WO2019142784A1 - 脂質二重膜形成用隔壁及びその製造方法 - Google Patents

脂質二重膜形成用隔壁及びその製造方法 Download PDF

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WO2019142784A1
WO2019142784A1 PCT/JP2019/000927 JP2019000927W WO2019142784A1 WO 2019142784 A1 WO2019142784 A1 WO 2019142784A1 JP 2019000927 W JP2019000927 W JP 2019000927W WO 2019142784 A1 WO2019142784 A1 WO 2019142784A1
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lipid bilayer
thin film
bilayer membrane
hole
partition wall
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寿久 大崎
早川　正俊
厚輝 神谷
金子　美晴
上原　秀雄
勝文 荒木
歩 根田
肇 平田
敏行 浦
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地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所
東レエンジニアリング株式会社
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    • B32B2379/08—Polyimides

Definitions

  • the present invention relates to a lipid bilayer membrane-forming septum for use in a lipid bilayer membrane-forming device, a lipid bilayer membrane-forming device including the septum, and a method for producing the septum.
  • Membrane proteins Proteins on the cell membrane (membrane proteins) occupy many of drug discovery targets, and observation and analysis of their functions are important not only in academic fields but also in the pharmaceutical field.
  • a technology has been developed to artificially form a cell membrane (lipid bilayer membrane) on a microdevice.
  • lipid bilayer membrane microdevices researches utilizing the excellent functions of membrane proteins are being conducted, and researches for engineering applications as sensors of artificial cell membranes are also active.
  • the lipid bilayer membrane is formed at the tip of a polymer thin film or a glass capillary provided with micropores having a diameter of several tens to several hundreds of micrometers.
  • a conventional method in which a Teflon (registered trademark) thin film is passed through a heated needle has come to use a method capable of controlling the pore size and shape using microfabrication technology.
  • a chamber is separated by a partition having a through hole, a solution for forming a lipid monolayer is placed in each separated chamber, and a lipid single layer is formed in two layers in the portion of the through hole in the partition.
  • Patent Document 1 a method for forming a lipid bilayer membrane by forming a molecular membrane. It is advantageous for good lipid bilayer membrane formation to have a tapered shape (the pore diameter changes continuously and unilaterally along the thickness direction of the partition) as a through hole in such a partition Is known (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 forms a silicon nitride film on a silicon substrate by making full use of micro processing technology. It is described that the silicon nitride film is provided with a through hole. It is also known to use a self-supporting film composed of parylene, which is a paraxylylene polymer, as a partition (Patent Document 2).
  • a partition is also known in which a plurality of through holes are provided in a parylene film, and a reinforcing film is attached with an adhesive on both sides of the film other than the region where the plurality of through holes are provided (non-patent document 3).
  • JP 2012-81405 A JP, 2011-149868, A
  • Non-Patent Document 2 is a method making full use of the fine processing technology used for manufacturing a semiconductor device, requires an expensive semiconductor manufacturing apparatus, and requires sputtering which is a gas phase reaction, so the manufacturing process It is complicated. Further, in the method described in Patent Document 2, the through holes formed in the parylene film are not tapered. Furthermore, in the partition described in Non-Patent Document 3, in addition to the through holes not being tapered, it is necessary to affix the reinforcing film with an adhesive and to dry the adhesive, so it takes a lot of skill and time to manufacture It is unsuitable for production. Furthermore, since the vicinity of all the through holes is not reinforced by the reinforcing film, the mechanical strength in the vicinity of the through holes is also uneasy.
  • An object of the present invention is a lipid bilayer membrane-forming septum capable of forming a good lipid bilayer membrane, which has sufficient mechanical strength and does not require an expensive device, and is versatile. It is an object of the present invention to provide a septum for forming a lipid bilayer membrane and a method for producing the same, which can be easily mass-produced using an apparatus.
  • the inventors of the present invention form a thin film having through holes from a resin that can be wet-etched, and can wet-etch both the through holes and portions other than the peripheral portion of each through hole.
  • the inventors have found that the above object can be achieved by forming a reinforcing layer formed of a resin and making the cross section of the through hole tapered, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • a lipid bilayer membrane formation device comprising the septum according to any one of 1 to 9 and a chamber separated into two wells by the septum.
  • 11. 1 is a method for producing a lipid bilayer membrane-forming septum according to 1. Preparing the thin film, coated on one side with a support film, Selectively etching the thin film to form one or more of the through holes having a tapered cross section; Covering the entire surface of the thin film opposite to the surface coated with the support film with a photosensitive resin layer; Peeling the support film; Covering the entire surface of the thin film exposed by peeling off the support film with a photosensitive resin layer; Selectively photoetching the photosensitive resin layers formed on both sides of the thin film to selectively remove the photosensitive resin filling the through holes and the photosensitive resin in the peripheral portion of each through hole; And heat-treating both photosensitive resin layers to form the reinforcing layer.
  • the lipid bilayer membrane formed using the partition of the present invention is measured by causing a protein having a nanopore functioning as an ion channel to be retained in the lipid bilayer membrane, as specifically described in the examples below.
  • Current noise is small and has good properties.
  • the partition wall of the present invention can be manufactured mainly by wet etching, so the manufacturing process is simple, and an expensive apparatus is not required, and it can be manufactured using an inexpensive general-purpose apparatus. Furthermore, in addition to the fact that the manufacturing process is simple, a large number of partition walls can be simultaneously manufactured in one thin film, so mass production is possible.
  • FIG. 1 It is a model cutting part end view of a penetration hole and its neighborhood of one example of a partition of the present invention. It is a schematic diagram for demonstrating the example of the preferable manufacturing method of one specific example of the partition of this invention shown in FIG.
  • FIG. 1 is a schematic cut end view of a through hole and its vicinity of one specific example of the partition wall of the present invention.
  • the dimensional ratio of each component is different from the actual dimensional ratio.
  • the septum comprises a membrane 10.
  • the thin film 10 is formed of a wet etchable resin.
  • “made of a wet-etchable resin” means that it is derived from a wet-etchable resin, and the thin film in the final product does not have to be wet-etchable.
  • the thin film 10 can be formed of a polyimide resin, an acrylic resin, an epoxy resin, or the like. Among these, polyimide resins are preferable from the viewpoint of the properties (the above-mentioned current noise and the like) of the formed lipid bilayer membrane.
  • the "polyimide resin” means a resin mainly composed of (50 mol% or more, preferably 90 mol% or more, more preferably 95 mol% or more, most preferably 100 mol%) polyimide.
  • the "resin” may contain additives often added to the resin, such as plasticizers, antistatic agents and inorganic particles, as long as the effects of the present invention are not adversely affected.
  • the total content of such additives is usually 10% by weight or less, preferably 5% by weight or less.
  • the thickness of the thin film 10 is usually 1 ⁇ m to 30 ⁇ m, preferably 5 ⁇ m to 20 ⁇ m, and particularly preferably 5 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • a polyimide precursor resin such as polyamic acid may be used.
  • the thin film 10 is provided with one or more through holes 12.
  • the lipid bilayer membrane formed in the through hole 12 is as thin as about 5 nm, and in order to prevent the destruction of the lipid bilayer membrane due to vibration or the like, it is preferable that the diameter of the through hole 12 be small.
  • the lipid bilayer membrane formed in the through hole 12 has a portion formed of fat and oil at the periphery thereof, and therefore the lipid bilayer membrane is difficult to be formed if the diameter of the through hole 12 is too small. Therefore, the diameter of the through holes 12 is preferably about 30 ⁇ m to 300 ⁇ m, and more preferably about 30 ⁇ m to 150 ⁇ m.
  • the hole diameter of a taper-shaped through hole the hole diameter of the part to which the hole diameter is the smallest is meant.
  • the ratio of the thickness of the thin film 10 to the diameter of the through hole 12 is preferably 1/50 to 1/5, and more preferably And 1/50 to 1/10 are preferable.
  • the through hole 12 has a tapered cross section (the hole diameter changes continuously and in one direction along the thickness direction of the partition wall).
  • An enlarged view of a circled portion in FIG. 1 is a lower right view of FIG.
  • the angle ⁇ shown here is a “taper angle”, and the taper angle is preferably 80 degrees or less, and more preferably 60 degrees or less.
  • the taper angle is 10 degrees or more, preferably 15 degrees or more.
  • the taper angle in this range can be achieved by etching the through holes by wet etching described later.
  • a reinforcing layer 14 formed of a wet-etchable resin is formed to cover the thin film 10.
  • “made of a wet-etchable resin” means that it is derived from a wet-etchable resin, and the reinforcing layer in the final product does not have to be wet-etchable.
  • the reinforcing layer 14 can be formed of a polyimide resin, an acrylic resin, an epoxy resin, or the like, but when formed of the same resin as the thin film 10, the coefficient of thermal expansion becomes the same, and deformation due to temperature change or It is preferable because peeling does not occur.
  • the reinforcing layer 14 is also preferably formed of a polyimide resin.
  • the description of the "polyimide resin” is the same as that described above, but as described later, the reinforcing layer is preferably formed of a photosensitive polyimide resin for the convenience of the manufacturing process.
  • the photosensitive polyimide resin may be cured to become polyimide in a later heat treatment step, that is, may be a polyimide precursor resin such as polyamic acid.
  • the reinforcing layer 14 is not formed not only at the portion of each through hole 12 but also at the peripheral portion 10 ′ of each through hole 12.
  • the thickness of the through-hole 12 in which the lipid bilayer membrane is formed can be limited to the thickness of the thin film 10, and the reinforcing layer 14 ensures that it does not participate in the formation of the lipid bilayer membrane at all. be able to.
  • sufficient mechanical strength can be achieved by limiting the region where the reinforcing layer 14 is not formed to the portion of each through hole 12 and the peripheral portion 10 ′ of each through hole 12.
  • the shape of the peripheral portion 10 ' is usually circular, but is not limited to circular.
  • the reduced diameter of “the peripheral portion 10 ′ of each through hole 12” is preferably in the range of 5 to 50 times the thickness of the reinforcing layer, and more preferably in the range of 10 to 30 times.
  • “converted diameter” means the diameter of the peripheral portion 10 'if it is circular, and if it is not circular, it means the diameter of a circle having the same area as the peripheral portion including the through hole portion.
  • parylene may be chemically vapor deposited (CVD) over the entire surface of the obtained partition wall.
  • the thickness of parylene to be deposited is preferably 10 nm to 500 nm, and particularly preferably 50 nm to 200 nm.
  • the thin film 10 is prepared. It is convenient to use a commercially available thin film 10, but since the thin film 10 is thin alone and has low mechanical strength and poor handleability, one side is covered with a support film (polyester film etc.) Use the one. Furthermore, since a laminated film in which a polyimide thin film is formed as an insulating film and a copper layer is formed on the polyimide thin film can be manufactured as a film for producing a wiring layer of an electronic component, such a copper layer coated polyimide film is also preferable. It can be used. The following description demonstrates the example using such a copper layer coating polyimide film.
  • a polyimide thin film 10 is laminated on a support film 16 (polyethylene terephthalate (PET) film or the like), and a film having a copper layer 18 laminated thereon is prepared.
  • PET polyethylene terephthalate
  • a dry film resist (DFR) 20 is laminated on the copper layer 18.
  • DFR dry film resist
  • the DFR 20 is selectively irradiated with ultraviolet light and developed to form a pattern.
  • through holes 12 are formed in the portion of the thin film 10 under the de-developed portion of the DFR 20.
  • the copper layer 18 is selectively etched using the selectively patterned DFR 20 as a mask.
  • the polyimide thin film 10 is selectively etched using the selectively etched copper layer 18 as a mask to form the through holes 12.
  • the copper layer 18 is entirely removed by etching.
  • a cover lay 22 a made of a photosensitive polyimide resin is laminated on the polyimide thin film 10.
  • the support film 16 is peeled off.
  • a cover lay 22b made of the same photosensitive polyimide resin as the cover lay 22a is covered on the surface of the polyimide thin film 10 exposed by peeling off the support film 16. Stack in the same way.
  • the region of the coverlays 22a and 22b covering the through hole 12 and its periphery 10 ' is double-sided exposed to ultraviolet light.
  • the cover lays 22 a and 22 b are developed to remove the cover lays 22 a and 22 b covering the through hole 12 and its peripheral portion 10 ′, and the through hole 12 and its peripheral portion 10 Expose '.
  • the cover lays 22 a and 22 b are heat-treated to be completely cured to form a reinforcing layer 14.
  • the heat treatment may be in the air or in a vacuum, but is preferably in vacuum from the viewpoint of forming a good lipid bilayer membrane.
  • the heat treatment temperature is usually about 150 ° C. to 250 ° C., preferably about 160 ° C. to 190 ° C.
  • the heat treatment time is preferably 50 minutes to 3 hours, and more preferably 1 hour to 2 hours.
  • parylene is vapor deposited on the entire surface of the obtained partition wall using a CVD apparatus.
  • the etching is all wet etching, and the partition wall of the present invention can be manufactured only by exposure, wet etching and heat treatment, so that the present invention can be easily and simply performed using a general-purpose apparatus.
  • Partition walls can be manufactured.
  • many (for example, several hundred) partition walls can be formed at one time on one polyimide thin film, which is suitable for mass production.
  • the lipid bilayer membrane-forming septum of the present invention can be used in the same manner as a conventional lipid bilayer membrane-forming septum. That is, by separating the chamber into two wells by the septum of the present invention, a lipid bilayer membrane formation device can be configured.
  • a chamber for example, a known double well chamber as described in Patent Document 1 can preferably be used, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides such a novel dual membrane forming device.
  • the method of forming a lipid bilayer membrane using the lipid bilayer membrane forming device of the present invention is a known method except that the lipid bilayer membrane forming device used is the above-described lipid bilayer membrane forming device of the present invention (for example, it can carry out by the method of the said patent document 1 or patent document 2). That is, for example, a lipid bilayer membrane can be formed as follows.
  • the lipid bilayer membrane forming lipid solution is added to each of the two wells described above, and each well is filled with the lipid solution.
  • the lipid bilayer membrane-forming lipid may be a known phospholipid used in the preparation of a liposome, and in order to simulate a reaction in a biological membrane, one that is the same as or similar to a biological membrane is preferable, Phospholipids conventionally widely used in this field, such as diphytanoyl phosphatidyl choline (DPhPC), dipalmitoyl phosphatidyl choline, palmitoyl oleoyl phosphatidyl choline (1- Palmitoyl 2-Oleoyl phosphatidylcholine (POPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), etc. can be mentioned as a preferred example. Since many of these are commercially available, commercially available products can be preferably used. It is also possible to easily form an asymmetric membrane by
  • the concentration of the phospholipid in the solution used to form the lipid bilayer membrane is not particularly limited as long as it is a concentration at which the lipid bilayer membrane can be formed, but generally 5 g / L to 30 g / L or so, preferably 10 g / L. It is about L to 20 g / L.
  • the solvent for the phospholipid solution is not particularly limited, but an organic solvent is preferable, and an aliphatic hydrocarbon solvent such as n-decane is preferable.
  • water or an aqueous solution is added to each well to form droplets of water or an aqueous solution in the lipid solution.
  • a micropipette is inserted into the lipid solution filled in each well to form water or aqueous solution droplets.
  • the liquid for forming droplets in this step may be pure water or an aqueous solution such as an aqueous buffer (a buffer whose main solvent is water).
  • the amount of water or aqueous solution to be added to each well is not particularly limited, but preferably about 1 to 20 times the volume of the lipid solution filled in each well, from the viewpoint of efficiently forming a lipid bilayer membrane. More preferably, it is about 1 to 10 times, more preferably about 1 to 5 times, and further preferably about 1.5 to 3 times.
  • lipid bilayer membranes are used to investigate the properties and functions of proteins in a state retained by the lipid bilayer membrane, and to screen or examine ligands that bind to such proteins to change their physiological activity. Since the lipid bilayer membrane is preferably used for measurement, the lipid bilayer membrane preferably contains a protein, and in particular, a transmembrane protein that functions in a state of being retained by a biological membrane in vivo is preferable.
  • proteins retained in lipid bilayer membranes include various receptors and enzymes, and examples include peptide proteins such as ⁇ -hemolysin, gramicidin, alamethicin, various ion channels, ABC transporter proteins, etc. But not limited thereto.
  • the protein When the protein is water-soluble, it is preferable to use an aqueous solution of the protein as the aqueous solution, and it is more preferable to use an aqueous solution containing the protein in an aqueous buffer.
  • concentration of the protein in these solutions is not particularly limited and can be appropriately selected, and is usually about 1 nM to about 1 mM, preferably about 0.1 to 10 ⁇ M.
  • the protein may be contained in the aqueous solution added to any one of the two wells, but may be contained in the aqueous solution added to both the wells.
  • the protein held in the lipid bilayer membrane is lipid soluble, it can be used by fusing a proteoliposome expressing the membrane protein with the lipid membrane in the present device.
  • the lipid solution When the droplet is formed in the lipid solution, the lipid solution is compressed and pressed against the partition wall, and in this portion, the lipid solution layer and the aqueous layer come into contact at a certain pressure. At this time, a lipid bilayer membrane is formed in the through hole of the partition wall.
  • the lipid bilayer membrane is formed in such a manner as to close the through-hole of the partition by standing for 3 minutes to 1 hour usually in a state where droplets of water or an aqueous solution are formed.
  • the protein is a protein that forms an ion channel such as ⁇ -hemolysin or alamethicin
  • the portion of the retained protein forms an ion channel
  • the two wells Electrically conducted. Therefore, by applying a predetermined voltage between the two wells and measuring the current flowing through the lipid bilayer membrane, it was confirmed that a lipid bilayer membrane in which the protein was correctly retained in the lipid bilayer membrane was formed. It can be confirmed.
  • Each well can be easily wired by disposing an electrode on the top surface of the bottom plate constituting the bottom of each well and connecting the electrode to the outside of the well.
  • Example 1 Production of Partition Walls
  • Preferred specific examples of the partition walls of the present invention were produced by the above-described production method shown in FIG. Specifically, it is as follows.
  • a laminated film was prepared (1 in FIG. 2).
  • the size of the laminated film used was 250 mm square.
  • a 25 ⁇ m thick DFR 20 was laminated on the copper layer 18 with an atmospheric pressure roll laminator at a speed of 20 cm / min at 110 ° C. (2 in FIG. 2).
  • the copper layer 18 was selectively removed with an alkaline copper etching solution (4 in FIG. 2).
  • the DFR 20 was fully swelled and exfoliated by immersing it in a stripping solution of DFR at 60 ° C. for 1 minute (5 in FIG. 2).
  • the polyimide thin film 10 was selectively etched with a commercially available polyimide etching solution (TPE 3000, manufactured by Toray Engineering Co., Ltd.) to form through holes 12 (6 in FIG. 2).
  • TPE 3000 commercially available polyimide etching solution
  • the copper layer 18 was entirely removed with an alkaline copper etching solution (7 in FIG. 2).
  • the support PET film was peeled off by hand (9 in FIG. 2).
  • both-side simultaneous diffusion exposure was performed at an energy of 550 mJ / cm 2 by contact exposure of ultraviolet light (11 in FIG. 2).
  • the exposed portion is a portion covering the through hole 12 and the periphery 10 ′.
  • eleven through holes 12 are provided.
  • the cover lays 22a and 22b were completely cured by heating in vacuum at 180 ° C. for 1 hour to form a reinforcing layer 14 (13 in FIG. 2).
  • the diameter of the through hole in the partition prepared as described above is 100 ⁇ m
  • the diameter of the through hole peripheral portion (the portion where the reinforcing layer 14 is not formed) is 1.2 mm
  • the aspect ratio is about 1/20
  • the taper angle was 40 to 60 degrees.
  • 280 partitions having 11 through holes each were simultaneously produced in a 250 mm square polyimide thin film.
  • the time required from the preparation start to completion was 7 hours.
  • Example 2 Parylene was vapor-deposited on the entire surface of the partition wall prepared in Example 1 using a CVD apparatus. The thickness of the vapor-deposited parylene layer was 100 nm.
  • Comparative Example 1 One through hole having a diameter of 600 ⁇ m was formed by a microdrill in a polymethyl methacrylate film having a thickness of about 75 ⁇ m to form a partition wall.
  • Comparative example 2 Eleven through holes with a diameter of 100 ⁇ m were formed in a 5 ⁇ m thick parylene film by ultraviolet lithography. Both sides of the rectangular area except for the 11 through holes were covered with a reinforcing film (an acrylic resin film having a thickness of about 75 ⁇ m). That is, two reinforcing films obtained by hollowing out a rectangular area were prepared, attached to both sides of a parylene film using an adhesive, and dried. It takes at least 30 hours to estimate the time for producing 280 sheets that can be produced in Example 1 from the time for producing about 5 sheets of this comparative example.
  • a reinforcing film an acrylic resin film having a thickness of about 75 ⁇ m
  • lipid bilayer Formation First, 1 to 5 ⁇ L of a lipid solution (containing diphitanoyl phosphatidylcholine (DPhPC) at a concentration of 20 mg / mL in n-decane) was dropped to each well. Next, an aqueous solution containing membrane protein ( ⁇ -hemolysin 0.1 nM or 1 nM; KCl 1 M, 10 mM phosphate buffer, pH 7; 18 to 25 ⁇ L) was dropped to each well and allowed to stand. A lipid monolayer is formed on the surface of the droplet, and a lipid bilayer membrane is formed in the through hole of the partition where the droplets contact with each other (droplet contact method). The formation of the lipid bilayer can be confirmed by a step signal associated with the membrane reconstitution of the membrane protein ⁇ -hemolysin ( ⁇ -hemolysin is functionally incorporated into the lipid bilayer) (see Patent Document 1). .
  • DPhPC diphitanoyl phosphat
  • the droplet contact method chip including the double well chamber was connected to a patch clamp amplifier (PICO2; Tecella LLC), and the current was measured under voltage clamp conditions.
  • the observation frequency was 5 KHz (Bessel low pass filter 1 kHz).
  • the gain was 10 mV / pA and the applied voltage was 50 mV.
  • nanometer-sized pores are opened in lipid bilayer membranes when alpha-hemolysin is reconstituted into lipid bilayer membranes. Under the experimental conditions, a current rise corresponding to 1 nS (1 GOhm) occurs.

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Abstract

要約　良好な脂質二重膜を形成することができる脂質二重膜形成用隔壁であって、十分な機械的強度を有し、高価な装置を必要とすることなく、汎用の装置を用いて簡便に大量生産することが可能な、脂質二重膜形成用の隔壁及びその製造方法が開示されている。脂質二重膜形成用隔壁は、１個又は複数の貫通孔を有する湿式エッチング可能な樹脂から形成される薄膜と、薄膜の両面を被覆する、湿式エッチング可能な樹脂から形成される補強層を具備する。補強層は、各貫通孔及び各貫通孔の周辺部分以外の部分を被覆し、貫通孔は、その断面がテーパー状である。

Description

脂質二重膜形成用隔壁及びその製造方法
　本発明は、脂質二重膜形成器具に用いられる脂質二重膜形成用隔壁、該隔壁を含む脂質二重膜形成器具及び該隔壁の製造方法に関する。
　細胞膜上のタンパク質(膜タンパク質)は創薬標的の多くを占め、その機能を観測・解析することは学術的のみならず医薬分野でも重要とされる。こうした膜タンパク質の機能を計測することを目的の一つとして、マイクロデバイス上に人工的に細胞膜（脂質二重膜）を形成する技術が開発されてきた。脂質二重膜マイクロデバイスの技術開発に伴い、膜タンパク質の優れた機能を利用する研究が行われるようになり、人工細胞膜のセンサとしての工学応用を見据えた研究も盛んになっている。
　脂質二重膜は、直径数十～数百マイクロメートルの微小孔を設けた高分子薄膜やガラス細管先端に形成する。薄膜における微小孔の作製は、テフロン（登録商標）薄膜に熱した針を通すといった旧来の方法から、微細加工技術を利用した孔径・形状制御が可能な方法が用いられるようになった。これまでの研究を通して、孔径や孔形状、薄膜の厚さなどが形成される脂質二重膜の性質・性能に影響を及ぼすことが明らかになってきている。
　脂質二重膜形成器具としては、貫通孔を有する隔壁でチャンバーを分離し、分離された各チャンバー内に脂質単分子膜形成性溶液を入れ、隔壁内の貫通孔の部分に２層に脂質単分子膜を形成させて脂質二重膜を形成する方法が知られている（特許文献１）。このような隔壁内の貫通孔としては、テーパー形状（隔壁の厚さ方向に沿って孔径が連続的かつ一方的に変化する）を有することが、良好な脂質二重膜形成に有利であることが知られている（非特許文献１）。また、良好な脂質二重膜を形成するためには、隔壁内の貫通孔の厚さは５μm～３０μm程度と薄いことが望まれるが、このような薄い膜は、機械的強度が小さくて取扱いが困難である。テーパー状の貫通孔を有し、貫通孔を設けるフィルムの機械的強度の問題を解決する方法として、非特許文献２には、シリコン基板上に、微細加工技術を駆使して窒化ケイ素膜を形成し、この窒化ケイ素膜に貫通孔を設けることが記載されている。また、パラキシリレン系ポリマーであるパリレンから成る自己支持性のフィルムを隔壁として用いることも公知である（特許文献２）。さらに、パリレンフィルムに複数の貫通孔を設け、この複数の貫通孔が設けられている領域以外の部分のフィルム両面に、補強フィルムを接着剤で貼り付けた隔壁も知られている（非特許文献３）。
特開2012-81405号公報 特開2011-149868号公報
Kalsi et al., Biophys. J., 2014, 106, 1650-1659 Hirano-Iwata et al., Langmuir, 2010, 26, 1949-1952 Kawano et al., Sci Rep, 2013, 3, 1996
　非特許文献２記載の方法は、半導体装置の製造に用いられる微細加工技術を駆使した方法であり、高価な半導体製造装置を必要とし、気相反応であるスパッタリングも必要であるため、製造工程が複雑である。また、特許文献２記載の方法では、パリレンフィルムに形成される貫通孔はテーパー状ではない。さらに、非特許文献３記載の隔壁では、貫通孔がテーパー状でないことに加え、補強フィルムを接着剤で貼り付けて接着剤を乾燥させる必要があるため、製造に熟練と時間を要し、大量生産には不向きである。さらに、全ての貫通孔の近傍が補強フィルムで補強されているわけではないので、貫通孔近傍の機械的強度にも不安がある。
　本発明の目的は、良好な脂質二重膜を形成することができる脂質二重膜形成用隔壁であって、十分な機械的強度を有し、高価な装置を必要とすることなく、汎用の装置を用いて簡便に大量生産することが可能な、脂質二重膜形成用の隔壁及びその製造方法を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、貫通孔を設ける薄膜を、湿式エッチング可能な樹脂から形成すると共に、各貫通孔及び各貫通孔の周辺部分以外の部分の両面上に、湿式エッチング可能な樹脂から形成される補強層を形成し、かつ、貫通孔の断面をテーパー状とすることにより、上記目的が達成可能であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
１．１個又は複数の貫通孔を有する湿式エッチング可能な樹脂から形成される薄膜と、該薄膜の両面を被覆する、湿式エッチング可能な樹脂から形成される補強層を具備し、該補強層は、前記各貫通孔及び各貫通孔の周辺部分以外の部分を被覆し、前記貫通孔は、その断面がテーパー状である、脂質二重膜形成用隔壁。
２．　前記薄膜がポリイミド系樹脂から成る１記載の隔壁。
３．　前記補強層がポリイミド系樹脂から成る１又は２記載の隔壁。
４．　前記補強層の厚さが２０μm～２００μmである１～３のいずれか１項に記載の隔壁。
５．　前記各貫通孔の前記周辺部の換算直径が、補強層の厚さの５倍～５０倍の範囲である１～４のいずれか１項に記載の隔壁。
６．　前記貫通孔のテーパー角が８０度以下である１～５のいずれか１項に記載の隔壁。
７．　前記薄膜の厚さと前記貫通孔の孔径の比が1/50～1/5である１～６のいずれか１項に記載の隔壁。
８．　前記薄膜の厚さが１μm～３０μmである１～７のいずれか１項に記載の隔壁。
９．　隔壁の全面上にパリレンの蒸着層をさらに含む、１～８のいずれか１項に記載の隔壁。
１０．　１～９のいずれか１項に記載の隔壁と、該隔壁により２つのウェルに分離されたチャンバーを具備する脂質二重膜形成器具。
１１．　１記載の脂質二重膜形成用隔壁の製造方法であって、
　片面が支持体フィルムにより被覆された、前記薄膜を準備する工程と、
　該薄膜を選択的にエッチングして、断面がテーパー状である１個又は複数の前記貫通孔を形成する工程と、
　前記薄膜の、前記支持体フィルムに被覆された面と反対側の面の全面を、感光性樹脂層で被覆する工程と、
　前記支持体フィルムを剥離する工程と、
　該支持体フィルムが剥離されて露出した前記薄膜の面の全面を、感光性樹脂層で被覆する工程と、
　前記薄膜の両面に形成された感光性樹脂層を選択フォトエッチングし、前記各貫通孔を埋める感光性樹脂及び各貫通孔の周辺部分の感光性樹脂を選択的に除去する工程と、
　前記両方の感光性樹脂層を加熱処理して前記補強層とする工程とを含む、製造方法。
１２．　前記薄膜がポリイミド系樹脂から成る１１記載の方法。
１３．　前記補強層がポリイミド系樹脂から成る１１又は１２記載の方法。
１４．　前記感光性樹脂層の加熱処理を真空中で行う１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．　１０記載の脂質二重膜形成器具を準備する工程と、前記ウェルのそれぞれに、脂質二重膜形成性脂質溶液を添加して各ウェルに該脂質溶液を充填する工程と、前記ウェルのそれぞれに水又は水溶液を添加して前記脂質溶液中に水又は水溶液の液滴を形成させて前記貫通孔内に脂質二重膜を形成する工程とを含む、脂質二重膜の形成方法。
　本発明の隔壁を用いて形成された脂質二重膜は、後述の実施例において具体的に記載されるように、イオンチャネルとして機能するナノポアを持つタンパク質を脂質二重膜中に保持させて測定される電流のノイズが小さく、良好な性質を有する。本発明の隔壁は、主として湿式エッチングにより製造することができるので、製造の工程が簡便であり、高価な装置を必要とせず、安価な汎用の装置を用いて製造することができる。さらに、製造工程が簡便であることに加え、１枚の薄膜に多数の隔壁を同時に作製することができるので、大量生産が可能である。
本発明の隔壁の１具体例の、貫通孔及びその近傍の模式切断部端面図である。 図１に示す本発明の隔壁の１具体例の好ましい製造方法の例を説明するための模式図である。
　図１は、本発明の隔壁の１具体例の、貫通孔及びその近傍の模式切断部端面図である。なお、便宜上、各構成要素の寸法比率は実際の寸法比率とは異なっている。
　隔壁は、薄膜１０を具備する。薄膜１０は、湿式エッチング可能な樹脂から形成される。ここで、「湿式エッチング可能な樹脂から形成される」は、湿式エッチング可能な樹脂に由来するという意味であり、最終製品中の薄膜が湿式エッチング可能である必要はない。薄膜１０は、ポリイミド系樹脂、アクリル系樹脂又はエポキシ系樹脂等から形成することができる。これらのうち、形成される脂質二重膜の性質（上記電流ノイズ等）の観点からポリイミド系樹脂が好ましい。「ポリイミド系樹脂」は、主として（５０モル％以上、好ましくは、９０モル％以上、さらに好ましくは９５モル％以上、最も好ましくは１００モル％）ポリイミドから成る樹脂を意味する。「樹脂」は、本発明の効果に悪影響を与えない範囲で、可塑剤、帯電防止剤、無機粒子のような、しばしば樹脂に添加される添加剤を含んでいてもよい。このような添加剤の合計含量は、通常１０重量％以下、好ましくは５重量％以下である。薄膜１０の厚さは、通常１μｍ～３０μｍであり、５μm～２０μmが好ましく、特に５μm～１０μmが好ましい。また、後の熱処理工程により、硬化してポリイミドとなるものでもよく、すなわち、ポリアミック酸等のポリイミド前駆体樹脂であってもよい。
　薄膜１０には、１個又は複数の貫通孔１２が設けられている。貫通孔１２に形成される脂質二重膜は、厚さが５nm程度と非常に薄く、振動等による脂質二重膜の破壊を防止するためには、貫通孔１２の孔径は小さい方が好ましい。一方、貫通孔１２に形成される脂質二重膜は、その周辺部に油脂から成る部分が形成されるので、貫通孔１２の孔径があまりに小さすぎると脂質二重膜が形成されにくくなる。このため、貫通孔１２の孔径は、３０μm～３００μm程度が好ましく、さらには、３０μm～１５０μm程度が好ましい。なお、テーパー状の貫通孔の「孔径」と言う場合、最も孔径が小さくなっている部分の孔径を意味する。また、同様に、良好な脂質二重膜の形成されやすさという観点から、薄膜１０の厚さと貫通孔１２の孔径の比（アスペクト比）は、1/50～1/5が好ましく、さらには、1/50～1/10が好ましい。
　貫通孔１２は、図示のように、その断面がテーパー状（隔壁の厚さ方向に沿って孔径が連続的にかつ一方的に変化する）である。図１中、丸で囲んだ部分の拡大図が図１の右下の図である。ここに示される角度θが「テーパー角」であり、このテーパー角は、８０度以下が好ましく、さらには６０度以下が好ましい。一方、テーパー角があまりに小さいものは製造が困難であり、通常、テーパー角は、１０度以上、好ましくは１５度以上である。なお、この範囲のテーパー角は、後述する湿式エッチングにより貫通孔をエッチング形成すれば達成される。
　薄膜１０の両面上には、薄膜１０を被覆する、湿式エッチング可能な樹脂から形成される補強層１４が形成されている。ここで、「湿式エッチング可能な樹脂から形成される」は、湿式エッチング可能な樹脂に由来するという意味であり、最終製品中の補強層が湿式エッチング可能である必要はない。補強層１４は、ポリイミド系樹脂、アクリル系樹脂又はエポキシ系樹脂等から形成することができるが、薄膜１０と同じ樹脂から形成すると、熱膨張率が同じとなって、温度変化に起因する変形や剥離が生じないので好ましい。上記のとおり、薄膜１０はポリイミド系樹脂から形成されることが好ましいので、補強層１４もポリイミド系樹脂から形成されることが好ましい。ここで、「ポリイミド系樹脂」の説明は上記と同様であるが、後述のように、製造工程の都合上、補強層は感光性ポリイミド系樹脂から形成することが好ましい。感光性ポリイミド系樹脂は、後の熱処理工程により、硬化してポリイミドとなるものでもよく、すなわち、ポリアミック酸等のポリイミド前駆体樹脂であってもよい。
　補強層１４は、各貫通孔１２の部分はもちろん、各貫通孔１２の周辺部１０’にも形成されない。これにより、脂質二重膜が形成される貫通孔１２の厚さを薄膜１０の厚さに限定することができ、補強層１４は、脂質二重膜の形成には全く関与しないことを確保することができる。一方、補強層１４が形成されない領域を、各貫通孔１２の部分と各貫通孔１２の周辺部１０’に限定することにより、十分な機械的強度を達成することができる。周辺部１０’の形状は、通常、円形であるが、円形に限定されるものではない。「各貫通孔１２の周辺部１０’」の換算直径は、補強層の厚さの５倍～５０倍の範囲であることが好ましく、さらには、１０倍～３０倍の範囲が好ましい。ここで、「換算直径」とは、周辺部１０’が円形である場合にはその直径、円形でない場合には、貫通孔の部分を含む周辺部の面積と同じ面積を持つ円の直径を意味する。
　さらに、所望により、得られた隔壁の全面上にパリレンを化学蒸着(CVD)してもよい。蒸着するパリレンの厚さは、10nm～500nmが好ましく、特に50nm～200nmが好ましい。パリレンを蒸着することにより、イオンチャネルとして機能するナノポアを持つタンパク質を脂質二重膜中に保持させて測定される電流のベースライン（絶縁性能）を向上させることができる。
　以下、図１に示す本発明の隔壁の１具体例の好ましい製造方法の例を図２に基づいて説明する。なお、詳細な条件は、後述の実施例に記載されている。
　先ず、薄膜１０を準備する。薄膜１０は、市販品を用いることが便利であるが、薄膜１０は単独では薄くて機械的強度が低く、取扱性に劣るため、片面が支持体フィルム（ポリエステルフィルム等）により被覆された形態のものを使用する。さらに、ポリイミド薄膜を絶縁膜として用い、ポリイミド薄膜上に銅層が形成された積層フィルムが、電子部品の配線層を作製するためのフィルムとして製造可能なので、このような銅層被覆ポリイミドフィルムも好ましく用いることができる。以下の説明では、このような銅層被覆ポリイミドフィルムを用いた例について説明する。
　図２の１に示すように、支持体フィルム１６（ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム等）上にポリイミド薄膜１０が積層され、その上に銅層１８が積層されたフィルムを準備する。
　次に、図２の２に示すように、銅層１８上にドライフィルムレジスト(DFR)２０を積層する。なお、DFRに代えてフォトレジストを塗布することも可能であるが、DFRを貼る方が簡便である。
　次に、図２の３に示すように、DFR２０を、選択的に紫外線照射して、現像し、パターンを形成する。後の工程において、DFR２０の現像除去された部分の下にある薄膜１０の部分に貫通孔１２が形成される。
　次に、図２の４に示すように、選択的にパターン形成したDFR20をマスクとして、銅層１８を選択エッチングする。
　次に、図２の５に示すように、DFR２０を全面除去する。
　次に、図２の６に示すように、選択エッチングされた銅層１８をマスクとして、ポリイミド薄膜１０を選択エッチングし、貫通孔１２を形成する。
　次に、図２の７に示すように、銅層１８を、エッチングにより全面除去する。
　次に、図２の８に示すように、ポリイミド薄膜１０上に、感光性ポリイミド系樹脂から成るカバーレイ２２ａを積層する。なお、カバーレイ２２ａは、フィルムであることが簡便で好ましく、この場合、ロールラミネーター等を用いて積層することができる。もっとも、感光性ポリイミド系樹脂のワニスを塗布してカバーレイ２２ａを形成することも可能である。
　次に、図２の９に示すように、支持体フィルム１６を剥離する。
　次に、図２の１０に示すように、支持体フィルム１６を剥離して露出したポリイミド薄膜１０の面上に、カバーレイ２２ａと同じ感光性ポリイミド系樹脂から成るカバーレイ２２ｂを、カバーレイ２２ａと同様に積層する。
　次に、図２の１１に示すように、貫通孔１２とその周辺部１０’以外を被覆するカバーレイ２２ａ及び２２ｂの領域を、紫外線で両面露光する。
　次に、図２の１２に示すように、カバーレイ２２ａ及び２２ｂを現像して貫通孔１２及びその周辺部１０’を被覆するカバーレイ２２ａ及び２２ｂを除去し、貫通孔１２及びその周辺部１０’を露出させる。
　次に、図２の１３に示すように、カバーレイ２２ａ及び２２ｂを熱処理して完全硬化させて補強層１４とする。熱処理は、大気中でも真空中でもよいが、良好な脂質二重膜を形成する観点から、真空中が好ましい。また、熱処理温度は、通常、１５０℃～２５０℃程度であり、１６０℃～１９０℃程度が好ましい。また、熱処理時間は５０分から３時間程度が好ましく、さらには１時間から２時間程度が好ましい。
　さらに、パリレンを蒸着する場合には、CVD装置を用いて、得られた隔壁の全面上にパリレンを蒸着する。
　上記の方法によれば、エッチングは全て湿式エッチングであり、露光、湿式エッチング、加熱処理のみによって本発明の隔壁を製造することができるので、汎用の装置を用いて容易に、簡便に本発明の隔壁を製造することができる。また、１枚のポリイミド薄膜上に多数（例えば数百）の隔壁を一度に形成することができ、大量生産にも適している。
　本発明の脂質二重膜形成用隔壁は、従来の脂質二重膜形成用隔壁と同様に用いることができる。すなわち、チャンバーを、本発明の隔壁により２つのウェルに分離することにより、脂質二重膜形成器具を構成することができる。チャンバーとしては、例えば特許文献１に記載されているような、周知のダブルウェルチャンバーを好ましく用いることができるがこれに限定されるものではない。したがって、本発明は、このような新規な二重膜形成器具をも提供するものである。
　本発明の脂質二重膜形成器具を用いて脂質二重膜を形成する方法は、用いる脂質二重膜形成器具が上記した本発明の脂質二重膜形成器具であること以外は周知の方法（例えば、上記特許文献１又は特許文献２に記載の方法）により行うことができる。すなわち、例えば、次のようにして脂質二重膜を形成することができる。
　上記した２つのウェルのそれぞれに、脂質二重膜形成性脂質溶液を添加して各ウェルに該脂質溶液を充填する。ここで、脂質二重膜形成性脂質としては、リポソームの作製に用いられている周知のリン脂質でよく、生体膜における反応を模するためには、生体膜と同じか類似したものが好ましく、この分野において従来から広く用いられているリン脂質、例えば、ジフィタノイルフォスファチジルコリン(diphytanoyl phosphatidylcholine, DPhPC)、ジパルミトイルフォスファチジルコリン(dipalmytoyl phosphatidylcholine)、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン(1-Palmitoyl 2-Oleoyl phosphatidylcholine, POPC)、ジオレオイルフォスファチジルコリン(Dioleoyl phosphatidylcholine, DOPC)等を好ましい例として挙げることができる。これらの多くは市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。また２つのウェルに異なる種類の脂質を導入することにより、簡便に非対称膜を形成することも可能である。
　脂質二重膜の形成に用いられる溶液中のリン脂質の濃度は、脂質二重膜が形成可能な濃度であれば特に限定されないが、通常、5g/L～30g/L程度、好ましくは10g/L～20g/L程度である。また、リン脂質溶液の溶媒は、特に限定されないが、有機溶媒が好ましく、n-デカンのような脂肪族炭化水素溶媒が好ましい。
　次に、各ウェルに水又は水溶液を添加して前記脂質溶液中に水又は水溶液の液滴を形成させる。例えば、各ウェルに充填された脂質溶液内にマイクロピペットを挿入して水又は水溶液の液滴を形成する。この工程で液滴を形成する液は、純水であってもよいし、水系緩衝液（主たる溶媒が水である緩衝液）のような水溶液であってもよい。各ウェルに添加する水又は水溶液の量は、特に限定されないが、脂質二重膜を効率良く形成する観点から、各ウェルに充填されている脂質溶液の体積の１倍～２０倍程度が好ましく、さらに好ましくは１倍～１０倍程度、さらに好ましくは１倍～５倍程度、さらに好ましくは1.5倍～３倍程度である。
　脂質二重膜は、脂質二重膜に保持された状態におけるタンパク質の性質や機能を調べたり、該タンパク質に結合して、その生理活性を変化させるリガンドをスクリーニングしたりその性質を調べたりする各種測定に好適に用いられるものであるので、脂質二重膜は、タンパク質を含んでいることが好ましく、特に生体内で生体膜に保持された状態で機能している膜貫通タンパク質が好ましい。脂質二重膜に保持するタンパク質としては、各種レセプターや酵素を挙げることができ、例としては、α－ヘモリシン、グラミシジン、アラメチシンなどのペプチドタンパク質類、各種イオンチャンネル、ABCトランスポータタンパク質等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。タンパク質が水溶性の場合、上記水溶液としてタンパク質の水溶液を用いることが好ましく、水系緩衝液中にタンパク質を含む水溶液を用いることがさらに好ましい。これらの溶液中のタンパク質の濃度は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができるが、通常、1nM～1mM程度、好ましくは0.1μM～10μM程度である。なお、タンパク質は、２つのウェルのいずれか一方に添加される水溶液中に含まれていればよいが、両方のウェルに添加される水溶液中に含まれていてもよい。また、脂質二重膜に保持するタンパク質が脂溶性の場合には、膜タンパク質を発現させたプロテオリポソームを本デバイス中の脂質膜に融合させることで使用可能である。
　脂質溶液内で上記液滴を形成すると、脂質溶液が圧迫されて隔壁に押しつけられ、この部分で脂質溶液の層と水層とがある程度の圧力で接することとなる。この際に隔壁の貫通孔内に脂質二重膜が形成される。脂質二重膜は、水又は水溶液の液滴を形成した状態で、通常３分間～１時間程度放置することにより、隔壁の貫通孔を塞ぐ形で形成される。
　タンパク質がα－ヘモリシンやアラメチシン等のイオンチャネルを形成するタンパク質である場合、脂質二重膜にタンパク質が正しく保持されると、保持されたタンパク質の部分がイオンチャネルを形成して、２つのウェルが電気的に導通される。従って、２つのウェル間に所定の電圧をかけ、脂質二重膜を介して流れる電流を測定することにより、タンパク質が脂質二重膜中に正しく保持された脂質二重膜が形成されたことを確認することができる。また、タンパク質に種々の物質を作用させることにより、タンパク質の構造を変化させてイオンチャネルを閉じたり広げたりする物質をスクリーニングすることもでき、このような物質は何らかの生理活性を発揮する可能性があり、医薬品の候補となり得る。従って、２つのウェル間の電流を測定することが望まれる場合が少なくない。各ウェルの底部を構成する底板の上面に電極を配置し、この電極をウェル外に接続することにより容易に各ウェルを配線することができる。
　以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．　実施例１　　隔壁の製造
　図２に示す、上記した製造方法により本発明の隔壁の好ましい具体例を製造した。具体的には以下のとおりである。
　厚さ５０μｍのPETフィルム（支持体フィルム１６）上に、厚さ7.5μｍのポリイミド薄膜１０であるカプトン30EN（商品名、東レ・デュポン社製）、その上に厚さ５μｍの銅層１８が積層された積層フィルムを準備した（図２の１）。用いた積層フィルムのサイズは、250mm四方とした。
　次に、銅層１８上に、厚さ２５μｍのDFR２０を、大気圧ロールラミネーターにより１１０℃、２０cm/分の速度でラミネートした（図２の２）。
　平行露光機を用いて80mJ/cm2のエネルギーで紫外線をコンタクト露光し、１％炭酸ナトリウム溶液でスプレー現像し、水洗した（図２の３）。
　パターン化されたDFR２０をマスクとして、アルカリ系の銅エッチング液で銅層１８を選択除去した（図２の４）。
　DFRの剥離液中に６０℃で１分間浸漬してDFR２０を全面的に膨潤剥離した（図２の５）。
　パターン化された銅層１８をマスクとして、市販のポリイミドエッチング液(TPE3000、東レエンジニアリング社製）でポリイミド薄膜１０を選択エッチングし、貫通孔１２を形成した（図２の６）。
　アルカリ系の銅エッチング液で、銅層１８を全面除去した（図２の７）。
　大気圧ロールラミネーターを用いて、ポリイミド薄膜１０上に、厚さ３０μｍの市販の感光性ポリイミドフィルムからなるカバーレイ２２ａを２層積層した（合計膜厚６０μｍ）（図２の８）。
　支持体PETフィルムを手で剥離した（図２の９）。
　大気圧ロールラミネーターを用いて、ポリイミド薄膜１０上に、厚さ３０μｍの市販の感光性ポリイミドフィルムからなるカバーレイ２２ｂを２層積層した（合計膜厚６０μｍ）（図２の１０）。
　拡散露光機を用い、紫外線のコンタクト露光により、550mJ/cm2のエネルギーで両面同時拡散露光した（図２の１１）。露光部分は、貫通孔１２とその周辺部１０’以外を被覆している部分である。なお、この実施例では、貫通孔１２は、１１個設けた。
　１％炭酸ナトリウム水溶液を用いたスプレー現像により、両面同時現像を行い、水洗した（図２の１２）。
　真空中で180℃で１時間加熱して、カバーレイ２２ａと２２ｂを完全硬化させ、補強層１４とした（図２の１３）。
　以上のようにして作製した隔壁中の、貫通孔の孔径は、100μｍ、貫通孔周辺部（補強層１４が形成されていない部分）の直径は、1.2mm、アスペクト比は、約1/20、テーパー角は40～60度であった。また、250mm四方のポリイミド薄膜に、各１１個の貫通孔を有する、２８０個の隔壁を同時に作製した。また、作製開始から完成までに要した時間は７時間であった。
２．　実施例２
　実施例１で作製した隔壁の全面に、CVD装置を用いてパリレンを蒸着した。蒸着したパリレン層の厚さは100nmであった。
３．　比較例１
　厚さ約75μｍのポリメチルメタクリレートフィルムに、直径600μｍの貫通孔１個をマイクロドリルにより形成して隔壁とした。
４．　比較例２
　厚さ５μｍのパリレンフィルムに紫外線リソグラフィーにより、孔径100μｍの貫通孔１１個を形成した。１１個の貫通孔が形成されている長方形状の領域以外の両面を、補強フィルム（厚さ約75μｍのアクリル樹脂フィルム）で被覆した。すなわち、長方形状の領域をくり抜いた補強フィルム２枚を準備し、接着剤を用いてパリレンフィルムの両面に貼り付け、乾燥させた。本比較例５枚程度を作製する時間から実施例１で作製可能な280枚を作製するための時間を概算すると少なくとも30時間を要する。
５．　性能試験
(1)　脂質二重膜形成器具の作製
　実施例１及び２、並びに比較例１及び２の隔壁を、１個のウェルの直径が4mm、深さが3mmのダブルウェルチャンバー（特許文献１参照）に、隔壁として組み込んで脂質二重膜形成器具を作製した。各ウェルの底面には銀塩化銀電極を配置した。
(2)　脂質二重膜形成
　まず、各ウェルに脂質溶液（n-デカン中に、ジフィタノイルフォスファチジルコリン(DPhPC)を20mg/mLの濃度で含む）１～５μＬを滴下した。次に、各ウェルに膜タンパク質を含む水溶液（α-ヘモリシン 0.1nM又は1nM； KCl 1M, 10mMリン酸緩衝液, pH 7；18～25μＬ）を滴下し、静置した。液滴表面に脂質単分子膜が形成され、液滴同士が接触する隔壁の貫通孔では、脂質二重膜が形成される（液滴接触法）。脂質二重膜の形成は、膜タンパク質α-ヘモリシンの膜への再構成（脂質二重膜にα－ヘモリシンが機能的に組み込まれる）に伴う階段状のシグナルによって確認できる（特許文献１参照）。
(3) 評価
　上記ダブルウェルチャンバーを含む液滴接触法チップは、パッチクランプ増幅器（PICO2；Tecella LLC）に接続し、電圧クランプ条件で電流を計測した。観測周波数は5 KHz（ベッセルローパスフィルタ1 kHz）を使用した。ゲインは10mV/pA、印加電圧は50 mVとした。上述の通り、α-ヘモリシンが脂質二重膜に再構成されるとナノメートルサイズの孔（ナノポア）を脂質二重膜に開ける。本実験条件では、1nS（1GOhm）に相当する電流上昇が生じる。十分な回数の観測を繰り返し、このナノポア形成直前、すなわち脂質二重膜形成下の１秒以上の電流シグナルの標準偏差（RMSノイズ）を評価基準とした。なお、膜タンパク質の機能解析やセンサにおいては、微弱電流（小さい場合で1pA程度）を出力として得る。RMSノイズが大きい場合、出力を十分なS/N比として得ることができなくなるため、小さいほど性能が高いとされる。
(4)　結果
　結果を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 ※平均値±標準偏差(pA rms)
　表１に示されるように、本発明の実施例の隔壁を用いた場合、RMSノイズが比較例のものよりも小さく、正確な測定が可能であることがわかる。比較例２の隔壁は、かなり好成績であるが、RMSノイズは実施例１及び２の方が低く、また、比較例２の隔壁は大量作製が困難であるのに対して、実施例１の隔壁は、７時間で２８０個を同時作製できた。
　１０　薄膜
　１０’　貫通孔周辺部
　１２　貫通孔
　１４　補強層
　１６　支持体フィルム
　１８　銅層
　２０　ドライフィルムレジスト(DFR)
　２２ａ　カバーレイ
　２２ｂ　カバーレイ

Claims (15)

  1. 　１個又は複数の貫通孔を有する湿式エッチング可能な樹脂から形成される薄膜と、該薄膜の両面を被覆する、湿式エッチング可能な樹脂から形成される補強層を具備し、該補強層は、前記各貫通孔及び各貫通孔の周辺部分以外の部分を被覆し、前記貫通孔は、その断面がテーパー状である、脂質二重膜形成用隔壁。
  2. 　前記薄膜がポリイミド系樹脂から成る請求項１記載の隔壁。
  3. 　前記補強層がポリイミド系樹脂から成る請求項１又は２記載の隔壁。
  4. 　前記補強層の厚さが２０μm～２００μmである請求項１～３のいずれか１項に記載の隔壁。
  5. 　前記各貫通孔の前記周辺部の換算直径が、補強層の厚さの５倍～５０倍の範囲である請求項１～４のいずれか１項に記載の隔壁。
  6. 　前記貫通孔のテーパー角が８０度以下である請求項１～５のいずれか１項に記載の隔壁。
  7. 　前記薄膜の厚さと前記貫通孔の孔径の比が1/50～1/5である請求項１～６のいずれか１項に記載の隔壁。
  8. 　前記薄膜の厚さが１μm～３０μmである請求項１～７のいずれか１項に記載の隔壁。
  9. 　隔壁の全面上にパリレンの蒸着層をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の隔壁。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の隔壁と、該隔壁により２つのウェルに分離されたチャンバーを具備する脂質二重膜形成器具。
  11. 　請求項１記載の脂質二重膜形成用隔壁の製造方法であって、
    　片面が支持体フィルムにより被覆された、前記薄膜を準備する工程と、
    　該薄膜を選択的にエッチングして、断面がテーパー状である１個又は複数の前記貫通孔を形成する工程と、
    　前記薄膜の、前記支持体フィルムに被覆された面と反対側の面の全面を、感光性樹脂層で被覆する工程と、
    　前記支持体フィルムを剥離する工程と、
    　該支持体フィルムが剥離されて露出した前記薄膜の面の全面を、感光性樹脂層で被覆する工程と、
    　前記薄膜の両面に形成された感光性樹脂層を選択フォトエッチングし、前記各貫通孔を埋める感光性樹脂及び各貫通孔の周辺部分の感光性樹脂を選択的に除去する工程と、
    　前記両方の感光性樹脂層を加熱処理して前記補強層とする工程とを含む、製造方法。
  12. 　前記薄膜がポリイミド系樹脂から成る請求項１１記載の方法。
  13. 　前記補強層がポリイミド系樹脂から成る請求項１１又は１２記載の方法。
  14. 　前記感光性樹脂層の加熱処理を真空中で行う請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　請求項１０記載の脂質二重膜形成器具を準備する工程と、前記ウェルのそれぞれに、脂質二重膜形成性脂質溶液を添加して各ウェルに該脂質溶液を充填する工程と、前記ウェルのそれぞれに水又は水溶液を添加して前記脂質溶液中に水又は水溶液の液滴を形成させて前記貫通孔内に脂質二重膜を形成する工程とを含む、脂質二重膜の形成方法。
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