JP2019180265A - 撹拌装置、細胞培養装置及び撹拌方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞を効率よく培養することが可能な撹拌装置の提供。【解決手段】超音波振動子５は、細胞２及び液体培地３を保持する培養容器１の水平断面における培養容器１の中心Ｏを中心とする円Ｃの接線に超音波の中心軸を一致させて、液体培地３に向かって超音波を照射する。制御部は、超音波振動子５の動作を制御する。回収部が前記細胞を回収する際、照射部から照射される超音波を定在波にする定在波生成部をさらに備え、回収部は、定在波で集められた細胞を回収する、撹拌装置。【選択図】図３

Description

本発明は、撹拌装置、細胞培養装置及び撹拌方法に関する。

化学分析において、検体及び試薬等を含む混合液を撹拌することがある。混合液の撹拌方法として、混合液を保持する容器の外部から音波を混合液に照射する方法が知られている。

例えば、特許文献１には、反応容器内の被測定液の液面に対して平行に、又は斜めに液相から気相に向かう方向に音波を照射する音波発生手段を備える化学分析装置が開示されている。

特許文献２には、反応容器の側方に配置され、側方超音波を発生する複数の超音波発生源と、超音波発生源からの超音波を反射する反射手段と、を備える自動分析装置が開示されている。

特開２０００−１４６９８６号公報 特開２００１−２４２１７７号公報

特許文献１に開示された化学分析装置によって誘起される旋廻流は、反応容器の底から被測定液の液面に向かい、液面から反応容器の底へと向かう流れである。特許文献２に開示された自動分析装置は、下方超音波をサンプルの液面に衝突させることで液面の一部を隆起させ、この隆起に側方超音波を照射して撹拌旋回流を発生させる。当該撹拌旋回流も、上記特許文献１と同様に、反応容器の底からサンプルの液面に向かい、液面から反応容器の底へと向かう流れである。

上記特許文献１に開示された化学分析装置及び上記特許文献２に開示された自動分析装置を細胞培養における液体培地の撹拌に用いた場合、反応容器の底から液体培地の液面に向かう流れが液体培地より比重が大きい細胞に対するせん断流となる。せん断流によってせん断応力が細胞に作用すると、細胞の増殖率及び生存率が低下することがある。細胞の増殖率及び生存率が低下してしまうと、細胞を効率よく培養できない。

本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、細胞を効率よく培養することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明に係る撹拌装置は、超音波を照射する照射部と、照射部の動作を制御する制御部と、を備える。照射部は、細胞及び液体培地を保持する培養容器の水平断面における培養容器の中心を中心とする円の接線に超音波の中心軸を一致させて、液体培地に向かって超音波を照射する。

本発明によれば、培養容器の高さ方向を軸とする旋回流を液体培地に発生させることができる。このため、せん断流の発生が抑制され、効率よく細胞を培養することができる。

本発明の実施の形態１に係る撹拌装置の構成を示す図 図１に示すＡ−Ａ’破線で切断した撹拌装置の矢視図 実施の形態１に係る撹拌装置に配置された培養容器の水平断面における培養容器の中心と超音波の中心軸との位置関係を示す図 実施の形態１における撹拌装置に配置された培養容器に対する平面視での培養容器の中心と音響流との位置関係を示す図 本発明の実施の形態２に係る撹拌装置の構成を示す図 図５に示す撹拌装置において超音波振動子に印加される駆動電圧の波形を示す図 図５に示す撹拌装置において超音波振動子に印加される別の駆動電圧の波形を示す図 図５に示す撹拌装置において超音波振動子に印加される他の駆動電圧の波形を示す図 実施の形態２に係る別の撹拌装置の構成を示す図 実施の形態２に係る他の撹拌装置の構成を示す図 本発明の実施の形態３に係る他の撹拌装置の構成を示す図 本発明の実施の形態４に係る他の撹拌装置の構成を示す図 本発明の実施の形態５に係る撹拌装置に配置された培養容器の水平断面における培養容器の中心と吸入口との位置関係を示す図 実施の形態５に係る撹拌装置に配置された培養容器内の細胞に作用する向心力及び遠心力を示す図 実施の形態５に係る撹拌装置に配置された培養容器内の液体培地の流れを示す図 実施の形態５に係る撹拌装置に配置された培養容器内の細胞の動きを示す図 本発明の実施の形態６に係る撹拌装置の構成を示す図 図１７に示す撹拌装置に配置された培養容器に対する平面視での超音波振動子から照射される超音波の進行方向を示す図 実施の形態６に係る定在波の交差地点を示す図 実施の形態６に係る定在波に留められた細胞を移動させる超音波の進行方向を示す図

以下、本発明の実施の形態に係る撹拌装置について図面を参照して詳細に説明する。なお図面中、同一又は同等の部分には同一の符号を付す。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係る撹拌装置１００の構成を示す図である。撹拌装置１００は、培養容器１に細胞２とともに保持された液体培地３を撹拌する。図１には培養容器１の底面に対する平面視における撹拌装置１００が示されている。培養容器１は、底面が円である円筒状で、上面が開口している。培養容器１はポリカーボネート製である。

細胞２は、浮遊系で培養できる動物細胞である。液体培地３は、細胞２の培養に適した液体培地である。液体培地３には、有機物、ｐＨ緩衝液、血清、各種ミネラル、抗生物質及びｐＨ指示薬等が含まれている。

撹拌装置１００は、底面が四角形である四角柱状で上面が開口している水槽４と、液体培地３に向かって超音波を照射する照射部としての超音波振動子５と、超音波振動子５の動作を制御する制御部としてのコントローラ６と、超音波振動子５及びコントローラ６に電力を供給する駆動用電源７と、を備える。なお、以下では、超音波振動子を単に「振動子」と表記する。

図２は、図１におけるＡ−Ａ’破線で撹拌装置１００を切断し、矢視したときの撹拌装置１００を示す。水槽４の内部には、円筒形状の設置台８が配設されている。培養容器１は、設置台８の上に配置されている。水槽４の内部には、液面が振動子５より高く、かつ培養容器１の上端より低い位置まで液体９が入っている。より具体的には、液体９は、重量濃度として１０％のエチレングリコールを添加した水である。

振動子５は水槽４の壁４ａに取り付けられた粘弾性体１０に埋め込まれることで、水槽４に設置されている。振動子５は圧電素子を備える。駆動電圧を印加された圧電素子が一点鎖線で示されている振動子５の中心軸の方向に振動することで、振動子５は超音波（疎密波）を照射する。照射された超音波は中心軸に沿って伝搬する。ここでの超音波とは、周波数が２０ｋＨｚ以上の弾性振動波である。

図１に戻って、振動子５はケーブル１１を介してコントローラ６に接続されている。コントローラ６は、ケーブル１１を介して駆動用電源７に接続されている。コントローラ６は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）と、外部記憶装置と、ＲＡＭ（Random Access Memory）と、を備える。ＣＰＵが外部記憶装置に記憶されたソフトウェアプログラムをＲＡＭに読み出し、ソフトウェアプログラムを実行制御することで、コントローラ６は振動子５の動作を制御する。

コントローラ６は、振動子５から照射される超音波の周波数及び振幅に対応する駆動電圧を生成する。コントローラ６は、生成した駆動電圧を振動子５に印加する。振動子５は、駆動電圧に応じて振動する。本実施の形態では、コントローラ６は、連続的に駆動電圧を振動子５に印加する。超音波の周波数は１６５ｋＨｚである。なお、細胞２の死滅及び減少を抑制するため、コントローラ６は、駆動電圧の振幅を制御し、超音波に起因して培養容器１内に生じる音圧を３００ｋｐａ以下にする。

図３は、培養容器１の水平断面における振動子５から照射される超音波の中心軸の位置を示す図である。図３において、振動子５から照射される超音波の中心軸でもある振動子５の中心軸は一点鎖線で示されている。振動子５は、培養容器１の水平断面における培養容器１の中心Ｏを中心とする円Ｃの接線に超音波の中心軸を一致させて、液体培地３に向かって超音波を照射する。

次に、本実施の形態における撹拌装置１００の使用方法について、図１を参照しながら説明する。

撹拌装置１００は、二酸化炭素の濃度が５％に維持された３７℃の空気の雰囲気下に設置される。また、撹拌装置１００は、液体培地３が外部から汚染されないために密閉空間内に設置される。

撹拌装置１００を設置し、水槽４内に配置された培養容器１に保持された液体培地３が雰囲気下で安定するのを待つ。続いて、液体培地３に１０^７個以上の細胞２を滅菌ピペットで液体培地３に播種する。次に、コントローラ６が振動子５に駆動電圧を印加する。これにより、振動子５が中心軸の方向に振動し、超音波が液体培地３に向かって照射される。より詳細には、振動子５の振動によって生じた音響放射圧が、振動子５の端面に接する液体９中を伝搬する。音響放射圧は、培養容器１の側面を介して液体培地３にさらに伝搬する。液体培地３には、音響放射圧に基づく音響流が生じる。この結果、液体培地３において培養容器１の高さ方向を軸とする旋回流１２が発生する。

旋回流１２をより確実に発生させるために、振動子５によって照射された超音波が液体培地３に励起する音響流は、培養容器１の中心Ｏを通らない。図４は、培養容器１に対する平面視における撹拌装置１００を示す図である。中心軸が一点鎖線で示された超音波によって液体培地３に励起される音響流Ｓは直進性を有する。超音波の中心軸に垂直な方向における音響流Ｓの幅をＤとする。音響流Ｓは、超音波の進行方向に液体培地３中を進む。このとき、Ｄの中点は超音波の中心軸上となる。

ここで、振動子５が（ｉ）の位置にある場合、培養容器１の中心Ｏと超音波の中心軸との距離ＬがＤ／２より短いＬ１となる。ＬがＬ１のとき、音響流Ｓが中心Ｏを通り、培養容器１の側面に対して直角にぶつかる。したがって、培養容器１の高さ方向を軸とする旋回流１２を発生させることが難しい。このため、ＬをＤ／２以上とすることで旋回流１２をより確実に発生させることができる。

距離Ｌの上限は、液体培地３に音響流Ｓが励起される限り特に限定されない。ただし、培養容器１の底面の半径をＲとすると、振動子５が（ｉｉ）の位置にある場合、ＬがＲ＋Ｄ／２より長いＬ２となる。ＬがＬ２のとき、振動子５の振動によって生じた音響放射圧はほとんど液体培地３に伝搬しない。よって、音響放射圧の大半を液体培地３に伝搬させるには、ＬをＲ＋Ｄ／２以下とすればよい。

以上説明したとおり、本実施の形態１に係る撹拌装置１００によれば、培養容器１内に培養容器１の高さ方向を軸とする旋回流１２を発生させることで、細胞２に対するせん断流の発生を抑制することができる。このため、細胞２に過度なストレスを与えることなく、細胞２の増殖率及び生存率が低下を抑えることができる。この結果、細胞２を効率よく培養することができる。

また、ＬをＤ／２以上かつＲ＋Ｄ／２以下にすることで、旋回流１２をより確実に、かつ効率的に発生させることができる。このため、振動子５の駆動に要する消費電力を抑えることができる。なお、図４において、超音波の中心軸に垂直な方向における振動子５の幅が音響流Ｓの幅Ｄに一致する場合には、振動子５の幅を上述の音響流Ｓの幅Ｄとしてもよい。

なお、本実施の形態では、培養容器１の材質はポリカーボネートに限定されず、オートクレーブによる滅菌が可能な他のプラスチック又はガラスでもよい。例えば、培養容器１の材質としては、ポリスチレンが挙げられる。

また、液体培地３に播種する細胞２の個数は、本実施の形態のように１０^７個以上が好ましいが、これに限定されない。培養する細胞２の種類又は増殖特性に応じて播種する細胞２の個数は適宜調整される。

また、液体９は液体であれば、水でも油でもよいが、音響インピーダンスが培養容器１に近い液体が望ましい。なお、本実施の形態では、液体９としてエチレングリコールを添加した水を用いたが、エチレングリコールを添加しなくてもよい。

本実施の形態では、超音波の周波数を１６５ｋＨｚとしたが、周波数は使用する振動子５に応じて適宜設定される。

なお、本実施の形態では、培養容器１は、底面が円である円筒状としたが、培養容器１の底面は、楕円の他、正方形、長方形、ひし形及び平行四辺形等の点対称の図形であってもよい。培養容器１の底面が楕円の場合、水平断面における培養容器１の中心Ｏは、楕円の重心に一致する。培養容器１の底面が点対称の図形の場合、点対称の中心が培養容器１の中心Ｏとなる。

（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２に係る撹拌装置２００、３００及び４００について、上記実施の形態１に係る撹拌装置１００と異なる点を主に説明する。図５は、培養容器１に対する平面視における撹拌装置２００を示す。撹拌装置２００は、振動子５に加え、振動子５と同様の振動子５ａを備える。振動子５ａは、振動子５が取り付けられている水槽４の壁４ａに対向する壁４ｂに取り付けられている。

振動子５と振動子５ａとは、培養容器１の中心Ｏを対称の中心とする点対称の位置関係にある。振動子５は、振動子５から超音波の進行方向に向かって、一点鎖線で示される振動子５から照射される超音波の中心軸に対して左側に培養容器１の中心Ｏが位置する。振動子５ａも同様である。

コントローラ６は、振動子５及び５ａそれぞれの動作を個別に制御する。図６は、振動子５及び５ａそれぞれに印加される駆動電圧の波形を示す。図６に示すように、振動子５及び５ａそれぞれに、波形が同期された駆動電圧が連続的に印加される。この駆動電圧を振動子５及び５ａに印加することで、コントローラ６は、振動子５及び５ａを連続的に駆動する。

図７は、振動子５及び５ａそれぞれに印加される駆動電圧の別の波形を示す。図７に示すように、波形が同期された駆動電圧が同じタイミングで、振動子５及び５ａそれぞれに一定時間印加された後、一定時間印加されず、再び一定時間印加される。この駆動電圧を振動子５及び５ａに印加することで、コントローラ６は、振動子５及び５ａを間欠的に駆動する。

コントローラ６は、振動子５及び５ａそれぞれから交互に超音波を照射させてもよい。例えば、図８に示すように、振動子５には、駆動電圧が一定時間印加された後、一定時間印加されず、再び一定時間印加される。一方、振動子５ａには、振動子５に駆動電圧が印加されていない時間に駆動電圧が印加される。

振動子５の個数は２個に限らず、振動子５をさらに増設してもよい。図９は、平面視における撹拌装置３００を示す。撹拌装置３００は、振動子５に加え、振動子５と同様の振動子５ａ、５ｂ及び５ｃを備える。振動子５ａ、５ｂ及び５ｃは、振動子５が取り付けられていない水槽４の３つの壁４ｂ、４ｃ及び４ｄそれぞれに取り付けられる。振動子５と振動子５ａ、５ｂ、５ｃとは、培養容器１の中心Ｏを対称の中心とする４回対称の位置関係にある。

図１０は、培養容器１に対する平面視における撹拌装置４００を示す。撹拌装置４００は、水槽４に代えて水槽１３を備える。水槽１３の形状は底面が八角形の八角柱状である。撹拌装置４００は、振動子５に加え、振動子５と同様の振動子５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｅ、５ｆ及び５ｇを備える。振動子５ａ〜５ｇは、振動子５が取り付けられていない水槽１３の７つの壁４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ及び４ｈそれぞれに取り付けられる。振動子５と振動子５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｅ、５ｆ及び５ｇとは、培養容器１の中心Ｏを対称の中心とする８回対称の位置関係にある。

以上説明したとおり、実施の形態２に係る撹拌装置２００、３００及び４００では、振動子５が複数個であって、すべての振動子５は、培養容器１に対する平面視において、振動子５から超音波の進行方向に向かって、中心軸に対して左右同じ側に培養容器１の中心が位置する方向に超音波を照射することとした。当該超音波によって励起される音響流は、中心Ｏの周囲を同じ方向に周る旋回流１２を発生させる。こうすることで、１個の振動子５の駆動に要する電力量を抑えつつ、１個の振動子５を用いた撹拌装置１００と同じ速度の旋回流１２を得ることができる。

さらに、振動子５に供給する電力量を抑えることで、振動子５の劣化を遅らせることができ、振動子５の駆動寿命を延長できる。なお、上記実施の形態１に係る撹拌装置１００のように振動子５を１個とした場合、撹拌装置１００の部品点数を抑えることができるという利点がある。

また、コントローラ６は、振動子５及び５ａそれぞれの動作を個別に制御する。これにより、振動子５及び５ａそれぞれの振動をより柔軟に制御することができ、旋回流１２の速度を適切に調整することができる。上述のように、コントローラ６が、中心Ｏを対称の中心とする点対称な位置に配置された振動子５及び５ａそれぞれに、駆動電圧を連続的に印加すると、同じ方向に旋回流１２を生じさせることができる。このため、旋回流１２の速度を大きくすることができる。

振動子５及び５ａの駆動で発生する熱の伝熱及び超音波の照射によって液体９、培養容器１及び液体培地３の温度が上昇することがある。これに対し、コントローラ６が、振動子５及び５ａそれぞれに駆動電圧を間欠的に印加することで、駆動電圧が印加されない時間に細胞２の培養に影響する液体培地３の温度上昇を抑制することができる。

また、本実施の形態では、コントローラ６が振動子５及び５ａそれぞれから交互に超音波を照射させてもよいこととした。こうすることで、液体培地３に音響流が常時励起されるため、旋回流１２の速度を維持することができる。さらに、振動子５による超音波の照射によって振動子５に近い液体培地３の温度が上昇したとしても、振動子５ａが超音波を照射している間に振動子５が超音波の照射を停止することで、温度が上昇した振動子５に近い液体培地３が放熱によって冷却される。結果として、液体培地３の全体の温度上昇を抑制することができる。

なお、図６及び図７に示した駆動電圧の波形は同期されなくてもよい。また、撹拌装置２００、３００及び４００において、振動子５から照射される超音波の中心軸と中心Ｏとの距離は、振動子５を除く振動子５ａ等から照射される各超音波の中心軸と中心Ｏとの距離と等しくなくてもよい。

培養容器１の高さ方向における振動子５、５ａ〜５ｇの位置は特に限定されない。培養容器１の高さ方向における旋回流１２の速度に応じて適宜調整される。

（実施の形態３）
上記実施の形態２に係る撹拌装置２００では、振動子５及び５ａから照射された超音波は、水槽４の壁４ｂ及び４ａにそれぞれ伝搬し、水槽４、培養容器１及び液体９に拡散する。拡散した超音波が振動子５及び５ａから照射された超音波と干渉すると、超音波の音圧が低下することがある。超音波の音圧低下は、撹拌効率を低下させるおそれがある。

撹拌効率の低下を防ぐためには、超音波の拡散を抑制すればよい。そこで、本発明の実施の形態３に係る撹拌装置５００は、撹拌装置２００の構成に加え、超音波を減衰する減衰材１４を備える。以下では、撹拌装置５００について、撹拌装置２００と異なる点を主に説明する。図１１は、培養容器１に対する平面視における撹拌装置５００を示す。減衰材１４は、超音波を含む音波を吸収する吸音材である。減衰材１４の材質は高分子系のシリコーン樹脂である。

減衰材１４は、振動子５によって照射される超音波の進行方向に対向する位置に配置されている。より詳細には、減衰材１４は、振動子５が取り付けられている水槽４の壁４ａに対向する壁４ｂにおける、超音波が照射される箇所に取り付けられている。培養容器１は、振動子５と減衰材１４との間に配置される。振動子５ａによって照射される超音波の進行方向に対向する位置にも減衰材１４が同様に配置される。

振動子５及び５ａから照射された超音波は、水槽４の壁４ｂ及び４ａにおいて減衰材１４に吸収されるため、超音波の拡散を防止することができる。こうすることで、撹拌効率の低下を回避できる。

また、振動子５及び５ａから照射された超音波が水槽４、培養容器１及び液体９に拡散した場合、旋回流１２の発生が抑制され、旋回流１２の維持が妨げられることも懸念される。減衰材１４を設置することで、水槽４の壁４ａ及び４ｂを介して拡散する超音波による旋回流１２への影響も抑えることができる。

なお、減衰材１４は、上記実施の形態１における撹拌装置１００、上記実施の形態２における撹拌装置３００及び４００に設置されてもよい。図１に示された撹拌装置１００の場合、減衰材１４を、壁４ａに対向する壁における超音波が照射される箇所に取り付ければよい。撹拌装置３００の場合には、減衰材１４を、壁４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄそれぞれの超音波が照射される箇所に１個ずつ取り付ければよい。撹拌装置４００の場合には、減衰材１４を、壁４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ及び４ｈそれぞれの超音波が照射される箇所に１個ずつ取り付ければよい。

なお、減衰材１４の材質を高分子系のシリコーン樹脂としたが、これに限定されない。減衰材１４の材質は、音波を吸収し、かつ液体９に耐性があるものから適宜選択される。

（実施の形態４）
上記実施の形態１〜３に係る撹拌装置１００〜５００によって効率よく培養した細胞２を回収する必要がある。そこで、上記実施の形態２に係る撹拌装置２００に、細胞２を回収するための構成を追加した実施の形態として撹拌装置６００について説明する。以下では、撹拌装置６００について、上記実施の形態２に係る撹拌装置２００と異なる点を主に説明する。

図１２は撹拌装置６００の構成を示す図である。撹拌装置６００は、上述の撹拌装置２００の構成に加えて、両端が開口した管１５と、吸引ポンプ１６と、吸引ポンプコントローラ１７と、吸引ポンプ駆動電源１８と、開閉弁１９と、回収用バッグ２０と、を備える。

管１５の開口した一端は吸入口２１である。吸入口２１は、液体培地３と接する、又は液体培地３内に入っている。管１５の開口した他端は吸引ポンプ１６に接続されている。吸引ポンプ１６は、ケーブル１１を介して、吸引ポンプコントローラ１７に接続されている。吸引ポンプコントローラ１７は、ケーブル１１を介して、吸引ポンプ駆動電源１８に接続されている。

吸引ポンプ駆動電源１８は、吸引ポンプ１６及び吸引ポンプコントローラ１７に電力を供給する。吸引ポンプコントローラ１７は、ＣＰＵと、外部記憶装置と、ＲＡＭと、を備える。ＣＰＵが外部記憶装置に記憶されたソフトウェアプログラムをＲＡＭに読み出し、ソフトウェアプログラムを実行制御することで、吸引ポンプコントローラ１７は吸引ポンプ１６の動作を制御する。回収用バッグ２０は、開閉弁１９を介して吸引ポンプ１６に接続されている。開閉弁１９を閉めると、吸引ポンプ１６から回収用バッグ２０への空気の流入が遮断される。一方、開閉弁１９を開けると、吸引ポンプ１６から回収用バッグ２０への空気の流入が可能になる。

吸引ポンプ１６、吸引ポンプコントローラ１７、吸引ポンプ駆動電源１８、開閉弁１９及び回収用バッグ２０は、回収部として機能する。開閉弁１９が開いた状態で、吸引ポンプコントローラ１７が吸引ポンプ１６を駆動すると、吸引ポンプ１６は吸入口２１から吸引する。吸入口２１が液体培地３と接する、又は液体培地３に入っているため、培養容器１内の細胞２が液体培地３とともに吸入口２１から吸引される。吸引された液体培地３及び細胞２は、回収用バッグ２０に移送される。これにより、撹拌装置６００は細胞２を回収することができる。

吸引ポンプコントローラ１７は、回収用バッグ２０に回収された液体培地３が規定の量になったら、吸引ポンプコントローラ１７は、吸引ポンプ１６による吸引を停止する。最後に、開閉弁１９を閉めると、細胞２を保持する回収用バッグ２０が得られる。

撹拌装置６００は、液体培地３が外部から汚染されないために密閉空間内に設置される。液体培地３に播種された細胞２を、超音波による旋回流１２によって撹拌しながら培養する。培養後、吸引ポンプコントローラ１７が吸引ポンプ１６を駆動することで、細胞２が回収用バッグ２０に回収される。

以上説明したように、撹拌装置６００によれば、細胞２の培養から回収に至るまでのすべての工程を閉鎖した空間で行うことができる。こうすることで、細胞２の培養時及び回収時の作業に伴う汚染の危険性を極力小さくすることができる。汚染を避けることで、高品質な細胞２を取得できる。

なお、管１５は常時設置されてもよいし、液体培地３の撹拌中又は細胞２の培養が完了した時点で設置されてもよい。また、管１５の形状及び大きさは、培養容器１に入れることができれば任意である。

なお、吸引ポンプコントローラ１７は、回収バッグ２０に回収された液体培地３の量を、センサで監視してもよい。この場合、吸引ポンプコントローラ１７は、センサによって液体培地３が規定の量になったことを検出したタイミングで吸引ポンプ１６による吸引を停止する。

また、細胞２の培養は、液体培地３の撹拌時間に基づいて終了してもよいし、液体培地３における細胞２の濃度に基づいて終了してもよい。細胞２の濃度は吸光度等を定期的に測定することで評価できる。撹拌時間に基づいて培養を終了する場合、コントローラ６がタイマで測定した撹拌時間を参照し、規定の時間になったタイミングで超音波の照射を停止すればよい。細胞２の濃度に基づいて培養を終了する場合、コントローラ６が定期的に測定される細胞２の濃度を参照し、規定の濃度になったタイミングで超音波の照射を停止すればよい。

また、コントローラ６を吸引ポンプコントローラ１７に通信可能に接続し、コントローラ６が培養終了を吸引ポンプコントローラ１７に通知してもよい。この場合、培養終了が通知されると、吸引ポンプコントローラ１７は、即時又は一定時間後に吸引ポンプ１６を駆動することで、細胞２を回収する。

本実施の形態では細胞２を回収用バッグ２０に移送するが、容量がより大きい他の培養容器、細胞２の塊を分離する分離装置、液体培地３を除去して液体培地３中の細胞２の濃度を高める濃縮装置等に細胞２を移送してもよい。

なお、本実施の形態では、細胞２を回収する構成を撹拌装置２００に追加したが、撹拌装置２００に代えて、撹拌装置１００、３００〜５００に、管１５、吸引ポンプ１６、吸引ポンプコントローラ１７、吸引ポンプ駆動電源１８、開閉弁１９及び回収用バッグ２０、を追加してもよい。

（実施の形態５）
実施の形態４に係る撹拌装置６００によって、培養後に細胞２を回収することができる。しかし、回収時に吸入口２１の付近に細胞２を集めておかないと細胞２を回収するためにほとんどの液体培地３を吸引しなければならず、回収効率において不利である。

そこで、本発明の実施の形態５に係る撹拌装置７００は、撹拌装置６００における吸入口２１の付近に培養後の細胞２を集めるための構成を備える。以下では、撹拌装置７００について、上記実施の形態４に係る撹拌装置６００と異なる点を主に説明する。

図１３は、平面視における培養容器１の水平断面を示す図である。図１３において、培養容器１の水平断面に投影された吸入口２１が破線で示されている。撹拌装置７００では、培養容器１の水平断面における培養容器１の中心Ｏに重なる位置に吸入口２１が配置される。

図１４は、中心Ｏで培養容器１の高さ方向に切断した培養容器１及び管１５の切断面を示す。図１４において、培養容器１の高さ方向の、旋回流１２の回転軸が破線で示されている。回転軸からの距離に比例する旋回流１２の速度によって、図１４に示す液体培地３の液面３ａのように、培養容器１の側面側の圧力がもっとも高く、回転軸に向かって圧力が小さくなり、回転軸の位置で圧力がもっとも小さくなる。この圧力勾配によって、回転軸に向かう向心力Ｆ１が細胞２に作用する。一方、旋回流１２による回転によって、培養容器１の回転軸から培養容器１の側面へ向かう遠心力Ｆ２が細胞２に作用する。細胞２に作用する遠心力Ｆ２の大きさは、回転軸からの距離によって決まる。向心力Ｆ１の大きさと遠心力Ｆ２の大きさとが等しい場合、細胞２は、回転軸からの距離を一定に保ちながら回転軸の周りを旋回する。

コントローラ６は、振動子５及び５ａの動作を制御することによって、向心力Ｆ１の大きさと遠心力Ｆ２の大きさとが等しい場合の旋回流１２の速度よりも旋回流１２の速度を大きくする。そうすると、液体培地３に粘性があるため、培養容器１の底面付近での旋回流１２の速度は、液面３ａ付近での旋回流１２の速度に比べ相対的に小さくなる。したがって、培養容器１の底面付近では、向心力Ｆ１に比べて遠心力Ｆ２が小さくなる。その結果、図１５に示すように、液体培地３には、培養容器１の底面付近では回転軸へ向かう流れが生じ、回転軸付近では上昇する流れが生じる。液体培地３の流れは、液面３ａ付近では培養容器１の側面に向かい、培養容器１の側面付近で底面方向に向かう。ここで、細胞２の比重は液体培地３の比重よりも大きいため、回転軸付近で細胞２は上昇せず、回転軸付近に留まる傾向がある。

すなわち、旋回流１２によって細胞２に作用する向心力Ｆ１が遠心力Ｆ２よりも大きい場合に、細胞２を回転軸付近に集めることができる。よって、コントローラ６は、細胞２を回収する際、振動子５及び５ａの動作を制御することで、液体培地３の旋回流１２によって細胞２に作用する向心力Ｆ１を遠心力Ｆ２よりも大きくする。こうすることで、図１６に示すように、培養容器１の中心Ｏに重なる位置に細胞２を徐々に集めることができる。

次に、撹拌装置７００の動作について説明する。撹拌装置７００は、超音波による旋回流１２によって液体培地３を撹拌しながら細胞２を培養する。培養時には、コントローラ６は、振動子５及び５ａの動作を制御することで、向心力Ｆ１を遠心力Ｆ２と等しくする、又は向心力Ｆ１を遠心力Ｆ２よりも小さくする。

培養が終了したら、コントローラ６は、振動子５及び５ａの動作を制御することで、向心力Ｆ１を遠心力Ｆ２よりも大きくする。これにより、吸入口２１が配置された位置に細胞２が集まる。続いて、吸引ポンプコントローラ１７が吸引ポンプ１６を駆動することで、細胞２が回収用バッグ２０に回収される。

以上説明したように、本実施の形態に係る撹拌装置７００では、コントローラ６が振動子５及び５ａの動作を制御することで、細胞２に作用する向心力Ｆ１と遠心力Ｆ２とを利用して吸入口２１が配置された位置に細胞２を集めることができる。これにより、細胞２を効率的に回収することができる。撹拌装置７００は、集めた細胞２を回収するので、回収した液体培地３中の細胞２の濃度を、撹拌装置６００と比較して高めることができる。

なお、上記のように旋回流１２の速度を制御することで回転軸付近の上昇する流れの大きさを調整することができる。このため、所望の大きさ又は重さを有する細胞２のみを中心Ｏに重なる位置に細胞２を集めることができる。

なお、本実施の形態では、細胞２を回収する構成及び細胞２を集める構成を撹拌装置２００に追加したが、撹拌装置２００に代えて、撹拌装置１００、３００〜５００を用いてもよい。

（実施の形態６）
上記実施の形態５に係る撹拌装置７００では、吸入口２１が配置される培養容器１の中心Ｏに重なる位置に細胞２を集める構成としたが、本発明に係る撹拌装置はこれに限らない。コントローラ６は、振動子５及び５ａの動作を制御し、細胞２に作用する向心力Ｆ１及び遠心力Ｆ２の大きさを適宜調整することで、中心Ｏ以外の任意の位置に細胞２を集めることができる。

また、向心力Ｆ１及び遠心力Ｆ２の大きさの調整によらずとも、超音波の照射方向を変えることによって細胞２を任意の位置に集めることができる。以下では、上記実施の形態４に係る撹拌装置６００の構成に、超音波の照射方向を変えるための構成を備えた撹拌装置８００について、撹拌装置６００と異なる点を主に説明する。

図１７は、撹拌装置８００の構成を示す図である。撹拌装置８００は、振動子５及び５ａの超音波の照射方向を手動で変えられる方向可変機構２２を備える。これにより、振動子５及び５ａから照射される超音波の進行方向を変えることができる。

図１８は、培養容器１に対する平面視での撹拌装置８００の水槽４、振動子５及び５ａを示す。撹拌装置８００では、コントローラ６及び振動子５ａが振動子５から照射される超音波を定在波にする定在波生成部として機能する。振動子５から照射される超音波Ｕ１の進行方向と、振動子５ａから照射される超音波Ｕ２の進行方向とが対向し、超音波Ｕ１の波長、周波数及び振幅と、Ｕ２の波長、周波数及び振幅とがそれぞれ等しい場合、超音波Ｕ１と超音波Ｕ２とが干渉して、定在波が合成される。

定在波は、波の進行があたかも止まっているように観測される波である。定在波で、「腹」の位置で振幅が最大となり、振動が繰り返し行われ、「節」の位置で振幅が最小となる。超音波Ｕ１及び超音波Ｕ２の波長をλとすると、節及び腹はそれぞれλ／２ごとに現れる。

液体培地３に定在波が生じた場合、定在波の節に細胞２を留めることができる。コントローラ６は、振動子５及び５ａから照射される超音波の波長、周波数及び振幅を調整することで、定在波の節を任意の位置に生じさせる。

図１７に戻って、撹拌装置８００は、位置決め部２３を備える。位置決め部２３は、管１５を保持している。位置決め部２３は、管１５を左右前後及び培養容器１の高さ方向に移動させることができる。管１５を移動させることで、位置決め部２３は、吸入口２１を培養容器１内の任意の位置に移動させることができる。

次に、撹拌装置８００の動作について説明する。撹拌装置８００は、超音波による旋回流１２によって液体培地３を撹拌しながら細胞２を培養する。培養が終了したら、図１８に示すように、方向可変機構２２を介して振動子５及び５ａによる超音波の照射方向を変更し、超音波を定在波にする。そして、定在波の節に細胞２が留まるまで待つ。

細胞２が定在波の節に集まると、位置決め部２３が吸入口２１を定在波の節の位置に移動させる。続いて、吸引ポンプコントローラ１７が吸引ポンプ１６を駆動することで、細胞２が回収用バッグ２０に回収される。

以上説明したように、本実施の形態に係る撹拌装置８００では、定在波を用いて細胞２を任意の位置に導き集めることができる。また、撹拌装置８００は、吸入口２１を細胞２の集まる位置に移動させることができるため、細胞２を効率的に回収することができる。

なお、本実施の形態では、振動子５及び５ａの超音波の照射方向を手動で変えられる方向可変機構２２を採用したが、手動ではなくモータ等を用いた自動の位置決め機構で照射方向を変えてもよい。また、方向可変機構２２は、振動子５及び５ａの超音波の照射方向を培養容器１の高さ方向で変えてもよい。こうすることで、液体培地３の液面付近に定在波を生じさせて、液体培地３の液面付近に細胞２を集めることができる。これにより、位置決め部２３が吸入口２１を液体培地３に深く入れずに液面付近に移動させることで細胞２を集めることができる。

位置決め部２３による吸入口２１の移動には、任意の動力、例えばステッピングモータを利用することができる。また、液体培地中３に形成される定在波の節は、１個であっても複数個であってもよい。定在波の節が複数個の場合、位置決め部２３は、吸入口２１を複数個の節の位置に順次移動させればよい。

また、本実施の形態では、振動子５から照射される超音波Ｕ１を反射させて、定在波を生じさせてもよい。この場合、例えば、図１８における振動子５ａの位置に、超音波Ｕ１を振動子５に向けて反射する反射部材を配置すればよい。

なお、本実施の形態では、撹拌装置２００に細胞２を回収する構成、細胞２を集める構成、方向可変機構２２及び位置決め部２３を追加したが、撹拌装置２００に代えて、撹拌装置１００、３００〜５００を用いてもよい。

また、複数の振動子５、又は反射材を配置して、交差する２つの定在波を生じさせてもよい。例えば、図１９に示すように、交差する定在波Ｕ３及びＵ４における交差地点に細胞２を留めることができる。この場合、位置決め部２３が吸入口２１を交差地点に移動させることで、細胞２を効率よく回収できる。

また、図２０に示すように、細胞２を回収する際、定在波Ｕ５で集められた細胞２に向かって超音波Ｕ６を照射してもよい。これにより、細胞２が超音波Ｕ６の進行方向に移動する。位置決め部２３が吸入口２１を細胞２の移動先の位置に固定しておくことで、細胞２を素早く回収することができる。この場合、位置決め部２３は、超音波Ｕ６によって細胞２が移動した位置に吸入口２１を移動させてもよい。

上記のように１つ以上の定在波と、任意の方向に進行する超音波とを組み合わせることで、細胞２を任意の位置に的確に移動させることができる。位置決め部２３が吸入口２１を細胞２が集まった位置に移動させることで、細胞２を効率よく回収することができる。

なお、別の実施の形態では、上記実施の形態１〜６に係る撹拌装置１００〜８００を備える、細胞培養装置が提供される。

１ 培養容器、２ 細胞、３ 液体培地、３ａ 液面、４，１３ 水槽、４ａ、４ｂ、４ｃ，４ｄ，４ｅ，４ｆ，４ｇ，４ｈ 壁、５，５ａ，５ｂ，５ｃ，５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｇ 超音波振動子、６ コントローラ、７ 駆動用電源、８ 設置台、９ 液体、１０ 粘弾性体、１１ ケーブル、１２ 旋回流、１４ 減衰材、１５ 管、１６ 吸引ポンプ、１７ 吸引ポンプコントローラ、１８ 吸引ポンプ駆動電源、１９ 開閉弁、２０ 回収用バッグ、２１ 吸入口、２２ 方向可変機構、２３ 位置決め部、１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００ 撹拌装置。

Claims (12)

1. 細胞及び液体培地を保持する培養容器の水平断面における該培養容器の中心を中心とする円の接線に超音波の中心軸を一致させて、前記液体培地に向かって該超音波を照射する照射部と、
   前記照射部の動作を制御する制御部と、
   を備える、撹拌装置。
2. 前記照射部が照射した超音波は、
   前記培養容器に対する平面視において、前記中心軸の方向に垂直な方向の幅がＤの音響流を前記液体培地に励起し、
   前記培養容器の中心と前記超音波の中心軸との距離ＬがＤ／２以上である、
   請求項１に記載の撹拌装置。
3. 前記照射部は、複数個であって、
   すべての前記照射部は、
   前記培養容器に対する平面視において、前記照射部から前記超音波の進行方向に向かって、前記中心軸に対して左右同じ側に前記培養容器の中心が位置する方向に前記超音波を照射する、
   請求項１又は２に記載の撹拌装置。
4. 前記制御部は、
   複数個の前記照射部それぞれから交互に前記超音波を照射させる、
   請求項３に記載の撹拌装置。
5. 前記超音波の進行方向に対向する位置に、該超音波を減衰する減衰材をさらに備え、
   前記照射部と前記減衰材との間に前記培養容器が配置される、
   請求項１から４のいずれか一項に記載の撹拌装置。
6. 開口した一端を吸入口として有する管と、
   前記培養容器内の前記細胞を前記吸入口から吸引して前記細胞を回収する回収部と、
   をさらに備える、請求項１から５のいずれか一項に記載の撹拌装置。
7. 前記吸入口は、
   前記培養容器に対する平面視において、前記培養容器の水平断面における前記培養容器の中心に重なる位置に配置され、
   前記制御部は、
   前記回収部が前記細胞を回収する際、前記照射部の動作を制御することで、前記液体培地の旋回流によって前記細胞に作用する向心力を遠心力よりも大きくする、
   請求項６に記載の撹拌装置。
8. 前記回収部が前記細胞を回収する際、前記照射部から照射される前記超音波を定在波にする定在波生成部をさらに備え、
   前記回収部は、
   前記定在波で集められた前記細胞を回収する、
   請求項６又は７に記載の撹拌装置。
9. 前記照射部は、
   前記回収部が前記細胞を回収する際、前記定在波で集められた前記細胞に向かって前記超音波を照射する、
   請求項８に記載の撹拌装置。
10. 前記吸入口を前記培養容器内の任意の位置に移動させる位置決め部をさらに備える、
    請求項６から９のいずれか一項に記載の撹拌装置。
11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の撹拌装置を備える、
    細胞培養装置。
12. 細胞及び液体培地を保持する培養容器の水平断面における該培養容器の中心を中心とする円の接線に超音波の中心軸を一致させて、前記液体培地に向かって該超音波を照射する、
    撹拌方法。