JP4790692B2 - 顆粒球又はマクロファージの浸潤及び出現促進剤 - Google Patents
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Description
ンドロイチン硫酸B(デルマタン硫酸)の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸の分解に対しては弱く触媒する酵素である。
う激痛を速やかに緩解することができる。またこの組成物および治療剤は、脊髄に影響を与えないので、安全な医薬品として極めて有用性が高い。
<1>本発明組成物
本発明組成物は、グリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体を含有する、脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物である。以下に、本発明組成物で用いることができるグリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体について詳述する。
本発明組成物に用いることができるグリコサミノグリカン分解酵素は、髄核中に含有されるグリコサミノグリカンの1種または2種以上を分解する作用を有するものであれば特に限定されないが、コンドロイチン硫酸を分解する作用を有する酵素(コンドロイチナーゼ)又はケラタン硫酸を分解する作用を有する酵素(ケラタナーゼ)であることが好ましい。特にコンドロイチナーゼであることがより好ましい。
Biol.Chem.,250, 1824 (1975)、K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem.(Tokyo), 80, 1201(1976))、コンドロイチナーゼACIII(Flavobacterium sp. Hp102由来;宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))、コンドロイチナーゼB(Flavobacterium heparinum由来;Y. M. Michelacci, C. P.Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun.,56, 973(1974)、Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121(1975)、前山賢一、多和田明、上野暁子、吉田圭一、生化学、57, 1189(1985))、コンドロイチナーゼC(Flavobacterium sp. Hp102由来;宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))等が知られており、これらのコンドロイチナーゼのいずれをも用いることができる。また、特開平9−168384号公報に記載されているヒト由来のコンドロイチン硫酸分解酵素や、コンドロイチン硫酸ABCエキソリアーゼ(chondroitin sulfate ABC exolyase; A. Hamai, N. Hashimoto, H. Mochizuki, F.
Kato, Y. Makiguchi, K. Horie and S. Suzuki, J. Biol. Chem.,272, 9123-9130(1997))等のコンドロイチナーゼも用いることができる。
hem., 250, 905(1975)、K.Nakazawa, S.Suzuki, J.Biol.Chem.,250, 912(1975))、特公昭57−41236号公報に開示されているシュードモナス・レプティリボーラ(Pseudomonas reptilivora)が産生するエンド−β−ガラクトシダーゼ、バチルス・エスピー.(Bacillus sp.)Ks36由来のエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ(橋本信一、森川清志、菊池博、吉田圭一、徳安清親、生化学、60, 935 (1988))、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)KsT202由来のエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ(WO96/16166号公報に記載)等が知られており、これらのケラタナーゼのいずれをも本発明組成物において用いることができる。
−ガラクトシダーゼの1Uとは、pH7.4、37℃で1分間にケラタン硫酸から1マイクロモルのガラクトースに相当する還元基を遊離させる酵素量と定義される。
本発明組成物に用いる医薬担体としては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等、通常医薬に用いられる成分が例示される。
活性の90%以上を保持させることも可能である。
E.O.))、ポリソルベート20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20 E.O.))、ポリソルベート21, 81, 65, 85等を例示することができる(ここで20 E.O. とは、ポリオキシエチレン部分のエチレンオキシドの重合度が約20であることを意味する)。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、市販品のHCO−10、HCO−50、HCO−60(日光ケミカルズ)等を例示することができる。またショ糖脂肪酸エステルとしては、市販品のDKエステルF−160(第一工業製薬(株))、リヨウトーシュガーエステル(三菱化学食品)等を例示することができる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール(ポロキサマー(poloxamer))としては、市販品のプルロニックF−68(旭電化工業(株))等を例示できる。
、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、アミノ酢酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミン等の1種以上を含有する緩衝剤が例示される。
株式会社販売)。
による再溶解後の溶液状態)で、通常、pH5〜9、好ましくは6〜8を示すように調整することが望ましい。このために本発明組成物には、通常該pH領域に維持可能な緩衝剤が配合される。そのような緩衝剤としては生理学上許容されるものであればよく、特に限定されず、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、アミノ酢酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミンまたはそれらの混合物が例示される。特にリン酸塩緩衝液(剤)が好ましい。これらの緩衝剤によって本発明組成物を溶液状態においてpH領域を5〜9、好ましくは6〜8に調整、保持することができる。なお、pH5より低い場合および9より高い場合にはグリコサミノグリカン分解酵素が失活したり、溶液状態で不溶物が生成することがある。また、本発明組成物中の緩衝剤の濃度は、溶液状態で1mM以上、好ましくは10〜50mMとすることができる。本発明組成物は、緩衝剤のほかに、等張化のために必要な成分(塩化ナトリウムなどの塩類、糖類など)や、保存剤、無痛化剤等を含有していてもよい。
本発明治療剤は、グリコサミノグリカン分解酵素を有効成分とする、硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや、経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアのための治療剤である。本発明治療剤の有効成分として用いることができるグリコサミノグリカン分解酵素、有効成分の含有量、含有せしめることができる医薬担体、投与対象、投与部位、投与量、その他の説明は、上記した本発明組成物と全く同様である。
(1)急性毒性試験
グリコサミノグリカン分解酵素(ここではコンドロイチナーゼABC(生化学工業株式会社製);以下、単にCABCともいう)の急性毒性試験を行った。
雌雄各5匹のラットに対し、2000U/kgのコンドロイチナーゼABCを、静脈内に単回投与した。投与後14日間、一般状態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。14日後に剖検して主要臓器の肉眼的観察を行った。
雌雄各2匹のビーグル犬に対し、40U/個体のコンドロイチナーゼABCを、脊柱管内の硬膜外に単回投与した。投与後4週間、一般状態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。4週後に剖検して主要臓器の肉眼的観察を行った。
グリコサミノグリカン分解酵素による、脊髄硬膜外遊走髄核の消失促進作用の検討ウサギの脊髄硬膜外に遊走した髄核のグリコサミノグリカン分解酵素による消失促進作用を検討するために、蛍光標識髄核をウサギ硬膜外腔に移植後、グリコサミノグリカン分解酵素を脊髄硬膜外腔に投与し、移植された蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量の変化を測定した。この実験において、移植された蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量が減少していれば、髄核の消失が促進されたことが示される。
蛍光標識髄核を作製した後、ウサギ脊髄硬膜外腔に約50mgを移植した。直ちに25U/mlのグリコサミノグリカン分解酵素(ここではコンドロイチナーゼABC)を2ml、ウサギ脊髄硬膜外腔中に投与した。翌日屠殺し、蛍光標識髄核を採取した。採取した蛍光標識髄核中のグリコサミノグリカン量を測定した。
(2−2−1)動物
髄核を採取する動物(髄核採取動物)として、体重3kg前後の、正常なJW種雌ウサギを使用した。
以下の試験物質は、全て無菌のものを使用した。
本試験における群構成を表1に示す。
以下の操作は全て無菌的に行った。髄核採取動物(ウサギ)のL6/L7、L5/L6、L4/L5、L3/L4及びL2/L3の椎間板を摘出し、髄核を採取して50mLの遠沈管にプールした。髄核がプールされた50mLの遠沈管に、50mg/mLのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)溶液(N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解)を10μL添加し混合した。この遠沈管を遮光して、5日間、0℃で放置した。6日目に遠沈管内の髄核を50mgずつに分けて、リン酸生理食塩液を入れたチューブに入れ、遠心によって洗浄した。これによって得られた髄核を「蛍光標識髄核」とした。
蛍光標識髄核の硬膜外腔への移植は、ハロタン(商品名;武田薬品工業株式会社)の吸入麻酔下で行った。背中から尾にかけて毛刈した髄核移植動物をエタノールとイソジン(商品名;明治製菓株式会社)で消毒後、固定する。背部皮膚に4cm程メスを入れ、切開した。棘突起と椎弓を取り除き、L5とL6の間の黄色靱帯を縦切開し、スパーテルで隙間をつくりながら、蛍光標識髄核50mgを尾側に移植した。蛍光標識髄核は、L6の硬膜外腔
内に移植された。移植後、切開した部位を縫合した。
試験物質を投与するために、蛍光標識髄核を移植した部位より尾側のL6/L7の椎間板付近の皮膚を切開し、蛍光標識髄核を移植した部位より尾側のL6/L7の椎間板から硬膜外腔内に試験物質をインフュージョンポンプを用いて、0.5mL/分の速さで投与した。投与終了後、傷口を縫合してイソジン(商品名;明治製菓株式会社)で消毒した。
翌日、放血屠殺し、腰椎部L2〜馬尾までを摘出した。摘出後、腹側より脊柱管を露出させた。次いで脊髄下の埋め込み部より蛍光標識髄核を回収した。
(2−8−1)凍結乾燥
回収した蛍光標識髄核を凍結乾燥した。凍結乾燥終了後、重量を測定した。重量を測定した試料を別のチューブに移した。
0.25%アクチナーゼ溶液1mLを加え、55℃で約3時間半消化した。消化後、アクチナーゼを失活させるため、100℃で10分間加熱処理し、アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液を得た。
蛍光標識髄核中の各種グリコサミノグリカン(コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸及びヒアルロン酸)を定量するため、アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液を、以下のグリコサミノグリカンリアーゼにより消化した。
アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液 100μLをチューブに採取した。これに5U/mLのコンドロイチナーゼABC(生化学工業株式会社製)を20μL添加した。軽く攪拌し、37℃で2時間消化した。消化終了後、5U/mLのコンドロイチナーゼAC−II(生化学工業株式会社製)を20μL、1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)20μLを添加した。軽く攪拌し、37℃で2時間消化して、蛍光標識髄核のコンドロイチナーゼ消化物を得た。この消化物は、蛍光標識髄核中のコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸の定量用サンプルとして用いた。
アクチナーゼ消化した蛍光標識髄核の溶液 100μLをチューブに採取した。これに0.1U/mLのケラタナーゼ(WO96/16166号公報に記載の方法で調製)を20μL、1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)を20μL添加した。軽く攪拌し、37℃で48時間消化し、蛍光標識髄核
のケラタナーゼ消化物を得た。この消化物は、蛍光標識髄核中のケラタン硫酸の定量用サンプルとして用いた。
グリコサミノグリカンリアーゼによる消化後、それぞれの消化物の全量を、分画分子量1万の遠心限外濾過チューブ(商品名:ウルトラフリー、ミリポア社製)にのせて限外濾過した。
限外濾過の濾液5〜10μLをHPLCカラムにアプライし、HPLCを行った。ΔDi-6S、ΔDi-4SおよびL4を分析する時のHPLCの条件を以下に示す。
(2)溶出:20mM Na2SO4/アセトニトリル=9/1
(3)流速:0.65ml/分
(4)反応液:0.1%2−シアノアセトアミドを含む50mM四ホウ酸ナトリウム
(5)反応液流速:0.65mL/分
(6)反応温度:150℃
(7)反応コイル:φ0.4mm×10m
(8)検出:励起波長331nm、蛍光波長383nmまたΔDi-HA、ΔDi-0SおよびL2を分析する時のHPLCの条件を以下に示す。
(2)溶出:25mMテトラメチルアンモニウム−酢酸緩衝液(pH8.5)/アセトニトリル=9/1(3)流速:0.5ml/分
(4)反応液:0.1%2−シアノアセトアミドを含む50mM四ホウ酸ナトリウム
(5)反応液流速:0.5mL/分
(6)反応温度:150℃
(7)反応コイル:φ0.4mm×10m
(8)検出:励起波長331nm、蛍光波長383nm
(i)コンドロイチナーゼABC(生化学工業株式会社製;1000U/mL)0.5mLとリン酸緩衝生理食塩液10mLとを混合し、これを無菌濾過した後、2mlずつアンプルに分注し密封して、硬膜外遊走型椎間板ヘルニア治療用注射剤を製造した。
(ii)10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に、ケラタナーゼII(Keratan sulfate endo-β-N-acetylglucosaminidase;生化学工業株式会社製)(終濃度20U/mL)、サッカロース(終濃度1%(w/w))およびポリエチレングリコール4000(終濃度2%(w/w))を溶解し、1バイアルあたり0.5mLで分注し、凍結乾燥した。凍結乾燥は、室温から−45℃まで冷却凍結後、減圧下(60 mTorr)で12時間一次乾燥し、次に25℃まで昇温(12時間)し、25℃で10時間二次乾燥した。乾燥後、窒素ガスで復圧し、打栓して、脊髄硬膜外腔投与用の注射用凍結乾燥組成物を製造した。
Claims (1)
- コンドロイチナーゼを有効成分とする、顆粒球又はマクロファージの浸潤及び出現促進剤(ただし、椎間板ヘルニア治療剤を除く)。
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