CN107427666A - 脊髓软膜下基因递送系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种递送装置、系统及其相关方法，可用于人进行细胞、药物或载体的脊髓递送。因此，该系统能够进行软膜下递送，所述软膜下递送导致在白质和灰质两者中的接近完全的脊髓实质AAV9介导基因表达或ASO分布。

Description

脊髓软膜下基因递送系统

相关申请的交叉引用

本申请请求2015年1月30日在美国专利商标局提交的美国临时申请号62/110,340的优先权权益，所述美国临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明大体涉及基因治疗，更具体地涉及一种用于将基因和寡核苷酸递送至哺乳动物的软膜下空间中以实现其脊髓经实质感染的方法和系统。

背景技术

目前用来将载体或反义寡核苷酸(ASO)递送至脊髓实质中的方法涉及两种技术，每种技术相比于本发明而言都具有实质的局限性。

首先，当将载体或ASO注射至脊髓鞘内空间(即，软膜外)时使用鞘内递送。使用这种方法，在AAV9递送之后未见深度实质转基因表达。由于软膜对AAV9的不渗透性，仅A-运动神经元和初级传入神经的亚群受感染。尽管ASO的鞘内递送可导致ASO向脊髓实质中良好渗透，但贯穿整个脊髓(即，从颈至骶段)可见ASO。因而，不可通过鞘内递送实现ASO的节段限制性分布。

其次，可使用直接脊髓实质注射。通过使用这种方法，可在脊髓实质中实现节段特异性的转基因表达或ASO分布。然而，这种技术的主要局限在于其侵入性，因为需要进行直接脊髓实质针穿透。

因此，需要一种软膜下递送系统，其对在白质和灰质中提供近乎完全的脊髓实质AAV9介导基因表达或ASO分布。

发明内容

基于AAV的载体用于实现中枢神经系统中基因特异性沉默或上调的体内有效使用，已受限于使用具有最大临床相关性的递送途径(即，静脉内或鞘内)无能力在成年动物中提供多于有限深度的实质表达。因此，本发明证明脊髓软膜代表了在鞘内AAV9递送之后限制AAV9有效穿透至脊髓实质中的主屏障。因此，本发明提供一种用于将基因和寡核苷酸递送至大型动物和人的脊髓实质中的方法和系统。

因此，在一方面，本发明提供一种在受试者中脊髓经实质感染核酸分子的方法。所述方法包括将核酸分子给药至受试者的软膜下空间的步骤。受试者可为哺乳动物，诸如人。在各种实施例中，给药的步骤包括：暴露受试者的脊椎的脊髓节段；在脊髓节段内创建软膜开口；推进导管穿过软膜开口并进入软膜下空间中；以及将核酸分子递送至受试者的软膜下空间。可通过用L形不锈钢管刺穿软膜来创建软膜开口，并且将导管推进穿过所述管进入软膜下空间中。在各种实施例中，核酸分子以含有约1-10％葡聚糖的混合物给药。在各种实施例中，核酸分子是载体或反义寡核苷酸(ASO)。载体可为慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体，诸如AAV9颗粒。在某些实施例中，载体包括编码调节或治疗诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿(Huntington)氏病、阿尔茨海默(Alzheimer)氏病、帕金森(Parkinson)氏病的神经退行性疾病的蛋白质或功能RNA的核酸分子。

在某些实施例中，核酸分子作为单次注射来递送。在某些实施例中，所述方法进一步包括将一次或多次核酸分子的第二软膜下注射给药至受试者的脊椎的不同脊髓节段中的步骤。在某些实施例中，所述方法进一步包括将一次或多次核酸分子的鞘内注射给药至受试者的步骤。

在另一方面，本发明提供一种基因递送系统。所述系统包括：L形导向管，其经配置以刺穿受试者软膜；导管，其可滑动设置在导向管内并且经配置以被推进至受试者的脊椎的脊髓节段的软膜下空间中；以及贮器，其与导管流体连通，并且含有包括核酸分子的组合物。在各种实施例中，L形导向管可以是16-26G不锈钢管，并且导管可由聚乙烯管形成，诸如PE-5或PE-10。

在另一方面，本发明提供一种将核酸分子递送至受试者的软膜下空间的方法。所述方法包括以下步骤：暴露受试者的脊椎的脊髓节段，在脊髓节段内创建软膜开口，将本文所述的基因递送系统置于脊髓节段上方，将导管推进穿过软膜开口并进入软膜下空间中，并且将核酸分子递送至受试者的软膜下空间。在各种实施例中，以含有约1-10％葡聚糖的混合物递送核酸分子。核酸分子是载体或反义寡核苷酸(ASO)。载体可为慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体，诸如AAV9颗粒。受试者可为哺乳动物，诸如人类。

附图简要说明

图1A-1J是图示软膜下AAV9递送和宏观定义的脊髓表面转基因表达的示意图。图1A图示猪中脊髓、脑脊膜和软膜下放置的PE-10导管的示意图。图1B图示具有尖锐的软膜穿透尖端(插图)的导管导向管(18G)，所述导向管用来穿透软膜并且将PE-10导管推进至软膜下空间中。图1C-1E是图示将导管放入软膜下空间的进展的示意图：首先切开硬脑膜(图1C)，并将导管推进至软膜下空间中(图1D和1E)。可发现注射入软膜下空间的气泡(图1D-星号)。图1F和1G图示表面GFP荧光密度测定法，其在猪和大鼠脊髓中显示强烈信号，其中在腰部软膜下注射的中心处发现最强烈的GFP荧光。在猪胸部脊髓中宏观检测到脊髓实质中强烈RFP荧光的存在(图1H和1J)。还可发现前根中明显高水平的RFP表达(图1H-插图)。在对照未注射脊髓中未能识别到荧光(图1I)。

图2A-2D是图示PE-10导管插入软膜下空间以及贯穿脊髓实质和在自AAV9注射节段远侧突出的轴突中GFP表达的示意图。

图3A-3G是图示在成年猪中单次推注软膜下AAV9-UBI-RFP注射之后有效的实质AAV9介导转基因表达的示意图。图3A和3B图示取自先前用AAV9-UBI-RGF注射六周的猪的胸中段脊髓的水平脊髓切片。在贯穿包括白质和灰质的整个区域可发现强烈的RFP表达。用NeuN抗体(绿色)的染色显示几乎所有神经元也是RFP阳性的。图3C-3G展示取自软膜下注射区域的横向脊髓切片的图片，其显示背索(DF)侧索(LF)和腹索(VF)(嵌入框)中横切的RFP+轴突。还可在GFAP染色的星形细胞中发现RFP表达(插图；RFP/GFAP)。可发现围绕表达RFP的α-运动神经元(图3D和3E)和中间神经元(图3F和3G)的高密度RFP+终结。(比例尺：图3A-3C＝500μm；图3D、3F＝30μm)。

图4A-4C是图示在猪中胸中段软膜下AAV9注射之后腰部脊髓中下行运动轴突中的强效GFP表达的示意图。图4A和4B图示取自先前软膜下AAV9-UBI-GFP注射入胸中段软膜下空间六周之后的腰部脊髓的横向脊髓切片。在侧索(LF)和腹索(VF)的横切轴突中可发现强烈的GFP表达(白色星号)。在背索(DF)中识别到相对较低密度的GFP+轴突。相应地，还可发现突出至位于背角(DH)与腹角(VH)之间的灰质中高密度的GFP+运动轴突。图4C图示显示中央灰质中GFP+轴突和终结的极细树状分支的更高分辨率共焦图像。(比例尺：图4A＝1000μm；图4C＝30μm)，(DH-背角，VH-腹角，DF-背索，LF-侧索，VF-腹索)。

图5A-5L是图示在成年猪中软膜下胸中段AAV9递送之后脑运动中枢中逆行运输介导GFP表达的示意图。图5A-5E图示在胸中段单次AAV9-UBI-GFP注射之后六周时猪的运动皮层中逆行标记的锥体神经元。图5F-5J图示位于脑干中的神经元中相当水平的GFP表达。图5K图示延髓(延髓锥体)中大的逆行标记运动GFP+轴突的存在。图5L图示网状结构中高密度的顺行标记感觉传入神经。(比例尺：图5A-5E和5G-5J＝50μm；图5K和5L＝50μm)。

图6A-6G是图示在成年大鼠中软膜下颈部AAV9递送之后脑运动中枢中逆行运输介导GFP表达的示意图。图6A-6D图示在上颈部单次AAV9-UBI-GFP注射之后八周时大鼠的运动皮层中两侧逆行GFP标记的锥体神经元。图6E-6G图示红核中的两侧神经元GFP表达。(比例尺：图6A、6B、6E和6F＝50μm；图6C和6D＝50μm；图6G＝20μm)。

图7A-7G是图示在大鼠中鞘内AAV9-UBI-GFP递送对比软膜下AAV9-UBI-RFP递送之后差异性区域脊髓转基因表达的示意图。图7A图示AAV9-UBI-GFP的腰部鞘内注射导致GFP优先在背索(DF)、背根(DR)和前根进入区(白色嵌入框2号)中表达。软膜下AAV9-UBI-RFP注射入上颈部脊髓导致明显的下行运动神经束标记。图7B图示在腰部鞘内AAV9-UBI-GFP注射之后背根神经节细胞(L4)中GFP的表达。图7C和7D图示在鞘内AAV9-UBI-GFP注射之后在背根(DR)中和较深背角中的初级传入神经结中发现强烈的GFP表达(白色星号)，但在背角NeuN+神经元中未能识别到表达。图7E图示未能在背索(DF)中发现GFP和RFP的共存(图7A的白色嵌入图，1号)。图7F图示由鞘内AAV9-UBI-GFP注射造成的位于前根进入区中的神经胶质细胞中的GFP表达(图7A的白色嵌入图，2号)。图7G图示可在用AAV9-UBI-GFP注射的动物中发现由GFP+初级Ia传入神经围绕的一些逆行标记表达GFP的α-运动神经元。(比例尺：图7A＝500μm；图7B-7G＝30μm)，(DR-背根，DH-背角，VH-腹角，DF-背索)。

图8是图示在单次软膜下AAV9-UBI-GFP注射之后软膜下AAV9递送和所得贯穿CNS的转基因(GFP)表达的示意图。在成年猪中使用PE-10导管将AAV9-UBI-GFP病毒递送至软膜下空间中。AAV9-UBI-GFP的软膜下递送导致病毒向节段性神经元(即，中间神经元和α-运动神经元)以及横跨经过软膜下注射节段的上行和下行轴突中扩散并因此被摄取。所得转基因表达随后被发现于以下中：i)节段性神经元，ii)背根神经节细胞(逆行性感染)，iii)运动轴突支配性骨骼肌(顺行性感染)，iv)运动皮层中的锥体神经元(逆行性感染)，和v)脊髓丘脑神经元的脑末端(顺行性感染)。

图9A-9F是图示在成年大鼠中单次推注腰部软膜下AAV9-UBI-GFP注射之后有效的实质AAV9介导转基因表达的示意图。图9A-9D图示在L1软膜下AAV9-UBI-GFP注射之后下胸部和上腰部脊髓中神经元和白质束中广泛的GFP表达。在水平切切片中几乎所有神经元(图9A)显示GFP表达。在横切切片中，贯穿薄层I-IX之间的整个灰质可见GFP+神经元(图9B-9D)。可在浅层背角(薄层I-III)中和腹角中发现许多表达GFP的NeuN染色的神经元。图9E和9F图示在上颈部AAV9-UBI-GFP注射之后腰部脊髓中高密度的GFP+下行运动纤维。图9F图示描绘灰质中可容易辨别的GFP+终结的高密度共焦图像。(比例尺：图9A＝1000μm；图9B-9D＝30μm；图9E＝50μm；图9F＝100μm)，(WM-白质，GM-灰质，DH-背角，VH-腹角，DF-背索)。

具体实施方式

本发明提供一种用于将基因和寡核苷酸递送至大型动物和人的脊髓实质中的方法和系统。

在描述本发明组合物和方法之前，应理解，本发明并不限于所描述的具体组合物、方法和实验条件，因而，此类组合物、方法和条件可以变化。还应理解的是，本文中使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，并不意欲为限制性的，因为本发明的范围将仅在随附权利要求书中限定。

除非上下文另有明确规定，如本说明书和随附权利要求书中所使用的单数形式“一种”，“一个”和“所述”包括复数引用。因此，例如，对“所述方法”的引用包括一种或多种方法，和/或将在阅读本公开内容后对本领域技术人员变得显而易见的本文所述类型的步骤等等。

术语“包含”可与“包括”、“含有”，或“特征为”交换使用，是包括性或开放的语言并且不排除另外未详述的要素或方法步骤。用语“由…组成”排除未在权利要求中规定的任何要素、步骤或成分。用语“主要由…组成”将权利要求的范围限制于所规定的材料或步骤以及不实质上影响所要求发明的基本和新颖特征的材料或步骤。本公开内容涵盖相应于这些用语中每一者的范围的发明组合物和方法的实施例。因此，包括详述要素或步骤的组合物或方法涵盖其中主要由那些要素或步骤组成或者由所述那些要素或步骤组成的组合物或方法的具体实施例。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。虽然可在本发明的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。

如本文中所使用的，术语“软膜”指的是脑脊膜的最内层，围绕脑和脊髓的膜(图1A)。软膜是不渗透液体的薄纤维组织。这允许软膜围住脑脊液。通过含有这种液体，软膜与其他脑脊膜层一起工作来保护和缓冲脑。软脊膜围住脊髓(medulla spinalis或spinalcord)的表面，并且通过与前裂进行连接而附接至脊髓。因此，术语“软膜下”指的是位于软膜下面或在软膜下面发生。

如本文中所使用的，术语“实质”指的是有别于结缔和支持组织的器官的功能组织。因此，术语“脊髓实质”指的是各种已知的脊髓的解剖学组织，包括但不限于灰质、白质、硬膜、蛛网膜、软膜、后索和前索、脊髓小脑后束和脊髓小脑前束等。

本文中所使用的术语“受试者”指的是对其执行主题方法的任何个体或患者。一般而言，受试者是人，但如将由本领域人员所理解的，受试者可以为动物。因此，在受试者的定义内包括其他动物，包括哺乳动物，诸如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)，猫，狗，兔，农场动物，包括奶牛、马、山羊、绵羊、猪等，以及灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、红毛猩猩和大猩猩)。

如本文中所使用的，“治疗”指的是响应于患者/受试者所显现的或患者/受试者可能易感的疾病、病症或生理病状而进行的临床干预。治疗的目的包括但不限于：减轻或预防症状，延缓或停止疾病、病症或病状的进展或恶化，和/或缓解疾病、病症或病状。“治疗”指的是治疗性治疗和预防性或预防措施中的一者或两者。需要治疗的受试者包括已受疾病或病症或非期望生理病状影响的那些受试者，以及其中疾病或病症或非期望生理病状将被预防的那些受试者。

如本文中所使用的，术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的，并且指的是任何核酸，无论由磷酸二酯键或诸如以下的修饰键构成：磷酸三酯，氨基磷酸酯，硅氧烷，碳酸酯，羧甲基酯，乙酰亚胺，氨基甲酸酯，硫醚，桥接氨基磷酸酯，桥接膦酸亚甲酯，硫代磷酸酯，膦酸甲酯，二硫代磷酸酯，桥接硫代磷酸酯或磺内酯键，以及此类键的组合。术语“核酸”和“多核苷酸”还特定地包括由除了五种生物学存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外的碱基构成的核酸。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可交换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”指的是天然存在和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及随后修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、α-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构的化合物，即结合至氢的α碳、羧基、氨基和R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物指的是具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。

在本文中氨基酸可由其俗称的三个字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的单字母符号指代。同样地，核苷酸可由其公认的单字母代码指代。

“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。就具体核酸序列而言，保守修饰变体指的是编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任一给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中由丙氨酸由密码子规定的每个位置处，密码子可改变成对应密码子的任意者而不会改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，这是一种保守修饰的变异。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述核酸的每种可能沉默变异。技术人员将认识到可以修饰核酸中的每种密码子(除了AUG，其通常是蛋氨酸仅有的密码子，和TGG，其通常是色氨酸仅有的密码子)以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异暗含在各个所述序列中。

关于氨基酸序列，技术人员将认识到改变、添加或缺失所编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独取代、缺失或添加是“保守修饰变体”，其中该改变导致氨基酸被化学类似的氨基酸取代。提供功能类似氨基酸的保守性取代表是本领域众所周知的。此类保守修饰变体是以下者的补充并且不排除本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因。

“多核苷酸”是从5'至3'端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可分离自天然来源、体外合成或由天然和合成分子的组合制备。多核苷酸的大小表示为碱基对(缩写“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)。在上下文允许的情况下，后两个术语可描述单链或双链的多核苷酸。当该术语应用于双链分子时，它用来表示总长度并且将理解为等同于术语“碱基对”。本领域技术人员将认识到，双链多核苷酸的两条链可在长度上稍有差异，并且其末端可因酶促裂解而交错；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可能不成对。

术语“基因”在广义上用来指代与生物功能相关联的核酸的任何片段。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需的调控序列。例如，“基因”指的是核酸片段，该核酸片段表达mRNA、功能RNA或特异性蛋白质，包括调控序列。“基因”还包括非表达DNA片段，该非表达DNA片段(例如)形成其他蛋白的识别序列。“基因”可得自各种来源，包括从目标来源克隆或者从已知或预测序列信息合成，并且可包括被设计成具有期望参数的序列。“等位基因”是占据染色体上给定基因座的基因的若干替代形式中的一者。

如本文中所使用的，“载体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导目标基因表达并且可将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。

对于将可用于进行本发明的方法中的多核苷酸引入靶细胞而言，病毒载体可能是特别有用的。病毒载体已被开发用于特别的宿主系统，特别是哺乳动物系统中，并且包括(例如)逆转录病毒载体，其他慢病毒载体、诸如基于人免疫缺陷病毒(HIV)的那些，腺病毒载体(AV)，腺相关病毒载体(AAV)，疱疹病毒载体，牛痘病毒载体，以及类似物(参见Miller和Rosman，BioTechniques 7：980-990，1992；Anderson等人，Nature 392：25-30增刊，1998；Verma和Somia，Nature 389：239-242，1997；Wilson，NewEngl.J.Med.334：1185-1187(1996)，所述文献的每一个以引用的方式并入本文)。在本发明的一方面，利用慢病毒或腺病毒载体。腺病毒是双链DNA病毒，其中DNA的两条链编码基因。基因组编码约三十种蛋白质。在本发明的另一方面，利用腺相关病毒载体。

术语“腺病毒”指的是分离自人的超过40种腺病毒亚型，以及分离自其他哺乳动物和鸟的多种亚型。参见，Strauss，“Adenovirus infections in humans”，在TheAdenoviruses，Ginsberg编，Plenum Press，New York，N.Y.，第451-596页(1984)中。重组腺病毒载体，诸如基于人腺病毒5的那些(如由McGrory WJ等人，Virology 163：614-617，1988所描述的)缺失来自腺病毒基因组的必需早期基因(通常为E1A/E1B)，并且因此不能复制，除非生长于提供反式所缺失基因产物的容许细胞系中。取代缺失的腺病毒基因组序列，可将目标转基因克隆并且在感染有复制缺陷腺病毒的组织/细胞中表达。虽然基于腺病毒的基因转移一般不会导致转基因稳定整合至宿主基因组中(少于0.1％的腺病毒介导转染导致转基因并入宿主DNA)，但腺病毒载体可以高滴度增殖并且转染未复制细胞；以及，虽然转基因未传递至子细胞，但这适合用于基因转移至不活跃分裂的成年心肌细胞。逆转录病毒载体提供稳定的基因转移，并且现在可经由逆转录病毒假型化获得高滴度(Burns等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90：8033-8037，1993)，但目前的逆转录病毒载体一般不能有效转导未复制细胞。

描述腺病毒载体和可用于本发明的方法中的其他病毒载体的另外的参考文献包括以下：Horwitz,M.S.，Adenoviridae and Their Replication，在Fields,B.等人(编)Virology，第2卷，Raven Press New York，第1679-1721页，1990中)；Graham,F.等人，第109-128页，在Methods in MolecularBiology，第7卷：Gene Transfer and ExpressionProtocols，Murray,E.(编)，Humana Press，Clifton，N.J.(1991)中；Miller,N.等人，FASEBJournal 9：190-199，1995；Schreier,H，Pharmaceutica Acta Helvetiae 68：145-159，1994；Schneider和French，Circulation 88：1937-1942，1993；Curiel D.T.等人，HumanGene Therapy 3：147-154，1992；Graham,F.L.等人，WO 95/00655(1995年1月5日)；Falck-Pedersen,E.S.，WO 95/16772(1995年6月22日)；Denefle,P.等人，WO 95/23867(1995年9月8日)；Haddada,H.等人，WO 94/26914(1994年11月24日)；Perricaudet,M.等人，WO 95/02697(1995年1月26日)；Zhang,W.等人，WO 95/25071(1995年10月12日)。各种腺病毒质粒还可购自商业来源，包括(例如)安大略省多伦多的Microbix Biosystems(参见，例如，Microbix Product Information Sheet:Plasmids for Adenovirus VectorConstruction，1996)。

腺相关病毒(AAV)是小型(26nm)复制缺陷无包膜病毒，其依靠诸如腺病毒或疱疹病毒的第二病毒的存在而在细胞中生长。尚未知AAV会引起疾病并且诱发非常轻微的免疫响应。AAV可感染分裂和未分裂细胞，并且可将自身基因组并入宿主细胞的基因组。本发明的多个方面提供了使用基于重组AAV的基因转移来在受试者中将转基因递送至脊髓组织的方法。

描述可用于本发明的方法中的AAV载体的另外的参考文献包括以下者：Carter,B.，HandbookofParvoviruses，第I卷，第169-228页，1990；Berns，Virology，第1743-1764页(Raven Press 1990)；Carter,B.，Curr.Opin.Biotechnol.，3：533-539，1992；Muzyczka,N.，Current Topics in Microbiology andImmunology，158：92-129，1992；Flotte,T.R.等人，Am.J.Respir.CellMol.Biol.7：349-356，1992；Chatterjee等人，Ann.NYAcad.Sci.，770：79-90，1995；Flotte,T.R.等人，WO 95/13365(1995年5月18日)；Trempe,J.P.等人，WO95/13392(1995年5月18日)；Kotin,R.，Human Gene Therapy，5：793-801，1994；Flotte,T.R.等人，Gene Therapy 2：357-362，1995；Allen,J.M.，WO 96/17947(1996年6月13日)；以及Du等人，Gene Therapy 3：254-261，1996。还参见美国专利号8,865,881，其以引用的方式并入本文。

AAV的“有效量”是足以感染受试者中的靶组织的足够数量的细胞的量。AAV的有效量可为足以在受试者中具有治疗益处的量，例如延长受试者的寿命，足以在受试者中改善疾病的一种或多种症状的量，例如神经退行性疾病的症状。有效量可能取决于各种因素，诸如(例如)受试者的物种、年龄、体重、健康，和待靶向的组织，并且可因此在受试者和组织之间有所变化。有效量还可取决于给药方式。例如，在一些情况下，与通过鞘内或大脑内注射靶向CNS组织相比，通过血管内注射靶向CNS组织可能需要不同(例如，更高)的剂量。在一些情况下，给予AAV的多次剂量。有效量还可能取决于所用的特定AAV。例如，靶向CNS组织的剂量可取决于AAV的血清型(例如，衣壳蛋白)。例如，AAV可具有选自由以下组成的组的AAV血清型的衣壳蛋白：AAV1，AAV2，AAV5，AAV6，AAV6.2，AAV7，AAV8，AAV9，rh.10，rh.39，rh.43和CSp3。在某些实施例中，AAV的有效量为每kg 10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴基因组拷贝。在某些实施例中，AAV的有效量为每位受试者10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵基因组拷贝。

取决于所利用的宿主细胞/载体系统，可在表达载体中使用若干合适的转录和翻译元件中的任意者，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子以及类似物(Bitter等人，Meth.Enzymol.153：516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子，诸如噬菌体的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac杂合启动子)以及类似物。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可使用来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子，例如人或小鼠金属硫蛋白启动子，或者来源于哺乳动物病毒的启动子，例如逆转录病毒长末端重复序列，腺病毒后期启动子或牛痘病毒7.5K启动子。还可使用通过重组DNA或合成技术产生的启动子来提供插入GDF受体编码序列的转录。

本文中所使用的“报告基因”或“报告序列”指的是产生优选但不必需以常规测定法容易测量的蛋白质产物的任何序列。合适的报告基因包括但不限于：编码介导抗生素抗性(例如，氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列，编码有色或荧光或发光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白(RFP)、荧光素酶)的序列，以及编码介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)的序列。表位标签包括(例如)一个或多个拷贝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列。“表达标签”包括编码可操作性连接至期望基因序列以便监测目标基因表达的报告基因的序列。

如本文中所使用的，术语“转化”或“转染”可交换使用，并且指代将外源DNA或RNA转移至或引入适当的宿主细胞中的方法。另外，可将编码其他异源蛋白的核酸引入宿主细胞。此类转染细胞包括稳定转染的细胞，其中致使插入的DNA能够在宿主细胞中复制。通常，稳定转染需要外源DNA与可选择标记核酸序列一起转移，诸如(例如)赋予抗生素抗性的核酸序列，所述核酸序列使得能够选择稳定转染子。这种标记核酸序列可连接至外源DNA，或通过与外源DNA一起同时共转染来独立提供。转染细胞还包括能够以有限时段表达RNA或DNA的瞬时表达细胞。转染程序取决于被转染的宿主细胞。它可包括将多核苷酸包装于病毒中以及直接摄取多核苷酸。转化可导致将插入的DNA并入宿主细胞的基因组或者将插入的DNA以质粒形式维持在宿主细胞内。转化/转染的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于：直接注射，诸如显微注射；病毒感染，特别是复制缺陷性腺病毒感染，电穿孔法，脂质转染，和磷酸钙介导的直接摄取。

如本文中所使用的，当核酸序列(例如，编码序列)和调控序列以将核酸序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制下的方式共价连接时，核酸序列和调控序列被述为可操作地连接。如果期望核酸序列翻译成功能蛋白，则在5'调控序列中启动子的诱导导致编码序列转录的情况下和在两个DNA序列之间的连接的性质不(1)导致引入移码突变、(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力或(3)干扰相应RNA转录物翻译成蛋白质的能力的情况下，两个DNA序列被述为可操作地连接。因此，在启动子区能够实现该DNA序列的转录以使得所得转录物可翻译成期望蛋白质或多肽的情况下，启动子区将可操作地连接至核酸序列。类似地，当两个或更多个编码区以一种方式连接而使得它们从常见启动子的转录导致已在框中翻译的两种或更多种蛋白质的表达时，它们可操作地连接。在一些实施例中，可操作地连接的编码序列产生融合蛋白。在一些实施例中，可操作地连接的编码序列产生功能RNA(例如，shRNA、miRNA)。

对于核酸编码的蛋白质而言，可在转基因序列之后和3'AAV ITR序列之前插入多腺苷酸化序列。可用于本发明中的AAV构建体还可含有内含子，所述内含子期望地是位于启动子/增强子序列与转基因之间。一种可能的内含子序列来源于SV-40，并且称为SV-40T内含子序列。可使用的另一种载体元件是内核糖体进入位点(IRES)。使用IRES序列来从单一基因转录物产生一种以上多肽。例如，IRES序列将用来产生含有一种以上多肽链的蛋白质。这些和其他常见载体元件的选择是常规的并且可得到许多此类序列。在一些实施例中，在多蛋白中包括口蹄疫病毒2A序列；这是已表明介导多蛋白裂解的小肽(长度为大约18个氨基酸)(Ryan,M D等人，EMBO，1994；4：928-933；Mattion,N M等人，J Virology，1996年11月；第8124-8127页；Furler,S等人，Gene Therapy，2001；8：864-873；以及Halpin,C等人，ThePlant Journal，1999；4：453-459)。2A序列的裂解活性先前已在包括质粒和基因疗法载体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中得到证明(Ryan,M D等人，EMBO，1994；4：928-933；Mattion,N M等人，J Virology，1996年11月；第8124-8127页；Furler,S等人，GeneTherapy，2001；8：864-873；和Halpin,C等人，The Plant Journal，1999；4：453-459；deFelipe,P等人，Gene Therapy，1999；6：198-208；de Felipe,P等人，Human Gene Therapy，2000；11：1921-1931；以及Klump,H等人，Gene Therapy，2001；8：811-817)。

宿主细胞中基因表达所需调控序列的精确性质可能在物种、组织或细胞类型之间有所变化，但应一般视需要包括分别涉及引发转录和翻译的5'非转录和5'非翻译序列，诸如TATA盒、加帽序列、CAAT序列、增强子元件以及类似物。尤其地，此类5'非转录调控序列将包括启动子区，所述启动子区包括用于可操作地接合的基因的转录控制的启动子序列。调控序列还可根据需要包括增强子序列或上游激活序列。本发明的载体可任选地包括5'前导或信号序列。适当载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断力之内。

诱导型启动子允许对基因表达的调控并且可通过以下来调控：外源供应的化合物，诸如温度的环境因素，或例如急性期的特定生理状态的存在，细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中。诱导型启动子和诱导型系统可购自各种商业来源，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。许多其他系统已被描述并且可容易由本领域技术人员选择。由外源供应启动子调控的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子，地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-3351(1996))，四环素抑制型系统(Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992))，四环素诱导型系统(Gossen等人，Science，268：1766-1769(1995)，还参见Harvey等人，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：512-518(1998))，RU486诱导型系统(Wang等人，Nat.Biotech.，15：239-243(1997)和Wang等人，Gene Ther.，4：432-441(1997))以及雷帕霉素诱导型系统(Magari等人，J.Clin.Invest.，100：2865-2872(1997))。可在此情形下可用的其他类型的诱导型启动子是由以下调控的那些：特定生理状态，例如温度、急性期，细胞的具体分化状态，或仅在复制细胞中。

在一些实施例中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调控序列(例如，启动子、增强子等)是本领域众所周知的。示例性组织特异性调控序列包括但不限于以下的组织特异性启动子：神经元的，诸如神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子(Andersen等人，Cell.Mol.Neurobiol.，13：503-15(1993))，神经丝轻链基因启动子(Piccioli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：5611-5(1991))，和神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等人，Neuron，15：373-84(1995))。在一些实施例中，组织特异性启动子是选自以下的基因的启动子：神经元核(NeuN)，胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)，腺瘤性结肠息肉病(APC)，和离子化钙结合衔接子分子1(Iba-1)。其他适当的组织特异性启动子对技术人员将是显而易见的。在一些实施例中，启动子是小鸡β-肌动蛋白启动子。

在一些方面，本发明提供一种AAV载体，其用于在哺乳动物中预防或治疗一种或多种基因缺陷(例如，遗传性基因缺陷，体细胞基因改变)的方法中，所述基因缺陷诸如(例如)导致受试者中多肽缺乏或多肽过量的基因缺陷，并且特别是用于在受试者中治疗或降低缺乏的严重度或程度的方法中，该受试者显现与细胞和组织中此类多肽的缺乏有关的CNS相关病症。在一些实施例中，所述方法涉及将编码一种或多种治疗性肽、多肽、shRNA、微RNA、反义核苷酸等的AAV载体，在药学上可接受的载体中以在患有或疑似患有CNS相关病症的受试者中足够治疗此种病症的量和时段来给予受试者。“反义抑制”指的是产生能够阻遏由内源基因或转基因表达蛋白质的反义RNA转录物。

因此，AAV载体可包含转基因、编码调节或治疗CNS相关病症的蛋白质或功能RNA的核酸。以下是与CNS相关病症相关联的基因的非限制性列举：神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)，神经生长因子(NGF)，神经胶质源性生长因子(GDNF)，脑源性生长因子(BDNF)，睫状神经营养因子(CNTF)，酪氨酸羟化酶(TH)，GTP环水解酶(GTPCH)，天冬氨酸酰酶(ASPA)，超氧化物歧化酶(SOD1)和氨基酸脱羧酶(AADC)。例如，在治疗帕金森氏病中可用的转基因编码TH，TH是多巴胺合成中的限速酶。还可在治疗帕金森氏病中使用编码GTPCH的转基因，GTPCH生成TH辅因子四氢生物蝶呤。编码促进L-多巴转化至DA的GDNF或BDNF或AADC的转基因也可用于治疗帕金森氏病。对于治疗ALS而言，可用的转基因可编码GDNF、BDNF或CNTF。此外，对于治疗ALS而言，可用的转基因可编码抑制SOD1表达的功能RNA，例如shRNA、miRNA。对于治疗局部缺血而言，可用的转基因可编码NAIP或NGF。编码β-葡糖醛酸酶(GUS)的转基因可用于治疗某些溶酶体贮存病(例如，VII型粘多糖病(MPS VII))。编码药物前体活化基因，例如将更昔洛韦转化成扰乱DNA合成并导致细胞死亡的毒性核苷酸的HSV胸苷激酶的转基因，可用于治疗某些癌症，例如在与药物前体组合给药时。编码诸如β-内啡肽的内源性阿片类物质的转基因可用于治疗疼痛。可在本发明的AAV载体中使用的转基因的其他实例将对技术人员显而易见(参见，例如，Costantini L C等人，Gene Therapy(2000)7，93-109)。

在过去十年内，若干实验和/或临床研究报道了将基于AAV的载体(特别是AAV9)成功用于CNS靶向基因递送。这些研究明确建立了基于AAV的递送载体作为在靶向CNS区中实现强效基因上调或沉默的工具的价值，并且已提供了这种治疗方法可有效用于治疗包括ALS、SMA、肌痉挛状态和慢性疼痛的许多神经变性病症的证据。尽管存在这些鼓舞人心的数据和广泛的临床前动物研究，但尚未完全理解关于在使用不同AAV递送途径(全身，鞘内)之后AAV载体如何在脑或脊髓实质中穿透的详细机制。这些数据对于开发新的和更有效的AAV递送规程是重要的，所述规程将在幼年以及完全发育的成年动物和人受试者中同样地强效。一般而言，基于动物在被采用时的发育阶段或递送AAV的途径(例如，全身或鞘内)，可将临床前动物研究分类成若干组。取决于个体研究中使用的参数，转基因表达水平和受感染的特定细胞群(神经元和/或神经胶质)有很大变化。

早期研究证明在新生小鼠中AAV9-GFP的全身静脉(iv)注射导致广泛的CNS GFP表达，包括背根神经节、脊髓运动神经元(MN)和脑中的神经元(新皮质、海马体、小脑)。使用成年小鼠，iv递送的AAV9-GFP导致贯穿整个CNS的优先星形细胞感染，但仅发现有限的神经元表达(Foust等人(2009).Intravascular AAV9preferentially targets neonatalneurons and adult astrocytes.Nature biotechnology 27：59-65)。报道了参照数据证明了在新生小鼠中AAV9全身(iv)递送之后广泛的脊髓MN GFP表达(Duque等人(2009)Intravenous administration of self-complementary AAV9enables transgenedelivery to adult motor neurons.Molecular therapy:the journal of the AmericanSociety of GeneTherapy 17：1187-1196)。另外，相同的组证明了一旦在成年小鼠或猫中iv递送AAV9，则在脊髓MN中成功转基因表达。类似于这两项研究，Gray等人已表明在成年小鼠中iv AAV9给药之后CNS神经元的GFP表达，然而，在青少年非人灵长类动物中仅发现有限的转导效率；比较先前的研究，其中在脑中发现神经元至神经胶质表达的明显偏移(Gray等人(2011).Preclinical differences of intravascular AAV9delivery to neurons andglia:a comparative study of adult mice and nonhuman primates.Moleculartherapy:thejournal ofthe American Society of Gene Therapy 19：1058-1069)。

考虑到在成年动物中全身iv AAV9递送之后明显有限的神经元表达，在若干研究中探索了鞘内途径的使用(以绕过血脑屏障)。使用一岁大2kg BW非人灵长类动物(食蟹猴(Cynomolgus macaques))，据证明，在AAV9注射之后两周时AAV9-CB-GFP的单次腰部-鞘内注射导致整个脊髓中50-75％MN转导。类似地，在使用青少年2至3年大非人灵长类动物(食蟹猴)或幼年(2月大)猪的另一个研究中，在脑池内或组合的脑池-腰部鞘内AAV9递送之后，贯穿整个脊髓发现强效的MN转导。另外，在同一研究中，在背根神经节细胞、运动皮层中和在小脑皮质中的蒲肯野(Purkinje)细胞中观测到GFP表达。在最近的研究中，在脑池内AAV9-GFP注射之后在非人灵长类动物(食蟹猴)中发现相似的腰部MN GFP表达。

有趣的是，在采用脑池或腰部-骶椎鞘内递送途径的所有研究中，可得到的组织学数据表明非常特定的脊髓转基因表达谱。其特征为：在α-运动神经元中强烈表达，然而，极接近于表达GFP的α-运动神经元处存在的腹角中间神经元显现为转基因阴性。类似地，在背根神经节细胞和初级传入神经中发现强效转基因表达。然而，位于浅层背角中或中间区中的小中间神经元显示无转基因表达。

这种高水平的转基因表达选择性和较深灰质细胞中感染的缺失指示存在良好发育的调控屏障系统(除血脑屏障以外)，这阻止病毒从鞘内空间穿透入较深脊髓隔室。基于脊膜的充分描述的解剖学组织，已假设软膜代表在鞘内AAV递送之后调控AAV穿透入脊髓实质的关键屏障。因此，推测在鞘内递送之后报道的MN和DRG细胞中发现的高水平转基因表达可能是通过突出至脊髓实质中和离开脊髓实质以及横穿鞘内空间(即，腹根和背根)的轴突的优先逆行和顺行性感染来进行介导。

因此，为了解决这一问题，本发明提供一种在哺乳动物中软膜下载体递送的方法，并且证明这种递送途径导致感染软膜下注射节段的灰质中神经元的整个群体的强效经脊髓转基因表达。另外，实现了近乎完全的下行和上行轴突感染，并且与脑中枢(即，运动皮层、红核)中的转基因表达相符合。

因此，本文提供的方法和递送系统允许脊髓软膜下基因治疗，诸如在大型动物中或人中将AAV9载体或反义寡核苷酸(ASO)递送至脊髓实质中。为了将AAV9或ASO递送至软膜下空间中，新递送系统被设计成包括以90°弯曲的导向管和导管(例如，PE-5或PE-10)，所述系统允许将软膜下导管精确引导和放置至靶向脊髓节段的背软膜下空间中。在放置导管之后，在移除之前输注AAV9或ASO持续一定量的时间。在各种实施例中，输注AAV9或ASO持续大约2-3分钟。

如本文中所使用的，术语“PE-10”指的是具有大约0.010英寸内径的聚乙烯管。在某些实施例中，PE-10管的内径将为约0.011英寸。同样地，术语“PE-5”指的是具有大约0.005英寸内径的聚乙烯管。在某些实施例中，PE-5管的内径将为约0.008英寸。

因此，所请求保护的系统提供软膜下递送(即，绕过软膜)，其在受治疗的受试者的白质和灰质中提供近乎完全的脊髓实质AAV9介导基因表达或ASO分布。目前可利用的非侵入技术不允许相似水平的脊髓实质转基因表达或充分受控的节段特异性基因沉默。

为了在哺乳动物受试者中放置软膜下导管，可接着进行若干连续的程序步骤以使与在暴露的“无硬膜”脊髓附近的仪器/导管操纵相关联的潜在脊髓损伤降到最低。在各种实施例中，使用尾侧和颅侧脊髓夹(置于椎板切除术正上方和正下方)使导管放置期间的脊髓搏动降到最低。此外，在各种实施例中，将安装在XYZ操纵器(如例如美国公开号2015/0224331中所描述的，该专利以引用的方式并入本文)上的“L”形导管不锈钢导向管(例如，以90°弯曲的16-26G不锈钢管)用于软膜下导管放置。

在某些实施例中，首先使用弯曲的30G针刺穿软膜。一旦穿透30G针的尖端处于软膜下空间中约1-1.5mm，可稍微提升软膜1-2mm。然后，通过将导管从导向管推进而将软膜下导管置于软膜下空间中。在导管推进至目标长度之后，从软膜下空间中移除导向管的穿透针尖端。一旦完成载体注射(通常历时2-5min，并且在一些实施例中历时约3min)，自软膜下空间拉出导管并且闭合硬膜。通过使用这种技术方法，可在从硬膜开口的时刻起约3-5min内完成软膜下导管的放置。

已使用这种技术将本文所述的软膜下导管成功置于17头猪中，实现了一致和无损伤的软膜下导管放置。在成年大鼠中使用了相同的技术，然而，替代地使用PE-5导管。使用这些成年大鼠和猪获得的数据证明：i)在单次推注软膜下AAV9递送之后，在包括神经元和神经胶质细胞的白质和灰质中强效的脊髓实质转基因表达，ii)在颈部或胸部软膜下AAV9注射之后递送至贯穿脊髓长度的几乎所有下行运动轴突，iii)在脑运动中枢(运动皮层和脑干)中强效的逆行转基因表达，以及iv)通过在AAV9递送之后持续高达三个月定义正常神经功能，证明这种方法的安全性。因此，AAV-9的软膜下递送允许在成年哺乳动物中具有广泛实验和临床利用的基于基因的治疗。

在一个实施例中，以90°弯曲的16-26G不锈钢管用作PE-10导管的导向插管。导向管恰好位于脊髓软膜上方，并且随后通过小软膜开口将PE导管推进至软膜下空间中(图1A-1E)。然后，将AAV9或ASO输注入软膜下空间。在某些实施例中，在含有1-10％之间的葡聚糖(10,000-30,000MW)的混合物中递送AAV9，以允许AAV9颗粒在脊髓实质中更持久的沉积。在AAV9-GFP递送之后，可在注射水平面处贯穿脊髓实质和在自AAV9注射节段远侧突出(至腰部脊髓中)的轴突中发现一致的GFP表达。

如本文中展现的，单次软膜下AAV9注射导致头尾向(rostro-caudally)散布多个节段的强效实质转基因表达。因此，软膜下AAV9递送导致贯穿软膜下注射节段中灰质神经元以及上行和下行轴突中广泛的转基因表达。例如，在成年猪脊髓中，在相距给药点约10-15cm的距离中一致地发现转基因散布。在所有灰质薄层的神经元和神经胶质细胞中以及在腹索、侧索和背索中的轴突中识别到表达，证实贯穿脊髓实质软膜下注射的AAV9载体近乎完全穿透。通过分析接收胸中段AAV9-UBI-GFP注射的猪中的横向腰部脊髓切片(即，离AAV9递送部位约30cm的距离)，在AAV9注射之后六周时几乎所有下行运动轴突显现为被标记。更高分辨率的共焦显微镜揭示，贯穿灰质具有终结的细轴突树状分支的致密网络。与白质中感染轴突的水平和分布一致，识别到运动皮层中和脑干中的逆行感染表达GFP的神经元。类似地，在网状结构中和丘脑中识别到中央突出的感觉轴突。

通过在大鼠中比较软膜下与鞘内AAV9递送之后的转基因表达谱，本发明证明实质上不同的区域性细胞表达。因而，在鞘内递送之后该软膜代表对AAV9有效实质穿透的主屏障。

首先，在鞘内递送之后，仅在形态学上与背根和前根进入区相关联的区域和神经元-神经胶质池中发现表达。因此，强效转基因表达在初级传入神经中发现并且明显存在于背索、背角中的初级传入神经和突出至腹角的Ia传入神经中。初级传入神经中的这种转基因表达与背根神经节细胞中的强效表达对应。类似地，在腹角中具有一些逆行标记的α-运动神经元的前根进入区周围发现明显表达。相比之下，然而，在薄层I-VII与X之间的所有其他神经元中几乎不存在转基因表达，并且在侧索或腹索中无下行运动轴突被标记。类似地，被表达GFP的初级传入神经围绕的大鼠中皮质脊髓束的轴突(位于背索的基部上)显示无转基因表达。在不受理论约束的情况下，这些数据共同地表明脊髓实质GFP表达(无论在神经元或突出的初级传入神经中)可由逆行或顺行转基因表达引起，并且并非由AAV9从鞘内空间摄取至脊髓实质中所引起。这种观测与来自其他实验室的数据一致，所述数据证明在成年非人灵长类动物或幼猪中单次鞘内或脑池AAV9-GFP注射之后强效的α-运动神经元GFP表达。然而，在存在于GFP+α-运动神经元紧邻处的中间神经元中未发现神经元间GFP表达(Meyer等人(2015).Improving single injection CSF delivery ofAAV9-mediated genetherapy for SMA:a dose-response st

udy in mice and nonhuman primates.Molecular therapy:the journal ofthe American Society ofGene Therapy 23：477-487；Foust等人(2013).TherapeuticAAV9-mediated suppression ofmutant SOD1 slows disease progression and extendssurvival in models ofinherited ALS.Molecular therapy:thejournal oftheAmerican Society ofGene Therapy 21：2148-2159；Passini等人(2014).Translationalfidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motorneuron 1 for spinal muscular atrophy.Human gene therapy 25：619-630；Bell等人(2015).Motor Neuron Transduction after Intracisternal Delivery of AAV9in aCynomolgus Macaque.Human gene therapymethods 26：43-44)。

相比之下，如上文所描述的，软膜下AAV9递送与灰质神经元(即，α-运动神经元和中间神经元)中以及注射节段的几乎所有下行运动轴突和初级传入神经中的强效转基因表达相关联。这些数据清楚地表明软膜代表阻止AAV9穿透至远离腹根和背根进入区的其他脊髓隔室中的主屏障。通过绕过软膜并且将AAV9沉积至软膜下空间中，可在成年啮齿动物或大型动物中有效实现白质和灰质的经实质感染。

因此，所请求保护的方法和系统可在受试者中用来在脊髓外伤之后通过上调下行运动轴突中神经营养基因的表达水平来增加轴突萌发。另外，ASO的此种局部递送使得与待靶向的慢性疼痛或肌痉挛状态的发展相关联的基因能够节段限制性沉默，而且不具有鞘内ASO递送之后另外发现的脊髓上副作用。

在成年动物中脊髓和脑中软膜下诱发性感染的效力和被感染的神经元细胞群具有若干潜在临床和实验意义。首先，在特异性基因将沉默下调时的情况下，沉默AAV9构建体的单次颈部软膜下注射将在颈部神经元和神经胶质细胞中、贯穿脊髓全长的下行运动轴突中以及大多数上行感觉纤维中导致有效的基因沉默。考虑到在ALS患者以及ALS的实验模型中良好表征的神经退行性模式并且该模式包括上运动神经元和突出下行运动轴突、下运动神经元和脊髓中间神经元的进行性退化，实现广泛突变基因沉默的能力将有可能提供实质性优点来实现最强效的治疗效果。另外，单次颈部软膜下注射可与向腰部膨大中的一次或多次额外的软膜下注射组合来靶向腰部神经元/神经胶质群，和/或与腰部鞘内注射组合来靶向贯穿胸部和腰部脊髓的α-运动神经元池。其次，与轴突萌发相关联的治疗性基因(例如生长因子)的表达增加可以容易地在下行运动束以及上行感觉纤维中实现，并且例如在脊髓外伤研究中测试其治疗效力。在这种情况下，可从恰好在损伤中心处的单一椎板切除术部位，利用头向和尾向推进的软膜下导管来分别靶向已切断的运动轴突的远端和上行感觉轴突的近端，给予该AAV9载体。第三，可由颈部软膜下AAV9-GFP注射实现的近乎完全的下行运动束标记，将允许对受试者的标记运动轴突与脊髓移植细胞之间的轴突萌发和突触形成进行研究。对脊髓损伤的细胞移植大型动物模型中轴突萌发的水平和/或突触接触的发育进行系统性表征的此类数据目前尚不可得。

如本文所描述的，如果与鞘内递送相比，软膜下AAV9递送的优点显现为更好的脊髓经实质转基因表达。另外，在完全成年大鼠或迷你猪中实现了相似的高水平的转基因表达。因为成年35-40kg猪中脊髓的尺寸类似于人的，所以预期也将在成人中实现类似的实质AAV9摄取。

本文所述的软膜下递送技术的一种相对局限性是要求进行局部椎板切除术以便能接近软膜下注射脊髓的背侧面。对椎板切除术的要求可能限制其重复使用(这与重复鞘内递送的潜在性相反)。然而，一旦将基于软膜下的基因递送用于在疾病修饰研究中，发现明显和更强效的治疗效果，那么在软膜下AAV9递送之后可实现的转基因表达的程度似乎平衡了(如果没有过度超过)这种局限。另外，最近已确定在空白对照大鼠中，给药后12个月时在腰部脊髓中保持连续高水平的脊髓GFP表达。这将指示治疗性基因的单次软膜下递送可在需要考虑另外的基因递送之前潜在地导致持久的效果。

使用示例性哺乳动物受试者(例如，成年猪和大鼠)，本发明证明本文提供的软膜下脊髓AAV9递送技术允许在脊髓实质、下行和上行轴突中广泛的转基因表达，并且不需要直接脊髓组织针穿透(参见图8)。除脊髓区域性转基因表达以外，在脑运动中枢中发现稳健的逆行表达。这种技术可潜在地用于临床前和人临床研究中，所述研究目的是在特异性脊髓节段中和/或在突出的运动轴突和上行感觉轴突中上调或下调目标基因。在这些示例性成年动物中转基因表达的程度表明本发明可成功地用于成年患者群体中以靶向各种脊髓神经退行性疾病和/或CNS相关性病症。示例性神经退行性疾病、CNS相关性病症、疾病或损伤包括但不限于：多发性硬化症(MS)，进行性多病灶脑白质病(PML)，脑脊髓炎(EPL)，脑桥中央髓鞘溶解(CPM)，脑白质肾上腺萎缩症，亚历山大(Alexander)氏病，佩利措伊斯(Pelizaeus)梅茨巴赫(Merzbacher)病(PMZ)，球形细胞脑白质病(克腊比(Krabbe)氏病)和华勒(Wallerian)变性，视神经炎，横惯性脊髓炎，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，亨廷顿氏病，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，帕金森氏外加疾病(例如，多系统萎缩、进行性核上麻痹和皮质基底变性)，外科切除术，脊髓损伤或外伤，由肿瘤切除术造成的CNS损伤，横惯性脊髓炎，视脊髓炎，格莱因(Guillain)-巴尔(Barré)综合征(GBS)，中风，外伤性脑损伤，放射后损伤，化疗的神经系统并发症，急性缺血性视神经病，维生素E缺乏症，孤立维生素E缺乏综合征，巴森(Bassen)-科恩韦格(Kornzweig)综合征，马尔基亚法瓦(Marchiafava)-比尼亚米(Bignami)综合征，异染性脑白质营养不良，三叉神经痛，舌咽神经痛，重症肌无力，癫痫，贝尔(Bell)氏麻痹，肌营养不良，进行性肌萎缩，原发性侧索硬化症(PLS)，假延髓病性麻痹，进行性延髓麻痹，脊髓性肌萎缩，遗传性肌萎缩，椎间盘综合征(例如，突出、破裂和脱出椎间盘综合征)，颈椎关节强硬，神经丛病症，胸廓出口破坏综合征，外周神经病，卟啉症，轻度认知损害，以及慢性疼痛综合征。

在一些实施例中，AAV组合物被配制成减少组合物中AAV颗粒的聚集，特别是在存在高AAV浓度(例如，约10¹³GC/ml或更高)的情况下。用于减少AAV聚集的方法是本领域众所周知的，并且包括(例如)添加表面活性剂、pH调节、盐浓度调节等。(参见，例如，Wright F R等人，Molecular Therapy(2005)12，171-178，其内容以引用的方式并入本文。)

药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员熟知的，供各种治疗方案中使用的本文所述的特定组合物的合适剂量给药和治疗方案的开发同样如此。通常，这些制剂可含有至少约0.1％的活性成分或更多，但一种或多种活性成分的百分比无疑是可变化的，并且可合宜地介于总制剂的约1％或2％与约70％或80％或更大重量或体积之间。自然地，每种治疗可用的组合物中的活性成分的量可以按一种方式制备，从而使得将在化合物的任何给定单位剂量中获得合适的剂量。制备此类药物制剂的本领域技术人员将考虑到诸如可溶性、生物可利用性、生物半衰期、给药途径、产品货架期以及其他药理学考虑因素的因素，并且因而可期望各种剂量和治疗方案。

适合于可注射使用的药用剂型包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌水溶液或分散体。还可在甘油、液体聚乙二醇和它们的混合物中以及在油中制备分散体。在普通的存储和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以阻止微生物生长。在许多情况下，所述形式是无菌的并且流动的达到可容易注射的程度。在制造和存储的条件下它必须是稳定的，并且必须被保存免受诸如细菌和真菌的微生物的污染。载体可为溶剂或分散介质，含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇以及类似物)、它们的合适混合物，和/或植物油。可(例如)通过使用诸如卵磷脂的涂层，在分散体的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

对于可注射水溶液的给药而言，例如，可在必要时恰当地缓冲溶液，并且首先用充足的盐水或葡萄糖致使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液尤其适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。在这方面，可采用无菌水介质将是本领域技术人员已知的。例如，可将一个剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中，并且添加至1000ml的皮下灌注液或在建议的输注部位处注射(参见例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038和1570-1580页)。取决于宿主的状况，将必然出现一些剂量变化。负责给药的人员将在任何情况下判定对各个宿主的适当剂量。

根据需要，通过将活性AAV以所需量混合在具有本文中列举的各种其他成分的适当溶剂中，接着过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般而言，通过将各种灭菌的活性成分合并至无菌赋形剂来制备分散体，所述赋形剂含有基础分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术生产活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外期望成分的粉末。

本文所述的药剂、组合物和/或系统在一些实施例中可组装成药用或诊断或研究试剂盒，以促进其在治疗、诊断或研究应用中的使用。试剂盒可包括容纳本发明的组分的一个或多个容器和使用说明书。具体地，此类试剂盒可包括组合物连同说明书，所述组合物包括如本文所述用于给药的AAV，所述说明书描述组合物的预期应用和适当用途。在某些实施例中，试剂盒可进一步包括含有以90°弯曲的导向管(例如，18或23G)和导管(例如，PE-5或PE-10)的单独容器，所述管适合用于特定应用，且适合用于组合物的软膜下给药方法。用于研究目的的试剂盒可含有适当浓度或量的组分以进行各种实验。试剂盒可进一步包括将组合物软膜下给药至受试者所需的一种或多种或所有组件，诸如注射器、尾侧和/或颅侧脊髓夹、XYZ操纵器等。

如本文中所使用的，“说明书”可定义指示和/或宣传的组件，并且通常涉及关于或与本发明的包装相关联的书面说明书。说明书还可包括以任何方式提供的任何口头或电子指示，例如视听(例如，录像带、DVD等)、因特网和/或基于网络的通信等，以使得用户将清楚地认识到说明书与试剂盒相关联。书面说明书可呈由管控医药或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，所述说明书还可反映经针对动物给药的制造、使用或销售的机构的批准。

以下实施例意欲说明而非限制本发明。

实施例1

材料和方法

动物和一般外科准备——使用成年斯普拉格(Sprague)-道利(Dawley)大鼠(雄性和雌性，250-350克；n＝16)或由明尼苏达和哥廷根品系杂交繁育产生的成年迷你猪(两性；30-40kg；n＝6)。用5％异氟烷麻醉大鼠，并且取决于呼吸率和爪捏(paw pinch)响应在手术期间维持在2-3％异氟烷下。然后，剃去大鼠背上的毛发并且用2％洗必泰清洗。在切开皮肤之后，移除围绕颈部、胸部或腰部脊椎的脊椎旁肌肉，并且使用如先前描述的坎宁安(Cunningham)氏脊髓夹将动物固定至脊髓固定架(Stoelting)中(Kakinohana等人(2004).Region-specific cell grafting into cervical and lumbar spinal cord in rat:aqualitative and quantitative stereological study.Experimental neurology 190：122-132)。为了暴露脊髓，使用牙钻进行相应脊椎的背椎板切除术。然后使用手术刀片切开硬膜。

对迷你猪用肌肉内阿扎哌隆(2mg/kg)和阿托品(1mg/kg；Biotika，SK)进行术前用药，并且随后用氯胺酮(20mg/kg；IV)诱导。在诱导之后，用2.5F气管导管对动物进行插管。用恒定2L/min的流速在50％/50％空气/氧气混合物中的1.5％异氟烷维持麻醉。使用脉搏血氧计(Nellcor Puritan Bennett公司，爱尔兰)在整个程序期间监测氧饱和度。在麻醉诱导之后，将动物置于如先前所述的脊髓固定器械中(Usvald等人(2010).Analysis ofdosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinalstem cells in immunosuppressed minipigs.Cell transplantation 19：1103-1122)。然后，进行分别对应于Th5和L3-L6脊髓节段的Th5或L2-L4脊椎的背椎板切除术，并且使用棉签移除硬膜外脂肪。将硬膜切开并且使用6.0脯氨酸将其紧固至外围组织(图1C-1E)。

软膜下导管的放置和软膜下AAV9注射——为了放置软膜下导管，构造L形导管导向管(18或23G)(图1B)。将导向管安装至XYZ(Stoelting)操纵器中并且推进至暴露的脊髓节段的表面。使用先前弯曲成45°的30G针来刺穿软膜。然后，通过从导向管的另一端手动推动导管，将软膜下导管(PE-10用于猪，且PE-5用于大鼠)从导向管推进至软膜下空间中。在大鼠中，将导管推进至软膜下空间约1-1.5cm，并且在猪中为约3-6cm。然后，在3min内使用50或250μl汉密尔顿(Hamilton)注射器将病毒注射入软膜下空间。在注射之后，移除导管，使用6.0脯氨酸闭合硬膜(仅在猪中闭合硬膜)，并且允许动物恢复。

制备用于体内注射的AAV9——通过寡核苷酸合成制得1.2kb泛素-C(UBC)启动子，与eGFP或DsRed(RFP)和SV40多聚A信号连接，并且克隆至自补双链DNA基因组AAV(scAAV)载体质粒中(Xu等人(2012).In vivo gene knockdown in rat dorsal root gangliamediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5followingintrathecal delivery.PloS one 7：e32581)。通过用载体质粒、pRep2-Cap9和pAd-辅助质粒瞬时转染HEK293T细胞来产生由UBC启动子驱动的表达eGFP或RFP的无辅助病毒scAAV9载体(Xiao等人(1998).Production ofhigh-titer recombinant adeno-associated virusvectors in the absence of helper adenovirus.J Virol 72：2224-2232)。质粒pRep2-Cap9得自U.Penn的载体中心(Vector Core)。在转染之后72后小时制备的细胞裂解物中的AAV载体如先前所述地纯化，并且通过Q-PCR测滴度(Xu等人，上述)。将最终滴度调整至每毫升1.0×10¹³基因组拷贝(gc/ml)。在注射之前将病毒与葡聚糖(10,000MW)1:1混合达到2.5％的最终葡聚糖浓度。软膜下注射液体积在大鼠中为30μl，在猪中为200μl。

脊髓和脑切片的灌注固定，死后原位GFP荧光成像和免疫荧光染色—用戊巴比妥深度麻醉动物(大鼠和猪)，并且用200ml(大鼠)或2000ml(猪)肝素化盐水，接着250ml(大鼠)或4000ml(猪)4％于PBS中的多聚甲醛经心脏灌注。解剖脊髓和脑，并且在4℃下后固定在4％于PBS中的甲醛中过夜，并且随后于30％蔗糖PBS中防冷冻，直至在低温恒温器上切下横向或纵向切片(30μm厚)并且存储于PBS中。在切片之前，使用IVIS Spectrum光学成像系统(Xenogen，加州阿拉米达)原位成像全部脊髓。在激发波长465nm和发射波长520nm下获得序列。使用中等像素混合(binning)，并且暴露时间为3秒。使用Living Image 4.3.1(Xenogen，加州阿拉米达)软件分析图像。使用定容ROI计算信号。所制备的切片在4℃下利用在具有0.2％Triton X-100的PBS中制得的以下一级抗体免疫染色过夜：家兔抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP；1:500，Origene，美国马里兰州罗克维尔)和小鼠抗神经元核抗原(NeuN，1:1000，Chemicon)。在用一级抗体孵育之后，将切片在PBS中洗涤三次，并且分别用荧光共轭的二级驴抗兔和驴抗小鼠抗体(Alexa Fluor 488、546或647，1:1000，Invitrogen)孵育，以及用DAPI孵育以用于一般核染色。然后，将切片固定在载玻片上，在室温下干燥，并且用Prolong抗褪色试剂盒(Invitrogen)覆盖。使用Zeiss Imager M2显微镜捕获荧光图像，并且使用Olympus FV1000显微镜拍摄共焦图像。

这种方法的一致、高水平的脊髓实质转基因表达以及可行性代表了优于目前方法的主要技术改进，具有一般而言旨在脊髓基因上调或沉默的潜在直接临床应用。目前使用的方法采用脊髓鞘内或侵入性直接实质内AAV注射，具有其明显限制，诸如低水平的实质转基因表达或实现更稳健感染效果所需的其侵入性质。另外，这种方法在远离AAV9递送部位的节段处提供空前水平的运动和感觉纤维标记，使它成为在啮齿动物和大型动物物种中的靶向脊髓节段中研究突触连接的程度和识别调控轴突萌发的因素(即，基因、神经营养因子)的非常稳健的工具。

本文提供了一个实例，其展现脊髓软膜下AAV9递送和所得区域性实质表达的原理，以及在AAV9递送后2个月时，成年猪中，远离AAV9递送部位的节段中的轴突标记。

实施例2

在单次软膜下推注之后实质AAV9介导转基因表达

最初，测试在大鼠和猪中单次推注软膜下AAV9-UBI-GFP或AAV9-UBI-RFP递送的效力。动物接收被递送至颈部(C4-6)、胸部(Th6-9)或腰部(L2-L5)节段的软膜下空间中的于2.5％葡聚糖溶液中的20μl(大鼠)或200μl(猪)AAV9载体。在AAV9递送之后6-8周时，从4％多聚甲醛固定的动物上解剖出脊髓，并且使用Avis荧光系统原位成像。然后，从AAV9注射节段切下横向或水平脊髓切片，并且对GFP或RFP的存在进行分析，并且用神经元(NeuN)和神经胶质(GFAP)抗体共染色。在大鼠和猪脊髓中，在脊髓的表面发现强烈的GFP或RFP表达，并且容易通过目视检查识别为黄-绿色或红色区域。图1H和1J图示与空白对照脊髓(图1I)相比，在横切的猪脊髓中和在前根中(图1H，插图)存在RFP(红色)。相应地，AAV9-UBI-GFP注射动物的脊髓表面密度计分析显示从软膜下AAV9递送的中心延伸多达5-10cm的GFP信号的广泛分布(图1F和1G)。

使用取自在胸中段水平面中先前用AAV9-UBI-RFP软膜下注射的猪的水平切胸部切片(与图1H中所示相同的脊髓)，发现广泛的实质RFP表达。RFP表达在大多数中间神经元和α-运动神经元中容易识别到，并且贯穿4-6脊髓节段延伸(图3A和3B)。类似地，贯穿表达RFP的灰质发现轴-树突(axo-dendritic arbor)中强烈的RFP表达(图3A和3B，白色星号)。

对取自软膜下AAV9注射中心的横向脊髓切片的分析证实了贯穿白质和灰质的强烈的RFP表达。在白质中，类点状RFP表达在大多数横切轴突中被发现(图3C，白色星号，嵌入框)，并且在背索、侧索和腹索中被识别到(图3C，DF、LF、VF；嵌入框)。在灰质中，分布在薄层I-IX与腹角中的腹部α-运动神经元之间的许多中间神经元显示在体细胞中和轴-树突中强烈的RFP表达。还在贯穿灰质终结中发现高密度的RFP表达(图3D-3G)。类似地，共焦分析表明星形细胞中存在RFP信号(图3C，插图：RFP/GFAP)。

在L1-2水平面处软膜下AAV9-UBI-GFP注射之后，在大鼠腰部脊髓中发现类似的神经元GFP表达谱。识别到贯穿L1-L5腰部节段和位于薄层I-IX之间的全部灰质中的高密度的GFP+神经元(图9A-9D)。

实施例3

远脊髓节段中的GFP表达

接下来，在大鼠和猪中将AAV9-UBI-GFP软膜下注射至胸中段(Th6-7)或下颈部节段的软膜下空间中之后，表征腰部脊髓中的下行脊髓束GFP表达的程度。在软膜下AAV9递送之后3-6周时，贯穿全部腰部脊髓发现强烈的GFP表达。使用取自猪的横向腰部(L2-L6)脊髓切片，在无额外的GFP免疫染色的情况下，容易识别到侧索和腹索中横切轴突中的高强度GFP表达(图4A，白色星号)。在这些区域中，贯穿全部白质发现类似密度的GFP+轴突。与侧索和腹索相比，在背索中发现相对更低数量的GFP+轴突(图4A，DF)。与在侧索和腹索的白质中发现的轴突标记的程度一致，发现终止于灰质中的GFP+轴突的致密网络(图4A和4B)。在薄层III-X之间识别到这些轴突。在薄层I-III中仅发现极少GFP+轴突。高功率共焦显微镜显示在灰质中具有许多终结的高密度细GFP+轴突(图4C)。

在先前接受上颈部软膜下AAV9-UBI-GFP注射的大鼠中发现腰部灰质内的下行运动轴突中相似的GFP表达谱(图9E和9F)。

实施例4

在脊髓软膜下递送之后脑运动区中的逆行转基因表达

在猪中软膜下AAV9-UBI-GFP递送之后六周时对脑运动中枢(运动皮层、红核和网状结构)中转基因(GFP)表达的分析显示运动皮层中强烈GFP标记的锥体神经元(图5A-5E)。类似地，识别到位于脑干中的许多GFP+神经元(图5F-5J)。与运动皮层中GFP+神经元的存在一致，在延髓(延髓锥体)的腹区中发现高数量的GFP+皮质脊髓轴突(图5K)。另外，贯穿网状结构(图5L)以及丘脑核中的脊髓丘脑末端(未图示)发现高密度的顺行标记GFP+脊髓网状末端。

相似地，如猪中所发现的，在大鼠中发现运动皮层中位于两侧的高密度GFP+锥体神经元(图6A-6D)。类似高水平的GFP表达还在红核中发现，并且容易通过位于两侧的GFP+核-神经元簇识别(图6E-6G)。

实施例5

在鞘内与软膜下AAV9递送对比之后，差异性区域脊髓转基因表达

在相同的动物(大鼠)中，一旦将AAV9注射入腰部(L1-L2)鞘内空间(AAV9-UBI-GFP)和注射入胸部Th7节段的软膜下空间(AAV9-UBI-RFP)，则比较脊髓转基因表达的分布。在腰部鞘内AAV9注射之后进行软膜下AAV9注射三周，并且在软膜下AAV9注射之后三周时分析横向腰部脊髓切片中的表达谱。AAV9-UBI-GFP的鞘内注射导致在背索中、在背角内的初级传入神经(薄层II-III)中和在薄层V-VII的内侧部中强烈的GFP表达。还识别到在CHAT+α-运动神经元附近的腹角中终止的若干GFP+Ia传入神经。与初级传入神经中的高GFP表达一致，在背根神经节细胞中发现高数量的GFP+神经元(图7B)。还在前根进入区周围一致地发现明显存在增加的GFP表达(图7A和7F)。在此区域中，发现若干表达GFP的神经胶质细胞。类似地，在背根进入区中识别到极少GFP+细胞。在腹部灰质中，一些α-运动神经元表现出GFP表达(图7G)。除了表现出GFP表达的这些区域和细胞组外，在包括背角、中间区的灰质的其他较深区域中以及侧索和腹索的白质中发现近乎完全缺失神经元或神经胶质GFP表达(图7A)。有趣的是，即使位于浅层背角中和存在于鞘内空间紧邻处(但由软膜分开)的神经元也表现出完全缺失GFP表达(图7C和7D)。

与在鞘内AAV9-UBI-GFP递送之后发现的GFP表达谱形成对比，如果在相同腰部脊髓切片中进行分析，那么由颈部软膜下AAV9注射造成的RFP表达显示出实质上不同的区域表达谱。dsRED表达在白质中大多数的轴突中被识别到，并且存在于侧索和腹索中。还发现突出至背角、中间区(薄层VII)和腹角的灰质中的许多轴突(图7A)。共焦显微镜显示白质或灰质中的几乎所有RFP+纤维为GFP阴性。有趣的是，在GFP标记的初级传入神经紧邻处发现存在于背索基部上的许多RFP+皮质脊髓轴突，但未在任何这些纤维中识别到RFP+GFP共存(图7E)。

虽然已参考上述实例描述了本发明，但将理解的是，诸多修改和变化包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由以下的权利要求书所限制。

Claims (26)

1.一种在受试者中进行核酸分子的脊髓经实质感染的方法，所述方法包括将核酸分子给药至受试者的软膜下空间的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中给药的步骤包括：

(a)暴露所述受试者的脊椎的脊髓节段；

(b)在所述脊髓节段内创建软膜开口；

(c)推进导管穿过所述软膜开口并进入软膜下空间中；以及

(d)将所述核酸分子递送至所述受试者的所述软膜下空间。

3.如权利要求2所述的方法，其中通过用L形不锈钢管刺穿所述软膜来创建所述软膜开口，并且推进所述导管穿过所述管进入所述软膜下空间中。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子以含有约1-10％葡聚糖的混合物给药。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子是载体或反义寡核苷酸(ASO)。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述载体是AAV9颗粒。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述载体包含编码调节或治疗神经退行性疾病的蛋白质或功能RNA的核酸分子。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述神经退行性疾病是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子作为单次注射来递送。

11.如权利要求2所述的方法，其进一步包括将一次或多次所述核酸分子的第二软膜下注射给药至所述受试者的所述脊椎的不同脊髓节段的步骤。

12.如权利要求2所述的方法，其进一步包括将一次或多次所述核酸分子的鞘内注射给药至所述受试者的步骤。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述受试者是人。

15.一种基因递送系统，其包括：

(a)L形导向管，其经配置以刺穿受试者的软膜；

(b)导管，其可滑动地设置在所述导向管内，并且经配置以被推进至所述受试者的脊椎的脊髓节段的软膜下空间中；以及

(c)贮器，其与所述导管流体连通，并且含有包含核酸分子的组合物。

16.如权利要求15所述的基因递送系统，其中所述L形导向管是16-26G不锈钢管。

17.如权利要求15所述的基因递送系统，其中所述导管由聚乙烯管形成。

18.一种将核酸分子递送至受试者的软膜下空间的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)暴露所述受试者的脊椎的脊髓节段；

(b)在所述脊髓节段内创建软膜开口；

(c)将如权利要求16所述的基因递送系统定位于所述脊髓节段上方；

(d)推进导管穿过所述软膜开口并进入软膜下空间中；以及

(e)将所述核酸分子递送至所述受试者的所述软膜下空间。

19.一种在有需要的受试者中治疗神经退行性疾病的方法，其包括将载体或反义寡核苷酸(ASO)给药至所述受试者的软膜下空间的步骤。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述给药的步骤包括：

(a)暴露所述受试者的脊椎的脊髓节段；

(b)在所述脊髓节段内创建软膜开口；

(c)推进导管穿过所述软膜开口并进入软膜下空间中；以及

(d)将所述核酸分子递送至所述受试者的所述软膜下空间。

21.如权利要求20所述的方法，其中通过用L形不锈钢管刺穿所述软膜来创建所述软膜开口，并且推进所述导管穿过所述管进入所述软膜下空间中。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述神经退行性疾病是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病。

23.如权利要求19所述的方法，其进一步包括将一次或多次所述载体或ASO的第二软膜下注射给药至所述受试者的所述脊椎的不同脊髓节段的步骤。

24.如权利要求19所述的方法，其进一步包括将一次或多次所述载体或ASO的鞘内注射给药至所述受试者的步骤。

25.如权利要求19所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述受试者是人。