WO2019167983A1 - 医薬組成物、包装体及びその製造方法 - Google Patents

医薬組成物、包装体及びその製造方法 Download PDF

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美音 樋口
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    • C12Y402/0202—Chondroitin-sulfate-ABC endolyase (4.2.2.20)
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    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02004—Chondroitin ABC lyase (4.2.2.4), i.e. chondroitinase

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing a glycolytic enzyme as an active ingredient, a package containing the same in a container, and a method for producing the same.
  • compositions containing glycolytic enzymes as active ingredients are used in various disease fields.
  • glycolytic enzyme such as Audrazyme®, Eraplace®, Nagrazyme®, Ripregal®, and Bimidim®
  • the pharmaceutical composition for treating lysosomal diseases is commercially available as a liquid preparation for injection.
  • International Publication No. 2012/081227 describes a therapeutic agent for intervertebral disc herniation containing a glycolytic enzyme (particularly chondroitinase ABC) as an active ingredient.
  • freeze-dried preparations are superior in that logistics costs can be reduced.
  • the titer of an enzyme may be greatly reduced by lyophilization, and it is even more so if the enzyme is in a trace amount. Therefore, when producing a lyophilized preparation, a device is devised so that a product having a desired enzyme activity can be produced.
  • a device is devised so that a product having a desired enzyme activity can be produced.
  • an enzyme that greatly exceeds the number of units required for a single dose is placed in a container and then lyophilized.
  • a freeze-dried preparation is obtained.
  • the administration liquid containing the active ingredient required for one administration is prepared by fractionating the amount required for administration.
  • one aspect of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing a glycolytic enzyme as an active ingredient, wherein the decrease in titer associated with formulation by freeze-drying is suppressed. .
  • the present inventors have found a means for providing a pharmaceutical composition containing a glycolytic enzyme capable of suppressing a decrease in titer before and after lyophilization, and have completed the present invention. .
  • One aspect of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a freeze-dried saccharolytic enzyme having a titer of 0.3 unit / ⁇ g or more as an active ingredient and a unit dose preparation having the enzyme amount of 2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less.
  • a freeze-dried saccharolytic enzyme having a titer of 0.3 unit / ⁇ g or more as an active ingredient and a unit dose preparation having the enzyme amount of 2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a package comprising a pharmaceutical composition and a container for storing the pharmaceutical composition, the step of storing a solution containing 2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less of a glycolytic enzyme in the container, Freeze-dried to obtain a unit dose pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutical composition containing a freeze-dried glycolytic enzyme in which a decrease in titer due to freeze-drying is greatly suppressed.
  • process is not limited to an independent process, and is included in the term if the intended purpose of the process is achieved even when it cannot be clearly distinguished from other processes. .
  • content of each component in a composition means the total amount of the said some substance which exists in a composition, unless there is particular notice, when the substance applicable to each component exists in a composition in multiple numbers.
  • the pharmaceutical composition is a lyophilized preparation containing a glycolytic enzyme as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition is a unit dose preparation containing lyophilized glycolytic enzyme having a titer of 0.3 unit / ⁇ g or more as an active ingredient, and the amount of the glycolytic enzyme is 2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less.
  • the “unit dose” is a necessary amount prepared for a single dose, and a unit dose preparation is obtained by formulating a pharmaceutical composition in a unit dose.
  • a unit dose can contain, in addition to an effective amount, the replenishment amount necessary for preparing a single administration solution.
  • the pharmaceutical composition In the pharmaceutical composition, the decrease in the titer of glycolytic enzyme due to freeze-drying is greatly suppressed. Moreover, the fall of the titer by storage is also suppressed significantly. Furthermore, since the pharmaceutical composition is a freeze-dried preparation prepared in advance for each unit dose, it is an excellent pharmaceutical composition from the viewpoint of convenience, hygiene, safety, etc. in the medical field.
  • the package includes at least a container and a pharmaceutical composition accommodated in the container, and the pharmaceutical composition is accommodated in the container.
  • “Saccharolytic enzyme” is not particularly limited as long as it can be used in medicine.
  • glycolytic enzymes glycosaminoglycan degrading enzyme; glycosidase; peptide: N-glycanase (PNGaseF, endoglycosidase H, etc.), ⁇ -L-iduronidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase, ⁇ -Glucocerebrosidase, idursulfase, iduronic acid-2-sulfatase, N-acetylgalactosamine-6-sulfatase, N-acetylgalactosamine-4-sulfatase and the like.
  • glycosaminoglycan degrading enzymes include keratanases such as keratanase I and keratanase II; heparinases such as heparinase I, heparinase II and heparinase III; -III, heparitinases such as heparitinase T-IV; chondroitinases such as chondroitinase ABC, chondroitinase ACI, chondroitinase ACII, chondroitinase ACIII, chondroitinase B, chondroitinase C; Examples include hyaluronidase and hyaluronidase such as hyaluronidase derived from streptococci. Examples of glycosidases include ⁇ -galactosidase and ⁇ -galactosidase derived from microorganisms.
  • glycosaminoglycan degrading enzyme is used as the glycolytic enzyme.
  • glycosaminoglycan degrading enzymes include hyaluronidase, chondroitinase, heparinase, keratanase, heparanase, heparitinase and the like.
  • chondroitinase is preferable, chondroitinase ABC, chondroitinase B, chondroitinase ACI, and chondroitinase ACII are more preferable, and chondroitinase ABC is particularly preferable.
  • Chondroitinase ABC may be a chondrase.
  • the origin of the glycolytic enzyme is not particularly limited.
  • a microbial glycolytic enzyme is employed.
  • microorganisms include, for example, Bacillus sp., Escherichia sp., Pseudomonas sp., Flavobacterium sp., Proteus sp., Arthrobacter sp., Streptococcus sp., Bacteroides sp., Aspergillus sp.
  • examples include the genus Myces.
  • the glycolytic enzyme is chondroitinase ABC
  • one derived from Proteus vulgaris for example, chondroitinase ABC derived from Proteus vulgaris
  • chondroitinase ABC derived from Proteus vulgaris
  • the method for producing a glycolytic enzyme is not particularly limited.
  • An exemplary method for producing a glycolytic enzyme includes a step of obtaining a culture of microorganisms or animal cells that produce the glycolytic enzyme, and a step of recovering the glycolytic enzyme from the culture.
  • the glycolytic enzyme produced by the microorganism may be one inherently possessed by the microorganism, or obtained by modifying the microorganism so as to produce the target enzyme by a genetic engineering technique described later. It may be a thing.
  • the glycolytic enzyme is chondroitinase ABC
  • it may be produced by culturing microorganisms such as Proteus vulgaris, etc., and produced by genetic engineering techniques using DNA or the like encoding chondroitinase ABC You may let them.
  • the glycolytic enzyme may have the same amino acid sequence as that inherently possessed by an organism, but some amino acids are deleted, substituted and / or added as long as the desired purpose as a pharmaceutical product can be achieved. It may be equal.
  • microorganism examples include, but are not limited to, those belonging to the genus Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Proteus, Arthrobacter, Streptococcus, Bacteroides, Aspergillus, Elizabetokingia, and Streptomyces. It can be illustrated.
  • the growth conditions (medium, culture conditions, etc.) of the microorganism are appropriately selected according to the microorganism to be used, and can be arbitrarily set by those skilled in the art. By producing a saccharolytic enzyme using a microorganism, it is possible to produce a large amount at a lower cost than when a saccharolytic enzyme is produced using animal cells.
  • the method for producing a glycolytic enzyme may include a step of introducing a recombinant vector expressing a gene encoding the target glycolytic enzyme into the host.
  • a recombinant vector expressing a gene encoding the target glycolytic enzyme into the host.
  • an appropriate expression vector such as a phage vector or plasmid vector
  • the vector is appropriately selected according to the host cell. More specifically, such host-vector systems include E. coli and prokaryotic cells such as pET series, pTrcHis, pGEX, pTrc99, pKK233-2, pEZZ18, pBAD, pRSET, and pSE420.
  • mammalian cells such as COS-7 cells and HEK293 cells
  • expression vectors for mammalian cells such as pCMV series, pME18S series, and pSVL
  • insect cells yeasts, Bacillus subtilis as host cells
  • various vectors corresponding to these are exemplified.
  • a vector constructed so as to express a fusion protein of a protein encoded by the incorporated gene and a marker peptide or a signal peptide can be used.
  • the peptide include protein A, insulin signal sequence, His, FLAG, CBP (calmodulin binding protein), GST (glutathione-S-transferase) and the like.
  • it is treated with restriction enzymes so that the inserted nucleic acid sequence and the vector can be ligated according to conventional methods, and blunting or ligation of the sticky ends is performed as necessary. Thereafter, the inserted nucleic acid sequence and the vector can be ligated.
  • Transformation with a host vector can be performed by a conventional method.
  • a vector can be introduced into a host and transformed by a method using a commercially available transfection reagent, a DEAE-dextran method, an electroporation method, a gene gun method, or the like.
  • the growth conditions (medium, culture conditions, etc.) of microorganisms or animal cells that produce glycolytic enzymes are appropriately selected according to the microorganisms and cells used.
  • a medium appropriately prepared with LB medium or the like as a main component can be used.
  • COS-7 cells when used as host cells, they can be cultured at 37 ° C. using a DMEM medium containing about 2% (v / v) fetal calf serum.
  • Recovery of the glycolytic enzyme from the growth can be performed by a known protein extraction / purification method according to the form of the glycolytic enzyme produced.
  • the glycolytic enzyme when the glycolytic enzyme is produced in a soluble form secreted into the culture medium (culture supernatant), the culture medium may be collected and used as it is as a glycolytic enzyme.
  • a method using a nitrogen cavitation device, homogenization, glass bead mill method, sonication, osmotic shock And extraction by cell disruption such as freeze-thaw method, surfactant extraction, or a combination thereof.
  • Glycolytic enzymes are salted out, ammonium sulfate fractionation, centrifugation, dialysis, ultrafiltration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, gel permeation chromatography, affinity chromatography, You may refine
  • Saccharolytic enzymes may be used alone or in combination of two or more.
  • glycolytic enzymes are acetylated, polyalkylene glycolated (eg, polyethylene glycolated), alkylated, acylated, biotinylated, labeled (eg, labels for fluorescent materials, luminescent materials, etc.), phosphorylated, sulfated
  • a conventionally known chemical modification group may be added.
  • the pharmaceutical composition can include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier includes conventional excipients, binders, buffers, water for injection, isotonic agents, preservatives, soothing agents, etc. Is exemplified.
  • Examples of the buffer include hydrochloric acid, sodium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, aminoacetic acid,
  • Examples include a buffer containing at least one kind of sodium benzoate, citric acid, sodium citrate, acetic acid, sodium acetate, tartaric acid, sodium tartrate, lactic acid, sodium lactate, ethanolamine, arginine, ethylenediamine, and dihydrogen phosphate Sodium and disodium hydrogen phosphate are preferred.
  • tonicity agents examples include sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, glucose, propylene glycol and the like.
  • compositions include dextrans, sucrose, lactose, maltose, xylose, trehalose, mannitol, xylitol, sorbitol, inositol, serum albumin, gelatin, creatinine, polyalkylene glycol, nonionic Surfactants (for example, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, sucrose fatty acid ester, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol) and the like, among which sucrose and / or polyalkylene glycol are preferable, Sucrose and / or polyethylene glycol are more preferred.
  • nonionic Surfactants for example, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, sucrose fatty acid ester, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol
  • sucrose and / or polyalkylene glycol are preferable, Sucrose and / or polyethylene glycol are more preferred.
  • the polyethylene glycol preferably has an average molecular weight of 200 or more and 25000 or less, more preferably a solid at room temperature, for example, an average molecular weight of 2000 or more and 9000 or less, more preferably 3000 or more and 4000 or less. preferable.
  • examples of the polyethylene glycol include those having an average molecular weight of 3250, 3350, and 4000.
  • the weight ratio of polyethylene glycol / sucrose is generally in the range of 1/10 to 10/1. The weight ratio is more preferably about 2/1.
  • the “container” is not particularly limited as long as it can accommodate a pharmaceutical composition.
  • the container include a syringe, a vial, an ampoule, and a syringe, and a vial is preferable.
  • the material of the container include glass and plastic, and glass is preferable.
  • the glass include borosilicate glass and soda lime glass.
  • the container preferably further has a plug member or cap, and more preferably has a rubber plug.
  • a container is not specifically limited, 0.5 mL or more and 100 mL or less are illustrated, 1 mL or more and 10 mL or less are preferable, 2 mL or more and 4 mL or less are more preferable, and 3 mL is still more preferable.
  • the package in which the pharmaceutical composition is contained in a container may be filled with an inert gas such as nitrogen gas or argon gas, or may be deaerated.
  • the water content of the freeze-dried preparation is, for example, 5% (w / w) or less, preferably 3% (w / w) or less, and more preferably 2% (w / w) or less.
  • the water content is a value measured by a coulometric titration method.
  • the amount of glycolytic enzyme per unit dose of the pharmaceutical composition is 2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less.
  • the lower the amount of the enzyme the more markedly the titer decreases before and after lyophilization.
  • the amount of glycolytic enzyme per unit dose of the pharmaceutical composition is 2 ⁇ g or more and 7 ⁇ g or less, 2 ⁇ g or more and 6 ⁇ g or less, or 2.5 ⁇ g or more. 6 ⁇ g or less.
  • the amount of glycolytic enzyme per unit dose of the pharmaceutical composition is 2 ⁇ g or more and 5 ⁇ g or less, or 2.5 ⁇ g or more and 5 ⁇ g or less. In a particularly preferred embodiment, the amount of glycolytic enzyme per unit dose of the pharmaceutical composition is 3 ⁇ g or more and 5 ⁇ g or less.
  • the amount of glycolytic enzyme per container is 2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less. In a more preferred embodiment, the amount of glycolytic enzyme per container is 2 ⁇ g or more and 7 ⁇ g or less, 2 ⁇ g or more and 6 ⁇ g or less, or 2.5 ⁇ g or more and 6 ⁇ g or less. In a more preferred embodiment, the amount of glycolytic enzyme per container is 2 ⁇ g or more and 5 ⁇ g or less, or 2.5 ⁇ g or more and 5 ⁇ g or less. In a particularly preferred embodiment, the amount of glycolytic enzyme per container is 3 ⁇ g or more and 5 ⁇ g or less.
  • “Titer” means the activity (unit) of an enzyme with respect to 1 ⁇ g of a glycolytic enzyme, and is expressed in units / ⁇ g.
  • the freeze-dried glycolytic enzyme has a titer of 0.3 (unit / ⁇ g) or more.
  • the freeze-dried glycolytic enzyme has a titer of 0.3 (unit / ⁇ g) or more and 1 (unit / ⁇ g) or less.
  • the titer of the lyophilized glycolytic enzyme is not less than 0.32 (unit / ⁇ g) and not more than 1 (unit / ⁇ g).
  • the freeze-dried glycolytic enzyme has a titer of 0.34 (unit / ⁇ g) or more and 1 (unit / ⁇ g) or less. In a further preferred embodiment, the freeze-dried glycolytic enzyme has a titer of 0.36 (unit / ⁇ g) or more and 1 (unit / ⁇ g) or less. In another particularly preferred embodiment, the lyophilized glycolytic enzyme has a titer of 0.38 (unit / ⁇ g) or more and 1 (unit / ⁇ g) or less.
  • the lyophilized glycolytic enzyme has a titer of 0.3 (unit / ⁇ g) or more and 0.5 (unit / ⁇ g) or less. In another embodiment, the titer of the lyophilized glycolytic enzyme is not less than 0.36 (unit / ⁇ g) and not more than 0.5 (unit / ⁇ g).
  • Unit (U, unit) indicates the activity of a glycolytic enzyme, and 1 U is a degradation product equivalent to 1 micromole from a substrate per unit time under optimum temperature and optimum pH conditions. Is the amount that liberates.
  • the glycolytic enzyme is chondroitinase ABC
  • one unit is 1 from sodium chondroitin sulfate (chondroitin sulfate sodium salt that conforms to Japanese Pharmacopoeia Standard 2002) under conditions of pH 8.0 and 37 ° C. It means the amount that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide per minute.
  • the enzyme activity per unit dose (enzyme activity of glycolytic enzyme) is, for example, 4 units or less. In another embodiment, the enzyme activity per unit dose is, for example, 0.1 unit or more and 4 units or less. In a preferred embodiment, the enzyme activity per unit dose is 0.5 units or more and 3 units or less. In a more preferred embodiment, the enzyme activity per unit dose is 0.9 unit or more and 3 units or less, or 0.9 unit or more and 2.5 units or less. In another preferred embodiment, the enzyme activity per unit dose is 0.9 unit or more and 2 units or less, 1.25 unit or more and 2 units or less, or 1.5 units.
  • the enzyme activity per container is, for example, 4 units or less. In another embodiment, the enzyme activity per container is, for example, 0.1 unit or more and 4 units or less. In a preferred embodiment, the enzyme activity per container is 0.5 unit or more and 3 units or less. In a more preferred embodiment, the enzyme activity per container is 0.9 unit or more and 3 units or less, or 0.9 unit or more and 2.5 units or less. In another preferred embodiment, the enzyme activity per container is 0.9 unit or more and 2 units or less, 1.25 unit or more and 2 units or less (for example, 1.5 units).
  • a pharmaceutical composition in the form of a lyophilized unit dose preparation containing a small amount (2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less) of a glycolytic enzyme having a high titer (0.3 unit / ⁇ g or more).
  • the enzyme activity of the glycolytic enzyme contained in the pharmaceutical composition in the form of a freeze-dried preparation is, for example, 75% or more and 80% or more when the value of the enzyme activity before freeze-drying is 100%. It is preferably 85% or more, more preferably 90% or more. If this is 100%, the enzyme activity values are equal before and after lyophilization.
  • a pharmaceutical composition having storage stability of 12 months or more can be provided.
  • the pharmaceutical composition has a storage stability of 24 months or longer, and in a more preferred embodiment, the pharmaceutical composition has a storage stability of 36 months or longer.
  • the upper limit of storage stability is not particularly limited, but may be, for example, 48 months or less (for example, 36 months or less).
  • “having storage stability” means predetermined conditions (for example, 12 months or more at 5 ° C. ⁇ 3 ° C., 6 months or more at 25 ° C. ⁇ 2 ° C., or 3 months or more at 40 ° C. ⁇ 2 ° C. or It means that the titer (%) after being stored in the dark for 6 months or longer is maintained to a pharmaceutically acceptable level.
  • “storage stability” is evaluated by, for example, the residual titer rate (%).
  • the residual titer ratio after storing the sample for 12 months or more while shielding light at 5 ° C. ⁇ 3 ° C. is, for example, 90% or more, and preferably 95% or more.
  • the residual titer rate after storing the sample for 24 months or more while shielding light at 5 ° C. ⁇ 3 ° C. is, for example, 90% or more, and preferably 95% or more.
  • the residual titer ratio after storing the sample for 36 months or longer with light shielding at 5 ° C. ⁇ 3 ° C. is, for example, 90% or more, and preferably 95% or more.
  • the residual titer ratio after storing the sample for 6 months or more while shielding light at 25 ° C. ⁇ 2 ° C. is, for example, 90% or more, and preferably 95% or more.
  • the residual titer rate after the sample is stored in the dark at 40 ° C. ⁇ 2 ° C.
  • the residual titer after storing the sample at 40 ° C. ⁇ 2 ° C. for 6 months or more is, for example, 65% or more, preferably 70% or more, and more preferably 75% or more.
  • the “titer residual ratio (%)” means that the pharmaceutical composition or package according to the present invention is subjected to conditions at a predetermined temperature (for example, 5 ° C. ⁇ 3 ° C., 25 ° C. ⁇ 2 ° C. or 40 ° C. ⁇ 2 ° C.).
  • the titer (%) after being stored while being shielded from light below is a value calculated with the titer at the start of storage as 100%. If this is 100%, the value of enzyme activity is equal before and after the start of storage.
  • a pharmaceutical composition having an effective period of 12 months or more can be provided.
  • it is a pharmaceutical composition having an effective period of 24 months or longer, and in a more preferred embodiment, it is a pharmaceutical composition having an effective period of 36 months or longer.
  • the upper limit of the effective period is not particularly limited, and may be, for example, 48 months or less (for example, 36 months or less).
  • the “effective period” means a certain storage method (for example, 5 ° C. ⁇ 3 ° C. under shading, 25 ° C. ⁇ 2 ° C. under shading or 40 ° C. ⁇ from the time when the medicinal product is confirmed to be useful. When stored at 2 ° C. under shading), it means a period during which the same usefulness as a medicinal product at the time of confirmation can be expected.
  • the pharmaceutical composition may include “a pharmaceutical composition contained in a container”.
  • the pharmaceutical composition contained in the container comprises a unit dose of glycolytic enzyme.
  • the use of the pharmaceutical composition various known uses can be selected as the use of the glycolytic enzyme.
  • the use of the pharmaceutical composition containing a glycolytic enzyme as an active ingredient is not particularly limited, and examples include treatment of hernia, lysosomal disease, keloid, hypertrophic scar, muscular dystrophy, or spinal cord injury.
  • the pharmaceutical composition is used for the treatment of hernias.
  • it is used for the treatment of disc herniation (eg, lumbar disc herniation).
  • treatment includes not only complete cure but also improvement of some or all symptoms of the disease, and suppression of the progression of the disease (including maintenance and reduction in the rate of progression) and prevention.
  • prevention includes preventing the occurrence of various symptoms in advance when various symptoms associated with the disease have not occurred.
  • prevention refers to, for example, preventing the occurrence of an organic lesion in advance when there are various symptoms associated with the disease even though no clear organic lesion has been observed. Inhibiting the development of unsymptomd symptoms.
  • an active ingredient and “effective amount” are amounts that are commensurate with a reasonable risk / benefit ratio, and have a desired level without excessive adverse side effects (toxicity, irritation, etc.). Meaning the amount of a component sufficient to obtain a response.
  • the “as an active ingredient” and “effective amount” can vary depending on various factors such as symptoms, physique, age, and sex of the patient to be administered. However, those skilled in the art need not conduct individual tests for each combination of elements, but based on the results of one or more specific test examples and common general knowledge, the effective amount in other cases Can be determined.
  • patient means an animal, preferably a mammal (eg, human, mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, dog, cat, horse, etc.), more preferably a human.
  • mammal eg, human, mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, dog, cat, horse, etc.
  • the pharmaceutical composition contained in the container is provided in a sterile state.
  • the sterilization method of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and can be performed by a conventionally known method such as filtration sterilization or dry heat sterilization.
  • the administration form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the disease to be treated, symptoms, severity, patient attributes (for example, age, etc.) and the like.
  • the lyophilized preparation can be used by dissolving in any solvent (for example, water for injection, physiological saline, etc.).
  • examples of the administration form include any administration route such as intravertebral injection, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, and infusion.
  • the dose of the pharmaceutical composition can also be appropriately determined by those skilled in the art depending on the disease to be treated, symptoms, severity, patient attributes (eg, age, etc.) and the like.
  • Kit In one embodiment, a package comprising the pharmaceutical composition contained in a container, and the pharmaceutical composition for the treatment of hernia, lysosomal disease, keloid, hypertrophic scar, muscular dystrophy, or spinal cord injury
  • a kit is provided that includes a package insert or label explaining the use of
  • kits describes the use of the pharmaceutical composition for the treatment of herniosis, lysosomal disease, keloid, hypertrophic scar, muscular dystrophy, or spinal cord injury, as well as a package comprising the pharmaceutical composition contained in a container. It only needs to contain a document or label. That is, it may further contain other components.
  • One aspect of the present invention is a method for manufacturing a packaged body in which a pharmaceutical composition is contained in a container, and includes a first step of storing a solution containing 2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less of a glycolytic enzyme in a container. And a second step of lyophilizing the solution to obtain a unit dose pharmaceutical composition.
  • the solvent used for the preparation of the solution containing the glycolytic enzyme is not particularly limited, and for example, a buffer solution such as water, physiological saline, or phosphate buffer may be employed.
  • the solution may contain a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • the pH of the solution containing the glycolytic enzyme contained in the container is not particularly limited, but is preferably in the range of 6.5 to 7.5.
  • a solution containing a glycolytic enzyme is accommodated in a container so that the enzyme activity per container is 4 units or less.
  • the solution is stored in a container so that the enzyme activity per container is 0.5 unit or more and 4 units or less.
  • the solution is stored in a container so that the enzyme activity per container is 1 unit or more and 3 units or less.
  • the solution is stored in the container so that the enzyme activity per container is 1.25 units or more and 2.5 units or less.
  • the second step includes a freeze-drying step in which a solution containing a glycolytic enzyme is frozen and moisture is removed by sublimation in the frozen state to dry the solution.
  • drying is performed until the water content of the pharmaceutical composition after lyophilization becomes, for example, 5% (w / w) or less.
  • the drying in the second step is preferably performed until the water content of the pharmaceutical composition after freeze-drying is 3% (w / w) or less, and is preferably performed until it is 2% (w / w) or less. More preferred.
  • Another aspect of the present invention is the use of a unit dose formulation in the manufacture of a pharmaceutical composition for use in the treatment of hernia, lysosomal disease, keloid, hypertrophic scar, muscular dystrophy, or spinal cord injury, with a titer of 0 It also includes the use of a unit dose preparation containing lyophilized glycolytic enzyme of 3 units / ⁇ g or more as an active ingredient, and the amount of the glycolytic enzyme is 2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less.
  • a unit dose formulation in the treatment of hernia, lysosomal disease, keloid, hypertrophic scar, muscular dystrophy, or spinal cord injury, wherein the titer is 0.3 units / ⁇ g or more
  • the titer is 0.3 units / ⁇ g or more
  • the unit dose preparation containing the produced glycolytic enzyme as an active ingredient, and the amount of the glycolytic enzyme is 2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less.
  • a unit dosage formulation for use in the treatment of hernias, lysosomal diseases, keloids, hypertrophic scars, muscular dystrophy, or spinal cord injury with a titer of 0.3 units / ⁇ g or more
  • a unit dose preparation containing dried glycolytic enzyme as an active ingredient and having an amount of the above-mentioned glycolytic enzyme of 2 ⁇ g to 8 ⁇ g is also included.
  • a pharmaceutical composition comprising a freeze-dried saccharide-degrading enzyme having a titer of 0.3 unit / ⁇ g or more as an active ingredient and a unit dose preparation having a glycolytic enzyme amount of 2 to 8 ⁇ g.
  • ⁇ 3> The pharmaceutical composition according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the enzyme activity of the glycolytic enzyme is 75% or more when the value before freeze-drying is 100%.
  • ⁇ 4> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, which has a storage stability of 12 months or more at 5 ° C. ⁇ 3 ° C.
  • ⁇ 5> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the glycolytic enzyme is a glycosaminoglycan degrading enzyme.
  • ⁇ 6> The pharmaceutical composition according to ⁇ 5>, wherein the glycosaminoglycan degrading enzyme is chondroitinase.
  • chondroitinase is chondroitinase ABC.
  • composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition according to ⁇ 8> wherein the carrier comprises at least one of polyalkylene glycol and sucrose.
  • ⁇ 10> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the pharmaceutical composition is used for treatment of hernia, lysosomal disease, keloid, hypertrophic scar, muscular dystrophy, or spinal cord injury.
  • ⁇ 11> A package in which the pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10> is contained in a container.
  • ⁇ 12> The package according to ⁇ 11>, wherein the container is a vial, a syringe, or an ampoule.
  • ⁇ 13> A package in which the pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10> is contained in a container, and treatment of hernia, lysosomal disease, keloid, hypertrophic scar, muscular dystrophy, or spinal cord injury
  • a kit comprising a package insert or label explaining the use of said pharmaceutical composition for.
  • a method for producing a package in which a pharmaceutical composition is contained in a container a step of containing a solution containing 2 ⁇ g or more and 8 ⁇ g or less of a glycolytic enzyme in a container; Obtaining a pharmaceutical composition.
  • ⁇ 15> The production method according to ⁇ 14>, wherein the lyophilized glycolytic enzyme has a titer of 0.3 (unit / ⁇ g) or more.
  • ⁇ 17> The production according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 16>, wherein the enzyme activity of the glycolytic enzyme after lyophilization is 75% or more when the enzyme activity before lyophilization is 100%.
  • ⁇ 18> The production method according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 17>, wherein the glycolytic enzyme is a glycosaminoglycan degrading enzyme.
  • glycoaminoglycan degrading enzyme is chondroitinase
  • chondroitinase is chondroitinase ABC.
  • ⁇ 21> The production method according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 20>, wherein the pharmaceutical composition comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • ⁇ 22> The production method according to ⁇ 21>, wherein the carrier contains at least one of polyalkylene glycol and sucrose.
  • ⁇ 23> The method according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 22>, wherein the pharmaceutical composition is used for treatment of hernia, lysosomal disease, keloid, hypertrophic scar, muscular dystrophy, or spinal cord injury.
  • ⁇ 24> The method according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 23>, wherein the container is a vial, a syringe, or an ampoule.
  • chondroitinase ABC Chondroitinase ABC was prepared according to the method described in JP-A-6-153947. That is, it was produced by purifying from the culture supernatant of Proteus vulgaris. The titer of the obtained chondroitinase ABC was 0.4 U / ⁇ g.
  • the enzyme activity of chondroitinase ABC was measured by the following method.
  • the enzyme sample (chondroitinase ABC) was diluted 4000 times with 0.01% (w / v) casein reagent (20 mM phosphate buffer).
  • 400 ⁇ L of substrate solution (3 mg / ml sodium chondroitin sulfate ester (Japanese Pharmacopoeia Standard), 50 mM 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 50 mM sodium acetate, pH 8 ) was added and mixed.
  • the solution was reacted at 37 ° C.
  • the sample solution, per the standard solution and the control solution, the ultraviolet-visible absorbance measurement method, the absorbance A T at a wavelength of 232 nm, the A S, and A B was measured to determine the enzyme solution activity (U / mL) by the following equation.
  • the enzyme solution activity is the enzyme activity per unit liquid volume.
  • a T Absorbance of sample solution
  • a B Absorbance of control solution
  • a S Absorbance of standard solution
  • 1 U (unit) is defined as the value of the enzyme activity that catalyzes the reaction that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide per minute under the above reaction conditions.
  • the value of the enzyme activity used in this specification was determined based on the enzyme solution activity.
  • the enzyme amount (protein amount, ⁇ g) of chondroitinase ABC was measured by the following Lowry method (Lowry method). That is, 2.5 mL of an alkaline copper reagent was added to 0.5 mL of an enzyme sample (chondroitinase ABC) diluted 50-fold with pure water and mixed, and the mixture was allowed to stand at room temperature (20 ° C. to 25 ° C.) for 10 minutes. To this solution, 0.25 mL of a 1 mol / L phenol reagent was added and mixed, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to prepare a sample solution.
  • Lowry method Lowry method
  • the same operation as for the diluted enzyme sample was performed to obtain a standard solution.
  • the same operation as the enzyme sample diluted 50 times was performed on 0.5 mL of water to obtain a blank solution.
  • the light absorbency in wavelength 750nm was measured.
  • the absorbance of the standard solution and the protein concentration were plotted by a linear regression method, and a standard curve that approximated each point was obtained.
  • the amount of protein in the sample solution was determined from the obtained standard curve and the absorbance of the sample solution.
  • chondrotinase ABC solution prepared using the enzyme buffer was placed in a 3 ml glass vial (manufactured by SCHOTT) so that the amount of the enzyme was as follows: Sample 1: 1.3 ⁇ g / vial (0.5 U / vial) Sample 2: 2.5 ⁇ g / vial (1.00 U / vial) Sample 3: 5.0 ⁇ g / vial (2.00 U / vial) Sample 4: 9.1 ⁇ g / vial (3.63 U / vial)
  • the enzyme solution contained in these vials was freeze-dried under the following conditions (water content 2% (w / w) or less). After lyophilization, the inside of the vial was decompressed with nitrogen gas, and a rubber stopper was stoppered to obtain a unit dose preparation.
  • Step 1 The temperature was cooled from room temperature to minus 35 ° C. under normal pressure, and the sample was frozen.
  • Step 2 Temperature minus 35 ° C. and normal pressure were maintained for 30 minutes.
  • Process 3 The state of temperature minus 35 ° C. and vacuum of 13.3 Pa was maintained for 5 hours.
  • Process 4 The temperature was raised from minus 35 ° C. to 25 ° C. while maintaining the degree of vacuum at 13.3 Pa.
  • Step 5 The temperature of 25 ° C. and the degree of vacuum of 13.3 Pa were maintained for 5 hours.
  • the enzyme activity (U / unit dose) after lyophilization was measured for each vial.
  • the titer (U / ⁇ g) and relative enzyme activity (enzyme activity after lyophilization when the enzyme activity before lyophilization was taken as 100%) (%) were calculated. The results are shown in Table 1.
  • the enzyme activity (U / vial) after lyophilization was measured for the obtained unit dose preparation. As a result, the enzyme activity of 1.5 U / vial was maintained even after lyophilization.
  • ⁇ Test Example 3> A unit dose formulation (1.5 U / vial) was obtained according to the method of Test Example 1. The resulting unit dose formulation was stored under conditions 1 or 2 below. The enzyme titer after each storage period was determined.
  • Condition 1 25 ° C. ⁇ 2 ° C.
  • light shielding Condition 2 5 ° C. ⁇ 3 ° C., light shielding
  • the residual titer rate was 95% or more when the titer at the start of storage was 100% in the first, third and sixth months after the start of storage.
  • the residual titer rate was 95% or more when the titer at the start of storage was 100% at 3 months, 6 months, 12 months, 24 months and 36 months after the start of storage.

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Abstract

優れた力価を有する凍結乾燥された糖分解酵素を含む医薬組成物及び、前記医薬組組成物を含む包装体が提供される。医薬組成物は、力価が０．３ユニット／μｇ以上である凍結乾燥された糖分解酵素を有効成分として含み、前記糖分解酵素量を２μｇ以上８μｇ以下で含む単位用量製剤である。

Description

医薬組成物、包装体及びその製造方法
　本発明は、糖分解酵素を有効成分として含む医薬組成物、並びにこれが容器に収容された包装体及びその製造方法に関する。
　糖分解酵素を有効成分として含む医薬組成物は、様々な疾患分野で利用されている。例えば、アウドラザイム（登録商標）、エラプレース（登録商標）、ナグラザイム（登録商標）、リプレガル（登録商標）、およびビミジム（登録商標）など、約３ｍｇ／バイアルから約１０ｍｇ／バイアルの糖分解酵素を有効成分として含むリソソーム病治療用医薬組成物が、注射用の液体製剤として市販されている。また、例えば、国際公開第２０１２／０８１２２７号には、糖分解酵素（特にコンドロイチナーゼＡＢＣ）を有効成分として含む椎間板ヘルニア治療剤が記載されている。
　液体製剤と比較して、凍結乾燥製剤は、物流コストが抑えられるという点で優れている。一方、一般に酵素の力価は凍結乾燥により大きく低下する場合があり、酵素が微量であればなおさらであるため、凍結乾燥製剤の製造に際しては、所望の酵素活性を有する製品が生産できるよう、工夫がされている。例えば、国際公開第２０１２／０８１２２７号の実施例では、凍結乾燥による力価の大幅な低下を考慮して、投薬１回分のために必要なユニット数を大きく超える酵素を容器に収容した後に凍結乾燥して凍結乾燥製剤を得ている。そして当該文献では、得られた凍結乾燥製剤を溶解希釈した後、投与に必要な量を分取することで、１回投与に必要な活性成分が含まれる投与液を調製している。
　ここで、単位用量を大きく超える凍結乾燥製剤を予め調製してから、その一部を１回投与量として分取する手法では、投与に使用されなかった多くの残部の酵素は廃棄されることとなる。このため、高価な酵素の多くの残部が無駄になる場合があった。
　したがって、本発明の一側面は、糖分解酵素を有効成分として含む医薬組成物であって、凍結乾燥による製剤化に伴う力価の低下が抑制された医薬組成物を提供することを目的とする。
　上記課題に鑑みて本発明者が鋭意検討を重ねた結果、凍結乾燥前後における力価の低下が抑制される糖分解酵素を含む医薬組成物を提供する手段を見出し、本発明の完成に至った。
　本発明の一側面は、力価が０．３ユニット／μｇ以上である凍結乾燥された糖分解酵素を有効成分として含み、前記酵素量が２μｇ以上８μｇ以下の単位用量製剤である、医薬組成物に関する。
　本発明の別の側面は、医薬組成物とそれを収容する容器とを含む包装体の製造方法であり、２μｇ以上８μｇ以下の糖分解酵素を含む溶液を容器に収容する工程と、前記溶液を凍結乾燥して単位用量の医薬組成物を得る工程とを含む、製造方法に関する。
　本発明の一側面によれば、凍結乾燥による力価の低下が大きく抑制された、凍結乾燥された糖分解酵素を含む医薬組成物が提供できる。
　以下、本発明を詳説するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
（１）医薬組成物および包装体
　医薬組成物は、糖分解酵素を有効成分として含む凍結乾燥製剤である。医薬組成物は、力価が０．３ユニット／μｇ以上である凍結乾燥された糖分解酵素を有効成分として含み、前記糖分解酵素量が２μｇ以上８μｇ以下の単位用量製剤である。本明細書において「単位用量」は、１回の投薬のために用意される必要量であり、単位用量製剤は医薬組成物が単位用量で製剤化されてなる。単位用量は、有効量に加えて、１回の投与液調製のために必要な増仕込み量を含み得る。
　医薬組成物では、凍結乾燥による糖分解酵素の力価の低下が大きく抑制される。また貯蔵による力価の低下も大きく抑制される。さらに医薬組成物は、単位用量毎に予め準備された凍結乾燥製剤であるため、医療現場における利便性、衛生面、安全性等の観点からも優れた医薬組成物である。
　包装体は、少なくとも、容器と、前記容器に収容される医薬組成物とを含み、前記医薬組成物が前記容器に収容されてなる。
　「糖分解酵素」とは、医薬に用いられ得るものであれば、特に限定されない。例えば、糖分解酵素としては、グリコサミノグリカン分解酵素；グリコシダーゼ；ペプチド：Ｎ－グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ、エンドグリコシダーゼＨなど）、α－Ｌ－イズロニダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、イデュルスルファーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ等を挙げることができる。グリコサミノグリカン分解酵素としては、例えば、ケラタナーゼＩ、ケラタナーゼＩＩなどのケラタナーゼ；ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、ヘパリナーゼＩＩＩなどのヘパリナーゼ；ヘパリチナーゼＩＶ、ヘパリチナーゼＶ、ヘパリチナーゼＴ－Ｉ、ヘパリチナーゼＴ－ＩＩ、ヘパリチナーゼＴ－ＩＩＩ、ヘパリチナーゼＴ－ＩＶなどのヘパリチナーゼ；コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣなどのコンドロイチナーゼ；放線菌由来のヒアルロニダーゼ、連鎖球菌由来のヒアルロニダーゼなどのヒアルロニダーゼ等が挙げられる。またグリコシダーゼとしては、例えば、微生物由来のβ－ガラクトシダーゼ、α－ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
　一実施形態では、グリコサミノグリカン分解酵素が、糖分解酵素として用いられる。グリコサミノグリカン分解酵素としては、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼ、ケラタナーゼ、ヘパラナーゼ、ヘパリチナーゼ等が挙げられる。糖分解酵素としては、中でもコンドロイチナーゼが好ましく、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩがより好ましく、コンドロイチナーゼＡＢＣが特に好ましい。コンドロイチナーゼＡＢＣは、コンドリアーゼであってもよい。
　糖分解酵素の由来は特に限定されない。好ましい一実施形態では、微生物由来の糖分解酵素が採用される。微生物の非制限的な例としては、例えば、バチルス属、エスケリキア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、プロテウス属、アースロバクター属、ストレプトコッカス属、バクテロイデス属、アスペルギルス属、エリザベトキンギア属、およびストレプトマイセス属等が挙げられる。例えば、糖分解酵素がコンドロイチナーゼＡＢＣである場合は、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のもの（例えば、プロテウス・ブルガリス由来のコンドロイチナーゼＡＢＣ）が例示できる。
　糖分解酵素の製造方法等は特に限定されない。糖分解酵素の例示的な製造方法は、糖分解酵素を産生する微生物または動物細胞の培養物を得る工程、および培養物から糖分解酵素を回収する工程を含む。
　微生物によって産生される糖分解酵素は、当該微生物が本来的に有するものであってもよく、または後述する遺伝子工学的手法等により目的とする酵素を産生するように当該微生物を改変して得たものであってもよい。例えば、糖分解酵素がコンドロイチナーゼＡＢＣである場合は、プロテウス・ブルガリス等の微生物を培養して生産させてもよく、コンドロイチナーゼＡＢＣをコードするＤＮＡ等を用いて遺伝子工学的手法で生産させてもよい。また、糖分解酵素は、生物が本来的に有するものと同一アミノ酸配列であってもよいが、医薬品としての所望の目的を達成し得る限りにおいて、一部のアミノ酸が欠損、置換および／または付加等されたものであってもよい。
　微生物としては、例えば、バチルス属、エスケリキア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、プロテウス属、アースロバクター属、ストレプトコッカス属、バクテロイデス属、アスペルギルス属、エリザベトキンギア属、およびストレプトマイセス属の微生物が例示できる。微生物の生育条件（培地や培養条件等）は、用いる微生物に合わせて適宜選択され、当業者であれば任意に設定できる。微生物を用いて糖分解酵素を製造することにより、動物細胞を用いて糖分解酵素を製造する場合に比べ、安価に大量に製造することが可能である。
　糖分解酵素の製造方法は、目的の糖分解酵素をコードする遺伝子を発現する組替えベクターを宿主に導入する工程を含んでもよい。ベクターとしては、例えば、導入した遺伝子を発現させることが可能な適当な（好ましくは、プロモーター等の調節配列を含む）発現ベクター（ファージベクター、プラスミドベクター等）を使用することができる。ベクターは、宿主細胞に応じて適宜選択する。より具体的には、このような宿主－ベクター系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と、ｐＥＴシリーズ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｃ９９、ｐＫＫ２３３－２、ｐＥＺＺ１８、ｐＢＡＤ、ｐＲＳＥＴ、およびｐＳＥ４２０等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせ；ＣＯＳ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞と、ｐＣＭＶシリーズ、ｐＭＥ１８Ｓシリーズ、ｐＳＶＬ等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせの他、宿主細胞として昆虫細胞、酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。
　また、上記ベクターは、組み込んだ遺伝子がコードするタンパク質と、マーカーペプチドやシグナルペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築されたものを用いることもできる。当該ペプチドとしては例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）などが挙げられる。いずれのベクターを用いる場合であっても、常法に従って、挿入核酸配列とベクターとを連結することが可能なように制限酵素などによって処理し、必要に応じて平滑化や粘着末端の連結を行った後、挿入核酸配列とベクターとを連結をすることができる。
　宿主のベクターによる形質転換は、常法によって行うことができる。例えば、市販のトランスフェクション用試薬を用いる方法や、ＤＥＡＥ－デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法等によってベクターを宿主に導入し、形質転換を行うことができる。
　糖分解酵素を産生する微生物または動物細胞の生育条件（培地や培養条件等）は、用いる微生物や細胞に合わせて適宜選択される。例えば、大腸菌を用いる場合は、ＬＢ培地等を主成分として適宜調製した培地を用いることができる。また例えば、宿主細胞としてＣＯＳ－７細胞を用いる場合には、２％（ｖ／ｖ）程度のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地を用い、３７℃条件下で培養することができる。
　生育物からの糖分解酵素の回収は、産生される糖分解酵素の形態に応じて、公知のタンパク質の抽出・精製方法によって行うことができる。例えば糖分解酵素が、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま糖分解酵素として用いてもよい。また糖分解酵素が細胞質中に分泌される可溶性の形態、または不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作によって抽出することができる。糖分解酵素は、塩析、硫安分画、遠心分離、透析、限外ろ過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の従来公知の手法により精製してもよい。
　糖分解酵素は１種を単独で、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、糖分解酵素は、アセチル化、ポリアルキレングリコール化（例えば、ポリエチレングリコール化）、アルキル化、アシル化、ビオチン化、ラベル化（例えば蛍光物質、発光物質などのラベル）、リン酸化、硫酸化などの、従来公知の化学修飾基が付加されたものであってもよい。
　医薬組成物は、薬学上許容される担体を含み得る。本明細書において、「薬学上許容される担体」としては、慣用の賦形剤、結合剤、緩衝剤、注射用水、等張化剤、保存剤、無痛化剤等、通常医薬に用いられる成分が例示される。
　緩衝剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、アミノ酢酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミン等の１種以上を含有する緩衝剤が例示され、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムが好ましい。
　等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコールなどが挙げられる。
　その他の薬学上許容される担体として具体的には、例えば、デキストラン類、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、血清アルブミン、ゼラチン、クレアチニン、ポリアルキレングリコール、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）などが挙げられ、中でもスクロースおよび／またはポリアルキレングリコールが好ましく、スクロースおよび／またはポリエチレングリコールがより好ましい。ポリエチレングリコールは平均分子量が２００以上２５０００以下であるものが好ましく、さらには常温で固体であるもの、例えば、平均分子量が２０００以上９０００以下であるものがより好ましく、３０００以上４０００以下であるものが更に好ましい。ポリエチレングリコールとしては、例えば平均分子量３２５０、３３５０および４０００のものを例示することができる。薬学上許容される担体としてポリエチレングリコールとスクロースとの混合物を用いる場合、ポリエチレングリコール／スクロースの重量比が一般に１／１０から１０／１までの範囲となるようにすることが好ましく、ポリエチレングリコール／スクロースの重量比が２／１程度となるようにすることがより好ましい。
　本明細書において、「容器」とは、医薬組成物を収容できるものであれば特に限定されない。容器としては、シリンジ、バイアル、アンプル、注射器などが例示され、バイアルであることが好ましい。容器の材質はガラス、プラスチックなどが例示でき、ガラスであることが好ましい。ガラスには例えば、ホウケイ酸ガラス、ソーダ石灰ガラスなどが含まれる。容器は、栓部材又はキャップをさらに有することが好ましく、ゴム栓を有することがより好ましい。容器のサイズは特に限定されないが、０．５ｍＬ以上１００ｍＬ以下が例示され、１ｍＬ以上１０ｍＬ以下が好ましく、２ｍＬ以上４ｍＬ以下がより好ましく、３ｍＬが更に好ましい。医薬組成物が容器に収容された包装体は、窒素ガス、アルゴンガスなどの不活性ガスが封入されていてもよく、あるいは、脱気されていてもよい。
　凍結乾燥製剤の水分含量は、例えば５％（ｗ／ｗ）以下であり、３％（ｗ／ｗ）以下であることが好ましく、２％（ｗ／ｗ）以下であることがより好ましい。なお、本明細書において水分含量は、電量滴定法によって測定された値である。
　本発明では、医薬組成物の単位用量あたりの糖分解酵素量が２μｇ以上８μｇ以下であることを特徴とする。一般に酵素の存在量が少ないほど凍結乾燥前後での力価の低下が顕著になるところ、本発明者は驚くべきことに、医薬組成物の単位用量あたりの糖分解酵素量を２μｇ以上８μｇ以下とすることで凍結乾燥前後での力価低下を顕著に抑制できることを見出した。凍結乾燥前後での力価低下抑制効果の観点から、好ましい一実施形態では、医薬組成物の単位用量あたりの糖分解酵素量は、２μｇ以上７μｇ以下や、２μｇ以上６μｇ以下や、２．５μｇ以上６μｇ以下である。より好ましい一実施形態では、医薬組成物の単位用量あたりの糖分解酵素量は、２μｇ以上５μｇ以下や、２．５μｇ以上５μｇ以下である。特に好ましい一実施形態では、医薬組成物の単位用量あたりの糖分解酵素量は、３μｇ以上５μｇ以下である。
　好ましい一実施形態では、容器あたりの糖分解酵素の収容量は、２μｇ以上８μｇ以下である。より好ましい一実施形態では、容器あたりの糖分解酵素の収容量は、２μｇ以上７μｇ以下や、２μｇ以上６μｇ以下や、２．５μｇ以上６μｇ以下である。さらに好ましい一実施形態では、容器あたりの糖分解酵素の収容量は、２μｇ以上５μｇ以下や、２．５μｇ以上５μｇ以下である。特に好ましい一実施形態では、容器あたりの糖分解酵素の収容量は、３μｇ以上５μｇ以下である。
　「力価」とは、糖分解酵素１μｇに対する酵素の活性（ユニット）を意味し、ユニット／μｇの単位で示される。本発明では、凍結乾燥された糖分解酵素の力価は０．３（ユニット／μｇ）以上である。一実施形態では、凍結乾燥された糖分解酵素の力価は０．３（ユニット／μｇ）以上１（ユニット／μｇ）以下である。別の実施形態では、凍結乾燥された糖分解酵素の力価は０．３２（ユニット／μｇ）以上１（ユニット／μｇ）以下である。より好ましい別の実施形態では、凍結乾燥された糖分解酵素の力価は０．３４（ユニット／μｇ）以上１（ユニット／μｇ）以下である。さらに好ましい別の実施形態では、凍結乾燥された糖分解酵素の力価は０．３６（ユニット／μｇ）以上１（ユニット／μｇ）以下である。特に好ましい別の実施形態では、凍結乾燥された糖分解酵素の力価は０．３８（ユニット／μｇ）以上１（ユニット／μｇ）以下である。
　一実施形態では、凍結乾燥された糖分解酵素の力価は０．３（ユニット／μｇ）以上０．５（ユニット／μｇ）以下である。別の実施形態では、凍結乾燥された糖分解酵素の力価は０．３６（ユニット／μｇ）以上０．５（ユニット／μｇ）以下である。
　「ユニット（Ｕ、単位）」とは、糖分解酵素が有する活性を示しており、１Ｕは、至適温度、至適ｐＨ条件下で、単位時間あたりに基質から１マイクロモルに相当する分解物を遊離させる量を意味する。例えば、糖分解酵素がコンドロイチナーゼＡＢＣの場合、１ユニットとは、ｐＨ８．０、３７℃の条件下で、コンドロイチン硫酸ナトリウム（日本薬局方外医薬品規格２００２に適合するコンドロイチン硫酸エステルナトリウム）から１分間あたり１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる量を意味する。
　一実施形態では、単位用量あたりの酵素活性（糖分解酵素の酵素活性）は、例えば、４ユニット以下である。別の一実施形態では、単位用量あたりの酵素活性は、例えば、０．１ユニット以上４ユニット以下である。好ましい実施形態では、単位用量あたりの酵素活性は、０．５ユニット以上３ユニット以下である。さらに好ましい実施形態では、単位用量あたりの酵素活性は、０．９ユニット以上３ユニット以下や、０．９ユニット以上２．５ユニット以下である。別の好ましい実施形態では、単位用量あたりの酵素活性は、０．９ユニット以上２ユニット以下、１．２５ユニット以上２ユニット以下、または１．５ユニットである。
　一実施形態では、容器あたりの酵素活性は、例えば、４ユニット以下である。別の一実施形態では、容器あたりの酵素活性は、例えば、０．１ユニット以上４ユニット以下である。好ましい一実施形態では、容器あたりの酵素活性は、０．５ユニット以上３ユニット以下である。さらに好ましい一実施形態では、容器あたりの酵素活性は、０．９ユニット以上３ユニット以下や、０．９ユニット以上２．５ユニット以下である。別の好ましい一実施形態では、容器あたりの酵素活性は、０．９ユニット以上２ユニット以下、１．２５ユニット以上２ユニット以下（例えば、１．５ユニット）である。
　本発明によれば、力価が高い（０．３ユニット／μｇ以上）糖分解酵素量を少量（２μｇ以上８μｇ以下）含有する、凍結乾燥された単位用量製剤の形態の医薬組成物が提供される。
　凍結乾燥製剤の形態である医薬組成物中に含まれる糖分解酵素の酵素活性は、凍結乾燥前の酵素活性の値を１００％とした場合に、例えば７５％以上であり、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。これが１００％ならば、凍結乾燥前後で酵素活性の値が等しいことになる。
　本発明の一実施形態によれば、例えば、１２ヶ月以上の貯蔵安定性を有する医薬組成物が提供され得る。好ましい一実施形態では、２４ヶ月以上の貯蔵安定性を有する医薬組成物であり、より好ましい一実施形態では、３６ヶ月以上の貯蔵安定性を有する医薬組成物である。貯蔵安定性の上限は特に制限されないが、例えば、４８ヶ月以下（例えば、３６ヶ月以下）であり得る。
　ここで、「貯蔵安定性を有する」とは、所定条件（例えば、５℃±３℃で１２ヶ月以上、２５℃±２℃で６か月以上、または４０℃±２℃で３ヶ月以上もしくは６ヶ月以上）で遮光して貯蔵した後における力価（％）が、薬学上許容される程度に維持されていることをいう。本明細書において「貯蔵安定性」は、例えば力価残存率（％）で評価される。例えば、５℃±３℃で遮光して１２ヶ月以上の間試料を貯蔵した後の力価残存率は、例えば９０％以上であり、９５％以上であることが好ましい。５℃±３℃で遮光して２４ヶ月以上の間試料を貯蔵した後の力価残存率は、例えば、９０％以上であり、９５％以上であることが好ましい。５℃±３℃で遮光して３６ヶ月以上の間試料を貯蔵した後の力価残存率は、例えば、９０％以上であり、９５％以上であることが好ましい。２５℃±２℃で遮光して６ヶ月以上の間試料を貯蔵した後の力価残存率は、例えば、９０％以上であり、９５％以上であることが好ましい。４０℃±２℃で３ヶ月以上の間試料を遮光して貯蔵した後の力価残存率は、例えば、９０％以上であり、９５％以上であることが好ましい。４０℃±２℃で６ヶ月以上の間試料を貯蔵した後の力価残存率は、例えば、６５％以上であり、７０％以上であることが好ましく、７５％以上であることがより好ましい。なお、「力価残存率（％）」とは、本発明に係る医薬組成物又は包装体を所定温度（例えば、５℃±３℃、２５℃±２℃または４０℃±２℃）の条件下で遮光して貯蔵した後における力価（％）を、貯蔵開始時の力価を１００％として算出した値を意味する。これが１００％ならば、貯蔵開始前後で酵素活性の値が等しいことになる。
　本発明の一実施形態によれば、１２ヶ月以上の有効期間を有する医薬組成物が提供され得る。好ましい一実施形態では、２４ヶ月以上の有効期間を有する医薬組成物であり、より好ましい一実施形態では、３６ヶ月以上の有効期間を有する医薬組成物である。有効期間の上限は特に制限されないが、例えば、４８ヶ月以下（例えば、３６ヶ月以下）であり得る。
　本明細書における「有効期間」とは、医薬品がその有用性を確認された時点から一定の貯蔵方法（例えば、５℃±３℃で遮光下、２５℃±２℃で遮光下または４０℃±２℃で遮光下）で保管した時、その確認時点における医薬品と同等の有用性が期待できる期間を意味する。
　本明細書において、前記医薬組成物は、「容器に収容された医薬組成物」を含み得る。容器に収容された医薬組成物は、糖分解酵素の単位用量を含む。
　本明細書において、前記医薬組成物の用途は、糖分解酵素の用途として公知の種々の用途が選択され得る。例えば、糖分解酵素を有効成分として含む医薬組成物の用途は、特に限定されないが、ヘルニア症、リソソーム病、ケロイド、肥厚性瘢痕、筋ジストロフィー、または脊髄損傷の治療が例示できる。好ましい一実施形態では、医薬組成物はヘルニア症の治療用に用いられる。より好ましい一実施形態では、椎間板ヘルニア（例えば、腰椎椎間板ヘルニア）の治療用に用いられる。
　本明細書において「治療」は、完全な治癒のみならず、疾患の一部又は全部の症状の改善、および疾患の進行の抑制（維持および進行速度の低下を含む）ならびに予防を含む。ここで予防とは、疾患に伴う諸症状が生じていない場合において、当該諸症状の発生を未然に防ぐことを含む。また、予防とは、例えば明確な器質的病変が認められていないものの、疾患に伴う諸症状が生じている場合において、当該器質的な病変の発生を未然に防ぐことや当該諸症状のうち顕在化していない症状の発展を抑制することを含む。
　本明細書において「有効成分として」および「有効量」とは、合理的なリスク／ベネフィット比に見合う量であり、且つ過度の有害副作用（毒性、刺激性など）を有さずに、所望の応答を得るのに十分な成分の量を意味する。当該「有効成分として」および「有効量」は、投与対象となる患者の症状、体格、年齢、性別等の諸要素によって変化し得る。しかしながら、当業者であれば、諸要素の組み合わせのそれぞれについての個別の試験を要するまでもなく、一又は複数の具体的な試験例の結果と技術常識とに基づいて、他の場合における有効量を決定することができる。
　本明細書において「患者」とは、動物、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ等）、より好ましくはヒトを意味する。
　好ましい一実施形態では、容器に収容された医薬組成物は、滅菌状態で提供される。医薬組成物の滅菌方法は特に制限されず、ろ過滅菌、乾熱滅菌等、従来公知の手法によって行われ得る。
　医薬組成物の投与形態も特に制限されず、治療すべき疾患、症状、重症度、患者の属性（例えば、年齢など）等に応じて、適宜選択され得る。凍結乾燥製剤は、任意の溶媒（例えば、注射用水、生理食塩液など）に溶解させて使用され得る。投与形態は、例えば、椎間板内注射、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、点滴などの任意の投与経路が挙げられる。医薬組成物の投与量もまた、治療すべき疾患、症状、重症度、患者の属性（例えば、年齢など）等に応じて、当業者であれば適宜設定できる。
　本発明の好ましい具体的態様を以下に例示するが、本発明の技術的範囲を制限するものではない。以下、医薬組成物の適用が椎間板ヘルニアであるものを例に説明することもあるが、適用される疾患等を問わない「医薬組成物」であってもよいことは当然である。
　（医薬組成物１）
有効成分：　コンドロイチナーゼＡＢＣ
単位用量あたりの酵素量：　２μｇ以上７μｇ以下
酵素力価：　０．３６（ユニット／μｇ）以上１（ユニット／μｇ）以下
単位用量あたりの酵素活性：　０．９ユニット以上３ユニット以下
適用：　椎間板ヘルニア
　（医薬組成物２）
有効成分：　コンドロイチナーゼＡＢＣ
単位用量あたりの酵素量：　２μｇ以上５μｇ以下
酵素力価：　０．３６（ユニット／μｇ）以上０．５（ユニット／μｇ）以下
単位用量あたりの酵素活性：　０．９ユニット以上２．５ユニット以下
適用：　椎間板ヘルニア
　（医薬組成物３）
有効成分：　コンドロイチナーゼＡＢＣ
単位用量あたりの酵素量：　２μｇ以上５μｇ以下
酵素力価：　０．３６（ユニット／μｇ）以上０．５（ユニット／μｇ）以下
単位用量あたりの酵素活性：　０．９ユニット以上２ユニット以下
適用：　椎間板ヘルニア
　（医薬組成物４）
有効成分：　コンドロイチナーゼＡＢＣ
単位用量あたりの酵素量：　２μｇ以上５μｇ以下
酵素力価：　０．３６（ユニット／μｇ）以上０．５（ユニット／μｇ）以下
単位用量あたりの酵素活性：　１．２５以上２ユニット以下
適用：　椎間板ヘルニア
　（医薬組成物５）
有効成分：　コンドロイチナーゼＡＢＣ
単位用量あたりの酵素量：　３μｇ以上５μｇ以下
酵素力価：　０．３６（ユニット／μｇ）以上０．５（ユニット／μｇ）以下
単位用量あたりの酵素活性：　１．５ユニット
適用：　椎間板ヘルニア
（２）キット
　一実施形態では、前記医薬組成物が容器に収容されてなる包装体、およびヘルニア症、リソソーム病、ケロイド、肥厚性瘢痕、筋ジストロフィー、または脊髄損傷の治療のための前記医薬組成物の使用を説明する添付文書又はラベルを含むキットが提供される。
　キットは、前記医薬組成物が容器に収容されてなる包装体、ならびにヘルニア症、リソソーム病、ケロイド、肥厚性瘢痕、筋ジストロフィー、または脊髄損傷の治療のための前記医薬組成物の使用を説明する添付文書又はラベルを含んでいればよい。すなわち、更に他の構成成分を含むものであってもよい。
（３）製造方法
　本発明の一側面は、医薬組成物が容器に収容されてなる包装体の製造方法であり、２μｇ以上８μｇ以下の糖分解酵素を含む溶液を容器に収容する第１工程と、前記溶液を凍結乾燥して単位用量の医薬組成物を得る第２工程とを含む、製造方法に関する。
　第１工程において、糖分解酵素を含む溶液の調製に用いる溶媒は、特に限定されないが、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の緩衝液が採用され得る。また、溶液は、上記したような薬学上許容される担体を含んでいてもよい。容器に収容する糖分解酵素を含む溶液のｐＨは特に限定されないが、６．５以上７．５以下の範囲であることが好ましい。
　好ましい一実施形態では、第１工程において、容器あたりの酵素活性が４ユニット以下となるように、糖分解酵素を含む溶液を容器に収容する。より好ましい一実施形態では、容器あたりの酵素活性が０．５ユニット以上４ユニット以下となるように、溶液を容器に収容する。さらに好ましい一実施形態では、容器あたりの酵素活性が１ユニット以上３ユニット以下となるように、溶液を容器に収容する。特に好ましい一実施形態では、容器あたりの酵素活性が、１．２５ユニット以上２．５ユニット以下となるように、溶液を容器に収容する。
　第２工程は、糖分解酵素を含む溶液を凍結させ、その凍結状態のまま昇華させることにより水分を除去して乾燥させる凍結乾燥工程を含む。第２工程においては、凍結乾燥後の医薬組成物の水分含量が、例えば５％（ｗ／ｗ）以下となるまで乾燥が行われる。第２工程における乾燥は、凍結乾燥後の医薬組成物の水分含量が３％（ｗ／ｗ）以下となるまで行われることが好ましく、２％（ｗ／ｗ）以下となるまで行われることがより好ましい。
　本発明に係る製造方法は、「前記（１）組成物および包装体」や「前記（２）キット」の記述、例示、好ましい範囲などがそのまま適用できる。
　本発明は、別の態様として、ヘルニア症、リソソーム病、ケロイド、肥厚性瘢痕、筋ジストロフィー、または脊髄損傷の処置に用いられる医薬組成物の製造における単位用量製剤の使用であって、力価が０．３ユニット／μｇ以上である凍結乾燥された糖分解酵素を有効成分として含み、前記糖分解酵素量が２μｇ以上８μｇ以下の単位用量製剤の使用をも包含する。また、別の態様として、ヘルニア症、リソソーム病、ケロイド、肥厚性瘢痕、筋ジストロフィー、または脊髄損傷の処置における単位用量製剤の使用であって、力価が０．３ユニット／μｇ以上である凍結乾燥された糖分解酵素を有効成分として含み、前記糖分解酵素量が２μｇ以上８μｇ以下の単位用量製剤の使用をも包含する。さらに、別の態様として、ヘルニア症、リソソーム病、ケロイド、肥厚性瘢痕、筋ジストロフィー、または脊髄損傷の処置に使用される単位用量製剤であって、力価が０．３ユニット／μｇ以上である凍結乾燥された糖分解酵素を有効成分として含み、前記糖分解酵素量が２μｇ以上８μｇ以下の単位用量製剤をも包含する。
　以下に本発明の実施形態を例示するが、本発明はこれらに限定されない。
＜１＞力価が０．３ユニット／μｇ以上である凍結乾燥された糖分解酵素を有効成分として含み、前記糖分解酵素量が２μｇ以上８μｇ以下の単位用量製剤である、医薬組成物。
＜２＞酵素活性が４ユニット以下である、＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞前記糖分解酵素の酵素活性が、凍結乾燥前の値を１００％とした場合に、７５％以上である、＜１＞または＜２＞に記載の医薬組成物。
＜４＞５℃±３℃で１２ヶ月以上の貯蔵安定性を有する、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜５＞前記糖分解酵素がグリコサミノグリカン分解酵素である、＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜６＞前記グリコサミノグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、＜５＞に記載の医薬組成物。
＜７＞前記コンドロイチナーゼがコンドロイチナーゼＡＢＣである、＜６＞に記載の医薬組成物。
＜８＞薬学上許容される担体を含む、＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜９＞前記担体が、ポリアルキレングリコールおよびスクロースの少なくとも一方を含む、＜８＞に記載の医薬組成物。
＜１０＞前記医薬組成物が、ヘルニア症、リソソーム病、ケロイド、肥厚性瘢痕、筋ジストロフィー、または脊髄損傷の治療用である、＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１１＞＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の医薬組成物が、容器に収容されてなる包装体。
＜１２＞前記容器が、バイアル、シリンジ、またはアンプルである、＜１１＞に記載の包装体。
＜１３＞＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の医薬組成物が容器に収容されてなる包装体、およびヘルニア症、リソソーム病、ケロイド、肥厚性瘢痕、筋ジストロフィー、または脊髄損傷の治療のための前記医薬組成物の使用を説明する添付文書またはラベルを含む、キット。
＜１４＞医薬組成物が容器に収容されてなる包装体の製造方法であり、２μｇ以上８μｇ以下の糖分解酵素を含む溶液を容器に収容する工程と、前記溶液を凍結乾燥して単位用量の医薬組成物を得る工程とを含む、製造方法。
＜１５＞凍結乾燥された前記糖分解酵素の力価が０．３（ユニット／μｇ）以上である、＜１４＞に記載の製造方法。
＜１６＞前記容器に収容される溶液の酵素活性が４ユニット以下である、＜１４＞または＜１５＞に記載の製造方法。
＜１７＞凍結乾燥後の前記糖分解酵素の酵素活性が、凍結乾燥前の酵素活性を１００％とした場合に、７５％以上である、＜１４＞から＜１６＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１８＞前記糖分解酵素はグリコサミノグリカン分解酵素である、＜１４＞から＜１７＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１９＞前記グリコアミノグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、＜１８＞に記載の製造方法。
＜２０＞前記コンドロイチナーゼがコンドロイチナーゼＡＢＣである、＜１９＞に記載の製造方法。
＜２１＞前記医薬組成物が薬学上許容される担体を含む、＜１４＞から＜２０＞のいずれかに記載の製造方法。
＜２２＞前記担体が、ポリアルキレングリコールおよびスクロースの少なくとも一方を含む、＜２１＞に記載の製造方法。
＜２３＞前記医薬組成物が、ヘルニア症、リソソーム病、ケロイド、肥厚性瘢痕、筋ジストロフィー、または脊髄損傷の治療用である、＜１４＞から＜２２＞のいずれかに記載の製造方法。
＜２４＞前記容器は、バイアル、シリンジ、またはアンプルである、＜１４＞から＜２３＞のいずれかに記載の製造方法。
　以下、本発明をより具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
＜調製例＞
１）コンドロイチナーゼＡＢＣの調製
　コンドロイチナーゼＡＢＣは、特開平６－１５３９４７号公報に記載の方法に準じて調製した。すなわち、プロテウス・ブルガリスの培養上清から精製することによって製造した。得られたコンドロイチナーゼＡＢＣの力価は、０．４Ｕ／μｇであった。
２）コンドロイチナーゼＡＢＣの酵素活性測定と濃度測定
　コンドロイチナーゼＡＢＣの酵素活性は以下の方法で測定した。
　酵素試料（コンドロイチナーゼＡＢＣ）を０．０１％（ｗ／ｖ）カゼイン試薬（２０ｍＭリン酸緩衝液）で４０００倍希釈した。この希釈された酵素試料１００μＬに基質溶液４００μＬ（３ｍｇ／ｍｌコンドロイチン硫酸エステルナトリウム（日本薬局方外医薬品規格）、５０ｍＭ　２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ８）を加えて混和した。溶液を３７℃で２０分間反応させた後、１００℃の水浴中で１分間加熱した。室温まで冷却後、０．０５Ｍ　塩酸を５．０ｍＬ加え、試料溶液を調製した。コンドロイチナーゼＡＢＣ標準物質を０．０１％（ｗ／ｖ）カゼイン試薬で４００倍希釈した。この希釈されたコンドロイチナーゼＡＢＣ標準物質の溶液１００μＬに対し、試料溶液の調製と同様の操作を行い、標準溶液を調製した。また、０．０１％（ｗ／ｖ）カゼイン試薬１００μＬに対し、試料溶液の調製と同様の操作を行い、対照溶液を調製した。試料溶液、標準溶液並びに対照溶液につき、紫外可視吸光度測定法により、波長２３２ｎｍにおける吸光度ＡＴ、ＡＳ、およびＡＢを測定し、下記式により酵素溶液活性（Ｕ／ｍＬ）を求めた。ここで酵素溶液活性は、単位液量当たりの酵素活性である。
　酵素溶液活性（Ｕ／ｍＬ）＝（ＡＴ－ＡＢ）／（ＡＳ－ＡＢ）×４０００／４００×Ｕｓ
　ＡＴ：試料溶液の吸光度
　ＡＢ：対照溶液の吸光度
　ＡＳ：標準溶液の吸光度
　Ｕｓ：コンドロチナーゼＡＢＣ標準物質の酵素溶液活性（Ｕ／ｍＬ）
　なお、１Ｕ（ユニット、単位）は、上記反応条件下において１分間に不飽和二糖を１マイクロモル遊離する反応を触媒する酵素活性の値と定義した。本明細書において用いた酵素活性の値は、酵素溶液活性に基づいて求めた。
　コンドロイチナーゼＡＢＣの酵素量（タンパク量、μｇ）は以下のＬｏｗｒｙ法（ローリー法）で測定した。すなわち、純水で５０倍希釈した酵素試料（コンドロイチナーゼＡＢＣ）０．５ｍＬにアルカリ性銅試薬２．５ｍＬ加えて混和し、室温（２０℃以上２５℃以下）に１０分間放置した。この液に１ｍｏｌ／Ｌフェノール試薬０．２５ｍＬを加え混和し、室温に３０分間放置し、試料溶液とした。ウシ血清アルブミンを水に溶かし、それぞれ３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、または７０μｇ／ｍＬとなるように溶液を調製し、これら溶液０．５ｍＬそれぞれに対し、前記５０倍希釈した酵素試料と同様の操作を行い、標準溶液とした。また、水０．５ｍＬに対し、前記５０倍希釈した酵素試料と同様の操作を行い、ブランク液とした。これらの液について、波長７５０ｎｍにおける吸光度を測定した。直線回帰法により標準溶液の吸光度とタンパク質濃度をプロットし、各点に最も近似した標準曲線を求めた。得られた標準曲線と試料溶液の吸光度から試料溶液中のタンパク量を求めた。
３）酵素用緩衝液の調製
　以下の組成となるよう、酵素用緩衝液を用意した。
（組成；注射用蒸留水１Ｌ中）
リン酸水素ナトリウム水和物（リン酸水素ニナトリウム）　１．１２５ｍｇ
リン酸ニ水素ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　０．３ｍｇ
スクロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｍｇ
ポリエチレングリコール３３５０　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
ｐＨ：６．５以上７．５以下。
＜試験例１＞
　酵素用緩衝液を用いて調製したコンドロチナーゼＡＢＣ溶液を、酵素量が以下になるように３ｍｌサイズのガラスバイアル（ＳＣＨＯＴＴ社製）に収容した：
　試料１：　１．３μｇ／バイアル（０．５Ｕ／バイアル）
　試料２：　２．５μｇ／バイアル（１．００Ｕ／バイアル）
　試料３：　５．０μｇ／バイアル（２．００Ｕ／バイアル）
　試料４：　９．１μｇ／バイアル（３．６３Ｕ／バイアル）
　これらバイアルに収容した酵素溶液を、以下の条件で凍結乾燥した（水分含量２％（ｗ／ｗ）以下）。凍結乾燥後、窒素ガスでバイアル内を復圧し、ゴム栓を打栓し、単位用量製剤を得た。
（凍結乾燥条件）
　工程１：常圧下で、温度を室温からマイナス３５℃に冷却させ、試料を凍結させた。
　工程２：温度マイナス３５℃、常圧の状態を３０分間維持した。
　工程３：温度マイナス３５℃、真空度１３．３Ｐａの状態を５時間維持した。
　工程４：真空度を１３．３Ｐａに維持したまま、温度をマイナス３５℃から２５℃に昇温させた。
　工程５：温度２５℃、真空度１３．３Ｐａの状態を５時間維持した。
　各バイアルについて、凍結乾燥後の酵素活性（Ｕ／単位用量）をそれぞれ測定した。また、力価（Ｕ／μｇ）、及び相対酵素活性（凍結乾燥前の酵素活性を１００％とした場合の、凍結乾燥後の酵素活性）（％）を算出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果より、単位用量あたりの糖分解酵素量を特定の範囲（２．０μｇ以上８．０μｇ以下）にすることで、力価が極めて高い凍結乾燥製剤を提供することができた。
＜試験例２＞
　酵素用緩衝液を用いてコンドロチナーゼＡＢＣ溶液を調製した。この調製した酵素溶液を、酵素量が１．５Ｕ／バイアルとなるように試験例１と同様にガラスバイアルに収容し、凍結乾燥した（水分含量２％（ｗ／ｗ）以下）。凍結乾燥後、窒素ガスでバイアル内を復圧し、ゴム栓を打栓し、単位用量製剤を得た。
　得られた単位用量製剤について、凍結乾燥後の酵素活性（Ｕ／バイアル）を測定した。その結果、凍結乾燥後も１．５Ｕ／バイアルの酵素活性が維持されていた。
＜試験例３＞
　試験例１の方法に準じて単位用量製剤（１．５Ｕ／バイアル）を得た。得られた単位用量製剤を、以下の条件１又は２で貯蔵した。各貯蔵期間後の酵素の力価を求めた。
　条件１）：２５℃±２℃、遮光
　条件２）：５℃±３℃、遮光
　その結果、条件１では、貯蔵開始後１ヶ月、３ヶ月及び６ヶ月において、貯蔵開始時の力価を１００％とした場合の力価残存率が９５％以上であった。条件２では、貯蔵開始後３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月及び３６ヶ月において、貯蔵開始時の力価を１００％とした場合の力価残存率が、９５％以上であった。
　本発明は具体的実施例と様々な実施形態とに関連して記載されているが、本明細書に記載される実施形態の多くの改変や応用が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく可能であることは、当業者によって容易に理解される。
　本出願は、２０１８年２月２８日付で日本国特許庁に出願された特願２０１８－３５８８４号に基づく優先権を主張し、その内容は参照によって全体として本出願に組み込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (7)

  1. 　力価が０．３ユニット／μｇ以上である凍結乾燥された糖分解酵素を有効成分として含み、
    　前記糖分解酵素量が２μｇ以上８μｇ以下の単位用量製剤である、医薬組成物。
  2. 　酵素活性が４ユニット以下である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　５℃±３℃で１２ヶ月以上の貯蔵安定性を有する、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 　請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の医薬組成物が容器に収容されてなる、包装体。
  5. 　医薬組成物が容器に収容されてなる包装体の製造方法であり、
    　２μｇ以上８μｇ以下の糖分解酵素を含む溶液を容器に収容する工程と、
    　前記溶液を凍結乾燥して単位用量の医薬組成物を得る工程とを含む、製造方法。
  6. 　前記医薬組成物は、力価が０．３ユニット／μｇ以上の糖分解酵素を含む、請求項５に記載の製造方法。
  7. 　前記容器に収容される溶液の酵素活性が４ユニット以下である、請求項５または請求項６に記載の製造方法。
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