WO2019164007A1

WO2019164007A1 - 特発性側弯症マーカー

Info

Publication number: WO2019164007A1
Application number: PCT/JP2019/007195
Authority: WO
Inventors: 友厚木村; 庄二関; 紘士牧野
Original assignee: 国立大学法人富山大学
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2019-08-29
Also published as: JPWO2019164007A1

Abstract

血液、尿、唾液及び脊髄液のような生体液検査で、特発性側弯症の発症の正確な早期発見、迅速で信頼性のある病勢予測ができ診断や治療のマーカーとなる特発性側弯症マーカーを提供する。　特発性側弯症マーカーは、アクチン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質、凝固第XIII　Ａ因子、フィブリノゲン、補体Ｈ因子－関連タンパク質、補体３、アディポネクチン、及びプロトロンビンから選ばれる少なくとも何れかのタンパク質からなるものであり、前記タンパク質の濃度及び／又は活性量によって、特発性側弯症の診断及び／又は治療のマーカーである。

Description

特発性側弯症マーカー

　本発明は、思春期特発性側弯症の診断や治療に用いることができる特発性側弯症マーカーに関するものである。

　側弯症は、脊柱が側方へ時にはねじれを伴いながら曲がる疾患である。中でも構造性又は非構造性の側弯症には、先天性脊椎奇形や外傷性側弯症等の他、ほぼ大半を占め原因不明の思春期特発性側弯症（Aadolescent Idiopathic Scoliosis：AIS。以下、単に特発性側弯症、又はAISともいう）がある。

　この特発性側弯症は、先天性脊椎奇形と異なり、思春期での骨成長加速期において顕著な脊柱変形であり、脊柱の三次元湾曲によって、特徴付けられるものである。特発性側弯症は、人種に拘らず、比較的ありふれた疾病であり、対象年齢人口の約０．５～４％に認められる。

　特発性側弯症の進行は、脊柱の湾曲の悪化に加え、呼吸性機能障害や背痛を伴う。単純Ｘ線撮像による脊柱のカーブの大きさにより特発性側弯症の重症度を示す指標となるコブ角（Cobb Angle）が２０度を超える中等度の患者には、湾曲患部での運動が可能な整形外科的矯正装具を用いた、装具治療が行われる。

　矯正装具として、例えば、特許文献１に、着用者の胴体に沿う胴部であって胴部の第１の側の第１の肩部と胴部の第２の側の第２の肩部とを含む胴部と、第１の肩部に隣接し胴部の第１の側に取り付けられた着用者の第１の肩を包むための腕部と、着用者の第１の肩に圧縮力を加える補強部であって胴部の前部または後部に位置する第１の端部から第１の肩部を越えて胴部の第１の側の脇の下部分の下側まで下がり胴部の前部または後部を下方向に斜めに横切って胴部の第２の側の腰椎分に位置する第２の端部まで延在し胴部に取り付けられる補強部とを備えた矯正装置が、開示されている。

　このような整形外科的矯正装具では、締め付けられているので、身体的や心理的に装着が耐え難いという問題が、起こる。

　この特発性側弯症がさらに進行すると、上体が明らかに大きく湾曲しているという外見上の問題、胸郭形成不全、腰痛などの様々な合併症の問題を引き起こす。コブ角が増大する従い、呼吸機能を示す肺活量と１秒率とが下がる。コブ角が１００度以上の特発性側弯症では肺性心、右心不全で死亡するリスクが高まることが知られている。そこで、コブ角４０度を超える重度の患者には、脊椎を金属フックやワイヤで矯正する脊椎固定手術などの高度な手術治療が、度々施される。

　このような固定手術として、例えば、特許文献２に、インプラントモジュールを有する脊柱調整システムであって、インプラントモジュールが、第１の椎骨に第１のインプラントモジュールを係合させるための手段と；第１の力適用手段と；を有する第１のインプラントモジュールであり、第１の力適用手段が、第１の椎骨の上位の第２の椎骨に係合した第２のインプラントモジュールに係合するよう構成されており；第１の力適用手段は、第１の椎骨の下位の第３の椎骨に係合した第３のインプラントモジュールに係合するよう構成されており；第１のインプラントモジュールが、第１の力適用手段によって第１の椎骨に加えられる力を調整する手段を有する脊柱調整システムが、開示されている。

　度重なる脊椎固定手術で、合併症発生率が好転するかもしれないが、瘢痕による美容上の問題や、神経障害や血管損傷や深刻な傷口感染のような様々な別な重篤な合併症の問題が起こり得る。

　このような特発性側弯症は、早期に治療を開始すれば、ある程度、進行を止めたり遅らせたりすることができる。特発性側弯症が悪化した場合、今のところ装具治療及び固定手術治療しかなく、根本的な治療薬がない。従って、特発性側弯症には、できる限り早期発見に努め進行を遅らせる努力が必要である。

　これまで特発性側弯症の早期発見及び病勢の判断・予測は、脊柱の外観観察、前屈テストのような一次的な理学検査、及び単純Ｘ線撮影等の二次的な画像検査しか存在していなかった。また、学校検診では、脊柱の外観観察や前屈テストで特発性側弯症の有無の判定を行っているが偽陽性率が多く、また思春期に急速に発症及び進行するため偽陰性率も多く、特発性側弯症発症の発見がしばしば遅れることがある。しかも、姿勢因子の影響により特発性側弯症の診断がつかなかったり、脊柱の湾曲が小さ過ぎて特発性側弯症の有無の診断に難渋し、見逃すことが多かったりしていた。

　病勢予測として、例えば、特許文献３に、特発性側弯症の最終的なコブ角予測値を生成するためのコンピューター実施方法であって、患者固有の３Ｄの形態学的脊椎パラメーター、選択したカーブタイプ、及び選択した骨格成熟度を受け取ることと、３Ｄの形態学的脊椎パラメーター、カーブタイプ、及び骨格成熟度に基づく予測モデルに対して、患者固有の３Ｄの形態学的脊椎パラメーター、選択したカーブタイプ、及び選択した骨格成熟度を適用することと、特発性側弯症の進行曲線をモデリングすることによって、最終的なコブ角予測値を生成することとを、含む方法が、開示されている。このような方法は、特発性側弯症がある程度進行しないと、予測できない。

　このように、さらに特発性側弯症の早期診断ができても、その患者が急激に悪化するか悪化が緩やかであるかの正確な予測が困難である。

　他の疾患では一般的に患者の血液や尿のサンプルから疾患の原因因子や疾病マーカーの定量により診断されているが、特発性側弯症について発症機序が不明であり近年になって漸く骨代謝変化が関与しているらしいと分かりつつある状況であり、これまで原因因子や病勢マーカーで診断されたことは、なかった。

　そこで、脊柱の外観観察・前屈テストや単純Ｘ線撮像の画像検査のみならず、血液等の生体液検査で、特発性側弯症の発症の正確な早期発見、早期に治療を開始するための重症度や病勢進行についての迅速で信頼性のある病勢予測、作用機序の特定をすることができる、特発性側弯症マーカーが、求められていた。また、特発性側弯症の診断薬や治療薬の有効性指標となる特発性側弯症用薬剤の評価マーカー、及びその治療のための治療標的因子が、求められていた。

特開２０１６－１３７２７７号公報特表２０１５－５１９１７０号公報特表２０１５－５３２１４４号公報

　本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、血液、尿、唾液及び脊髄液のような生体液検査で、特発性側弯症の発症の正確な早期発見、迅速で信頼性のある病勢予測ができ診断や治療のマーカーとなる特発性側弯症マーカー、特発性側弯症の診断薬や治療薬の有効性指標となる特発性側弯症用薬剤の評価マーカー、及びその治療のための治療標的因子を提供することを目的とする。

　前記の目的を達成するためになされた本発明の特発性側弯症マーカーは、アクチン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質（Vitamin D binding protein。以下、DBPということもある）、凝固第XIII　Ａ因子、フィブリノゲン、補体Ｈ因子－関連タンパク質、補体３、アディポネクチン、及びプロトロンビンから選ばれる少なくとも何れかのタンパク質からなることを特徴とする。

　この特発性側弯症マーカーは、前記タンパク質の濃度及び／又は活性量によって、前記特発性側弯症の診断及び／又は治療のマーカーとなることを特徴とするものである。

　この特発性側弯症マーカーは、血液、尿、唾液及び脊髄液から選ばれる生体液中で、前記アクチン、前記フィブロネクチン、前記ビタミンＤ結合タンパク質、前記凝固第XIII　Ａ因子、前記フィブリノゲン、及び／又は前記補体Ｈ因子－関連タンパク質の濃度及び／又は活性度が増加することを活性指標とし、前記補体３、前記アディポネクチン、及び／又は前記プロトロンビンの濃度及び／又は活性度が減少乃至無となることを活性指標とすることを特徴とするものである。

　この特発性側弯症マーカーは、前記特発性側弯症における、発症の有無、レンケ分類の型、作用機序、重症度、病勢進行、治療介入、及び／又は創薬に対する症状指標となることを特徴とするものである。

　この特発性側弯症マーカーは、前記アクチンがサイトプラスミック１(cytoplasmic 1)であり、前記フィブロネクチンが血漿フィブロネクチンであり、前記ビタミンＤ結合タンパク質がトランスカルシフェリンであり、前記凝固第XIII　Ａ因子が凝固第XIII　Ａ因子鎖を有するものであり、前記フィブリノゲンがフィブリノゲンアルファ鎖を有するものであり、前記補体Ｈ因子－関連タンパク質が補体Ｈ因子関連タンパク質１であり、前記補体３が補体第３成分：Ｃ３であり、前記アディポネクチンがアディポネクチン単量体又は多量体であり、前記プロトロンビンが第ＩＩａ因子であるというものである。

　この特発性側弯症マーカーは、特に前記ビタミンＤ結合タンパク質からなることが好ましい。

　前記の目的を達成するためになされた本発明の特発性側弯症用薬剤の評価マーカーは、アクチン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質、凝固第XIII　Ａ因子、フィブリノゲン、補体Ｈ因子－関連タンパク質、補体３、アディポネクチン、及びプロトロンビンから選ばれる少なくとも何れかからなり、特発性側弯症の診断薬及び／又は治療薬の有効性指標とするマーカーであることを特徴とするというものである。

　この特発性側弯症用薬剤の評価マーカーは、特にビタミンＤ結合タンパク質からなることが好ましい。

　前記の目的を達成するためになされた本発明の特発性側弯症の治療標的因子は、アクチン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質、凝固第XIII　Ａ因子、フィブリノゲン、補体Ｈ因子－関連タンパク質、補体３、アディポネクチン、及びプロトロンビンから選ばれる少なくとも何れかからなるというものである。

　この特発性側弯症の治療標的因子は、特にビタミンＤ結合タンパク質からなることが好ましい。

　本発明の特発性側弯症マーカーは、血液、尿、唾液、脊髄液のような生体液の検査で、特発性側弯症の発症の正確な早期発見・早期診断を行ったり、レンケ分類の型、作用機序、重症度、病勢進行、治療介入等に対する症状指標を基に病状診断・治療方針決定・治療を行ったりするバイオマーカーとなるものである。

　本発明の特発性側弯症マーカーは、アクチン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質、凝固第XIII　Ａ因子、フィブリノゲン、補体Ｈ因子－関連タンパク質、補体３、アディポネクチン、及びプロトロンビンから選ばれる特定の９種のタンパク質が、生体液サンプル中で特発性側弯症患者に特異的に増加し又は減少乃至無となるバイオマーカーとして用いられる。

　従来、特発性側弯症の一次検査として脊柱の外観観察や前屈テストなどの理学検査、二次検査として単純Ｘ線撮像等の画像検査が行われていたが、前者は姿勢因子の影響が大きく、後者に関しては病勢（弯曲）が進行した状態に至るまで所見が顕在化しないなどの問題点があった。また、今まで特発性側弯症の発症や病勢を血液等の生体液検査で診断していなかった。しかし、本発明の特発性側弯症マーカーによれば、血液、尿、唾液、脊髄液のような生体液の検査、例えば血液検査での血漿又は血清を用いたこのバイオマーカーの検査により、特発性側弯症の早期診断を行うことによって、初期段階での迅速で正確な発症判断や病勢の進行の予測が、可能である。

　これらのタンパク質の中でもとりわけ血漿中のビタミンＤ結合タンパク質は、特発性側弯症マーカーとして、その血漿中での濃度と特発性側弯症罹患患者のコブ角（弯曲の程度）との間に正の相関関係があり、特発性側弯症の早期診断、病勢判断、悪化の可能性の診断を行うのに有用な診断マーカー・病勢マーカー（悪化因子マーカー）であるバイオマーカーとなる。

　この特発性側弯症マーカーは、血液、尿、唾液、脊髄液のような生体液、特に血漿や血清のような血液試料中に分析可能な十分な濃度で安定して存在しており、簡易な汎用分析機器、特に液体クロマトグラフ装置、質量分析計、抗原抗体反応を検出する光学機器、市販のタンパク質検出キットを用いた簡便な方法で、迅速かつ正確に、定量的又は定性的に、測定して検出できる。

　また、この特発性側弯症マーカーは、測定感度に優れるので、被検者からの生体液の採取を最小限に抑えて、非侵襲的に検査できる。

　さらに、この特発性側弯症マーカーによれば、発症機序が未だ不明な特発性側弯症を早期に発見でき、早期に特発性側弯症患者へ治療を開始してその進行を止めたり遅らせたりして、患者の身体的・精神的な負担を軽減できると共に、医療費削減に資することができる

　また、本発明の特発性側弯症用薬剤の評価マーカーは、特発性側弯症の診断・治療用の薬剤の候補化合物である被検薬物から診断能・薬効の強いものを峻別したりスクリーニングしたりする際に用いられるものである。従ってこの評価マーカーは、特発性側弯症の診断薬や治療薬の有効性指標とするマーカーであるから、特発性側弯症の診療・治療への応用が可能である。

　さらに、特定の９種のタンパク質、とりわけビタミンＤ結合タンパク質は、その血漿中での濃度と特発性側弯症罹患患者のコブ角との間に正の相関関係があることから、本発明の特発性側弯症の治療標的因子は、コブ角を増大させないようして特発性側弯症を悪化させないようにするために活用できるものであり、特発性側弯症の治療のターゲットとなり得るものである。

本発明を適用する特発性側弯症マーカーを血漿から同定する際に行った蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動（2D-DIGE）の結果を示す、写真である。本発明を適用する特発性側弯症マーカーを血漿から同定する際に行った蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動（2D-DIGE）について、重ね合せた結果を示す写真である。本発明を適用する特発性側弯症マーカーについて、遺伝子オントロジーによる、（ａ）分子機能、（ｂ）生物学的プロセス、（ｃ）細胞構成、（ｄ）タンパク質分類、（ｅ）PANTHER経路を夫々示す円グラフである。本発明を適用する特発性側弯症マーカーに関し血漿中のビタミンＤ結合タンパク質について、レンケ(Lenke)分類５型特発性側弯症罹患患者群とコントロール被験者群とでのウェスタンブロットの結果を示す写真である。本発明を適用する特発性側弯症マーカーに関し血漿中のビタミンＤ結合タンパク質について、コントロール群に対する、Lenke分類３～６型特発性側弯症罹患患者群の強度シグナル比を示すグラフである。本発明を適用する特発性側弯症マーカーに関し血漿中のビタミンＤ結合タンパク質について、ビタミンＤ結合タンパク発現量と胸腰椎／腰椎の特発性側弯症罹患患者でのコブ角との間での相関を示すグラフである。

　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。

　本発明の特発性側弯症マーカーは、特発性側弯症患者の血液、尿、唾液及び脊髄液から選ばれる生体液、とりわけ血漿又は血清中に検出されるものである。この特発性側弯症マーカーは、アクチン（例えばサイトプラスミック１）、フィブロネクチン（例えば血漿フィブロネクチン）、ビタミンＤ結合タンパク質（例えばトランスカルシフェリン）、凝固第XIII　Ａ因子（例えば凝固第XIII　Ａ因子鎖を有するもの）、フィブリノゲン（例えばフィブリノゲンアルファ鎖を有するもの）、補体Ｈ因子－関連タンパク質（例えば補体Ｈ因子関連タンパク質１）、補体３（補体第３成分：Ｃ３）、アディポネクチン（例えば、アディポネクチンの単量体又は多量体）、及びプロトロンビン（例えば第ＩＩａ因子）の９種のタンパク質から選ばれる少なくとも何れかからなるもので、とりわけビタミンＤ結合タンパク質からなるものである。

　本発明の特発性側弯症マーカーのこれら９種のタンパク質は、血中から同定されたタンパク質自体であってもよく、健常人の生体液での濃度や活性量と比較して特発性側弯症患者で増減する同等の性質を有する限り、配列相同性がある組換えタンパク質であってもよい。

　これら９種のタンパク質は、特発性側弯症罹患患者の血漿と健常者（側弯症に関与しない別な疾患罹患者を含む）の血漿とを用いた蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis：2D-DIGE）を行うことによって、特発性側弯症に特異的に異なる発現を示すタンパク質の一群として、同定されたものである。

　このような特発性側弯症マーカーは、以下のようにして見出されたものである。

　特発性側弯症について、レンケ(Lenke L. G.)らは、特発性側弯症をレンケ分類（以下、Lenke分類ともいう）１～６型の６タイプに分類している。その１型は主に胸椎部の一つのカーブがあり構造性のものであり、２型は胸椎に２つカーブがあり一つの胸腰椎部は非構造性のものであり、３型は胸椎・胸腰椎部共に構造性のものであり、４型は３つのカーブが存在し全て構造性のものであり、第５型は胸腰椎／腰椎にカーブがあり構造性のものであり、６型は胸腰椎／腰椎にカーブがあり胸椎がメインカーブで構造性のものである。これらの特発性側弯症の全型が、同様な作用機序の結果惹き起こされるか否かは、知られていなかった。

　そこで、先ず、特発性側弯症の発症機序・重症化に関連して、それに特異的なタンパク質又はプロテオームを同定するために、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析（2D-DIGE）を用い、Lenke分類５型特発性側弯症（胸腰椎／腰椎の特発性側弯症）罹患患者からの血液からそれに関連するプロテオームを特定した。次いで、2D-DIGE解析で同定した健常人及び特発性側弯症罹患患者での血漿サンプル中の異なる量を発現しているこれらの中でも興味あるタンパク質を選択し、胸腰椎／腰椎の特発性側弯症におけるLenke分類３～６型での臨床学的因子とタンパク質の量との関係を調べ、特発性側弯症マーカーとなる前記の９種のタンパク質が、特定された。

　これら９種のタンパク質の内、アクチン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質、凝固第XIII　Ａ因子、フィブリノゲン、及び補体Ｈ因子－関連タンパク質の６種のタンパク質は、健常者血漿に比べ特発性側弯症罹患患者血漿で濃度又は活性度が有意に増加しており、また補体３、アディポネクチン、及びプロトロンビンの３種のタンパク質は、健常者血漿に比べ特発性側弯症罹患患者血漿で濃度又は活性度が有意に減少していた。従って、これら９種のタンパク質は、特発性側弯症罹患患者で特有に増減するものであるから、特発性側弯症であることを検知するバイオマーカーとなるものである。

　これら９種のタンパク質は、特発性側弯症の発症機序に関連する因子であると推察される。

　今まで、特発性側弯症の発症や重篤度を、生体液の検査で診断する方法は無かった。最近の研究では、特発性側弯症での骨の石灰化の経路での遺伝学的な変異の役割が推察されてきているが、特発性側弯症の発症機序は、依然、不明である。例えば、全ゲノム関連解析により、LBX1、GPR126、及びBNC2の異型が特発性側弯症と関係しているということが、分かってきた。これらの遺伝子の機能的複製が欠損している動物種では、特発性側弯症と似ている遺伝表現型が出現する。骨髄間葉細胞能で骨形成分化を起こすのを減少させて、特発性側弯症罹患患者での骨塩密度が通常、減少するという報告がある。これら特発性側弯症罹患患者の６５％が骨減少症を発症し、59％が骨再吸収マーカーである酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ血清バンド５（TRAP5b）が高レベルになるという報告がある。また、特発性側弯症罹患患者中の骨芽細胞関連転写因子Runx2 mRNAレベルが、低下するこという報告がある。

　本発明の特発性側弯症マーカーによれば、新たなバイオマーカーとして、生体液、特に血液検査で、特発性側弯症の早期診断あるいは病勢判断ができ、そして治療標的となりうる因子の同定が可能となる。

　この特発性側弯症マーカーは、血液、尿、唾液、脊髄液のような生体液、簡便には血液検査によって特に血漿から検出されるものである。検出には、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析(2D-DIGE)、液体クロマトグラフィー(LC)、液体クロマトグラフィー－質量分析(LC-MS)、ナノスケール液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析(nanoLC-MS/MS)のようなLC-MS/MSを用いて強度や面積により検量したり、酵素結合免疫吸着法(ELISA)で定量したり、及び／又は市販のタンパク質検出キットを用いて定量する方法が、用いられる。

　このようなタンパク質検出キットは、
　βアクチン抗体であって全てのアクチンを認識できるbeta Actin抗体(製品番号60008-1-Ig；Proteintech社製)；
　ヒトのフィブロネクチンをウサギに免疫して得られた抗血清を用いたフィブロネクチンキット(製品番号30271000；シーメンスヘルスケア・ダイアグノスティクス株式会社製)；
　ヒト試料中に存在するビタミンＤ結合タンパク質をサンドイッチ法により定量するELISAキットであるビタミンＤ結合タンパク質定量キットQuantikine Human Vitamin D Binding Protein ELISA Kit(商品名VitD BP, ELISA Kit； R&D SYSTEMS社製)；
　試薬中のウシトロンビンはフィブリノゲンを可溶性フィブリンに転化すると同時に活性化した第XIII因子は可溶性フィブリンに働きかけ安定化フィブリンに変化させ、試薬中のクロットインヒビターによって阻止され、可溶性フィブリンに作用できず、グリシンエステルを第XIII因子合成基質に結合させ、NH₃を遊離し、NADHが酸化されNADとなり、その時の340nmにおける吸光度の減少を測定して第XIII因子の活性を測定する第XIII凝固因子キット（商品名ベリクローム FXIII；シスメックス株式会社製）；
　フィブリノゲンキット（商品名コアグピア(登録商標) Fbg；積水メディカル株式会社製）；
　サンドイッチELISAで補体Ｈ因子関連蛋白１（CFHR1）を検出するキット（商品名Human CFHR1 ELISA Kit (Sandwich ELISA) - LS-F22606；Life Span BioSciences, Inc.社製）；
　不溶性の抗原抗体複合体を形成し特異抗体と結合し比濁法により分析物の濃度の測定する補体成分Ｃ３キット（商品名シンクロンシステム補体C3試薬; ベックマン・コールター株式会社製）；
　サンドイッチELISAで検出するアディポネクチン検出キット（商品名Adiponectin, Human, ELISA Kit；AdipoGen LIFE SCIENCES社製）；
　プロトロンビン測定キットとして第II凝固因子キット(商品名　第II凝固因子キット[トロンボチェック血液凝固第II因子定量キット]；シスメックス株式会社製)；
が挙げられる。

　この特発性側弯症マーカーは、例えば健常人（側弯症に関与しない別な疾患罹患者を含む）の血漿中に比べ、これら９種の少なくとも何れかのタンパク質の濃度及び／又は活性度が、有意に増加し又は減少乃至無となることにより、特発性側弯症に罹患しているか否か（発症の有無）、レンケ分類の型、作用機序、重症度、及び／又は病勢進行を推定する病状指標となるものである。

　これら９種のタンパク質の中でも、ビタミンＤ結合タンパク質は、健常者血漿に比べ特発性側弯症罹患患者血漿において量が高い値を示し、病勢を示すコブ角と正の相関を示していた。

　本発明の特発性側弯症用薬剤の評価マーカーは、前記の９種のタンパク質の少なくとも何れかからなり、特発性側弯症の診断薬及び／又は治療薬の有効性指標とするマーカーとするものである。この特発性側弯症用薬剤の評価マーカーは、特発性側弯症治療用薬剤の候補化合物である被検薬物を峻別したりスクリーニングしたりする際に、非ヒト哺乳動物におけるin vivoやin vitroで被験薬物の薬理応答性・薬理効果を定量的又は定性的に評価し若しくは発症機序を検討するのに用いたり、非ヒト哺乳動物や特発性側弯症罹患患者に対する被験薬物の効能や薬効域を的確に評価したり、特発性側弯症罹患患者への被験薬物の有効投与量を正確に推定したりするのに、用いることができる。

　また、本発明の特発性側弯症の治療標的因子は、前記９種のタンパク質の少なくとも何れかからなり、例えばアクチン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質、凝固第XIII　Ａ因子、フィブリノゲン、補体Ｈ因子－関連タンパク質の濃度や活性度が増加することを活性指標としたり、補体３、アディポネクチン、プロトロンビンの濃度や活性度が減少乃至無となることを活性指標としたりして、特発性側弯症の治療の直接的又は間接的な標的として用いるというものである。例えば、ビタミンＤ結合タンパク質の場合は、その数値を測定し、数値が高ければビタミンＤの不足が予測されるため、活性型ビタミンＤを投与する治療方法などが考えられる。

　以下、本発明の特発性側弯症マーカー、特発性側弯症用薬剤の評価マーカー及び特発性側弯症の治療標的因子についての実施例について、具体的に説明する。

　特発性側弯症マーカーを同定することとし、そのマーカーとしての有用性について検討し、さらに特発性側弯症用薬剤の評価マーカー、及び特発性側弯症の治療標的因子として、それらの有用性について検討した。

　この特発性側弯症マーカーは、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析を用い、胸腰椎／腰椎の側弯症を罹患した特発性側弯症(AIS)の発症機序との因果関係がありそうな骨代謝に関連付けられたタンパク質、又はプロテオームを同定することにより、特定したものである。このようなプロテオーム解析は、タンパク質やその断片を分離して質量分析し、そのデータをゲノム解析から推定されるタンパク質アミノ酸配列を比較して同定し、生物学的な系で存在するタンパク質の構造や機能を網羅的に解析するというものである。

（実施例）
　具体的には、以下のようにして本発明を実施した。

（１．被験者）
　被験者は、対象群である特発性側弯症（AIS。以下、実施例中、AISと略記する）群として外科手術が予定されている３０人のLenke分類３～６型AIS患者（各Lenke分類の型ごとに５人の被験者）と、コントロール群として５人のボランティア（臨床的情報の信用度３）とである。全被験者は、AISとLenke分類の型との診断を確認するために、身体検査と、Ｘ線コンピューター断層撮影法や核磁気共鳴映像法のような放射線検査とを受けた。コントロール群の被験者は、四肢骨折や体位異常のように、AISをはじめとする脊柱側彎症でなくAIS以外の疾病でＸ線を受診した患者である。年齢の平均±SDは、AIS群で14.9 ± 2.4歳であり、コントロール群で13.4 ± 0.8歳であった（表１参照）。

　なお、本実施例は、国立大学法人富山大学医学部の倫理委員会の承認を得ており、本実施例への参加前に全被験者から書面でインフォームド・コンセントを得ている。血液サンプルは、全ての被験者から、対象群のAIS患者では外科手術前、及びコントール群の被験者では本来の疾患が安定していると判断された時に、プロテアーゼ阻害剤を含有した採血管(商品名BD P100; Becton, Dickinson and Company社製)で採血し、血漿分画を分離した。

（２．2D-DIGEの手順）
　Lenke分類５型特発性AIS患者とコントロール群被験者とから夫々のプール血漿、そのAIS患者とコントロール群被験者との両方からのプール血漿とを、2D-DIGE解析に用いた。これらの３つの試料は、アルブミン、IgG、IgA、トランスフェリン、ハプトグロビン、アンチトリプシンを除去するため、タンパク質除去キット(商品名Multiple Affinity Removal Spin Cartridge; Agilent Technologies社製)でタンパク質除去を行い、遠心濃縮装置(商品名Amicon Ultla-4, 3kDa; Merck Millipore社製)を用いて、延伸濃縮を行った。その後、得られた試料を、カルボシアニン色素Cy2、Cy3、Cy5で標識した（表２）。

　その後、下記条件下で、コントロールとAISとの試料を夫々標識して、３回、二次元電気泳動を行った。一次等電点電気泳動は、全量で150 μg の試料 (AIS試料, コントロール試料, 及びプール試料を夫々50 μg)をアプライし、固定化ｐH勾配ストリップ(24 cm, 商品名pH3-11NL；GE Healthcare社製)を用いた平面電気泳動システム (商品名the Multiphore II GE；Healthcare社製)により、36 kVh (300 V, 5 h; 300-3500 V, 1.5 h; 3500 V, 10 h)で、行った。ストリップは、２工程で平衡化した。先ず、ストリップを、0.25% w/vジチオスレイトール(DTT)含有平衡溶液(50 mM Tris, pH 8.8, 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS)で10分間室温でインキュベートし、その後、4.5% w/vヨードアセトアミドを加えた前記平衡溶液で、さらに10分間室温でインキュベートした。平衡化の後、12%ポリアクリルアミドを用いたドデシル硫酸ナトリウム(SDS)・ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を3 Wで、電気泳動装置（商品名Ettan DALT II system；GE Healthcare社製)を用いて15時間行った。引き続き、スキャナー（商品名Typhoon 9400 scanner；GE Healthcare社製)を用いて、ゲルを走査した。差分解析ソフト(商品名DeCyder v7.0；GE Healthcare社製)を使用して、DIGE像を解析した。コントロール群と比較してAIS患者群にて異なる量で過剰発現又は低発現したタンパク質スポットは、スポット量比> 2又は < 0.5であって、かつスチューデントｔ検定でp < 0.05のものを、選別した。図２は、ゲルの試験番号１[Cy2 (プール), Cy3 (コントロール), Cy5 (AIS)]から得られた、血漿での代表的な2D-DIGEの重ね合せ写真である。増加したスポットをＵ、減少したスポットをＤで図示した。

（３．ナノスケール液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析(nanoLC-MS/MS)）
　さらに、Lenke分類５型被験者とコントロール被験者とからの500 μgの血漿試料を、同様の条件下で、試験し、質量分析（MS）用に十分な量のタンパク質を得た。ルテニウム含有タンパク質ゲル染色(商品名Sypro Ruby; Bio-Rad Laboratories社製)で固定化及び染色を行い、2D-DIGE 解析で同定された過剰発現又は低発現したタンパク質を、ゲル（商品名Sypro Ruby-stained gels；Bio-Rad Laboratories社製）から、ロボティックピッカー (商品名Spot-picker； GE Healthcare社製)を用いて切り出し、2 μLトリプシン及び50 mM炭酸水素アンモニウムを用いて、一晩、蒸解した。蒸解後、トリプシンペプチドを遠心分離し、乾燥してから、１%ギ酸20 μLに溶解した。高速液体クロマトグラフィー(商品名UltiMate(登録商標) 3000 HPLC; Dionex社製)と、前記の質量分析計(商品名Q-Exactive Plus； Thermo Scientific社製)とで、ナノスケール液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析(nanoLC-MS/MS)を、行った。検索ソフト(商品名MASCOT； Matrix Science社製)を用い、the SWISS-PROT及びNCBInrタンパク質配列データベースで、タンパク質を同定した。

（４．タンパク質ネットワーク及び機能分析）
　AIS患者から異なる量で発現したタンパク質を特定するため、機能的経路解析について、Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships (PANTHER) system, ver. 11.1を用いて、遺伝子オントロジー関連、生物学的過程、分子機能、及び生理学的経路について、機能性タンパク質の分類情報を得る機能的経路解析を行って、タンパク質を同定した。

（５．ウェスタン　ブロット）
　血漿中、Lenke分類の全型での標的タンパク質の発現は、ウェスタンブロット分析で測定した。５人のコントロール被験者と３０人のAIS患者とからの血漿の0.5%希釈液を、ドデシル硫酸リチウム（LDS）試料緩衝液及び還元剤が含有されたゲルにアプライした。その後、200Vで30分間電気泳動を行い、ゲルをポリフッ化ビニリデン膜上に移した。その膜を、抗ビタミンＤ結合タンパク抗体(1:1000; 商品名sc-32899； Santa Cruz Biotechnology社製)とインキュベートし、5%脱脂粉乳に溶解し、次いで１時間室温で、5%脱脂粉乳でブロッキングした。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた二次抗体を加え、ブロットを検出試薬（商品名ELC Prime Western Blot Detecting Reagent；GE Healthcare社製)で可視化した。ソフトウエア（商品名Image J software；NIH社製)を用い、バンドのシグナル強度を測定した。

（６．骨代謝抗体アレイ）
　骨代謝に関連する他の因子をスクリーニングするために、ヒト骨代謝抗体アレイ調査（商品名ab197422,；Abcam PLC.社製)を、それの商品指示書に従って行った。コントロール被験者とLenke分類５型AIS患者とから得られた2倍希釈血漿（n=5、2D-DIGEで使用した試料と同じ）及び希釈試料を含有する標準混合試料を、1時間室温で抗体アレイとインキュベートし、次いで、試料希釈液と30分間ブロッキングした。ビオチン結合二次抗体(Detection Antibody Cocktail)を用い、標的タンパク質を、Cy3等価染料結合ストレプトアビジンで検出した。シグナルは、マイクロアレイスキャナ（商品名GenePix 4000B ；Molecular Devices社製)で定量し、その後、標的タンパク質の濃度を夫々、検量線を用いて検出した。

（７．統計解析）
　データは、平均と標準偏差で示した。一元配置分散分析法（ANOVA）、次いでテューキー－クレーマー事後比較検定 (Tukey-Kramer post-hoc test)を用いて多群と比較し、異なる量で発現したタンパク質を、スチューデントｔ検定(Student’t test)で選択し、p値が< 0.05のものを統計学的有意差ありと見做した。標的タンパク質の発現と、AIS患者での年齢・肥満度指数（BMI）・骨成熟度（リッサーサイン：(Risser grade),）・コブ角のような各種連続型変数との相関係数を算出した。さらに、段階的多重線形回帰により、年齢・MBI・リッサーサイン・コブ角に基いて着目したタンパク質の発現の予測に用いた。

（８．AIS患者における過剰発現又は低発現した血漿タンパク質の同定）
　全部で3862 ± 137 スポットが、３種のゲル上で検出された。これらのタンパク質スポットの内、１１スポットが、コントロール群に比べた量が２倍を越え又は０．５未満である発現変化と、有意差があるスチューデントｔ検定(p < 0.05)との２つの基準を、満足した。この発現の異なる量の１１スポットは、LC-MS/MS分析(図１)で検出され、同定された。図１は、ゲルの試験番号１[Cy2 (プール), Cy3 (コントロール), Cy5 (AIS)]から得られた2D-DIGEの結果を示す写真である。分子量(kDa)とｐH勾配とを併記してある。この１１スポットから、nanoLC-MS/MSで９種のタンパク質が同定された（表３）。

　これらの内、コントロール被験者群に比べ、Lenke分類５型AIS患者群において、アクチン（サイトプラスミック１）、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質（DBP）、凝固第XIII　A因子鎖、フィブリノゲンアルファ鎖、及び補体Ｈ因子-関連タンパク質１が、増加し、補体３、アディポネクチン、プロトロンビンは減少した。

（９．機能性解析）
　PANTHER systemを用いた機能性解析により、遺伝子オントロジーを用いて、AIS患者において過剰発現又は低発現したタンパク質の関連性が、明らかとなった。図３（ａ）に、３つの分子機能（結合42.9%、触媒作用42.9%、構造的な分子活性14.3%）、図３（ｂ）に８つの生物学的プロセス（細胞プロセス25%、免疫系プロセス15%、代謝プロセス15%、生物学的接着15%、刺激反応10%、細胞組成の構成又は発生10%、多細胞性生物プロセス5%、局在化5%）、図３（ｃ）に４つの細胞構成（細胞外領域40%、細胞外基質20%、細胞部位20%、細胞小器官20%）、及び図３（ｄ）に６つのタンパク質分類（シグナル伝達分子37.5%、トランスフェラーゼ12.5%、防御／免疫タンパク質12.5%、ヒドラーゼ12.5%、細胞骨格タンパク質12.5%、酵素調節因子12.5%）を示す。さらに、PANTHER経路解析では、AIS患者において、血液凝固について、９種の過剰発現又は低発現したタンパク質の関係が明らかとなった(p = 0.000148, 図３（ｅ）)。

（１０．血漿中でのDBP発現の検証）
　AIS患者中で９種の過剰発現又は低発現のタンパク質について、DBPが最も重要なタンパク質であり骨代謝に緊密に関連していると考えたことからDBPに着目し、解析を行った。血漿中のDBPの発現は、Lenke分類５型AIS患者で、コントロール値の2.5倍も顕著に増加した（図４Ａ及び図４Ｂ参照）。図４Ａは、血漿中のビタミンＤ結合タンパク質について、Lenke分類５型AIS患者群とコントロール被験者群とでのウェスタンブロットの結果を示している。図４Ｂは、Lenke分類３～６型AIS患者群の強度シグナル比を示す。血漿中のDBPの発現は、コントロール被験者に比べ、Lenke分類４、５及び６型AIS患者で有意に増加した(** p < 0.01, * p < 0.05)。さらに、血漿中でのDBPの発現は、コントロールに対し、Lenke分類３～６型AIS患者で、顕著に増加した。コントロールとLenke分類３型AIS患者の間で、DBP発現に相違がなかった。３つの湾曲タイプの間で、DBPの発現は、Lenke分類５型AIS患者で最も高かった。

（１１．血漿中のDBPと臨床学的因子との関係）
　血漿DBPレベルは、年齢や骨成熟には有意には相互関係が無い（表４）。図４Ｃは、特発性側弯症マーカーに関し血漿中のビタミンＤ結合タンパク質について、DBP発現と胸腰椎／腰椎のAISでのコブ角との間で有意な相関が認めれられたことを示している(r = 0.43, p = 0.03)これらは、主に胸部及び胸腰椎／腰椎のAISにおけるBMIとコブ角とに有意に相互関係がある（図４Ｃ、及び表４参照）。また、段階的な多重線形回帰解析で、胸腰椎／腰椎のAISでのコブ角及びBMIは、独立した変数として、選択された。(R² = 0.36, p < 0.01, 表５参照)

（１２．コントロール群とLenke分類５型AIS患者群との間における骨代謝での相違）
　骨代謝に関連する他の因子を探索するため、コントロール群の５人の被験者と５人のLenke分類５型AIS患者とで、骨代謝抗体アレイを検討した。骨代謝に関連する合計４１の標的物質の間で、コントロール群とLenke分類５型AIS患者群との間で有意な発現の差異のある標的物質は、無かった。

（１３．結果及び考察）
　2D-DIGE を用いてコントロール被験者群と比較し、Lenke分類５型AIS患者での９種の過剰発現又は低発現のタンパク質を、同定した。引き続き、PANTHER systemを用いGO termsによりこれらのタンパク質を特徴づけ、血液凝固経路と関連していることを明らかにした。さらに、DBPに着目し、血漿中のDBPの発現と、構造性の胸腰椎／腰椎のAISにおけるLenke分類５型を包含するLenke分類３～６型AIS患者での臨床学的因子との関係を調べ、DBPとコブ角との有意な相関関係があることが分かった。

　このことから、DBPと幾つかの凝固関連タンパク質とが、AISの作用機序での役割を果たし、DBPが、胸腰椎／腰椎のAISの重症度のマーカーとなることが分かった。

　Lenke分類５型AIS患者での過剰発現又は低発現のタンパク質の殆んどは、凝固過程に関与している。AIS患者での血液凝固異常の研究結果が報告されており、この結果を支持している。

　別な研究によれば、脊柱側彎症を罹患小児患者は、健常人ボランティアに比べて、術前での凝固異常が高い有病率であることを示している。さらに別な研究によれば、AIS患者でも、凝固異常が高い有病率であることが、報告されている。血小板凝集異常は、幾つか報告されているが、AISに関連する血小板凝集異常を報告したものはない。別な研究によれば、最近になって、凝固異常が無いにも拘らず、臀部脊椎固定手術中での大量出血の症例が、報告されている。線維素溶解の調節向上が惹き起こされていると考えられるが、今までの凝固研究では見つけられなかった、AISに対する特定の血液凝固異常があるようである。

　Lenke分類５型AIS患者で過剰発現又は低発現した９種のタンパク質の内でDBPにとりわけ着目した。それを選択した理由は、AIS患者での低骨塩密度が、AIS発症機序における骨代謝障害に関連している。DBPは、GC型 (Group-specific component)グロブリンとして知られており、細胞外アクチンの捕捉剤と同様に、ビタミンＤの主な担体タンパク質である。

　幾つかの研究によれば、骨粗鬆症に関連したDBP異型が報告されている。さらに、別な研究によれば、AISに対する感受性に関連するビタミンＤ受容体（VDR）とDBP遺伝的多型、及び装具療法の効果が、報告されている。また幾つかの研究で、ビタミンＤとAISとの関係を示す、報告がなされている。さらに別な研究によれば、健常少女よりも、AIS罹患少女で25-OH-D3が顕著に低レベルであることが、報告されている。さらに、AIS患者でビタミンＤレベルが低いことが、報告されている。

　DBPタンパク質の量が如何にビタミンＤ代謝に影響を及ぼしているか、分かっていない。ビタミンＤ状態の指標として、25 (OH) D(25-ヒドロキシビタミンＤ)は、臨床診療で測定されており、そのうち85%がDBPに確りと結合しており10～15%が緩くアルブミンに結合している。残りの少量は遊離のままで存在している。生物学的利用可能な25 (OH) Dは、遊離であると思われる。血中で増加したDBPは、遊離25 (OH) Dを減少させるようであり、遊離25 (OH) D濃度が様々な疾患と関連していると推察される。本発明での結果を合わせて鑑みると、ビタミンＤの状態はAISの重要な特徴であり、DBPがAISの発症機序や重症度に関与している可能性がある。

　DBPは、骨代謝において直接的に影響を与えている。その前駆体であるGcタンパク質誘導マクロファージ活性化因子（Gc protein-derived macrophage activating factor ：Gc-MAF)は、破骨細胞を活性化する。AIS患者の65%が骨減少症を発症し、その59％がTRAP5bが高レベルであると報告されており、本発明での結果を合わせ鑑みると、AIS患者での血漿DBPの増加は、破骨細胞活性に影響し、骨形成と溶解との間の不均衡をもたらしているという可能性がある。

　血漿中のDBPが、Lenke分類３～６型AIS患者の胸腰椎／腰椎のAISでのコブ角と正の相関関係があることを見出した。さらに、他の因子を含む多変量解析で、胸腰椎／腰椎のAISのコブ角がDBPレベルと正の相関関係があることが、明らかとなった。

　本発明で、Lenke分類５型AIS患者からの血漿を用い2D-DIGEを行った。AISの発症機序における以前の研究では、胸部のAISであるLenke分類１型及び２型AIS患者が対象となっていた。そのため、本実施例では、胸腰椎／腰椎のAISであるLenke分類５型AIS患者からの血漿を用いて2D-DIGEを行った。このことは、もっと均質な母集団を対象とすることによって、新たな知見を得たものである。

　この実施例では、単回解析の例を示したが、長期間での疾患の重症度の過程でDBPがどのように変化するか解析できる。また、Lenke分類の型は、各症例ごとに、長期間で変わり得る。例えばLenke分類５型がLenke分類６型になった時に、例えば、BPレベルがどのように変化するかを測定すると、一層正確に診断ができる。

　このように、この実施例では、2D-DIGEを用いて、コントロール被験者群に比べAISのLenke分類５型AIS患者で過剰発現又は低発現の９種のタンパク質を同定した。これらタンパク質の殆んどは、血液凝固経路に関係している。さらに、血漿DBPレベルは、コブ角と有意に正の相関関係がある。DBPは骨代謝と関係があることが分かったので、AISの発症機序や疾患重症度での重要な役割を果たしているようである。

　本発明の特発性側弯症マーカー、特発性側弯症用薬剤の評価マーカー、特発性側弯症の治療標的因子によれば、第一に、早期診断を目的として、発症の好発年齢対象より血液サンプルを採取して、ビタミンＤ結合蛋白値を測定することにより、早期に発症の有無を判断することができる。また、第二に、比較的早期に特発性側弯症と診断されたら、進行が早まらないように経過観察しつつ必要に応じて装具治療を施し、定期的に、通院治療中のAIS患者より血液を採取して、血液サンプル中のタンパク質、とりわけビタミンＤ結合タンパク質値を測定し、側弯の進行予測を行うことにより、装具療法の継続の適否や、重症度の判断や、手術へ至る時期についての適切な判断が、可能となる。第三に、９種のタンパク質の作用に介入すること、とりわけビタミンＤ結合タンパク質を含めた生体内でのビタミンＤ代謝へ介入することにより、側弯の悪化防止、手術回避を目的とした治療を、行うことができる。

　本発明の本発明の特発性側弯症マーカーは、特発性側弯症における早期診断や病勢判断のバイオ―マーカーとして利用できる。特に、ビタミンＤ結合タンパク質からなる特発性側弯症マーカーは、ビタミンＤ結合蛋白の迅速な測定キットの測定対象として用いて、特発性側弯症の診療に、有用である。

　また、本発明の特発性側弯症用薬剤の評価マーカーは、特発性側弯症の診断・治療用の薬剤の候補化合物である被検薬物から診断能・薬効の強いものを峻別したりスクリーニングしたりして、検体検査法や治療法の早期開発に繋ぐことができる。特に、ビタミンＤ結合タンパク質からなる特発性側弯症用薬剤の評価マーカーは、治療を目的として、ビタミンＤ代謝に介入して特発性側弯症用薬剤の治療薬の早期開発に繋ぐことができる。

　さらに、本発明の特発性側弯症の治療標的因子は、特発性側弯症の治療の直接的又は間接的な標的として用い、治療を目的として、特発性側弯症の発症や進行を遅らせたり、抜本的な疾患の原因を取り除いたりする可能性がある。

Claims

　アクチン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質、凝固第XIII　Ａ因子、フィブリノゲン、補体Ｈ因子－関連タンパク質、補体３、アディポネクチン、及びプロトロンビンから選ばれる少なくとも何れかのタンパク質からなることを特徴とする特発性側弯症マーカー。
　前記タンパク質の濃度及び／又は活性量によって、前記特発性側弯症の診断及び／又は治療のマーカーとなることを特徴とする請求項１に記載の特発性側弯症マーカー。
　血液、尿、唾液及び脊髄液から選ばれる生体液中で、前記アクチン、前記フィブロネクチン、前記ビタミンＤ結合タンパク質、前記凝固第XIII　Ａ因子、前記フィブリノゲン、及び／又は前記補体Ｈ因子－関連タンパク質の濃度及び／又は活性度が増加することを活性指標とし、前記補体３、前記アディポネクチン、及び／又は前記プロトロンビンの濃度及び／又は活性度が減少乃至無となることを活性指標とすることを特徴とする請求項１～２の何れかに記載の特発性側弯症マーカー。
　前記特発性側弯症における、発症の有無、レンケ分類の型、作用機序、重症度、病勢進行、治療介入、及び／又は創薬に対する症状指標となることを特徴とする請求項１～３の何れかに記載の特発性側弯症マーカー。
　前記アクチンがサイトプラスミック１であり、前記フィブロネクチンが血漿フィブロネクチンであり、前記ビタミンＤ結合タンパク質がトランスカルシフェリンであり、前記凝固第XIII　Ａ因子が凝固第XIII　Ａ因子鎖を有するものであり、前記フィブリノゲンがフィブリノゲンアルファ鎖を有するものであり、前記補体Ｈ因子－関連タンパク質が補体Ｈ因子関連タンパク質１であり、前記補体３が補体第３成分：Ｃ３であり、前記アディポネクチンがアディポネクチン単量体又は多量体であり、前記プロトロンビンが第ＩＩａ因子であることを特徴とする請求項１～４の何れかに記載の特発性側弯症マーカー。
　前記ビタミンＤ結合タンパク質からなることを特徴とする請求項１～５の何れかに記載の特発性側弯症マーカー。
　アクチン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質、凝固第XIII　Ａ因子、フィブリノゲン、補体Ｈ因子－関連タンパク質、補体３、アディポネクチン、及びプロトロンビンから選ばれる少なくとも何れかからなり、特発性側弯症の診断薬及び／又は治療薬の有効性指標とするマーカーであることを特徴とする特発性側弯症用薬剤の評価マーカー。
　前記ビタミンＤ結合タンパク質からなることを特徴とする請求項７に記載の特発性側弯症用薬剤の評価マーカー。
　アクチン、フィブロネクチン、ビタミンＤ結合タンパク質、凝固第XIII　Ａ因子、フィブリノゲン、補体Ｈ因子－関連タンパク質、補体３、アディポネクチン、及びプロトロンビンから選ばれる少なくとも何れかからなることを特徴とする特発性側弯症の治療標的因子。
　ビタミンＤ結合タンパク質からなることを特徴とする請求項９に記載の特発性側弯症の治療標的因子。