマイクロ流体流路の通過細胞に焦点を合わせた５３２ｎｍのパルスレーザーと一緒にはめ込まれたマイクロ流体装置などの、光音響法を使用して実施されてきた。その目的は、急速に流れる細胞の特徴を評価することができる音波ベースのフローサイトメーターを開発して、メラノーマ細胞および急性骨髄性白血病細胞で装置を試験することであった。同時の超音波および光音響波伝播に対する細胞音響応答の分光幅を使用してメラノーマ細胞の細胞直径を決定した。他の者は同じ超音波および光音響技法を利用して（音響顕微鏡を使用して）、赤血球、白血球、およびメラノーマ細胞を区別した。彼らは、白血液が光音響信号を発しないことを見出し、このおかげで彼らはメラノーマ由来の細胞と赤血球を区別することができた。
ＩＶ．音響浮揚
[0125]液体と相互作用する超音波を使用することにより、上記はすべて達成することができる。超音波音響浮揚は、物体を空中に保持する音響ツイーザーを使用することにより達成される。浮揚は、物体を引き下ろす重力が反力とバランスが保たれるときに達成される。この場合、反力は音響反射力である。ツイーザーが定在波場を生み出すと、この力は、振幅がゼロである（波は相互作用する場合ノードで互いに相殺する）定在波場のノードと呼ばれる特定の点でそのピーク値に達する。ノードでは、音響反射力は重力のバランスを保つのに十分であり、物体の浮揚が生じるのを可能にする。これらのノードは、組み込まれた参考文献中の音響ツイージングのマイクロ流体応用に記載された圧力ノードに似ている。

[0126]音響ツイージングは、細胞および生物学的液体を操作する生物医学的応用で使用されてきており、汚染または変更された測定値を含む、装置壁との試料接触の潜在的な影響を取り除くその能力のせいで好ましい。音響ツイージングは、光学的ツイージング法に必要な高出力のレーザーと比べると比較的安価でもあり、光学的または磁気的ツイーザーとは違って、ナノメーターサイズの試料との相互作用のために使用することができる。他の方法とは違って、音響ツイージングは細胞構造を損傷しないことが明らかにされており、その生物的適合性を証明している。

[0127]図８は、浮揚液体に対する音響放射力の効果を描く模式図である。ここでは、音響ツイージングを使用して、全血を含む液体試料のレオロジー特性を研究し、音響ツイージング流動測定と呼ばれるレオロジー分析のための新規の非接触法を開発した。その方法は、音響浮揚を使用して、わずか６μＬまたはそれ未満の容量を持つ液体のレオロジー特性を測定する。

[0128]圧力ノードでの浮揚は、装置からの汚染なしで推進力により操作されるように液体試料を単離させる。動的音響ツイージング実験では、変調信号が定在波場に導入される。この変調信号は、声帯を通過して声道に入っていく空気の推進力に類似している。変調信号は流体液滴振動を誘発するが、これは圧力波による粒子変位（振幅）に類似している。最大の振動が生じる周波数はその系の共振周波数である。

[0129]変調信号へのそのような応答は、マラリアに罹った赤血球または鎌状赤血球を区別するのに使用されており、こうした赤血球は正常な赤血球よりもはるかに硬い。硬さは、赤血球が変形する能力に影響を与え、これは以前述べたように、組織毛細管の中を押し分けて進む細胞の能力の不可欠な部分である。全血試料の粘度は試料が振動する能力にも影響を与える。全血は非ニュートン流体であるため、流れへのその抵抗は、細胞成分間の相互作用により生じる非定常剪断率に依存している。したがって、これらの成分（主に赤血球）の特徴は、全血試料の振動に直接影響を与える。
Ｖ．分光分析
[0130]図９Ａに示されるように、信号が記録された後は、推進力の存在に起因する媒体の振動は、系においてそれぞれの周波数での振幅応答を示すグラフであるスペクトル上で分析することができる。スペクトルは、時間領域信号のフーリエ変換の計算の結果である（時間対振幅）。フーリエ変換はそれぞれの周波数でのエネルギーを計算する。フーリエ変換のピークは、その系の共振周波数と見なすことができる。スペクトルは周波数と振幅の間の関係でのもっと量的な観察にとって有用である。なぜならば、正確な値は、スペクトルの対応物である、例えば、図９Ｂに示されるスペクトル写真よりもスペクトルから抽出するほうが容易だからである。

[0131]おそらく音声科学において最も広範に使用されている分析道具として、スペクトル写真は、信号の周波数成分についてだけではなく、それらの周波数での対応する振幅についての情報も提供する。これは、強度によりスペクトル写真上で位置を特定することにより行われ、通常は、強度が大きな部分ほど高い振幅を表す（これは、カラーマップを使用して行われ、黒色と白色が最も典型的である）。より高エネルギーの広い帯域を見つけることによりスペクトル写真上でフォルマント、またはピークは見つけられる。エネルギー帯の中心は、フォルマントの代表的な周波数として選ばれる。

[0132]その振幅以上にフォルマントの質を測定するのに使用することができるもう一つの計量は、品質係数、またはＱ係数であり、ＱＦとしても略記される。Ｑ係数は、ピークの周波数をピークの幅（ピークが作り出すハンプの始まりと終わりに対応する周波数）で割ることにより見い出される。式１：

Ｑ係数は、共振周波数（ｆ０）を共振の帯域幅（ＢＷ）で割ることにより見い出される。
[0133]Ｑ係数は、オシレーターがどのようにして減衰するかの尺度である。減衰は増幅の反対であり、信号を強化する代わりに、減衰は信号品質を低下させる。Ｑ係数が低いほど、減衰は高くなり、共振は弱くなる。図１０に示されるように、本出願では、振幅が高くフォルマントが突起しているほど、それだけＱ係数は高くなる。

[0134]Ｑ係数の値は、系がどのようにして減衰するかを記述している。Ｑ係数＞１／２の系は不足制動応答であり、これを有し、減衰が低いので振動が、振り子のようにもっと長期間持続されることを意味する。Ｑ係数＜１／２の系は過制動系であり、この系の振動はそれほど長くは持続されそうにない。実際、振動は指数関数的に減衰する。Ｑ係数＝１／２の系は決定的に減衰系であり、この系は徐々に定常状態まで上昇する。強い共振系は、より高いＱ係数のあるピークを有する。

[0135]声道のソースフィルター理論という基本原理に従って、動的変調と連結させた音響浮揚を使用して、浮揚流体の振動を誘導する。そのような振動は記録され、次に流体のスペクトルフィンガープリントの図表を作るためにそのスペクトル成分についてスペクトル的に測定される。

[0136]本明細書で開示されるように、本明細書で開示される種々の実施は、一般に１０で示される浮揚および分析システムに関し、これは装置上である特定の方法を実施するツイージングシステムまたは音響レオロジーシステムとも様々に呼ばれる。本明細書で想定されるこれらのシステム、方法および装置は、容易に認識されるように、試料、生物流体、血液および同類のものを浮揚させ分析するための技術のことであると理解されている。

[0137]図１１は、１つのそのようなシステム１０の模式図を描いている。この実施では、システム１０は、組み込まれた参考文献に示されているなどの、浮揚装置（１００）、オシロスコープ（１０２）、ファンクションジェネレータ（１０４）、増幅器（１０６）、変換器（１０８）、反射器（１１０）、および浮揚されている試料（１１２）からなる。搬送波はファンクションジェネレータにより送られ、増幅器により増幅され、その後変換器（１０８）に送られて試料を浮揚させ、そこではその特徴は、本明細書および以下の実施例に記載されるように、記録されて分析される。浮揚装置構成要素および機能に関するさらなる詳細は組み込まれた参考文献に見い出すことができる。

[0138]１つのそのような浮揚システムは、図１２Ａの実施などの実施において利用されることが認識されている。これらのおよび他の実施において、構成要素を使用して種々のステップおよびサブステップを実施する。例えば、図１２Ａの実施では、システムは一般には分析２０４のために浮揚２００および記録２０２を実施するために使用され、これは、容易に認識されるように、浮揚システムでまたは分離処理システム上で行うことができる。種々の実施では、容易に認識されるように、既知のソフトウェアおよびハードウェア構成要素を利用しうる。

[0139]図１２Ａに示されるように、浮揚ステップ（ボックス２００）は、試料上の干渉または信号を含むことができる様々なサブステップを含むことができる。すなわち、種々の実施では、浮揚は、下の図２５Ａ～２５Ｂにさらに示されているように、搬送波信号２００Ａ、変調信号２００Ｂおよび／または掃引信号２００Ｃなどのいくつかのサブステップを含むことができる。

[0140]そのような実施では、システム１０搬送波信号２００Ａを使用して、搬送波の助けを借りて液滴を浮揚させ、この搬送波は、その周波数が最初のファンクションジェネレータにより生み出される変換器の周波数（約２９．５ｋＨｚなどの）である正弦波信号であることができる。多くの他の立体配置および約１５ｋＨｚ未満から約４０ｋＨｚまたはそれ以上までなどの周波数を使用できることは認識される。搬送波周波数および立体配置は、液滴を浮揚装置に置くことができ、何事も行われない場合には液滴がただ静止しているというものであることが認識されている。

[0141]図１２Ａの実施では、変調信号２００Ｂは、特定の振幅および特定の周波数を有する別の正弦波信号である。例えば、１００Ｈｚなどの周波数および１０％の深度を利用することができ、これはこの変調正弦波信号の振幅は、図１３Ａに示される搬送波信号振幅の変調の１０％になることを意味する。駆動信号の上と下の深さのみが変調され、その深さが上と下の深さはどれほどであるのかを決めると理解されている。この例では、液滴は１００Ｈｚ周波数で振動しており、これは顕著な変調である。本明細書で理解されている深さのさらなる説明は、図２５Ａに関連して見出される。当業者であれば理解するように、深さが増加するにしたがって、それだけ振動が観察される。

[0142]システム１０の種々の実施では、変調は掃引される２００Ｃ、すなわち、特定の期間および一定範囲の周波数にわたり液滴に適用される。これは、１００Ｈｚなどの固定された周波数を利用する代わりに、システムは掃引範囲を利用する（例えば、約１０秒などの規定された掃引時間にわたり約１５０Ｈｚ～約５０Ｈｚなどの）ことを意味する。約２０Ｈｚ～約２５０Ｈｚもしくは約５００Ｈｚ、または約１０Ｈｚ～約１ｋＨｚもしくはそれよりも高い周波数、例えば約３０ｋＨｚまでもしくはそれよりも高い周波数などの、様々な周波数および時間を利用することができると認識されている。種々の実施では、掃引は、約１０秒、約３０秒などの秒または数秒、またはそれよりも多い分の範囲の持続期までなどの経過にわたることが可能である。液滴のサイズはこれらの周波数および期間数に影響を与え、経時的な周波数の変化の速度は、液滴の特定の特性、液滴のサイズ、および研究中の特定のパラメータにより変動することが認識されている。

[0143]さらに、掃引２００Ｃはどちらの方向にも、すなわち、高いほうの周波数から低いほうの周波数へ、または低いほうの周波数から高いほうの周波数へ生じることができる。したがって、本考察が第１の周波数から第２の周波数へ言及する場合、容易に認識されるように、反対、すなわち、第２の周波数から第１の周波数へも含意されている。

[0144]種々の実施では、掃引は、変化の速度に基づいて決定され、システム１０は、増加または減少として、約０．１Ｈｚ／秒から約１００Ｈｚ／秒への経時的な周波数の変化などの様々な速度を利用することができる。本明細書で考察されるように、当然のことながら、多くの実施が想定されている。

[0145]例えば、正弦波信号２００Ｂが１０秒間印加され、図２５Ｂに示されるように、その１０秒でその正弦波信号の周波数が約１５０Ｈｚから約５０Ｈｚに（または約５０Ｈｚから約１５０Ｈｚに）掃引される、これは使用者が必要に応じて選択する、場合である。したがって、液滴は変化する振動周波数に晒され、それぞれの周波数について液滴は異なる振幅で振動し、振動振幅は共振周波数で最大である。したがって、その特定の液滴が共振周波数としてその周波数を有する場合、特定の周波数でピークを観察することができる。

[0146]システムの代わりの実施では、掃引は基本振動のために除かれ、例えば、共振からわずかに離れている単一周波数が一時印加されて（例えば、約１０秒間約１２５Ｈｚ）その１つの単一周波数について振動振幅が集められる。１つのそのような例は図３６におよび図１２Ｇにも示されている。

[0147]図１２Ａの実施を続けると、記録ステップ（ボックス２０２）中、生データおよび／または画像が記録され、例えば、それぞれカメラによる画像データおよび／または光ダイオードならびに図１１および図２５Ｃ～２５Ｄに示される。記録ステップのさらなる態様は本明細書で詳細に説明される。

[0148]図１２Ａの実施に示される分析ステップ（ボックス２０４）中、記録ステップ（ボックス２０２）から導かれる生データ（ステップ２Ａ）および／または画像（ステップ２Ｂ）は、分析のために図１１に示される操作システムに入力される。手短に言えば、ある特定の実施では、生データは、抽出２０４Ａなどのいくつかの任意選択のサブステップを介して分析され、振幅周波数応答（ＡＦＲ）曲線２０４Ｂを生み出し、図２５Ｅにも示されているように、ある特定の非限定的例は、曲線下面積（ＡＵＣ）、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）、不安定性の帯域幅、不安定性のＡＵＣ、ＡＦＲ曲線由来などのｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）を含むパラメータ２０４Ｃを回収することができる。

[0149]図１２Ｂの実施に示されるように、分析はＡＦＲ曲線の性質に応じて実施することができ、例えば、１ピークのある平滑（ボックス２１０）、ピークのない平滑（ボックス２１２）または非平滑曲線、複数のピークを有する（ボックス２１４）などの、いくつかのＡＦＲ曲線を同定することができる。

[0150]１ピークのある平滑曲線（ボックス２１０）とは、液滴が安定した四重極振動を受ける状況のことである。振動振幅は共振周波数近くで最も高く、他の周波数では低くなる。これにより、１つの平滑ピークが得られる。これは、図２６Ｂまたは２６Ｃにあるように、安定した共振段階と呼ばれる。これらの状況では、および一般にボックス２１６に示されるように、ＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）および他などのある特定のパラメータを抽出することができる。

[0151]液滴が安定した四重極振動を受けるが、いかなる周波数変化に対しても感受性がないときなどのピークのない平滑曲線（ボックス２１２）では、したがって、ピークが観察されないことも同様に理解されている。これは、図２６Ｃにも示されるように、安定した非共振段階と呼ばれる。この状況でのある特定のパラメータは、ＡＵＣ、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘおよび同類のものである。

[0152]さらに、非平滑曲線は、複数のピークを有する（ボックス２１４）が、液滴が共振周波数近くで不安定な四重極振動を受ける状況のことであり、したがって、いくつかのピークが観察され、不安定なせいでランダムであることが理解されている。これは、図２６Ａ～２６Ｂでなどの、不安定な共振段階と呼ばれる。この状況でのある特定のパラメータは、ＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、不安定性の帯域幅、不安定性のＡＵＣおよび同類のものである。

[0153]図１２Ｂに示されるように、種々の実施で、容易に理解されるように、記録された画像を分析すれば、例えば、落高、幅、アスペクト比、相当半径および体積または他のものうちの１つまたは複数を出力することができる。

[0154]図１２Ｃでは、ある特定の実施で、システム１０は、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｍｉｎおよび／もしくはＡ_ｍａｘまたはＡＵＣから任意選択ステップとして弾性を抽出する（ボックス２２２）。例えば、ある特定の実施では、
[0155]ω＿ｐｅａｋ＝２πｆ＿ｐｅａｋ
[0156]Ｇ＝ｆ（ω＿ｐｅａｋ、半径、密度、表面張力）
によりｆ_ｐｅａｋを抽出することができる２２２Ａ。

[0157]さらに、弾性または弾性率はＡ_ｍｉｎ２２２Ｂから抽出することができ、そこでは安定した共振段階でのＡ_ｍｉｎとＧの間の関係、線形または非線形が確立され、安定した非共振段階中Ａ_ｍｉｎからＧを見つけるのに使用される。

[0158]さらなる実施では、および図１２Ｃの２２２Ｃに示されるように、弾性はＡＵＣから抽出することができ、そこでは上記手順が適用されるが、容易に理解されるように、Ｇを抽出するのにＡ_ｍｉｎの代わりにＡＵＣまたはＡ_ｍａｘが使用される。

[0159]図１２Ｄに示されるように、粘度（ボックス２２４）も、いくつかの任意選択のステップまたはサブステップを介してパラメータから抽出することができる。図１２Ｄの実施では、任意選択のキャリブレーション（ボックス２２６）、実験（ボックス２２８）および計算（ボックス２３０）ステップが実施されるが、当然のことながら他のステップもあり、これらは様々な順番で実施することができる。

[0160]手短に言えば、キャリブレーション（ボックス２２６）中、Ａ_ｐｅａｋ、ＡＵＣおよびＱＦなどのある特定のパラメータを確立するために既知の粘度の流体を用いて標準手順が実施され、検量線を作成する。当然のことながら他のパラメータを使用することができる。

[0161]実験（ボックス２２８）中、実験または試料流体を使用して、Ａ_ｐｅａｋ、ＡＵＣおよび／またはＱＦなどの同じパラメータを抽出する。次に、容易に理解されるように、検量線を使用すれば粘度（ボックス２３０）を確立することができる。

[0162]図１２Ｅの実施に示されるように、方法確認（ボックス２３２）は、本明細書の図２８～３０で考察されるように、例えば、デキストラン、キサンタンガム、ゼラチンおよび他のものを利用し様々な技法を通じて実施することができる。手短に言えば、図１２Ｅに示されるように、ある特定の非限定的例は、粘度確認（ボックス２３４）、一定の粘度および一定の弾性（ボックス２３６）ならびに／または増加する粘度および弾性（ボックス２３８）を含む。

[0163]粘度確認（ボックス２３４）の１つのそのような実施中、いくつかの任意選択のサブステップ、すなわち、異なるデキストラン濃度を用いて基本実験手順を遂行するサブステップ、粘度差に対する感度を示すＡ_ｐｅａｋ、ＡＵＣおよびＱＦパラメータを確立するサブステップ、検量線から推定された粘度にＡＵＣを使用するサブステップ（図１２Ｄに示されている）、報告された値を用いて検証するサブステップおよびＧしたがってｆ_ｐｅａｋに対する任意の効果を確立するサブステップが実施される。本明細書の他の場所および下で考察されるように、当然のことながらさらなる手順が想定されている。

[0164]定数確認（ボックス２３６）の１つのそのような実施中、観察されるＡ_ｐｅａｋ、ＡＵＣ、ＱＦおよびｆ_ｐｅａｋのいかなる違いでも評価するサブステップ、ＡＵＣを利用して基づく粘度を推定し（図１２Ｄ参照）弾性を推定するサブステップなどのいくつかの任意選択のサブステップが実施される。

[0165]粘度および弾性を増やす（ボックス２３８）１つのそのような実施中、粘度を推定するのに使用できるＡＵＣ（図１２Ｄ参照）および／または弾性を推定するのに使用されるｆ_ｐｅａｋ（図１２Ｃ参照）を使用するなどのいくつかのアプローチを利用することができる。さらなるアプローチも当然のことながら可能である。

[0166]図１２Ｆに目を向けると、システム１０のある特定の実施を、例えば、血漿（ボックス２４０）および全血（ボックス２４２）の液滴試料に適用することができる。
[0167]血漿（ボックス２４０）についての、図１２Ｆの実施では、凝固を記録するため指定された時間に基本手順を実施するステップ、ＣＩＴ、ＴＦＣＦ、ＣＴ、ＣＲ、ＭＣＦ、ＴＲＰ（ＴＥＧ粘弾性測定に類似している）などの凝固パラメータを確立するために弾性ツイゾーグラフ（すなわち、経時的なＧ）を抽出するステップ、およびＲＴ、ＦＦＲ、ＭＦＬパラメータを得るために粘性ツイゾーグラフ（ｍｕ対時間）を抽出するステップ（比濁法測定を使用する血漿凝固検査に類似している）を含むがこれらに限定されないいくつかの任意選択のステップを実施することができる。さらなる一連のステップを実施することができ、１つのそのような例は図３１で示されている。

[0168]全血（ボックス２４２）に関しては、および図３２に示されるように、手順は以前記載された手順に類似することができ、粘性ツイゾーグラフおよびパラメータが抽出される。すなわち、そのような実施では、手順は凝固を記録するために指定された時間に全血液滴上で実施され、反応時間（ＲＴ）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ）、最大フィブリンレベル（ＭＦＬ）、凝固時間（ＣＴ）、凝固開始時間（ＣＩＴ）、凝固速度（ＣＲ）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ）、最大凝固硬度（ＭＣＦ）、フィブリンネットワーク形成時間（ＦＮＦＴ）、ＴＲＰ（ＴＥＧ粘弾性測定値に類似している）を含む凝固パラメータを確立するために弾性ツイゾーグラフ（すなわち、経時的なＧ）を抽出し、パラメータを確立するために粘性ツイゾーグラフ（ｍｕ対時間）を抽出する（比濁法測定を使用する血漿凝固検査に類似している）。これらのパラメータのいくつかは、現在開示されている方法ならびに関連するシステムおよび装置の開発までは測定可能ではなかった。これらの測定を通じて、血液凝固形成に必要である、血液試料中のフィブリノーゲンおよび第ＸＩＩＩ因子の機能的レベルを評価する方法を使用することができる。他の流体に適用した場合、その方法は、重合過程にまたは生体組織での線維状タンパク質の形成および架橋結合に関与している分子の活性を検出することができる。血液凝固に適用した場合、開示されたシステムおよび方法は、血液試料を人工試薬（エラグ酸、カオリン）曝露せずにまたは人工表面との試料接触を誘導せずに、全血または血漿の凝固パラメータを測定することができる。

[0169]図１２Ｇに示されるように、システム１０の種々の実施では、構造、質量、細胞数、細胞含有物および同類のものなどの試料の特徴を、全血または血漿などの試料から検出することができる（ボックス２５０）。例えば、図１２Ｇに示されるように、分子量（ボックス２５２）、タンパク質含有量（ボックス２５４）および細胞数（ボックス２５６）を検出することができる。

[0170]この実施では、例えば、分子量は、例えば、ＡＲＦ曲線の違いを確立するために水ならびに種々の低量および高量デキストランでいくつかのステップを実施することにより検出することができ、ＡＵＣ、不安定性帯域幅、不安定性のＡＵＣ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）および同類のものなどの種々のパラメータを抽出できる。

[0171]図１２Ｇを続けると、タンパク質含有量（ボックス２５４）は、例えば、血漿およびＭＳＦ１．２を利用し、アルブミンおよび他のタンパク質を検出するためにパラメータの違いを決定して、類似の様式で決定することができる。別の生物流体を当然のことながら使用できることが認識されている。

[0172]システム１０をさらに使用すれば、所与の試料中のいくつかの細胞を決定することができ、種々の赤血球パーセンテージを有するいくつかの群が評価され、検出されたパラメータの違いを使用すれば試料中の細胞の数を確立することができる。

[0173]図１２Ｈは、図１２Ａで概説されている実験手順のさらなる別の実施を描いており、容易に認識されるように、違いは、掃引２００Ｃが一定範囲にわたりではなく、１つの指定された周波数で起こることである。

[0174]図１２Ｉは、血漿（ボックス２６０）に適用された図１２Ｈの配置の適用を描いており、容易に理解されるようにおよび下の図３６でさらに図解されるように、そこでは再び、いくつかの任意選択のステップ、すなわち、対照および凝固中の血漿上で実験手順を実施してＡＵＣおよび振幅を記録して分析し、群間のＡＵＣおよび／または振幅の違いを確立して、凝固に起因する粘弾性の変化を確立するステップが実施される。さらなる実施が当然のことながら可能である。

[0175]以下の実施例は、当業者に、本明細書で主張される物品、装置および／または方法がどのようにして作製され評価されるか、本発明の純粋な例であることが意図されていること、発明者らが自分たちの発明であると見なしているものの範囲を限定するよう意図されてはいないことの完全な開示および説明を提供するために述べられている。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態において多くの変更を加えることができ、それでも、本発明の精神および範囲から逸脱することなく似たようなまたは類似する結果を得ることを認識するはずである。

実施例１
材料および方法
Ｉ．音響ツイージング
[0176]一実施例では、特注の音響浮揚システムを実験用に使用した。装置の核は変換器および反射器であり、半波長だけ互いに離れて配置されている。搬送波はファンクションジェネレータ（Ａｇｉｌｅｎｔ ３３２２０Ａ Ｓｅｒｉｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）により変換器に送られ、増幅器（Ｋｒｏｈｎ－Ｈｉｔｅ、Ｂｒｏｃｋｔｏｎ、ＭＡ）を使用して増幅され、このようにして定在波場を作り出す。この定在波場は、３０ｋＨｚの変換器としての機能を果たす３．１７５ｍｍ厚の圧電ディスク（Ｃｈａｎｎｅｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）および反射器としての機能を果たすアルミニウムシリンダーの２つにより安定にされる。

[0177]動的音響ツイージング分光学実験では、搬送波の振幅は、第２のファンクションジェネレータを使用して正弦波により変調される。この変調信号は液滴に振動を誘導し、この液滴は定在波場の圧力ノードに置かれ、変調に先立って安定に保たれる。液滴の振動は、液滴と一直線に並べられた光検出器により記録される。閃光装置は光源として使用され、浮遊する液滴および光検出器と一直線に並んでいる。閃光装置は光を光検出器まで通して当てる。液滴が振動すると、液滴は光検出器まで到達する光の量を変える。したがって、光検出器からの出力電圧は、振動している間の液滴の変化領域と線形的に比例している。

[0178]図１３Ａに示されているように、駆動（搬送波）信号は正弦波により変調され、正弦波は変調信号としての機能を果たす。変調された出力は浮揚した液滴からの振動を誘導し、この振動は光検出器装置により記録される。
ＩＩ．試料調製
[0179]概念実証を確立するための試料は、最初に水溶液中５％デキストラン（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓａｌｅｍ、ＭＡ）の基礎液を作製することにより調製された。５％デキストラン濃度は、より安定した振動モードを誘導するその能力により選ばれた。デキストランは、実際、水ベースの流体の粘度を上げるデキストランの能力のせいで、超音波応用のために血液を模倣するように設計された流体を作るのに使用されてきた。デキストランなどのポリマー濃度の増加は、溶液の体積粘性率を増やす。したがって、溶液でのより少ない振動モードがより高い粘度のせいで誘導される（誘導されると試料が振動する傾向を低減する）。さらに、デキストラン濃度が増加しても溶液の弾性を増加させない。システムの変わりやすい変化の数を減らせれば、より安定した対照群が可能になる。

[0180]５％デキストランの基礎液はそれぞれ、５％デキストラン中０．０２５Ｍ、０．０５Ｍ、および０．１Ｍポリスチレンマイクロ粒子の濃度を有する溶液を作り出すために、ポリスチレンマイクロ粒子（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の１０％溶液と混合した。これら３種の溶液由来の液滴は、対照群（ポリスチレンマイクロ粒子のない５％デキストラン）の液滴と一緒に浮揚された。
ＩＩＩ．実験手順
[0181]浮揚装置はこの実施例では２つのファンクションジェネレータを有する。第１のファンクションジェネレータは、搬送波信号を送り出して音響波場を作り出すために使用され、したがって、搬送波の周波数は、液滴を浮揚させるのに必要なノードを活性化するのに十分強力な音場を作り出すために使用者により制御されなければならない。ノードが活性化された後、ピペットを使用して６μＬの溶液を抜き取って、変換器と反射器の間に挟まれた定位波場のノード上に置かれた。音響場が液滴を捕捉してそれを浮揚させるほど強力になった後、特注のＬａｂＶＩＥＷコードは自動的に第２のファンクションジェネレータを始動させて搬送波を変調させる。変調信号としての役目を果たす正弦波は、１０秒間、１５０Ｈｚから５０Ｈｚまでの周波数掃引で搬送波を変調させる。この変調の間、光検出器からの電圧は、データ集録システム（データ集録システム情報はここに置く）を使用して捕捉される。それぞれの濃度（５％デキストラン、３％デキストラン、１％デキストラン、５％デキストランｗ／．１ ＰＳＭＰ、ｗ／０．０５Ｐ ＳＭＰ、およびｗ／０．０２５ ＰＳＭＰ）の６試料が浮揚され（１０％ ＰＳＭＰを除いて、これでは４試料のみが浮揚された）、それぞれの試料について３つの別々の試験が行われた。浮揚期間は１０分間に１分間間隔で行われ、これは、変調信号が１０秒振動を誘導するために１分ごとに変換器に送られたことを意味する。

[0182]図１３は浮揚システムを描いており、スタンドに置かれた自動注射器を使用して６μＬの試料を溶液から浮揚装置のプレート－変換器と反射器－の間に挟まれたノード中に注入する。閃光はカメラ用の光源として使用され、このカメラを使用して浮揚した試料の写真を撮る。加湿器（カメラの後）を使用すれば部屋の湿度を制御できる。図１４では、６μＬの流体試料が浮揚されているが、下は１μＬ未満まで上は１５μＬ、２０μＬまたはそれよりも多い範囲に及ぶ多種多様の試料サイズが種々の実施において想定されていることは容易に認識される。認識されるように、浮揚装置構成要素が調整される場合には、もっと大きな液滴を使用することが可能である。
ＩＶ．信号処理
[0183]次に、生の電圧データを、特注のＭＡＴＬＡＢ（登録商標）コードを通して処理し、このコードは全信号から信号の平均を引いて、信号末端でノイズピークを取り除き、信号を正規化し、ノッチフィルターを適用して６０Ｈｚでの電線ノイズピークおよびそれに続く高調波を取り除いて、信号の長さにわたってハミング窓を適用した。

[0184]図１５に示されるように、光検出器により記録される電圧は液滴の面積と線形的に比例している。電圧（振動信号）は帯域フィルターを通じて流され、６０Ｈｚ整数倍で電気ハムノイズを取り除く。次に、高速フーリエ変換が信号を時間領域から周波数領域に転換する。
Ｖ．信号分析
[0185]もう１つの特注のＭＡＴＬＡＢ（登録商標）コードは、処理された信号の高速フーリエ変換を取るように書かれ、信号を時間領域から周波数領域に転換する。取った後は、ピーク幅および最小ピーク距離についての特定の閾値を使用するピーク検出を使用してスペクトル中の特有のピークを単離し、最も突出したピークを記録した。同じＭＡＴＬＡＢ（登録商標）コードは、２５０秒の窓サイズを使用して処理された信号のスペクトル写真を作成するようにもプログラムされていた。スペクトル写真の最も突出したエネルギー帯を記録し、次に、フォルマント検証のためスペクトルの突出したピークと交差適合させた。最後に、Ｑ係数を使用して共振ピークのシャープネスを分析した。

[0186]図１６に図解しているように、包絡線はＦＦＴよりもよりもはるかに平坦な曲線であり、したがって、共振ピークを見積もる場合に作業に用いるのがはるかに申し分ない。ピーク識別は、ピーク幅および突出閾値を介して実施され、次に、それぞれの共振ピークの品質係数が計算される。
結果
Ｉ．フォルマント抽出
[0187]図１７Ａ～Ｃは、不必要な変動およびノイズを取り除くために信号（Ａ）がどこでフィルターされ標準化されているかを示すグラフを描いている。次に、得られた信号（Ｂ）を高速フーリエ変換を使用して周波数領域で分析し、この変換により分析のため明確な共振ピークが強調される（Ｃ）。

[0188]図１８Ａ～Ｃは、高速フーリエ変換（Ａ）、スペクトル包絡線（Ｂ）およびフォルマントのピッキング（Ｃ）を描いている。観察できるように、包絡線ははるかに平坦であり、ピークはよりはっきりしており、システムの共振のより容易な識別が可能になっている。

[0189]高速フーリエ変換は、大半の浮揚した試料では、３つのはっきり異なる共振ピークを明らかにし、それぞれが約５０～６０Ｈｚ、約９０～１１０Ｈｚ、および約１２０～１２５Ｈｚの間をうろついている。これらの共振領域のそれぞれから正確な振幅および周波数を調べるためには、ＲＭＳアルゴリズムに基づく包絡線抽出関数が、正しいフォルマントを選び抜くための最良の方法であった（緑色で）。
ＩＩ．対照選択の立証
[0190]１％デキストラン、３％デキストラン、および５％デキストラン溶液の試料を浮揚させて、共振ピークに対するより高いデキストラン濃度の効果を研究して、溶液の粘度に対してより高いデキストラン濃度が有する効果が共振ピーク（この場合は、共振ピークの変動性）または振動モードの数を下げると考えられるか検証した。

[0191]図１９は、その結果を描いており、そこでは５％デキストラン（緑色で）はシステムの振動モードの数を下げる。なぜならば、デキストラン濃度が高いほど試料の全体の粘度を増やすからである。試料の粘性が高いほど、試料が有する振動モードの数は少なくなる。１％デキストランは水に非常に類似する挙動を示す。
ＩＩＩ．試薬のフォルマント周波数分析
[0192]複雑な組成はその内部成分の共振を描くと考えられるスペクトルを形成するという最初の仮説を直接試験し検査するため、水溶液中その個々の試薬、５％デキストラン溶液および１０％ＰＳＭＰを混合する前に最初の形態として浮揚させた。

[0193]図２０Ａ～Ｂに示されるように、（Ａ）での３つの共振ピーク（２つはピンク色、１つは緑色）は正常な振動曲線が互いの上に重なるときに見い出される。（Ｂ）は、すべての試験についてすべての時点で浮揚されたすべての試料のすべての共振を示しており、ＰＳＭＰについてはより高い数をはっきり示している。
ＩＶ．組成のフォルマント周波数分析
[0194]．１ ＰＳＭＰ、０．０５ ＰＳＭＰ、０．０２５ ＰＳＭＰの浮揚した試料および５％デキストランの対照群の振動信号が得られ、前のセクションで説明された通りに分析された。特に、．１ ＰＳＭＰ試料に見られる４番目のピークの著しいピーク低下は、典型的には５分間の実験後に観察された。したがって、ここで示されたデータ解析は、試料の５分間までの１分の時間間隔で観察された振動のものである。２元配置分散分析検定は、その時間が、振動曲線のピークフォルマント周波数値の変動に対していかなる有意な効果もない（ｐ＝０．０７０８）ことを明らかにしていたが、ＰＳＭＰ濃度それ自体はピークフォルマント周波数値の変動に対して有意な効果を有していた（ｐ＝０．００１２）。

[0195]図２１Ａ～Ｂに示されるように、いずれかのプロットで見るほうがむつかしいが、図２１Ａでは、ＰＳＭＰの濃度が増加するにしたがってＦ０、ならびに黒色の追加の共振ピークにシフトを見ることができる。図２１Ｂでは、すべての試験についてすべての時点ですべての試料の共振。

[0196]この効果をさらに調べるため、直接分析用に振幅による最高のフォルマント周波数値を選んだ（最高ではＦ０、上から２番目ではＦ１）。これは、検査されたその他の濃度では１つだけの高振動モードと対照的に、０．１ ＰＳＭＰ試料では２つの高振動モードが誘導されるという知見を得るために行われた。２つの高振動モードを有する試料は、１つの振動モードを有する試料よりもＦ０に近いＦ１周波数値を有する可能性があった。

[0197]図２２Ａ～Ｄに示されるように、時間は、Ｆ０周波数値に対して有意な効果を有すとは見い出されなかった（ｐ＝０．０７０８）が、時間は確かにＦ１周波数値に影響を及ぼした（ｐ＝０．００３７）^＊＊＊。浮揚した試料中のマイクロ粒子の濃度は、Ｆ０およびＦ１について有意な効果を有していることが分かった（ｐ＝０．００１２およびｐ＝０．００３２）^＊＊＊。

[0198]図２２Ａに見えるように、時間は、検査された濃度群間でピークフォルマント周波数値（Ｆ０）の値に対して有意な効果を有していなかった。しかし、時間（ｐ＝０．００３７）は、ＰＳＭＰ濃度（ｐ＝０．００３２）と一緒に、Ｆ１周波数値に対して有意な効果を有しているのが見られた（図２２Ｃおよび２２Ｄ）。共振ピークの品質が時間とともに減少するのが観察され、したがって、この現象をさらに調べるため共振ピークのそれぞれのＱ係数を計算した。
Ｖ．フォルマントＱ係数分析
[0199]それぞれのＦ０およびＦ１共振ピークのＱ係数は、それぞれの濃度由来の試料について計算された。同様に、フォルマントの周波数値、時間はどちらも、Ｆ０（ｐ＝．１０９５）またはＦ１（ｐ＝．０９７４）におけるＰＳＭＰ濃度間のＱ係数平均の変動に有意な効果（図２２Ａおよび２２Ｃ）を引き起こすとは見出されなかった。濃度はＦ０においてのみ平均変動に有意な効果を引き起こす（図２２Ｂ）ことが見出され（ｐ＜０．０００１）、Ｆ１では見い出されなかった（ｐ＝．４８７１）。

[0200]図２３Ａに示されるように、時間はＦ０（ｐ＝．１０９４）でも（図２３Ｃ）Ｆ１（ｐ＝０．０９７４）でもＱ係数値に対して有意な効果を有するとは見い出されなかった。浮揚した試料中のマイクロ粒子の濃度はＦ０ Ｑ係数値のみに影響を与えることが見い出され（ｐ＜０．０００１）^＊＊＊、Ｆ１ Ｑ係数値では見い出されなかった（ｐ＝．４８７１）。

[0201]図２４Ａは、それぞれの時点での異なる濃度のＦ０共振ピークのＱ係数の平均のプロットを描いている。図２４Ｂでは、Ｆ０についてのＱ係数値の平均は、濃度とＱ係数の間で線形傾向を示した（Ｒ２＝０．８８５）。

[0202]．１ ＰＳＭＰのＦ０についてのＱ係数は、その他の濃度由来のＱ係数の平均よりも一貫して高い（図２７Ａ）。それぞれの濃度についてそれぞれの時点でのすべてのＱ係数の全平均の線形回帰分析は、．８８５というＲ二乗値をもたらし（図２７Ｂ）、５％デキストラン中のＰＳＭＰの濃度がＱ係数と直線関係を有することを含意する。

実施例２
材料および方法
[0203]２５℃で１０．０ｍＰａ．ｓ、６．０ｍＰａ．ｓ、４．０ｍＰａ．ｓ、２．０ｍＰａ．ｓ、１．６ｍＰａ．ｓおよび１．２ｍＰａ．ｓの対応する粘度を有する医学粘性標準ＭＧＶＳ１００（ＭＳＦ１０）、ＭＧＶＳ６０（ＭＳＦ６）、ＭＧＶＳ４０（ＭＳＦ４）、ＭＧＶＳ２０（ＭＳＦ２）、ＭＧＶＳ１６（ＭＳＦ１．６）およびＭＧＶＳ１２（ＭＳＦ１．２）が購入される（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）。異なる濃度のデキストラン溶液は、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）菌種由来の２００００００ＭＷデキストラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）およびデキストランＭＷ３５０００～４５０００（ＵＳ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｓａｌｅｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に溶解させることにより調製される。同様に、ザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）由来のキサンタンガム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）とゲル強度２００、Ａ型のブタ皮膚由来のゼラチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を蒸留水で混合して所望の濃度を達成した。キサンタンガムは室温で２～３時間溶解させておき、ゼラチン混合物は３７℃の水浴中に少なくとも３０分間保って溶解させる。

[0204]血漿研究では、対照の正常なレベル１ヒト血漿（ＲＥＦ１００５９）、活性化部分的トロンボプラスチンＴｉｍｅ ＡＰＴＴ－ＸＬ（エラグ酸活性化因子）を（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入し、塩化カルシウム粉末（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を購入した。血漿凝固の固有の経路は、血漿をＡＰＴＴ－ＸＬおよび０．２ＭのＣａＣｌ_２の特注レシピと混合することにより開始させる。血漿とＡＰＴＴ－ＸＬ試薬混合物は固有の経路として使用される。全血は、ボランティアからヒト対象ＩＲＢプロトコルを使用してクエン酸ナトリウムチューブに収集される（青色上）。全血凝固は、血漿の固有の経路に類似する固有の経路で開始される。１０％の洗浄プールされたヒツジ赤血球は、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．（Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）から購入される。１０％溶液は等量のＰＢＳでさらに希釈して、５％ＲＢＣ溶液を得る。
Ｉ．装置設定
[0205]音響ツイージングシステムは研究所において特注で組み立てられた。この音響ツイージングシステムの模式図は図２５Ａに示されている。システムの１つの鍵となる構成要素は、２９．５ＫＨｚのオーダーで固有振動数を有する変換器、変換器表面から半波長距離に置かれた反射器表面からなる音響浮揚装置からなる。この実施例では、２つの信号発生装置（Ａｇｉｌｅｎｔ ３３２２０Ａ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、それぞれの信号発生装置からそれぞれ発生される静的信号と変調信号の両方を含む駆動信号を生み出すように配置される。図２５Ｂに表示されるこの組み合わされた駆動信号は（Ｋｒｏｈｎ－Ｈｉｔｅ ７５００、Ｂｒｏｃｋｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）で増幅され、変換器に送られる。デジタルカメラ（ａｃＡ１９２０－２５ｕｍ、Ｂａｓｌｅｒ、Ａｈｒｅｎｓｂｕｒｇ、ＧｅｒｍａｎｙまたはＨｏｔＳｈｏｔ ＨＳ ＭｅｇａＸ３ＣＣ、ＮＡＣ Ｉｍａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して、液滴のサイズを追跡するため実験中一定の間隔で同じ液滴の画像を撮影する。光検出器（ＤＥＴ １００Ａ Ｓｉ Ｂｉａｓｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、３５０－１１００ｎｍ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ Ｉｎｃ．Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）および集光光源（Ｏｄｅｐｒｏ ＫＬ５２Ｐｌｕｓ Ｚｏｏｍａｂｌｅ Ｈｕｎｔｉｎｇ Ｆｌａｓｈｌｉｇｈｔ、Ｏｄｅｐｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ、Ｓｈｅｎｚｈｅｎ、Ｃｈｉｎａ）設定を使用して、Ｈｅ－Ｎｅレーザーの代わりに集光光源を使用すること以外に、鉛直ひずみ、すなわち、記載されている形状振動に類似する形状振動中の同じ液滴の高さの変化を追跡する。この実施例では、集光がひずみを追跡するのに十分良好であり、そのような設定でレーザーを使用するよりも安価で安全な代替手段として機能することが観察された。光ダイオードの出力電圧は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）データ集録システム（ｃＤＡＱ－９１７１ ＣｏｍｐａｃｔＤＡＱ ｃｈａｓｓｉｓ ｗｉｔｈ ＮＩ－９２３９ Ｃシリーズ電圧入力モジュール）およびＤＡＱＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して集録され、さらなる信号処理およびパラメータ抽出はＭＡＴＬＡＢ（登録商標）で行われる。

[0206]本明細書で使用される場合、深さとは、［変調信号の振幅＝搬送波信号の深さ^＊振幅］ならびに深さが０と１Ｖの間にある場合、０＝０％および１＝１００％；１０％の深さ＝０．１Ｖであるような搬送波信号の振幅上の変調信号の所与の振幅であり、約５０％までの深さが想定されている。

[0207]例えば、図２５Ｂでは、黒色の信号はＡの振幅を有する搬送波信号であり、１０％深さが使用されたので、ピンク色の信号（変調信号）は、容易に認識されるように、上の式に基づいて０．１Ａの振幅を有する。
ＩＩ．実験手順
[0208]２９．５ＫＨｚの正弦波信号は静的信号として機能し、音響定在波動場を生み出して試料液滴を浮揚させる（典型的には容積約６μｌ）。静的信号振幅の１０％を有し短期間の間Ｈｚのオーダーで一定範囲の周波数で掃引きされた別の正弦波信号は、掃引周波数の範囲内で試料液滴の形状振動を生じさせることにより強制的液滴ひずみを誘導する変調信号として機能する。図２５Ｃは、カメラに捕らえられた形状振動を受ける一連の浮揚血液滴を示した。エッジ検出アルゴリズムで特注で書かれたＭＡＴＬＡＢ（登録商標）コードを使用して、幅、高さ、アスペクト比および相当半径を含む液滴寸法を抽出する。図２５Ｄは、単一振動数掃引中の試料液滴応答を表している。

[0209]別段言及されなければ、変調信号は、１０Ｈｚ／秒の速度で約１５０Ｈｚから約５０Ｈｚまで掃引きされる。約１Ｈｚからの任意の範囲などのさらなる範囲の周波数が当然のことながら想定されることは容易に認識される。

[0210]液滴応答の上および下包絡線は、特注のＭＡＴＬＡＢ（登録商標）コードを使用して得られた。両方の包絡線間の差は、周波数の関数としてピーク振幅までの全体ピークを表している。したがって、振幅周波数応答（ＡＦＲ）（図２５Ｅ）は、それぞれの液滴応答について得られ、この液滴応答は掃引きが実施される周波数範囲の関数としてピーク振幅までの全体ピークを表している。液滴が最大ひずみを受ける周波数（ｆ_ｐｅａｋ）、最大ひずみ振幅（Ａ_ｐｅａｋ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、品質係数（ＱＦ）、変調された周波数の最小値での振幅（Ａ_ｍｉｎ）および変調された周波数の最大値での振幅（Ａ_ｍａｘ）を含むいくつかのパラメータがＡＦＲ曲線から抽出された。品質係数は：

としてＡＦＲ曲線から測定され、
[0211]そこでは、

はＡ_ｐｅａｋの半分の値での周波数である。ピーク周波数は、Ｈｚでｆ_ｐｅａｋとしてまたは秒^－１でω_ｐｅａｋ＝２πｆ_ｐｅａｋとして報告される。
ＩＩＩ．粘度測定
[0212]マーストン理論式の簡略版は、以前、粘度を推定するため形状振動中の周波数に関して液滴の歪み応答を適合させるのに使用された。この実施例では、この式の別の形式、数値解析において下に与えられる式（３）を使用して、振幅周波数応答曲線および既知の粘度を有する医学標準流体についての曲線からそれぞれのパラメータを作成し：

[0213]そこではｘは振幅応答であり、Ａは駆動振幅であり、ωは変調振動数であり、σは表面張力であり、ρは密度であり、μは粘度であり、Ｒは液滴の半径である。モデルから得られるパラメータを、実験的に得られたパラメータと比較され互いに関係付けて、モデルの補正を得る。この実施例は、この文書ではそのような解析のためのパラメータとして液滴体積およびアスペクト比に基づいて正規化されたＡＵＣを選択する。しかし、残りのパラメータに関しても同様に類似する解析を行うことができる。次に、補正をモデルに適用して、その粘度を決定することになっているそれぞれの試料について医学標準流体の粘度に基づいて独特な検量線を作成した。この場合では、検量線は、粘度対正規化されたＡＵＣのプロットであり、このプロットから試料の粘度はその実験的に得られた正規化されたＡＵＣ値に基づいて決定される。
ＩＶ．弾性測定
[0214]弾性率（Ｇ）は、中で行われる分析に類似しているがケルビンフォークト粘弾性モデルを使用することにより、粘弾性液滴の形状振動の理論的分析を行うことにより得られる式から評価される。

[0215]図２６Ａ～Ｃは、（Ａ）医学標準流体ＭＳＦ１．２（黒色）、ＭＳＦ１．６（ピンク色）、ＭＳＦ２（緑色）、ＭＳＦ４（紫色）、ＭＳＦ６（ラベンダー色）、ＭＳＦ１０（青色）、（Ｂ）分子量２００００００（ピンク色）、２００００（青色）のデキストラン５％（ｗ／ｖ）溶液、（Ｃ）時間０分（青色）、２．５分（ピンク色）および５分（緑色）での市販の血漿（破線）ならびにＡＰＴＴおよびＣａＣｌ_２で処理された市販の血漿（実線）の振幅周波数応答曲線を描いている。

[0216]弾性率を測定する能力は、ω_ｐｅａｋを測定することができることに依存していることに留意されたい。しかし、ω_ｐｅａｋは、実験の共振段階でのみ測定可能であり、非共振段階では測定できない。共振と非共振段階は図２６Ｃに描かれており、次のセクションで詳細に説明される。Ａ_ｍｉｎパラメータはω_ｐｅａｋと類似する様式で変動することが観察されている。したがって、非共振段階でのＧ値は、共振段階でのＧとＡ_ｍｉｎの間の関係に基づいてＡ_ｍｉｎから推定することができる。
結果
Ｉ．振幅周波数応答曲線
[0217]図２６Ａは、１．２ｃＰから１０ｃＰまで変動する異なる粘度の医学粘度標準（医学標準流体（ＭＳＦ）とも呼ばれる）の振幅周波数応答曲線を示している。この実施例は、高粘度液滴と比べて低粘度液滴について複数のピークが観察されることに注目している。複数の共振ピークがあるように見えるが、ところが実はフォーシング中に四重極形状振動を受けている液滴のエネルギーは、その共振周波数に近づく場合他の振動モードに変換され、共振周波数から遠ざかるにしたがって、液滴は四重極振動に戻っていく。このために、観察される２つまたはそれよりも多いピーク間のどこかにある１つの真の共振ピークの代わりに２つまたはそれよりも多いピークが人為的に現れる。粘度が低くなるにしたがって、２つのピークの出現の間に約２１．５Ｈｚ差を有するＭＳＦ１．２の場合に見られるように、これが起こる共振周辺にそれだけ広い範囲の周波数が存在する。しかし、粘度が増加するにしたがって、複数のピーク間のこのギャップは減少する。なぜならば、その差は、それぞれＭＳＦ１．６、ＭＳＦ２、ＭＳＦ４、およびＭＳＦ６では、それぞれ約１４．６．８Ｈｚ、１３．１Ｈｚ、１２．９Ｈｚおよび８．２Ｈｚまで減少するからである。

[0218]この問題はＭＳＦ１０ではすべて消滅する。これは、粘度が低いほうの試料は、粘度が高いほうの試料と比べて共振近くの四重極振動にとどまる安定性が低いことを示唆している。とは言え、この実施例では、室温での粘度がＭＳＦ１．２～ＭＳＦ２の範囲内である血漿において同じ挙動は観察されなかった。さらに調べるため、この実施例では、５％（ｗ／ｖ）デキストラン溶液（図２６Ｂ）、低いほうの分子量（ＭＷ３５０００～４５０００）の溶液、および高いほうの分子量（ＭＷ２００００００）の溶液のＡＲＦ曲線を比較した。この実施例では、ＭＷ２００００００のデキストラン溶液での１つだけのピークと比べてＭＷ３５０００～４５０００のデキストラン溶液では複数のピークの出現が観察された。２つのデキストラン溶液間の粘度の違いは、ＭＳＦにおいて観察された挙動に類似して、この挙動の明白な理由であると思われるが、別の鍵となる違いは溶液内でのポリマー鎖の分子構造および絡み合いである。分子量が低いほうのデキストラン溶液と比べて分子量が高いほうのデキストラン溶液が安定な線維構造を形成する能力により、四重極振動中分子量が高いほうのデキストラン溶液のほうが安定している理由を説明しうる。血漿中でのアルブミン、グロブリン、フィブリノーゲンおよび同類のものなどのタンパク質の存在が、血漿の粘度のほうが低いにもかかわらず、血漿を安定化することに関与している可能性がある。

[0219]図２６Ｃは、それぞれ０、２．５および５分での未処理血漿（破線で）および再石灰化された血漿（実線）のＡＦＲ曲線を示している。この図は、ピーク振幅の減少ならびにピーク周波数の左への、すなわち、さらに高い周波数のほうへのシフトをもたらす経時的なＡＦＲ曲線の減衰を説明するのが狙いである。未処理の血漿の場合、経時的に弾性の変化は予想されず、ピーク振幅の減少は主に粘度減衰に帰せられ、これにより５分でおおよそ０．２Ｖ振幅が減少する。蒸発により引き起こされる液滴の有効半径のわずかな減少により、ピーク周波数の約５Ｈｚのシフトも観測される。しかし、再石灰化された血漿の場合、２．５分でのピーク振幅の類似する減少およびピーク周波数のシフトがあるが、５分ではピーク振幅の著しい降下ならびにピーク周波数のシフトがある。これは主に、凝固に起因する血漿の粘度と弾性の両方の増加に帰せられる。この時点で、ピークが観察されない共振段階から非共振段階へのシフトがあり、したがって、ピーク振幅、ピーク周波数および品質係数などのパラメータを測定することができない。しかし、この実施例では、非共振段階でもＡＵＣ、Ａ_ｍｉｎおよびＡ_ｍａｘのような他のパラメータを測定することはまだ可能であった。これは、この実施例が正規化されたＡＵＣを選んで粘度を測定するための検量線を作成した主な理由の１つである。なぜならば、ＡＵＣは共振と非共振段階の両方で測定することができるからである。
ＩＩ．医学標準流体
[0220]図２７Ａは、異なる医学標準流体について測定されたピーク振幅を示しており、半径で正規化された対応するピーク周波数が図２７Ｂに示されている。Ａ_ｐｅａｋは、より低い粘度がより高いピーク振幅値をもたらす試料粘度に対して感度がよいパラメータであり、ω_ｐｅａｋは弾性に対して感度がよくω_ｐｅａｋが高いほどより高い弾性を示す。この実施例では、粘度４ｃＰ、６ｃＰおよび１０ｃＰを有するＭＳＥ４、６および１０の間のＡ_ｐｅａｋ値間に有意差が観察され、これらの標準間では弾性に差がないので予想通りピーク周波数に有意差は観察されなかった。ＭＳＦ４および６の場合共振近くでエネルギーがある程度消失するが、それが測定されたピーク周波数に対して大きな影響を与えることはなく、振幅はこれが起きる比較的小さな範囲の周波数に起因しうる。しかし、ＭＳＦ１．２、１．４および２では、起きる消失は、測定された最高のピークが真の共振ピークから十分離れているほど十分大きく、予想される効果はそれほど優位ではない。したがって、Ａ_ｐｅａｋを使用すれば単一の大きなピークが存在する場合は粘度を測定することができるが、複数のピークが存在する場合には信頼するに最良のパラメータではない。図２７Ｃは、この実施例で検査された異なるＭＳＦについての正規化されたＡＵＣパラメータを示しており、これが粘度を測定するのにより優れたパラメータであり、四重極振動が不安定であり複数のピークを引き起こすとしてもその効果は有効であることを示唆している。これを立証するため、この実施例では、式（３）を使用して理論的モデルからＭＳＦについての正規化されたＡＵＣを数値的に推定し、それを正規化されたＡＵＣ測定実験と比較した（図２７Ｄ）。スピアマンの順位相関を実施すると、この実施例では、^＊＊優位性のある１の係数を確立し、正規化されたＡＵＣが粘度を推定するのにより優れたパラメータでありうることが確かめられる。さらに、モデルと比べて実験由来の正規化されたＡＵＣ間には直線関係が存在すると思われ、粘度検量線を作成するための補正として使用される。
ＩＩＩ．デキストラン
[0221]この実施例がこの技法を適用して、異なる体積粘性を有するが体積弾性がないニュートン流体の粘度を測定することができるかどうかを試験するため、開示されたシステム１０の態様を、１から５％（ｗ／ｖ）まで変動する濃度のデキストラン溶液（ＭＷ ２００００００）での実験において利用した。共振近くでの他のモードの振動への短いスイッチは１および２％溶液では観察されるが、３、４または５％では観察されない。したがって、１％および２％では、ＱＦはＡ_ｐｅａｋほどうまくは計算できず、ｆ_ｐｅａｋは真の値からわずかに外れている。すべての濃度間の体積粘性差は、Ａ_ｐｅａｋ（図２８Ａ）と正規化されたＡＵＣ（図２８Ｄ）の両方により捕捉され、３％～５％溶液ではＱＦ（図２８Ｂ）により捕捉される。この実施例では、デキストランでは体積弾性がないので正規化されたω_ｐｅａｋにいかなる違いも観察されなかった。ＭＳＦを使用して作成された検量線から、デキストラン溶液の粘度は推定されてきた（図２８Ｅ）。変動する温度でデキストラン溶液３、４および５％の粘度が報告されており、図２８Ｅでは破線として表されている。報告されている値と比べてシステムからの粘度の計算でのエラーは、３％デキストランでは約１４．９％、４％デキストランでは０．６％および５％デキストランでは３．７％である。測定のエラーは、溶液調製での違いに起因しうるが、同じデキストラン粉末が使用されている。この実施例では、ＰＢＳを使用したが、デキストラン溶液を調製するためには異なるストック溶液を使用したことに留意されたい。
ＩＶ．キサンタンガム
[0222]この技法をどのように使用すれば粘度と弾性の両方を検出できるかを決定するために、この実施例では、濃度０．１、０．２および０．３％（ｗ／ｖ）のキサンタンガムを試験した。これらの流体は一定の粘弾性を示し、濃度が高いほど高い体積粘性および弾性をもたらす。図２９Ａは、ガム濃度の増加とともにω_ｐｅａｋの値は増加するが、時間とともに変化は観察されないことを示している。弾性率は、ω_ｐｅａｋ値に基づく式（４）から計算され、図２９Ｂに示されている。予想通り、０．３％ガムのほうが、それぞれ約７Ｐａおよび４Ｐａを有する０．２および０．１％ガムと比べて約２２Ｐａの高い弾性率を有し、５分後でさえおおよそ同じままである。図２９Ｃは、正規化されたＡＵＣがガム濃度の増加とともに減少することを示しており、０．３％ガムが０．２および０．１％と比べて高い粘度を有することを示している。さらに、正規化されたＡＵＣに時間による有意な変化はない。図２９Ｄは、ＭＳＦの検量線から推定される粘度値を示しており、０．１、０．２および０．３％キサンタンガムでは平均粘度はそれぞれ６．６ｃＰ、１０．２ｃＰおよび１３．５ｃＰである。粘度の増加は５分で注目されている。キサンタンガムの粘度は経時的に変化するとは予想されていないが、これは、蒸発による液滴内での粘度の見かけの増加のせいで観察される。
Ｖ．ゼラチン
[0223]開示されたシステムおよび方法を一定の粘弾性的挙動をするキサンタンガムのような材料に適用した後、この実施例は、重合およびゲル化に起因する経時的な体積粘弾性の増加を特徴とするゼラチン溶液でこれを試験した。異なる濃度のゼラチン溶液は、異なるゲル加速度を示す。この実施例では、２、３および４％のゼラチン溶液を試験してゲル化過程でのその粘度および弾性を評価した。図３０Ａおよび図３０Ｂは、異なるゼラチン濃度での時間によるそれぞれω_ｐｅａｋおよびＧの変化を示している。ゲル化は４％ゼラチンで急速に開始され、８分以内に最大ゲル化の約４９Ｐａに到達するまで体積弾性を増やし続け、その後、非共振段階が始まるとω_ｐｅａｋは姿を消す。Ｇは３％ゼラチンでは１２．５分で約４３Ｐａに、２％ゼラチンでは２０分で約３４Ｐａに到達した。これは、体積弾性の変化を首尾よく測定でき、この技法がゼラチンの異なる濃度間で見られる異なるゲル化速度に対しても感度がよいことを実証している。図３０Ｃおよび図３０Ｄは、異なる速度でゲル化を受けている異なるゼラチン溶液での正規化されたＡＵＣおよび粘度の変化を示している。正規化されたＡＵＣはそれぞれのゼラチン液滴で減少し続けて、ゲル化中の粘度の増加を示しており、それぞれの試料がゲル化を受ける速度に対して感度がよい。粘度は、２％ゼラチンでは１分以内に約４９ｃＰから１６０ｃＰまで増加し、その後約１０．５分で２００ｃＰの飽和に到達し、３％ゼラチンの粘度は１分で８０ｃＰから１７５ｃＰに進みその後２．５分で２００ｃＰで飽和し、４％ゼラチンの粘度は１２７ｃＰで開始して３０秒以内に２００ｃＰまで飽和する。この実施例ではこれらのゼラチン溶液について異なる最初の粘度を測定することができたが、ゼラチン溶液はすべて２００ｃＰまで飽和し、液滴が３０秒から２分以内に液体状からゲル状にすでに変わっていることを示している。
ＶＩ．血漿
[0224]開示されたシステムおよび方法を使用すればゲル化／重合中の液滴の粘弾性変化を測定することができるので、この技法を血漿に適用すれば、凝固中の粘弾性の変化を推定することができる。図３１Ａは、未処理の血漿（対照群）ならびに凝固を開始するためにＡＰＴＴ試薬で処理され再石灰化された血漿について弾性率の変化ならびに凝固群についてＡ_ｍｉｎから推定されるＧ値を示している。この実施例では、対照群では体積弾性の変化はないが、凝固群では５分で平坦域に到達するまで弾性の増加が観察された。Ａ_ｍｉｎから推定されるＧ値は、式（４）から計算されるＧに類似して変化しているように思われ、Ａ_ｍｉｎからのＧ推定が非共振段階での有効なアプローチであり、弾性率を測定するために信頼して使用することができることを証明している。図３１Ｂは、対照群および凝固群の粘度の変化を示している。血漿の最初の粘度は約１．３７ｃＰだと推定され、この粘度は血漿粘度の以前報告された値に一致しており、飽和前に６分で約３．５ｃＰまで到達した。一方、対照血漿の粘度も１０分で約２．４ｃＰまで増加する。凝固することはできないので、この見かけの増加は主に液滴蒸発に帰せられる。しかし、凝固群でも液滴蒸発があり、優性効果は凝固である。図３１Ｃは、対照群と凝固群の粘度間の差を示している。この曲線は、蒸発の効果を取り除いているので、凝固形成に起因する粘度の絶対変化を示している。この曲線は、凝固形成までの間の臨床情報を引き出すのに価値がある。

[0225]図３１Ｄは、凝固パラメータ、凝固群について粘度ツイゾーグラフから抽出される反応時間（ＲＴ）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ）および最大フィブリンレベル（ＭＦＬ）を示している。ＲＴは粘度変化の開始時間であり、ＦＦＲは時間による粘度の最大変化速度であり、ＭＦＬは平坦域での最大粘度である。図３１Ｅは、凝固パラメータ－凝固開始時間（ＣＩＴ）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ），凝固時間（ＣＴ）、凝固速度（ＣＲ）、最大凝固硬さ（ＭＣＦ）およびピークに到達するまでの時間（ＴＲＰ）を示している。ＣＩＴは、血漿弾性変化の開始を示しており、ＴＦＣＦは凝固硬さが平坦域に到達するまでにかかる時間であり、凝固時間はＣＩＴとＴＦＣＦの間の差であり、凝固開始から平坦域に到達するまでの全時間を示しており、ＣＲは弾性変化の最大速度であり、ＭＣＦは平坦域に到達した弾性率の最大値であり、ＴＲＰは弾性の最大変化速度に到達するまでの時間である。

[0226]図３２Ａは、ａＰＴＴ試薬およびＣａＣｌ_２で処理された凝固クエン酸全血の弾性ツイゾーグラフを示しており、このツイゾーグラフから抽出される凝固パラメータＣＩＴ、ＴＦＣＴ、ＣＴ、ＣＲおよびＭＣＦは図３２Ｃに示されている。粘度ツイゾーグラフは図３２Ｂに示されており、粘度ツイゾーグラフから抽出されるパラメータＲＴ、ＦＦＲおよびＭＦＬは図３２Ｄに示されている。伝統的に、フィブリン動態は、血漿からのみ測定され全血からは測定されない。なぜならば、これらの方法は、試料曖昧さに限られている濁度測定値に基づいているからである。したがって、そのような測定値は血漿のみに限定されるが、全血では首尾よく行うことができない。しかし、開示されたシステムおよび方法を用いれば、フィブリン動態は粘度ツイゾーグラフから抽出することができる。したがって、これは、フィブリン動態を決定する血漿凝固アッセイの必要性をなくし、単一の血液滴を使用するだけで、この実施例は、広範囲のパラメータセットを用いて完全な凝固プロファイルを得ることができる。

[0227]図３３Ａ、３３Ｂおよび３３Ｃは、水、ならびにＭＷ３５０００から４５０００およびＭＷ２００００００の分子量の５％（ｗ／ｖ）デキストラン溶液それぞれのＡＦＲ曲線を示している。図３３Ｄは、不安定性領域のすべてのピークの振幅の合計（存在すれば）、全ＡＵＣ、不安定性領域のＡＵＣおよび不安定性の帯域幅を含むＡＦＲから抽出されたパラメータを示している。３つの群間の主要な違いは、デキストラン分子の有無であり、異なる分子量を有するデキストラン分子の有無である。対照群（いかなるデキストラン分子もない）、低ＭＷデキストラン群および高ＭＷデキストラン群の間にはＡＦＲ曲線ならびにパラメータに明白な違いがある。この実施例では、デキストランの分子量の増加とともに不安定性の減少が観察された。異なる群間のパラメータの違いをその分子量と互いに関係付けることにより、開示されたシステムと方法を使用すれば、デキストラン試料で示される差に類似する異なる流体間の分子量の差を捕捉し定量化することができる。

[0228]図３４Ａは、ＭＳＦ１．２および血漿のＡＦＲ曲線を示しており、図３４Ｂは、ＡＦＲ曲線から測定されるパラメータを示している。この図は、アルブミンなどの血漿タンパク質を検出し定量化するＡＦＲ方法の能力を説明している。ＭＳＦ１．２と血漿の粘度は同一であり（１．２ｃＰ）類似するＡＵＣ測定値から明らかであるが、アルブミンなどの大きなタンパク質分子の存在により血漿液滴はより安定になり、したがって、血漿ＡＦＲ曲線に不安定性の領域は観察されないが、ＭＳＦ１．２には大きな安定化分子は存在しないので、この実施例は不安定性の領域を図解している。したがって、この技法により使用者は血漿中のアルブミンなどの大きなタンパク質の存在を検出し定量化することができ、この技法は大きなタンパク質を含有する他の生物流体に適用すれば大きなタンパク質を検出することもできる。

[0229]図３５Ａ、３５Ｂおよび３５Ｃは、細胞のないＰＢＳ、５％および１０％ヒツジ赤血球それぞれのＡＦＲ曲線を示している。図３５Ｄは、不安定性領域のすべてのピークの振幅の合計（存在すれば）、全ＡＵＣ、不安定性領域のＡＵＣおよび不安定性の帯域幅を含むＡＦＲから抽出されたパラメータを示している。３つの群間の主要な違いは赤血球の総数である。細胞の数が変動する３つの群間のＡＦＲ曲線ならびにパラメータには明白な違いがある。この実施例では、ＲＢＣのないＰＢＳは共振近くで不安定性を有するが、試料は細胞の添加によりより安定になることが観察された。細胞の数をＡＦＲ曲線から抽出されるパラメータと互いに関係付けることにより、開示された方法を使用すれば、試料中の細胞の数を定量化することができる。

[0230]図３６Ａおよび３６Ｂは、振幅応答実験から抽出された対照と凝固血漿試料の間の全振幅とＡＵＣの変化を示している。一定範囲の周波数で掃引を使用して試料にフォーシングを適用する代わりに、単一周波数を使用して液滴を強制する。この場合、血漿試料を１２５Ｈｚで振動させて、液滴振動から安定な振幅応答を収集する。対照群試料の振幅およびＡＵＣは時間とともにわずかに増加し、凝固群では振幅とＡＵＣは減少し、試料凝固の結果として粘弾性の変化のせいで平坦域に到達する。対照と凝固群の間の振幅とＡＵＣの変化の違いはそれぞれ図３６Ｃおよび３６Ｄに示されており、そこから、以前考察された粘度および弾性ツイゾーグラフから抽出されたパラメータに類似する凝固パラメータを得ることができる。したがって、これは、システム設定を使用する液滴の強制振動を用いて物質特性を抽出する別のアプローチである。
考察
[0231]異なる濃度のポリスチレンマイクロ粒子を含有する液滴の振動のフーリエスペクトルにより、共振ピークパラメータの違いが明らかにされた。これらの共振ピークは、振動のモード、または倍音であり、これらのモードの数は、粘度を含むいくつかの要因に依存している場合がある。より高い濃度のポリスチレンマイクロ粒子を有する液滴のスペクトルのほうが低い濃度よりも基本周波数の共振ピークに近い共振ピークを誘導する可能性が高く、その低い濃度対応物よりもより高いＱ係数を有する共振ピークを誘導する可能性も高かった。

[0232]濃縮物の振動間にはスペクトル形状に有意差があるため、マイクロ粒子の存在の検出のために濃縮閾値を確立することができる。しかし、この閾値は、ポリスチレンマイクロ粒子に特異的である可能性がある。シリカマイクロ粒子などの他のタイプのマイクロ粒子、または生物細胞でさえ、音速および音響インピーダンスなどの音響特性の違いのせいで異なる閾値を有する。デキストラン溶液の粘度に対するポリスチレンマイクロ粒子の効果は、全血に対する鎌状赤血球の効果とは異なっている可能性が高い。物体の弾性などの振動モードに影響を及ぼす他の特性について同じことが言える。

[0233]粒子および類似の物質の内部組成を有する流体に言及する最初の仮説はその全体を正しいと証明することができないという知見のせいでこのことも重要である。ポリスチレンマイクロ粒子を有するデキストラン溶液の振動から得られる複合波は、構成要素の振動の周波数と個々に同じである周波数を構成しなかった。しかし、これは新しいシステムを用いる新しい適用であるという事実のせいで可能性を排除することはできず、ただ存在を検出することによってであろうと、共振ピークパラメータを濃度に関する情報に変換することもできようと、コールターカウンターのための音響インピーデンスのピークが細胞の体積とどのような相関関係があるかに類似して、共振ピークパラメータをどのように使用すれば内部構成要素の存在を分類できるのかははっきりしない。しかし、Ｑ係数が濃度と線形関係があることが明らかにされており、Ｑ係数は検出された粒子の濃度を評価する方法でありうることが示唆されるのは前途有望である。

[0234]その上、将来の分類分析のための適切な実験時間を決定することが鍵となる。時間とともに、高ピークの共振周波数（０．１ＰＳＭＰ試料では２つのピークならびにその他の濃度および対照では１つ）は安定せずにシフトし続けることが観察された。０．１ＰＳＭＰ試料に特有であるので、第２の高共振ピークは消散すると考えられ、個々の試薬（５％デキストランおよび１０％ＰＳＭＰ）の比較および種々の濃度でのその得られた組合せに見られるように、試料内での相互作用が時間とともに共振を減衰させうる可能性への門戸を開く。この現象をさらに理解するためには、将来の実験法およびよりロバストな分析が必要になる。

[0235]このモデルを実証し考え得る改良法への道順を示し、粒子検出のための濃度閾値、液滴キャリブレーションが必要かどうか、粒子のない対照液滴が必要かどうか、およびモデルが異なるタイプの粒子（例えば、ポリスチレン対シリカマイクロ粒子または赤血球対白血球）を検出できるかどうかなどの疑問に答えるためには、違う組成（異なるサイズの粒子を含む）を有する異なる媒体を含むより多くの実験法が必要である。

[0236]これらの疑問に取り組むため、システムの改良を行わなければならない。実験的観点からは、モデルの現在の限界は実験装置に根差している。浮揚システムは液滴振動を２Ｄで記録する。液滴振動は、光が上下に（ｙ軸）または左右に（ｘ軸）に動く際だけ光を遮断する。しかし、ｚ軸での液滴の活性は記録されない。生物流体試料で細胞クロマトグラフィーを実施するという目標を持つモデルは、検出できるものを繊細に正確に決定するのに必要なデータのすべてを必要とすると考えるのが妥当である。すべての振動モデルを捕捉しモデルに必要なデータを提供する記録システムが必要とされる。

[0237]実験装置のもう１つの限界は、浮揚装置が開放系であることにある。時間とともに、浮揚された液滴の共振周波数（Ｆ０、および．１ ＰＳＭＰの場合には、Ｆ１も）はシフトする。このシフトの理由の１つは、蒸発のせいで半径が記録の１分ごとに縮むからでありうる。時間は、Ｆ０、Ｆ１またはそのそれぞれのＱ係数のいずれにも有意差を引き起こさないことが見出されたが、これはおそらく実験分析が５分間にわたる変調掃引のためにのみ検討されたからである。実験分析が掃引を１０分間まで検討していたならば、おそらく、時間が結果に対して有意な効果を与えていたと考えられる。なぜならば、液滴の半径が縮む時間がもっとあったと考えられるからである。加湿器を使用すれば実験雰囲気を制御し浮揚された試料の蒸発の速度を落としうるが、空気の流れをもっと細かく制御できるシステムがあれば実験的変動性を制限するのに有益になると考えられる。

[0238]分析的観点からは、異なる濃度のスペクトルを比較する際に出会うことがある問題は正規化の欠如である。類似する問題が音声認識システムに見い出され、そこではシステムは異なる話し手から出る類似する音声を捕捉しようと試みる。ヒトがアクセントを持っていたらどうなるだろうか。それでもシステムはどのようにして音声を認識するだろうか。本出願では、ほとんどの場合、同じ溶液からの異なる浮揚された液滴の基本周波数は異なる。異なる液滴の共振周波数の平均をとるだけでは、スペクトル形状を正確に表したものにはならないと考えられる。スペクトルパターンを評価するほうが正確だと考えられ、音声の場合と同じように、スペクトルパターンは周波数値とは無関係に同じままであるはずである。新たな試料中でこれらの同じマイクロ粒子の存在を検出する目的で分光学モデルをディープラーニングニューラルネットワークに変換することを目指してそのもっとロバストな分光学モデルを開発するためには、スペクトルパターンの評価方法に関するより多くの研究が必要とされる。

[0239]開示された技術は、ごく少量の試料量を使用することにより流体のレオロジー特性の非接触リアルタイム測定を提供する。壁接触に起因する試料汚染も測定誤差もない。ＱＡＴＴ技法は弾性の測定を可能にするが、この振動音響ツイージング法は使用者が試料流体の粘度と弾性の両方（弾性率によって）を測定することを可能にする。

[0240]音響ツイージング分光法では、ピーク振幅、ピーク周波数、品質係数、曲線下の面積、最小周波数での振幅および最大周波数での振幅などのいくつかのパラメータは、生データ曲線から測定することができる。これらのパラメータはすべて粘度もしくは弾性または両方に対して感度がよく、共振が観察される限り、粘度または弾性の指標として役立つ。しかし、この実験が数分にわたり続けられた場合、この実施例では、ピーク振幅および曲線値下の面積の降下、品質係数を測定するための帯域幅を捕捉できないこと、ならびに特に重合を受けている試料液滴での共振ピークの完全な消滅までものような少数のことが観察された。これは主に、粘度減衰、弾性の急速な増加ならびに液滴蒸発のせいだと考えることができる。これらのそれぞれがこの現象を独立して引き起こすことができるが、これらのうちの２つまたはそれ以上の組合せは共振モードから非共振モードへの急速なシフトを引き起こすことができる。実施例では、高度に粘性の液滴は粘性が低い液滴よりも速く共振を失うことがある。弾性がはるかに増加している４％ゼラチン液滴は、約１５～２０分まで共振を有する２％ゼラチン液滴と比べて５分未満で非共振モードに進むことができる。ピーク振幅、ピーク周波数、および品質係数のようなパラメータは非共振ＡＦＲ曲線で抽出することはできないが、これらの実験から粘度および弾性を測定するために、ＡＵＣおよび最小周波数での振幅などの他のパラメータはそれでも得ることができる。

[0241]そのような少量の流体のレオロジー特性を検出するこの方法の能力は、かなりの利点を有するいくつかの応用の余地を広げる。これは、血液凝固障害および凝固が変化している他の疾患を有する患者で出血または血栓性のリスクを検出するため全血および血漿を凝固させることに適用できる。血液凝固関連適用以外では、血液粘稠度が循環器疾患の重要な初期指標としてすでに公知である。市場ではいくつかの粘度計が入手可能であり、血液粘稠度がこれらの疾患を検出する鍵となる指標であるが、血液粘稠度アッセイは、試料体積要件に関連する問題のせいで、ルーチンな臨床検査ではない。しかし、開示されたシステムおよび方法を用いれば、血液粘稠度モニタリングは新たなルーチンになることが可能である。この技法は、創薬の異なる段階での医薬品および特に血液流動学に対して効果のある薬物の試験にも使用できる。しばしば、創薬および検査はマウスまたはラットなどの小動物モデルで行われ、これらの動物は内部に持つ血液の量が非常に限られている。通常、薬物を試験しながらその血液で定期的な臨床検査を実施するのに十分な血液をその体から抜き取るためには、動物を屠殺する必要がある。しかし、この技法は、一滴の血液だけを使用して血液流動学に対する薬物効果が可能であり、この量であれば屠殺せずに動物から容易に抜き取ることができる。さらに、臨床試験中、これらの試験に参加している患者は薬効をモニターするために試験全体を通じて数回検査され、これには、特に試験中に検査が数回行われる場合には患者から抜き取られる複数回の採血と大量の血液が必要である。ふたたび、本システムおよび方法はそのような検査に必要な試料の量を著しく減少させることができ、検査を患者にとって容易で、便利でリスクの少ないものにする。全体として、これは、創薬および検査の費用を著しく下げることができ、低い試料要件という利益をもたらす。この技法は、疾患状態においてそのレオロジーが変更される、滑液、羊水、粘液、唾液、精液、等などの他の生物流体のレオロジー的および構造的構成要素を評価するのにも適用できる。全体として、これは、１つまたは複数の生物流体が疾患のせいでレオロジーが変化しているいくつかの疾患を検出する診断ツールとして役立つ。
結論
[0242]ここで提示されているプラットフォームは、媒体内でマイクロメーター直径サイズの粒子の存在を検出することができる。プラットフォームは、音響ツイージングの技法を使用して空中の物体を捕捉し操作して、実験に必要な試料の量を減らしつつ汚染または不正確な実験結果のリスクを回避する。波場に変調信号を印加することにより、浮揚した試料による振動を誘導することができ、光ダイオードシステムにより追跡することができた。なぜならば、光ダイオードが受ける光は液滴の振動パターンと線形的に関連付けられているからである。

[0243]生物流体は、細胞およびタンパク質などの様々な構成成分を有する複雑な試料なので、ポリスチレンマイクロ粒子の溶液と混合された選ばれた媒体の試料に、マイクロメーター直径の細胞を有する生物流体を模倣させた。媒体とマイクロ粒子の間の音響特性の違いのせいで、変調信号に対する応答は異なり、したがって、異なる周波数での振動を浮揚した液滴による全体振動に提供する。したがって、液滴の振動は複合信号として記録することができ、これは高速フーリエ変換を適用することによりその周波数成分に分解することができる。

[0244]論文で報告された実験では、流体試料の組成の変化はその共振周波数を変更すること、モデルが媒体中の添加物（この場合は、ポリスチレンマイクロ粒子）の存在を検出するためには濃度閾値に到達しなければならないことが示されている。これらの基本的結論は、臨床診断のために使用され、病態を診断する目的で生物流体試料中の細胞、タンパク質、および分子の存在を検出するこのモデルの潜在能力を立証する。しかし、この目的を達成するモデルの能力を確認するためには、モデルの改良ならびに全血などの生物流体を用いたさらなる実験法が必要である。

[0245]範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表せる。そのような範囲が表される場合、さらなる態様は、１つの特定の値からおよび／またはもう１つの特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用により近似として表される場合、特定の値はさらなる態様を形成すると理解される。範囲のそれぞれのエンドポイントは、もう一方のエンドポイントとの関係で、ともう一方のエンドポイントとは独立しての両方で重要であることがさらに理解される。いくつかの値が本明細書で開示されていること、およびそれぞれの値が、値それ自体に加えて「約」その特定の値としても本明細書では開示されていることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。２つの特定の単位間のそれぞれの単位も開示されていることも理解されている。例えば、１０と１５が開示されている場合、１１、１２、１３および１４も開示されている。

[0246]本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、投与の標的、例えば、動物のことである。したがって、本明細書で開示される方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモットまたは齧歯類が可能である。この用語は特定の年齢も性別も表していない。したがって、成獣および新生対象、ならびに胎仔は、オスであれメスであれ、包含されることが意図されている。一態様では、対象は哺乳動物である。患者とは、疾患または障害に苦しむ対象のことである。用語「患者」は、ヒトおよび獣医学対象を含む。

[0247]本開示は好ましい実施形態に関連して記載されているが、当業者であれば、開示された装置、システムおよび方法の精神および範囲から逸脱することなく形態および詳細な点で変更を加えうることを認識する。

Claims (43)

1. 生体試料を分析する非接触インビトロ方法であって、
   試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、
   搬送波信号を生体試料に印加するステップ、
   生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および
   変調信号を一定範囲の周波数にわたって掃引するステップ
   を含む、ステップと、
   試料からの生データおよび／または画像を記録するステップと、
   振幅周波数応答（ＡＦＲ）についての生データおよび／または画像を分析するステップと
   を含む方法。
2. ＡＦＲ曲線からパラメータを抽出するステップをさらに含み、抽出されたパラメータが、ＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）およびｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、不安定性の帯域幅ならびに不安定性のＡＵＣである、請求項１に記載の方法。
3. 抽出したパラメータから粘度、表面張力および弾性のうちの１つまたは複数を計算するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 変調信号掃引が約１５０Ｈｚ～約５０Ｈｚの範囲を含む、請求項１に記載の方法。
5. 分析がピーク振幅を利用して粘度および／または弾性率を確立する、請求項１に記載の方法。
6. 分析が曲線下面積（ＡＵＣ）を利用して粘度および／または弾性率を確立する、請求項１に記載の方法。
7. 分析がＡ＿ｍｉｎおよび／またはＡ＿ｍａｘを利用して粘度および／または弾性率を確立する、請求項１に記載の方法。
8. 分析が品質係数（ＱＦ）を利用して粘度および／または弾性率を確立する、請求項１に記載の方法。
9. 帯域幅上の共振周波数により見い出されるＱＦが、最大振幅の半分を利用して帯域幅を確定する、請求項８に記載の方法。
10. 帯域幅上の共振周波数により見い出されるＱＦが、最大振幅の約３０％～約７０％を利用して帯域幅を確立する、請求項８に記載の方法。
11. 分析がピーク周波数を利用して弾性率を確立する、請求項１に記載の方法。
12. 分析が、２つまたはそれよりも多いパラメータを利用して粘度および／または弾性率を確立するステップを含む、請求項１に記載の方法。
13. ２つまたはそれよりも多いパラメータが、ＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）およびｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、不安定性の帯域幅ならびに不安定性のＡＵＣからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 分析が、粘性ツイゾーグラフまたは弾性ツイゾーグラフからパラメータを抽出するステップを含む、請求項２に記載の方法。
15. 分子量の違いを検出して定量化するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
16. 大きなタンパク質を検出して定量化するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
17. 存在する細胞の数を検出して定量化するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
18. 分析が、粘性ツイゾーグラフからパラメータを抽出するステップを含み、全血フィブリン動力学を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
19. Ａ＿ｐｅａｋおよび／またはｆ＿ｐｅａｋから分子量および／または細胞の数を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
20. ＡＵＣから分子量および／または細胞の数を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
21. 周波数の範囲は約１５０Ｈｚ～約５０Ｈｚであり、規定された時間は約１秒～約６０秒である、請求項１に記載の方法。
22. 生体試料を分析する非接触インビトロ方法であって、
    試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、
    搬送波信号を生体試料に印加するステップ、
    生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および
    変調信号を掃引するステップ
    を含む、ステップと、
    試料からの生データおよび／または画像を記録するステップと、
    試料パラメータについての生データおよび／または画像を分析するステップと
    を含む方法。
23. 生体試料が全血または血漿である、請求項２２に記載の方法。
24. 周波数の範囲が約１５０Ｈｚ～約５０Ｈｚである、請求項２２に記載の方法。
25. 周波数の範囲が定義された時間にわたって印加される、請求項２２に記載の方法。
26. 定義された時間が約１秒～約６０秒である、請求項２５に記載の方法。
27. 周波数の範囲が約１５０Ｈｚ～約５０Ｈｚであり、定義された時間は約１秒～約６０秒である、請求項２５に記載の方法。
28. 試料パラメータが、ＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）およびｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、不安定性の帯域幅ならびに不安定性のＡＵＣのうちの１つまたは複数を含む、請求項２２に記載の方法。
29. 凝固開始時間（ＣＩＴ）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ）、凝固時間（ＣＴ）、凝固速度（ＣＲ）、最大凝固硬度（ＭＣＦ）およびピークに到達するまでの時間（ＴＲＰ）、反応時間（ＲＴ）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ）ならびに最大フィブリンレベル（ＭＦＬ）のうちの１つまたは複数を確立するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
30. 凝固開始時間（ＣＩＴ）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ）、凝固時間（ＣＴ）、凝固速度（ＣＲ）、最大凝固硬度（ＭＣＦ）およびピークに到達するまでの時間（ＴＲＰ）、反応時間（ＲＴ）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ）ならびに最大フィブリンレベル（ＭＦＬ）のうちの１つまたは複数を確立するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
31. 変調信号掃引が、約１０００Ｈｚ～約１０Ｈｚの範囲を含む、請求項１に記載の方法。
32. 変調信号掃引が、約１０００Ｈｚ～約１０Ｈｚの範囲を含む、請求項２２に記載の方法。
33. 生体試料を分析する非接触インビトロ方法であって、
    試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、
    搬送波信号を生体試料に印加するステップ、
    生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および
    変調信号を掃引するステップ
    を含む、ステップと、
    試料から生データおよび／または画像を記録するステップと、
    ＡＦＲ曲線からパラメータを抽出するために生データおよび／または画像を分析するステップと
    を含み、
    抽出されたパラメータがＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）およびｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、不安定性の帯域幅ならびに不安定性のＡＵＣである方法。
34. 全血を分析する非接触インビトロ方法であって、
    試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、
    搬送波信号を生体試料に印加するステップ、
    生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および
    変調信号を一定範囲の周波数にわたって掃引するステップ
    を含む、ステップと、
    試料から生データおよび／または画像を記録するステップと、
    ＡＦＲ曲線からパラメータを抽出するために生データおよび／または画像を分析するステップと
    を含み、
    抽出されたパラメータがＡＵＣ、ｆ_ｐｅａｋ、Ａ_ｐｅａｋ、ｆ１／２右、ｆ１／２左、Ａ_ｍｉｎ、Ａ_ｍａｘ、品質係数（ＱＦ）およびｆ_ｐｅａｋ、ｓｕｍ（Ａ_ｐｅａｋ）、不安定性の帯域幅ならびに不安定性のＡＵＣである方法。
35. 分析が粘性ツイゾーグラフからパラメータを抽出するステップを含み、全血フィブリン動力学を測定するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
36. 変調信号掃引が、約１０Ｈｚ～約１０００Ｈｚの範囲を含む、請求項１に記載の方法。
37. 変調信号掃引が、約１０Ｈｚ～約１０００Ｈｚの範囲を含む、請求項２２に記載の方法。
38. 掃引が単一周波数においてである、請求項２２に記載の方法。
39. 凝固開始時間（ＣＩＴ）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ）、凝固時間（ＣＴ）、凝固速度（ＣＲ）、最大凝固硬度（ＭＣＦ）およびピークに到達するまでの時間（ＴＲＰ）、反応時間（ＲＴ）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ）ならびに最大フィブリンレベル（ＭＦＬ）のうちの１つまたは複数を確立するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
40. 凝固開始時間（ＣＩＴ）、硬い凝固形成までの時間（ＴＦＣＦ）、凝固時間（ＣＴ）、凝固速度（ＣＲ）、最大凝固硬度（ＭＣＦ）およびピークに到達するまでの時間（ＴＲＰ）、反応時間（ＲＴ）、フィブリン形成速度（ＦＦＲ）ならびに最大フィブリンレベル（ＭＦＬ）のうちの１つまたは複数を確立するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
41. 生体試料を測定する非接触方法であって、
    試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、
    搬送波信号を生体試料に印加するステップ、
    生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および
    変調信号を掃引するステップ
    を含む、ステップと、
    試料からの生データおよび／または画像を記録するステップと、
    生体試料の分子量を検出するために生データおよび／または画像を分析するステップと
    を含む方法。
42. 生体試料を測定する非接触方法であって、
    試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、
    搬送波信号を生体試料に印加するステップ、
    生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および
    変調信号を掃引するステップ
    を含む、ステップと、
    試料からの生データおよび／または画像を記録するステップと、
    大きなタンパク質を検出し定量化するために生データおよび／または画像を分析するステップと
    を含む方法。
43. 生体試料を測定する非接触方法であって、
    試料を浮揚させるステップであって、浮揚が、
    搬送波信号を生体試料に印加するステップ、
    生体試料を変調信号でツイーズするステップ、および
    変調信号を掃引するステップ
    を含む、ステップと、
    試料からの生データおよび／または画像を記録するステップと、
    存在する細胞の数を検出し定量化するために生データおよび／または画像を分析するステップと
    を含む方法。

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