ES2349858T3 - Procedimiento y dispositivo de concentración acústiva y procedimiento de reacción. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de concentración para el aumento de la concentración de material en un líquido, en el que - un líquido (10) con material contenido en el mismo se introduce en un recipiente (12) y - ondas acústicas se emiten de tal modo en el líquido que en el recipiente (12) se genera una estructura de flujo estacionaria (20) con zonas de distintas velocidades de flujo, acumulándose el material (22, 24) en las zonas con una velocidad de flujo mínima.

Description

La invención se refiere a un procedimiento de concentración para el aumento de la concentración de material en un líquido, a un dispositivo de concentración para la realización del procedimiento y a un procedimiento de reacción usándose el procedimiento de concentración.

En particular en la investigación biológica o en el diagnóstico se presenta en muchos casos el problema de hacer reaccionar partículas de material, en particular células o llamadas microesferas (beads) entre sí o con macromoléculas biológicas, como ácidos nucleicos, proteínas, antígenos, anticuerpos, etc. ‘Beads’ significa microesferas de un diámetro entre algunos 100 nm y algunos µm, en los que está aplicado un reactivo de partida. Un ejemplo son las pruebas de aglutinación en látex, como están descritas, p.ej., en el documento US 4,960,715. Allí, se usan bolitas de látex con un diámetro entre algunos 100 nm y algunos µm que están recubiertas con anticuerpos o antígenos. En la muestra de líquido se detectan a continuación correspondientemente anticuerpos o antígenos que pueden reaccionar con las moléculas en las microesferas y que pueden reticular las microesferas entre sí. Esta llamada aglutinación o agregación puede evaluarse ópticamente y sirve para detectar la presencia de anticuerpos o antígenos en la muestra. En el presente texto, el concepto “reacción” comprenderá, dado el caso, también el proceso de reticulación entre las microesferas.

Las partículas de material en el líquido que deben reaccionar entre sí se aproximan unas a otras debido a la difusión. Este proceso puede ser reforzado mezclando o agitando activamente.

Sería deseable aproximar mucho unas a otras las distintas partículas de material en la solución para aumentar la probabilidad de reacción. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante una concentración suficientemente elevada de partículas en la solución. No obstante, en muchos no está disponible suficiente material para conseguir una concentración del grado de concentración deseable. Este problema se presenta, en particular, también cuando se pretenden analizar las interacciones célula-célula en una solución, la reacción de células con microesferas recubiertas o entre microesferas con diferentes recubrimientos.

También independientemente de una reacción en la que los reactivos de partida deberían aproximarse mucho entre sí, en algunas aplicaciones es deseable conseguir un aumento de la concentración de partículas de material en una solución.

Un procedimiento conocido para el aumento de la concentración es el uso de filtros, membranas u otros medios porosos, como está descrito en el documento US 6,887,384. En un filtro pueden producirse, no obstante, reacciones no especificas con la pared del filtro y, por lo general, es imposible realizar mediciones de transmisión en el medio concentrado.

Otra posibilidad para el aumento de la concentración es la centrifugación, como se usa, p.ej., en el enriquecimiento de uranio. Para ello debe introducirse un recipiente de reacción en una centrífuga y volver a retirarse tras la centrifugación para poder realizar una medición, de modo que el procedimiento es costoso.

El objetivo de la presente invención es indicar un procedimiento para el aumento de la concentración de material en un líquido, cuya realización sea fácil y económica y que permita, dado el caso, también mediciones directamente en el recipiente de concentración.

Este objetivo se consigue con un procedimiento de concentración para el aumento de la concentración de material en un líquido con las características de la reivindicación 1. La reivindicación 9 se refiere a un procedimiento de reacción para la reacción de al menos dos reactivos de partida en un líquido, que use el procedimiento de concentración según la invención. Un dispositivo de concentración para la realización del procedimiento según la invención es objeto de la reivindicación 15. Las reivindicaciones subordinadas se refieren a configuraciones preferibles.

En el procedimiento de concentración según la invención, un líquido con material contenido en el mismo se introduce en un recipiente emitiéndose ondas acústicas de tal modo en el líquido que en el recipiente se genera una estructura de flujo estacionaria con zonas de distintas velocidades de flujo. Las partículas de material, p.ej. células o microesferas, se acumulan y concentran en regiones del líquido en las que la velocidad de flujo es mínima, en particular, en las que es igual a cero. De este modo, las partículas pueden aproximarse mucho unas a otras, lo cual conduce en estas zonas a un aumento de la concentración con una concentración local más elevada. A diferencia del uso de ondas acústicas para la homogeneización, para la agitación o la mezcla de líquido, en el que se desea una estructura de flujo no estacionaria, generándose la misma, p.ej. mediante un variación de la amplitud y/o de la frecuencia de las ondas aplicadas, el procedimiento de concentración según la invención está basado en el uso de una estructura de flujo estacionaria, que puede conseguirse, p.ej., porque se mantienen constantes la amplitud y/o la frecuencia de las ondas acústicas emitidas.

El material que ha de ser concentrado en el líquido comprende, p.ej., células, microesferas recubiertas, partículas u otros reactivos de partida.

Ya al generar mediante la estructura de flujo estacionaria zonas en el recipiente en las que la velocidad de flujo es inferior a la del entorno, esto conduce a una acumulación de material en estas zonas. Es especialmente ventajoso generar zonas con una velocidad de flujo próxima a cero, preferiblemente igual a cero.

El lugar de emisión y la dirección de emisión de las ondas acústicas dependen de la forma de recipiente usada y pueden optimizarse p.ej. con ayuda de experimentos. Por lo general, es suficiente acoplar ondas acústicas en un lugar del recipiente y en una dirección. No obstante, también son posibles aplicaciones en las que se emiten ondas acústicas en distintos lugares y/o en distintas direcciones en el líquido, para generar un aumento de concentración en zonas deseadas determinadas del recipiente.

Las ondas acústicas pueden generase, p.ej., con ayuda de un transductor de volumen piezoeléctrico que se encuentra en la pared del recipiente o que está integrado en la pared del recipiente. Es especialmente sencillo y ventajoso el uso de al menos un transductor interdigital, como son conocidos por la tecnología de filtros de alta frecuencia. Los transductores interdigitales de este tipo, que están aplicados en materiales piezoeléctricos, pueden usarse para la excitación de ondas acústicas, en particular de ondas acústicas de superficie, en el material piezoeléctrico mediante la aplicación de una frecuencia de p.ej. algunos MHz a algunos 100 MHz. Comprenden electrodos metálicos realizados a modo de peine, que engranan a modo de dedos unos en otros y que pueden fabricarse mediante un procedimiento de fotolitografía con una distancia entre los dedos del orden de p.ej. 10 µm. Los transductores interdigitales están previstos, p.ej., en cristales piezoeléctricos, para excitar en ellos de forma de por sí conocida ondas acústicas de superficie, definiendo la distancia doble entre dedos de los electrodos metálicos que engranan unos en otros a modo de peine la longitud de onda de las ondas acústicas de superficie, que se propagan por lo general en la dirección perpendicular respecto a la orientación de los electrodos a modo de dedos. Cuando un transductor interdigital de este tipo aplicado en un substrato piezoeléctrico se pone en contacto con la pared del recipiente, p.ej. mediante un medio de acoplamiento, la deformación periódica de la superficie excitada en el material piezoeléctrico mediante la aplicación de una alta frecuencia en el transductor interdigital provoca la generación de ondas acústicas mediante la pared del recipiente y el líquido.

En principio, las ondas acústicas pueden acoparse, p.ej., en la pared lateral del recipiente. Se obtienen condiciones simétricas y sencillas si el acoplamiento se realiza desde abajo.

La velocidad con la que se produce un aumento de la concentración en el recipiente depende entre otras cosas de la geometría del recipiente, de la disposición elegida de los dispositivos para la generación de las ondas acústicas, de la potencia emitida de las ondas acústicas, de la viscosidad y del nivel de relleno. Los tiempos, geometrías y los parámetros externos de flujo, como la potencia, la frecuencia, la superficie de la pared del recipiente a través de la cual se emiten las ondas acústicas, la geometría del recipiente y el nivel de relleno pueden optimizarse de forma específica para cada prueba.

El material concentrado puede evacuarse desde las zonas con una

velocidad de flujo mínima, en las que se acumula el material en el líquido. De

este modo, el líquido con una concentración más elevada de material puede transferirse p.ej. a otro recipiente. En particular, puede transferirse p.ej. con ayuda de una pipeta sólo un elemento de volumen tal del líquido en el recipiente en el que la velocidad de flujo es mínima, por lo que se presenta una concentración localmente más elevada tras el aumento de la concentración del material. El líquido transferido tiene por lo tanto una concentración más elevada. Los volúmenes típicos para un aumento de la concentración de este tipo están situados, p.ej. entre algunos µl y algunos 100 µl.

El procedimiento de concentración según la invención puede usarse de forma especialmente ventajosa para aproximar dos tipos de reactivos de partida en un líquido hasta tal punto que aumente la probabilidad de reacción. En las zonas en las que la velocidad de flujo es mínima, preferiblemente igual a cero, se acumulan los reactivos de partida por lo que llegan más rápidamente a una reacción de lo que sería el caso, p.ej., en un procedimiento de reacción que depende exclusivamente de la difusión.

El procedimiento de reacción puede usarse, p.ej., para examinar interacciones célula-célula en una solución o la reacción de células con microesferas recubiertas o la reacción entre microesferas con distintos recubrimientos. Los productos de reacción que se encuentran en las zonas con una velocidad de flujo mínima pueden evacuarse a continuación directamente, p.ej. pueden aspirarse con una pipeta. El procedimiento de reacción según la invención ofrece, no obstante, en particular la ventaja de que, gracias a una observación directa de una zona con velocidad de flujo mínima, en la que se produce preferiblemente una reacción, puesto que los reactivos están próximos unos a otros gracias al aumento de la concentración, la reacción puede evaluarse directamente. Esto puede realizarse, p.ej., con ayuda de procedimientos ópticos, en particular la medición de la fluorescencia de las zonas correspondientes.

El procedimiento de reacción según la invención puede usarse, en particular, de tal modo que los dos reactivos de partida de una reacción se acumulan en las zonas de una velocidad de flujo mínima para aumentar así la probabilidad de una reacción. En otra configuración especialmente ventajosa, se usan los llamados beads, es decir, microesferas de un diámetro entre algunos 100 nm y algunos µm, en las que se ha aplicado uno de los reactivos de partida. El reactivo de partida aplicado puede estar formado, por ejemplo, por anticuerpos o antígenos. Si en el líquido en el que se han introducido las microesferas se encuentran los antígenos o anticuerpos complementarios correspondientes, éstos se ligan al recubrimiento de las microesferas y pueden conducir a una reticulación de las microesferas. Esta aglutinación puede evaluarse ópticamente, de modo puede deducirse la presencia de anticuerpos

o antígenos que corresponden a los antígenos o anticuerpos aplicados en las microesferas. Gracias al uso del procedimiento de aumento de la concentración según la invención se concentran las microesferas en las zonas con una velocidad de flujo mínima, de modo que se favorece y acelera la reticulación.

La invención se refiere, además, a un dispositivo de concentración para la realización del procedimiento de concentración según la invención o del procedimiento de reacción según la invención. El dispositivo de concentración según la invención presenta un dispositivo o varios dispositivos para la generación de ondas acústicas, que está dispuesto o que están dispuestos de tal modo que mediante las ondas acústicas generadas por el mismo o los mismos puede generarse una estructura de flujo estacionaria en el líquido.

Un dispositivo de concentración según la invención puede usarse, en particular, en un autómata configurado de forma correspondiente, en el que el dispositivo o los dispositivos para la generación de ondas acústicas se controla

o controlan con ayuda de un dispositivo de control automático. El dispositivo de control comprende, por ejemplo, un microprocesador que está programado de tal modo que el suministro de energía a los dispositivos para la generación de ondas acústicas se controla de tal modo que se ajuste la estructura de flujo estacionaria deseada. El desarrollo del procedimiento necesario, que ha de ser programado para ello, puede determinarse, por ejemplo, previamente mediante experimentos.

La invención se explicará detalladamente con ayuda de la Figura 1, que muestra en una representación esquemática una disposición para la realización del procedimiento según la invención.

En el recipiente de reacción 12 se encuentra un líquido 10, en el que se encuentran microesferas recubiertas p.ej. con anticuerpos o antígenos. En la forma de realización representada, en el fondo del recipiente está dispuesto como generador de sonido un substrato piezoeléctrico 16, que comprende p.ej. un cristal de niobato de litio, con un transductor interdigital 14 dispuesto en el mismo. El signo de referencia 18 se refiere a un medio de acoplamiento, p.ej. agua, aceite, glicerina, silicona, resina epoxi o una película de gel para compensar irregularidades y garantizar un acoplamiento óptimo. Para la conexión de los electrodos del transductor interdigital 14 están previstas líneas de alimentación eléctricas de una forma de por sí conocida a una fuente de alta frecuencia, que no están representadas en la Figura 1. La representación del transductor interdigital 14 sólo está realizada de forma esquemática. De forma de por sí conocida, el número de los dedos que engranan unos en otros del transductor interdigital es mucho más elevado del que está representado. En la Figura 1 está esbozado de forma esquemática el corte lateral a través de los electrodos en forma de dedos que engranan a modo de peine unos en otros del transductor interdigital 14.

Al aplicarse un campo alterno eléctrico a los electrodos del transductor interdigital 14, se genera una onda acústica de superficie en el cristal piezoeléctrico 16. Mediante el medio de acoplamiento 18 y la pared del recipiente, esto provoca la generación de ondas acústicas en el líquido 10.

La disposición mostrada debe comprender una geometría de transductor interdigital que conduzca a una aplicación orientada de ondas acústicas al líquido 10 en la dirección de la flecha 15. Esto puede conseguirse, p.ej., mediante la elección de un transductor que emite de forma unidireccional, es decir, que sólo emite en una dirección.

Como alternativa puede usarse, p.ej., un transductor interdigital que emite de forma bidireccional, que no está dispuesto de forma simétrica en el recipiente. Es posible, p.ej., la disposición de un transductor interdigital que emite de forma bidireccional en una esquina del recipiente, de modo que sólo una de las dos direcciones de emisión está dirigida al interior del recipiente. Finalmente pueden realizarse geometrías en las que una dirección de emisión de un transductor interdigital que emite de forma bidireccional es absorbida o reflejada de forma selectiva.

En la Figura 1, el signo de referencia 20 se refiere a un flujo estacionaria representado de forma esquemática, que se genera mediante la emisión de ondas acústicas en la dirección de la flecha 15. 22 y 24 se refieren a material ya concentrado en el líquido 10, p.ej. microesferas recubiertas.

El dispositivo mostrado puede usarse de la siguiente manera. Se explicará un ejemplo en el que deben detectarse determinados anticuerpos en un líquido. Para ello, las microesferas se recubren con los antígenos que corresponden a estos anticuerpos y se introducen en el líquido 10 en el recipiente 12. La aplicación de un campo alterno eléctrico al transductor interdigital 14 que emite de forma unidireccional provoca la aplicación de una onda acústica en la dirección de la flecha 15. Esto conduce a la formación de una estructura de flujo estacionaria que se designa con 20 y está representada esquemáticamente. La velocidad de flujo se reduce desde el circuito de flujo 20 hacia el exterior y hacia el interior. En las zonas en las que hay una velocidad de flujo igual a cero, se acumulan las microesferas recubiertas con los antígenos. Para las zonas en la pared del recipiente esto está representado de forma esquemática mediante las cruces con el signo de referencia 22 y para el centro del recipiente mediante las cruces con el signo de referencia 24. Si en el líquido 10 hay anticuerpos que corresponden a los antígenos aplicados en las microesferas, éstos se ligan a los antígenos aplicados en las microesferas, de modo que las microesferas pueden reticular unas con otras. Gracias a la elevada concentración de las microesferas 22, 24 en las zonas con una velocidad de flujo mínima, este proceso de reticulación se favorece y acelera.

La reticulación o aglutinación en las zonas con una velocidad de flujo mínima puede evaluarse ópticamente y puede servir de este modo para la detección de la presencia de anticuerpos que corresponden a los antígenos aplicados en las microesferas.

En una forma de realización no mostrada no se usa ningún transductor interdigital sino un transductor de volumen piezoeléctrico, que está dispuesto p.ej. de tal modo que tiene lugar un acoplamiento oblicuo de la onda acústica.

Lista de signos de referencia: 10 Líquido con material que ha de ser concentrado 12 Recipiente 14 Transductor interdigital 15 Dirección de las ondas acústicas aplicadas 16 Substrato piezoeléctrico 18 Medio de acoplamiento 20 Circuito de flujo estacionario 22, 24 Material concentrado

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Procedimiento de concentración para el aumento de la concentración de

   material en un líquido, en el que -un líquido (10) con material contenido en el mismo se introduce en un recipiente (12) y -ondas acústicas se emiten de tal modo en el líquido que en el recipiente (12) se genera una estructura de flujo estacionaria (20) con zonas de distintas velocidades de flujo, acumulándose el material (22, 24) en las zonas con una velocidad de flujo mínima.

2. 2.

   Procedimiento de concentración según la reivindicación 1, en el que las ondas acústicas se emiten de tal modo que se genera al menos una zona con una velocidad de flujo próxima a cero, preferiblemente igual a cero.

3. 3.

   Procedimiento de concentración según una de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que unas ondas acústicas se emiten en el líquido (10) en un lugar y/o en una dirección.

4. 4.

   Procedimiento de concentración según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los lugares de emisión y/o la dirección de emisión de las ondas acústicas se eligen de tal modo que en el líquido se ajustan varias zonas con una velocidad de flujo próxima a cero, preferiblemente igual a cero.

5. 5.

   Procedimiento de concentración según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que para la generación de las ondas acústicas se usa al menos un transductor interdigital (14) en un substrato piezoeléctrico (16).

6. 6.

   Procedimiento de concentración según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las ondas acústicas se emiten al menos en parte desde abajo en el líquido (10).

7. 7.

   Procedimiento de concentración según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el líquido que contiene material concentrado de zonas con una velocidad de flujo mínima, preferiblemente de zonas con una velocidad de flujo igual a cero, es retirado del recipiente (12).

8. 8.

   Procedimiento de concentración según la reivindicación 7, en el que el líquido con material concentrado se aspira con ayuda de una pipeta.

9. 9.

   Procedimiento de reacción para la reacción de al menos dos reactivos de partida en un líquido, en el que el líquido (10) se concentra usándose un procedimiento de concentración según una de las reivindicaciones 1 a 6 de tal modo que al menos uno de los reactivos de partida (22, 24) se acumula en al menos una zona con una velocidad de flujo próxima a cero, preferiblemente igual a cero.

10. 10.

    Procedimiento de reacción según la reivindicación 9, en el que al menos dos reactivos de partida en el líquido se concentran con ayuda del procedimiento de concentración.

11. 11.

    Procedimiento de reacción según una de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que al menos uno de los reactivos de partida está aplicado en microesferas (22, 24).

12. 12.

    Procedimiento de reacción según la reivindicación 11, en el que la reacción se evalúa mediante la observación de la aglutinación o agregación de microesferas (22, 24), que se permite gracias a la reacción del al menos un reactivo de partida aplicado en las microesferas con un reactivo de partida en el líquido.

13. 13.

    Procedimiento de reacción según una de las reivindicaciones 9 a 12, en el que la reacción se evalúa mediante la observación de al menos una zona con una velocidad de flujo mínima, preferiblemente una velocidad de flujo

    próxima a cero.

14. 14.

    Procedimiento de reacción según la reivindicación 13, en el que la

    reacción se evalúa con ayuda de procedimientos ópticos, en particular 5 mediante la medición de la fluorescencia.
15. 15. Dispositivo de concentración para la realización de un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, con un recipiente (12) para el alojamiento del líquido (10), que presenta un dispositivo (14) o varios

    10 dispositivos para la generación de ondas acústicas, que está/n dispuesto/s de tal modo que mediante las ondas acústicas generadas por el mismo/los mismos puede generarse una estructura de flujo estacionaria (20) en el líquido (10).

    15 16. Dispositivo de concentración según la reivindicación 15, en el que el al menos un dispositivo para la generación de ondas acústicas comprende al menos un transductor interdigital (14) en un substrato piezoeléctrico (16).
16. 17. Dispositivo de concentración según una de las reivindicaciones 15 ó 16,

    20 en el que está previsto al menos un dispositivo para la generación de ondas acústicas en el lado inferior del recipiente (12).