JP2009106273A - 培養容器および細胞厚さ測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】培養の進行に伴い培養液の屈折率が変化しても、細胞の厚さ分布を精度よく測定することを可能にする。
【解決手段】透明な材質からなり、底面に細胞を接着させて培養可能な培養面１ａを有する培養容器１であって、前記培養面１ａの一部に、既知の屈折率および厚さ寸法を有する基準物質２が固定されている培養容器１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、培養容器および細胞厚さ測定方法に関するものである。

従来、培養細胞を含む全体画像から細胞画像を抽出する方法として、例えば、特許文献１に示される方法が知られている。
この方法は、顕微鏡において、細胞のフォーカス画像に対して、光軸方向両方向にフォーカス位置をずらして取得された２枚のデフォーカス画像により、観察像の干渉の際の位相差の符号が反対となる２つのコントラスト像からなる画像の差演算を行うものである。
また、フォーカス画像と２枚のデフォーカス画像とを用いて、物体の厚さ分布を測定する方法も知られている（例えば、特許文献２参照。）。物体を透過もしくは反射する光と参照光とを干渉させ、生じた干渉縞から物体の厚さ分布を測定する方法も知られている。

特開２００５−２１８３７９号公報 オーストラリア特許出願公開第２００４２０１１０９Ａ１号公報

しかしながら、物体の厚みを光学的測定する上記手法は、物体と周囲環境の屈折率の差を利用しているものであるため、物体および周囲環境の屈折率の変動による影響を受け易い。この手法を培養細胞の厚みの測定に適用した場合、培養液を貯留した培養容器内に収容されている細胞においては、培養中に、細胞が培養液内に含まれている栄養分を吸収し、培養液内に老廃物を放出するため、培養液の成分が変動する。培養液の成分が変動すると、その屈折率が変化するため、細胞の厚さ分布を精度よく測定することが困難になるという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、培養の進行に伴い培養液の屈折率が変化しても、細胞の厚さ分布を精度よく測定することができる培養容器および細胞厚さ測定装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、透明な材質からなり、底面に細胞を接着させて培養可能な培養面を有する培養容器であって前記培養面の一部に、既知の屈折率および厚さ寸法を有する基準物質が固定されている培養容器を提供する。

本発明によれば、基準物質が培養液中に没するように培養液を貯留した状態で、基準物質および培養液を貫通して所定の波長の光を透過させ、検出された光における位相情報を検出することにより、該位相情報、基準物質の既知の屈折率およびその厚さ寸法に基づいて、培養液の屈折率を推定することが可能となる。したがって、細胞の培養の進行とともに細胞による栄養分の吸収や老廃物の放出により、培養液の屈折率が変化しても、その変化した培養液の屈折率を容易に推定することができ、細胞の厚さ寸法の測定を精度よく行うことが可能となる。

また、本発明は、上記培養容器の培養面に細胞を接着させ、該細胞および前記基準物質が培養液中に没するように培養液を貯留して培養された細胞の厚さ寸法を測定する方法であって、前記細胞、前記基準物質および前記培養液を貫通して所定の波長の光を透過させ、透過した光を撮影することにより位相情報の２次元的な分布を示す位相情報画像を取得する撮影ステップと、前記基準物質の位置における位相情報、前記基準物質の厚さ寸法およびその屈折率に基づいて培養液の屈折率を算出する屈折率算出ステップと、前記細胞の位置における位相情報および前記屈折率算出ステップにおいて算出された培養液の屈折率に基づいて前記細胞の厚さ寸法を算出する厚さ算出ステップとを備える細胞厚さ測定方法を提供する。

本発明によれば、撮影ステップにおいて、透明な材質からなる培養容器の下方または上方から所定の波長を有する光を入射させ、培養容器、培養容器の培養面に接着させられて培養されている細胞およびその上方を覆っている培養液を貫通して、上方または下方において透過してきた光を検出することにより、細胞および培養液の屈折率に応じて位相が変化した光の情報を含んだ画像が取得され、従来の手法を用いて、上記画像より位相情報抽出した位相情報画像を得ることができる。したがって、屈折率算出ステップにおいて、基準物質の位置における位相情報、基準物質の厚さ寸法および屈折率を用いて培養液の屈折率を算出することができる。

そして、この後に、厚さ算出ステップでは、細胞の位置における位相情報、細胞の屈折率および算出された培養液の屈折率を用いて細胞の厚さ寸法を精度よく算出することができる。
すなわち、細胞の厚さ寸法の算出に先立って、培養液の屈折率を算出するので、細胞の培養の進行に伴う培養液中の栄養分の減少や細胞からの老廃物の増加によって培養液の屈折率が変動しても、細胞の厚さ寸法を精度よく算出することができる。

本発明によれば、培養の進行に伴い培養液の屈折率が変化しても、細胞の厚さ分布を精度よく測定することができるという効果を奏する。このため、培養を継続しながら細胞の３次元形状の変化の観察したり、細胞厚さ分布の変化などを計測することができるという効果も奏する。

本発明の一実施形態に係る培養容器および細胞厚さ測定方法について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１は、図１に示されるように、透明な材質からなるシャーレ状の容器であって、接着性の細胞を接着させて培養するための培養面１ａを底面に有するとともに、該培養面１ａの少なくとも一部に、既知の屈折率および厚さ寸法を有する基準物質２を固定して構成されている。

基準物質２としては、均一な屈折率と正確な厚さ寸法を有する物質であれば、その材料に限定はないが、例えば、ポリスチレンのような生体親和性のある材料からなることが好ましい。また基準物質２は、測定に影響を与えない程度に極めて薄い接着剤層を介して培養面１ａに接着されている。なお、基準物質２の周囲の培養面１ａには細胞が接着しないように配置したり、処理を施したりしてもよい。

本実施形態に係る細胞厚さ測定方法は、図４に示されるように、撮影ステップＳ１と、培養液３の屈折率ｎＬを算出する屈折率算出ステップＳ２と、算出された培養液３の屈折率ｎＬに基づいて細胞の厚さ寸法を算出する厚さ算出ステップＳ３とを備えている。

撮影ステップＳ１は、図２に示されるように、上記培養容器１の培養面１ａに測定したい細胞Ｓを接着させ、該細胞Ｓおよび前記基準物質２の厚さ寸法よりも深い培養液３を貯留した培養工程のいずれかの時点で、これら細胞Ｓ、基準物質２および培養液３を貫通して所定の波長の光Ｌを透過させ、透過した光ＬをＣＣＤのような２次元的な撮像素子４によって撮影することにより行われる。撮影ステップＳ１は、フォーカス画像と２枚のデフォーカス画像とを用いた従来の方法によって、位相情報の２次元的な分布を示す位相情報画像を取得するようになっている。

撮影ステップＳ１において撮影された位相情報画像は、例えば、当該位相情報画像上において、基準物質２を通る任意の一直線上の位相情報を抽出することにより、図３に示されるように、多数の位相情報の一次元的な分布として捉えることができる。

屈折率算出ステップＳ２は、基準物質２とその周囲の位相情報を用いて培養液３の屈折率ｎＬを算出するようになっている。
具体的には、培養液３の深さｄＬ、培養液３の屈折率ｎＬ、基準物質２の厚さ寸法ｄＣ、基準物質２の屈折率ｎＣ、透過させる光の波長λ、基準物質２の位置における位相情報ΔφＣ、その周囲における位相情報ΔφＬとする。基準物質２の位置においては、培養液の深さｄＬの内の厚さ寸法ｄＣ分だけ基準物質２が占有しており、その周囲においては深さｄＬの全長にわたって培養液３で満たされている。

したがって、基準物質２の位置とその周囲とでは、基準物質２の厚さ寸法ｄＣ分だけ屈折率の異なる領域が存在するので、その屈折率差Δｎ１＝（ｎＣ−ｎＬ）および厚さ寸法ｄＣに応じた位相差Δφ１が発生する。すなわち、
Δφ１＝Δｎ１×λ×ｄＣ （１）
となる。
基準物質２の屈折率ｎＣ、光の波長λおよび基準物質２の厚さ寸法ｄＣは既知なので、式（１）を変形して、
ｎＬ＝ｎＣ−Δφ１／（λ×ｄＣ） （２）
により、測定により求めた位相差Δφ１を代入することで、培養液３の屈折率ｎＬを算出することができる。

厚さ算出ステップＳ３は、同様にして、細胞Ｓとその周囲の位相情報を用いて細胞Ｓ各部の厚さ寸法を算出するようになっている。
具体的には、培養液３の深さｄＬ、培養液３の屈折率ｎＬ、細胞Ｓの厚さ寸法ｄＳ、細胞Ｓの屈折率ｎＳ、細胞Ｓの特定位置における位相情報ΔφＳとする。細胞Ｓの位置においては、培養液３の深さｄＬの内の厚さ寸法ｄＳ分だけ細胞Ｓが占有しており、細胞Ｓの周囲においては深さｄＬの全長にわたって培養液３で満たされている。

したがって、細胞Ｓの特定位置と細胞Ｓの周囲とでは、細胞Ｓの厚さ寸法ｄＳ分だけ屈折率の異なる領域が存在するので、その屈折率差Δｎ２＝（ｎＳ−ｎＬ）および厚さ寸法ｄＳに応じた位相差Δφ２が発生する。すなわち、
Δφ２＝Δｎ２×λ×ｄＳ （３）
となる。
光の波長λは既知であり、式（２）により求められた培養液３の屈折率ｎＬおよび別途測定により決定された細胞Ｓの屈折率ｎＳ、測定により求められた位相差Δφ２を用いて、細胞Ｓの厚さ寸法ｄＳを式（４）により求めることができる。
ｄＳ＝Δφ２／（λ×Δｎ２） （４）

このように、本実施形態に係る培養容器１によれば、基準物質２を用いて培養液３の屈折率ｎＬを測定し、測定された培養液の屈折率ｎＬを用いて細胞Ｓの厚さ寸法を測定する。したがって、培養中に、培養の進行とともに細胞Ｓによる栄養分の吸収や老廃物の放出により、培養液３の屈折率ｎＬが変化しても、その変化した培養液ｎＬの屈折率を容易に測定することができ、細胞Ｓの厚さ寸法の測定を精度よく行うことができるという利点がある。
ここで、位相情報画像を取得する手法としては、フォーカス画像とデフォーカス画像とを用いた方法について説明したが、本手法に限定されるものではなく、透過光と参照光との干渉縞による位相情報取得手段であってもよい。

本発明の一実施形態に係る培養容器を示す縦断面図である。 図１の培養容器を用いた本実施形態に係る細胞の厚さ寸法の測定方法を説明する図である。 図２の測定方法において取得された位相情報画像の一直線上における位相情報の分布を示すグラフである。 図２の測定方法を示すフローチャートである。

符号の説明

ｄＣ，ｄＬ，ｄＳ 厚さ寸法
ΔφＣ，ΔφＬ，ΔφＳ 位相情報
ｎＣ，ｎＬ，ｎＳ 屈折率
Ｓ 細胞
Ｓ１ 撮影ステップ
Ｓ２ 屈折率算出ステップ
Ｓ３ 厚さ算出ステップ
１ 培養容器
１ａ 培養面
２ 基準物質
３ 培養液

Claims (2)

1. 透明な材質からなり、底面に細胞を接着させて培養可能な培養面を有する培養容器であって、
   前記培養面の一部に、既知の屈折率および厚さ寸法を有する基準物質が固定されている培養容器。
2. 請求項１に記載の培養容器の培養面に既知の屈折率を有する細胞を接着させ、該細胞および前記基準物質の厚さ寸法よりも深い培養液を貯留して培養された細胞の厚さ寸法を測定する方法であって、
   前記細胞、前記基準物質および前記培養液を貫通して所定の波長の光を透過させ、透過した光を撮影することにより位相情報の２次元的な分布を取得する撮影ステップと、
   前記基準物質の位置における位相情報、前記基準物質の厚さ寸法およびその屈折率に基づいて培養液の屈折率を算出する屈折率算出ステップと、
   前記細胞の位置における位相情報、細胞の屈折率および前記屈折率算出ステップにおいて算出された培養液の屈折率に基づいて前記細胞の厚さ寸法を算出する厚さ算出ステップとを備える細胞厚さ測定方法。

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