WO2019240145A1 - アルツハイマー病治療薬 - Google Patents

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WO2019240145A1
WO2019240145A1 PCT/JP2019/023176 JP2019023176W WO2019240145A1 WO 2019240145 A1 WO2019240145 A1 WO 2019240145A1 JP 2019023176 W JP2019023176 W JP 2019023176W WO 2019240145 A1 WO2019240145 A1 WO 2019240145A1
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microtubule
mbp1b
dementia
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光山　冬樹
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光山　冬樹
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    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for dementia of Alzheimer's disease. More specifically, it relates to gene therapy by introducing and expressing genes in brain neurons.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • the drug called donepezil can increase the neurotransmitter called acetylcholine in the brain (Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • the synaptic neurotransmitter that controls memory is glutamic acid
  • acetylcholine is only a symptomatic treatment and can only slightly suppress the progression of early to middle symptoms of Alzheimer's disease, and its effects are limited.
  • amyloid antibody As a method for solving this problem, there is a treatment method using amyloid antibody, which is considered to be a causal therapy, but there are drawbacks that it is less effective and has strong side effects such as cerebral edema.
  • the problem to be solved is to provide an effective treatment for Alzheimer's disease dementia and its therapeutic substance that can be causal therapy, not symptomatic therapy.
  • DNA encoding microtubule binding protein 1B (MBP1B) ii) a gene encoding a protein having 70% or more homology with a DNA encoding MBP1B and having an equivalent function iii) hybridizing with a DNA encoding MBP1B under stringent conditions, and equivalent to the MBP1B protein DNA encoding a functional protein iv) DNA encoding a protein having 60% or more identity with the amino acid sequence of the MBP1B protein and having a function equivalent to that of the MBP1B protein A treatment for dementia, including any of the following.
  • the gene to be encoded means an open reading frame (ORF) or a coding region (preferably full length), and is a protein that functions when introduced into a cell linked to a promoter.
  • ORF open reading frame
  • the promoter may include an internal ribosomal entry site (IRES), an enhancer, an insulator, and the like as necessary.
  • IRS internal ribosomal entry site
  • the entire ORF cDNA is introduced in the present invention, but may contain substitution, addition, deletion, etc.
  • the therapeutic agent for dementia according to (1) which is linked to a vector so as to function.
  • a method for achieving (1) a method in which a gene therapy vector bound to a microtubule-binding protein 1B gene is directly injected into the brain, and a microtubule-binding protein 1B gene is passed through the BBB (blood brain barrier).
  • BBB blood brain barrier
  • the therapeutic agent for dementia according to (1) which is bonded to a blood-brain barrier (BBB) -passing nanomachine.
  • the blood-brain barrier mainly controls cerebral vascular endothelial cells and controls the transport of substances in the circulating blood and cranial nerve parenchyma. It takes in nutrients essential for brain activity, but significantly restricts the delivery of drugs to the brain. . Kazunori Kataoka et al.
  • microtubule-binding protein 1B gene Passed the blood-brain barrier in response to a simple stimulus called a change in blood glucose level, passing through the blood-brain barrier with a significantly higher efficiency than existing technologies, and further accumulating into nerve cells in the brain.
  • Successfully developed nanomachines If the microtubule-binding protein 1B gene is bound to this blood-brain barrier-penetrating nanomachine and administered into the blood vessel, the microtubule-binding protein 1B can be applied to nerve cells in the brain simply by intravascular administration without the need for brain surgery. It becomes possible to express a gene.
  • a method for treating dementia by expressing microtubule-binding protein 1B in brain cells.
  • Microtubule binding protein 1B gene used for the treatment of dementia (7) A method for treating dementia by administering the therapeutic agent for dementia according to any one of (1) to (3).
  • a method for treating dementia by introducing and expressing any of the following DNA: i) DNA encoding microtubule binding protein 1B (MBP1B) ii) a gene encoding a protein having 70% or more homology with a DNA encoding MBP1B and having an equivalent function iii) hybridizing with a DNA encoding MBP1B under stringent conditions, and equivalent to the MBP1B protein DNA encoding a functional protein Or iv) DNA encoding a protein having 60% or more identity with the amino acid sequence of the MBP1B protein and having a function equivalent to that of the MBP1B protein.
  • the site to be introduced is preferably in the brain, but if it can pass through the blood-brain barrier, it may be injected into the arm or the like, introduced into the blood, and moved to the brain for expression.
  • a DNA encoding microtubule binding protein 1B (MBP1B) for producing a dementia therapeutic agent ii) a gene encoding a protein having 70% or more homology with a DNA encoding MBP1B and having an equivalent function iii) hybridizing with a DNA encoding MBP1B under stringent conditions, and equivalent to the MBP1B protein DNA encoding a functional protein Or iv) DNA encoding a protein having 60% or more identity with the amino acid sequence of the MBP1B protein and having a function equivalent to that of the MBP1B protein Use of either.
  • (10) for treating dementia i) DNA encoding microtubule binding protein 1B (MBP1B) ii) a gene encoding a protein having 70% or more homology with a DNA encoding MBP1B and having an equivalent function iii) hybridizing with a DNA encoding MBP1B under stringent conditions, and equivalent to the MBP1B protein DNA encoding a functional protein Or iv) DNA encoding a protein having 60% or more identity with the amino acid sequence of the MBP1B protein and having a function equivalent to that of the MBP1B protein Any of the DNA. (11) The DNA according to (10), wherein the DNA is further linked to a vector. (12) The DNA according to (10), which is further bound to a blood-brain barrier (BBB) -passing nanomachine.
  • BBB blood-brain barrier
  • the present invention has an effect of improving Alzheimer's disease dementia.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an overall image of the present invention.
  • Example 1 FIG. 2 is a conceptual diagram of the method for producing a gene transfer substance of the present invention.
  • Example 1 FIG. 3 is a graph showing the effect when the microtubule-binding protein 1B gene is introduced.
  • FIG. 4 is a photograph showing that dendritic spines expand when microtubule-binding protein 1B is expressed in cultured cells.
  • FIG. 5 is a photograph and a drawing of a microtubule stained with a spine that has grown by introducing and expressing the microtubule-binding protein 1B in cultured cells.
  • Example 6 shows that when the microtubule-binding protein 1B gene was injected into the brain, it was injected into the right hippocampus of the model mouse, but one week after the injection, the hippocampus of the model mouse brain was removed and the right hippocampus and the left hippocampus were extracted.
  • a photograph of Western blotting with an antibody of a protein representing spines and the degree thereof are graphed (Example 2).
  • dementia is a type of cognitive impairment, and refers to a state in which intelligence once developed normally is irreversibly lowered due to an acquired brain organic disorder. Dementia also occurs in non-human subjects such as dogs and cats. In the narrow sense, it refers to a state where intelligence has been acquired.
  • cognitive impairments including “memory” and “registration” and “personality changes” are associated with syndromes. means.
  • dementia refers to Alzheimer-type dementia, frontotemporal dementia, Parkinson's disease, Lewy body dementia, Huntington's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, amyotrophic lateral sclerosis with dementia
  • diseases such as prion diseases, but is not limited to these diseases.
  • diseases with these dementias other than Alzheimer's disease often show spinal and / or synaptic loss and amyloid deposition.
  • the treatments and therapeutic substances for dementia of Alzheimer's disease mainly described in this specification are effective for dementia other than dementia of Alzheimer's disease. There is a possibility.
  • Alzheimer's disease is a disease mainly occurring at an old age and pathologically characterized by amyloid deposition in the brain, with memory impairment as the main symptom.
  • a microtubule is a fibrous intracellular organ found in an axon, dendrite, or spine in a nerve cell, whereby cell processes such as axon, dendrite, and spine are removed. It means something that forms or transports materials along it.
  • Microtubule-associated protein (MBP1B, the same meaning of microtubule-associated protein) is a protein that adheres to the surface of fibrous microtubules and promotes stabilization and elongation of microtubules. is there.
  • MBP1B Microtubule-associated protein
  • microtubule binding protein 1A / 1B Four types of microtubule binding proteins are known: microtubule binding protein 1A / 1B, sputum microtubule binding protein 2, and tau.
  • DNA encoding MBP1B means DNA containing the full length of the open reading frame (ORF), which may be the ORF itself, or may have a linker or the like before and after the ORF. Good.
  • gene overexpression means that a target gene is produced in large quantities in a test tube, and a promoter that enhances the level of expression in the target tissue, organ, etc. functions in the region encoding the protein. And an expression cassette to which a carrier for facilitating introduction into a cell such as a vector is bound, and the expression cassette is inserted into the target cell (gene transfer). By borrowing the mechanism, the target protein is finally made excessively in the cell.
  • overexpression includes introducing an expression cassette into the blood, crossing the blood-brain barrier, and overexpressing in brain neurons.
  • vector refers to a carrier that binds to a gene and places the gene in the cell for the purpose of expressing the gene in the cell.
  • a plasmid refers to a circular double-stranded DNA that replicates independently of chromosomal DNA in bacteria such as Escherichia coli.
  • a gene into which a target gene is incorporated using this property is used to cause gene expression in various cells (also called a plasmid vector).
  • DNA used for the treatment of dementia is as follows: i) Microtubule-binding protein 1B (MBP1B Ii) DNA encoding MBP1B, ii) DNA encoding a protein having 70% or more homology with MBP1B protein, and iii) DNA encoding MBP1B and stringent conditions DNA encoding a protein having a function equivalent to that of MBP1B protein, and iv) encoding a protein having at least 60% identity with the amino acid sequence of MBP1B protein and having a function equivalent to that of MBP1B protein DNA.
  • Dementia can be treated by introducing any of these DNAs into cerebral neurons and expressing MBP1B protein or a protein having a function equivalent thereto in cerebral neurons.
  • the main object of the present invention is to provide a therapeutic drug for dementia, it is thought that the principle of the present invention may also be effective in preventing dementia.
  • the DNA to be introduced and expressed has 70% or more homology with the DNA encoding MBP1B and preferably has the same function as the MBP1B protein, but more preferably 75% or more and 80% or more. 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more It may be.
  • stringent conditions include, for example, conditions of washing at 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SSC after Southern hybridization.
  • the identity of the protein having the same function as the MBP1B protein that can be used in the present invention to the amino acid sequence of the MBP1B protein is preferably 60% or more, more preferably 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80 % Or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more Good.
  • the blood-brain barrier is mainly responsible for cerebrovascular endothelial cells and is responsible for controlling the transport of substances in the circulatory blood and cranial nerve system, while selectively taking in nutrients essential for brain activity,
  • a promoter refers to a sequence having a function to transcribe mRNA from a gene. Depending on the purpose, it may be DNA or RNA, but usually DNA is used.
  • a promoter may have cis elements such as an enhancer and a silencer, but is not particularly distinguished in this specification, and a promoter having an enhancer is also called a promoter.
  • a promoter in which a cis element is bound upstream or downstream of the core promoter can also be used.
  • the present invention is characterized in that the microtubule binding protein 1B is expressed in brain neurons (preferably in hippocampal neurons).
  • brain neurons preferably in hippocampal neurons.
  • promoters capable of expressing genes in brain neurons include, but are not limited to, CMV (cytomegalovirus) promoter, EF1 ⁇ promoter, etc. Any combination of promoters and enhancers capable of expressing foreign genes in brain neurons. That's fine. 1 illustrates an exemplary embodiment of the present invention.
  • the Map1b gene containing a region encoding microtubule-binding protein 1B can be cloned by a known method.
  • mRNA having a polyA chain is prepared from a tissue that expresses the Map1b gene (for example, brain tissue including the hippocampus), and preferably a poly T sequence with a linker (poly T is preferably about 18 to 30) is annealed.
  • CDNA is synthesized by reverse transcriptase.
  • an appropriate primer for example, a DNA having a sequence of about 20 to 30 bases in the region containing the start codon of the region encoding MAP1B protein, is used as the 5′-end primer, and the poly T sequence with the linker is used.
  • DNA containing the region encoding the MAP1B protein can be amplified by PCR using the 3′-side primer. PCR conditions can be determined by methods well known to those skilled in the art depending on the length and nature of the primers.
  • the amplification enzyme (polymerase) to be used is preferably an enzyme with high fidelity (with few errors). Examples of highly accurate amplification enzymes include, but are not limited to, pfu and KOD polymerase. If necessary, the DNA of the PCR product is cloned into a plasmid and the nucleotide sequence is determined, thereby confirming that there is no mutation due to amplification.
  • the Map1b gene is cloned by screening a cDNA library or genomic library by plaque hybridization or the like using the full length or a part of the amplified DNA fragment of the Map1b gene or a cloned Map1b gene DNA fragment as a probe. be able to. At this time, by screening with a reduced stringency, a gene having homology with the Map1b gene can be found and cloned.
  • a linker can be inserted by designing an appropriate primer from the start codon to the end codon of the Map1b gene obtained by screening from the PCR method or library and performing PCR.
  • a primer with a linker is used at the time of cDNA synthesis and a linker is added after the next complementary strand synthesis, or a 5'-side primer with a linker is also used at the time of PCR, so that the trouble can be avoided twice.
  • the DNA containing the entire region encoding the MAP1B protein obtained by these operations can be linked to a vector so as to function.
  • a promoter such as Lenti-X Vector (Lenti-X TM HTX Packaging System) from Clontech (for example, cytomegalovirus promoter, EF1 ⁇ promoter, etc.) and introduced into cells or blood.
  • Lenti-X Vector Lenti-X TM HTX Packaging System
  • Clontech for example, cytomegalovirus promoter, EF1 ⁇ promoter, etc.
  • FIG. 3 shows a Y maze test in which a lentiviral vector linked to the microtubule-binding protein 1B gene was drilled into the skull of an Alzheimer disease model mouse and injected stereotactically into the right hippocampus. This is a change in the degree of dementia in Alzheimer model mice. By binding the virus vector, the degree of expression of the microtubule-binding protein 1B gene in the hippocampal neurons was improved. On the second day after injection, the degree of dementia in the injection group clearly improved (FIG. 3).
  • Alzheimer's disease is thought to be caused by the accumulation of amyloid in the brain, which adversely affects neurons, but the mechanism has not been elucidated.
  • the microtubule-binding protein 1B protein As a result of amyloid binding to the microtubule-binding protein 1B protein, the microtubule-binding protein 1B protein is inactivated, and the microtubules in the spine forming the back of the synapse are depolymerized (dissolved), resulting in shortening of the spines. It is thought that the function of synapse falls.
  • the effect gradually faded, but this is thought to be because model mice with as many as five genetic mutations in the gene producing amyloid were used in order to produce results faster (Oakley, H Et.al. J.
  • the microtubule binding protein 1B gene bound to the lentiviral vector was introduced into the primary (primary) cultured neurons derived from the hippocampus (synapses formed after about 2 weeks of culture) by the calcium phosphate method and overexpressed.
  • the MAP1B gene bound to the lentiviral vector was added, dendritic spines forming the posterior part of the synapse were expanded about 10 times as compared with those not added (DE in FIG. 4) (AB in FIG. 4).
  • D and E are normal dendrites and do not use the microtubule-binding protein 1B. Only GFP (green fluorescein protein) was introduced, and the whole nerve cells were stained green, and here thin dendrites were stained.
  • the spines that were enlarged by the microtubule-binding protein 1B gene bound to the lentiviral vector were simultaneously stained with microtubules. It can be seen that a part of the dendrite is enlarged on the left (FIG. 5). Red is the microtubule staining, but the microtubules are darkly stained on the axis of the dendrite where the spine does not expand (red, arrowhead). In the part that expands as a thorn, the microtubule of the shaft was thin. From this, it can be inferred that the microtubules of the shaft extend laterally in the portion that expands as spines, and the pressure of the microtubules to the side causes the spines to expand (the right is a schema).
  • Alzheimer's disease it is known that the number of spines is decreasing, but this is determined by shape. It has been found that the same can be detected by a biochemical method for measuring a target protein of electrophoresis ⁇ western blotting.
  • the lentiviral vector-microtubule binding protein 1B gene was injected into the hippocampus only on the right side of the model mouse used this time, and the left and right hippocampus were taken out and electrophoresed (SDS-PAGE) one week later.
  • vectors for gene therapy include viral vectors (gene transfer methods utilizing the mechanism by which viruses infect cells), non-proliferative viral vectors, retro, adeno, wrench, adeno-associated virus (AAV), Sendai virus, etc., proliferative virus vector, oncolytic virus, etc., non-viral vector, plasmid (Naked DNA (naked DNA), complex with liposome or polymer), bacterial vector (genetic modification) But are not limited to these.
  • the viral vector used in the present invention may be a retro, adeno, wrench, adeno-associated virus (AAV), Sendai virus, or the like, and the non-viral vector may be a plasmid, a bacterial vector, or the like. Further, instead of a conventional so-called vector, a blood-brain barrier (BBB) passing nanomachine may be used.
  • the vector is not particularly limited as long as the gene can be expressed in brain nerve cells, and can achieve this purpose.
  • the present invention has the effect of dramatically improving Alzheimer's disease dementia as a causal therapy rather than a symptomatic therapy.
  • a vector In the case of using a vector, it must be injected into the brain by a small operation.
  • a blood-brain barrier-passing nanomachine it can act in the brain only by injection into a blood vessel.
  • Example 1 A method of improving dementia of Alzheimer's disease by puncturing the skull of an Alzheimer's disease model mouse with a lentiviral vector linked to the mouse microtubule-binding protein 1B gene and stereotaxically injecting it into the right hippocampus
  • the mouse microtubule binding protein 1B gene was cloned as follows. BL6 mouse brain total RNA was prepared using RNeasy Mini Kit (Quiagen). Next, total RNA was reverse transcribed by SuperScript III (Invitrogen) using poly T primer. A cDNA library was prepared by a conventional method and screened using the Map1b gene fragment as a probe, so that the Map1b gene was cloned and the nucleotide sequence was confirmed.
  • the mouse microtubule-associated protein 1B gene (protein coding region of Map1b gene) was ligated to a lentiviral vector using Lenti-X TM 293T Cell Line and Lenti-X HTX Packaging System (Clontech.
  • This chimeric gene solution 1 Microliter, model mouse B6SJLTg (APPSwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V) 6799Vas / Mmjax (The Jackson Laboratory, purchased from https://www.mmrrc.org/about/mmrrcContacts.php), 034840-JAX-HEMI-F -Hemizygous female, (Oakley, et al. J Neurosci. 2006 26: 10129-40) 2 mm to the right of the coronal sagittal cross, 2 mm to the back, and 1 mm from the brain surface. Injected.
  • the skull of the double transgenic mouse of the amyloid precursor protein gene and presenilin gene was punctured using the mouse skull fixation and microinjection system (Narishige, Tokyo, Japan), and the right hippocampus was stereotactically (2 mm to the right of the bregma, 2 mm to the back, 1 mm from the brain surface).
  • the change in the degree of dementia in Alzheimer's disease model mice measured by the Y maze test at this time is shown.
  • the microtubule binding protein 1B gene with the viral vector into the hippocampus the microtubule binding protein 1B was overexpressed in the hippocampal neurons. In two days, it was confirmed that the degree of dementia in the injection group was clearly improved (FIG. 3).
  • Example 2 Confirmation by Western Blotting Alzheimer's disease is known to have a reduced number of spines, but this is determined by shape. It has been found that the same can be detected by a biochemical method for measuring a target protein of electrophoresis ⁇ western blotting.
  • Transformed model mouse B6SJLTg (APPSwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V) 6799Vas / Mmjax used in this study was injected with the lentiviral vector-microtubule-binding protein 1B gene in the right hippocampus. (SDS-PAGE).
  • the hippocampus was homogenized in 1 ml Eppendorf in 2 volumes of 4x Remli sample buffer (Laemmli sample buffer, Bio-Rad, Tokyo) containing protease inhibitors, 10-20 ⁇ L of which was 12% miniprotean TGX gel ( Bio-Rad).
  • Primary antibody HOMER1 rabbit polyclonal antibody, 1: 500, Proteintec Group Inc., Rosemont, IL, USA
  • PVDF membrane polyvinylidene difluoride membrane
  • the reaction was performed with anti-tublin (1: 10000, DM1A, Sigma, St. Lois, MO).
  • the PVDF membrane was then incubated with a secondary antibody (Amersham) conjugated with horseradish peroxidase and the signal was detected with Image TM Quantum 400 (GE Healthcare, Buckinghamshire, England). A quantitative band pattern was obtained by ImageJ (NIH). The results showed that as shown in the upper left A, Right became thicker and the decreased protein in the spines of the microtubule-binding protein 1B gene injection group was recovered (FIG. 6).
  • the mouse microtubule-binding protein 1B gene is bound to the blood-brain barrier (BBB, ⁇ ⁇ blood-brain barrier) nanomachine. Describe the creation method.
  • Micellarized nanoparticles are a combination of a hydrophilic polymer composed of polyethylene glycol (PEG), which is easily soluble in water, and a hydrophobic polymer composed of a polyamino acid, which is hardly soluble in water, at the molecular level. It is composed of a block copolymer (copolymer). When the block copolymer is diffused in water, it forms micelles, which are 20-100 nanometer-sized spherical aggregates with a distinct bilayer structure, with a hydrophilic polymer on the outside and a hydrophobic polymer on the inside. Drugs and physiologically active substances can be encapsulated in the hydrophobic inner core of the micelle.
  • PEG polyethylene glycol
  • hydrophobic polymer composed of a polyamino acid, which is hardly soluble in water, at the molecular level. It is composed of a block copolymer (copolymer).
  • the block copolymer When the block copolymer is diffuse
  • the blood-brain barrier which is mainly composed of cerebral vascular endothelial cells, and functions to control the transport of substances in the circulating blood and cranial nervous system. It is a tissue that can be said to be a biological barrier that significantly restricts the delivery of drugs to the brain, while selectively taking in the nutrients essential for these activities. While it selectively incorporates glucose, which is essential for brain activity, it significantly restricts drug delivery.
  • microtubule binding protein 1B gene of the present invention with a blood-brain barrier (BBB) -passing nanomachine, or the binding of a vector to the microtubule binding protein 1B gene is a treatment for human Alzheimer's disease. Therefore, it can be used in the medical industry.
  • BBB blood-brain barrier
  • Microtubule-associated protein 1B gene (ORF.
  • microtubule-related protein 1B gene has the same meaning

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Abstract

解決しようとする課題は、対症療法ではなく、原因療法となりうる、実際に効果のあるアルツハイマー病の認知症の治療法とその治療物質である。 解決手段　微小管結合タンパク質１B遺伝子を脳内の神経細胞で過剰発現させ、アルツハイマー病の認知症などの症状を改善させる物質。 また、これを達成する方法として、微小管結合タンパク質１B遺伝子に遺伝子治療用ベクターを結合させたものを脳内に注入する方法と、微小管結合タンパク質１B遺伝子 をBBB（血液脳関門）通過型ナノマシンに結合させて血管内投与する大きく分けて2つの方法がある。

Description

アルツハイマー病治療薬
　本発明は、アルツハイマー病の認知症の治療薬に関するものである。より詳しくは、脳の神経細胞に、遺伝子を導入、発現させるものであり、遺伝子治療に関する。
　現状では、アルツハイマー病の原因がアミロイドの脳内蓄積によるということは解っているが、そのアミロイドにより脳の神経細胞がどのようにしてダメージをうけるかが諸説あり決定していない。そのため、原因療法はアミロイド抗体（非特許文献１）などアミロイドを標的としたものにほとんど限られるだけだが、うまくいっていない。そのため、対症療法が主に行われている。
　ドネペジルという薬剤により、脳内のアセチルコリンという神経伝達物質を増やすことができる（特許文献１、非特許文献２）。しかしながら記憶をつかさどるシナプスの神経伝達物質はグルタミン酸なので、アセチルコリンは対症療法に過ぎず、アルツハイマー病の初期から中期の症状が進行するのを僅かに抑制できるのみであり、その効果は限定的である。
　すなわち、これらの、従来の対症療法では、認知症に対する効果が非常にわずかで、臨床的にほとんど効果が見られないものがほとんどであり、アルツハイマー病の認知症を有効に治療できる薬剤、方法は存在しないと言っても過言ではない。
　この問題の解決方法として、原因療法と考えられるアミロイド抗体による治療法があるが、効果が少なく、脳浮腫などの副作用が強いという欠点があり、その問題の解消が求められていた。
特許０００５５６２３３７号公報
Biosci Biotechnol Biochem. ;78(8):1293-305 (2014) J Alzheimers Dis. 2018 Apr 28. doi: 10.3233/JAD-180159
　解決しようとする課題は、対症療法ではなく、原因療法となりうる、実際に効果のあるアルツハイマー病の認知症の治療法とその治療物質を提供する。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ｉ）微小管結合タンパク質１Ｂ（ＭＢＰ１Ｂ）をコードするＤＮＡ
ｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡと７０％以上の相同性を有し、同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
ｉｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
ｉｖ）ＭＢＰ１Ｂタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有し、該ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
のいずれかを含む、認知症治療薬。
　本発明においては、微小管結合タンパク質１Ｂ遺伝子またはそれと相同で同一又は類似の機能を有する遺伝子を脳内の神経細胞で過剰発現させ、アルツハイマー病の認知症などの症状を改善させる方法と物質を提供する。また、コードする遺伝子とは、オープンリーディングフレーム（ORF）または、コーディング領域（coding region）（好ましくは全長）を意味し、プロモーターに機能するように連結して細胞に導入した場合に、機能するタンパク質が発現するDNAをいう。なお、プロモーターには、必要に応じて、internal ribosomal entry site (IRES)やエンハンサー、インシュレーター等が含まれていてもよい。本発明においては原則として、（ｃDNAの）ORF全長を導入するが、タンパク質として同等の機能を有する限り、DNAの置換、付加、欠失等を含んでいてもよい。DNAの置換、付加、欠失等は、同等の機能を有する限り制限はないが、全塩基数の３０％以下、より好ましくは、２０％以下、さらに好ましくは、１０％以下、特に好ましくは、１～数個である。
（２）機能するように、ベクターに連結された、（１）の認知症治療薬。
　（１）を達成する方法として、微小管結合タンパク質１Ｂ遺伝子に遺伝子治療用ベクターを結合させたものを脳内に直接注入する方法と、微小管結合タンパク質１Ｂ遺伝子 をBBB（血液脳関門）通過型ナノマシンに結合させて血管内投与する大きく分けて2つの方法があるが、ここではベクターに連結されたものを提供する。
（３）血液脳関門（BBB, blood-brain barrier）通過型ナノマシンに結合されることを特徴とする、（１）の認知症治療薬。
　血液脳関門（BBB, blood-brain barrier）通過型ナノマシンに微小管結合タンパク質１B遺伝子を結合させて、血管内に投与する方法と物質。血液脳関門は、脳血管内皮細胞を主体として、循環血液と脳神経実質の物質輸送を制御するもので、脳の活動に必須な栄養素を取り込む反面、薬剤の脳への送達を著しく制限している。片岡一則らは、血糖値の変化という簡単な刺激に応答して、既存技術と比較して著しく高い効率で血液脳関門を通過し、さらに脳内の神経細胞へと集積する血液脳関門通過型ナノマシンの開発に成功した。この血液脳関門通過型ナノマシンに微小管結合タンパク質１B遺伝子を結合させ、血管内に投与すれば、脳の手術の必要なく、血管内に投与するだけで脳内の神経細胞に微小管結合タンパク質１B遺伝子を発現させることが可能になる。
（４）微小管結合タンパク質１Bを脳細胞内で発現させることにより、認知症を治療する方法。
（５）微小管結合タンパク質１B遺伝子の認知症治療薬を製造するための使用。
（６）認知症治療に使用する、微小管結合タンパク質１B遺伝子。
（７）（１）～（３）のいずれか１に記載の認知症治療薬を投与することにより、認知症を治療する方法。
（８）以下のいずれかのDNAを導入し発現させることにより、認知症を治療する方法：
ｉ）微小管結合タンパク質１Ｂ（ＭＢＰ１Ｂ）をコードするＤＮＡ
ｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡと７０％以上の相同性を有し、同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
ｉｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
または、
ｉｖ）ＭＢＰ１Ｂタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有し、該ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。導入する部位は、脳内が好ましいが、血液脳関門を通過できる場合は、腕等に注射して血液中に導入し、脳に移動して発現させるようにしてもよい。
（９）認知症治療薬を製造するための
ｉ）微小管結合タンパク質１Ｂ（ＭＢＰ１Ｂ）をコードするＤＮＡ
ｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡと７０％以上の相同性を有し、同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
ｉｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
または
ｉｖ）ＭＢＰ１Ｂタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有し、該ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
のいずれかの使用。
（１０）認知症を治療するための、
ｉ）微小管結合タンパク質１Ｂ（ＭＢＰ１Ｂ）をコードするＤＮＡ
ｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡと７０％以上の相同性を有し、同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
ｉｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
または
ｉｖ）ＭＢＰ１Ｂタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有し、該ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
のいずれかのDNA。
（１１）前記DNAがさらにベクターに連結されている、（１０）のDNA。
（１２）さらに、血液脳関門（BBB, blood-brain barrier）通過型ナノマシンに結合されることを特徴とする、（１０）のDNA。
　本発明では、アルツハイマー病の認知症を、改善できるという効果を有する。
図１は本発明の全体像を示した概略図である。（実施例１） 図２は本発明の遺伝子導入物質の製造方法の概念図である。（実施例１） 図３は、微小管結合タンパク質１B遺伝子を導入した場合の効果を示すグラフである。 図４は、培養細胞に微小管結合タンパク質１Bを発現させた場合に樹状突起棘が拡大することを示した写真である。 図５は、培養細胞において、微小管結合タンパク質１Bを導入、発現させて大きくなった棘を微小管染色した写真および図である。 図６は、脳に微小管結合タンパク質１B遺伝子を注入した場合、モデルマウスの右の海馬に注入したが、注入後1週間後にモデルマウス脳の海馬を取り出して、右の海馬と左の海馬の棘を代表するタンパク質の抗体でウェスタンブロットした写真および、その程度をグラフ化したものである（実施例２）。
　本明細書において、認知症とは、認知障害の一種であり、後天的な脳の器質的障害により、いったん正常に発達した知能が不可逆的に低下した状態をいう。認知症は犬や猫などヒト以外でも発症する。狭義では「知能が後天的に低下した状態」の事を指すが、本明細書では「知能」の他に「記憶」「見当識」を含む認知障害や「人格変化」などを伴った症候群を意味する。
　本明細書において、認知症とは、アルツハイマー型認知症、前頭側頭認知症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ハンチントン病、クロイツフェルドヤコブ病、認知症を伴った筋萎縮性側索硬化症、プリオン病などの疾病において症状として認められることが多いが、これらの疾病に限られない。最近の研究では、アルツハイマー病以外のこれらの認知症を示す疾病でも、棘および／またはシナプスのロスやアミロイドの沈着がみられることが多いという報告が多い。つまり、認知症を示す疾患には共通な点が多くみられ、本明細書で主に述べるアルツハイマー病の認知症に対する治療法と治療物質が、アルツハイマー病の認知症以外の認知症にも有効である可能性がある。
　本明細書において、アルツハイマー病とは、一般に高齢で発症し、病理学的に脳内へのアミロイドの沈着を病理学的特徴とする、記憶障害を主症状とする疾患である。
　本発明において、微小管とは、神経細胞のなかの軸索や樹状突起や棘に見られる、繊維状の細胞内器官であり、これにより軸索や樹状突起や棘などの細胞突起を形成したり、これに沿って物質を移送したりするものを意味する。
　微小管結合タンパク質（microtubule-associated protein：ＭＢＰ１Ｂ、微小管関連タンパク質も同じ意味である）とは、繊維状の微小管の表面に付着して存在し、微小管の安定化、伸長を促すタンパク質である。微小管結合タンパク質として、微小管結合タンパク質１A/１B, 微小管結合タンパク質２、タウの４種類が知られている。本明細書では、特に断らない限り、ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長を含むＤＮＡを意味し、ＯＲＦそのものであってもよく、ＯＲＦの前後にリンカー等を有していてもよい。
　本発明において、遺伝子の過剰発現とは、目的の遺伝子を大量に試験管内で製造し、そのタンパク質をコードする領域に、目的の組織、器官等でその発現の程度を強くするプロモーターを機能するように連結し、またベクターなどの細胞内への導入を容易にする運搬体を結合した発現カセットを作成し、該発現カセットを目的の細胞内に挿入し（遺伝子導入）、既存細胞のタンパク質合成の仕組みを借りて、該細胞内で最終的に該当タンパク質を過剰に作らせることである。本発明においては、過剰発現には、血中に発現カセットを導入し、血液―脳関門を通過して、脳神経細胞内で過剰発現させることも含まれる。
　本明細書において、ベクターとは、遺伝子を細胞内で発現させることが目的で、遺伝子に結合させ、遺伝子を細胞内にいれる運搬体である。
　本明細書においてプラスミドとは、大腸菌などの細菌で染色体DNAとは独立して複製する環状の2本鎖DNAを言う。 この性質を利用して目的遺伝子を組み込んだものが、種々の細胞で遺伝子発現を起こさせるために利用される（プラスミドベクターともいう）。
　本発明で、認知症（dementiaの訳であるが、患者を侮辱する言葉だということで、厚生労働省が認知症に統一した）の治療に用いるＤＮＡとしては、ｉ）微小管結合タンパク質１Ｂ（ＭＢＰ１Ｂ）をコードするＤＮＡ、ｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡと７０％以上の相同性を有し、ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、ｉｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、ｉｖ）ＭＢＰ１Ｂタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有し、該ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、があげられる。これらのＤＮＡのいずれかを脳神経細胞中に導入し、ＭＢＰ１Ｂタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質を脳神経細胞中で発現させることにより、認知症を治療することができる。本発明の主な目的は、認知症の治療薬の提供であるが、本発明の原理から認知症の予防にも効果を発揮する場合もあり得ると考えられる。
　ここで、導入、発現させるDNAは、ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡと７０％以上の相同性を有し、ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有することが好ましいが、より好ましくは、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有していてもよい。
　また、ストリンジェントな条件とは、例えば、サザンハイブリダイゼーションの後、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。
　本発明に使用できるＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等な機能を有するタンパク質のＭＢＰ１Ｂタンパク質のアミノ酸配列との同一性については、６０％以上が好ましく、より好ましくは、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい。
　これらのＭＡＰ１ＢをコードするＤＮＡと相同なＤＮＡから産生されるタンパク質がＭＡＰ１Ｂと同等の機能を有するかどうかは、脳神経細胞に導入して、Ｙ迷路テスト（Neuroscience. 2006 Dec 1;143(2):395-405. Epub 2006 Sep 14. PMID:16973297）を行うことにより確認することができる。
　本明細書において、血液脳関門とは、脳血管内皮細胞を主体として、循環血液と脳神経系の物質輸送を制御する機能を担っており、脳の活動に必須な栄養素を選択的に取り込む反面、薬剤の脳への送達を著しく制限する生体バリアともいえる組織をいう。
　本明細書において、プロモーターとは、遺伝子からｍRNAを転写させる働きを有する配列を言う。目的に応じてDNAであってもRNAであってもよいが、通常はDNAが用いられる。プロモーターにはエンハンサー、サイレンサー等のシスエレメントを有する場合もあるが、本明細書では特に区別せず、エンハンサーなどを有するプロモーターもプロモーターと呼ぶ。また、コアプロモーターの上流や下流にシスエレメントを結合させたプロモーターも使用できる。
　本発明においては、脳神経細胞内(好ましくは海馬神経細胞内)で微小管結合タンパク質１Bを発現させることに特徴がある。脳神経細胞内で遺伝子を発現できるプロモーターとしては、例えば、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、EF1αプロモーター等が挙げられるがこれらに限られず、脳神経細胞内で外来遺伝子を発現できるプロモーター、エンハンサーの組み合わせであればよい。
　本発明の典型的な実施形態を示す。
　微小管結合タンパク質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）をコードする領域を含むＭａｐ１ｂ遺伝子は、公知の方法でクローニングできる。例えば、Ｍａｐ１ｂ遺伝子を発現する組織（例えば海馬を含む脳組織など）からｐｏｌｙＡ鎖を有するｍＲＮＡを調製し、好ましくはリンカー付きのポリＴ配列（ポリＴは１８～３０程度が好ましい）をアニールさせて逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡを用いて、適当なプライマー、例えば、ＭＡＰ１Ｂタンパク質をコードする領域の開始コドンを含む領域の２０～３０塩基程度の配列のＤＮＡを５’－側プライマーに用いて、前記リンカー付きポリＴ配列を３’－側プライマーとしてＰＣＲによりＭＡＰ１Ｂタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲの条件は、プライマーの長さ、性質により当業者の周知の方法で決定できる。用いる増幅酵素（ポリメラーゼ）は正確性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）の高い（エラーの少ない）酵素を用いることが好ましい。正確性の高い増幅酵素としては、ｐｆｕ，ＫＯＤポリメラーゼ等が挙げられるがこれらに限られない。必要に応じてＰＣＲ産物のＤＮＡをプラスミドにクローン化して塩基配列を決定することにより、増幅による変異がないか確認することができる。
　あるいは、Ｍａｐ１ｂ遺伝子の全長または一部の増幅ＤＮＡ断片またはクローン化したＭａｐ１ｂ遺伝子ＤＮＡ断片などをプローブとして用いて、ｃＤＮＡライブラリまたはジェノミックライブラリをプラークハイブリダイゼーション等によりスクリーニングすることにより、Ｍａｐ１ｂ遺伝子をクローニングすることができる。この際、ストリンジェンシーを下げてスクリーニングすることで、Ｍａｐ１ｂ遺伝子と相同性を有する遺伝子を見出し、クローニングすることができる。
　ＰＣＲ法またはライブラリーからスクリーニングして得たＭａｐ１ｂ遺伝子の開始コドンから終始コドン又はその下流までを適当なプライマーを設計してＰＣＲすることで、リンカーを挿入できる。好ましくは、ｃＤＮＡ合成時にリンカー付きのプライマーを用い、次の相補鎖合成後にリンカーを付けるか、またはＰＣＲ時にもリンカー付きの５’－側プライマーを用いることで２度手間を避けることができる。
　これらの操作により得られたＭＡＰ１Ｂタンパク質をコードする領域全長を含むＤＮＡは、機能するようにベクターに連結することができる。例えば、クロンテク社の、Lenti-X Vector（Lenti-XTM HTX Packaging System）などのプロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、EF1αプロモーター等）に機能するように連結させ、細胞や血液中に導入することで、タンパク質を望む細胞中で発現させることができる。
　図３は、微小管結合タンパク１Ｂ遺伝子にレンチウイルスベクターを結合させたものを、Alzheimer病モデルマウスの頭蓋骨に穴を開け、定位的に右の海馬に注射した時の、Y迷路テストで測ったAlzheimerモデルマウスの痴呆の程度の変化である。ウイルスベクターを結合することにより、海馬内神経細胞での微小管結合タンパク質１B遺伝子の発現の程度が向上した。注射後二日目で、注射群の痴呆の程度が明らかに改善した（図３）。
　アルツハイマー病は、脳内にアミロイドが蓄積して、これが神経細胞に悪影響をして起こると考えられているが、その仕組みは解明されていない。アミロイドは微小管結合タンパク質１Ｂタンパクに結合するので、それにより微小管結合タンパク質１Ｂタンパクが不活化され、シナプスの後部を形成する棘内の微小管が脱重合（溶ける）して棘が短縮する結果シナプスの機能が落ちると考えられる。局注後1週で、だんだん効果が薄れているが、これは、結果を早く出すために、アミロイドを産生する遺伝子内に5つも遺伝子変異のあるモデルマウスを使ったためと考えられる（Oakley, H. et.al. J. Neurosci. 40, p10129-10140 (2009)）。変異が多いほど症状が早く現れる。人間のアルツハイマー病では2割が１つの遺伝子変異で、あとは遺伝子変異がない。微小管結合タンパク質１Ｂの効果を、非常に速いアミロイドの沈着が打ち消してしまうものと考えられる。
　海馬由来の初代（プライマリー）培養神経細胞（培養後約２週間経ってシナプスが形成されたもの）に、レンチウイルスベクターに結合した微小管結合タンパク質１Ｂ遺伝子をリン酸カルシウム法により導入し過剰発現させた。レンチウイルスベクターに結合したＭＡＰ１Ｂ遺伝子を加えると、加えないもの（図４のDE）より10倍ほどにシナプスの後部を形成する樹状突起棘が拡大した（図４のAB）。D, Eは、正常の樹状突起で、微小管結合タンパク質１Ｂを使用していない。GFP（グリーンフルオレセインプロテイン）だけを導入しており、神経細胞全体が緑に染まっていて、ここでは細い樹状突起が染まっていた。小さな膨らみが正常な棘で、ここに、他からの神経細胞が入力し、シナプスを形成する。A,Bは、GFPに加えて、微小管結合タンパク質１Bにレンチウイルスベクターを結合させたもの＋GFPを導入した。樹状突起の突起が巨大化した。Cでは、棘を代表するタンパク質の遺伝子PSD95に、黄色に光る色素の遺伝子YFP95を結合した遺伝子を導入した。大きくなった樹状突起上の突起の中に棘であることを示す遺伝子のスポットが出てきて、この大きくなった突起が棘であると分かる（図４のC, 矢印）。
　上記の海馬由来培養神経細胞でレンチウイルスベクターに結合した微小管結合タンパク質１B遺伝子により大きくなった棘を、同時に微小管染色した。左で樹状突起の一部が大きくなっていることが分かる（図５）。赤が微小管染色であるが、棘として拡大していない部分の樹状突起の軸では、微小管が濃く染まっている（赤、矢頭）。棘として拡大している部分では、軸の微小管が薄くなっていた。これから、棘として拡大している部分では、軸の微小管が側方に伸びてこの側方への微小管の圧力が棘の拡大をおこしていると推察される（右はシェ－マ）。
　アルツハイマー病では、棘の数が減少していることが解っているが、これは、形で判定している。同じようなことが、電気泳動→ウェスタンブロッティングという標的タンパク質を測定する生化学的な方法でも検出されることが解った。今回使用したモデルマウスの右だけの海馬にレンチウイルスベクター―微小管結合タンパク質１B遺伝子を注入し、1週後に左右の海馬を取り出し電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）した。常法により、PVDF膜等に転写後、棘、つまりシナプス後部にあるタンパク質を認識する抗体で反応させると、左Aの上のように、Rightの方が太くなり、微小管結合タンパク質１B遺伝子注入群の、棘にある減少していたタンパク質が回復していることを示した（図６）。図６Bは、Aをデンシトメーターにより定量化したものであるが、N＝４で、５％有意でRightの方が多いことがわかる。
　遺伝子治療用ベクターの種類としては、ウイルスベクター（ウイルスが細胞に感染する機構を利用した遺伝子導入法）の中に、非増殖性ウイルスベクターとして、レトロ、アデノ、レンチ、アデノ随伴ウイルス（AAV)、センダイウイルス等があり、増殖性ウイルスベクターとして、腫瘍溶解性ウイルス等 があり、 非ウイルスベクターとして、プラスミド（Naked DNA（裸のDNA）、リポソームやポリマーとの複合体）や、バクテリアベクター（遺伝子改変した細菌）などがあげられるがこれらに限られない。
　本発明に使用するウイルスベクターとしては、レトロ、アデノ、レンチ、アデノ随伴ウイルス（AAV)、センダイウイルス等であってもよく、非ウイルスベクターとしては、プラスミド、バクテリアベクター等でもよい。また、従来のいわゆるベクターの代わりに、血液脳関門（BBB, blood-brain barrier）通過型ナノマシンを用いても良い。要は、ベクターは、遺伝子を脳神経細胞中で発現できるものであればよく、この目的を達成できれば特に制限されない。
　本発明によれば、アルツハイマー病の認知症を、対症療法ではなく、原因療法として、劇的に改善するという効果を有する。ベクターを用いる場合では、小さな手術で脳内に注入しなければならないが、血液脳関門通過型ナノマシンを用いる場合には、血管内への注射だけで、脳内に作用させることができる。
（実施例１）
　マウス微小管結合タンパク質１B遺伝子にレンチウイルスベクターを結合させたものを、アルツハイマー病モデルマウスの頭蓋骨に穴を開け、定位的に右の海馬に注入し、アルツハイマー病の認知症を改善させる方法
　マウス微小管結合タンパク質１B遺伝子は、以下のようにしてクローニングした。BL6マウスの脳の全RNAを、RNeasy Mini Kit (Quiagen)を用いて調製した。次に、全RNAは、ポリTプライマーを用い、SuperScript III（Invitrogen）により逆転写された。常法によりｃDNAライブラリーを作成し、Map1b遺伝子断片をプローブとしてスクリーニングすることで、Map1b遺伝子をクローニングし、塩基配列を確認した。マウス微小管結合タンパク質１B遺伝子（Map1b遺伝子のタンパク質コーディング領域）は、Lenti-XTM 293T Cell Line と Lenti-X HTX Packaging System (クロンテクを用いて、レンチウイルスベクターと結合させた。このキメラ遺伝子溶液1マイクロリッターを、モデルマウス　B6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax（The Jackson Laboratory、https://www.mmrrc.org/about/mmrrcContacts.phpより購入）、034840-JAX-HEMI-F - Hemizygous female、（Oakley, et al.　J Neurosci. 2006 26:10129-40）の冠状矢状縫合交差より右に２ｍｍ、後ろへ２ｍｍ、脳表から１ｍｍのところへ頭蓋固定定位脳内局所注入装置にて注入した。
　アミロイド前駆体タンパク質遺伝子、プレセニリン遺伝子（トータル5変異）の2重トランスジェニックマウスの頭蓋骨に、マウス頭蓋固定、マイクロインジェクションシステム（ナリシゲ、東京、日本）を用いて穴を開け、定位的に右の海馬に注射した（ブレグマより右へ２ｍｍ、後ろへ2ｍｍ、脳表より１ｍｍ）。この時の、Y迷路テストで測ったAlzheimer病モデルマウスの痴呆の程度の変化を示す。ウイルスベクターが付いたマウス微小管結合タンパク質１B遺伝子を海馬内に注入することにより、海馬内神経細胞で、微小管結合タンパク質１Bが過発現した。二日で、注射群の痴呆の程度が明らかに改善したことを確認できた（図３）。
（実施例２）
ウェスタンブロッティングによる確認
　アルツハイマー病では、棘の数が減少していることが解っているが、これは、形で判定している。同じようなことが、電気泳動→ウエスタンブロッティングという標的タンパク質を測定する生化学的な方法でも検出されることが解った。今回使用した形質転換モデルマウスB6SJLTg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjaxの右だけの海馬にレンチウイルスベクター―微小管結合タンパク質１B遺伝子を注入し、1週後に左右の海馬を取り出し電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）した。
　すなわち、海馬は、１ｍｌエッペンドルフ中で、プロテアーゼインヒビターを含む２倍容量の４倍レムリサンプルバッファー（Laemmli sample buffer, Bio-Rad、東京）中でホモジェナイズされ、その１０～２０μLが１２％ミニプロテアンTGXゲル（Bio-Rad）で電気泳動された。ポリビニリデン・ジフルオライド膜（PVDF膜）に転写後、棘、つまりシナプス後部にあるタンパク質を認識する1次抗体（HOMER1ウサギポリクローナル抗体、1:500, Proteintec Group Inc., Rosemont, IL, USA）及び内部コントロールとしてanti-tublin（1:10000, DM1A, Sigma, St. Lois, MO）で反応させた。その後、PVDF膜は、西洋ワサビペルオキシダーゼを連結した２次抗体（アマシャム）とインキュベートし、シグナルは、Image Quant 400（GEヘルスケア、Buckinghamshire, 英国）により検出した。定量的バンドパターンはImageJ（NIH）により得た。結果は、左Aの上のように、Rightの方が太くなり、微小管結合タンパク質１B遺伝子注入群の、棘にある減少していたタンパク質が回復していることを示した（図６）。
　マウス微小管結合タンパク質１B遺伝子にレンチウイルスベクターを結合させたものの製造方法はすでに述べたので、マウス微小管結合タンパク質１B遺伝子に血液脳関門（BBB, blood-brain barrier）通過型ナノマシンを結合したものの作成方法を述べる。
　ミセル化ナノ粒子(高分子ミセル）は、水に溶けやすい性質を示すポリエチレングリコール（PEG）からなる親水性ポリマーと水に溶けにくい性質を示すポリアミノ酸からなる疎水性ポリマーを分子レベルで結合させたブロックコポリマー（共重合体）から構成される。ブロックコポリマーを水中で拡散すると、外側が親水性ポリマーで内側が疎水性ポリマーという明確な二層構造を有する20～100ナノメートルサイズの球状の集合体であるミセルを形成する。このミセルの疎水性内核部分に薬物や生理活性物質を封入することができる。アミノ酸の種類や構造を化学的に変化させることで様々な化合物に対応が可能である。表面をPEG（ポリエチレングルコール）が覆うことで血液中での安定性を確保できる。脳には、血液脳関門という特殊な血液と脳組織とを隔てる組織があり、それは、脳血管内皮細胞を主体として、循環血液と脳神経系の物質輸送を制御する機能をになっており、脳の活動に必須な栄養素を選択的に取り込む反面、薬剤の脳への送達を著しく制限する生体バリアともいえる組織である。脳の活動に必須なブドウ糖などを選択的に取り込む反面、薬剤の送達を著しく制限している。このような背景において、片岡一則らは、血糖値の変化で著しく高い効率で脳血液関門を通過しさらに脳内の神経細胞へと集積する脳血液関門通過型ナノマシン)を開発した（Nature Communications 8、 Article number 1001, 2017）.
　疎水性ブロックの端にグルコース分子を付けることで、空腹時にナノマシンを注射しその後に食事をするという簡単な方法で、脳内に薬を効率よく運ぶことができる。かかるナノマシンに微小管結合タンパク質１B遺伝子を発現するように結合させて、静脈注射し、その後血糖値を上げることにより血液脳関門を通過させ、脳神経細胞内で、微小管結合タンパク質１Bを発現させることにより、認知症を予防ないし治療できる。
　本発明の微小管結合タンパク質１B遺伝子に血液脳関門（BBB, blood-brain barrier）通過型ナノマシンを結合したものや、微小管結合タンパク質１B遺伝子にベクターを結合したものは、人のアルツハイマー病の治療に使用できる可能性が高いことから、医療産業において利用できる。
　１　　ベクター
　２　　ヒト
　３　　BBB通過型ナノマシン
　４　　プロモーター
　５　　微小管結合タンパク質１B遺伝子（ORF。ここでは、微小管関連タンパク１B遺伝子も同じ意味である）

 

Claims (3)

  1. ｉ）微小管結合タンパク質１Ｂ（ＭＢＰ１Ｂ）をコードするＤＮＡ、
    ｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡと７０％以上の相同性を有し、ＭＢＰ１Ｂと同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    ｉｉｉ）ＭＢＰ１ＢをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    ｉｖ）ＭＢＰ１Ｂタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有し、該ＭＢＰ１Ｂタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
    のいずれかを含む、認知症治療薬。
  2. 機能するように、ベクターに連結された、請求項１の認知症治療薬。
  3. 血液脳関門（BBB, blood-brain barrier）通過型ナノマシンに結合されることを特徴とする、請求項１または２の認知症治療薬。

     
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