WO2019176044A1 - 観察装置 - Google Patents

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WO2019176044A1
WO2019176044A1 PCT/JP2018/010195 JP2018010195W WO2019176044A1 WO 2019176044 A1 WO2019176044 A1 WO 2019176044A1 JP 2018010195 W JP2018010195 W JP 2018010195W WO 2019176044 A1 WO2019176044 A1 WO 2019176044A1
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WO
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cell
image
unit
height dimension
illumination
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Application number
PCT/JP2018/010195
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English (en)
French (fr)
Inventor
仁 越後
Original Assignee
オリンパス株式会社
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Publication date
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Priority to PCT/JP2018/010195 priority patent/WO2019176044A1/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters

Definitions

  • the present invention relates to an observation apparatus.
  • cell selection is performed by a culture operator by observing the shape of a colony, which is a collection of cells divided several times under a phase contrast microscope. Sorting colonies that are likely to be iPS cells by comparing the culture conditions and colonies was done sensuously, which was troublesome. In particular, when the colony is small, the difference in shape is small, and it is difficult to determine whether it is an iPS cell.
  • An object of the present invention is to provide an observation apparatus that can efficiently extract specific cells present in a culture vessel.
  • an image acquisition unit that acquires an image in which a shadow changes according to a gradient of a cell surface by photographing a cell in culture, and an image acquired by the image acquisition unit is processed.
  • a cell height calculation unit that calculates a height dimension at each position on the cell surface from the shadow of the image, and stores the height dimension of the cell surface calculated by the cell height calculation unit and the position information in association with each other.
  • An observation device including a storage unit.
  • the acquired image is processed by the cell height calculation unit, and the height dimension at each position on the cell surface is calculated. Then, the calculated height dimension of the cell surface is stored in the storage unit in association with the position information.
  • the number of cells changes due to division or the like in the culturing process, the area of the colony which is an aggregate of cells changes, and the height dimension also changes, so that the same type of cells have the same height dimension.
  • the stored equivalent height By selecting the cells present at the position of the dimensions, only the cells to be observed can be efficiently observed.
  • the image acquisition unit includes a cell region extraction unit that processes the image acquired by the image acquisition unit and extracts the cell region in which the cell exists, and the cell height calculation unit is extracted by the cell region extraction unit. Further, the height dimension of the cell surface at each position of the cell region may be calculated. With this configuration, the height dimension of the cell surface is calculated for each position of the cell region extracted by the cell region extraction unit, and the calculation of the height dimension for the region where no cell exists can be omitted. Thereby, the specific cell which exists in the culture container can be observed more efficiently.
  • the said display part may display the said cell area extracted by the said cell area extraction part by color-coding according to the said height dimension.
  • the apparatus includes a classification unit that classifies the cells based on the height dimension calculated by the cell height calculation unit, and the display unit classifies and stores the classification classified by the classification unit.
  • the position information stored in the section may be displayed in association with the position information.
  • the said cell height calculation part may calculate the height dimension of the said cell surface from the change of the direction of the illumination with respect to the said cell, and a parallel shadow.
  • the said cell height calculation part may process the image acquired by the said image acquisition part, and may calculate the said continuous height dimension of the said cell surface from the shadow of this image.
  • FIG. 1 It is a block diagram which shows the observation apparatus which concerns on one Embodiment of this invention. It is a figure which shows an example of the image acquired by the observation apparatus of FIG. It is a figure which shows the cell area
  • FIG. 9A It is a perspective view which shows a part of illumination optical system in the image acquisition part of FIG. It is a side view which shows an example of the line light source in the illumination optical system of FIG. It is the front view which looked at the line light source of FIG. 9A in the optical axis direction. It is a figure which shows the other example of the line light source in the illumination optical system of FIG. It is a figure which shows the objective optical system group of the image acquisition part of FIG. It is a figure which shows the arrangement
  • the observation apparatus 200 includes an image acquisition unit 100 that acquires an image of a cell, and a cell region extraction unit 110 that extracts a cell region by processing the acquired image.
  • a cell height calculation unit 120 that calculates the height dimension of each position on the cell surface in each extracted cell region, and an information storage unit (storage unit) that stores the calculated height dimension and position information in association with each other 130.
  • the cell region extraction unit 110 and the cell height calculation unit 120 are configured by a processor, and the information storage unit 130 is configured by a memory or a storage medium.
  • the image acquisition unit 100 acquires an image in which the shadow changes in accordance with the gradient of the cell surface by photographing cells in culture, and details thereof will be described later.
  • the cell region extraction unit 110 detects the boundary between the cell X and the non-cell as shown in FIG. 3 by edge detection and contour tracking in the image G as shown in FIG. 2 acquired by the image acquisition unit 100.
  • the extracted one is recognized as a cell X or a colony Y whose boundary is closed, and the cell X and the colony Y are distinguished from each other.
  • the cell height calculation unit 120 processes the image acquired by the image acquisition unit 100 and calculates the height dimension at each position on the cell surface from the shadow of the image. In the image acquired by the image acquisition unit 100, the shading changes according to the gradient of the cell surface. Therefore, if the gradient is large, the amount of change in luminance increases, and if the same gradient continues, constant luminance continues.
  • FIG. 5 shows a change in luminance along a predetermined straight line parallel to the illumination direction in the image H shown in FIG. Then, by integrating the gradient obtained using this change in luminance, the shape of the cell surface along the straight line can be calculated as shown in FIG. By estimating the magnitude and direction of the gradient on the basis of the brightness of the region without the colony Y, the relative height dimension of each position on the cell surface along the straight line can be calculated.
  • the height dimension at each position of the cell X or the colony Y calculated by the cell height calculation unit 120 is stored in the information storage unit 130 in association with the position information. Further, not only the height dimension of the colony Y on one straight line, but also the height dimension on the straight line at a plurality of positions of the colony Y may be calculated and stored in the information storage unit 130. May be stored in the information storage unit 130.
  • the image acquisition unit 100 irradiates illumination light to the stage 2 that supports the container (culture container) 1 containing the sample (cell) A and the sample A supported by the stage 2.
  • the illumination unit 3, the imaging unit 4 that acquires the image G of the sample A by detecting the illumination light transmitted through the sample A by the line sensor 13, and the focus adjustment mechanism 5 that adjusts the position of the focal point of the imaging unit 4 with respect to the sample A
  • a scanning mechanism 6 that moves the imaging unit 4 in a scanning direction orthogonal to the longitudinal direction of the line sensor 13.
  • the illumination unit 3, the imaging unit 4, the focus adjustment mechanism 5, the scanning mechanism 6, and the line sensor 13 are housed in a sealed state in a housing 101 whose upper surface is closed by the stage 2.
  • the direction along the optical axis of the imaging unit 4 (the optical axis of the objective optical system 11) is the Z direction
  • the scanning direction of the imaging unit 4 by the scanning mechanism 6 is the X direction
  • the longitudinal direction of the line sensor 13 is the Y direction.
  • An XYZ orthogonal coordinate system is used.
  • the image acquisition unit 100 is arranged in a posture in which the Z direction is a vertical direction and the X direction and the Y direction are horizontal directions.
  • the container 1 is a container formed of an entirely optically transparent resin, such as a cell culture flask or dish, and has a top plate 1a and a bottom plate 1b facing each other.
  • Sample A is, for example, a cell cultured in medium B.
  • the inner surface of the upper plate 1a is a reflecting surface that reflects the Fresnel of the illumination light.
  • the stage 2 includes a flat plate-like mounting table 2a arranged horizontally, and the container 1 is mounted on the mounting table 2a.
  • the mounting table 2a is made of an optically transparent material such as glass so as to transmit illumination light.
  • the illumination unit 3 includes an illumination optical system 7 that is disposed below the stage 2 and emits linear illumination light obliquely upward, and the illumination light is reflected obliquely downward on the upper plate (reflecting member) 1a.
  • the sample A is irradiated with illumination light obliquely from above.
  • the illumination optical system 7 is disposed on the side of the imaging unit 4 and emits illumination light toward the imaging unit 4 in the X direction, and the line light source 8.
  • the line light source 8 are provided with a cylindrical lens (lens) 9 that converts the illumination light emitted from the light into a parallel light beam, and a prism (deflection element) 10 that deflects the illumination light emitted from the cylindrical lens 9 upward.
  • the line light source 8 includes a light source body 81 having an exit surface for emitting light, and an illumination mask 82 provided on the exit surface of the light source body 81.
  • the illumination mask 82 has a rectangular opening 82a having a short side extending in the Z direction and a long side extending in the Y direction and longer than the short side.
  • illumination light having a linear cross section (cross section intersecting the optical axis of the illumination light) having a longitudinal direction in the Y direction is generated.
  • the light source body 81 includes an LED array 81a composed of LEDs arranged in a line in the Y direction, and a diffusion plate 81b that diffuses light emitted from the LED array 81a.
  • the illumination mask 82 is provided on the exit side surface of the diffusion plate 81b.
  • the light source body 81 includes a light diffusing optical fiber 81c and a light source 81d such as an LED or a super luminescent diode (LSD) that supplies light to the optical fiber 81c.
  • a light diffusing optical fiber 81c By using the light diffusing optical fiber 81c, the homogeneity of the light intensity of the illumination light can be improved as compared with the case where the LED array 81a is used.
  • the cylindrical lens 9 has a curved surface extending in the Y direction and curved only in the Z direction on the side opposite to the line light source 8. Therefore, the cylindrical lens 9 has refractive power in the Z direction and does not have refractive power in the Y direction.
  • the illumination mask 82 is located at or near the focal plane of the cylindrical lens 9. Thereby, the illumination light of the divergent light beam emitted from the opening 82a of the illumination mask 82 is bent only in the Z direction by the cylindrical lens 9 and converted into a light beam having a certain dimension in the Z direction (parallel light beam in the XZ plane). Is done.
  • the prism 10 has a deflection surface 10a that is inclined at an angle of 45 ° with respect to the optical axis of the cylindrical lens 9 and deflects the illumination light transmitted through the cylindrical lens 9 upward.
  • the illumination light deflected on the deflection surface 10a is transmitted through the mounting table 2a and the bottom plate 1b of the container 1, reflected from the upper plate 1a to illuminate the sample A from above, and the illumination light transmitted through the sample A and the bottom plate 1b.
  • the light enters the imaging unit 4.
  • the imaging unit 4 includes an objective optical system group 12 having a plurality of objective optical systems 11 arranged in a line, and a line sensor 13 that captures an optical image of the sample A connected by the objective optical system group 12.
  • each objective optical system 11 includes a first lens group G1, an aperture stop AS, and a second lens group G2 in order from the object side (sample A side).
  • the plurality of objective optical systems 11 are arranged in the Y direction with the optical axis extending parallel to the Z direction, and form an optical image on the same plane. Therefore, a plurality of optical images I arranged in a line in the Y direction are formed on the image plane (see FIG. 14).
  • the aperture stops AS are also arranged in a line in the Y direction.
  • the line sensor 13 has a plurality of light receiving elements arranged in the longitudinal direction, and acquires a linear one-dimensional image. As illustrated in FIG. 14, the line sensor 13 is disposed in the Y direction on the image planes of the plurality of objective optical systems 11. The line sensor 13 acquires a line-shaped one-dimensional image of the sample A by detecting the illumination light that connects the optical image I to the image plane.
  • the objective optical system group 12 satisfies the following two conditions.
  • the first condition is that, in each objective optical system 11, as shown in FIG. 11, the entrance pupil position is located closer to the image side than the first lens group G ⁇ b> 1 located closest to the sample A. This is realized by disposing the aperture stop AS closer to the object side than the image side focal point of the first lens group G1.
  • the off-axis principal ray approaches the optical axis of the objective optical system 11 as it approaches the first lens group G1 from the focal plane, so that the real field F in the direction perpendicular to the scanning direction (Y direction). Is larger than the diameter ⁇ of the first lens group G1. Therefore, the fields of the two adjacent objective optical systems 11 overlap each other in the Y direction, and an optical image of the sample A having no missing field is formed on the image plane.
  • the second condition is that the absolute value of the lateral magnification of projection from the object plane to the image plane of each objective optical system 11 is 1 or less, as shown in FIG.
  • the line sensor 13 can pick up and image a plurality of optical images I by the plurality of objective optical systems 11 spatially separated from each other.
  • the projection lateral magnification is larger than 1, the two optical images I adjacent in the Y direction overlap each other on the image plane.
  • the transmission range of the illumination light is regulated in the vicinity of the image plane in order to reliably prevent the light passing outside the real field F from overlapping the adjacent optical image. It is preferable to provide a field stop FS.
  • Entrance pupil position (distance from the most object-side surface of the first lens group G1 to the entrance pupil) 20.1 mm
  • Projection lateral magnification -0.756 times real field of view F 2.66 mm Lens diameter ⁇ 2.1mm of the first lens group G1 Lens interval d in the Y direction of the first lens group G1 2.3 mm
  • the illumination unit 3 is configured to perform oblique illumination that irradiates the sample A with illumination light from an oblique direction with respect to the optical axis of the imaging unit 4.
  • the illumination mask 82 is positioned at or near the focal plane of the cylindrical lens 9 as described above, and the center of the short side of the illumination mask 82 is the center of the cylindrical lens 9. It is eccentric downward by a distance ⁇ with respect to the optical axis. Thereby, illumination light is emitted from the prism 10 in a direction inclined with respect to the Z direction in the XZ plane.
  • the illumination light reflected by the substantially horizontal upper plate 1a is incident on the sample surface (focal plane of the objective optical system 11) obliquely with respect to the Z direction in the XZ plane, and the illumination light transmitted through the sample A is Incidently enters the objective optical system 11.
  • the illumination light converted into a parallel light beam by the cylindrical lens 9 has an angular distribution because the illumination mask 82 has a width in the short side direction.
  • illumination light is incident on the objective optical system 11 obliquely, only a part located on the optical axis side reaches the image plane through the aperture stop AS, as indicated by a two-dot chain line in FIG. The other part located outside the optical axis is blocked by the outer edge of the aperture stop AS.
  • FIG. 16 is a diagram for explaining the action of oblique illumination when observing a cell having a high refractive index as the sample A.
  • the objective optical system 11 is moved from left to right.
  • the incident angle of the illumination light is equal to the taking-in angle of the objective optical system 11
  • the light beams a and e transmitted through the region where the sample A does not exist and the light beam c incident substantially perpendicular to the surface of the sample A are almost refracted. Without passing through the vicinity of the edge of the entrance pupil and reaching the image plane.
  • Such light rays a, c, e form an optical image having a medium brightness on the image plane.
  • the light beam b transmitted through the left end of the sample A is refracted to the outside, reaches the outside of the entrance pupil, and is vignetted by the aperture stop AS.
  • Such a light ray c forms a dark optical image on the image plane.
  • the light beam d that has passed through the right end of the sample A is refracted inward and passes through the inside of the edge of the entrance pupil.
  • Such a light beam d forms a brighter optical image on the image plane.
  • a high-contrast image of the sample A is obtained that is bright on one side and shaded on the other side and looks three-dimensional.
  • the objective optical system 11 has illumination light with an angular distribution such that part of the illumination light passes through the aperture stop AS and the other part is blocked by the aperture stop AS. It is preferable that the incident angle with respect to the optical axis of the illumination light when entering the lens satisfies the following conditional expressions (1) and (2).
  • ⁇ min is the minimum value of the incident angle of the illumination light with respect to the optical axis of the objective optical system 11 (incident angle of the light beam closest to the optical axis)
  • ⁇ max is the incident angle of the illumination light with respect to the optical axis of the objective optical system 11.
  • the maximum value (incident angle of a light beam positioned radially outward with respect to the optical axis)
  • NA is the numerical aperture of the objective optical system 11.
  • the deflection angle of the prism 10 (inclination angle of the deflection surface 10a with respect to the optical axis of the objective optical system 11) is 45 °
  • the shift amount of the center position of the short side of the illumination mask 82 with respect to the optical axis of the cylindrical lens 9 ( The eccentric distance ( ⁇ ) preferably satisfies the following conditional expression (4).
  • ⁇ NA / Fl (4)
  • ⁇ NA / Fl (4)
  • conditional expressions (1) to (4) By satisfying conditional expressions (1) to (4), an image G with high contrast can be obtained even if the sample A is a phase object such as a cell. When the conditional expressions (1) to (4) are not satisfied, the contrast of the sample A is lowered.
  • the focus adjustment mechanism 5 moves the illumination optical system 7 and the imaging unit 4 integrally in the Z direction by using a linear actuator (not shown), for example. Thereby, the position of the illumination optical system 7 and the imaging unit 4 in the Z direction with respect to the stationary stage 2 can be changed, and the objective optical system group 12 can be focused on the sample A.
  • the scanning mechanism 6 moves the imaging unit 4 and the illumination optical system 7 in the X direction integrally with the focus adjustment mechanism 5 by, for example, a linear actuator that supports the focus adjustment mechanism 5.
  • the scanning mechanism 6 may be configured by moving the stage 2 in the X direction instead of the imaging unit 4 and the illumination optical system 7, and both the imaging unit 4, the illumination optical system 7, and the stage 2 may be used. May be configured to be movable in the X direction.
  • the linear illumination light emitted from the line light source 8 in the X direction is converted into a parallel light beam by the cylindrical lens 9, deflected upward by the prism 10, and emitted obliquely upward with respect to the optical axis.
  • the illumination light passes through the mounting table 2 a and the bottom plate 1 b of the container 1, is reflected obliquely downward on the upper plate 1 a, passes through the sample A, the bottom plate 1 b and the mounting table 2 a, and is collected by the plurality of objective optical systems 11. Lighted.
  • Illumination light traveling obliquely inside each objective optical system 11 is partially vignetted at the aperture stop AS, and only part of the illumination light passes through the aperture stop AS, so that an optical image of the sample A with a shadow is displayed on the image plane. tie.
  • the optical image of the sample A formed on the image plane is picked up by the line sensor 13 arranged on the image plane, and a one-dimensional image of the sample A is acquired.
  • the imaging unit 4 repeats acquisition of a one-dimensional image by the line sensor 13 while moving in the X direction by the operation of the scanning mechanism 6. Thereby, a two-dimensional image of the sample A distributed on the bottom plate 1b is acquired.
  • the image connected to the image plane by each objective optical system 11 is an inverted image. Therefore, for example, when a two-dimensional image of the sample A shown in FIG. 18A is acquired, the image is inverted in the partial image P corresponding to each objective optical system 11 as shown in FIG. 18B. In order to correct the inversion of the image, as shown in FIG. 18C, a process of inverting each partial image P in a direction perpendicular to the scanning direction is performed.
  • the line scanning type image acquisition unit 100 that acquires the two-dimensional image of the sample A by scanning the line sensor 13 with respect to the sample A, it is colorless and transparent like a cell by using oblique illumination. Even if it is a phase object, there exists an advantage that the image G with high contrast can be acquired. Further, by using the upper plate 1a of the container 1 as a reflecting member, all of the illumination unit 3, the imaging unit 4, the focus adjustment mechanism 5 and the scanning mechanism 6 are integrated below the stage 2, thereby realizing a compact device. There is an advantage that you can.
  • the illumination unit 3, the imaging unit 4, the focus adjustment mechanism 5 and the scanning mechanism 6 are housed in a sealed state in the casing below the stage 2, they can be housed in a high temperature and high humidity incubator. While culturing the sample A in the incubator, the image G can be acquired over time.
  • the prism 10 disposed in the vicinity of the objective optical system group 12 can also deal with the container 1 having a low upper plate 1a. That is, when the container 1 with the lower position of the upper plate 1a is used, in order to satisfy the conditional expressions (1) to (4), the emission position of the illumination light from the illumination unit 3 is set to the objective optical system group 12. Must be close to the optical axis. However, it is difficult to dispose the line light source 8 in the vicinity of the objective optical system group 12 because the lenses, frames, and the like of the objective optical system group 12 are in the way.
  • the prism 10 is inserted between the mounting table 2 a and the objective optical system group 12, and is slightly displaced in the radial direction above the objective optical system group 12 and from the optical axis.
  • the line light source 8 is arranged at a position away from the objective optical system group 12 in the horizontal direction. Thereby, illumination light can be emitted obliquely upward from the vicinity of the optical axis of the objective optical system group 12.
  • the illumination light is oblique from a position away from the optical axis of the objective optical system group 12. Injected upward. Therefore, as shown in FIG. 19, the prism 10 may be omitted, and the line light source 8 may be arranged at a position where illumination light is emitted obliquely upward from the line light source 8.
  • the relative positional relationship between the sample surface, the reflecting surface of the reflecting member (upper plate 1a), and the illumination optical system 7 does not change.
  • the irradiation angle of the illumination light to is constant. Therefore, in this case, the prism 10 and the cylindrical lens 9 may be omitted as shown in FIG.
  • the upper plate 1a of the container 1 is used as a reflecting member for reflecting the illumination light, instead of this, a configuration in which the illumination light is reflected by a reflecting member provided above the container 1 may be used. Good.
  • the observation apparatus 200 When the image G of the culture surface in the container 1 is acquired by the image acquisition unit 100, the acquired image G is sent to the cell region extraction unit 110.
  • the cell region extraction unit 110 extracts a plurality of cell regions by edge detection or the like in the sent image G. Then, for each extracted cell region, the cell height calculation unit 120 calculates the cell surface height dimension, and the calculated height dimension is associated with the position information of the cell surface having the height dimension. It is stored in the information storage unit 130.
  • the cell height and the position information are associated with each other and stored in the information storage unit 130.
  • the cell height and the position stored in the information storage unit 130 are stored. You may provide the display part which matches and displays information. For example, as shown in FIG. 20, the display unit displays the image G sent from the image acquisition unit 100 and superimposes it on the image G so that the extracted cell region has the maximum height dimension. Depending on the color, it may be displayed in different colors.
  • identifying whether or not it is a colony Y it is preferable to identify the colony Y based on a plurality of parameters from the area, shape, texture, and the like of the colony Y. Thereby, only the colony Y according to the objective can be made into an observation object.
  • the selection criteria may be changed according to the type of cell X or the purpose of culture. Thereby, the colony Y suitable for the purpose can be selected. In this case, if the selection criteria table is provided, the selection criteria can be easily switched. The selection criteria may be set appropriately by the observer.
  • a moving image showing the time change of the designated colony Y may be displayed. That is, when the image acquisition unit 100 acquires a plurality of whole images G at time intervals and a colony Y is designated in any of the whole images G, the whole image G in which the colony Y is designated.
  • the corresponding colonies Y in a plurality of past and future whole images G may be extracted with reference to, and the old images G may be switched and displayed in order at predetermined time intervals.
  • the center position of the colony Y is calculated, and the partial image H is cut out from the entire image G within the range where the center position of the colony Y extracted in each image G is centered in the movie. May be.
  • the blur due to the movement of the colony Y is reduced during the reproduction of the moving image, and the temporal change of the colony Y can be easily recognized.
  • the moving image display of the colony Y when the moving image display of the colony Y is performed, it is preferable to simultaneously display the entire image G displaying the partial image H including the designated colony Y and the moving image, as shown in FIG.
  • the time interval for image acquisition may be arbitrarily changed.
  • the morphological change is large, such as at the beginning of culture or at the time of photographing the cell X that moves around, errors can be reduced by reducing the time interval.
  • the cell area whose height dimension is approximate may be grouped and stored.
  • measurement regions that approximate the growth rate may be grouped based on cluster analysis, which is one of statistical methods, or based on a predetermined boundary value.
  • the illumination part 3 is provided with several illumination, and you may decide to switch arbitrarily.
  • the illumination can be switched to widen the image acquisition range. Further, by combining information from a plurality of directions, highly accurate measurement is possible.
  • the width of the line sensor 13 is preferably equal to or longer than the short side of the container 1. Thereby, the image G of the whole culture surface can be acquired by one operation.
  • the display unit displays the height dimension in association with the position information by color coding superimposed on the image G.
  • the position information and the height dimension are numerical values. May be displayed in association with each other.
  • the display unit may display the estimated cross section as shown in FIG.
  • the observation apparatus 200 is exemplified to acquire the image G in which the shadow changes according to the gradient of the cell surface by photographing in a line shape, but the shadow changes according to the gradient of the cell surface. As long as the image G to be acquired can be acquired, an image captured in a square shape may be employed.
  • a classification unit that classifies the cells X based on the height dimension calculated by the cell height calculation unit 120 may be provided. As a result, on the display unit, the classification classified by the classification unit and the position information stored in the information storage unit 130 are displayed in association with each other.
  • the cell height calculation unit 120 may calculate the height dimension of the cell surface from the direction of illumination with which the cell X is illuminated and a change in parallel shadow.
  • the image G acquired by the image acquisition unit 100 may be processed to calculate the continuous height dimension of the cell surface from the shade of the image G.

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Abstract

培養容器内に存在している特定の細胞を効率的に抽出することを目的として、培養中の細胞を撮影することにより、細胞表面の勾配に応じて陰影が変化する画像を取得する画像取得部（１００）と、画像取得部（１００）によって取得された画像を処理して、画像の陰影から細胞表面の各位置における高さ寸法を算出する細胞高算出部（１２０）と、細胞高算出部（１２０）によって算出された細胞表面の高さ寸法と位置情報とを対応づけて記憶する記憶部（１３０）とを備える観察装置（１００）である。

Description

観察装置
　本発明は、観察装置に関するものである。
　ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの万能細胞の制作過程では、遺伝子の導入や発現に失敗して、万能細胞の特性を持たない細胞が多数発生する。再生医療等に応用するには、万能細胞の特性を持たない細胞を取り除き、万能細胞のみを抽出する必要がある。
　例えば、ｉＰＳ細胞になっているか否かを見極めるには、多能性を持つ細胞が発現しているＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１等の未分化マーカと呼ばれるタンパク質を、ｑＰＣＲ法あるいは免疫染色法により検査する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特開２０１４－１００１４１号公報
　しかしながら、これらの方法はコストおよび時間がかかるため、細胞の選別は、培養作業者が、位相差顕微鏡下において、複数回分裂した細胞の集まりであるコロニーの形状を観察し、作業者の経験、培養条件およびコロニー同士を比較するなどして、ｉＰＳ細胞になっていそうなコロニーを選別することを感覚的に行っており手間がかかっていた。
　特に、コロニーが小さい場合には形状の差異も小さく、ｉＰＳ細胞であるか否かの見極めが困難であった。
　本発明は、培養容器内に存在している特定の細胞を効率的に抽出することができる観察装置を提供することを目的としている。
　本発明の一態様は、培養中の細胞を撮影することにより、細胞表面の勾配に応じて陰影が変化する画像を取得する画像取得部と、該画像取得部により取得された画像を処理して、画像の陰影から前記細胞表面の各位置における高さ寸法を算出する細胞高算出部と、該細胞高算出部により算出された前記細胞表面の高さ寸法と位置情報とを対応づけて記憶する記憶部とを備える観察装置である。
　本態様によれば、画像取得部により画像が取得されると、取得された画像が細胞高算出部により処理されて細胞表面の各位置における高さ寸法が算出される。そして、算出された細胞表面の高さ寸法は位置情報と対応づけて記憶部に記憶される。
　細胞はその培養過程における分裂等により数が変化して細胞の集合体であるコロニーの面積が変化するとともに、高さ寸法も変化し、同種の細胞は同等の高さ寸法を有することになる。本態様によれば、高さ寸法と位置情報とを対応づけて記憶することにより、観察者がいずれかの位置の細胞が観察したい細胞であることを特定できれば、記憶されている同等の高さ寸法の位置に存在する細胞を選択することにより、観察したい細胞のみを効率的に観察することができる。
　上記態様においては、前記画像取得部により取得された画像を処理して前記細胞の存在する細胞領域を抽出する細胞領域抽出部を備え、前記細胞高算出部が、前記細胞領域抽出部により抽出された前記細胞領域の各位置における前記細胞表面の高さ寸法を算出してもよい。
　この構成により、細胞領域抽出部により抽出された細胞領域の各位置について細胞表面の高さ寸法が算出され、細胞の存在しない領域についての高さ寸法の算出を省略することができる。これにより、培養容器内に存在している特定の細胞をさらに効率的に観察することができる。
　また、上記態様においては、前記記憶部に対応づけて記憶されている前記高さ寸法と前記位置情報とを対応づけて表示する表示部を備えていてもよい。
　この構成により、表示部に表示された高さ寸法によって観察したい細胞を簡易に選択して観察することができる。
　また、上記態様においては、前記表示部が、前記細胞領域抽出部により抽出された前記細胞領域を前記高さ寸法に応じて色分けして表示してもよい。
　この構成により、同程度の高さ寸法を有する細胞領域を色により簡易に特定することができ、同程度の高さ寸法を有する細胞を簡易に選択して効率的に観察することができる。
　また、上記態様においては、前記細胞高算出部が算出した前記高さ寸法に基づいて前記細胞をクラス分類する分類部を備え、前記表示部が、前記分類部によりクラス分類された分類と前記記憶部に記憶されている前記位置情報とを対応づけて表示してもよい。
　上記態様においては、前記細胞高算出部が、前記細胞に対して照明される照明の方向および平行な陰影の変化から前記細胞表面の高さ寸法を算出してもよい。
　また、上記態様においては、前記細胞高算出部が、前記画像取得部により取得された画像を処理して、該画像の陰影から前記細胞表面の連続する前記高さ寸法を算出してもよい。
　本発明によれば、培養容器内に存在している特定の細胞を効率的に抽出することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る観察装置を示すブロック図である。 図１の観察装置により取得された画像の一例を示す図である。 図２の画像から抽出された細胞領域を示す図である。 図２の画像から抽出された一の細胞領域の画像上に輝度の変化を検出する直線を表示した図である。 図４の直線に沿う図４の画像の輝度の変化を示す図である。 図５の輝度の変化から算出された図４の直線に沿う細胞表面の高さ寸法の変化を示す図である。 画像を取得する画像取得部を示す全体構成図である。 図７の画像取得部における照明光学系の一部を示す斜視図である。 図８の照明光学系におけるライン光源の一例を示す側面図である。 図９Ａのライン光源を光軸方向に見た正面図である。 図８の照明光学系におけるライン光源の他の例を示す図である。 図７の画像取得部の対物光学系群を示す図である。 図１１の対物光学系群における対物光学系の配列を示す図である。 図１１の対物光学系群における開口絞りの配列を示す図である。 図１１の対物光学系群の像面におけるラインセンサの配置を示す図である。 図８の照明光学系におけるライン光源、シリンドリカルレンズおよびプリズムの配置を示す図である。 偏斜照明の作用を説明する図である。 図１６の偏斜照明によって照明された試料の画像の一例を示す図である。 試料の一例を示す図である。 図７の画像取得部によって取得された図１８Ａの試料の２次元画像を示す図である。 図１８Ｂの画像を反転処理およびつなぎ合わせ処理することにより得られた画像を示す図である。 図７の画像取得部の他の態様におけるライン光源の配置を示す図である。 図１の観察装置により細胞表面の高さ寸法と位置情報とを対応づけて表示する表示例を示す図である。
　本発明の一実施形態に係る観察装置２００について図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る観察装置２００は、図１に示されるように、細胞の画像を取得する画像取得部１００と、取得された画像を処理することにより細胞領域を抽出する細胞領域抽出部１１０と、抽出された各細胞領域における細胞表面の各位置の高さ寸法を算出する細胞高算出部１２０と、算出された高さ寸法と位置情報とを対応づけて記憶する情報記憶部（記憶部）１３０とを備えている。細胞領域抽出部１１０および細胞高算出部１２０はプロセッサにより構成され、情報記憶部１３０はメモリあるいは記憶媒体等により構成されている。
　画像取得部１００は、培養中の細胞を撮影することにより、細胞表面の勾配に応じて陰影が変化する画像を取得するものであり、詳細については後述する。
　細胞領域抽出部１１０は、画像取得部１００により取得された図２に示されるような画像Ｇ内におけるエッジ検出や輪郭追跡により、図３に示されるように、細胞Ｘと細胞以外との境界を抽出し、その境界が閉じているものを細胞ＸあるいはコロニーＹとして認識し、その大きさから細胞ＸとコロニーＹとを区別する。
　細胞高算出部１２０は、画像取得部１００により取得された画像を処理して、画像の陰影から細胞表面の各位置における高さ寸法を算出する。
　画像取得部１００により取得された画像は、細胞表面の勾配に応じて陰影が変化するので、勾配が大きければ輝度の変化量も大きくなり、同じ勾配が連続すれば一定の輝度が連続する。
　例えば、図４に示される画像Ｈにおいて、照明方向と平行な所定の直線に沿う輝度の変化を図５に示す。そして、この輝度の変化を用いて得られる勾配を積分することにより、図６に示されるように、上記直線に沿う細胞表面の形状を算出することができる。コロニーＹのない領域の輝度を基準として、勾配の大きさと向きを推定することにより、上記直線に沿う細胞表面の各位置の相対的な高さ寸法を算出することができる。
　細胞高算出部１２０により算出された、細胞ＸあるいはコロニーＹの各位置における高さ寸法は、位置情報と対応付けて情報記憶部１３０に記憶される。
　さらに、コロニーＹの１つの直線上における高さ寸法のみならず、コロニーＹの複数位置における直線上の高さ寸法を算出し情報記憶部１３０に記憶させてもよく、コロニーＹの立体的な情報として情報記憶部１３０に記憶させてもよい。
　ここで、画像取得部１００について説明する。
　画像取得部１００は、図７に示されるように、試料（細胞）Ａを収容した容器（培養容器）１を支持するステージ２と、該ステージ２に支持された試料Ａに照明光を照射する照明部３と、試料Ａを透過した照明光をラインセンサ１３によって検出して試料Ａの画像Ｇを取得する撮像部４と、試料Ａに対する撮像部４の焦点の位置を調整するフォーカス調整機構５と、撮像部４をラインセンサ１３の長手方向に直交する走査方向に移動させる走査機構６とを備えている。照明部３、撮像部４、フォーカス調整機構５、走査機構６およびラインセンサ１３はステージ２によって上面を閉塞された筐体１０１内に密封状態に収容されている。
　以下の説明において、撮像部４の光軸（対物光学系１１の光軸）に沿う方向をＺ方向、走査機構６による撮像部４の走査方向をＸ方向、ラインセンサ１３の長手方向をＹ方向とするＸＹＺ直交座標系を用いる。画像取得部１００は、図７に示されるように、Ｚ方向が鉛直方向となり、Ｘ方向およびＹ方向が水平方向となる姿勢に配置される。
　容器１は、細胞培養用のフラスコまたはディッシュのような、全体的に光学的に透明な樹脂から形成された容器であり、互いに対向する上板１ａおよび底板１ｂを有している。試料Ａは、例えば、培地Ｂ中で培養される細胞である。上板１ａの内側の面は、照明光をフレネル反射する反射面となっている。
　ステージ２は、水平に配置された平板状の載置台２ａを備え、載置台２ａ上に容器１が載置される。載置台２ａは、照明光を透過させるように光学的に透明な材質、例えばガラスからなる。
　照明部３は、ステージ２の下方に配置され斜め上方に向けてライン状の照明光を射出する照明光学系７を備え、上板（反射部材）１ａおいて照明光が斜め下方に反射されることにより、斜め上方から照明光を試料Ａに照射する。
　具体的には、照明光学系７は、図８に示されるように、撮像部４の側方に配置され照明光を撮像部４に向かってＸ方向に発するライン光源８と、該ライン光源８から発せられた照明光を平行光束に変換するシリンドリカルレンズ（レンズ）９と、シリンドリカルレンズ９から射出された照明光を上方へ偏向するプリズム（偏向素子）１０とを備えている。
　ライン光源８は、光を射出する射出面を有する光源本体８１と、該光源本体８１の射出面上に設けられた照明マスク８２とを備えている。照明マスク８２は、Ｚ方向に延びる短辺と、Ｙ方向に延び短辺よりも長い長辺とを有する長方形の開口部８２ａを有する。射出面から発せられた光が開口部８２ａのみを透過することによって、Ｙ方向に長手方向を有するライン状の横断面（照明光の光軸に交差する断面）を有する照明光が生成される。
　図９Ａ、図９Ｂおよび図１０は、ライン光源８の具体的な構成の一例を示している。
　図９Ａおよび図９Ｂのライン光源８において、光源本体８１は、Ｙ方向に一列に配列したＬＥＤからなるＬＥＤ列８１ａと、ＬＥＤ列８１ａから発せられた光を拡散する拡散板８１ｂとを備えている。照明マスク８２は、拡散板８１ｂの射出側の面上に設けられている。
　図１０のライン光源８において、光源本体８１は、光拡散性光ファイバ８１ｃと、該光ファイバ８１ｃに光を供給する、ＬＥＤまたはＬＳＤ（Ｓｕｐｅｒｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｄｉｏｄｅ）のような光源８１ｄとを備えている。光拡散性光ファイバ８１ｃを用いることにより、ＬＥＤ列８１ａを用いた場合に比べて、照明光の光強度の均質性を高めることができる。
　シリンドリカルレンズ９は、Ｙ方向に延びＺ方向のみに湾曲する曲面をライン光源８とは反対側に有する。したがって、シリンドリカルレンズ９は、Ｚ方向に屈折力を有し、Ｙ方向に屈折力を有しない。また、照明マスク８２は、シリンドリカルレンズ９の焦点面または該焦点面の近傍に位置している。これにより、照明マスク８２の開口部８２ａから射出された発散光束の照明光は、シリンドリカルレンズ９によってＺ方向のみ曲げられて、Ｚ方向に一定の寸法を有する光束（ＸＺ平面において平行光束）に変換される。
　プリズム１０は、シリンドリカルレンズ９の光軸に対して４５°の角度をなして傾斜し、シリンドリカルレンズ９を透過した照明光を上方へ偏向する偏向面１０ａを有する。偏向面１０ａにおいて偏向された照明光は、載置台２ａおよび容器１の底板１ｂを透過し、上板１ａにおいて反射されて試料Ａを上方から照明し、試料Ａおよび底板１ｂを透過した照明光が撮像部４に入射する。
　撮像部４は、一列に配列された複数の対物光学系１１を有する対物光学系群１２と、該対物光学系群１２によって結ばれた試料Ａの光学像を撮影するラインセンサ１３とを備えている。
　各対物光学系１１は、図１１に示されるように、物体側（試料Ａ側）から順に、第１レンズ群Ｇ１、開口絞りＡＳ、および第２レンズ群Ｇ２を備えている。複数の対物光学系１１は、図１２に示されるように、光軸をＺ方向に平行に延ばしてＹ方向に配列され、同一面上に光学像を結ぶ。したがって、像面には、Ｙ方向に一列に並ぶ複数の光学像Ｉが形成される（図１４参照。）。開口絞りＡＳも、図１３に示されるように、Ｙ方向に一列に配列する。
　ラインセンサ１３は、長手方向に配列された複数の受光素子を有し、ライン状の１次元画像を取得する。ラインセンサ１３は、図１４に示されるように、複数の対物光学系１１の像面上にＹ方向に配置されている。ラインセンサ１３は、像面に光学像Ｉを結んだ照明光を検出することによって、試料Ａのライン状の１次元画像を取得する。
　隣接する対物光学系１１の間には隙間ｄが生じる。Ｙ方向において試料Ａの像に切れ目が無い画像を得るために、対物光学系群１２は以下の２つの条件を満たす。
　第１の条件は、各対物光学系１１において、図１１に示されるように、入射瞳位置が最も試料Ａ側に位置する第１レンズ群Ｇ１よりも像側に位置することである。これは、開口絞りＡＳを第１レンズ群Ｇ１の像側焦点よりも物体側に配置することによって実現している。第１の条件を満たすことにより、焦点面から第１レンズ群Ｇ１に近付くにつれて軸外主光線が対物光学系１１の光軸に近付くので、走査方向に垂直な方向（Ｙ方向）の実視野Ｆが第１レンズ群Ｇ１の直径φよりも大きくなる。したがって、隣接する２つの対物光学系１１の視野がＹ方向に互いに重なり合い、視野の欠けがない試料Ａの光学像が像面に形成される。
　第２の条件は、図１１に示されるように、各対物光学系１１の物体面から像面への投影横倍率の絶対値が１倍以下であることである。第２の条件を満たすことにより、像面には、複数の対物光学系１１によって結ばれた複数の光学像ＩがＹ方向に互いに重なり合うことなく配列する。したがって、ラインセンサ１３は、複数の対物光学系１１による複数の光学像Ｉを互いに空間的に分離して、撮像することができる。投影横倍率が１倍よりも大きい場合、Ｙ方向に隣接する２つの光学像Ｉが像面において互いに重なり合ってしまう。
　第２の条件を満たす場合であっても、実視野Ｆよりも外側を通る光が隣接する光学像に重なることを確実に防止するために、像面の近傍に照明光の透過範囲を規制する視野絞りＦＳを設けることが好ましい。
　対物光学系群１２の一例を以下に示す。
入射瞳の位置（第１レンズ群Ｇ１の最も物体側の面から入射瞳までの距離）２０．１ｍｍ
投影横倍率　－０．７５６倍
実視野Ｆ　２．６６ｍｍ
第１レンズ群Ｇ１のレンズ直径φ　２．１ｍｍ
第１レンズ群Ｇ１のＹ方向のレンズ間隔ｄ　２．３ｍｍ
視野の重なり幅Ｄ　０．３６ｍｍ（＝２．６６／２－（２．３－２．６６／２））
　ここで、照明部３は、撮像部４の光軸に対して斜め方向から試料Ａに照明光を照射する偏斜照明を行うように構成されている。具体的には、図１５に示されるように、照明マスク８２は、上述したようにシリンドリカルレンズ９の焦点面またはその近傍に位置し、かつ、照明マスク８２の短辺の中心はシリンドリカルレンズ９の光軸に対して距離Δだけ下側に偏心している。これにより、プリズム１０からは、ＸＺ平面内においてＺ方向に対して傾斜する方向に照明光が射出される。そして、略水平な上板１ａにおいて反射された照明光は、ＸＺ平面内においてＺ方向に対して斜めに試料面（対物光学系１１の焦点面）に入射し、試料Ａを透過した照明光は斜めに対物光学系１１に入射する。
　シリンドリカルレンズ９によって平行光束に変換された照明光は、照明マスク８２が短辺方向に幅を有しているので、角度分布を有する。このような照明光が対物光学系１１に斜めに入射すると、図１３において二点鎖線で示されるように、光軸側に位置する一部のみが開口絞りＡＳを通過して像面に到達し、光軸に対して外側に位置する他の部分は開口絞りＡＳの外縁によって遮られる。
　図１６は、試料Ａとして高い屈折率を有する細胞を観察する際の偏斜照明の作用を説明する図である。図１６において対物光学系１１を左から右へ移動させるものとする。照明光の入射角度が対物光学系１１の取り込み角と同等である場合、試料Ａが存在しない領域を透過した光線ａ，ｅおよび試料Ａの表面に略垂直に入射した光線ｃは、ほとんど屈折されることなく、入射瞳の辺縁の近傍を通過し、像面に到達する。このような光線ａ，ｃ，ｅは、像面において中くらいの明るさの光学像を結ぶ。
　図１６において試料Ａの左端を透過した光線ｂは、外側に屈折され、入射瞳の外側に達し、開口絞りＡＳによってケラレる。このような光線ｃは、像面において暗い光学像を結ぶ。図１６において試料Ａの右端を透過した光線ｄは、内側に屈折され、入射瞳の辺縁よりも内側を通過する。このような光線ｄは、像面においてより明るい光学像を結ぶ。上記の結果、図１７に示されるように、一方の側が明るく、他方の側に影が付き立体的に見える高コントラストの試料Ａの画像が取得される。
　対物光学系１１に斜めに入射した照明光のうち、一部が開口絞りＡＳを通過し、他の部分が開口絞りＡＳにおいて遮られるような角度分布の照明光を有するために、対物光学系１１に入射する際の照明光の光軸に対する入射角度は、下記の条件式（１）および（２）を満たすことが好ましい。
　θｍｉｎ　＞　０．５ＮＡ　　　（１）
　θｍａｘ　＜　１．５ＮＡ　　　（２）
　θｍｉｎは、対物光学系１１の光軸に対する照明光の入射角度の最小値（最も光軸側に位置する光線の入射角度）、θｍａｘは、対物光学系１１の光軸に対する照明光の入射角度の最大値（光軸に対して最も径方向外側に位置する光線の入射角度）、ＮＡは対物光学系１１の開口数である。
　上記画像取得部１００による観察において条件式（１）および（２）を満たすときにコントラストの高い試料Ａの画像が取得されることが実験的に確認されている。条件式（１）および（２）を満たすためには、シリンドリカルレンズ９の焦点距離Ｆｌと照明マスク８２の開口部８２ａの短辺の長さＬが、下記の条件式（３）を満たすことが好ましい。
　Ｌ　＞　（θｍａｘ－θｍｉｎ）Ｆｌ　　　（３）
　さらに、プリズム１０の偏向角（対物光学系１１の光軸に対する偏向面１０ａの傾斜角度）が４５°である場合、シリンドリカルレンズ９の光軸に対する照明マスク８２の短辺の中心位置のシフト量（偏心距離）Δは、下記の条件式（４）を満たすことが好ましい。
　Δ＝ＮＡ／Ｆｌ　　　（４）
　プリズムの偏向角が４５°でない場合には、偏向角の４５°からのずれ量に応じてΔが補正される。具体的には、偏向角が４５°よりも大きい場合には、Δをより大きくし、偏向角が４５°よりも小さい場合には、Δをより小さくする。
　条件式（１）～（４）を満たすことによって、試料Ａが細胞のような位相物体であっても高いコントラストの付いた画像Ｇを取得することができる。条件式（１）～（４）を満たさない場合には、試料Ａのコントラストが低下する。
　フォーカス調整機構５は、例えば図示しない直動アクチュエータによって、照明光学系７および撮像部４を一体的にＺ方向に移動させる。これにより、静止したステージ２に対する照明光学系７および撮像部４のＺ方向の位置を変更し、試料Ａに対する対物光学系群１２の焦点合わせを行うことができる。
　走査機構６は、例えばフォーカス調整機構５を支持する直動アクチュエータによって、フォーカス調整機構５と一体的に撮像部４および照明光学系７をＸ方向に移動させる。
　なお、走査機構６は、撮像部４および照明光学系７ではなく、ステージ２をＸ方向に移動させる方式で構成されていてもよく、撮像部４および照明光学系７と、ステージ２との両方をＸ方向に移動可能に構成されていてもよい。
　次に、画像取得部１００の作用について、容器１内で培養中の細胞である試料Ａを観察する場合を例に挙げて説明する。
　ライン光源８からＸ方向に発せられたライン状の照明光は、シリンドリカルレンズ９によって平行光束に変換され、プリズム１０によって上方に偏向され、光軸に対して斜め上方に射出される。照明光は、載置台２ａおよび容器１の底板１ｂを透過し、上板１ａにおいて斜め下方に向けて反射され、試料Ａ、底板１ｂおよび載置台２ａを透過し、複数の対物光学系１１によって集光される。各対物光学系１１の内部を斜めに進む照明光は、開口絞りＡＳにおいて部分的にケラレ、一部のみが開口絞りＡＳを通過することにより、陰影の付いた試料Ａの光学像を像面に結ぶ。
　像面に形成された試料Ａの光学像は、像面に配置されたラインセンサ１３によって撮像されて試料Ａの一次元画像が取得される。撮像部４は、走査機構６の作動によってＸ方向に移動しながら、ラインセンサ１３による１次元画像の取得を繰り返す。これにより、底板１ｂ上に分布する試料Ａの２次元画像が取得される。
　ここで、各対物光学系１１によって像面に結ばれる像は倒立像になる。したがって、例えば、図１８Ａに示される試料Ａの２次元画像を取得した場合、図１８Ｂに示されるように、各対物光学系１１に対応する部分画像Ｐにおいて像が倒立する。この像の倒立を補正するために、図１８Ｃに示されるように、各部分画像Ｐを走査方向に垂直な方向に反転する処理が行われる。
　対物光学系１１の投影横倍率の絶対値が１よりも大きい場合、各部分画像Ｐの縁部の視野は、隣接する部分画像Ｐの縁部の視野と重複する。この場合には、図１８Ｃに示されるように、縁部を互いに重なり合わせて部分画像Ｐをつなぎ合わせる処理が行われる。各対物光学系１１の投影横倍率が１倍である場合、このようなつなぎ合わせ処理は不要となる。
　このように、ラインセンサ１３を試料Ａに対して走査して試料Ａの２次元画像を取得するライン走査型の画像取得部１００において、偏斜照明を用いることによって、細胞のような無色透明の位相物体であっても高いコントラストの付いた画像Ｇを取得することができるという利点がある。また、容器１の上板１ａを反射部材として利用し、照明部３、撮像部４、フォーカス調整機構５および走査機構６の全てをステージ２の下方に集約することによって、コンパクトな装置を実現することができるという利点がある。
　さらに、照明部３、撮像部４、フォーカス調整機構５および走査機構６の全てをステージ２の下方の筐体内に密封状態に収容しているので、高温多湿のインキュベータ内に収容することができ、インキュベータ内で試料Ａの培養を行いながら、経時的に画像Ｇを取得することができる。
　また、対物光学系群１２の近傍に配置されたプリズム１０によって、上板１ａの低い容器１にも対応することができる。
　すなわち、上板１ａの位置が低い容器１を使用する場合、上述した条件式（１）～（４）を満たすためには、照明部３からの照明光の射出位置を、対物光学系群１２の光軸に近付ける必要がある。しかし、対物光学系群１２のレンズや枠等が邪魔となり、対物光学系群１２の近傍にライン光源８を配置することは難しい。
　そこで、図１５に示されるように、プリズム１０を、載置台２ａと対物光学系群１２との間に挿入して、対物光学系群１２の上部、かつ、光軸からわずかに径方向にずれた位置に配置し、ライン光源８を対物光学系群１２から水平方向に離れた位置に配置する。これにより、対物光学系群１２の光軸の近傍から斜め上方に向けて照明光を射出することができる。
　上板１ａの位置が高い容器１を使用する場合、偏斜照明によってコントラストの付いた試料Ａの光学像を得るためには、対物光学系群１２の光軸から離れた位置から照明光が斜め上方に射出される。したがって、図１９に示されるように、プリズム１０を省略して、ライン光源８から斜め上方に向けて照明光が射出される位置に、ライン光源８を配置してもよい。
　さらに、上板１ａの高さが同一である容器１しか使用しない場合には、試料面、反射部材の反射面（上板１ａ）および照明光学系７の相対位置関係が変化しないので、試料Ａへの照明光の照射角度は一定となる。したがって、この場合には、図１９に示されるように、プリズム１０とシリンドリカルレンズ９を省略してもよい。
　照明光を反射するための反射部材として容器１の上板１ａを利用することとしたが、これに代えて、容器１の上方に設けた反射部材によって照明光を反射する方式で構成してもよい。
　このように構成された本実施形態に係る観察装置２００の作用について以下に説明する。
　画像取得部１００により、容器１における培養面の画像Ｇが取得されると、取得された画像Ｇが細胞領域抽出部１１０に送られる。
　細胞領域抽出部１１０は、送られて来た画像Ｇにおいてエッジ検出等により複数の細胞領域を抽出する。
　そして、抽出された各細胞領域について、細胞高算出部１２０により細胞表面の高さ寸法が算出され、算出された高さ寸法と当該高さ寸法を有する細胞表面の位置情報とが対応づけられて情報記憶部１３０に記憶される。
　したがって、観察者が、画像Ｇを観察して、画像Ｇ内の一の細胞領域において特定の細胞Ｘの存在を確認した場合には、当該細胞Ｘにおける高さ寸法と同等の高さ寸法が対応づけられている位置の細胞Ｘを観察することにより、確認された特定の細胞Ｘと同等の性質を有する細胞Ｘについて選択的に観察することができる。
　すなわち、画像Ｇ内の全ての箇所を逐次観察する場合と比較して、観察したい特定の細胞Ｘと同等の性質を有する細胞Ｘを選んで観察することができ、時間と手間をかけずに、特定の細胞Ｘを選別することができる。また、細胞高さによって特定の細胞Ｘを選別するので、コロニーＹの大きさが小さい場合であっても、細胞Ｘを精度よく選別することができるという利点がある。
　なお、本実施形態においては、細胞高さと位置情報とを対応づけて情報記憶部１３０に記憶することに止めているが、本実施形態においては、情報記憶部１３０に記憶された細胞高さと位置情報とを対応づけて表示する表示部を備えていてもよい。
　例えば、図２０に示されるように、表示部が、画像取得部１００から送られて来た画像Ｇを表示するとともに、画像Ｇに重畳して、抽出された細胞領域を最大の高さ寸法に応じて色分けして表示することにしてもよい。
　また、コロニーＹか否かを識別する場合に、コロニーＹの面積、形状、テクスチャなどから複数のパラメータによって識別することが好ましい。これにより、目的に即したコロニーＹのみを観察対象とすることができる。
　また、細胞Ｘの種類あるいは培養の目的に応じて選択基準を変えてもよい。これにより、目的に即したコロニーＹを選択することができる。この場合には、選択基準のテーブルを備えていれば、選択基準の切替を容易に行うことができる。また、選択基準は観察者が適宜設定できることにしてもよい。
　さらに、観察者がいずれかの画像（全体画像）Ｇにおいて、いずれかのコロニーＹを指定したときに、指定されたコロニーＹの時間変化を示す動画を表示することにしてもよい。すなわち、画像取得部１００によって、時間間隔をあけて複数枚の全体画像Ｇを取得しておき、いずれかの全体画像ＧにおいてコロニーＹが指定された場合に、コロニーＹが指定された全体画像Ｇを基準として過去および未来の複数の全体画像Ｇにおける対応するコロニーＹを抽出し、古い画像Ｇから順に所定時間間隔で切り替えて表示すればよい。
　指定したコロニーＹを動画表示する場合に、コロニーＹの中心位置を算出し、各画像Ｇにおいて抽出されたコロニーＹの中心位置を動画の中心する範囲で全体画像Ｇから部分画像Ｈを切り出すことにしてもよい。動画再生中にコロニーＹの移動によるブレが少なくなり、コロニーＹの時間変化を視認しやすくすることができる。
　また、コロニーＹの動画表示を行う場合には、図７に示されるように、指定されたコロニーＹを含む部分画像Ｈを表示した全体画像Ｇと動画とを同時に表示することが好ましい。
　また、画像取得の時間間隔は任意に変更できることにしてもよい。培養初期や大きく動き回る細胞Ｘの撮影時等の形態変化の大きい場合には、時間間隔を小さくすることにより、誤差を減らすことができる。
　また、細胞Ｘの高さ寸法と位置情報とを対応づけて情報記憶部１３０に記憶する際に、高さ寸法の近似する細胞領域をグルーピングして記憶することにしてもよい。この場合に、統計手法の１つであるクラスター分析あるいは予め定められた境界値に基づいて、増殖速度の近似する測定領域をグルーピングしてもよい。
　また、照明部３は複数の照明を備え、任意に切り替えられることにしてもよい。容器１の壁で照明がケラレる場合に照明を切り替えて画像取得範囲を広げることができる。また、複数方向からの情報を合わせることにより、精度の高い測定が可能となる。
　また、ラインセンサ１３の幅は容器１の短辺以上であることが好ましい。これにより１回の操作によって培養面全面の画像Ｇを取得することができる。
　また、本実施形態においては、表示部が、画像Ｇに重畳した色分けによって位置情報に対応づけて高さ寸法を表示することとしたが、これに代えて、位置情報と高さ寸法とを数値によって対応づけて表示することにしてもよい。さらに表示部は、図６のような推定断面を合わせて表示してもよい。
　本実施形態においては、観察装置２００として、ライン状に撮影することによって細胞表面の勾配に応じて陰影が変化する画像Ｇを取得するものを例示したが、細胞表面の勾配に応じて陰影が変化する画像Ｇが取得可能であればよく、スクエア状に撮影するものを採用してもよい。
　以上のような構成により、焦点位置を変更した複数枚の画像Ｇを取得し解析することによって細胞Ｘの高さ寸法を算出する手間が無く、所望の焦点位置の１枚の画像Ｇに基づいて細胞Ｘの高さを算出することが可能である。これにより、容器１内に存在しているｉＰＳ細胞のような特定の細胞を効率的に抽出することができる。
　また、本実施形態においては、細胞高算出部１２０によって算出された高さ寸法に基づいて細胞Ｘをクラス分類する分類部を備えていてもよい。これにより、表示部において、分類部によりクラス分類された分類と情報記憶部１３０に記憶されている位置情報とが対応づけて表示されるようになっている。
　また、細胞高算出部１２０は、細胞Ｘに対して照明される照明の方向および平行な陰影の変化から細胞表面の高さ寸法を算出してもよい。また、画像取得部１００により取得された画像Ｇを処理して、画像Ｇの陰影から細胞表面の連続する高さ寸法を算出してもよい。
　１００　画像取得部
　１１０　細胞領域抽出部
　１２０　細胞高算出部
　１３０　情報記憶部（記憶部）
　２００　観察装置
　Ａ　試料（細胞）
　Ｇ，Ｈ　画像
　Ｘ　細胞

Claims (7)

  1. 　培養中の細胞を撮影することにより、細胞表面の勾配に応じて陰影が変化する画像を取得する画像取得部と、
    　該画像取得部により取得された画像を処理して、画像の陰影から前記細胞表面の各位置における高さ寸法を算出する細胞高算出部と、
    　該細胞高算出部により算出された前記細胞表面の高さ寸法と位置情報とを対応づけて記憶する記憶部とを備える観察装置。
  2. 　前記画像取得部により取得された画像を処理して前記細胞の存在する細胞領域を抽出する細胞領域抽出部を備え、
    　前記細胞高算出部が、前記細胞領域抽出部により抽出された前記細胞領域の各位置における前記細胞表面の高さ寸法を算出する請求項１に記載の観察装置。
  3. 　前記記憶部に対応づけて記憶されている前記高さ寸法と前記位置情報とを対応づけて表示する表示部を備える請求項２に記載の観察装置。
  4. 　前記表示部が、前記細胞領域抽出部により抽出された前記細胞領域を前記高さ寸法に応じて色分けして表示する請求項３に記載の観察装置。
  5. 　前記細胞高算出部が算出した前記高さ寸法に基づいて前記細胞をクラス分類する分類部を備え、
    　前記表示部が、前記分類部によりクラス分類された分類と前記記憶部に記憶されている前記位置情報とを対応づけて表示する請求項３に記載の観察装置。
  6. 　前記細胞高算出部が、前記細胞に対して照明される照明の方向および平行な陰影の変化から前記細胞表面の高さ寸法を算出する請求項１に記載の観察装置。
  7. 　前記細胞高算出部が、前記画像取得部により取得された画像を処理して、該画像の陰影から前記細胞表面の連続する前記高さ寸法を算出する請求項６に記載の観察装置。
     
     
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