WO2019093663A1 - 당 대사 조절용 효소 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당 대사 조절용 효소 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase) 및 락타아제(lactase)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 효소; 글루코오스옥시다아제(glucose oxidase); 및 트랜스글루코시다아제(transglucosidase);를 포함하는 당 대사 조절용 효소 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 당 대사 조절용 효소 조성물은 음식물 중 탄수화물이 소장에서 말타아제, 수크라아제, 락타아제 등의 여러 효소 작용으로 인하여 포도당으로 분해되어 흡수되기 전에 위장 등에서 먼저 흡수되지 않는 형태의 당으로 전환시킴으로써 포도당이 체내에 흡수되는 것을 조절할 수 있다. 이에 따라, 비만으로 인해 탄수화물 섭취를 조절해야 하는 사람 또는 고혈당증이나 당뇨병의 위험이 있어 혈당 조절이 필요한 사람에게 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

당 대사 조절용 효소 조성물
본 발명은 당 대사 조절용 효소 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase) 및 락타아제(lactase)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 효소; 글루코오스옥시다아제(glucose oxidase); 및 트랜스글루코시다아제(transglucosidase);를 포함하는 당 대사 조절용 효소 조성물에 관한 것이다.
당류(saccharide)는 생물을 구성하는 중요한 물질이면서 에너지원으로 이용되며, 특히 포도당은 인체에서 탄수화물 대사의 중심적 화합물로서 매우 중요하다.
당은 인체에 반드시 필요한 화합물이지만, 과도한 섭취는 비만을 야기하고, 대사의 불균형은 당뇨병과 같은 다양한 질병을 야기할 수 있다.
당 대사의 불균형으로 인해 발생하는 질환 중에는 대표적으로 고혈당증(hyperglycemia)이 있다. 고혈당증이란 혈당치가 비정상적으로 높은 상태를 말하는데, 생리적 고혈당은 식사 후 일시적으로 유발되는 자연적인 현상이지만, 생리적 현상으로 허용되는 범위 외의 혈당치가 증가하는 것은 이미 당뇨병이 진행된 상황이거나 당뇨병으로의 진행 가능성이 있는 중요한 문제이다. 고혈당증이 만성화되면 다른 생체기관에 영향을 미치게 되어 신장, 신경, 심혈관계, 망막 등에 심각한 질환을 유발할 수 있으므로, 당 대사의 조절을 통해 혈당을 조절하는 것이 필요하다.
이러한 당 대사를 조절하기 위해 식물 추출물 등을 이용하는 기술들(대한민국 등록특허 제10-1193730호, 제10-1561600호 등)이 개시되어 있으나, 이들의 경우 대부분 당 대사 뿐만 아니라 다른 생체 내 생리활성과도 연관된 인자에 영향을 미치는 메커니즘을 갖고 있기 때문에 부작용 문제를 완전히 배제할 수 없다.
이에 본 발명자는 상기와 같은 부작용 문제를 배제하기 위하여 당 대사에 관여하는 효소를 이용하고자 하였다. 당 대사에 관여하는 효소를 이용하는 방법은 생체의 특정 인자에 영향을 미치는 방법이 아니므로 부작용을 방지할 수 있어 음식물로 섭취되는 당을 체내에서 흡수되지 않는 형태로 효율적으로 전환시킬 수 있다면 매우 안전하게 당 대사를 조절할 수 있을 것으로 기대하였다.
본 발명자는 상기와 같이 효소를 이용하여 당 대사를 보다 효과적으로 조절할 수 있는 방법을 연구하였으며, 이의 결과 탄수화물을 포도당으로 전환할 수 있는 효소와 글루코오스옥시다아제(glucose oxidase) 및 트랜스글루코시다아제(transglucosidase)를 조합하여 음식물과 함께 또는 음식물을 섭취하기 직전 또는 직후에 섭취할 경우, 탄수화물이 소장에서 말타아제, 수크라아제, 락타아제 등의 여러 효소 작용으로 인하여 포도당으로 분해되어 흡수되기 전에 위장 등에서 먼저 흡수되지 않는 형태의 당으로 효율적으로 전환됨으로써 포도당이 체내에 흡수되어 급격하게 혈당이 상승하는 것을 막을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 탄수화물의 소화 이외의 다른 생체 내 생리활성에 영향을 미치지 않아 부작용의 발생 가능성이 낮고, 탄수화물이 소장에서 말타아제, 수크라아제, 락타아제 등의 여러 효소 작용으로 인하여 포도당으로 분해되어 체내에 흡수되기 전에 위장 등에서 먼저 흡수되지 않는 형태의 당으로 효율적으로 전환시킴으로써 당 대사를 효과적으로 조절할 수 있는 효소 조성물을 제공하는데 있다.
[선행기술문헌]
대한민국 등록특허 제10-1193730호
대한민국 등록특허 제10-1561600호
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase) 및 락타아제(lactase)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 효소; 글루코오스옥시다아제(glucose oxidase); 및 트랜스글루코시다아제(transglucosidase);를 포함하는 당 대사 조절용 효소 조성물을 제공한다.
본 발명의 효소 조성물에 있어서, 상기 효소 이외에 카탈라아제(catalase)를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 효소 조성물에 있어서, 상기 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase), 락타아제(lactase), 글루코오스옥시다아제(glucose oxidase), 트랜스글루코시다아제(transglucosidase) 및 카탈라아제(catalase)를 모두 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 효소 조성물에 있어서, 상기 효소 이외에 알파-아밀라아제(α-amylase) 및 베타-아밀라아제(β-amylase) 중에서 선택된 1종 이상의 아밀라아제를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 당 대사 조절용 효소 조성물은 음식물 중 탄수화물이 소장에서 말타아제, 수크라아제, 락타아제 등의 여러 효소 작용으로 인하여 포도당으로 분해되어 흡수되기 전에 위장 등에서 먼저 흡수되지 않는 형태의 당으로 전환시킴으로써 포도당이 체내에 흡수되는 것을 조절할 수 있다. 이에 따라, 비만으로 인해 탄수화물 섭취를 조절해야 하는 사람 또는 고혈당증이나 당뇨병의 위험이 있어 혈당 조절이 필요한 사람에게 매우 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 글루코오스옥시다아제 반응에 따른 과산화수소에 대한 카탈라아제의 효과를 실험한 결과이다. w/o catalase : 카탈라아제를 제외시킨 대조군, w/ catalase : 카탈라아제를 첨가한 실험군.
도 2 내지 7은 본 발명의 일실시예에 따른 동물실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2 : 쥐(랫트)에 본 발명의 효소 조성물을 쥐(랫트)의 체중 1kg 당 2, 5, 50㎎으로 경구투여한 다음, 30분 후 포도당을 쥐 체중 1kg 당 2g씩 경구투여하고 경과시간에 따른 혈당을 측정한 결과 그래프. Y축의 단위: ㎎/㎗.
도 3 : 쥐(랫트)에 본 발명의 효소 조성물을 쥐(랫트)의 체중 1kg 당 2, 5, 50㎎으로 경구투여한 다음, 30분 후 수크로오스을 쥐 체중 1kg 당 2g씩 경구투여하고 경과시간에 따른 혈당을 측정한 결과 그래프. Y축의 단위: ㎎/㎗.
도 4 : 쥐(랫트)에 본 발명의 효소 조성물을 쥐(랫트)의 체중 1kg 당 2, 5, 50㎎으로 경구투여한 다음, 30분 후 포도당을 쥐(랫트) 체중 1kg 당 2g씩 경구투여하고 첫 30분간 1분당 혈당 증가량을 나타낸 결과 그래프. Y축의 단위: ㎎/㎗*min.
도 5 : 쥐(랫트)에 본 발명의 효소 조성물을 쥐(랫트)의 체중 1kg 당 2, 5, 50㎎으로 경구투여한 다음, 30분 후 수크로오스을 쥐(랫트) 체중 1kg 당 2g씩 경구투여하고 첫 30분간 1분당 혈당 증가량을 나타낸 결과 그래프. Y축의 단위: ㎎/㎗*min.
도 6 : 쥐(랫트)에 본 발명의 효소 조성물을 쥐(랫트)의 체중 1kg 당 2, 5, 50㎎으로 경구투여한 다음, 30분 후 글루코오스를 쥐(랫트) 체중 1kg 당 2g씩 경구투여하고 2시간 동안의 혈당 변화의 면적을 나타낸 결과 그래프. Y축 단위: ㎎*min/㎗.
도 7 : 쥐(랫트)에 본 발명의 효소 조성물을 쥐(랫트)의 체중 1kg 당 2, 5, 50mg으로 경구투여한 다음, 30분 후 수크로오스를 쥐(랫트) 체중 1kg 당 2g씩 경구투여하고 2시간 동안의 혈당 변화의 면적을 나타낸 결과 그래프. Y축 단위: ㎎*min/㎗.
본 발명의 효소 조성물은 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase) 및 락타아제(lactase)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 효소; 글루코오스옥시다아제(glucose oxidase); 및 트랜스글루코시다아제(transglucosidase);를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 글루코아밀라아제, 수크라아제 및 락타아제는 탄수화물 다당류 또는 이당류를 포도당으로 전환시키는 효소로 음식물 섭취 후 소장에 도착하기 전에 탄수화물을 미리 포도당으로 전환시킬 수 있고, 전환된 포도당에 상기 글루코오스옥시다아제가 작용하면 글루코노 락톤으로 전환시키고, 상기 트랜스글루코시다아제가 작용하면 포도당을 전이시켜 보다 분자량이 크고 소장의 말타아제, 수크라아제, 락타아제 등의 효소가 작용하지 못하는 형태로 전환시킴으로써 포도당으로써 체내에서 이용할 수 없게 된다. 본 발명의 효소 조성물은 이러한 원리로 당 대사를 조절할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 효소들 이외에 카탈라아제(catalase)를 더 포함하는 것이 효과적이다. 상기 글루코오스옥시다아제의 작용에 따라 과산화수소가 발생하게 되는데, 이 과산화수소는 각 효소의 활성을 저해시킬 수 있을 뿐만 아니라 인체에도 좋지 않다. 카탈라아제는 이러한 과산화수소를 소거함으로써 본 발명 효소 조성물의 각 효소활성에 방해가 되는 요인을 제거할 수 있을 뿐만 아니라 보다 인체에 안전하게 적용할 수 있도록 한다.
바람직하게는 본 발명의 효소 조성물은 상기 글루코아밀라아제, 수크라아제, 락타아제, 글루코오스옥시다아제, 트랜스글루코시다아제 및 카탈라아제를 모두 포함하는 것이 좋다. 이 경우, 음식물에 포함된 다양한 형태의 탄수화물을 보다 효율적으로 포도당으로 전환시키고 이들 전환된 포도당을 체내에서 이용할 수 없는 형태로 보다 효율적으로 전환시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 효소들 이외에 알파-아밀라아제(α-amylase) 및 베타-아밀라아제(β-amylase) 중에서 선택된 1종 이상의 아밀라아제를 더 포함하는 것이 효과적이다. 이에 따르면, 이당류 이외의 다당류의 분해가 보다 효율적으로 이루어지도록 할 수 있어 음식물이 소장에 도달하기 전에 음식물에 포함된 탄수화물을 체내에서 흡수되지 않는 형태로 보다 효율적으로 전환시킬 수 있다.
상기 각 효소는 식품으로 사용 가능한 효소가 바람직하며, 예를 들어 Aspergillus niger, Aspergillus oryzae , Saccharomyces cerevisiae 등과 같은 천연 미생물을 배양하여 얻을 수 있고, 상업적으로 판매되는 효소들을 이용할 수도 있다.
특히, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae , Saccharomyces cerevisiae와 같은 곰팡이 혹은 효모 등의 자연균주에서 생산된 이들 효소들은 주로 산성 및 약산성에서 최적 작용 pH(pH 2 ~ 7)를 갖는 특성이 있어 음식물(탄수화물) 섭취 후, 위장에서 빠르게 잘 작용할 수 있다.
본 발명의 효소 조성물의 상기와 같은 작용 효과를 충분히 발휘할 수 있도록 하기 위해 상기 글루코아밀라아제는 바람직하게는 1회 섭취량 기준으로 580 U 이상, 더욱 바람직하게는 5,800 U 이상, 상기 수크라아제의 경우에는 바람직하게는 20 U 이상, 더욱 바람직하게는 200 U 이상, 상기 락타아제의 경우에는 바람직하게는 40 U 이상, 더욱 바람직하게는 400 U 이상, 상기 트랜스글루코시다아제의 경우에는 바람직하게는 2 U 이상, 더욱 바람직하게는 20 U 이상, 그리고 상기 글루코오스옥시다아제의 경우에는 바람직하게는 40 U 이상, 더욱 바람직하게는 400 U 이상의 역가를 갖도록 포함되는 것이 바람직하다.
카탈라아제가 포함될 경우, 카탈라아제는 글루코오스옥시다아제 활성에 의해 생산된 과산화수소를 소거하는 것이 주된 목적으로 글루코오스옥시다아제 활성 대비 바람직하게는 1배 이상 더욱 바람직하게는 5배 이상의 역가를 갖도록 하는 것이 바람직하며, 알파-아밀라아제 또는 베타-아밀라아제가 포함될 경우 바람직하게는 700 U 이상, 더욱 바람직하게는 7,000 U 이상의 역가를 갖도록 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 효소 조성물은 음식물 섭취 시 포도당이 체내에 흡수되는 것을 조절할 수 있으므로 고혈당증이나 당뇨병, 또는 비만의 치료, 예방 또는 개선을 위한 의약품, 식품첨가제, 사료첨가제 등의 용도로도 이용될 수 있다.
이때, 본 발명의 효소 조성물은 식품의약안정청(FDA)의 통상적인 약제학적 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 효소 조성물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시켜 제형화할 수 있다.
또한 상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 0.1 내지 100㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.
본 발명의 효소 조성물은 상기 유효량을 기준으로, 효소 조성물 그 자체 또는 식품학적으로 허용된 담체를 포함하는 식품첨가제로 이용될 수 있으며, 또한 사료학적으로 허용된 담체를 포함하는 사료첨가제로도 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 효소의 조합에 따른 글루코오스 감소 효과 조사
1-1. 방법
1-1-1. 말토오스(maltose) 유래 글루코오스의 감소 효과 조사
기질(substrate)로써, 2%(w/v) 말토오스 수용액 10㎖씩을 준비된 2개의 100㎖ 부피의 삼각플라스크에 각각 넣어 37℃ 항온수욕에서 미리 가온하였다.
이중 하나의 삼각플라스크에는 글루코아밀라아제(290,000 U/g)를 단독으로 최종농도 0.2㎎/㎖가 되도록 녹인 수용액을, 다른 하나에는 글루코아밀라아제(290,000 U/g)(Aspergillus niger 유래)와 글루코오스 옥시다아제(20,000U/g)(Aspergillus niger 유래)를 각각 최종농도 0.2㎎/㎖가 되도록 녹인 수용액 10㎖를 넣고, 잘 흔들어 섞고 37℃ 항온수욕에서 2시간 동안 반응시킨 다음 직화 상에서 5분간 끓여 반응을 정지시켰다. 그리고 각각 반응 시료들에 대하여 구성당을 분석하였다.
대조구로서 별도로 글루코아밀라아제(290,000 U/g)와 글루코오스 옥시다아제(20,000U/g)를 각각 최종농도 0.2㎎/㎖가 되도록 녹인 수용액 10㎖를 직화 상에서 5분간 끓여 불활화하고, 이것을 2%(w/v) 말토오스 수용액 10㎖에 넣어 37℃에서 2시간 반응시킨 다음 구성당을 분석하였다.
구성당의 분석은 전류도 검출기가 장착된 HPAEC(High Performance Anion-Exchange Chromatography, ICS-5000, Dionex co., USA)를 사용하여 분석하였으며, CarboPac PA-1(250 x 4mm, Dionex co., USA)을 컬럼으로 사용하였고, 이동상은 18mM NaOH 용액을 사용하였다. Flow rate은 1.0㎖/min, 컬럼온도는 25℃로 설정하였다.
1-1-2. 수크로오스(sucrose) 유래 글루코오스의 감소 효과 조사
상기 1-1-1과 같은 방법을 사용하되, 기질로 2%(w/v) 말토오스 수용액 대신 2%(w/v) 수크로오스 수용액을 사용하였고, 효소로 글루코아밀라아제(290,000 U/g) 대신 수크라아제(10,000U/g)(Saccharomyces cerevisiae 유래)를 사용하였다.
1-1-3. 락토오스(lactose) 유래 글루코오스의 감소 효과 조사
상기 1-1-1과 같은 방법을 사용하되, 기질로 2%(w/v) 말토오스 수용액 대신 2%(w/v) 락토오스 수용액을 사용하였고, 효소로 글루코아밀라아제(290,000 U/g) 대신 락타아제(100,000U/g)(Aspergillus niger 유래)를 사용하였다.
1-1-4. 글루코오스의 감소 효과 조사
상기 1-1-1과 같은 방법을 사용하되, 기질로 2%(w/v) 말토오스 수용액 대신 2%(w/v) 글루코오스 수용액을 사용하였고, 효소로 글루코아밀라아제(290,000 U/g) 대신 트랜스글루코시다아제(200 U/g)(Aspergillus niger 유래)를 최종농도 2㎎/㎖가 되도록 녹여 사용하였다.
또한, 트랜스글루코시다아제(200 U/g), 글루코오스 옥시다아제(20,000U/g) 및 카탈라아제(50,000U/g)(Aspergillus niger 유래)를 각각 최종농도 2㎎/㎖, 0.2㎎/㎖, 및 0.2㎎/㎖가 되도록 녹인 수용액을 사용한 실험군을 추가하였다.
1-2. 결과
상기 각 조사에 따른 결과는 다음 표 1 내지 4와 같다.
샘플 말토오스 수크로오스 락토오스 글루코오스 프럭토오스 갈락토오스
말토오스(대조구) 9.00±0.00 ND ND 0.10±0.00 ND ND
말토오스/G 7.25±0.02 ND ND 2.75±0.02 ND ND
말토오스/G/GO 8.27±0.02 ND ND 1.73±0.02 ND ND
* G : 글루코아밀라아제, GO : 글루코오스 옥시다아제
* ND : 불검출
* 단위 : g/L
샘플 말토오스 수크로오스 락토오스 글루코오스 프럭토오스 갈락토오스
수크로오스(대조구) ND 7.60±0.41 ND ND ND ND
수크로오스/S ND 3.63±0.19 ND 3.4±0.10 2.53±0.12 ND
수크로오스/S/GO ND 2.74±0.10 ND 1.76±0.04 1.40±0.05 ND
* S : 수크라아제, GO : 글루코오스 옥시다아제
* ND : 불검출
* 단위 : g/L
샘플 말토오스 수크로오스 락토오스 글루코오스 프럭토오스 갈락토오스
락토오스(대조구) ND ND 10.40±0.32 ND ND ND
락토오스/L ND ND 2.83±0.06 4.72±0.14 ND 4.77±0.16
락토오스/L/GO ND ND 1.75±0.04 2.19±0.06 ND 2.38±0.08
* L : 락타아제, GO : 글루코오스 옥시다아제
* ND : 불검출
* 단위 : g/L
샘플 말토오스 수크로오스 락토오스 글루코오스 프럭토오스 갈락토오스
글루코오스(대조구) ND ND ND 10.21±0.08 ND ND
글루코오스/TG ND ND ND 9.52±0.08 ND ND
글루코오스/GO ND ND ND 9.41±0.05 ND ND
글루코오스/TG/GO ND ND ND 5.95±0.01 ND ND
글루코오스/TG/GO/C ND ND ND 4.41±0.04 ND ND
* TG : 트랜스글루코시다아제, GO : 글루코오스 옥시다아제, C : 카탈라아제
* ND : 불검출
* 단위 : g/L
상기와 같이 글루코오스옥시다아제를 단독으로 처리한 경우에 비하여 글루코아밀라아제, 수크라아제, 락타아제 또는 트랜스글루코시다아제를 글루코오스옥시다아제와 함께 처리하였을 때 예상되는 효과에 비하여 현저한 글루코오스의 감소 효과가 확인되었다.
즉, 상기 표 4의 '글루코오스/GO' 샘플의 결과에서와 같이 글루코오스옥시다아제를 단독으로 처리하였을 경우 약 7.8%의 글루코오스 감소 효과가 나타나는 반면, 글루코아밀라아제와 글루코오스옥시다아제를 함께 처리할 경우 약 37%의 글루코오스 감소 효과가 나타났고(표 1 참조), 수크라아제와 글루코오스옥시다아제를 함께 처리할 경우에서는 약 48.2%의 글루코오스 감소 효과가 나타났으며(표 2 참조), 락타아제와 글루코오스옥시다아제를 함께 처리할 경우 약 53.6%(표 3 참조), 트랜스글루코시다아제와 글루코오스옥시다아제를 함께 처리할 경우 약 41.7%의 글루코오스 감소 효과가 나타났다(표 4 참조).
또한, 카탈라아제와 함께 처리할 경우 글루코오스 감소 효과가 더욱 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 2. 글루코오스옥시다아제 반응유래 과산화수소에 대한 카탈라아제의 효과 조사
0.1M sodium citrate (pH 3.0), 0.1M sodium acetate (pH 5.0), 그리고 0.1M sodium phosphate (pH 7.0) 각각의 완충용액 100㎖에 glucose를 1%(w/v)가 되도록 녹여서 기질용액을 준비하고 여기에 글루코오스옥시다아제(400 U/㎖) 1㎖ 및 카탈라아제(2,000 U/㎖) 1㎖를 첨가하고 37℃에서 시간변화(0시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 그리고 24시간)에 따라 과산화수소 정량 KIT를(B50-H2O2, ITS, China)를 이용하여 과산화수소량을 측정하였다.
또한, 비교를 위해 카탈라아제를 제외시킨 대조군을 사용하였다.
이의 결과 도 1과 같이, 글루코오스옥시다아제의 반응에 의해 생성되는 과산화수소가 카탈라아제에 의해 효과적으로 소거되는 것으로 나타났다.
실시예 3. 동물실험
3-1. 방법
트랜스글루코시다아제, 수크라아제, 락타아제, 글루코아밀라아제, 글루코오스옥시다아제 및 카탈라아제, 그리고 추가로 알파-아밀라아제를 사용하여 다음 표 5와 같이 효소 조성물을 제조하였다.
효소 역가(/400mg) 기원 제조처/제조국
트랜스글루코시다아제 20 U Aspergillus niger 넨시스(주)/대한민국
수크라아제 200 U Saccharomyces cerevisiae Orchid/중국
락타아제 400 U Aspergillus niger Adavanced Enzyme Technologies/인도
알파-아밀라아제 7,000 U Aspergillus oryzae Shandong Longda/중국
글루코아밀라아제 5,800 U Aspergillus niger Shandong Longda/중국
글루코오스옥시다아제 400 U Aspergillus niger 넨시스(주)/대한민국
카탈라아제 2,000 U Aspergillus niger 넨시스(주)/대한민국
쥐(랫트, rat)(Sprague dawley, 체중 평균 160g, 7주령)에 상기 효소 조성물을 쥐의 체중 1kg 당 2, 5, 50mg으로 경구투여하고, 30분 후 포도당 또는 설탕을 쥐 체중 1kg 당 2g씩 경구투여하고 경과시간에 따른 혈당을 측정하였다.
이의 결과, 도 2 내지 7에서와 같이 효소 조성물을 투여하였을 경우 포도당 또는 수크로오스의 섭취에 따른 혈당 증가가 감소하는 것으로 나타났다.
[효소 역가 시험법]
1. 글루코아밀라아제 시험법
1-1. 역가정의
1U은 pH6.0, 40℃ 환경에서 1시간동안 1mg의 전분을 가수분해하는 역가를 의미하며 고체시료의 경우 u/g으로, 액체시료의 경우 u/ml로 표기한다.
1-2. 시험과정
2%(w/v) 가용성전분용액 25ml을 2개의 시험관에 각각 넣은 뒤 5ml의 0.1M 초산염완충용액(pH 6.0)를 넣고 잘 흔들어 40℃ 항온수조에서 5분간 유지한다. 검액 2ml을 시험군 시험관에 넣고 5분간 잘 섞어준 후, 30분 동안 유지한다. 0.2ml의 20%(w/v) 수산화나트륨용액을 시험군, 공시험군 2개 시험관에 모두 넣고 잘 섞어준 후, 식혀준다. 0.1M 초산염완충용액(pH 6.0) 2ml을 공시험관에 넣어준다. 두 시험관에서 모두 5ml을 즉시 취해 0.1M iodine 용액 10ml과 0.1M sodium hydroxide 용액 15ml과 혼합해 잘 흔들어준 뒤 어두운 곳에서 15분 동안 반응 시킨다. 2M 황산용액 2ml을 첨가하고 0.05M 치오황산나트륨 용액으로 푸른색이 사라질 때까지 적정한다. 하기의 계산식에 따라 역가를 계산한다.
X = (a-b) c × 90.005 × 32.2/5 × 1/2 × n × 2 = 579.9 × (a-b) c × n
a : 공시험군의 적정 볼륨 (ml)
b : 시험군의 적정 볼륨 (ml)
c : 표준 sodium hyposulfite 용액의 농도 (mol/L)
90.05 : 포도당 질량 (1ml의 standard sodium hyposulfite 용액 내)
32.2 : 반응액의 총 부피 (ml)
5 : 흡수된 반응액 부피 (ml)
1/2 : 흡수된 효소액 2ml=1ml
n : 확장율
2 : 반응시간 시간 30분을 1시간 반응 한 것으로 환산
2. 수크라아제 시험법
2-1. 역가정의
본 시험법에서의 역가정의는 하기 시험법에 따라 시험했을 때, 5분 동안 1mg의 수크로오스를 글루코오스와 프럭토오스로 변화시키는데 필요한 효소의 양(g)을 1단위라고 한다.
2-2. 시험과정
6.5%(w/v) 수크로오스 용액(기질용액), 5mL를 시험관에 넣고 (각 시료별 공시험군 및 시험군 설정) 20℃ 항온수조에서 데운다. 이와 동시에 준비된 검액 10ml 역시 같은 온도에서 데워준다. 검액(0.5U/mL) 1mL를 기질용액이 담긴 각 시험관에 넣고 강하게 흔들어준다. 검액에 대한 공시험군은 검액을 끓는 물에서 10분간 담근 뒤, 5분간 얼음에 식혀 비활성화된 효소액 1ml을 넣어 준비한다.
포도당 표준 준비를 위해 1ml의 0.3%(w/v) 글루코오스 용액을 3개의 6.5%(w/v) 수크로오스 용액(기질용액), 5mL가 들어있는 시험관에 첨가한다.
기질에 대한 공시험군의 준비를 위해 1mL의 정제수를 3개의 5mL의 6.5%(w/v) 수크로오스 용액(기질용액)가 들어있는 시험관에 첨가한다. 정확히 30분 후에 7ml의 3,5-DNS 용액1 )을 넣고 흔들어 효소반응을 정지시킨다. 마찬가지로 3ml의 0.3%(w/v) 글루코오스 용액, 3ml의 6.5%(w/v) 수크로오스 용액(기질용액), 그리고 3ml의 비활성화된 효소반응액 각각에 7ml의 3,5-DNS 용액1 )을 첨하하고 강하게 혼합한다.
모든 시험관을 끓는 물에서 10분간 가열하고 얼음에 5분간 식혀준다. 각 시험관에 40mL의 정제수를 넣고 강하게 섞어준다.
10분간 실온에서 방치한뒤 515nm에서 정제수를 "0"으로 하여 흡광도를 측정한다.
검액의 수크라아제 역가(u/g) = [(AU-AB) / (AS-AW) × (0.5/C)
AU : 검액의 평균 흡광도
AB : 검액에 대한 공시험 군의 평균 흡광도
AS : 포도당 표준 군의 평균 흡광도
AW : 기질에 대한 공시험 군의 평균 흡광도
C : 검액의 농도 (g/ml)
0.5 : (3 mg glucose * 5 min unit definition)/30min reaction
1) 3,5-DNS 용액: 308g의 sodium potassium tartrate tetrahydrate 와 19.4g 의 sodium hydroxide를 1000ml 플라스크에 넣고 DW에 녹여준다. 3,5-DNS acid 10.7g을 넣고 녹여준다. 3번째 용기에는 8.33g의 phenol을 옮겨담고 1.83g 의 sodium hydroxide와 8.33g의 sodium metabisulfite를 녹여준다. 만든지 48시간이 지나지 않은 것을 사용하고 유리섬유를 이용하여 여과하여 사용한다. 이 용액 200mL에 0.3%(w/v) 글루코오스 용액 3mL를 첨가한다.
3. 락타아제 시험법
3-1. 역가정의
1 단위(U)는 위 시험 조건에서 1분 동안 1μmol의 기질을 분해하는 효소 역가를 의미한다.
3-2. 시험과정
25mm 직경의 150mm 길이의 시험관을 준비한다. 2ml의 기질용액(o-nitrophenyl-β-D-glactopyranoside, 7.4 mg/mL, pH 4.5)을 37℃에서 10분간 방치한다. 검액을 시험관에 넣고 공시험군에는 동량의 정제수를 첨가한 후, 15분간 반응시킨다. 2.5ml의 10%(w/v) 탄산나트륨 용액을 넣고 흔들어 반응을 정지시키고 20ml의 정제수를 첨가해 25ml로 희석하여 강하게 흔들어준다. 420nm 파장에서 흡광도를 측정한다.
표준곡선을 다음과 같이 작성한다. 139mg의 o-니트로페놀을 500ml 플라스크에 넣고 95% 에탄올 10mL를 이용해 녹여 2mM o-니트로페놀 용액을 제조한다. 이 용액을 1%(w/v) 탄산나트륨 용액에 다양하게 희석하여 사용한다.
2mM o-니트로페놀 용액(mL) 1%(w/v) 탄산나트륨 용액과 혼합하여 100ml로 조정 o-니트로페놀의 농도
5.0 0.10
7.0 0.14
9.0 0.18
* R2 > 0.99 이 되도록 설정
하기의 계산식에 따라 락타아제의 역가를 계산한다.
검액의 락타아제 역가(U/g) = [ (As - B)(25) ] / [ (ε) (15) (W) ]
As : 시험군의 흡광도 값
B : 공시험군의 흡광도 값
ε : μmol 당 o-nitrophenol 표준 흡광도
25 : 최종 부피
15 : 반응시간 (min)
W : 최초 시험액에 첨가한 시료의 무게 (g/ml)
4. 글루코오스 옥시다아제 시험법
4-1. 역가정의
1U 의 glucose oxidase는 37℃ pH6.0 조건에서 1분 동안 1μmol의 β-D-glucose를 D-gluconic acid도 산화시키는 역가를 의미한다.
4-2. 시험과정
희석된 글루코오스 옥시다아제(HRP, GenView DH165-2, 4U/mL)를 이용해 아래 표 7에 따라 0.1M 인산염완충용액(pH6.0)으로 더 희석하여 표준물질을 준비한다.
표준 희석 배수
표준용액 번호 초기 농도 -> 최종 농도/(U/ml) 초기 부피 -> 최종 부피(mL)
1 4 -> 0.8 0.2 -> 1
2 4 -> 1.2 0.3 -> 1
3 4 -> 1.6 0.4 -> 1
4 4 -> 2.0 0.5 -> 1
5 4 -> 2.4 0.6 -> 1
6 4 -> 2.8 0.7 -> 1
표 8에 따라 조작하여 글루코오스 옥시다아제 없이 37℃에서 5분 동안 방치시킨다. 글루코오스 옥시다아제 용액 0.1ml을 넣고 3분간 반응시킨다. 2mL의 2M H2SO4을 넣고 흔들어 섞은 다음 1cm cell을 이용해 540nm 파장에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 작성한다. (Y축 : 글루코오스 옥시다아제 농도 / X축 : OD값으로 설정 / R2≥0.995)
시료 첨가 무게
항목 공시험 시험관 (ml) 검액 시험관 (ml)
1%(w/v) 디아니시딘 용액 2.6 2.5
1.8%(w/v) 글루코오스 용액 0.3 0.3
퍼옥시다아제(100U/mL) 용액 0.1 0.1
검액 -- 0.1
검액을 표 8에 따라 시험을 수행하여 공시험액과 검액의 흡광도를 측정하고 하기의 계산식에 따라 검액의 글루코오스 옥시다아제의 역가를 계산한다.
Y = K (AE - AB) × D
Y : 검액의 글루코오스 옥시다아제 역가(U/ml)
AE : 검액의 OD값
AB : 공시험액의 OD값
K : 표준곡선 상의 기울기
D : 희석 배수
5. 트랜스글루코시다아제 시험법
5-1. 역가정의
본 시험법의 시험조건에 따라 시험할 때, 1분 동안 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside로 부터 1㎍의 4-Nitrophenol을 생성시키는 효소의 양을 1 단위(unit)로 한다.
5-2. 시험과정
밀봉이 가능한 시험관에 10 mM p-NPG 1㎖, 0.2M sodium acetate buffer (pH5.5) 0.5㎖, 그리고 5%(w/v) pyridine solution 100㎕를 첨가한 후, 50℃의 항온수조에서 5분간 예열한다. 5분 후, 검액을 200㎕를 첨가하고 흔들어주면서 50℃에서 10분간 반응시킨다. 정확히 10분 반응시킨 후, 반응액을 항온수조에서 꺼내고 200㎕의 0.2M 탄산나트륨을 첨가하여 효소반응을 정지시킨다. 25℃에서 10분간 방치시킨 후, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 파장 420㎚에서 흡광도(A420)값을 측정한다(T). 이 때 공시험군으로는 10 mM p-NPG 1㎖, 0.2 M sodium acetate buffer (pH5.5) 0.5㎖, 그리고 5%(w/v) pyridine solution 100㎕를 각각 첨가하고 혼합하여 50℃의 항온수조에서 10분간 방치한 후, 200㎕의 0.2M sodium carbonate를 첨가하여 혼합하고 다시 검액 200㎕를 첨가한 것으로 한다. 이 공시험군의 흡광도(A420)를 측정한다(B).
p-Nitrophenol 표준곡선(p-Nitrophenol Standard Curve)은 다음과 같이 구하고 기울기 (a) 값을 얻는다. 0.1 ㎎/㎖ p-nitrophenol을 20㎕, 40㎕, 60㎕, 80㎕, 그리고 100㎕를 각각 넣은 시험관에 정제수를 각각 1,780㎕, 1,760㎕, 1,740㎕, 1,720㎕, 그리고 1,700㎕ 첨가하고 다시 0.2 M sodium carbonate를 각각 200㎕씩 첨가하여 잘 섞어준다. p-nitrophenol의 최종농도는 각각 1㎍/㎖(C1), 2㎍/㎖(C2), 3㎍/㎖(C3), 4㎍/㎖(C4), 그리고 5㎍/㎖(C5)이 된다. 이것들을 파장 420㎚에서 흡광도(A1, A2, A3, A4, 그리고 A5)를 측정한다. 농도 C1, C2, C3, C4, 그리고 C5를 각각 X축으로 하고 흡광도 A1, A2, A3, A4, 그리고 A5를 각각 Y축으로 하여 회귀분석을 하고 기울기 a를 구한다.
검액의 트랜스글루코시다아제 역가(u/g) = 1/W × (T-B)/a × 1/10 × 2
W : 효소반응에 첨가된 시료의 양(g)
T : 효소 반응액의 흡광도(A420)
B : 공전시험액의 흡광도(A420)
a : 표준곡선의 기울기
1/10 : 반응시간 보정계수
2 : 부피 보정계수
6. 카탈라아제 시험법
6-1. 역가정의
본 시험법의 1단위의 카탈라아제는 pH 6.8, 30℃ 조건에서 1분 동안 1μmol의 과산화수소를 분해하는 역가를 의미한다.
6-2. 시험과정
5mL의 0.075%(v/v) 과산화수소용액(pH 6.8)을 플라스크로 옮긴 후, 30℃ 항온수조에서 5분 방치한다. 여기에 1mL의 검액(pH6.8)을 첨가한 후, 5분간 반응시킨다. 그 후 2mL의 1N H2SO4를 넣어 반응을 정지시킨다. 1mL의 10%(w/v) patassium iodide 용액과 1%(w/v) ammonium molybdate 1방울, 2~3방울의 지시약[1%(w/v) starch-iodide]를 첨가한다. 유리된 요오드를 0.01N 치오황산나트륨을 이용해 적정하고, 이 사용된 양을 V1 으로 한다. 2mL의 1N H2SO4를 첨가하고 1mL의 검액(pH6.8)을 첨가한 뒤 기질용액을 넣지 않고 공시험군으로 하며 공시험군의 적정양을 V2로 한다. 아래의 계산식에 따라 역가를 계산한다.
검액의 카탈라아제의 역가 (u/g) = (V2-V1) × (0.01/2) × 1000 × DT / 5
DT : 희석배수
V2 : 공시험군 적정에 사용된 치오황산나트륨의 양 (mL)
V1 : 시험군 적정에 사용된 치오황산나트륨의 양 (mL)
0.01 : 치오황산용액의 농도 (mol/L)
7. α-아밀라아제 시험법
7-1. 역가정의
1 α-아밀라아제 단위(U)는 충분한 양의 β-아밀라아제(β-Amylase) 존재하에 30℃에서 1시간에 1g의 비율로 가용성전분을 덱스트린화하는 효소의 양이다.
7-2. 시험과정
13×100mm 시험관 20개를 1조로 하여 요오드시액1 ) 5mL씩을 취하여 각 시험관에 넣고 30±0.1℃의 수욕조에 항온시킨다. 미리 수욕조에서 20분간 처리한 기질용액 20mL를 50mL 삼각플라스크에 넣고 동 수욕조에서 미리 20분간 처리한 0.5% 염화나트륨용액 5mL를 취하여 항온시킨 2%(w/v) 가용성전분(pH 4.8)에 넣고 이를 즉시 마개를 하여 혼합하고 수욕조에 유지시킨다. 시험시작시간에서 검액 5mL를 가하여 수욕조에서 유지시킨다. 10분 후 50mL 삼각플라스크내의 반응혼액 1mL를 요오드시액이 든 시험관에 취하여 잘 흔들어 내용물을 비색계에서 얻은 표준색2 )과 즉시 비교한다. 비색판 뒤에는 물이 든 튜브를 사용한다. 동일한 방법으로 일정하고 정확한 시간의 간격으로 반복 비교실험을 하여 표준색과 동일하게 될 때까지 행한다. 취하는 매시간을 기록한다. 하기 계산식에 따라 검액의 역가를 구한다.
검액의 아밀라아제 역가(solution) ＝ 24 / (W × T)
W : 시험용액 5mL에 함유된 효소의 양(g)
T : 덱스트린화 시간(분)
24 : 전분기질무게(0.4g)와 60분간의 계산값
1) 요오드시액 : 요오드칼륨 20g을 물 300mL에 녹이고 요오드원액(요오드 5.5g과 요오드칼륨 11.0g을 정제수에 녹여 250mL 부피로 한 것), 2.0mL를 가하여 물로 500mL로 한다.
2) 표준색 : 염화코발트(CoCl2·6H5O) 25g과 중크롬산칼륨 3.84g을 0.01N 염산에 녹여 100mL로 한 것을 사용한다.

Claims (4)

  1. 글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase) 및 락타아제(lactase)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 효소;
    글루코오스옥시다아제(glucose oxidase); 및
    트랜스글루코시다아제(transglucosidase);를 포함하는 당 대사 조절용 효소 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    카탈라아제(catalase)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 당 대사 조절용 효소 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    글루코아밀라아제(glucoamylase), 수크라아제(sucrase), 락타아제(lactase), 글루코오스옥시다아제(glucose oxidase), 트랜스글루코시다아제(transglucosidase) 및 카탈라아제(catalase)를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 당 대사 조절용 효소 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    알파-아밀라아제(α-amylase) 및 베타-아밀라아제(β-amylase) 중에서 선택된 1종 이상의 아밀라아제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 당 대사 조절용 효소 조성물.
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