JP4728459B2 - 椎間板ヘルニア治療剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素の医薬用途に関する技術分野に属する。さらに詳細には、グリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体を含有する、脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物、およびグリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする硬膜外遊走型椎間板ヘルニア、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤に関わる技術分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】
椎間板ヘルニアは、椎間板内の髄核の突出等に起因する疾患であり、突出した髄核が付近の神経を刺激するために、腰痛等の症状が現れる。
【０００３】
椎間板ヘルニアの中でも、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアは、Macnabの分類においてsequestered type herniated intervertebral discとして分類される椎間板ヘルニアである。これは、椎間板内の髄核が線維輪の最外層と後縦靱帯を破り、中央椎間板とは完全に遊離して、脊柱管内の脊髄硬膜外腔に遊走した椎間板ヘルニアである。硬膜外遊走型椎間板ヘルニアは、期間が経過すれば自然に消失する椎間板ヘルニアであるが、自然消失するまでの期間は激痛を伴うことから、自然消失するまでの間、患者にとっては非常に苦痛であり、一刻も早く激痛から免れることができる治療が望まれている。
また、椎間板ヘルニアの中でも、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアは、Macnabの分類において transligamentous extrusion type herniated intervertebral discとして分類される椎間板ヘルニアである。この経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアは、椎間板内の髄核が線維輪の最外層と後縦靱帯を破って硬膜外に突出しているが中央椎間板とは遊離していない点で上記硬膜外遊走型椎間板ヘルニアとは異なる椎間板ヘルニアである。しかし、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアは、髄核が硬膜外に存在している点で硬膜外遊走型椎間板ヘルニアと共通しており、それにより症状が似通っているため、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアにおいても上記同様の治療が望まれている。
【０００４】
従来、椎間板ヘルニア症の治療に、キモパパインや、バクテリア由来のコラゲナーゼ等の蛋白分解酵素を、該ヘルニア症患者の椎間板内に注入し、ヘルニア部分を溶解する椎間板溶解療法(ＩＤ療法)が開発され、キモパパインが医薬品(商品名；キモダイアクチン)として市販されている。
【０００５】
しかし、上記蛋白分解酵素を用いるＩＤ療法は、脊椎・椎間板のヘルニア部分のみならず、周辺の構造組織の蛋白部分をも分解し、神経麻痺や、アレルギー発現等、副作用を生じやすい欠点を有する。
【０００６】
特に、脊髄硬膜外腔に突出したり遊走したりしている髄核を溶解するために上記蛋白分解酵素を脊髄硬膜外腔内に投与すると、蛋白質分解酵素が髄核を溶解すると同時に脊髄をも溶解してしまうことから、このような投与および治療は行うことができない。
【０００７】
近年、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはコンドロイチナーゼＡＣを椎間板に投与して椎間板ヘルニアを治療する試みが行なわれており、椎間板ヘルニアの治療薬としての用途が期待されている〔米国特許4696816号明細書、Clinical Orthopaedics, 253,301-308(1990)〕
【０００８】
例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣ(chondroitinase ABC)〔EC 4.2.2.4〕は、グリコサミノグリカンを不飽和オリゴ糖および不飽和二糖に分解する酵素で、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃおよび哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸の分解に対しては弱く触媒する酵素である。
【０００９】
上記したコンドロイチナーゼは、従来、椎間板内に直接投与されてきているが、このような投与では、髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアを治療するには有効ではない。これは、椎間板内へのコンドロイチナーゼ投与では、脊髄硬膜外腔に遊走している髄核を溶解できず、また、突出している髄核を溶解しにくいからである。
【００１０】
従来、コンドロイチナーゼのようなグリコサミノグリカン分解酵素を脊髄硬膜外腔に投与するための組成物は知られておらず、またコンドロイチナーゼのようなグリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤も知られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
このように、脊髄硬膜外遊走型椎間板ヘルニア、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療に用いることができる医薬組成物および薬剤が望まれていた。
【００１２】
本発明が解決すべき課題は、このような治療に用いることができる脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物、および硬膜外遊走型椎間板ヘルニア、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、脊髄硬膜外腔にグリコサミノグリカン分解酵素を投与すると、脊髄硬膜外腔内の髄核が顕著に溶解され、かつ脊髄には全く影響を与えないことを見出し、これに用いる医薬組成物および治療剤を提供することに成功し、本発明に至った。
【００１４】
すなわち本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体を含有する、脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物（本明細書中では単に「本発明組成物」ともいう）、およびグリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする、髄核が硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤（本明細書中では単に「本発明治療剤」ともいう）を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態について説明する。
＜１＞本発明組成物
本発明組成物は、グリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体を含有する、脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物である。以下に、本発明組成物で用いることができるグリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体について詳述する。
【００１６】
（１）グリコサミノグリカン分解酵素
本発明組成物に用いることができるグリコサミノグリカン分解酵素は、髄核中に含有されるグリコサミノグリカンの１種または２種以上を分解する作用を有するものであれば特に限定されないが、コンドロイチン硫酸を分解する作用を有する酵素（コンドロイチナーゼ）又はケラタン硫酸を分解する作用を有する酵素（ケラタナーゼ）であることが好ましい。特にコンドロイチナーゼであることがより好ましい。
【００１７】
本発明組成物で用いることができるコンドロイチナーゼは、コンドロイチン硫酸を分解する酵素である限り特に限定されるものではない。コンドロイチナーゼとして、具体的には、コンドロイチナーゼＡＢＣ(Proteus vulgaris由来；特開平６−１５３９４７号公報、T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523(1968)、S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543(1968))、コンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来；T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523(1968))、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来；K. Hiyama, S. Okada, J. Biol. Chem.,250, 1824 (1975)、K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem.(Tokyo), 80, 1201(1976))、コンドロイチナーゼＡＣIII(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来；Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun.,56, 973(1974)、Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121(1975)、前山賢一、多和田明、上野暁子、吉田圭一、生化学、57, 1189(1985))、コンドロイチナーゼＣ(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))等が知られており、これらのコンドロイチナーゼのいずれをも用いることができる。また、特開平９−１６８３８４号公報に記載されているヒト由来のコンドロイチン硫酸分解酵素や、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ(chondroitin sulfate ABC exolyase； A. Hamai, N. Hashimoto, H. Mochizuki, F. Kato, Y. Makiguchi, K. Horie and S. Suzuki, J. Biol. Chem.,272, 9123-9130(1997)）等のコンドロイチナーゼも用いることができる。
【００１８】
これらの各種コンドロイチナーゼはあくまで例示であり、本発明組成物で用いることができるコンドロイチナーゼはこれらに限定されるものではない。なお、本発明組成物において用いるコンドロイチナーゼは、１種類のコンドロイチナーゼであってもよく、あるいは複数種のコンドロイチナーゼの混合物であってもよく、本明細書において単に「コンドロイチナーゼ」といった場合には、これら両方の意味を包含する。
【００１９】
また、本発明組成物に用いることができるケラタナーゼとして具体的には、例えばエシェリキア・フロインディ（Escherichia freundii）由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ（H.Nakagawa, T.Yamada, J-L.Chien, A.Gardas, M.Kitamikado, S-C.Li, Y-T.Li, J.Biol.Chem., 255, 5955(1980)）、シュードモナス・エスピー．（Pseudomonas sp.）IFO-13309株由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ（K.Nakazawa, N.Suzuki, S.Suzuki, J.Biol.Chem., 250, 905(1975)、K.Nakazawa, S.Suzuki, J.Biol.Chem.,250, 912(1975)）、特公昭５７−４１２３６号公報に開示されているシュードモナス・レプティリボーラ（Pseudomonas reptilivora）が産生するエンド−β−ガラクトシダーゼ、バチルス・エスピー．（Bacillus sp.）Ks36由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（橋本信一、森川清志、菊池博、吉田圭一、徳安清親、生化学、60, 935 (1988)）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）KsT202由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＷＯ９６／１６１６６号公報に記載）等が知られており、これらのケラタナーゼのいずれをも本発明組成物において用いることができる。
【００２０】
これらの各種ケラタナーゼはあくまで例示であり、本発明組成物で用いることができるケラタナーゼはこれらに限定されるものではない。なお、本発明組成物において用いるケラタナーゼは、１種類のケラタナーゼであってもよく、あるいは複数種のケラタナーゼの混合物であってもよく、本明細書において単に「ケラタナーゼ」といった場合には、これら両方の意味を包含する。
【００２１】
本発明組成物に用いるグリコサミノグリカン分解酵素としては、コンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが極めて好ましい。また、コンドロイチナーゼＡＢＣの中でも、特に、Proteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが好ましい。
【００２２】
本発明組成物に用いるグリコサミノグリカン分解酵素は、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まない酵素であることが好ましい。例えばグリコサミノグリカン分解酵素としてコンドロイチナーゼを用いる場合、300U/mg蛋白以上の酵素活性を有する精製されたコンドロイチナーゼであることが好ましく、300U/mg蛋白以上の酵素活性を有し、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量が検出限界以下である精製されたコンドロイチナーゼがより好ましく、このような特性をもつ精製されたコンドロイチナーゼＡＢＣが特に好ましい。
【００２３】
なお、本明細書においてグリコサミノグリカン分解酵素の１Ｕ(単位)は、至適ｐＨおよび至適温度付近の条件において、グリコサミノグリカンから１分間に１マイクロモルの反応生成物を遊離させる酵素量である。念のため、以下に各種グリコサミノグリカン分解酵素の１Ｕの定義を示す。
【００２４】
コンドロイチナーゼＡＢＣの１Ｕとは、pH8.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
またコンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来）の１Ｕとは、pH7.3、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００２５】
また、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来）の１Ｕとは、pH6.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００２６】
また、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来）の１Ｕとは、pH8.0、30℃で１分間にデルマタン硫酸から１マイクロモルのヘキスロン酸残基に相当するUV吸収物質を遊離させる酵素量と定義される。
【００２７】
また、エシェリキア・フロインディ（Escherichia freundii）由来のエンド−β−ガラクトシダーゼの１Ｕとは、pH5.8、37℃で１分間にケラタン硫酸から１マイクロモルのガラクトースに相当する還元基を遊離させる酵素量と定義される。
【００２８】
また、シュードモナス・エスピー．（Pseudomonas sp.）IFO-13309株由来のエンド−β−ガラクトシダーゼの１Ｕとは、pH7.4、37℃で１分間にケラタン硫酸から１マイクロモルのガラクトースに相当する還元基を遊離させる酵素量と定義される。
【００２９】
また、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）Ks36由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの１Ｕとは、pH6.5、37℃で１分間にケラタン硫酸から１マイクロモルのＮ−アセチルグルコサミンに相当する還元基を遊離させる酵素量と定義される。
【００３０】
例えば、酵素活性が300U/mg 蛋白以上であるコンドロイチナーゼＡＢＣを使用することにより、注射用医薬品として生体内に投与した際に周辺組織に影響を与えること無く、目的部位（例えば、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアの脊髄硬膜外腔）のプロテオグリカンを適切に分解することができ、安全性と有効性が高い医薬とすることができる。このようなコンドロイチナーゼＡＢＣは、例えば、特開平６−１５３９４７号公報に記載の方法で得ることができる。
【００３１】
本発明組成物においては、１種類のグリコサミノグリカン分解酵素を用いてもよく、あるいは複数種のグリコサミノグリカン分解酵素の混合物であってもよい。例えば１種類又は２種類以上のコンドロイチナーゼと１種類又は２種類以上のケラタナーゼとの混合物も、本発明組成物に用いることができる。
【００３２】
本発明組成物においては、このようなグリコサミノグリカン分解酵素を、硬膜外に存在する髄核を溶解するために有効な量を含有せしめることが好ましい。ここで「有効な量」とは、突出、遊走等により脊髄硬膜外腔に存在する髄核（以下、「硬膜外髄核」ともいう）を溶解し、硬膜外髄核による影響を排除せしめるのに有効な量を意味する。この量は、患者の症状、年齢等によって異なるものであり、硬膜外髄核を溶解し、硬膜外髄核による影響を排除せしめるのに有効な量である限りにおいて特に限定されるものではないが、通常、１箇所に１回投与する分の本発明組成物中においては５Ｕ以上が好ましく、５〜４００Ｕがより好ましく、５〜２００Ｕがさらに好ましい。
【００３３】
また、本発明組成物には、グリコサミノグリカン分解酵素と共に、このグリコサミノグリカン分解酵素以外の髄核溶解作用を有する物質を有効成分として配合することができる。なお、ここにいう「グリコサミノグリカン分解酵素以外の髄核溶解作用を有する物質」は、グリコサミノグリカン分解酵素との組合せ配合又は組合せ投与により、重篤な副作用が惹起されたり、一方の物質が他方の物質の本来有する髄核溶解作用を阻害する物質ではない限りにおいて特に限定されない。尚、本発明組成物は脊髄硬膜外腔内に投与するので、本発明組成物と脊髄を溶解するような蛋白分解酵素等との組合わせ配合又は組合わせ投与は行わないように注意すべきである。
【００３４】
（２）医薬担体
本発明組成物に用いる医薬担体としては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等、通常医薬に用いられる成分が例示される。
【００３５】
本発明組成物に用いる医薬担体としては、医薬担体１ｇあたり還元性不純物の量が、アンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法において０．４ｍＬ以下、特に０.３６ｍＬ以下であるものが好ましく、さらに、過酸化物濃度が２０ｐｐｍ以下、特に１８.５ppm以下であるものがより好ましい。こうすることにより、本発明組成物が凍結乾燥物として提供される場合、凍結乾燥前後でグリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性の低下を極めて少なくすることができる。また常温で長期間保存しても、グリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性の低下を極めて少なくすることができる。例えば、窒素充填したガラス容器内で４０℃で３０日間保存した場合、保存開始時のグリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性の９０％以上を保持させることも可能である。
【００３６】
グリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性の測定は公知の方法で行うことができるが、例えば、グリコサミノグリカンを基質にして、グリコサミノグリカン分解酵素を作用させた時に生成する二糖類を、吸光光度法で測定することにより求めることができる。
【００３７】
医薬担体中の還元性不純物の量は、アンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法により測定することができる。「アンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法」とは、医薬担体２ｇを２５ｍＬの温水に溶解させ、希硫酸２５ｍＬとフェロイン（トリス（１，１０−フェナントロリン）鉄(II)錯体：[Fe(C12H8N2)3]2+）０．１ｍＬを加え、０．０１Ｎのアンモニウムセリウムニトレートで、赤色から青緑色に変色し３０秒維持するまで滴定する方法である。
【００３８】
また、医薬担体中の過酸化物濃度は、医薬担体１ｇを正確にはかりとり、蒸留水を加えて１０ｍＬとし、すなわち１０％（w/v）水溶液とし、この水溶液０．８ｍＬに２０％(v/v)硫酸０．２５ｍＬと１Ｍ TiSO4(BDH製)０．１５ｍＬを加え、４０８ｎｍの紫外部吸収を測定し、その後既知濃度のH2O2を用いて作成した検量線を基に、H2O2濃度を算出する方法によって測定することができる。
【００３９】
本発明組成物において使用することを望む医薬担体中の還元性不純物の量及び／又は過酸化物濃度が前記で規定する限度を超えている場合、あるいは所期のレベル以下に低下させたい場合には、例えば、医薬担体を常法により活性炭で処理することにより、還元性不純物の量及び過酸化物濃度を低減させることができる。また、過酸化物濃度は医薬担体を加熱処理することによっても低減させることができる。
【００４０】
本発明組成物で用いることができる医薬担体として具体的には、例えば、デキストラン類、サッカロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、血清アルブミン、ゼラチン、クレアチニン、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）などが挙げられる。
【００４１】
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート(polysorbate))としては、ポリオキシエチレンソルビタン（エチレンオキシドの重合度約20）のモノラウレート、モノパルミテート、モノオレエート、モノステアレート、トリオレエート等を挙げることができる。市販品としては、ポリソルベート80 (ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(20 E.O.))、ポリソルベート60（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(20 E.O.))、ポリソルべート40（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート (20 E.O.))、ポリソルベート20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20 E.O.))、ポリソルベート21, 81, 65, 85等を例示することができる（ここで20 E.O. とは、ポリオキシエチレン部分のエチレンオキシドの重合度が約２０であることを意味する）。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、市販品のＨＣＯ−10、ＨＣＯ−50、ＨＣＯ−60（日光ケミカルズ）等を例示することができる。またショ糖脂肪酸エステルとしては、市販品のＤＫエステルＦ−160（第一工業製薬（株））、リヨウトーシュガーエステル（三菱化学食品）等を例示することができる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロキサマー(poloxamer)）としては、市販品のプルロニックＦ−68（旭電化工業（株））等を例示できる。
【００４２】
また、緩衝剤としては生理学上許容されるものであればよく、特に限定されるものではなく、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、アミノ酢酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミン等の１種以上を含有する緩衝剤が例示される。
【００４３】
本発明組成物で用いる医薬担体は、医薬として使用できる程度の純度であり、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。
本発明組成物においては、これら医薬担体を適宜組合わせて用いることができる。その中でも、ポリエチレングリコール及びサッカロースのいずれかもしくはこれらの混合物、またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、特にポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（20 E.O.）が好ましい。
【００４４】
ポリエチレングリコールとサッカロースとの混合物は、凍結乾燥形態で本発明組成物を提供する場合、凍結乾燥後のグリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性低下を抑え、凍結乾燥物中の水分含量を低く保持することができ、凍結乾燥物を再溶解した時に澄明でかつ異物が存在せず、また、凍結乾燥物の長期間保存によるグリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性低下が少ないという効果を有する点から、特に好ましい。
【００４５】
この場合に用いるポリエチレングリコールとしては、ポリエチレングリコール１ｇあたりの還元性不純物の量が、アンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法において０．４ｍＬ以下、特に０.３６ｍＬ以下のものが好ましいが、さらに、ポリエチレングリコール１ｇ中の過酸化物濃度が、２０ｐｐｍ以下、特に１８.５ｐｐｍ以下であるものを用いることがより好ましい。
【００４６】
また、ポリエチレングリコールは平均分子量が２００〜２５０００であるものが好ましく、さらには常温で固体であるもの、例えば、平均分子量が２０００〜９０００であるものがより好ましく、２０００〜４０００であるものが特に好ましく、３０００〜４０００であるものが極めて好ましい。平均分子量が３０００〜４０００であるポリエチレングリコールとしては、例えば平均分子量３２５０、３３５０および４０００のものを例示することができる。
【００４７】
ポリエチレングリコールと併用されるサッカロースもまた、還元性不純物の量がアンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法においてサッカロース１ｇあたり０．４ｍＬ以下、特に０.３６ｍＬ以下であるものを用いることが好ましい。さらに、サッカロース１ｇあたりの過酸化物濃度が、２０ｐｐｍ以下、特に１８.５ｐｐｍ以下であるものを用いることがより好ましい。
【００４８】
なお、市販のサッカロースは、一般にエンドトキシン含量が高いので、活性炭処理等により１０％(w/w)サッカロース溶液中におけるエンドトキシン濃度が０．０３ＥＵ／ｍＬ以下、望ましくは０.０１ＥＵ／ｍＬ以下、より一層望ましくは０.００６ＥＵ／ｍＬ以下となるように処理することが好ましい。
【００４９】
サッカロース中のエンドトキシン濃度は、公知のエンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。リムルス試験法に用いるリムルス試薬としては、エンドトキシン特異的リムルス試薬を用いることが好ましい。リムルス試薬としては、例えば次に挙げる市販のリムルス試薬を用いることができる；トキシカラーシステムＬＳ−６，ＬＳ−２０，ＬＳ−２００、エンドスペシーＥＳ−６，エンドスペシーＥＳ−２００（以上、生化学工業株式会社販売）、リムルスＥＳ−IIテストワコー，リムルスＥＳ−IIシングルテストワコー，リムルスＥＳ−IIIテストワコー，リムルスＥＳ−Ｊテストワコー（以上、和光純薬工業株式会社販売）。
【００５０】
なお、医薬担体としてポリエチレングリコールとサッカロースとの混合物を用いる場合、ポリエチレングリコールとサッカロースの混合物１ｇあたりの還元性不純物の量がアンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法において０．４ｍＬ以下、特に０.３６ｍＬ以下となるようにすることが好ましく、さらに、ポリエチレングリコールとサッカロースの混合物１ｇ中の過酸化物濃度が２０ｐｐｍ以下、特に１８.５ｐｐｍ以下となるようにすることがより好ましい。
【００５１】
医薬担体としてポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを用いる場合、該エステル１ｇあたりの還元性不純物の量がアンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法において０．４ｍＬ以下、特に０.３６ｍＬ以下であるポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを使用することが好ましい。さらに該エステル１ｇあたりの過酸化物濃度が、２０ｐｐｍ以下、特に１８.５ｐｐｍ以下であるものを用いることがより好ましい。
【００５２】
医薬担体としてポリエチレングリコールとサッカロースの混合物を用いる場合、ポリエチレングリコール／サッカロースの重量比が一般に０／１〜１０／１程度となるように配合することが好ましく、ポリエチレングリコール／サッカロースの重量比が２／１程度となるように配合することが特に好ましい。
【００５３】
等張化剤としては、塩化ナトリウムなどの塩類、糖類などが挙げられる。
【００５４】
本発明組成物中のグリコサミノグリカン分解酵素と医薬担体の配合比率は特に限定されるものではなく、投与量や本発明組成物の形態等に応じて、当業者が適宜決定することができる。例えば、本発明組成物を凍結乾燥状態で提供(保存)する場合、本発明組成物中のグリコサミノグリカン分解酵素の含量は、凍結乾燥ケーキの形状が維持できる程度とすることが好ましい。
【００５５】
本発明組成物の調製は、グリコサミノグリカン分解酵素及び前記の如き医薬担体を用い、製剤学的に公知の方法を用いて行なうことができる。また、本発明組成物は、溶液状態、凍結状態、乾燥状態のいずれの状態であってもよい。
【００５６】
これらの中で、本発明組成物の好ましい状態は乾燥状態であり、より好ましくは凍結乾燥状態、すなわち凍結乾燥物である。
凍結乾燥物として提供される本発明組成物の場合、一般に水分含量が低いほど凍結乾燥製剤の安定性が向上すると考えられていること、および凍結乾燥製剤の水分含量としては３％(w/w)以下を目標に設定することが製剤学上通常行われていることから、本発明組成物の凍結乾燥物中の水分含量もまた、３％(w/w)以下とすることが好ましい。水分含量は、例えば、サンプルを以下の条件で加熱し、加熱前後の重量をマイクロ天秤で測り、減少した重量を水分とする（加熱条件：サンプルを２５℃から１０５℃まで、２．５℃／分で加熱し、１０５℃に達したら２０分間１０５℃で保持する）、乾燥減量法（ＴＧ法）、あるいはサンプルをメタノール中で３分間攪拌し、水分を抽出し、抽出された水分に電量滴定を行い、要した電気量（クーロン）から水分量を換算する、カールフィッシャー法で測定することができる。
【００５７】
凍結乾燥物として提供される本発明組成物は、該凍結乾燥物を生理食塩水で溶解した時に、澄明でありかつ異物が存在しないものであることが好ましい。澄明であることおよび異物が存在しないことは、肉眼による観察により容易に判定することができる。
【００５８】
本発明組成物は、溶液状態（本発明組成物が凍結状態である場合は、凍結前および融解後の溶液状態、本発明組成物が凍結乾燥組成物である場合は、凍結乾燥前および溶媒添加による再溶解後の溶液状態）で、通常、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８を示すように調整することが望ましい。このために本発明組成物には、通常該ｐＨ領域に維持可能な緩衝剤が配合される。そのような緩衝剤としては生理学上許容されるものであればよく、特に限定されず、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、アミノ酢酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミンまたはそれらの混合物が例示される。特にリン酸塩緩衝液（剤）が好ましい。これらの緩衝剤によって本発明組成物を溶液状態においてpH領域を５〜９、好ましくは６〜８に調整、保持することができる。なお、ｐＨ５より低い場合および９より高い場合にはグリコサミノグリカン分解酵素が失活したり、溶液状態で不溶物が生成することがある。また、本発明組成物中の緩衝剤の濃度は、溶液状態で１ｍＭ以上、好ましくは10〜50mMとすることができる。本発明組成物は、緩衝剤のほかに、等張化のために必要な成分（塩化ナトリウムなどの塩類、糖類など）や、保存剤、無痛化剤等を含有していてもよい。
【００５９】
本発明組成物は、そのまま医薬品として投与するための最終剤形として用いることができ、あるいは他の最終剤形医薬品、例えば、液剤、凍結乾燥剤等の原料として使用することもできる。
【００６０】
本発明組成物は、グリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする注射用製剤として主に使用される。本発明組成物を溶液状態の注射用製剤として提供する場合、前記の方法で製造される溶液状態の本発明組成物を、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存し、注射剤として投与に供することができる。
【００６１】
本発明組成物を凍結状態の注射用製剤として提供する場合、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に、前記の方法で製造される凍結状態の本発明組成物を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に融解させて注射剤として投与に供することができる。
【００６２】
また、本発明組成物を乾燥状態の注射用製剤として提供する場合、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に前記の方法で製造される乾燥状態の本発明組成物を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液またはソルビトール水溶液等で溶解し、注射剤として投与に供することができる。乾燥状態の本発明組成物は、溶解用の溶媒とセットで提供してもよい。
【００６３】
以上に述べた注射用製剤の中でも、乾燥状態のものが好ましく、凍結乾燥状態のものがより好ましい。すなわち、本発明組成物は注射用凍結乾燥組成物の形態であることが特に好ましい。
【００６４】
本発明組成物は、注射剤として脊髄硬膜外腔に投与することができる。
なお、本発明組成物は特に硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアの治療に有用であることから、前記髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアの脊髄硬膜外腔に投与されることがより好ましい。
【００６５】
投与量は、患者の症状、年令等によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、例えば、グリコサミノグリカン分解酵素としてコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、１箇所に投与する場合、１回あたり概ね５〜２００Ｕ程度を投与することができる。
【００６６】
また本発明組成物は、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアを発症しうる脊椎動物、特に哺乳動物の前記髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアの脊髄硬膜外腔に投与する組成物とすることができるが、ヒトの硬膜外遊走型椎間板ヘルニアまたは経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアの脊髄硬膜外腔に投与する組成物とすることが好ましい。
【００６７】
＜２＞本発明治療剤
本発明治療剤は、グリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤である。本発明治療剤の有効成分として用いることができるグリコサミノグリカン分解酵素、有効成分の含有量、含有せしめることができる医薬担体、投与対象、投与部位、投与量、その他の説明は、上記した本発明組成物と全く同様である。
【００６８】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を試験例及び製剤例として具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００６９】
〔試験例〕
（１）急性毒性試験
グリコサミノグリカン分解酵素（ここではコンドロイチナーゼＡＢＣ(生化学工業株式会社製)；以下、単にCABCともいう）の急性毒性試験を行った。
【００７０】
▲１▼ラットを用いた急性毒性試験
雌雄各５匹のラットに対し、２０００Ｕ／ｋｇのコンドロイチナーゼＡＢＣを、静脈内に単回投与した。投与後１４日間、一般状態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。１４日後に剖検して主要臓器の肉眼的観察を行った。
【００７１】
その結果、死亡した動物は観察されず、一般状態、体重、剖検所見のいずれにおいても変化は認められなかったことから、ラット静脈内投与によるコンドロイチナーゼＡＢＣの無影響量は２０００Ｕ／ｋｇと推定される。
【００７２】
▲２▼ビーグル犬を用いた急性毒性試験
雌雄各２匹のビーグル犬に対し、４０Ｕ／個体のコンドロイチナーゼＡＢＣを、脊柱管内の硬膜外に単回投与した。投与後４週間、一般状態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。４週後に剖検して主要臓器の肉眼的観察を行った。
【００７３】
その結果、死亡した動物は観察されず、一般状態、体重、剖検所見のいずれにおいても変化は認められなかったことから、イヌの硬膜外腔内投与によるコンドロイチナーゼＡＢＣの無影響量は４０Ｕ／ｋｇと推定される。
【００７４】
（２）薬効薬理試験
グリコサミノグリカン分解酵素による、脊髄硬膜外遊走髄核の消失促進作用の検討
ウサギの脊髄硬膜外に遊走した髄核のグリコサミノグリカン分解酵素による消失促進作用を検討するために、蛍光標識髄核をウサギ硬膜外腔に移植後、グリコサミノグリカン分解酵素を脊髄硬膜外腔に投与し、移植された蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量の変化を測定した。この実験において、移植された蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量が減少していれば、髄核の消失が促進されたことが示される。
【００７５】
（２−１）試験の概略
蛍光標識髄核を作製した後、ウサギ脊髄硬膜外腔に約50mgを移植した。直ちに25U/mlのグリコサミノグリカン分解酵素（ここではコンドロイチナーゼＡＢＣ）を２ml、ウサギ脊髄硬膜外腔中に投与した。翌日屠殺し、蛍光標識髄核を採取した。採取した蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量を測定した。
【００７６】
（２−２）材料
（２−２−１）動物
髄核を採取する動物(髄核採取動物)として、体重３kg前後の、正常なＪＷ種雌ウサギを使用した。
【００７７】
髄核が移植される動物(髄核移植動物)として、体重３kg前後の、正常なＪＷ種雌ウサギを使用した。
【００７８】
（２−２−２）試験物質
以下の試験物質は、全て無菌のものを使用した。
【００７９】
陰性対照物質として、リン酸生理食塩液(ＰＢＳ)を使用した。
被験物質（グリコサミノグリカン分解酵素）として、コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製；1000U/mL）の0.5mLとリン酸緩衝生理食塩液10mLを混合した溶液を使用した。
【００８０】
（２−３）髄核移植動物の群構成
本試験における群構成を表１に示す。
【００８１】
【表１】
【００８２】
（２−４）蛍光標識髄核の調製
以下の操作は全て無菌的に行った。
髄核採取動物（ウサギ）のＬ６／Ｌ７、Ｌ５／Ｌ６、Ｌ４／Ｌ５、Ｌ３／Ｌ４及びＬ２／Ｌ３の椎間板を摘出し、髄核を採取して50mLの遠沈管にプールした。髄核がプールされた50mLの遠沈管に、50mg/mLのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)溶液（Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解）を10μL添加し混合した。この遠沈管を遮光して、５日間、０℃で放置した。６日目に遠沈管内の髄核を50mgずつに分けて、リン酸生理食塩液を入れたチューブに入れ、遠心によって洗浄した。これによって得られた髄核を「蛍光標識髄核」とした。
【００８３】
蛍光標識髄核は、対照物質投与群５匹、CABC投与群６匹への移植に用いた。
【００８４】
（２−５）蛍光標識髄核の硬膜外腔への移植
蛍光標識髄核の硬膜外腔への移植は、ハロタン（商品名；武田薬品工業株式会社）の吸入麻酔下で行った。背中から尾にかけて毛刈した髄核移植動物をエタノールとイソジン（商品名；明治製菓株式会社）で消毒後、固定する。背部皮膚に４cm程メスを入れ、切開した。棘突起と椎弓を取り除き、Ｌ５とＬ６の間の黄色靱帯を縦切開し、スパーテルで隙間をつくりながら、蛍光標識髄核50mgを尾側に移植した。蛍光標識髄核は、Ｌ６の硬膜外腔内に移植された。移植後、切開した部位を縫合した。
【００８５】
（２−６）試験物質の投与
試験物質を投与するために、蛍光標識髄核を移植した部位より尾側のＬ６／Ｌ７の椎間板付近の皮膚を切開し、蛍光標識髄核を移植した部位より尾側のＬ６／Ｌ７の椎間板から硬膜外腔内に試験物質をインフュージョンポンプを用いて、0.5mL／分の速さで投与した。投与終了後、傷口を縫合してイソジン（商品名；明治製菓株式会社）で消毒した。
【００８６】
（２−７）移植蛍光標識髄核の回収
翌日、放血屠殺し、腰椎部Ｌ２〜馬尾までを摘出した。摘出後、腹側より脊柱管を露出させた。次いで脊髄下の埋め込み部より蛍光標識髄核を回収した。
【００８７】
（２−８）蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量の測定
（２−８−１）凍結乾燥
回収した蛍光標識髄核を凍結乾燥した。凍結乾燥終了後、重量を測定した。重量を測定した試料を別のチューブに移した。
【００８８】
（２−８−２）アクチナーゼ消化
0.25％アクチナーゼ溶液１mLを加え、５５℃で約３時間半消化した。消化後、アクチナーゼを失活させるため、１００℃で１０分間加熱処理し、アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液を得た。
【００８９】
（２−８−３）グリコサミノグリカンリアーゼによる消化
蛍光標識髄核中の各種グリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸及びヒアルロン酸）を定量するため、アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液を、以下のグリコサミノグリカンリアーゼにより消化した。
【００９０】
（２−８−３−１）コンドロイチナーゼによる消化
アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液 100μLをチューブに採取した。これに５U／mLのコンドロイチナーゼＡＢＣ(生化学工業株式会社製)を20μL添加した。軽く攪拌し、３７℃で２時間消化した。消化終了後、５U／mLのコンドロイチナーゼＡＣ−II(生化学工業株式会社製)を20μL、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)20μLを添加した。軽く攪拌し、３７℃で２時間消化して、蛍光標識髄核のコンドロイチナーゼ消化物を得た。この消化物は、蛍光標識髄核中のコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸の定量用サンプルとして用いた。
【００９１】
なおこの消化物に含まれるコンドロイチン硫酸由来のΔDi-6S（2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid)-6-O-sulfo-D-galactose）、ΔDi-4S（2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid)-4-O-sulfo-D-galactose）およびΔDi-0S（2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid)-D-galactose）を、後述する高速液体クロマトグラフィーで検出することにより、蛍光標識髄核中のコンドロイチン硫酸を定量することができる。また、この消化物に含まれるヒアルロン酸由来のΔDi-HA（2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid)-D-glucose）を後述する高速液体クロマトグラフィーで検出することにより、蛍光標識髄核中のヒアルロン酸を定量することができる。
【００９２】
（２−８−３−２）ケラタナーゼによる消化
アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液 100μLをチューブに採取した。これに0.1U／mLのケラタナーゼ(WO96/16166号公報に記載の方法で調製)を20μL、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)を20μL添加した。軽く攪拌し、３７℃で４８時間消化し、蛍光標識髄核のケラタナーゼ消化物を得た。この消化物は、蛍光標識髄核中のケラタン硫酸の定量用サンプルとして用いた。
【００９３】
なおこの消化物に含まれるケラタン硫酸由来のGal-GlcNAc(6S)（以下、Ｌ２ともいう）およびGal(6S)-GlcNAc(6S)（以下、Ｌ４ともいう）（Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、(6S)は6-O-硫酸エステルを、-はグリコシド結合をそれぞれ表す）を、後述する高速液体クロマトグラフィーで検出することにより、蛍光標識髄核中のケラタン硫酸を定量することができる。
【００９４】
（２−８−４）限外濾過
グリコサミノグリカンリアーゼによる消化後、それぞれの消化物の全量を、分画分子量１万の遠心限外濾過チューブ（商品名：ウルトラフリー、ミリポア社製）にのせて限外濾過した。
【００９５】
（２−８−５）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
限外濾過の濾液５〜１０μLをＨＰＬＣカラムにアプライし、ＨＰＬＣを行った。ΔDi-6S、ΔDi-4SおよびＬ４を分析する時のＨＰＬＣの条件を以下に示す。
【００９６】
(1)カラム：センシューパック N(CH3) 2-315-N、φ８ｍｍ×１５ｃｍ（センシュー科学株式会社製）
(2)溶出 ：20mM Na2SO4／アセトニトリル＝９／１
(3)流速 ：0.65ml／分
(4)反応液：0.1％２−シアノアセトアミドを含む50mM四ホウ酸ナトリウム
(5)反応液流速：0.65mL／分
(6)反応温度 ：１５０℃
(7)反応コイル：φ0.4ｍｍ×１０ｍ
(8)検出 ：励起波長３３１ｎｍ、蛍光波長３８３ｎｍ
またΔDi-HA、ΔDi-0SおよびＬ２を分析する時のＨＰＬＣの条件を以下に示す。
【００９７】
(1)カラム：アサヒパック NH2P、φ4.6ｍｍ×２５ｃｍ×２本（旭化成工業株式会社製）
(2)溶出 ：25mMテトラメチルアンモニウム−酢酸緩衝液(pH8.5)／アセトニトリル＝９／１
(3)流速 ：0.5ml／分
(4)反応液：0.1％２−シアノアセトアミドを含む50mM四ホウ酸ナトリウム
(5)反応液流速：0.5mL／分
(6)反応温度 ：１５０℃
(7)反応コイル：φ0.4ｍｍ×１０ｍ
(8)検出 ：励起波長３３１ｎｍ、蛍光波長３８３ｎｍ
【００９８】
対照物質投与群およびCABC投与群における蛍光標識髄核中のヒアルロン酸量の指標となるΔDi-HA量、コンドロイチン硫酸量の指標となるΔDi-CS（ΔDi-6S、ΔDi-4SおよびΔDi-0S）量、およびケラタン硫酸量の指標となるDi-KS（Ｌ２およびＬ４）量を図１に示す。なお、図１においてPBSは対照物質投与群を、C-ABCはCABC投与群をそれぞれ示す。また、図１中、ＨＡ、ＣＳ及びＫＳは、それぞれヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びケラタン硫酸を表し、＊＊は、２群間のｔ検定の結果ｐ＜0.05で有意差があること、＊は同じくｐ＜0.1で有意差があることを示す。
【００９９】
その結果、CABC投与群の移植髄核（蛍光標識髄核）中のグリコサミノグリカン量は、いずれも対照物質投与群に比較して顕著に減少していた。特に、CABC投与群の移植髄核（蛍光標識髄核）中のコンドロイチン硫酸量およびケラタン硫酸量は、対照物質投与群に比べて統計学的に有意な減少が見られた。
【０１００】
また組織学的観察の結果、CABC投与群では対照物質投与群よりも短時間で炎症細胞の浸潤が観察され、多数の顆粒球やマクロファージの出現が見られた。硬膜外遊走髄核はこれら炎症細胞によって貪食される。このことから、CABC投与によって、炎症細胞による硬膜外遊走髄核の貪食も促進できることが示された。
【０１０１】
また観察の結果、CABCは脊髄には全く影響を与えていなかった。
この結果から、脊髄硬膜外腔に投与されたCABCは、脊髄硬膜外腔内の髄核を極めて効率的に消化する作用を有すると共に、炎症細胞による硬膜外遊走髄核の貪食も促進し、極めて有効に硬膜外遊走髄核を消失させることが示された。また脊髄には全く影響を与えず、脊髄硬膜外腔内の髄核のみを消化することが示された。
【０１０２】
以上の結果から、脊髄硬膜外腔内投与用のグリコサミノグリカン分解酵素組成物、およびグリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする硬膜外遊走型椎間板ヘルニア治療剤は、脊髄硬膜外腔に遊走した椎間板ヘルニアの髄核を効率的に消化し、また炎症細胞による髄核の貪食をも促進することによって、極めて効率的かつ有効に硬膜外遊走髄核を消失せしめることができ、かつ脊髄に全く影響を与えないという効果を有することが示された。
【０１０３】
〔製剤例〕
▲１▼コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製；1000U/mL）0.5mLとリン酸緩衝生理食塩液10mLとを混合し、これを無菌濾過した後、２mlずつアンプルに分注し密封して、硬膜外遊走型椎間板ヘルニア治療用注射剤を製造した。
▲２▼10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に、ケラタナーゼII（Keratan sulfate endo-β-Ｎ-acetylglucosaminidase；生化学工業株式会社製）（終濃度20U／mL）、サッカロース（終濃度１％(w/w)）およびポリエチレングリコール４０００（終濃度２％(w/w)）を溶解し、１バイアルあたり0.5mLで分注し、凍結乾燥した。凍結乾燥は、室温から−45℃まで冷却凍結後、減圧下(60 mTorr)で12時間一次乾燥し、次に25℃まで昇温(12時間)し、25℃で10時間二次乾燥した。乾燥後、窒素ガスで復圧し、打栓して、脊髄硬膜外腔投与用の注射用凍結乾燥組成物を製造した。
【０１０４】
【発明の効果】
本発明により、グリコサミノグリカン分解酵素と医薬担体とを含有する脊髄硬膜外腔投与用医薬組成物、及びグリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤が提供される。この組成物および治療剤は、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等における脊髄硬膜外腔内の髄核を、速やかに、かつ顕著に溶解する作用を有し、また炎症細胞による髄核の貪食をも促進するので、髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアに伴う激痛を速やかに緩解することができる。またこの組成物および治療剤は、脊髄に影響を与えないので、安全な医薬品として極めて有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】 コンドロイチナーゼＡＢＣを脊髄硬膜外腔に投与したときの、脊髄硬膜外腔内の蛍光標識髄核中の各種グリコサミノグリカン量を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素の医薬用途に関する技術分野に属する。さらに詳細には、グリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体を含有する、脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物、およびグリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする硬膜外遊走型椎間板ヘルニア、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤に関わる技術分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】
椎間板ヘルニアは、椎間板内の髄核の突出等に起因する疾患であり、突出した髄核が付近の神経を刺激するために、腰痛等の症状が現れる。
【０００３】
椎間板ヘルニアの中でも、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアは、Macnabの分類においてsequestered type herniated intervertebral discとして分類される椎間板ヘルニアである。これは、椎間板内の髄核が線維輪の最外層と後縦靱帯を破り、中央椎間板とは完全に遊離して、脊柱管内の脊髄硬膜外腔に遊走した椎間板ヘルニアである。硬膜外遊走型椎間板ヘルニアは、期間が経過すれば自然に消失する椎間板ヘルニアであるが、自然消失するまでの期間は激痛を伴うことから、自然消失するまでの間、患者にとっては非常に苦痛であり、一刻も早く激痛から免れることができる治療が望まれている。
また、椎間板ヘルニアの中でも、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアは、Macnabの分類において transligamentous extrusion type herniated intervertebral discとして分類される椎間板ヘルニアである。この経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアは、椎間板内の髄核が線維輪の最外層と後縦靱帯を破って硬膜外に突出しているが中央椎間板とは遊離していない点で上記硬膜外遊走型椎間板ヘルニアとは異なる椎間板ヘルニアである。しかし、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアは、髄核が硬膜外に存在している点で硬膜外遊走型椎間板ヘルニアと共通しており、それにより症状が似通っているため、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアにおいても上記同様の治療が望まれている。
【０００４】
従来、椎間板ヘルニア症の治療に、キモパパインや、バクテリア由来のコラゲナーゼ等の蛋白分解酵素を、該ヘルニア症患者の椎間板内に注入し、ヘルニア部分を溶解する椎間板溶解療法(ＩＤ療法)が開発され、キモパパインが医薬品(商品名；キモダイアクチン)として市販されている。
【０００５】
しかし、上記蛋白分解酵素を用いるＩＤ療法は、脊椎・椎間板のヘルニア部分のみならず、周辺の構造組織の蛋白部分をも分解し、神経麻痺や、アレルギー発現等、副作用を生じやすい欠点を有する。
【０００６】
特に、脊髄硬膜外腔に突出したり遊走したりしている髄核を溶解するために上記蛋白分解酵素を脊髄硬膜外腔内に投与すると、蛋白質分解酵素が髄核を溶解すると同時に脊髄をも溶解してしまうことから、このような投与および治療は行うことができない。
【０００７】
近年、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはコンドロイチナーゼＡＣを椎間板に投与して椎間板ヘルニアを治療する試みが行なわれており、椎間板ヘルニアの治療薬としての用途が期待されている〔米国特許4696816号明細書、Clinical Orthopaedics, 253,301-308(1990)〕
【０００８】
例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣ(chondroitinase ABC)〔EC 4.2.2.4〕は、グリコサミノグリカンを不飽和オリゴ糖および不飽和二糖に分解する酵素で、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃおよび哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸の分解に対しては弱く触媒する酵素である。
【０００９】
上記したコンドロイチナーゼは、従来、椎間板内に直接投与されてきているが、このような投与では、髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアを治療するには有効ではない。これは、椎間板内へのコンドロイチナーゼ投与では、脊髄硬膜外腔に遊走している髄核を溶解できず、また、突出している髄核を溶解しにくいからである。
【００１０】
従来、コンドロイチナーゼのようなグリコサミノグリカン分解酵素を脊髄硬膜外腔に投与するための組成物は知られておらず、またコンドロイチナーゼのようなグリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤も知られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
このように、脊髄硬膜外遊走型椎間板ヘルニア、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療に用いることができる医薬組成物および薬剤が望まれていた。
【００１２】
本発明が解決すべき課題は、このような治療に用いることができる脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物、および硬膜外遊走型椎間板ヘルニア、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、脊髄硬膜外腔にグリコサミノグリカン分解酵素を投与すると、脊髄硬膜外腔内の髄核が顕著に溶解され、かつ脊髄には全く影響を与えないことを見出し、これに用いる医薬組成物および治療剤を提供することに成功し、本発明に至った。
【００１４】
すなわち本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体を含有する、脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物（本明細書中では単に「本発明組成物」ともいう）、およびグリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする、髄核が硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤（本明細書中では単に「本発明治療剤」ともいう）を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態について説明する。
＜１＞本発明組成物
本発明組成物は、グリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体を含有する、脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物である。以下に、本発明組成物で用いることができるグリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体について詳述する。
【００１６】
（１）グリコサミノグリカン分解酵素
本発明組成物に用いることができるグリコサミノグリカン分解酵素は、髄核中に含有されるグリコサミノグリカンの１種または２種以上を分解する作用を有するものであれば特に限定されないが、コンドロイチン硫酸を分解する作用を有する酵素（コンドロイチナーゼ）又はケラタン硫酸を分解する作用を有する酵素（ケラタナーゼ）であることが好ましい。特にコンドロイチナーゼであることがより好ましい。
【００１７】
本発明組成物で用いることができるコンドロイチナーゼは、コンドロイチン硫酸を分解する酵素である限り特に限定されるものではない。コンドロイチナーゼとして、具体的には、コンドロイチナーゼＡＢＣ(Proteus vulgaris由来；特開平６−１５３９４７号公報、T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523(1968)、S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543(1968))、コンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来；T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523(1968))、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来；K. Hiyama, S. Okada, J. Biol. Chem.,250, 1824 (1975)、K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem.(Tokyo), 80, 1201(1976))、コンドロイチナーゼＡＣIII(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来；Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun.,56, 973(1974)、Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121(1975)、前山賢一、多和田明、上野暁子、吉田圭一、生化学、57, 1189(1985))、コンドロイチナーゼＣ(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))等が知られており、これらのコンドロイチナーゼのいずれをも用いることができる。また、特開平９−１６８３８４号公報に記載されているヒト由来のコンドロイチン硫酸分解酵素や、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ(chondroitin sulfate ABC exolyase； A. Hamai, N. Hashimoto, H. Mochizuki, F. Kato, Y. Makiguchi, K. Horie and S. Suzuki, J. Biol. Chem.,272, 9123-9130(1997)）等のコンドロイチナーゼも用いることができる。
【００１８】
これらの各種コンドロイチナーゼはあくまで例示であり、本発明組成物で用いることができるコンドロイチナーゼはこれらに限定されるものではない。なお、本発明組成物において用いるコンドロイチナーゼは、１種類のコンドロイチナーゼであってもよく、あるいは複数種のコンドロイチナーゼの混合物であってもよく、本明細書において単に「コンドロイチナーゼ」といった場合には、これら両方の意味を包含する。
【００１９】
また、本発明組成物に用いることができるケラタナーゼとして具体的には、例えばエシェリキア・フロインディ（Escherichia freundii）由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ（H.Nakagawa, T.Yamada, J-L.Chien, A.Gardas, M.Kitamikado, S-C.Li, Y-T.Li, J.Biol.Chem., 255, 5955(1980)）、シュードモナス・エスピー．（Pseudomonas sp.）IFO-13309株由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ（K.Nakazawa, N.Suzuki, S.Suzuki, J.Biol.Chem., 250, 905(1975)、K.Nakazawa, S.Suzuki, J.Biol.Chem.,250, 912(1975)）、特公昭５７−４１２３６号公報に開示されているシュードモナス・レプティリボーラ（Pseudomonas reptilivora）が産生するエンド−β−ガラクトシダーゼ、バチルス・エスピー．（Bacillus sp.）Ks36由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（橋本信一、森川清志、菊池博、吉田圭一、徳安清親、生化学、60, 935 (1988)）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）KsT202由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＷＯ９６／１６１６６号公報に記載）等が知られており、これらのケラタナーゼのいずれをも本発明組成物において用いることができる。
【００２０】
これらの各種ケラタナーゼはあくまで例示であり、本発明組成物で用いることができるケラタナーゼはこれらに限定されるものではない。なお、本発明組成物において用いるケラタナーゼは、１種類のケラタナーゼであってもよく、あるいは複数種のケラタナーゼの混合物であってもよく、本明細書において単に「ケラタナーゼ」といった場合には、これら両方の意味を包含する。
【００２１】
本発明組成物に用いるグリコサミノグリカン分解酵素としては、コンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが極めて好ましい。また、コンドロイチナーゼＡＢＣの中でも、特に、Proteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが好ましい。
【００２２】
本発明組成物に用いるグリコサミノグリカン分解酵素は、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まない酵素であることが好ましい。例えばグリコサミノグリカン分解酵素としてコンドロイチナーゼを用いる場合、300U/mg蛋白以上の酵素活性を有する精製されたコンドロイチナーゼであることが好ましく、300U/mg蛋白以上の酵素活性を有し、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量が検出限界以下である精製されたコンドロイチナーゼがより好ましく、このような特性をもつ精製されたコンドロイチナーゼＡＢＣが特に好ましい。
【００２３】
なお、本明細書においてグリコサミノグリカン分解酵素の１Ｕ(単位)は、至適ｐＨおよび至適温度付近の条件において、グリコサミノグリカンから１分間に１マイクロモルの反応生成物を遊離させる酵素量である。念のため、以下に各種グリコサミノグリカン分解酵素の１Ｕの定義を示す。
【００２４】
コンドロイチナーゼＡＢＣの１Ｕとは、pH8.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
またコンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来）の１Ｕとは、pH7.3、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００２５】
また、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来）の１Ｕとは、pH6.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００２６】
また、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来）の１Ｕとは、pH8.0、30℃で１分間にデルマタン硫酸から１マイクロモルのヘキスロン酸残基に相当するUV吸収物質を遊離させる酵素量と定義される。
【００２７】
また、エシェリキア・フロインディ（Escherichia freundii）由来のエンド−β−ガラクトシダーゼの１Ｕとは、pH5.8、37℃で１分間にケラタン硫酸から１マイクロモルのガラクトースに相当する還元基を遊離させる酵素量と定義される。
【００２８】
また、シュードモナス・エスピー．（Pseudomonas sp.）IFO-13309株由来のエンド−β−ガラクトシダーゼの１Ｕとは、pH7.4、37℃で１分間にケラタン硫酸から１マイクロモルのガラクトースに相当する還元基を遊離させる酵素量と定義される。
【００２９】
また、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）Ks36由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの１Ｕとは、pH6.5、37℃で１分間にケラタン硫酸から１マイクロモルのＮ−アセチルグルコサミンに相当する還元基を遊離させる酵素量と定義される。
【００３０】
例えば、酵素活性が300U/mg 蛋白以上であるコンドロイチナーゼＡＢＣを使用することにより、注射用医薬品として生体内に投与した際に周辺組織に影響を与えること無く、目的部位（例えば、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアの脊髄硬膜外腔）のプロテオグリカンを適切に分解することができ、安全性と有効性が高い医薬とすることができる。このようなコンドロイチナーゼＡＢＣは、例えば、特開平６−１５３９４７号公報に記載の方法で得ることができる。
【００３１】
本発明組成物においては、１種類のグリコサミノグリカン分解酵素を用いてもよく、あるいは複数種のグリコサミノグリカン分解酵素の混合物であってもよい。例えば１種類又は２種類以上のコンドロイチナーゼと１種類又は２種類以上のケラタナーゼとの混合物も、本発明組成物に用いることができる。
【００３２】
本発明組成物においては、このようなグリコサミノグリカン分解酵素を、硬膜外に存在する髄核を溶解するために有効な量を含有せしめることが好ましい。ここで「有効な量」とは、突出、遊走等により脊髄硬膜外腔に存在する髄核（以下、「硬膜外髄核」ともいう）を溶解し、硬膜外髄核による影響を排除せしめるのに有効な量を意味する。この量は、患者の症状、年齢等によって異なるものであり、硬膜外髄核を溶解し、硬膜外髄核による影響を排除せしめるのに有効な量である限りにおいて特に限定されるものではないが、通常、１箇所に１回投与する分の本発明組成物中においては５Ｕ以上が好ましく、５〜４００Ｕがより好ましく、５〜２００Ｕがさらに好ましい。
【００３３】
また、本発明組成物には、グリコサミノグリカン分解酵素と共に、このグリコサミノグリカン分解酵素以外の髄核溶解作用を有する物質を有効成分として配合することができる。なお、ここにいう「グリコサミノグリカン分解酵素以外の髄核溶解作用を有する物質」は、グリコサミノグリカン分解酵素との組合せ配合又は組合せ投与により、重篤な副作用が惹起されたり、一方の物質が他方の物質の本来有する髄核溶解作用を阻害する物質ではない限りにおいて特に限定されない。尚、本発明組成物は脊髄硬膜外腔内に投与するので、本発明組成物と脊髄を溶解するような蛋白分解酵素等との組合わせ配合又は組合わせ投与は行わないように注意すべきである。
【００３４】
（２）医薬担体
本発明組成物に用いる医薬担体としては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等、通常医薬に用いられる成分が例示される。
【００３５】
本発明組成物に用いる医薬担体としては、医薬担体１ｇあたり還元性不純物の量が、アンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法において０．４ｍＬ以下、特に０.３６ｍＬ以下であるものが好ましく、さらに、過酸化物濃度が２０ｐｐｍ以下、特に１８.５ppm以下であるものがより好ましい。こうすることにより、本発明組成物が凍結乾燥物として提供される場合、凍結乾燥前後でグリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性の低下を極めて少なくすることができる。また常温で長期間保存しても、グリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性の低下を極めて少なくすることができる。例えば、窒素充填したガラス容器内で４０℃で３０日間保存した場合、保存開始時のグリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性の９０％以上を保持させることも可能である。
【００３６】
グリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性の測定は公知の方法で行うことができるが、例えば、グリコサミノグリカンを基質にして、グリコサミノグリカン分解酵素を作用させた時に生成する二糖類を、吸光光度法で測定することにより求めることができる。
【００３７】
医薬担体中の還元性不純物の量は、アンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法により測定することができる。「アンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法」とは、医薬担体２ｇを２５ｍＬの温水に溶解させ、希硫酸２５ｍＬとフェロイン（トリス（１，１０−フェナントロリン）鉄(II)錯体：[Fe(C12H8N2)3]2+）０．１ｍＬを加え、０．０１Ｎのアンモニウムセリウムニトレートで、赤色から青緑色に変色し３０秒維持するまで滴定する方法である。
【００３８】
また、医薬担体中の過酸化物濃度は、医薬担体１ｇを正確にはかりとり、蒸留水を加えて１０ｍＬとし、すなわち１０％（w/v）水溶液とし、この水溶液０．８ｍＬに２０％(v/v)硫酸０．２５ｍＬと１Ｍ TiSO4(BDH製)０．１５ｍＬを加え、４０８ｎｍの紫外部吸収を測定し、その後既知濃度のH2O2を用いて作成した検量線を基に、H2O2濃度を算出する方法によって測定することができる。
【００３９】
本発明組成物において使用することを望む医薬担体中の還元性不純物の量及び／又は過酸化物濃度が前記で規定する限度を超えている場合、あるいは所期のレベル以下に低下させたい場合には、例えば、医薬担体を常法により活性炭で処理することにより、還元性不純物の量及び過酸化物濃度を低減させることができる。また、過酸化物濃度は医薬担体を加熱処理することによっても低減させることができる。
【００４０】
本発明組成物で用いることができる医薬担体として具体的には、例えば、デキストラン類、サッカロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、血清アルブミン、ゼラチン、クレアチニン、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）などが挙げられる。
【００４１】
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート(polysorbate))としては、ポリオキシエチレンソルビタン（エチレンオキシドの重合度約20）のモノラウレート、モノパルミテート、モノオレエート、モノステアレート、トリオレエート等を挙げることができる。市販品としては、ポリソルベート80 (ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(20 E.O.))、ポリソルベート60（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(20 E.O.))、ポリソルべート40（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート (20 E.O.))、ポリソルベート20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20 E.O.))、ポリソルベート21, 81, 65, 85等を例示することができる（ここで20 E.O. とは、ポリオキシエチレン部分のエチレンオキシドの重合度が約２０であることを意味する）。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、市販品のＨＣＯ−10、ＨＣＯ−50、ＨＣＯ−60（日光ケミカルズ）等を例示することができる。またショ糖脂肪酸エステルとしては、市販品のＤＫエステルＦ−160（第一工業製薬（株））、リヨウトーシュガーエステル（三菱化学食品）等を例示することができる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロキサマー(poloxamer)）としては、市販品のプルロニックＦ−68（旭電化工業（株））等を例示できる。
【００４２】
また、緩衝剤としては生理学上許容されるものであればよく、特に限定されるものではなく、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、アミノ酢酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミン等の１種以上を含有する緩衝剤が例示される。
【００４３】
本発明組成物で用いる医薬担体は、医薬として使用できる程度の純度であり、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。
本発明組成物においては、これら医薬担体を適宜組合わせて用いることができる。その中でも、ポリエチレングリコール及びサッカロースのいずれかもしくはこれらの混合物、またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、特にポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（20 E.O.）が好ましい。
【００４４】
ポリエチレングリコールとサッカロースとの混合物は、凍結乾燥形態で本発明組成物を提供する場合、凍結乾燥後のグリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性低下を抑え、凍結乾燥物中の水分含量を低く保持することができ、凍結乾燥物を再溶解した時に澄明でかつ異物が存在せず、また、凍結乾燥物の長期間保存によるグリコサミノグリカン分解酵素の酵素活性低下が少ないという効果を有する点から、特に好ましい。
【００４５】
この場合に用いるポリエチレングリコールとしては、ポリエチレングリコール１ｇあたりの還元性不純物の量が、アンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法において０．４ｍＬ以下、特に０.３６ｍＬ以下のものが好ましいが、さらに、ポリエチレングリコール１ｇ中の過酸化物濃度が、２０ｐｐｍ以下、特に１８.５ｐｐｍ以下であるものを用いることがより好ましい。
【００４６】
また、ポリエチレングリコールは平均分子量が２００〜２５０００であるものが好ましく、さらには常温で固体であるもの、例えば、平均分子量が２０００〜９０００であるものがより好ましく、２０００〜４０００であるものが特に好ましく、３０００〜４０００であるものが極めて好ましい。平均分子量が３０００〜４０００であるポリエチレングリコールとしては、例えば平均分子量３２５０、３３５０および４０００のものを例示することができる。
【００４７】
ポリエチレングリコールと併用されるサッカロースもまた、還元性不純物の量がアンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法においてサッカロース１ｇあたり０．４ｍＬ以下、特に０.３６ｍＬ以下であるものを用いることが好ましい。さらに、サッカロース１ｇあたりの過酸化物濃度が、２０ｐｐｍ以下、特に１８.５ｐｐｍ以下であるものを用いることがより好ましい。
【００４８】
なお、市販のサッカロースは、一般にエンドトキシン含量が高いので、活性炭処理等により１０％(w/w)サッカロース溶液中におけるエンドトキシン濃度が０．０３ＥＵ／ｍＬ以下、望ましくは０.０１ＥＵ／ｍＬ以下、より一層望ましくは０.００６ＥＵ／ｍＬ以下となるように処理することが好ましい。
【００４９】
サッカロース中のエンドトキシン濃度は、公知のエンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。リムルス試験法に用いるリムルス試薬としては、エンドトキシン特異的リムルス試薬を用いることが好ましい。リムルス試薬としては、例えば次に挙げる市販のリムルス試薬を用いることができる；トキシカラーシステムＬＳ−６，ＬＳ−２０，ＬＳ−２００、エンドスペシーＥＳ−６，エンドスペシーＥＳ−２００（以上、生化学工業株式会社販売）、リムルスＥＳ−IIテストワコー，リムルスＥＳ−IIシングルテストワコー，リムルスＥＳ−IIIテストワコー，リムルスＥＳ−Ｊテストワコー（以上、和光純薬工業株式会社販売）。
【００５０】
なお、医薬担体としてポリエチレングリコールとサッカロースとの混合物を用いる場合、ポリエチレングリコールとサッカロースの混合物１ｇあたりの還元性不純物の量がアンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法において０．４ｍＬ以下、特に０.３６ｍＬ以下となるようにすることが好ましく、さらに、ポリエチレングリコールとサッカロースの混合物１ｇ中の過酸化物濃度が２０ｐｐｍ以下、特に１８.５ｐｐｍ以下となるようにすることがより好ましい。
【００５１】
医薬担体としてポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを用いる場合、該エステル１ｇあたりの還元性不純物の量がアンモニウムセリウムニトレートを用いた滴定法において０．４ｍＬ以下、特に０.３６ｍＬ以下であるポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを使用することが好ましい。さらに該エステル１ｇあたりの過酸化物濃度が、２０ｐｐｍ以下、特に１８.５ｐｐｍ以下であるものを用いることがより好ましい。
【００５２】
医薬担体としてポリエチレングリコールとサッカロースの混合物を用いる場合、ポリエチレングリコール／サッカロースの重量比が一般に０／１〜１０／１程度となるように配合することが好ましく、ポリエチレングリコール／サッカロースの重量比が２／１程度となるように配合することが特に好ましい。
【００５３】
等張化剤としては、塩化ナトリウムなどの塩類、糖類などが挙げられる。
【００５４】
本発明組成物中のグリコサミノグリカン分解酵素と医薬担体の配合比率は特に限定されるものではなく、投与量や本発明組成物の形態等に応じて、当業者が適宜決定することができる。例えば、本発明組成物を凍結乾燥状態で提供(保存)する場合、本発明組成物中のグリコサミノグリカン分解酵素の含量は、凍結乾燥ケーキの形状が維持できる程度とすることが好ましい。
【００５５】
本発明組成物の調製は、グリコサミノグリカン分解酵素及び前記の如き医薬担体を用い、製剤学的に公知の方法を用いて行なうことができる。また、本発明組成物は、溶液状態、凍結状態、乾燥状態のいずれの状態であってもよい。
【００５６】
これらの中で、本発明組成物の好ましい状態は乾燥状態であり、より好ましくは凍結乾燥状態、すなわち凍結乾燥物である。
凍結乾燥物として提供される本発明組成物の場合、一般に水分含量が低いほど凍結乾燥製剤の安定性が向上すると考えられていること、および凍結乾燥製剤の水分含量としては３％(w/w)以下を目標に設定することが製剤学上通常行われていることから、本発明組成物の凍結乾燥物中の水分含量もまた、３％(w/w)以下とすることが好ましい。水分含量は、例えば、サンプルを以下の条件で加熱し、加熱前後の重量をマイクロ天秤で測り、減少した重量を水分とする（加熱条件：サンプルを２５℃から１０５℃まで、２．５℃／分で加熱し、１０５℃に達したら２０分間１０５℃で保持する）、乾燥減量法（ＴＧ法）、あるいはサンプルをメタノール中で３分間攪拌し、水分を抽出し、抽出された水分に電量滴定を行い、要した電気量（クーロン）から水分量を換算する、カールフィッシャー法で測定することができる。
【００５７】
凍結乾燥物として提供される本発明組成物は、該凍結乾燥物を生理食塩水で溶解した時に、澄明でありかつ異物が存在しないものであることが好ましい。澄明であることおよび異物が存在しないことは、肉眼による観察により容易に判定することができる。
【００５８】
本発明組成物は、溶液状態（本発明組成物が凍結状態である場合は、凍結前および融解後の溶液状態、本発明組成物が凍結乾燥組成物である場合は、凍結乾燥前および溶媒添加による再溶解後の溶液状態）で、通常、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８を示すように調整することが望ましい。このために本発明組成物には、通常該ｐＨ領域に維持可能な緩衝剤が配合される。そのような緩衝剤としては生理学上許容されるものであればよく、特に限定されず、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、アミノ酢酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミンまたはそれらの混合物が例示される。特にリン酸塩緩衝液（剤）が好ましい。これらの緩衝剤によって本発明組成物を溶液状態においてpH領域を５〜９、好ましくは６〜８に調整、保持することができる。なお、ｐＨ５より低い場合および９より高い場合にはグリコサミノグリカン分解酵素が失活したり、溶液状態で不溶物が生成することがある。また、本発明組成物中の緩衝剤の濃度は、溶液状態で１ｍＭ以上、好ましくは10〜50mMとすることができる。本発明組成物は、緩衝剤のほかに、等張化のために必要な成分（塩化ナトリウムなどの塩類、糖類など）や、保存剤、無痛化剤等を含有していてもよい。
【００５９】
本発明組成物は、そのまま医薬品として投与するための最終剤形として用いることができ、あるいは他の最終剤形医薬品、例えば、液剤、凍結乾燥剤等の原料として使用することもできる。
【００６０】
本発明組成物は、グリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする注射用製剤として主に使用される。本発明組成物を溶液状態の注射用製剤として提供する場合、前記の方法で製造される溶液状態の本発明組成物を、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存し、注射剤として投与に供することができる。
【００６１】
本発明組成物を凍結状態の注射用製剤として提供する場合、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に、前記の方法で製造される凍結状態の本発明組成物を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に融解させて注射剤として投与に供することができる。
【００６２】
また、本発明組成物を乾燥状態の注射用製剤として提供する場合、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に前記の方法で製造される乾燥状態の本発明組成物を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液またはソルビトール水溶液等で溶解し、注射剤として投与に供することができる。乾燥状態の本発明組成物は、溶解用の溶媒とセットで提供してもよい。
【００６３】
以上に述べた注射用製剤の中でも、乾燥状態のものが好ましく、凍結乾燥状態のものがより好ましい。すなわち、本発明組成物は注射用凍結乾燥組成物の形態であることが特に好ましい。
【００６４】
本発明組成物は、注射剤として脊髄硬膜外腔に投与することができる。
なお、本発明組成物は特に硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアの治療に有用であることから、前記髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアの脊髄硬膜外腔に投与されることがより好ましい。
【００６５】
投与量は、患者の症状、年令等によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、例えば、グリコサミノグリカン分解酵素としてコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、１箇所に投与する場合、１回あたり概ね５〜２００Ｕ程度を投与することができる。
【００６６】
また本発明組成物は、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアを発症しうる脊椎動物、特に哺乳動物の前記髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアの脊髄硬膜外腔に投与する組成物とすることができるが、ヒトの硬膜外遊走型椎間板ヘルニアまたは経靭帯性脱出型椎間板ヘルニアの脊髄硬膜外腔に投与する組成物とすることが好ましい。
【００６７】
＜２＞本発明治療剤
本発明治療剤は、グリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤である。本発明治療剤の有効成分として用いることができるグリコサミノグリカン分解酵素、有効成分の含有量、含有せしめることができる医薬担体、投与対象、投与部位、投与量、その他の説明は、上記した本発明組成物と全く同様である。
【００６８】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を試験例及び製剤例として具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００６９】
〔試験例〕
（１）急性毒性試験
グリコサミノグリカン分解酵素（ここではコンドロイチナーゼＡＢＣ(生化学工業株式会社製)；以下、単にCABCともいう）の急性毒性試験を行った。
【００７０】
▲１▼ラットを用いた急性毒性試験
雌雄各５匹のラットに対し、２０００Ｕ／ｋｇのコンドロイチナーゼＡＢＣを、静脈内に単回投与した。投与後１４日間、一般状態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。１４日後に剖検して主要臓器の肉眼的観察を行った。
【００７１】
その結果、死亡した動物は観察されず、一般状態、体重、剖検所見のいずれにおいても変化は認められなかったことから、ラット静脈内投与によるコンドロイチナーゼＡＢＣの無影響量は２０００Ｕ／ｋｇと推定される。
【００７２】
▲２▼ビーグル犬を用いた急性毒性試験
雌雄各２匹のビーグル犬に対し、４０Ｕ／個体のコンドロイチナーゼＡＢＣを、脊柱管内の硬膜外に単回投与した。投与後４週間、一般状態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。４週後に剖検して主要臓器の肉眼的観察を行った。
【００７３】
その結果、死亡した動物は観察されず、一般状態、体重、剖検所見のいずれにおいても変化は認められなかったことから、イヌの硬膜外腔内投与によるコンドロイチナーゼＡＢＣの無影響量は４０Ｕ／ｋｇと推定される。
【００７４】
（２）薬効薬理試験
グリコサミノグリカン分解酵素による、脊髄硬膜外遊走髄核の消失促進作用の検討
ウサギの脊髄硬膜外に遊走した髄核のグリコサミノグリカン分解酵素による消失促進作用を検討するために、蛍光標識髄核をウサギ硬膜外腔に移植後、グリコサミノグリカン分解酵素を脊髄硬膜外腔に投与し、移植された蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量の変化を測定した。この実験において、移植された蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量が減少していれば、髄核の消失が促進されたことが示される。
【００７５】
（２−１）試験の概略
蛍光標識髄核を作製した後、ウサギ脊髄硬膜外腔に約50mgを移植した。直ちに25U/mlのグリコサミノグリカン分解酵素（ここではコンドロイチナーゼＡＢＣ）を２ml、ウサギ脊髄硬膜外腔中に投与した。翌日屠殺し、蛍光標識髄核を採取した。採取した蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量を測定した。
【００７６】
（２−２）材料
（２−２−１）動物
髄核を採取する動物(髄核採取動物)として、体重３kg前後の、正常なＪＷ種雌ウサギを使用した。
【００７７】
髄核が移植される動物(髄核移植動物)として、体重３kg前後の、正常なＪＷ種雌ウサギを使用した。
【００７８】
（２−２−２）試験物質
以下の試験物質は、全て無菌のものを使用した。
【００７９】
陰性対照物質として、リン酸生理食塩液(ＰＢＳ)を使用した。
被験物質（グリコサミノグリカン分解酵素）として、コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製；1000U/mL）の0.5mLとリン酸緩衝生理食塩液10mLを混合した溶液を使用した。
【００８０】
（２−３）髄核移植動物の群構成
本試験における群構成を表１に示す。
【００８１】
【表１】
（２−４）蛍光標識髄核の調製
以下の操作は全て無菌的に行った。
髄核採取動物（ウサギ）のＬ６／Ｌ７、Ｌ５／Ｌ６、Ｌ４／Ｌ５、Ｌ３／Ｌ４及びＬ２／Ｌ３の椎間板を摘出し、髄核を採取して50mLの遠沈管にプールした。髄核がプールされた50mLの遠沈管に、50mg/mLのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)溶液（Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解）を10μL添加し混合した。この遠沈管を遮光して、５日間、０℃で放置した。６日目に遠沈管内の髄核を50mgずつに分けて、リン酸生理食塩液を入れたチューブに入れ、遠心によって洗浄した。これによって得られた髄核を「蛍光標識髄核」とした。
【００８３】
蛍光標識髄核は、対照物質投与群５匹、CABC投与群６匹への移植に用いた。
【００８４】
（２−５）蛍光標識髄核の硬膜外腔への移植
蛍光標識髄核の硬膜外腔への移植は、ハロタン（商品名；武田薬品工業株式会社）の吸入麻酔下で行った。背中から尾にかけて毛刈した髄核移植動物をエタノールとイソジン（商品名；明治製菓株式会社）で消毒後、固定する。背部皮膚に４cm程メスを入れ、切開した。棘突起と椎弓を取り除き、Ｌ５とＬ６の間の黄色靱帯を縦切開し、スパーテルで隙間をつくりながら、蛍光標識髄核50mgを尾側に移植した。蛍光標識髄核は、Ｌ６の硬膜外腔内に移植された。移植後、切開した部位を縫合した。
【００８５】
（２−６）試験物質の投与
試験物質を投与するために、蛍光標識髄核を移植した部位より尾側のＬ６／Ｌ７の椎間板付近の皮膚を切開し、蛍光標識髄核を移植した部位より尾側のＬ６／Ｌ７の椎間板から硬膜外腔内に試験物質をインフュージョンポンプを用いて、0.5mL／分の速さで投与した。投与終了後、傷口を縫合してイソジン（商品名；明治製菓株式会社）で消毒した。
【００８６】
（２−７）移植蛍光標識髄核の回収
翌日、放血屠殺し、腰椎部Ｌ２〜馬尾までを摘出した。摘出後、腹側より脊柱管を露出させた。次いで脊髄下の埋め込み部より蛍光標識髄核を回収した。
【００８７】
（２−８）蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量の測定
（２−８−１）凍結乾燥
回収した蛍光標識髄核を凍結乾燥した。凍結乾燥終了後、重量を測定した。重量を測定した試料を別のチューブに移した。
【００８８】
（２−８−２）アクチナーゼ消化
0.25％アクチナーゼ溶液１mLを加え、５５℃で約３時間半消化した。消化後、アクチナーゼを失活させるため、１００℃で１０分間加熱処理し、アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液を得た。
【００８９】
（２−８−３）グリコサミノグリカンリアーゼによる消化
蛍光標識髄核中の各種グリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸及びヒアルロン酸）を定量するため、アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液を、以下のグリコサミノグリカンリアーゼにより消化した。
【００９０】
（２−８−３−１）コンドロイチナーゼによる消化
アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液 100μLをチューブに採取した。これに５U／mLのコンドロイチナーゼＡＢＣ(生化学工業株式会社製)を20μL添加した。軽く攪拌し、３７℃で２時間消化した。消化終了後、５U／mLのコンドロイチナーゼＡＣ−II(生化学工業株式会社製)を20μL、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)20μLを添加した。軽く攪拌し、３７℃で２時間消化して、蛍光標識髄核のコンドロイチナーゼ消化物を得た。この消化物は、蛍光標識髄核中のコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸の定量用サンプルとして用いた。
【００９１】
なおこの消化物に含まれるコンドロイチン硫酸由来のΔDi-6S（2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid)-6-O-sulfo-D-galactose）、ΔDi-4S（2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid)-4-O-sulfo-D-galactose）およびΔDi-0S（2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid)-D-galactose）を、後述する高速液体クロマトグラフィーで検出することにより、蛍光標識髄核中のコンドロイチン硫酸を定量することができる。また、この消化物に含まれるヒアルロン酸由来のΔDi-HA（2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enopyranosyluronic acid)-D-glucose）を後述する高速液体クロマトグラフィーで検出することにより、蛍光標識髄核中のヒアルロン酸を定量することができる。
【００９２】
（２−８−３−２）ケラタナーゼによる消化
アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液 100μLをチューブに採取した。これに0.1U／mLのケラタナーゼ(WO96/16166号公報に記載の方法で調製)を20μL、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)を20μL添加した。軽く攪拌し、３７℃で４８時間消化し、蛍光標識髄核のケラタナーゼ消化物を得た。この消化物は、蛍光標識髄核中のケラタン硫酸の定量用サンプルとして用いた。
【００９３】
なおこの消化物に含まれるケラタン硫酸由来のGal-GlcNAc(6S)（以下、Ｌ２ともいう）およびGal(6S)-GlcNAc(6S)（以下、Ｌ４ともいう）（Galはガラクトース残基を、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基を、(6S)は6-O-硫酸エステルを、-はグリコシド結合をそれぞれ表す）を、後述する高速液体クロマトグラフィーで検出することにより、蛍光標識髄核中のケラタン硫酸を定量することができる。
【００９４】
（２−８−４）限外濾過
グリコサミノグリカンリアーゼによる消化後、それぞれの消化物の全量を、分画分子量１万の遠心限外濾過チューブ（商品名：ウルトラフリー、ミリポア社製）にのせて限外濾過した。
【００９５】
（２−８−５）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
限外濾過の濾液５〜１０μLをＨＰＬＣカラムにアプライし、ＨＰＬＣを行った。ΔDi-6S、ΔDi-4SおよびＬ４を分析する時のＨＰＬＣの条件を以下に示す。
【００９６】
(1)カラム：センシューパック N(CH3) 2-315-N、φ８ｍｍ×１５ｃｍ（センシュー科学株式会社製）
(2)溶出 ：20mM Na2SO4／アセトニトリル＝９／１
(3)流速 ：0.65ml／分
(4)反応液：0.1％２−シアノアセトアミドを含む50mM四ホウ酸ナトリウム
(5)反応液流速：0.65mL／分
(6)反応温度 ：１５０℃
(7)反応コイル：φ0.4ｍｍ×１０ｍ
(8)検出 ：励起波長３３１ｎｍ、蛍光波長３８３ｎｍ
またΔDi-HA、ΔDi-0SおよびＬ２を分析する時のＨＰＬＣの条件を以下に示す。
【００９７】
(1)カラム：アサヒパック NH2P、φ4.6ｍｍ×２５ｃｍ×２本（旭化成工業株式会社製）
(2)溶出 ：25mMテトラメチルアンモニウム−酢酸緩衝液(pH8.5)／アセトニトリル＝９／１
(3)流速 ：0.5ml／分
(4)反応液：0.1％２−シアノアセトアミドを含む50mM四ホウ酸ナトリウム
(5)反応液流速：0.5mL／分
(6)反応温度 ：１５０℃
(7)反応コイル：φ0.4ｍｍ×１０ｍ
(8)検出 ：励起波長３３１ｎｍ、蛍光波長３８３ｎｍ
【００９８】
対照物質投与群およびCABC投与群における蛍光標識髄核中のヒアルロン酸量の指標となるΔDi-HA量、コンドロイチン硫酸量の指標となるΔDi-CS（ΔDi-6S、ΔDi-4SおよびΔDi-0S）量、およびケラタン硫酸量の指標となるDi-KS（Ｌ２およびＬ４）量を図１に示す。なお、図１においてPBSは対照物質投与群を、C-ABCはCABC投与群をそれぞれ示す。また、図１中、ＨＡ、ＣＳ及びＫＳは、それぞれヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びケラタン硫酸を表し、＊＊は、２群間のｔ検定の結果ｐ＜0.05で有意差があること、＊は同じくｐ＜0.1で有意差があることを示す。
【００９９】
その結果、CABC投与群の移植髄核（蛍光標識髄核）中のグリコサミノグリカン量は、いずれも対照物質投与群に比較して顕著に減少していた。特に、CABC投与群の移植髄核（蛍光標識髄核）中のコンドロイチン硫酸量およびケラタン硫酸量は、対照物質投与群に比べて統計学的に有意な減少が見られた。
【０１００】
また組織学的観察の結果、CABC投与群では対照物質投与群よりも短時間で炎症細胞の浸潤が観察され、多数の顆粒球やマクロファージの出現が見られた。硬膜外遊走髄核はこれら炎症細胞によって貪食される。このことから、CABC投与によって、炎症細胞による硬膜外遊走髄核の貪食も促進できることが示された。
【０１０１】
また観察の結果、CABCは脊髄には全く影響を与えていなかった。
この結果から、脊髄硬膜外腔に投与されたCABCは、脊髄硬膜外腔内の髄核を極めて効率的に消化する作用を有すると共に、炎症細胞による硬膜外遊走髄核の貪食も促進し、極めて有効に硬膜外遊走髄核を消失させることが示された。また脊髄には全く影響を与えず、脊髄硬膜外腔内の髄核のみを消化することが示された。
【０１０２】
以上の結果から、脊髄硬膜外腔内投与用のグリコサミノグリカン分解酵素組成物、およびグリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする硬膜外遊走型椎間板ヘルニア治療剤は、脊髄硬膜外腔に遊走した椎間板ヘルニアの髄核を効率的に消化し、また炎症細胞による髄核の貪食をも促進することによって、極めて効率的かつ有効に硬膜外遊走髄核を消失せしめることができ、かつ脊髄に全く影響を与えないという効果を有することが示された。
【０１０３】
〔製剤例〕
▲１▼コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業株式会社製；1000U/mL）0.5mLとリン酸緩衝生理食塩液10mLとを混合し、これを無菌濾過した後、２mlずつアンプルに分注し密封して、硬膜外遊走型椎間板ヘルニア治療用注射剤を製造した。
▲２▼10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に、ケラタナーゼII（Keratan sulfate endo-β-Ｎ-acetylglucosaminidase；生化学工業株式会社製）（終濃度20U／mL）、サッカロース（終濃度１％(w/w)）およびポリエチレングリコール４０００（終濃度２％(w/w)）を溶解し、１バイアルあたり0.5mLで分注し、凍結乾燥した。凍結乾燥は、室温から−45℃まで冷却凍結後、減圧下(60 mTorr)で12時間一次乾燥し、次に25℃まで昇温(12時間)し、25℃で10時間二次乾燥した。乾燥後、窒素ガスで復圧し、打栓して、脊髄硬膜外腔投与用の注射用凍結乾燥組成物を製造した。
【０１０４】
【発明の効果】
本発明により、グリコサミノグリカン分解酵素と医薬担体とを含有する脊髄硬膜外腔投与用医薬組成物、及びグリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤が提供される。この組成物および治療剤は、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等における脊髄硬膜外腔内の髄核を、速やかに、かつ顕著に溶解する作用を有し、また炎症細胞による髄核の貪食をも促進するので、髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアに伴う激痛を速やかに緩解することができる。またこの組成物および治療剤は、脊髄に影響を与えないので、安全な医薬品として極めて有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】 コンドロイチナーゼＡＢＣを脊髄硬膜外腔に投与したときの、脊髄硬膜外腔内の蛍光標識髄核中の各種グリコサミノグリカン量を示す図である。
Claims (3)
- 硬膜外に存在する髄核を溶解するために有効な量のコンドロイチナーゼを有効成分とする、脊髄硬膜外腔に投与されることを特徴とする、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアの治療剤。
- 硬膜外遊走型椎間板ヘルニアが、ヒトの椎間板ヘルニアである、請求項１に記載の治療剤。
- コンドロイチナーゼが、コンドロイチナーゼＡＢＣである、請求項１又は２に記載の治療剤。
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