WO2020004528A1 - グリオーマ検出用バイオマーカー - Google Patents

グリオーマ検出用バイオマーカー Download PDF

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WO2020004528A1
WO2020004528A1 PCT/JP2019/025538 JP2019025538W WO2020004528A1 WO 2020004528 A1 WO2020004528 A1 WO 2020004528A1 JP 2019025538 W JP2019025538 W JP 2019025538W WO 2020004528 A1 WO2020004528 A1 WO 2020004528A1
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glioma
ptprz
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free
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橋本　康弘
しのぶ 北爪
京香 星
正純 藤井
友太 村上
優 山ノ井
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公立大学法人福島県立医科大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for detecting glioma, a method for detecting glioma using the biomarker, and a kit for detecting glioma.
  • Glioma (glioma) is a general term for tumors thought to arise from glial cells, accounting for about 30% of brain tumors, and is a primary brain tumor frequently observed in humans (Non-Patent Document 1). There are many malignant tumors with poor prognosis, and the development of more accurate diagnosis and treatment is required.
  • Non-Patent Document 2 Primary brain tumors include more than 100 types including pathological subtypes, but the optimal treatment differs for each tumor. Therefore, it is important to accurately diagnose the type of tumor.
  • diagnosis of brain tumors before surgery mostly depends on diagnostic imaging such as CT, MRI, or PET.
  • image diagnosis accurate information can be obtained on the localization of a lesion, but often information specific to the type of tumor cannot be obtained.
  • malignant lymphoma of the same central nervous system tumor as glioma and multiple sclerosis which is a non-neoplastic disease of the central nervous system, may be similar to the primary brain tumor because the findings on the image may be similar to the primary brain tumor. It is sometimes difficult to distinguish a brain tumor (Non-Patent Document 3).
  • brain biopsy partial sampling of brain tissue by craniotomy or craniotomy.
  • brain biopsy is highly invasive and carries the risk of sequelae due to intracranial hemorrhage. After brain biopsy, it usually takes 1 to 2 weeks or more before pathological diagnosis can be obtained. In actual clinical practice, a considerable period of time must elapse between securing the operation schedule, performing surgery, and confirming pathological diagnosis. It becomes. This is a major problem from the viewpoint of early diagnosis and early treatment.
  • brain biopsy requires in-patient treatment in principle, the burden on patients is large in terms of medical expenses. That is, in the conventional diagnosis and treatment, two hospitalizations of a brain biopsy for diagnosis and a tumor extirpation operation are required.
  • Non-Patent Documents 4 and 5 Non-Patent Documents 4 and 5
  • tumor markers present in blood and cerebrospinal fluid have not been put to practical use, and gliomas are highly effective The tumor marker itself is unknown.
  • An object of the present invention is to develop and provide a method for simply and easily detecting glioma. It is also an object to develop and provide tumor markers for use in the method.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • PTPRZ human receptor-type protein tyrosine phosphatase Z
  • PRPRZ1 Receptor type-Protein Tyrosine Phosphatase Receptor 1 zeta: PTPRZ, PRPRZ1, PTP ⁇ , or RPTP ⁇ .
  • PTPRZ Receptor type-Protein Tyrosine Phosphatase Receptor 1 zeta: PTPRZ, PRPRZ1, PTP ⁇ , or RPTP ⁇ .
  • PTPRZ Receptor type-Protein Tyrosine Phosphatase Receptor 1 zeta
  • PTPRZ Receptor type-Protein Tyrosine Phosphatase Receptor 1 zeta
  • the PTPRZ1 gene encoding PTPRZ is known to be highly expressed in glioma cells (MullerulS., Et al., 2003, Oncogene, 22: 6661-6668). It is also known that PTPRZ plays an important role in cell invasion and tumor formation (Fujikawa et al., 2017, Scientific Reports, 17 (1): 5609). However, unlike mouse Ptprz, no secreted PTPRZ has been identified in the human PTPRZ isoform. Therefore, the partial region of human PTPRZ released into the cerebrospinal fluid suggests that the extracellular region of PTPRZ is a peptide fragment which has been cleaved by protease or the like and has become free.
  • a method for detecting glioma wherein the amount of free receptor protein tyrosine phosphatase Z (free PTPRZ) protein contained per unit volume of cerebrospinal fluid derived from a subject is measured, and the measured value is obtained. And a step of determining in vitro the presence or absence of glioma in the subject based on the measurement values obtained in the measurement step, wherein the free PTPRZ comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5.
  • the above method wherein the extracellular region of PTPRZ is cleaved.
  • the glioma susceptibility of the subject is determined based on a cutoff value calculated from a measurement value of a glioma patient and a non-glioma patient.
  • the measured value of the subject is compared with the measured value of free PTPRZ contained per unit volume of cerebrospinal fluid derived from a control subject not having glioma, and the measured value of the subject is calculated.
  • the free PTPRZ has a truncated extracellular region of PTPRZ consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 5.
  • Said method (5) The identification method according to (4), wherein the other primary tumor in the central nervous system is malignant lymphoma or schwannoma, and the non-neoplastic disease in the central nervous system is multiple sclerosis.
  • a glioma detection kit comprising a binding means for specifically recognizing and binding all or a part of the extracellular region of PTPRZ comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5.
  • the binding means is an antibody or an aptamer.
  • a method for evaluating the presence or absence of glioma recurrence wherein in a subject who has a history of glioma treatment, free PTPRZ contained per unit volume of cerebrospinal fluid derived from the subject after a predetermined period has elapsed after surgery Measuring the amount of protein, a measurement step of obtaining the measurement value, based on the measurement value obtained in the measurement step, including an evaluation step of evaluating the presence or absence of glioma recurrence of the subject in vitro, the free PTPRZ is PTPRZ The above evaluation method, wherein the extracellular region is cut.
  • a biomarker composed of free PTPRZ for detecting glioma (12) The biomarker according to (11), wherein the free PTPRZ is composed of an extracellular region of PTPRZ. (13) The biomarker according to (11) or (12), wherein the free PTPRZ comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a part thereof. (14) The biomarker according to (13), wherein the free PTPRZ containing a part thereof has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the glioma detection method of the present invention it is possible to easily and easily detect glioma disease by using a test subject's cerebrospinal fluid as a test sample.
  • malignant tumors such as primary malignant lymphomas of the central nervous system and central nervous systems such as multiple sclerosis (multiple sclerosis: MS) having high similarity in findings in diagnostic imaging and gliomas are also provided. Discrimination from a nervous system non-neoplastic disease can be performed clearly and accurately. It is also useful for differentiating from benign tumors other than glioma such as schwannoma.
  • a glioma detection biomarker that can be present in a cerebrospinal fluid derived from a subject can be detected, and glioma disease of the subject can be easily and easily detected.
  • I to IV are cerebrospinal fluid from patients with glioma of each grade
  • SW is cerebrospinal fluid from patients with schwannoma
  • MS is cerebrospinal fluid from patients with multiple sclerosis
  • 2 respectively show the cerebrospinal fluid of a patient with idiopathic normobaric hydrocephalus.
  • fPTPRZ-long and fPTPRZ-short generate broad bands at positions of about 400 kDa (about 350 to 400 kDa) and about 190 kDa (about 160 to 190 kDa), respectively, due to the influence of modified sugar chains and the like.
  • FIG. 4 is a diagram quantifying a band (A) around 400 kDa and a band (B) around 190 kDa obtained in Example 2.
  • the vertical axis indicates the signal intensity.
  • data was shown by the average value +/- standard error.
  • FIG. 4 is a view quantifying a band (A) around 400 kDa and a band (B) around 190 kDa obtained in Example 3.
  • the vertical axis indicates the signal intensity.
  • data was shown by the average value +/- standard error.
  • FIG. 9 is a view quantifying a band (A) near 400 kDa and a band (B) near 190 kDa obtained in Example 4.
  • the vertical axis indicates the signal intensity.
  • data was shown by the average value +/- standard error.
  • Glioma detection method 1-1 Overview
  • a first aspect of the present invention is a glioma detection method.
  • the present invention measures the amount of a glioma-detecting biomarker contained in a cerebrospinal fluid derived from a subject, and based on the measured value, for example, an in vitro test, determines whether or not the subject has glioma. It is characterized by the following.
  • a highly invasive brain biopsy is not required, and other primary nervous system tumors and central nervous system Differentiation from non-neoplastic diseases is also facilitated.
  • Glioma is a general term for tumors that are generated from glial cells (glial cells) that support brain nerve cells. Glioblastoma, astrocytic tumor, oligodendroglial tumor, ependymal tumor Tumors and the like are included. Glioma is highly invasive, and most clinically classified as malignant brain tumors. However, gliomas are classified into four WHO grades in pathological diagnosis according to the grade of malignancy. The higher the grade, the higher the grade of malignancy, and some of them include benign tumors. In general, pilocytic astrocytomas etc.
  • grade I is grade I
  • diffuse astrocytomas and oligodendrogliomas etc. are grade II
  • Grade III is classified and glioblastoma is classified as grade IV.
  • Grade I is a benign tumor
  • grades II, III, and IV are malignant tumors.
  • Grade IV in particular has a very high degree of malignancy, with a life expectancy of only 14 months despite surgery and radiation / chemotherapy.
  • the gliomas herein include tumors belonging to any grade, and the gliomas in the methods and kits of the present invention may be of any grade.
  • the “primary tumor of the central nervous system” refers to a tumor that first occurs in the central nervous system such as the brain and spinal cord.
  • the present specification includes both benign tumors and malignant tumors.
  • benign tumors include, but are not limited to, meningiomas and schwannomas.
  • malignant tumors include, but are not limited to, gliomas and malignant lymphomas.
  • another central nervous system primary tumor means a central nervous system primary tumor other than glioma.
  • a primary tumor of the central nervous system which is difficult to distinguish from glioma in diagnosis, is applicable.
  • central nervous system non-neoplastic disease refers to a non-neoplastic disease that occurs in the central nervous system.
  • non-neoplastic diseases that are difficult to distinguish from gliomas in diagnosis are applicable. For example, but not limited to, multiple sclerosis.
  • the “biomarker for detecting glioma” is a biomarker that reflects the presence or absence of glioma. It may also be a marker for differentiating glioma from other CNS primary tumors or CNS non-neoplastic diseases.
  • the biomarker for detecting glioma in the present specification is, specifically, a polypeptide comprising the extracellular region of receptor-type protein tyrosine phosphatase Z or a glycosylated polypeptide (Glycosylated polypeptide) comprising the region, or a part thereof. Polypeptide.
  • the amount is increased in patients with glioma compared to non-glioma patients.
  • Receptor-type protein tyrosine phosphatase Z (often referred to herein as“ PTPRZ ”, as described above) is a receptor-type protein tyrosine phosphatase (receptor-type ⁇ PRPs: RPTPs) belonging to the protein tyrosine phosphatase superfamily. Is a one-time transmembrane membrane protein whose N-terminal is exposed outside the cytoplasm. RPTPs are classified into eight subfamilies based on structural similarity, while PTPRZ is classified into the R5 subfamily.
  • PTPRZ is composed of a carbonic anhydrase-like domain (CA domain), a type III fibronectin-like domain (FN domain), a serine-glycine-rich chondroitin sulfate chain-binding region (CS-binding region), and a membrane. It is composed of a transmembrane domain and two PTP domains (D1 and D2) located on the C-terminal side of the cell. PTPRZ is mainly expressed in the central nervous system and is known to be involved in demyelination and the like (Harroch S. et al., 2002, atNat. Genet. 32, 411-4; Kuboyama K. et al. 2012, PloS One. 7, e48797).
  • PTPTPRZ in the present specification means human PTPRZ unless otherwise specified.
  • three isoforms (isoforms 1 to 3) shown in FIG. 1 have been identified.
  • Isoform 1 (often referred to as “PTPRZ-iso1” in the present specification) consists of 2315 amino acid residues represented by SEQ ID NO: 1.
  • PTPRZ-iso1 is the longest PTPRZ, with a signal peptide at positions 1 to 24, a CA domain at positions 45 to 298, an FN domain at positions 313 to 401, a transmembrane domain at positions 1637 to 1662, and 1717. It has a D1 domain at positions 1991992 and a D2 domain at positions 2023-2282.
  • the CS binding region corresponds to a region where a CS chain is bound between the FN domain and the transmembrane domain.
  • the extracellular region consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 corresponding to positions 25 to 1636 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Isoform 2 (often referred to herein as “PTPRZ-iso2”) consists of 2308 amino acid residues represented by SEQ ID NO: 2.
  • PTPRZ-iso2 is an isoform in which 8 amino acid residues corresponding to positions 1723 to 1729 of the D1 domain in PTPRZ-iso1 have been deleted.
  • the extracellular region of isoform 2 is identical to that of isoform 1 and consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • Isoform 3 (often referred to as “PTPRZ-iso3” in the present specification) consists of 1448 amino acid residues represented by SEQ ID NO: 3.
  • PTPRZ-iso3 is an isoform in which 860 amino acid residues at positions 755 to 1614, which may correspond to most of the CS binding region in PTPRZ-iso1, and 8 amino acid residues corresponding to positions 1723 to 1729, have been deleted. Therefore, the extracellular region of isoform 3 is shorter than that of isoforms 1 and 2 and is derived from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 corresponding to positions 25 to 754 and 1615 to 1636 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Become.
  • mouse Ptprz three isoforms consisting of Ptprz-A, Ptprz-B, and Ptprz-S are known (ChowCJP, et al., 2008, J Biol Chem., 283 (45) : 30879-89).
  • mouse Ptprz-S is expressed as a secreted Ptpr that does not contain a transmembrane domain or a tyrosine phosphatase domain.
  • free receptor protein tyrosine phosphatase Z (in this specification, often referred to as” free PTPRZ "or” fPTPRZ (free-type @ PTPRZ) ") refers to each isoform in the human PTPRZ.
  • polypeptide fragment comprising a part thereof refers to a polypeptide fragment comprising the extracellular region of each isoform in the human PTPRZ or any fragment produced by degrading a glycosylated polypeptide fragment comprising the region.
  • Means PTPRZ has a site sensitive to proteases at the C-terminal side of the extracellular region. When this site is cleaved by the decomposition of a protease such as a metalloprotease, it becomes free PTPRZ.
  • free PTPRZ includes about 400 kDa long-form (often referred to as “fPTPRZ-long”) and about 190 kDa short-form derived from the extracellular domain of PTPRZ.
  • fPTPRZ-long long-form
  • fPTPRZ-short short-form derived from the extracellular domain of PTPRZ.
  • the two types are mainly referred to as “fPTPRZ-short”), and both types can be biomarkers for detecting glioma.
  • free PTPRZ shall mean a polypeptide containing fPTPRZ-long and a part thereof, for example, fPTPRZ-short.
  • free PTPRZ shall mean a polypeptide comprising fPTPRZ-short and parts thereof.
  • free PTPRZ is a continuous amino acid sequence (1612 amino acids) represented by SEQ ID NO: 4, which is 1129 amino acids or more, 1209 amino acids or more, 1290 amino acids or more, 1371 amino acids or more, 1451 amino acids or more, 1532 amino acids or more, 1580 amino acids or more. And a peptide containing an amino acid sequence of 1596 or more amino acids.
  • free PTPRZ is a continuous amino acid sequence (752 amino acids) represented by SEQ ID NO: 5, 269 or more, 349 or more, 430 or more, 511 or more, 591 or more, 672 or more, 720 or more Examples include a peptide containing an amino acid sequence of 736 or more amino acids or more.
  • free PTPRZ is exemplified by fragments having a molecular weight of 175 kDa or more, 200 kDa or more, 225 kDa or more, 250 kDa or more, 275 kDa or more, 300 kDa or more, 325 kDa or more, 350 kDa or more, and 375 kDa or more derived from fPTPRZ-long. Is done.
  • Examples of the free PTPRZ include fragments having a molecular weight of 25 kDa or more, 50 kDa or more, 75 kDa or more, 90 kDa or more, 115 kDa or more, 140 kDa or more, and 165 kDa or more derived from fPTPRZ-short.
  • fPTPRZ-long and fPTPRZ-short can be detected as molecules having a non-uniform molecular weight because they have sugar chain modification.
  • the ranges of molecular weights corresponding to fPTPRZ-long and fPTPRZ-short are conveniently described as “about 400 kDa” and “about 190 kDa”, respectively, but “about 400 kDa” means, for example, about 350 to 400 kDa. , About 350 kDa.
  • “About 190 kDa” includes, for example, a molecular weight of about 160 to 190 kDa, about 160 kDa, and about 180 kDa.
  • Cerebrospinal fluid refers to cerebrospinal fluid (CSF).
  • CSF cerebrospinal fluid
  • CSF cerebrospinal fluid
  • Recent studies have shown that cerebrospinal fluid is derived from secretion from the choroid plexus and exudation from the brain parenchyma, and there is virtually no barrier between brain cells and cerebrospinal fluid (Wang C, et al., 2012, Cerebrospinal Fluid: Physiology, biomarker and methodology. In: V. S, Dolezal, T., editor. Cerebrospinal Fluid: Functions, Composition Disorders. New York: Nova Science. ).
  • the term "subject” refers to a human individual to which the method or kit of the present invention is applied.
  • Subjects include, but are not limited to, patients suspected of having glioma, especially those suspected of having glioma based on physician findings or diagnostic imaging, but other than glioma-related primary nervous system tumors such as malignant lymphoma or multiple sclerosis Patients who are difficult to discriminate from a central nervous system non-neoplastic disease such as sickness are preferred. There are no restrictions on the subject's gender, age, height, weight, treatment history, health status, genetic predisposition, and the like.
  • control person refers to a human individual serving as a control in the method or kit of the present invention. Specifically, it is a human individual (non-glioma patient) apparently not having glioma.
  • the control is preferably an individual close to the condition of the subject. For example, a person of the same gender as the subject and of the same age may be mentioned.
  • the glioma detection method of the present invention includes a measurement step and a determination step as essential steps. Hereinafter, each step will be specifically described.
  • the “measuring step” is a step of measuring the amount of the glioma-detecting biomarker protein contained in the cerebrospinal fluid per unit volume and obtaining the measured value.
  • the glioma detection biomarker to be measured in this step is free PTPRZ present in the cerebrospinal fluid as described above.
  • the measurement target is a polypeptide containing fPTPRZ-long or a part thereof, for example, fPTPRZ-short, or any combination thereof.
  • the cerebrospinal fluid used for the measurement in this step is cerebrospinal fluid derived from the subject.
  • the method for collecting cerebrospinal fluid from the subject may be any known method, and is not particularly limited. For example, it may be collected by lumbar puncture. Lumbar puncture is relatively invasive because it is possible to reduce pain to the same level as blood sampling by using a commercially available local anesthetic in advance, and it is possible to reduce side effects by using an atraumatic needle. It is low and is a suitable method for collecting cerebrospinal fluid. In the course of the operation, cerebrospinal fluid collected from a glioma patient serves as a positive control for judging the therapeutic effect.
  • the “unit volume” is a unit of volume and includes, for example, microliter ( ⁇ L) or cubic mm (mm 3 ), milliliter (mL) or cubic cm (cm 3 ), and liter (L).
  • the “measurement value” is a value obtained by measuring the amount of the glioma-detecting biomarker contained in the cerebrospinal fluid per unit volume.
  • the amount of cerebrospinal fluid to be measured in this step is not limited, but for example, 1 ⁇ L to 10 ⁇ L, 2 ⁇ L to 20 ⁇ L, 5 ⁇ L to 50 ⁇ L, 8 ⁇ L to 80 ⁇ L, 10 ⁇ L to 100 ⁇ L, 20 ⁇ L to 200 ⁇ L, 50 ⁇ L to 500 ⁇ L, 80 ⁇ L to 800 ⁇ L, 100 ⁇ L It may be in the range of 11 mL, 200 ⁇ L to 2 mL, or 500 ⁇ L to 5 mL.
  • the method of measuring the protein amount of the glioma-detecting biomarker in the cerebrospinal fluid is not particularly limited as long as it is a peptide quantification method.
  • known quantification methods such as immunological detection, aptamer analysis, and mass spectrometry can be used.
  • each quantitative method will be described.
  • the “immunological detection method” is a method of quantifying a target molecule using an antibody or a binding fragment thereof that specifically binds to the target molecule.
  • the immunological detection method include enzyme immunoassay (including ELISA and EIA), fluorescence immunoassay, radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay, and surface plasmon resonance (SPR).
  • Quartz crystal microbalance (QCM) method immunoturbidimetry, latex agglutination immunoassay, latex nephelometry, hemagglutination, particle agglutination, colloidal gold, capillary electrophoresis, western blotting or immunization
  • QCM Quartz crystal microbalance
  • immunoturbidimetry latex agglutination immunoassay
  • latex nephelometry hemagglutination
  • particle agglutination colloidal gold
  • capillary electrophoresis western blotting or immunization
  • any detection method may be used in this method.
  • the ELISA method is suitable, and the sandwich ELISA method using an antibody that specifically recognizes two different epitopes of the target molecule is particularly preferable in terms of simplicity, detection sensitivity, and quantification.
  • Anti-fPTPRZ antibody may be prepared by a conventional method using the full length of free PTPRZ or a part thereof (for example, a CS binding region, a CA domain, or an FN domain) as an antigen. Specifically, a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5, or a fragment thereof can be used as the antigen. A commercially available PTPRZ antibody that specifically binds to the extracellular region of PTPRZ may be used. As the antibody, either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody may be used.
  • the immunoglobulin constituting the antibody is any class (for example, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD and IgY), or any subclass (for example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2).
  • Antibodies can be from any animal, including mammals and birds. Examples of animals derived from antibodies include rabbits, mice, rats, guinea pigs, goats, donkeys, sheep, camels, llamas, alpacas, horses, chickens, and humans.
  • an artificially prepared antibody based on a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can also be used.
  • Such antibodies include, for example, recombinant antibodies, synthetic antibodies, and antibody fragments.
  • Recombinant antibody is an antibody produced using a gene recombination technique, and includes chimeric antibodies, humanized antibodies, multispecific antibodies, and the like.
  • a “chimeric antibody” is an antibody obtained by substituting the variable region (V region) of an antibody derived from one animal with the V region of an antibody derived from another animal using a molecular biological technique.
  • V region variable region
  • the V region of a mouse-derived anti-fPTPRZ monoclonal antibody that specifically binds to the glioma detection biomarker fPTPRZ was replaced with the V region of a human antibody, the V region was derived from a mouse, and the C region was derived from a human.
  • Antibodies are relevant.
  • Humanized antibody refers to the replacement of the complementarity determining regions (CDRs; CDR1, CDR2 and CDR3) in the V region of a non-human mammal, eg, mouse, monoclonal antibody with the corresponding CDRs of a suitable human monoclonal antibody This is the graft antibody obtained.
  • a humanized anti-fPTPRZ antibody obtained by replacing each CDR in a mouse-derived anti-fPTPRZ monoclonal antibody with the corresponding CDR of a human monoclonal antibody, respectively.
  • Multispecific antibody refers to a multivalent antibody, that is, an antibody having a plurality of antigen-binding sites in one molecule, wherein each antigen-binding site binds to a different epitope.
  • a bispecific antibody in which each antigen-binding site specifically binds to the same or a different antigen is mentioned.
  • Synthetic antibody refers to an antibody synthesized by using a chemical method or a recombinant DNA method.
  • VL regions light chain variable regions
  • VH regions heavy chain variable regions
  • Monomeric polypeptide molecules, or multimeric polypeptides thereof, are relevant. Specific examples of such a polypeptide include single chain Fv (scFv: single chain fragment of variable region) (see Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL), diabody (diabody). ), Triabody or tetrabody.
  • the VL and VH regions are usually located on separate polypeptide chains (light and heavy).
  • the single-chain Fv is a synthetic antibody fragment having a structure in which the V regions on these two polypeptide chains are connected by a flexible linker having a sufficient length, and is included in one polypeptide chain.
  • both V regions can self-assemble with each other to form one functional antigen-binding site.
  • a single-stranded Fv can be obtained by incorporating a recombinant DNA encoding the same into a phage genome using a known technique and expressing the same.
  • Diabodies are molecules having a structure based on the dimeric structure of a single-chain Fv (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). For example, if the length of the linker is less than about 12 amino acid residues, the two variable sites within a single-chain Fv cannot self-assemble, but by forming a diabody, i.e., two single-chain Fv Allows the VL region of one Fv chain to assemble with the VH region of the other Fv chain, forming two functional antigen-binding sites (Marvin et al., 2005, Acta Pharmacol. Sin. 26: 649-658).
  • diabodies are bivalent antibody fragments, but each antigen-binding site need not bind to the same epitope, but each has a bispecificity that recognizes different epitopes and binds specifically. It may be.
  • Triabodies and tetrabodies have their trimer and tetramer structures based on single-chain Fv structures, like diabodies. These are trivalent and tetravalent antibody fragments, respectively, and may be multispecific antibodies.
  • Antibody fragments include, for example, Fab, F (ab ′) 2 , Fv, and the like.
  • the “aptamer analysis method” is a method for quantifying a biomarker for detecting a glioma, which is a target molecule, using an aptamer that binds tightly and specifically to a target substance by a three-dimensional structure.
  • Aptamers can be broadly classified into nucleic acid aptamers and peptide aptamers depending on the type of the molecule, and any aptamer may be used.
  • Nucleic acid aptamer refers to an aptamer composed of nucleic acids.
  • the nucleic acid constituting the nucleic acid aptamer may be any of DNA, RNA or a combination thereof. If necessary, a chemically modified nucleic acid such as PNA, LNA / BNA, methylphosphonate-type DNA, phosphorothioate-type DNA, and 2′-O-methyl-type RNA can be included.
  • an anti-fPTPRZ RNA aptamer or an anti-fPTPRZ DNA aptamer can be mentioned.
  • a nucleic acid aptamer can be prepared using a biomarker for detecting glioma, i.e., a full-length or a part of fPTPRZ as a target molecule, using a method known in the art, for example, SELEX (systematic evolution of of ligands by by exponential enrichment). it can.
  • SELEX systematic evolution of of ligands by by exponential enrichment. It can.
  • the SELEX method is a known method, and a specific method may be performed according to, for example, Pan et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92: 11509-11513).
  • Peptide aptamer is an aptamer composed of amino acids and is a peptide molecule of 1 to 6 kDa that recognizes the surface structure of a specific target molecule and binds specifically, like an antibody.
  • an anti-fPTPRZ peptide aptamer can be mentioned.
  • the peptide aptamer may be prepared based on a production method known in the art. For example, reference can be made to Whaley, S.R., et al., 2000, Nature, 405, 665-668. Usually, it can be prepared using a phage display method or a cell surface display method.
  • the above antibody or aptamer may be labeled as necessary.
  • the label may use a labeling substance known in the art.
  • fluorescent dyes fluorescein, FITC, rhodamine, Texas Red, Cy3, Cy5
  • fluorescent proteins eg, PE, APC, GFP
  • enzymes eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose) Oxidase
  • radioisotopes eg, 3 H, 14 C, 35 S
  • biotin or (strept) avidin e.
  • nucleic acid aptamers for example, radioisotopes (eg, 32 P, 3 H, 14 C), DIG, biotin, fluorescent dyes (eg, FITC, Texas, cy3, cy5, cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493, NBD, TAMRA), or a luminescent substance (eg, acridinium ester).
  • An antibody or aptamer labeled with a labeling substance can be a useful tool when detecting an aptamer bound to a target protein.
  • Mass spectrometry includes high performance liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS / MS), gas chromatography mass spectrometry (GC -MS), gas chromatography tandem mass spectrometry (GC-MS / MS), capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS) and ICP mass spectrometry (ICP-MS).
  • LC-MS high performance liquid chromatography mass spectrometry
  • LC-MS / MS high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry
  • GC -MS gas chromatography mass spectrometry
  • GC-MS / MS gas chromatography tandem mass spectrometry
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • ICP-MS ICP mass spectrometry
  • the immunological detection method, aptamer analysis method, and mass spectrometry method are all techniques known in the art, and may be performed according to those methods.
  • Peptide quantification kits are commercially available from each manufacturer, and they can also be used.
  • the “judgment step” is a step of judging the presence or absence of glioma in a subject based on the measurement values obtained in the measurement step.
  • a determination method based on the measurement value for example, but not limited to, a cut-off value is determined, a method of determining glioma morbidity based on the cut-off value, and the measurement value of the subject and the measurement average value of the control group and There is a method of determining the presence of glioma based on a statistically significant difference in comparison.
  • the cutoff value is a boundary value for classifying a quantitative result as positive or negative.
  • the cutoff value can usually be calculated based on the morbidity of the disease and the sensitivity and specificity calculated from the ROC curve (receiver operating characteristic curve).
  • a subject determined to be positive by the cutoff value indicates that there is a high possibility that the subject has glioma, and a subject that is determined to be negative indicates that there is a high possibility that the subject does not have glioma.
  • the method for setting the cutoff value is not particularly limited.
  • a predetermined value is defined as a cut-off value, and if the measured value is equal to or greater than that value, the subject who is a cerebrospinal fluid provider in the measurement step is determined to be positive and highly likely to be suffering from glioma. do it. Conversely, if it is less than the cut-off value, it is negative, and it may be determined that there is a high possibility that glioma is not affected. For example, comparing the measured value of the subject with the measured value of free PTPRZ contained per unit volume of cerebrospinal fluid derived from a control without glioma, the measured value of the subject was Is higher, it can be determined that the subject is more likely to be suffering from glioma.
  • the measured values obtained from the control group can be classified by percentile, and the percentile value used for the classification can be used as the cutoff value.
  • the cut-off value is the 95th percentile of the measured values obtained from the control subjects, if the value is more than the positive and less than the value is negative, if the measured value of the subject is more than the 95th percentile, the subject is positive , It may be determined that there is a high possibility of suffering from glioma.
  • the method of determination based on statistical significance is not limited as long as it is a known test method capable of determining the presence or absence of significance. For example, a t-test method, a multiple comparison test method and the like can be mentioned. "Statistically (significantly) significant” means that the contingency of the obtained value is statistically low and meaningful under the null hypothesis, and "significant difference” is between two values Means that there is a significant difference. Specifically, there are cases where the risk ratio (significance level) is smaller than 5%, 1%, 0.3%, 0.2% or 0.1%.
  • the “average measured value of the control group” refers to the average value of the measured values obtained from a plurality of controls by the same method as the measurement method performed on the subject in the measurement step.
  • a primary tumor of the central nervous system other than glioma such as malignant lymphoma, which has been difficult only by diagnostic imaging
  • Differentiation from central nervous system non-neoplastic diseases such as multiple sclerosis is clear and accurate, and can prevent misdiagnosis of those diseases.
  • Glioma detection kit 2-1 Overview
  • a second aspect of the present invention is a glioma detection kit.
  • the kit of the present invention includes, as a component, a binding means that specifically binds to a glioma detection biomarker.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION According to the kit of this invention, the biomarker for glioma detection which may exist in the cerebrospinal fluid derived from a test subject can be detected, and the glioma disease of the test subject can be detected easily and simply.
  • the glioma detection kit of the present invention includes a binding means as an essential component.
  • binding means refers to means for specifically recognizing and binding to fPTPRZ, ie, the extracellular region of PTPRZ. Specifically, it is a means for specifically recognizing and binding all or part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 5.
  • the material constituting the binding means is not particularly limited, but a polypeptide or nucleic acid is suitable.
  • Examples of the binding means composed of the polypeptide include an antibody, a binding fragment thereof, and a peptide aptamer.
  • an antibody an anti-fPTPRZ antibody that binds to the target antigen, fPTPRZ
  • a peptide aptamer an anti-fPTPRZ peptide aptamer that binds to fPTPRZ is exemplified.
  • the anti-fPTPRZ antibody is described in “(1) Immunological detection method” of “1-3-1. Measurement step” in the section “1-3. Method” of the first embodiment, and for the anti-fPTPRZ peptide aptamer. , "(2) Aptamer analysis method", and the detailed description is omitted here.
  • Examples of the binding means composed of a nucleic acid include a nucleic acid aptamer (RNA aptamer, DNA aptamer).
  • RNA aptamer RNA aptamer, DNA aptamer
  • an anti-fPTPRZ RNA aptamer and an anti-fPTPRZ DNA aptamer that bind to the target antigen, fPTPRZ are exemplified.
  • These nucleic acid aptamers have been described in detail in “(2) Aptamer analysis method” of “1-3-1. Measurement step” in the section “1-3. Method” of the first embodiment. Specific description is omitted.
  • the glioma detection kit of the present invention can include two or more of the above binding means.
  • the constituent materials of each connecting means may be the same or different.
  • An example of the case where the constituent materials are the same is a combination of an anti-fPTPRZ antibody and a binding fragment thereof.
  • An example of a case where the constituent materials are different includes a combination of an anti-fPTPRZ antibody and an anti-fPTPRZ ⁇ RNA aptamer.
  • each binding means may specifically recognize different sites of fPTPRZ.
  • the binding means is an antibody
  • two or more antibodies that recognize and bind to different epitopes on fPTPRZ correspond.
  • Such a plurality of types of binding means that specifically recognizes different sites of fPTPRZ can be used, for example, in a sandwich ELISA method, and can detect a glioma-detecting biomarker with higher sensitivity and accuracy. Is preferred.
  • the sample to which the glioma detection kit of the present invention is applied is, in principle, a cerebrospinal fluid isolated. This is because the present invention is based on a novel finding that the extracellular region of PTPRZ is cleaved in glioma-affected patients and is secreted into the cerebrospinal fluid as free PTPRZ.
  • Glioma recurrence evaluation method 3-1 Overview
  • a third aspect of the present invention is a method for evaluating glioma recurrence. According to the method of the present invention, it is possible to evaluate whether or not glioma has recurred in a patient with glioma after a predetermined period of time after surgery. In addition, it is possible to evaluate the therapeutic effects in inoperable cases and examples of radiation therapy or chemotherapy.
  • the glioma recurrence evaluation method of the present invention includes a measurement step and an evaluation step as essential steps. Hereinafter, each step will be described.
  • Measurement step is a step of measuring the amount of free PTPRZ protein contained per unit volume of cerebrospinal fluid derived from a subject and obtaining the measured value. It is almost the same as the measurement step in the glioma detection method of one embodiment. Therefore, description of the same points as in the measurement step of the first embodiment will be omitted, and only different points will be described here.
  • the condition of the subject is different from that of the subject of the first aspect.
  • the subject in the method of the present embodiment corresponds to a person who has had glioma, that is, a person who has a history of glioma treatment and a predetermined period has elapsed after glioma surgery.
  • the “predetermined period” here is not limited, but may be, for example, a period during which glioma can recur after surgery from a case. Specifically, for example, three months, six months, nine months, one year, 1.5 years, two years, three years, four years, or five years after surgery.
  • the “evaluation step” is a step of evaluating whether or not the subject has recurrence of glioma based on the measurement values obtained in the measurement step.
  • the evaluation method based on the measured values is similar to the measurement step in the glioma detection method of the first embodiment. That is, for example, but not limited to, a cut-off value, a method for evaluating recurrence of glioma based on the cut-off value, or a statistical significance when comparing a measured value of a subject with a measured average value of a control group. There is a method to evaluate glioma recurrence based on the difference.
  • a predetermined value is determined as the cut-off value, and if the measured value is equal to or more than that value, the cerebrospinal fluid provider in the measuring step.
  • the cerebrospinal fluid provider in the measuring step Some subjects may be positive and have a high likelihood of recurrent glioma. Conversely, if the measured value is less than the cutoff value, it is negative, and it may be evaluated that there is a high possibility that glioma has not recurred.
  • the measured value of the subject comparing the measured value of the subject with the measured value of free PTPRZ contained per unit volume of cerebrospinal fluid derived from a control without glioma, the measured value of the subject was Is higher, the subject can be assessed as likely to have relapsed glioma.
  • the percentile value is used as the cutoff value, for example, the 95th percentile of the measured values obtained from the control is set as the cutoff value, the value or more is positive, and the subject has relapsed glioma What is necessary is just to evaluate that the possibility is high. Conversely, a value less than the cutoff value is negative, and the subject may be evaluated as having a high possibility that glioma has not recurred.
  • the method of evaluating glioma recurrence based on a statistically significant difference is also basically the same as the determination step in the glioma detection method of the first embodiment, and the difference between the measured value of the control group and the measured value of the subject is determined. If there is a significant difference in the glioma, it is considered that the subject is likely to have relapsed glioma, and if no significant difference is found, the subject is highly likely to have not relapsed glioma. Good.
  • a relatively invasive measure of cerebrospinal fluid collection The evaluation can be performed simply and easily.
  • glioma recurrence evaluation method of the present invention regularly or continuously before or after treatment for subjects undergoing glioma treatment, surgery, radiation, chemotherapy or other treatments, respectively, Can also be evaluated for therapeutic effects.
  • Example 1 Verification of free PTPRZ in cerebrospinal fluid> (Purpose) To verify that two free forms of PTPRZ from the extracellular region of PTPRZ are present in the cerebrospinal fluid of glioma patients.
  • chondroitinase digestion was performed on 10 ⁇ L of cerebrospinal fluid collected from each of the above patients. Specifically, 100 mM final concentration of Tris-HCl (pH 7.5), 60 mM sodium acetate, and 4 mU chondroitinase ABC (Sigma, 2905) were added to the sample solution, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • Western blotting was performed according to the following procedure.
  • Laemmli Sample buffer (final concentration 20.8 mM Tris-HCl (pH 6.5), 8.3% glycerol, 1% SDS, 1% ⁇ -mercaptoethanol) was added to the chondroitinase-treated sample solution, and heated at 99 ° C. for 5 minutes. .
  • Using a 3 to 10% gradient polyacrylamide gel (Atto, NPG-310L), the gel was electrophoresed at a constant current of 20 to 25 mA per gel for 60 to 70 minutes.
  • Using a wet transfer device transfer was performed on the nitrocellulose membrane at a constant current of 350 mA for 45 minutes.
  • mouse anti-Ptprz IgM ⁇ (Santa cruz, sc-) diluted 200-fold with PBS-0.1% Tween (PBS-T) 33664) as a primary antibody in 1.5 mL of PBS-T at room temperature for 2 hours.
  • PBS-T containing HRP-labeled goat anti-mouse IgM antibody (SAB-110, Stressgen) diluted 10,000 times as a secondary antibody and room temperature For 2 hours.
  • the color was developed using SuperSignal West Femto maximum sensitivity substrate (Thermo Fisher Scientific, 34096), and the resulting signal was detected with ATTO Ez-Capture MG (ATTO).
  • the quantification of the signal intensity of the band was performed using the attached quantification software CS-Analyzer.
  • the band at about 400 kDa corresponds to fPTPRZ-long, and the band at about 190 kDa corresponds to fPTPRZ-short. This suggests that free PTPRZ, fPTPRZ-long and fPTPRZ-short, can be tumor markers for detecting glioma in cerebrospinal fluid.
  • Example 2 Verification of free PTPRZ in cerebrospinal fluid as biomarker for detecting glioma> (Purpose) It is verified that free PTPRZ (fPTPRZ-long and fPTPRZ-short) can function as a biomarker for detecting glioma in cerebrospinal fluid.
  • iNPH idiopathic normohydric hydrocephalus Free PTPRZ (fPTPRZ-long and fPTPRZ-short) in cerebrospinal fluid from each of the 14 patients was measured by Western blotting.
  • iNPH is a disorder of cerebrospinal fluid metabolism, which is difficult to distinguish from glioma and does not fall into any of the central nervous system primary tumor and the central nervous system non-neoplastic. Therefore, cerebrospinal fluid from iNPH patients was used as a negative control in this example.
  • the specific method was in accordance with Example 1.
  • the signal intensities of free PTPRZ of about 400 kDa (hereinafter simply referred to as “400 kDa”) and about 190 kDa (hereinafter simply referred to as “190 kDa”) obtained from each patient were quantified and compared.
  • glioma patients and non-glioma patients can be clearly and easily distinguished.
  • Example 3 Validation targeting only glioma patient group of first onset case> (Purpose) The number of subjects was increased from Example 2 to show that free PTPRZ (fPTPRZ-long and fPTPRZ-short) can function as a biomarker for detecting glioma in cerebrospinal fluid, targeting only the glioma patient group of the first case. Verify.
  • the “first onset case” refers to a case in which a patient who has not been diagnosed with glioma in the past has been diagnosed with glioma for the first time.
  • Western blotting was performed by adding the following modifications to the method described in Example 1.
  • For chondroitinase digestion add 100 mM final concentration Tris-HCl (pH 7.4), 60 mM sodium acetate, 0.2 mU chondroitinase ABC (Sigma, 2905) to the sample solution and incubate at 37 ° C for 1 hour. I went in.
  • To prepare a sample for electrophoresis add Laemmli Sample buffer (final concentration 60 mM Tris-HCl (pH 6.5), 10% glycerol, 2% SDS, 5% ⁇ -mercaptoethanol) to the sample solution treated with chondroitinase, and add Performed by heating at 5 ° C. for 5 minutes. The secondary antibody reaction was performed at room temperature for 30 minutes.
  • Example 4 Validation for glioma patient group of recurrent cases only> (Purpose) The number of subjects was increased from Example 2 to show that free PTPRZ (fPTPRZ-long and fPTPRZ-short) can function as a biomarker for detecting glioma in cerebrospinal fluid, targeting only the glioma patient group of recurrent cases. Verify.
  • the “recurrent case” refers to a case in which the glioma has reappeared after a state in which the glioma seems to have once disappeared due to treatment such as surgery, radiation, or chemotherapy.

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Abstract

患者への負担を軽減し、グリオーマを簡便、かつ容易に検出する方法を開発し、提供する。また、その方法で使用するための腫瘍マーカーを開発し、提供する。　遊離型受容体型プロテインチロシンホスファターゼZをグリオーマ検出用バイオマーカーとし、被験者の髄液中に含まれる当該マーカーの量に基づき、被験者のグリオーマの罹患を検出する方法を提供する。

Description

グリオーマ検出用バイオマーカー
　本発明は、グリオーマ検出用バイオマーカー、それを用いてグリオーマを検出する方法、及びグリオーマ検出用キットに関する。
　グリオーマ（神経膠腫）は、神経膠細胞より発生すると考えられている腫瘍の総称で、脳腫瘍の約3割を占め、ヒトにおいて高頻度にみられる原発性脳腫瘍である（非特許文献１）。予後の悪い悪性腫瘍が多く、より的確な診断と治療の開発が求められている。
　原発性脳腫瘍は、病理学的亜型を含めると100種類以上にわたるが、腫瘍毎に最適な治療法は異なる（非特許文献２）。したがって、腫瘍の種類を的確に診断することが重要となる。現在、手術前の脳腫瘍の診断は、ほとんどがCT、MRI、又はPET等の画像診断に依存している。画像診断では、病変の局在に関しては正確な情報を得ることができるが、腫瘍の種類に特異的な情報までは得られないことが多い。また、グリオーマと同じ中枢神経系原発腫瘍の悪性リンパ腫や中枢神経系非腫瘍性疾患である多発性硬化症では、画像上の所見が原発性脳腫瘍と類似することがあるため画像診断のみから原発性脳腫瘍を鑑別することは困難な場合がある（非特許文献３）。
　したがって、確定診断には、脳生検術（開頭術又は穿頭術による脳組織の一部採取）が必要となる。しかし、脳生検術は、侵襲性が高い上に、頭蓋内出血による後遺症の危険性がある。また、脳生検術後、病理診断が得られるまでに通常１～２週以上を要し、実臨床においては、手術スケジュールの確保、手術実施、及び病理診断確定までに相当期間が経過することとなる。これは、早期診断、早期治療の観点からも大きな問題となる。さらに、脳生検術は、原則として入院治療が必須であるため、医療費の面でも患者の負担が大きい。即ち、従来の診断・治療では、診断のための脳生検術と腫瘍摘出手術の２回の入院が必要となる。
　多くの腫瘍では、その発生に応じて血液等の試料中に含まれる量が上昇するタンパク・ポリペプチドや核酸の存在が知られている。これらは既に多くのものが臨床応用され、多くの癌腫で特異的な腫瘍マーカー検査として実用化され、さらに癌の診断、及び再発判定に向けた開発が進んでいる（非特許文献４、５）。ところが、原発性脳腫瘍に関しては、中枢神経系原発胚細胞性腫瘍の一部を除いて、血液や髄液中に存在する腫瘍マーカーは全く実用化されておらず、またグリオーマについては有効性の高い腫瘍マーカー自体が知られていない。
Committee-of-Brain-Tumor-Registry-of-Japan, Brain Tumor Registry of Japan, 2017, Neurol Med Chir (Tokyo), 57(Supplement-1): 9-102. Louis, D.N., et al., 2016, Acta Neuropathol, 131(6): 803-820. Niibo, T., et al., 2012, Jpn. J. Neurosurgery, 21 (8): 625-629. 光永 修ら, 2017，膵臓, 32(1): 56-61. 藤村 勉, 2016, 東北医科薬科大学研究誌, 63: 1-13.
　本発明は、グリオーマを簡便、かつ容易に検出する方法を開発し、提供することを目的とする。
　また、その方法で使用するための腫瘍マーカーを開発し、提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明者らは、グリオーマの腫瘍マーカーの探索用試料として髄液に着目した。髄液は、採取時の患者への侵襲性が生検術に比べて軽微であり、通常の髄液検査と同様に安全に実施することができる。さらにグリオーマ患者において、その量が変化する腫瘍マーカーとなり得るポリペプチド等の存在する可能性も高い。
　研究の結果、本発明者らは、ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼZ（Receptor type-Protein Tyrosine Phosphatase Receptor zeta：PTPRZ、PRPRZ1、PTPζ、又はRPTPβとも称する。本明細書では、しばしば「PTPRZ」と表記する。）における3種類のアイソフォームの細胞外領域に相当する一部領域が、グリオーマ患者の髄液中で著しく増加していることを見出した。
　PTPRZをコードするPTPRZ1遺伝子は、グリオーマ細胞において高発現していることが知られている（Muller S., et al., 2003, Oncogene, 22: 6661-6668）。また、PTPRZが細胞浸潤と腫瘍形成において重要な機能を果たすことも知られている（Fujikawa et al., 2017, Scientific Reports, 17(1):5609）。しかし、マウスPtprzと異なり、ヒトPTPRZのアイソフォームには分泌型PTPRZが同定されていない。それ故に、髄液中に放出されたヒトPTPRZの一部領域とは、PTPRZの細胞外領域がプロテアーゼ等によって切断され、遊離型となったペプチド断片であることを示唆している。
　髄液中に遊離したPTPRZの細胞外領域（遊離型PTPRZ）の量がグリオーマ患者で増加していることや、グリオーマと画像所見が類似する他の中枢神経系疾患では、この遊離型PTPRZの増加が認められないことは、これまでに報告がなかった。したがって、これらの結果は、ヒト髄液中の遊離型PTPRZがグリオーマ特異的なバイオマーカーとなり得ることを示唆している。本発明は、当該知見に基づいて開発されたものであって、以下を提供する。
（１）グリオーマの検出方法であって、被験者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型受容体型プロテインチロシンホスファターゼZ（遊離型PTPRZ）のタンパク質量を測定し、その測定値を得る測定工程、及び前記測定工程で得られた測定値に基づき、当該被験者のグリオーマの罹患の有無をin vitroで判定する判定工程を含み、前記遊離型PTPRZは配列番号４又は５で示すアミノ酸配列からなるPTPRZの細胞外領域が切断されてなる、前記方法。
（２）前記判定工程で、グリオーマ患者及び非グリオーマ患者の測定値から算出されるカットオフ値に基づいて、前記被験者のグリオーマ罹患可能性を判定する、（１）に記載の方法。
（３）前記判定工程で、被験者の測定値とグリオーマに罹患していない対照者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZの測定値とを比較して、被験者の測定値が対照者の測定値よりも高いときに、前記被験者はグリオーマに罹患している可能性が高いと判定する、（１）に記載の方法。
（４）グリオーマと他の中枢神経系原発腫瘍又は中枢神経系非腫瘍性疾患との鑑別方法であって、被験者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZのタンパク質量を測定し、その測定値を得る測定工程、及び前記測定工程で得られた測定値に基づいて、当該被験者が前記いずれの疾患に罹患しているかをin vitroで判定する判定工程を含み、前記被験者はグリオーマ、他の中枢神経系原発腫瘍、又は中枢神経系非腫瘍性疾患のいずれかに罹患の疑いがあり、前記遊離型PTPRZは配列番号４又は５で示すアミノ酸配列からなるPTPRZの細胞外領域が切断されてなる、前記方法。
（５）前記他の中枢神経系原発腫瘍が悪性リンパ腫又は神経鞘腫であり、また前記中枢神経系非腫瘍性疾患が多発性硬化症である、（４）に記載の鑑別方法。
（６）配列番号４又は５で示すアミノ酸配列からなるPTPRZの細胞外領域の全部又は一部を特異的に認識し、結合する結合手段を含むグリオーマ検出用キット。
（７）前記結合手段が抗体又はアプタマーである、（６）に記載のグリオーマ検出用キット。
（８）グリオーマ再発の有無を評価する方法であって、グリオーマ治療歴のある被験者において、術後、所定の期間が経過した前記被験者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZのタンパク質量を測定し、その測定値を得る測定工程、前記測定工程で得られた測定値に基づき、当該被験者のグリオーマ再発の有無をin vitroで評価する評価工程を含み、前記遊離型PTPRZはPTPRZの細胞外領域が切断されてなる、前記評価方法。
（９）前記評価工程で、グリオーマ患者及び非グリオーマ患者の測定値から算出されるカットオフ値に基づいて前記被験者のグリオーマ再発可能性を評価する、（８）に記載の方法。
（１０）前記評価工程で、被験者の測定値とグリオーマに罹患していない対照者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZの測定値とを比較して、被験者の測定値が対照者の測定値よりも高いときに、前記被験者はグリオーマを再発した可能性が高いと評価する、（８）に記載の方法。
（１１）遊離型PTPRZからなるグリオーマ検出用のバイオマーカー。
（１２）前記遊離型PTPRZはPTPRZの細胞外領域で構成される、（１１）に記載のバイオマーカー。
（１３）前記遊離型PTPRZが配列番号４で示すアミノ酸配列又はその一部を含む、（１１）又は（１２）に記載のバイオマーカー。
（１４）前記その一部を含む遊離型PTPRZが配列番号５で示すアミノ酸配列からなる、（１３）に記載のバイオマーカー。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-125216号の開示内容を包含する。
　本発明のグリオーマ検出方法によれば、被験者の髄液を検査試料とし、簡便かつ容易にグリオーマの罹患を検出することができる。
　また、本発明のグリオーマ検出方法によれば、グリオーマと画像診断における所見の類似性の高い、中枢神経原発悪性リンパ種のような悪性腫瘍や多発性硬化症（multiple sclerosis：MS）のような中枢神経系非腫瘍性疾患との鑑別を、明瞭かつ正確に行うことができる。また、グリオーマ以外の神経鞘腫のような良性腫瘍との鑑別にも有用である。
　本発明のグリオーマ検出用キットによれば、被験者由来の髄液中に存在し得るグリオーマ検出用バイオマーカーを検出し、その被験者のグリオーマ罹患を、容易かつ簡便に検出することができる。
ヒトPTPRZの3種類のアイソフォームの構造を示す概念図である。Aはアイソフォーム１を、Bはアイソフォーム2を、Cはアイソフォーム3を示す。図中、CAはカルボニックアンヒドラーゼ様ドメインを、FNはタイプIIIフィブロネクチン様ドメインを、CSはコンドロイチン硫酸鎖結合領域を、TMは膜貫通ドメインを、D1とD2はいずれもPTPドメインを表す。 本実施例におけるウェスタンブロッティングを示す図である。図中、I～IVは、各グレードのグリオーマ罹患患者由来の髄液を、SWは神経鞘腫罹患患者由来の髄液を、MSは多発性硬化症罹患患者由来の髄液を、Cont.1,2は特発性正常圧水頭症罹患患者の髄液をそれぞれ示している。fPTPRZ-long及びfPTPRZ-shortは、修飾糖鎖等の影響によりそれぞれ約400kDa（約350～400kDa）、約190kDa（約160～190kDa）の位置にブロードなバンドを生じる。 実施例２で得られた400kDa付近のバンド（A）及び190kDa付近のバンド（B)を定量化した図である。縦軸はシグナル強度を示す。なお、データは平均値±標準誤差で示した。 実施例３で得られた400kDa付近のバンド（A）及び190kDa付近のバンド（B)を定量化した図である。縦軸はシグナル強度を示す。なお、データは平均値±標準誤差で示した。 実施例４で得られた400kDa付近のバンド（A）及び190kDa付近のバンド（B)を定量化した図である。縦軸はシグナル強度を示す。なお、データは平均値±標準誤差で示した。
１．グリオーマ検出方法
１-１．概要
　本発明の第１の態様は、グリオーマ検出方法である。本発明は、被験者由来の髄液中に含まれるグリオーマ検出用バイオマーカーの量を測定し、その測定値に基づいて、例えばin vitroでの検査により、該被験者のグリオーマの罹患の有無を判定することを特徴とする。
　本発明の方法によれば、侵襲性が極めて高い脳の生検術を必要とせず、また、従来、画像診断だけではグリオーマとの鑑別が困難であった他の中枢神経系原発腫瘍や中枢神経系非腫瘍性疾患との鑑別も容易になる。
１-２．定義
　本明細書において使用する以下の用語について定義する。
　「グリオーマ（神経膠腫）」は、脳神経細胞を支持する神経膠細胞（グリア細胞）より発生するとされる腫瘍の総称で、膠芽腫、星細胞系腫瘍、乏突起膠細胞系腫瘍、上衣系腫瘍等が含まれる。グリオーマは、浸潤性が高く、悪性脳腫瘍に分類されるものが臨床上大半を占める。ただし、グリオーマは、悪性度に応じて、病理診断上、4つのWHOグレードに分けられ、グレードが高いほど悪性度が高いとされており、一部には良性腫瘍も含まれる。一般に、毛様細胞性星細胞腫等はグレードIに、びまん性星細胞腫、及び乏突起神経膠腫等はグレードIIに、退形成性星細胞腫及び退形成性乏突起神経膠腫等はグレードIIIに、そして膠芽腫はグレードIVに分類されている。このうちグレードIが良性腫瘍に、またグレードII、III、IVが悪性腫瘍に該当する。特にグレードIVの悪性度は非常に高く、手術及び放射線・化学療法を行っても平均余命が14か月に留まる。本明細書のグリオーマは、いずれのグレードに属する腫瘍も包含し、また、本発明の方法及びキットにおけるグリオーマは、いずれのグレードも対象となり得る。
　本明細書において「中枢神経系原発腫瘍」とは、脳や脊髄等の中枢神経系で最初に発生する腫瘍をいう。本明細書では、良性腫瘍及び悪性腫瘍のいずれも包含する。良性腫瘍の例として、限定はしないが、髄膜種・神経鞘腫が挙げられる。また、悪性腫瘍の例として、限定はしないが、グリオーマや悪性リンパ腫が挙げられる。本明細書において「他の中枢神経系原発腫瘍」とは、グリオーマ以外の中枢神経系原発腫瘍を意味する。特に、診断上、グリオーマとの鑑別が困難な中枢神経系原発腫瘍が該当する。
　本明細書において「中枢神経系非腫瘍性疾患」とは、中枢神経系で発生する非腫瘍性の疾患をいう。特に、診断上、グリオーマとの鑑別が困難な非腫瘍性疾患が該当する。例えば、限定はしないが、多発性硬化症が挙げられる。
　本明細書において「グリオーマ検出用バイオマーカー」とは、グリオーマの罹患の有無を反映するバイオマーカーである。グリオーマと、他の中枢神経系原発腫瘍、又は中枢神経系非腫瘍性疾患との鑑別用マーカーにもなり得る。
　本明細書におけるグリオーマ検出用バイオマーカーは、具体的には、受容体型プロテインチロシンホスファターゼZの細胞外領域からなるポリペプチド若しくは当該領域からなる糖鎖化ポリペプチド（Glycosylated polypeptide）、又はその一部からなるポリペプチドである。グリオーマに罹患している患者では、その量が非グリオーマ患者と比較して増加している。
　「受容体型プロテインチロシンホスファターゼZ（前述のように、本明細書では、しばしば「PTPRZ」と表記する。）」は、プロテインチロシンホスファターゼスーパーファミリーに属する受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（receptor-type PRPs：RPTPs)の１つで、N末端側を細胞質外に露出させた1回膜貫通型の膜タンパク質である。RPTPsは、構造的類似性から8つのサブファミリーに分類されるが、PTPRZはR5サブファミリーに分類されている。PTPRZは、細胞外のN末端側から順にカルボニックアンヒドラーゼ様ドメイン（CAドメイン）、タイプIIIフィブロネクチン様ドメイン（FNドメイン）、及びセリン－グリシンに富むコンドロイチン硫酸鎖結合領域（CS結合領域）、膜貫通ドメイン、そして細胞内のC末端側に位置する2つのPTPドメイン（D1及びD2)で構成されている。PTPRZは、主に中枢神経系で発現し、脱髄等に関与することが知られている（Harroch S. et al., 2002, Nat. Genet. 32, 411-4; Kuboyama K. et al. 2012, PloS One. 7, e48797）。
　本明細書におけるPTPRZは、特に断りのない限りヒトPTPRZを意味する。野生型のヒトPTPRZは、図１に示す3種類のアイソフォーム（アイソフォーム1～3）が同定されている。
　アイソフォーム１（本明細書では、しばしば「PTPRZ-iso1」と表記する。）は、配列番号１で示す2315アミノ酸残基からなる。PTPRZ-iso1は、最長のPTPRZであって、1～24位にシグナルペプチドを、45～298位にCAドメインを、313～401位にFNドメインを、1637～1662位に膜貫通ドメインを、1717～1992位にD1ドメインを、そして2023～2282位にD2ドメインを有する。また、CS結合領域は、前記FNドメインと膜貫通ドメイン間でCS鎖結合している領域が該当する。このうち細胞外領域は、配列番号１で示すアミノ酸配列において25～1636位に相当する配列番号４で示すアミノ酸配列からなる。
　アイソフォーム２（本明細書では、しばしば「PTPRZ-iso2」と表記する。）は、配列番号２で示す2308アミノ酸残基からなる。PTPRZ-iso2は、PTPRZ-iso1におけるD1ドメインの1723～1729位に相当する8アミノ酸残基が欠失したアイソフォームである。したがって、アイソフォーム２の細胞外領域は、アイソフォーム１のそれと一致し、配列番号４で示すアミノ酸配列からなる。
　アイソフォーム３（本明細書では、しばしば「PTPRZ-iso3」と表記する。）は、配列番号３で示す1448アミノ酸残基からなる。PTPRZ-iso3は、PTPRZ-iso1におけるCS結合領域の大部分に相当し得る755～1614位の860アミノ酸残基と、1723～1729位に相当する8アミノ酸残基が欠失したアイソフォームである。したがって、アイソフォーム３の細胞外領域は、アイソフォーム１及び２のそれよりも短く、配列番号１で示すアミノ酸配列において25～754位及び1615～1636位に相当する配列番号５で示すアミノ酸配列からなる。
　なお、マウスPtprzにおいても、Ptprz-A、Ptprz-B、及びPtprz-Sからなる3種類のアイソフォームが知られている（Chow J.P., et al., 2008, J Biol Chem., 283(45):30879-89）。しかし、全てのアイソフォームが膜タンパク質であるヒトPTPRZと異なり、マウスのPtprz-Sは、膜貫通ドメインやチロシンフォスファターゼドメインを含まない分泌型Ptprとして発現している。
　本明細書において「遊離型受容体型プロテインチロシンホスファターゼZ（本明細書では、しばしば「遊離型PTPRZ」又は「fPTPRZ（free-type PTPRZ）」と表記する。）」とは、前記ヒトPTPRZにおける各アイソフォームの細胞外領域からなるポリペプチド断片若しくは当該領域からなる糖鎖化ポリペプチド断片、又はその一部からなるポリペプチド断片をいう。ここで「その一部からなるポリペプチド断片」とは、前記ヒトPTPRZにおける各アイソフォームの細胞外領域からなるポリペプチド断片若しくは当該領域からなる糖鎖化ポリペプチド断片が分解されて生じる任意の断片を意味する。PTPRZには、細胞外領域のC末端側にプロテアーゼに対し感受性の高い部位が存在する。この部位がメタロプロテアーゼ等のプロテアーゼの分解により切断されること等により、遊離型PTPRZとなる。
　前述のように、遊離型PTPRZには、PTPRZの細胞外ドメインに由来する約400kDaのlong-form（本明細書では、しばしば「fPTPRZ-long」と表記する。）と約190kDaのshort-form（本明細書では、しばしば「fPTPRZ-short」と表記する。）の2種類が主に存在するが、いずれもグリオーマ検出用バイオマーカーとなり得る。したがって、本明細書では、特に断りのない限り遊離型PTPRZは、fPTPRZ-long及びその一部を含むポリペプチド、例えばfPTPRZ-shortを意味するものとする。あるいは、遊離型PTPRZは、fPTPRZ-short及びその一部を含むポリペプチドを意味するものとする。例えば、遊離型PTPRZは、配列番号４で示すアミノ酸配列（1612アミノ酸）の、連続する、1129アミノ酸以上、1209アミノ酸以上、1290アミノ酸以上、1371アミノ酸以上、1451アミノ酸以上、1532アミノ酸以上、1580アミノ酸以上、及び1596アミノ酸以上のアミノ酸配列を含むペプチド等が例示される。また、例えば、遊離型PTPRZは、配列番号５で示すアミノ酸配列（752アミノ酸）の、連続する、269アミノ酸以上、349アミノ酸以上、430アミノ酸以上、511アミノ酸以上、591アミノ酸以上、672アミノ酸以上、720アミノ酸以上、及び736アミノ酸以上のアミノ酸配列を含むペプチド等が例示される。さらに、例えば、遊離型PTPRZは、fPTPRZ-longに由来する、175kDa以上、200kDa以上、225kDa以上、250kDa以上、275kDa以上、300kDa以上、325kDa以上、350kDa以上、及び375kDa以上の分子量の断片等が例示される。また、例えば、遊離型PTPRZは、fPTPRZ-shortに由来する、25kDa以上、50kDa以上、75kDa以上、90kDa以上、115kDa以上、140kDa以上、及び165kDa以上の分子量の断片等が例示される。
　なお、fPTPRZ-long及びfPTPRZ-shortは、糖鎖修飾を有するため分子量が不均一な分子として検出され得る。本明細書では、fPTPRZ-long及びfPTPRZ-shortに対応する分子量の範囲を、便宜的にそれぞれ「約400kDa」、「約190kDa」と記載するが、「約400kDa」とは、例えば約350～400kDa、約350kDaの分子量を含むものとする。また、「約190kDa」とは、例えば約160～190kDa、約160kDa、約180kDaの分子量を含むものとする。
　本明細書において「髄液」とは、脳脊髄液（cerebrospinal fluid：CSF）をいう。髄液は、脳と脊髄の周囲にのみ存在する無色透明の液体で、他の臓器とは硬膜、血液とは血液脳関門や血液脳脊髄液関門で隔てられている。髄液は、脈絡叢からの分泌や脳実質からの滲出に由来し、脳細胞と髄液との間には障壁が事実上存在しないことが近年の研究から明らかとなっている（Wang C, et al., 2012, Cerebrospinal Fluid: Physiology, biomarker and methodology. In: V. S, Dolezal, T., editor. Cerebrospinal Fluid: Functions, Composition and Disorders. New York: Nova Science Publishers; pp.1-37.）。
　本明細書において「被験者」とは、本発明の方法又はキットの適用対象となるヒト個体をいう。被験者は、限定はしないが、グリオーマ罹患の疑いがある患者、特に、医師による所見や画像診断によりグリオーマ罹患の疑いがあるが、悪性リンパ腫のようなグリオーマ以外の中枢神経系原発腫瘍や多発性硬化症のような中枢神経系非腫瘍性疾患との判別が困難な患者が好適である。被験者における性別、年齢、身長、体重、治療歴、健康状態、遺伝的素因等の条件は問わない。
　本明細書において「対照者」とは、本発明の方法又はキットにおいて対照となるヒト個体をいう。具体的には、グリオーマに罹患していないことが明白なヒト個体（非グリオーマ患者）である。限定はしないが、対照者は被験者の条件に近い個体が好ましい。例えば、被験者と同性で、同年齢の者が挙げられる。
１－３．方法
　本発明のグリオーマ検出方法は、測定工程、及び判定工程を必須工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
１－３－１．測定工程
　「測定工程」は、単位容量あたりの髄液中に含まれるグリオーマ検出用バイオマーカーのタンパク質量を測定し、その測定値を得る工程である。本工程での測定対象となるグリオーマ検出用バイオマーカーは、前述のように髄液中に存在する遊離型PTPRZである。測定対象は、fPTPRZ-long又はその一部を含むポリペプチド、例えばfPTPRZ-short、あるいはそれらの任意の組合せである。
　本工程で測定に供される髄液は、被験者由来の髄液である。被験者から髄液を採取する方法は、既知の方法であればよく、特に限定はしない。例えば、腰椎穿刺により採取すればよい。腰椎穿刺は、事前に市販の局所麻酔薬を用いることで、痛みを採血と同等程度にすることが可能であり、また無外傷性針を用いることで、副作用を軽減できることから侵襲性が比較的低く、髄液を採取する場合には好適な方法である。また、手術過程で、グリオーマ患者から採取された髄液は治療効果判定用の陽性コントロールとなる。
　「単位容量」は、容量の単位であって、例えば、マイクロリットル（μL）若しくは立方mm（mm3）、ミリリットル（mL）若しくは立方cm（cm3）、及びリットル（L）等が挙げられる。
　本明細書において「測定値」は、単位容量あたりの髄液中に含まれるグリオーマ検出用バイオマーカーの量を測定し、得られた値である。
　本工程で測定に供する髄液の量は限定しないが、例えば、1μL～10μL、2μL～20μL、5μL～50μL、8μL～80μL、10μL～100μL、20μL～200μL、50μL～500μL、80μL～800μL、100μL～1mL、200μL～2mL、又は500μL～5mLの範囲内であればよい。
　髄液中のグリオーマ検出用バイオマーカーのタンパク質量を測定する方法は、ペプチド定量方法であればよく、特に限定はしない。例えば、免疫学的検出法、アプタマー解析法、又は質量分析法等の公知の定量方法を利用できる。以下、各定量法について説明をする。
（１）免疫学的検出法
　「免疫学的検出法」とは、標的分子と特異的に結合する抗体又はその結合断片を用いて、その標的分子を定量する方法である。免疫学的検出法には、例えば、酵素免疫測定法（ELISA法、EIA法を含む）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（RIA）、発光免疫測定法、表面プラズモン共鳴法（SPR法）、水晶振動子マイクロバランス（QCM）法、免疫比濁法、ラテックス凝集免疫測定法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応法、金コロイド法、キャピラリー電気泳動法、ウェスタンブロット法又は免疫組織化学法（免疫染色法）等が知られているが、本方法ではいずれの検出法を用いてもよい。限定はしないが、ELISA法は好適であり、標的分子の異なる2つのエピトープをそれぞれ特異的に認識する抗体を用いたサンドイッチELISA法は、簡便性、検出感度、及び定量性の点から特に好ましい。
　抗fPTPRZ抗体は、遊離型PTPRZの全長又はその一部（例えば、CS結合領域、CAドメイン、又はFNドメイン）を抗原とし、常法により作製すればよい。具体的には、配列番号４又は５で示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその断片を抗原とすることができる。PTPRZの細胞外領域に特異的に結合する市販のPTPRZ抗体を使用してもよい。抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを使用してもよい。抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合、それを構成する免疫グロブリンは、任意のクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びIgY）、又は任意のサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）でよい。抗体は、哺乳動物及び鳥を含めたいずれの動物由来でもよい。抗体由来動物として、例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ウマ、ニワトリ又はヒト等が挙げられる。
　免疫学的検出法では、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体に基づき、人為的に作製した抗体も使用することができる。そのような抗体として、例えば、組換え抗体、合成抗体、及び抗体フラグメントが挙げられる。
　「組換え抗体」は、遺伝子組換え技術を用いて作製された抗体であり、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び多重特異性抗体等を含む。
　「キメラ抗体」とは、分子生物学的手法を用いて、ある動物由来の抗体の可変領域（V領域）を他の異なる動物由来の抗体のV領域で置換した抗体である。例えば、グリオーマ検出用バイオマーカーであるfPTPRZと特異的に結合するマウス由来の抗fPTPRZモノクローナル抗体のV領域をヒト抗体のV領域と置き換えて、V領域がマウス由来、C領域がヒト由来となった抗体が該当する。
　「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス由来のモノクローナル抗体のV領域における相補性決定領域（CDR；CDR1、CDR2及びCDR3）を適当なヒトモノクローナル抗体の対応するCDRと置換したグラフト抗体である。例えば、マウス由来の抗fPTPRZモノクローナル抗体における各CDRをヒトモノクローナル抗体の対応するCDRとそれぞれ置換して得られる抗fPTPRZヒト化抗体が該当する。
　「多重特異性抗体」とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、IgGのように2つの抗原結合部位を有する抗体であれば、それぞれの抗原結合部位が同一の又は異なる抗原と特異的に結合する二重特異性抗体（Bispecific抗体）が挙げられる。
　「合成抗体」は、化学的方法又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、適当な長さと配列を有するリンカーペプチド等を介して、特定の抗体の一以上の軽鎖可変領域（VL領域）及び一以上の重鎖可変領域（VH領域）を人工的に連結させた一量体ポリペプチド分子、又はその多量体ポリペプチドが該当する。このようなポリペプチドの具体例としては、一本鎖Fv（scFv ：single chain Fragment oｆ variable region）（Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL参照）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ(tetrabody)等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、VL領域及びVH領域は、通常別々のポリペプチド鎖（軽鎖と重鎖）上に位置する。一本鎖Fvは、これら2つのポリペプチド鎖上のV領域を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、1本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する合成抗体断片である。一本鎖Fv内において両V領域は、互いに自己集合して1つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。一本鎖Fvは、それをコードする組換えDNAを、公知技術を用いてファージゲノムに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、一本鎖Fvの二量体構造を基礎とした構造を有する分子である(Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)。例えば、上記リンカーの長さが約12アミノ酸残基よりも短い場合、一本鎖Fv内の2つの可変部位は自己集合できないが、ダイアボディを形成させることにより、すなわち、2つの一本鎖Fvを相互作用させることにより、一方のFv鎖のVL領域が他方のFv鎖のVH領域と集合可能となり、2つの機能的な抗原結合部位を形成することができる（Marvin et al., 2005, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658）。さらに、一本鎖FvのC末端にシステイン残基を付加させることにより、2本のFv鎖同士のジスルフィド結合が可能となり、安定的なダイアボディを形成させることもできる(Olafsen et al., 2004, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27)。このようにダイアボディは二価の抗体断片であるが、それぞれの抗原結合部位は、同一エピトープと結合する必要はなく、それぞれが異なるエピトープを認識し、特異的に結合する二重特異性を有していてもよい。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様に一本鎖Fv構造を基本としたその三量体、及び四量体構造を有する。それぞれ、三価、及び四価の抗体断片であり、多重特異性抗体であってもよい。
　「抗体フラグメント」とは、例えば、Fab、F(ab’)2、Fv等が該当する。
（２）アプタマー解析法
　「アプタマー解析法」は、立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合するアプタマーを用いて、標的分子であるグリオーマ検出用バイオマーカーを定量する方法である。アプタマーは、その分子の種類により、核酸アプタマーとペプチドアプタマーに大別することができるが、いずれのアプタマーであってもよい。
　「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーをいう。核酸アプタマーを構成する核酸は、DNA、RNA又はそれらの組合せのいずれであってもよい。必要に応じて、PNA、LNA／BNA、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等の化学修飾核酸を含むこともできる。本発明であれば、抗fPTPRZ RNAアプタマー又は抗fPTPRZ DNAアプタマー等が挙げられる。
　核酸アプタマーは、グリオーマ検出用バイオマーカー、すなわち、fPTPRZの全長又は一部を標的分子として、当該分野で公知の方法、例えば、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法を用いて作製することができる。SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92: 11509-11513）に準じて行えばよい。
　ペプチドアプタマーとは、アミノ酸で構成されるアプタマーで、抗体と同様に、特定の標的分子の表面構造を認識して、特異的に結合する1～6kDaのペプチド分子である。本発明であれば、抗fPTPRZペプチドアプタマーが挙げられる。ペプチドアプタマーは、当該分野で公知製造の方法に基づいて作製すればよい。例えば、Whaley, S.R., et al., 2000, Nature, 405, 665-668を参照することができる。通常は、ファージディスプレイ法や細胞表層ディスプレイ法を用いて作製することができる。
　上記抗体又はアプタマーは、必要に応じて標識されていてもよい。標識は、当該分野で公知の標識物質を利用すればよい。抗体及びペプチドアプタマーの場合、例えば、蛍光色素（フルオレセイン、FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5）、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンにより標識することができる。また、核酸アプタマーの場合、例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。標識物質で標識された抗体やアプタマーは、標的タンパク質と結合したアプタマーを検出する際に有用なツールとなり得る。
（３）質量分析法
　「質量分析法」には、高速液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（LC-MS/MS）、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（ICP-MS）が挙げられる。
　上記免疫学的検出法、アプタマー解析法、及び質量分析法は、いずれも当該分野に公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York；Christopher J., et al., 2005, Chemical Review,105:1103-1169；Iijima Y. et al., 2008,.The Plant Journal, 54,949-962；Hirai M. et al.,2004, Proc Natl Acad Sci USA, 101(27) 10205-10210；Sato S, et al., 2004,,The Plant Journal, 40(1)151-163； Shimizu M. et al., 2005, Proteomics, 5,3919-3931に記載の方法に準じて行うことができる。また、各メーカーからペプチド定量キットが市販されており、それらを利用することもできる。
１－３－２．判定工程
　「判定工程」は、前記測定工程で得られた測定値に基づき、被験者におけるグリオーマの罹患の有無を判定する工程である。
　測定値に基づいた判定方法として、限定はしないが、例えば、カットオフ値を定め、そのカットオフ値に基づきグリオーマの罹患を判定する方法、及び被験者の測定値を対照者群の測定平均値と比較したときの統計学的有意差に基づきグリオーマの罹患を判定する方法が挙げられる。
　カットオフ値は、定量結果を陽性、陰性に分類するための境界値をいう。カットオフ値は、通常、疾患の罹患率とROC曲線(receiver operating characteristic curve)より算出された感度及び特異度に基づき算出することができる。カットオフ値により陽性と判定された被験者はグリオーマに罹患している可能性が高いことを、また陰性と判定された被験者はグリオーマに罹患していない可能性が高いことをそれぞれ示す。カットオフ値の設定法は特に限定しない。
　例えば、所定の値をカットオフ値と定め、測定値がその値以上であれば、測定工程での髄液提供者である被験者は陽性であり、グリオーマに罹患している可能性が高いと判定すればよい。逆にカットオフ値未満であれば陰性であり、グリオーマには罹患していない可能性が高いと判定すればよい。例えば、被験者の測定値とグリオーマに罹患していない対照者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZの測定値とを比較して、被験者の測定値が対照者の測定値よりも高いときに、前記被験者はグリオーマに罹患している可能性が高いと判定することができる。
　または、対照者群から得られた測定値をパーセンタイルで分類し、その分類に用いたパーセンタイル値をカットオフ値とすることもできる。例えば、対照者から得られた測定値の95パーセンタイルをカットオフ値とし、その値以上を陽性、値未満を陰性とした場合、被験者の測定値が95パーセンタイル以上であれば、被験者は陽性のため、グリオーマに罹患している可能性が高いと判定すればよい。
　統計学的有意差に基づき判定する方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法であれば限定はしない。例えば、t検定法や多重比較検定法等が挙げられる。「統計学的（に）有意」とは、帰無仮説の下で、得られた値の偶然性が統計確率的に低く、意味があることをいい、「有意差」とは2つの値の間で有意な差があることをいう。具体的には、危険率（有意水準）が5％、1％、0.3％、0.2％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。本方法の場合であれば、被験者の測定値と対照者群の平均測定値を前記t検定法等により統計学的に処理したときに、両者間に統計学的有意差があることをいう。「対照者群の平均測定値」とは、前記測定工程において被験者に対して行った測定方法と同じ方法により、複数の対照者から得た測定値の平均値をいう。
　対照者群の測定平均値と被験者の測定値の間に有意差が認められた場合、その被験者はグリオーマに罹患している可能性が高いと判定すればよい。一方、有意差が認められない場合、その被験者はグリオーマに罹患していない可能性が高いと判定すればよい。
１－４．効果
　本発明の方法によれば、被験者の髄液のみを検査試料として要する。それ故に、侵襲性の極めて高い脳生検術を必要とせず、簡便、かつ容易にグリオーマの罹患を検出することができる。
　また、本発明の方法によれば、グリオーマに特異的なバイオマーカーを用いて鑑別することから、従来、画像診断だけでは困難であった悪性リンパ腫のようなグリオーマ以外の中枢神経系原発腫瘍や、多発性硬化症のような中枢神経系非腫瘍性疾患との鑑別は明瞭、かつ正確であり、それらの疾患との誤診を防ぐことができる。
２．グリオーマ検出用キット
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、グリオーマ検出用キットである。本発明のキットは、グリオーマ検出用バイオマーカーに特異的に結合する結合手段を構成要素として含む。本発明のキットによれば、被験者由来の髄液中に存在し得るグリオーマ検出用バイオマーカーを検出し、その被験者のグリオーマ罹患を容易、かつ簡便に検出することができる。
２－２．構成
　本発明のグリオーマ検出用キットは、必須の構成要素として結合手段を含む。
　本明細書において「結合手段」とは、fPTPRZ、すなわちPTPRZの細胞外領域を特異的に認識し、結合する手段をいう。具体的には、配列番号４又は５で示すアミノ酸配列の全部、又は一部を特異的に認識し、結合する手段である。
　結合手段を構成する素材は、特に限定はしないが、ポリペプチドや核酸が適当である。
　ポリペプチドで構成される結合手段には、例えば、抗体、若しくはその結合断片、又はペプチドアプタマーが挙げられる。抗体の場合、標的抗原であるfPTPRZに結合する抗fPTPRZ抗体が例示される。ペプチドアプタマーの場合、fPTPRZに結合する抗fPTPRZペプチドアプタマーが例示される。抗fPTPRZ抗体については、第１態様の「１－３．方法」の章における「１－３－１．測定工程」の「（１）免疫学的検出法」で、また抗fPTPRZペプチドアプタマーについては、「（２）アプタマー解析法」で、それぞれ詳述したことから、ここでの具体的な説明は省略する。
　核酸で構成される結合手段には、例えば、核酸アプタマー（RNAアプタマー、DNAアプタマー）が挙げられる。本発明の場合、標的抗原であるfPTPRZに結合する抗fPTPRZ RNAアプタマーや抗fPTPRZ DNAアプタマーが例示される。これらの核酸アプタマーについては、第１態様の「１－３．方法」の章における「１－３－１．測定工程」の「（２）アプタマー解析法」で詳述したことから、ここでの具体的な説明は省略する。
　本発明のグリオーマ検出用キットは、前記結合手段を2種以上含むことができる。この場合、各結合手段の構成素材は同一であっても、異なっていてもよい。構成素材が同一の場合の例として、抗fPTPRZ抗体とその結合断片の組み合わせが挙げられる。また、構成素材が異なる場合の例として、抗fPTPRZ抗体と抗fPTPRZ RNAアプタマーの組み合わせが挙げられる。
　本発明のグリオーマ検出用キットが結合手段を2種以上含む場合、各結合手段はfPTPRZの異なる部位を特異的に認識するものであってもよい。例えば、結合手段が抗体の場合、fPTPRZ上の異なるエピトープを認識して結合する2種以上の抗体が該当する。このようなfPTPRZの異なる部位を特異的に認識する複数種の結合手段は、例えば、サンドイッチELISA法等で使用することができ、より高い感度と精度でグリオーマ検出用バイオマーカーを検出できるため構成要素として好ましい。
　なお、本発明のグリオーマ検出用キットの適用対象となる試料は、原則として単離された髄液である。これは、本発明がグリオーマ罹患患者において、PTPRZの細胞外領域が切断され、遊離型PTPRZとして髄液中に分泌される新規知見に基づくものであるからである。
３．グリオーマ再発評価方法
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、グリオーマ再発評価方法である。本発明の方法によれば、グリオーマ罹患患者において、術後所定期間を経過した後、グリオーマが再発したか否かを評価することできる。また、手術不能症例や放射線療法や化学療法の実施例における治療効果を評価することができる。
３－２．方法
　本発明のグリオーマ再発評価方法は、測定工程、及び評価工程を必須工程として含む。以下、各工程について説明をする。
（１）測定工程
　「測定工程」は、被験者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZのタンパク質量を測定し、その測定値を得る工程であって、その基本構成は、第１態様のグリオーマ検出方法における測定工程とほとんど同じである。したがって、第１態様の測定工程と同一な点についての説明は省略し、ここでは異なる点についてのみ説明をする。
　本態様の方法では、被験者の条件が第１態様の被験者のそれとは異なる。本態様の方法における被験者は、グリオーマに罹患していたことのある者、すなわちグリオーマ治療歴のある者であって、グリオーマ手術後に所定の期間が経過した者が該当する。ここでいう「所定の期間」とは、限定はしないが、例えば、症例から術後にグリオーマが再発し得る期間であればよい。具体的には、例えば、術後、3ヶ月、半年、9か月、１年、1.5年、2年、3年、4年、又は5年が挙げられる。
（２）評価工程
　「評価工程」は、測定工程で得られた測定値に基づき、当該被験者のグリオーマ再発の有無を評価する工程である。
　本工程において、測定値に基づいた評価方法は、第１態様のグリオーマ検出方法における測定工程に類似する。すなわち、限定はしないが、例えば、カットオフ値を定め、そのカットオフ値に基づきグリオーマの再発を評価する方法や被験者の測定値を対照者群の測定平均値と比較したときの統計学的有意差に基づきグリオーマの再発を評価する方法が挙げられる。
　カットオフ値や統計学的有意差に関する説明は、第１態様のグリオーマ検出方法における判定工程で詳述していることから、ここではその説明を省略する。
　本工程において、カットオフ値に基づきグリオーマの再発を評価する場合には、例えば、所定の値をカットオフ値と定め、測定値がその値以上であれば、測定工程での髄液提供者である被験者は陽性であり、グリオーマを再発している可能性が高いと評価すればよい。逆に測定値がカットオフ値未満であれば陰性であり、グリオーマを再発していない可能性が高いと評価すればよい。例えば、被験者の測定値とグリオーマに罹患していない対照者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZの測定値とを比較して、被験者の測定値が対照者の測定値よりも高いときに、前記被験者はグリオーマを再発した可能性が高いと評価することができる。
　また、パーセンタイル値をカットオフ値として用いる場合であれば、例えば、対照者から得られた測定値の95パーセンタイルをカットオフ値として、その値以上は陽性であり、被験者はグリオーマを再発している可能性が高いと評価すればよい。逆に、前記カットオフ値未満は陰性であり、被験者はグリオーマを再発していない可能性が高いと評価すればよい。
　統計学的有意差に基づきグリオーマの再発を評価する方法も、基本的には第１態様のグリオーマ検出方法における判定工程と同じであって、対照者群の測定平均値と被験者の測定値の間に有意差が認められた場合、その被験者はグリオーマを再発している可能性が高いとし、逆に有意差が認められない場合には、グリオーマを再発していない可能性が高いと評価すればよい。
３－３．効果
　本発明のグリオーマ再発評価方法によれば、グリオーマ治療歴のある者が術後所定の期間を経過した後に、グリオーマを再発しているか否かを、髄液採取という比較的侵襲性の低い措置のみで、簡便、かつ容易に評価することができる。
　また、本発明のグリオーマ再発評価方法をグリオーマ治療中の被験者に対して定期的に継続して実施するあるいは治療前後に実施することで、手術、放射線、化学療法あるいはその他の治療に対して、それぞれの治療効果を評価することもできる。
＜実施例１：髄液中の遊離型PTPRZの検証＞
（目的）
　PTPRZの細胞外領域に由来する2種類の遊離型PTPRZが、グリオーマ患者の髄液中に存在していることを検証する。
（方法）
　グレードI～IVの各グリオーマ患者（4名）、神経鞘腫患者（1名）、及び多発性硬化症患者（1名）のそれぞれに由来する髄液中の遊離型PTPRZをウェスタンブロッティングで測定した。なお、本明細書の実施例で使用した髄液は、福島県立医科大学附属病院を中心とした医療機関で得られた患者試料であり、全患者からインフォームドコンセントを取得した。使用した抗体は、抗PTPRζ抗体であるMouse anti PTPζ IgMκ (sc-33664, Santa cruz)、及びGoat anti mouse IgM antibody-HRP (SAB-110, Stressgen)である。Mouse anti PTPζ IgMκはラット胎児脳からプロテオグリカン画分を調製して作製されたPTPRZ特異的モノクローナル抗体である。その他の試薬は、主にWako社より購入した。
　遊離型PTPRZのCS結合領域には、多数のコンドロイチン硫酸鎖によって修飾されている。そこで、それらを消化するために上記各患者から採取した10μLの髄液にコンドロイチナーゼ消化を行った。具体的には、試料溶液に、終濃度100mM Tris－HCl(pH7.5)、60mM 酢酸ナトリウム、4mUコンドロイチナーゼABC（Sigma, 2905）を添加し、37℃にて1時間インキュベートした。
　その後、ウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングは以下の手順で行った。コンドロイチナーゼ処理した試料溶液にLaemmliのSample buffer（終濃度20.8mM Tris-HCl(pH6.5)、8.3％グリセロール、1％SDS、1％βメルカプトエタノール)を加え、99℃で5分間加熱した。3～10％グラジエントポリアクリルアミドゲル（Atto社,NPG-310L）を用いてゲル1枚あたり20mA～25mAの定電流で60分間～70分間泳動した。ウェット式の転写装置を用いて、ニトロセルロース膜に350mAの定電流で45分間転写を行った。1％BSA-PBS(pH7.4)に4℃で1晩浸漬してブロッキングを行った後、PBS-0.1%Tween（PBS-T）で200倍希釈したマウス抗Ptprz IgMκ(Santa cruz, sc-33664)を一次抗体として含む1.5mLのPBS-T中で室温にて2時間振とうした。続いて、PBS-T中に5分間ずつ3回浸漬して洗浄した後、二次抗体として10,000倍希釈したHRP標識化ヤギ抗マウスIgM抗体(SAB-110, Stressgen)を含むPBS-Tと室温で2時間反応させた。TBS-Tで3回洗浄後、SuperSignal West Femto maximum sensitivity substrate（Thermo Fisher Scientific社, 34096）を用いて発色させて、得られたシグナルをATTO Ez-Capture MG(ATTO)で検出した。なお、バンドのシグナル強度の定量は、付属の定量ソフトCS Analyzerを用いて行った。
（結果）
　図２で示す通り、各髄液から抗fPTPRZ抗体と反応を示す数本の又はブロードなバンドからなる約400kDa（約350～400kDa）のバンドと約190kDa（約160～190kDa）のバンドの2つが各患者由来の髄液から検出された。約400kDaと約190kDaのいずれのバンドもグリオーマ罹患患者の髄液では、そのグレードにかかわらず、他の疾患の同サイズのシグナル強度と比較して、強いシグナルが検出された。特に約400kDaのバンドのシグナル強度は著しく高かった。約400kDaのバンドは、fPTPRZ-longに相当し、約190kDaのバンドはfPTPRZ-shortに相当する。これは遊離型PTPRZであるfPTPRZ-longとfPTPRZ-shortが髄液中のグリオーマ検出用の腫瘍マーカーとなり得ることを示唆している。
＜実施例２：髄液中の遊離型PTPRZのグリオーマ検出用バイオマーカーとしての検証＞
（目的）
　遊離型PTPRZ（fPTPRZ-long及びfPTPRZ-short）が、髄液中のグリオーマ検出用バイオマーカーとして機能し得ることを検証する。
（方法）
　グレードI～IVの様々なグレードからなるグリオーマ患者群（15名、初発症例と再発症例の両方を含む）、多発性硬化症（MS）患者群（16名）、及び特発性正常圧水頭症群（iNPH）患者（14名）のそれぞれに由来する髄液中の遊離型PTPRZ（fPTPRZ-long及びfPTPRZ-short)をウェスタンブロッティングで測定した。iNPHは、髄液代謝異常症であって、グリオーマとの鑑別が困難な中枢神経系原発腫瘍及び中枢神経系非腫瘍性のいずれにも該当しない疾患である。それ故に、iNPH患者由来の髄液は、本実施例の陰性対照として使用した。具体的な方法については、実施例１に準じた。各患者から得られた約400ｋDa（以下、単に「400ｋDa」と表記する。）と約190ｋDa（以下、単に「190ｋDa」と表記する。）の遊離型PTPRZのシグナル強度を定量化して、比較した。
（結果）
　図３で示すようにグリオーマ患者由来の髄液中の遊離型PTPRZのシグナル強度は、400ｋDaのfPTPRZ-long及び190ｋDaのfPTPRZ-shortのいずれも他疾患と比較して有意に高いことが明らかとなった。この結果から、どちらの遊離型PTPRZもグリオーマ特異的なバイオマーカーとなり得ることが立証された。
　また、遊離型PTPRZ、特に400ｋDaのfPTPRZ-longをバイオマーカーとして用いることで、従来、画像診断の所見からは確定診断が困難であったグリオーマ患者と非グリオーマ患者（本実施例では多発性硬化症患者）とを明瞭かつ容易に鑑別できることも明らかとなった。
＜実施例３：初発症例のグリオーマ患者群のみを対象とする検証＞
（目的）
　初発症例のグリオーマ患者群のみを対象として、遊離型PTPRZ（fPTPRZ-long及びfPTPRZ-short）が、髄液中のグリオーマ検出用バイオマーカーとして機能し得ることを、実施例２から被験者数を増やして検証する。なお、「初発症例」とは、過去にグリオーマを診断されたことのない患者が初めてグリオーマを診断された症例をいう。
（方法）
　グレードI～IVの様々なグレードからなる初発症例のグリオーマ患者群（17名）、多発性硬化症（MS）患者群（27名）、及び対照群（21名、内訳はiNPH患者11名、片側顔面痙攣患者3名、未破裂脳動脈瘤患者4名、三叉神経痛患者3名）のそれぞれに由来する髄液中の遊離型PTPRZ（fPTPRZ-long及びfPTPRZ-short)をウェスタンブロッティングで測定した。
　具体的には、実施例１に記載の方法に以下の改変を加えてウェスタンブロッティングを行った。コンドロイチナーゼ消化は、試料溶液に、終濃度100mM Tris－HCl(pH7.4)、60mM 酢酸ナトリウム、0.2mUコンドロイチナーゼABC（Sigma, 2905）を添加し、37℃にて1時間インキュベートすることで行った。泳動用試料の調製は、コンドロイチナーゼ処理した試料溶液にLaemmliのSample buffer（終濃度60mM Tris-HCl(pH6.5)、10％グリセロール、2％SDS、5％βメルカプトエタノール)を加え、95℃で5分間加熱することで行った。また、二次抗体反応は室温にて30分で行った。
（結果）
　図４で示すように初発症例のグリオーマ患者由来の髄液中の遊離型PTPRZのシグナル強度は、400ｋDaのfPTPRZ-long及び190ｋDaのfPTPRZ-shortのいずれも他疾患と比較して有意に高いことが明らかとなった。この結果から、どちらの遊離型PTPRZも、初発症例のグリオーマ患者において、グリオーマ特異的なバイオマーカーとなり得ることが立証された。
　また、遊離型PTPRZ、特に400ｋDaのfPTPRZ-longをバイオマーカーとして用いることで、初発症例のグリオーマ患者と非グリオーマ患者（本実施例では多発性硬化症患者）とを明瞭かつ容易に鑑別できることも明らかとなった。
＜実施例４：再発症例のグリオーマ患者群のみを対象とする検証＞
（目的）
　再発症例のグリオーマ患者群のみを対象として、遊離型PTPRZ（fPTPRZ-long及びfPTPRZ-short）が、髄液中のグリオーマ検出用バイオマーカーとして機能し得ることを、実施例２から被験者数を増やして検証する。なお、「再発症例」とは、手術、放射線、化学療法等の治療によってグリオーマが一旦消失したと思われる状態を経た後にグリオーマが再出現した症例をいう。
（方法）
　グレードI～IVの様々なグレードからなる再発症例のグリオーマ患者群（7名）、多発性硬化症（MS）患者群（27名）、及び対照群（21名、内訳はiNPH患者11名、片側顔面痙攣患者3名、未破裂脳動脈瘤患者4名、三叉神経痛患者3名）のそれぞれに由来する髄液中の遊離型PTPRZ（fPTPRZ-long及びfPTPRZ-short)をウェスタンブロッティングで測定した。具体的な方法については、実施例３に準じた。
（結果）
　図５で示すように再発症例のグリオーマ患者由来の髄液中の遊離型PTPRZのシグナル強度は、400ｋDaのfPTPRZ-long及び190ｋDaのfPTPRZ-shortのいずれも他疾患と比較して有意に高いことが明らかとなった。この結果から、どちらの遊離型PTPRZも、再発症例のグリオーマ患者において、グリオーマ特異的なバイオマーカーとなり得ることが立証された。
　また、遊離型PTPRZ、特に400ｋDaのfPTPRZ-longをバイオマーカーとして用いることで、再発症例のグリオーマ患者と非グリオーマ患者（本実施例では多発性硬化症患者）とを明瞭かつ容易に鑑別できることも明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (14)

  1. 　グリオーマの検出方法であって、
    　被験者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型受容体型プロテインチロシンホスファターゼZ（遊離型PTPRZ）のタンパク質量を測定し、その測定値を得る測定工程、及び
    　前記測定工程で得られた測定値に基づき、当該被験者のグリオーマの罹患の有無を判定する判定工程
    を含み、
    　前記遊離型PTPRZは配列番号４又は５で示すアミノ酸配列からなるPTPRZの細胞外領域が切断されてなる、
    前記方法。
  2. 　前記判定工程で、グリオーマ患者及び非グリオーマ患者の測定値から算出されるカットオフ値に基づいて、前記被験者のグリオーマ罹患可能性を判定する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記判定工程で、被験者の測定値とグリオーマに罹患していない対照者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZの測定値とを比較して、被験者の測定値が対照者の測定値よりも高いときに、前記被験者はグリオーマに罹患している可能性が高いと判定する、請求項１に記載の方法。
  4. 　グリオーマと他の中枢神経系原発腫瘍又は中枢神経系非腫瘍性疾患との鑑別方法であって、
    　被験者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZのタンパク質量を測定し、その測定値を得る測定工程、及び
    　前記測定工程で得られた測定値に基づいて、当該被験者が前記いずれの疾患に罹患しているかを判定する判定工程
    を含み、
    　前記被験者はグリオーマ、他の中枢神経系原発腫瘍、又は中枢神経系非腫瘍性疾患のいずれかに罹患の疑いがあり、
    　前記遊離型PTPRZは配列番号４又は５で示すアミノ酸配列からなるPTPRZの細胞外領域が切断されてなる、
    前記方法。
  5. 　前記他の中枢神経系原発腫瘍が悪性リンパ腫又は神経鞘腫であり、また前記中枢神経系非腫瘍性疾患が多発性硬化症である、請求項４に記載の鑑別方法。
  6. 　配列番号４又は５で示すアミノ酸配列からなるPTPRZの細胞外領域の全部又は一部を特異的に認識し、結合する結合手段を含むグリオーマ検出用キット。
  7. 　前記結合手段が抗体又はアプタマーである、請求項６に記載のグリオーマ検出用キット。
  8. 　グリオーマ再発の有無を評価する方法であって、
    　グリオーマ治療歴のある被験者において、術後、所定の期間が経過した前記被験者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZのタンパク質量を測定し、その測定値を得る測定工程、
    　前記測定工程で得られた測定値に基づき、当該被験者のグリオーマ再発の有無を評価する評価工程、
    を含み、
    　前記遊離型PTPRZはPTPRZの細胞外領域が切断されてなる、
    前記評価方法。
  9. 　前記評価工程で、グリオーマ患者及び非グリオーマ患者の測定値から算出されるカットオフ値に基づいて前記被験者のグリオーマ再発可能性を評価する、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記評価工程で、被験者の測定値とグリオーマに罹患していない対照者に由来する髄液の単位容量あたりに含まれる遊離型PTPRZの測定値とを比較して、被験者の測定値が対照者の測定値よりも高いときに、前記被験者はグリオーマを再発した可能性が高いと評価する、請求項８に記載の方法。
  11. 　遊離型PTPRZからなるグリオーマ検出用のバイオマーカー。
  12. 　前記遊離型PTPRZはPTPRZの細胞外領域で構成される、請求項１１に記載のバイオマーカー。
  13. 　前記遊離型PTPRZが配列番号４で示すアミノ酸配列又はその一部を含む、請求項１１又は１２に記載のバイオマーカー。
  14. 　前記その一部を含む遊離型PTPRZが配列番号５で示すアミノ酸配列からなる、請求項１３に記載のバイオマーカー。
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