WO2019082721A1 - Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト及びその利用 - Google Patents

Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト及びその利用

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WO2019082721A1
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subunit
construct
coupled receptor
substance
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一平 下村
山本　岳
将史 上瀧
直哉 飛田
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    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Definitions

  • the present invention provides a construct for expressing a G protein-coupled receptor or a subunit thereof, a transformed cell into which the construct of the present invention has been transfected, a method of measuring a physiological response of a substance using the transformed cell of the present invention,
  • the present invention relates to a use of the transformed cell of the present invention for measuring a physiological response of a substance, a kit comprising the transformed cell of the present invention, for use in a method of measuring a physiological response of a substance.
  • G Protein-Coupled Receptor and Signaling via G Protein G protein-coupled receptor is one of the types of receptors present on the cytoplasmic membrane of eukaryotic cells or on the constitutive membrane inside cells.
  • signals neurotransmitters, hormones, chemicals, light, etc.
  • the G protein coupled receptor undergoes a structural change, and the trimer G bound to the inner side of the membrane Signal transduction is performed by activating the protein.
  • G protein is a heterotrimer which binds to the inner surface of the cell membrane and tightly binds G ⁇ dimers to G ⁇ subunits.
  • G protein bound to G protein coupled receptor separates its possessed GDP from G ⁇ subunit and binds to a new molecule of GTP (GDP type ⁇ Conversion to GTP type). This conversion separates each of the G ⁇ subunit, the G ⁇ dimer and the G protein coupled receptor. The separated G ⁇ subunit activates its downstream effector protein.
  • G protein-coupled receptors and G proteins downstream thereof have many basic physiochemical properties in intracellular signal networks such as olfactory sensation, taste, vision, neurotransmission, metabolism, cell differentiation and cell proliferation, inflammatory response and immune response. Control the response.
  • Findings on Taste and Olfaction Taste is the sensation that results from binding of a substance to specific receptors present on the surface of the tongue, especially when the substance is in the mouth.
  • the taste of mammals is composed of five basic tastes, that is, saltiness, sourness, sweetness, umami and bitterness, and is considered to be formed by integration of these basic tastes.
  • saltiness and acidity are said to be sensed via several ionotropic receptors expressed on the cell membrane of the proximal side of taste cells present in taste buds on the surface of the tongue.
  • Sweetness, umami and bitter taste are considered to be sensed by signal transduction via G protein coupled receptors present in taste cells and G proteins coupled thereto.
  • bitter taste is accepted by a molecule (bitter taste receptor) (25 types in human) designated as T2R family
  • sweetness is a T1R2 + T1R3 heterodimer (sweet taste receptor)
  • umami is a T1R1 + T1R3 heterodimer (Umami taste receptor It has been shown to be accepted by the body).
  • the mechanism of the transmission mechanism of taste information is generally understood as follows. That is, first, when a taste substance binds to a receptor of taste cells, the intracellular calcium concentration increases through a signal transduction process via intracellular second messengers (IP3, DAG) and the like. Then, the calcium ion supplied into the cell causes the neurotransmitter to be released to the synapse to cause the nerve cell to generate an action potential, and as a result, the taste signal originating from the receptor is transmitted from the taste nerve to the brain It is common practice that taste information is identified and judged.
  • IP3, DAG intracellular second messengers
  • Olfactory receptors are also G protein coupled receptors, as are taste receptors such as bitter taste receptors, sweet taste receptors and umami receptors. Olfactory receptors are present on olfactory cells of the olfactory epithelium. Olfactory cells are the only place in the human body where neurons are in direct contact with the outside world, and the other end is directly connected to the area called the olfactory bulb of the brain. "Odor substance” is a low molecular weight compound having a molecular weight of about 30 to 300, and it is said that hundreds of thousands of odor substances exist on the earth. As many as 400 or more olfactory receptors have been identified in humans.
  • the intracellular calcium concentration passes through a process of signal transduction via an intracellular second messenger, as with taste receptors such as bitter taste receptors, sweet taste receptors, and umami receptors. To rise.
  • G protein-coupled receptor agonists Chemical substances, neurotransmitters, hormones, etc. contained in foods and beverages are bound to the G protein-coupled receptor to cause a structural change and are bound to the inside of the membrane It may be a G protein coupled receptor agonist in a series of signal transductions that activate G proteins. It is desirable to be able to simply and efficiently evaluate the physiological response of these G protein coupled receptor agonist candidates. If it is possible to appropriately evaluate the physiological response of the candidate substance of protein coupled receptor agonist, it is beneficial to improve the taste, quality, etc. of food and drink, medicine, etc. and to adjust the amount of protein coupled receptor agonist used. Effects can be achieved.
  • a cell line expressing G protein coupled receptor and G ⁇ protein is prepared, and a G protein coupled receptor agonist (candidate compound) is directly added to such cell line. Methods to assess the effect have been reported.
  • the G protein coupled receptor protein and the G ⁇ protein need to be expressed in the same cell.
  • a co-gene transfer method is generally widely used in which two types of vectors containing nucleic acids encoding the respective proteins are introduced simultaneously or sequentially. This is an aspect as follows, for example.
  • A cotransfecting a host cell with a vector comprising a nucleic acid encoding a G ⁇ protein and a vector comprising a nucleic acid encoding a G protein coupled receptor protein or a subunit thereof;
  • B A cell line in which G ⁇ protein is stably expressed is transformed with a vector containing a nucleic acid encoding a G protein coupled receptor protein or a subunit thereof.
  • the production difficulty is high (the success rate is low), and stable data can not be acquired. Therefore, it can not be said that it is a cell line having sufficient quality to use for evaluating G protein coupled receptor agonists.
  • Patent 5905187 “A sweet taste receptor expression construct obtained by inserting each of the genes encoding the taste receptor subunits T1R2 and T1R3 of the taste receptor and the G protein ⁇ subunit into the same plasmid, the EF-1 ⁇ promoter The gene encoding the G protein ⁇ subunit is linked via the IRES sequence immediately after the gene encoding the sweet taste receptor subunit T1R2, which is located downstream of, and further downstream of the CMV promoter present downstream thereof Describes a “sweetener receptor expression construct” consisting of a gene encoding a G protein ⁇ subunit linked to an IRES sequence immediately after a gene encoding a sweetness receptor subunit T1R3 located at .
  • Patent 5905187 has a specific structure of EF-1 ⁇ promoter-T1R2-IRES-G ⁇ -CMV promoter-TIR3-IRES-G ⁇ "sequentially from the 5 'side.
  • T1R2 and T1R3 are each located downstream of the particular promoter and upstream of the IRES.
  • IRES is an RNA element that enables cap-independent translational initiation to increase the efficiency of protein synthesis. It is known that translation through IRES tends to be less efficient compared to upstream proteins that generally undergo cap-dependent translation.
  • G in order from the 5' side in a single vector, G Protein ⁇ subunit protein-encoding nucleic acid, nucleic acid containing IRES sequence, and G protein-coupled receptor protein or nucleic acid encoding subunit thereof, thereby enhancing G protein-coupled receptor protein or subunit thereof
  • the present invention was conceived based on the finding that it is efficiently expressed and responds highly efficiently to G protein coupled receptor agonists.
  • Proteins encoded by genes located 3 'to IRES are believed to have low expression levels. Therefore, in the present invention, highly efficient expression of the G protein coupled receptor protein or its subunit is contrary to conventional findings and is characteristic.
  • a construct for expressing a G protein-coupled receptor protein or a subunit thereof comprising: a nucleic acid encoding a G protein ⁇ subunit protein, a nucleic acid containing an IRES sequence, and A construct comprising a nucleic acid encoding a G protein coupled receptor protein or a subunit thereof.
  • a construct for expressing a G protein-coupled receptor protein or a subunit thereof comprising: a nucleic acid encoding a G protein ⁇ subunit protein, a nucleic acid containing an IRES sequence, and A construct comprising a nucleic acid encoding a G protein coupled receptor protein or a subunit thereof.
  • the G protein coupled receptor or a subunit thereof is a rhodopsin-like receptor class or a metabotropic glutamate receptor / metabolic pheromone receptor class G protein coupled receptor.
  • the vector is a plasmid vector containing the EF1 ⁇ promoter.
  • the vector is a plasmid vector containing an EF1 ⁇ promoter and a puromycin resistance gene.
  • Aspect 10] Aspect 11. The construct according to any one of aspects 1-9, wherein the IRES sequence is a type 2 IRES sequence.
  • a polypeptide that enhances translocation of a G protein-coupled receptor protein or a subunit thereof to the cell membrane is a polypeptide comprising the N-terminal 45 amino acids of rat somatostatin receptor or a polypeptide comprising the N-terminal 39 amino acids of bovine rhodopsin
  • the G protein ⁇ subunit protein is a G protein ⁇ subunit protein of Gq family, a G protein ⁇ subunit protein of Gi family, a G protein ⁇ subunit protein of Gs family, or a chimeric protein thereof The construct according to any one of 13.
  • a method of measuring a physiological response of a substance which comprises adding the substance to the transformed cell according to aspect 19 and measuring a physiological response by the substance.
  • the substance is a bitter-tasting substance, an odorant, a umami substance or a sweetening substance, or a modulator for these substances.
  • 21 Use of a transformed cell according to aspect 19 for measuring the physiological response of a substance.
  • Cells transformed with the construct of the present invention express G protein coupled receptor protein or its subunit with high efficiency and respond highly efficiently to G protein coupled receptor agonist.
  • the transformed cells of the present invention provide cell lines of sufficient quality to be used to evaluate G protein coupled receptor agonists.
  • FIG. 1 illustrates the construction of the construct prepared in Example 1.
  • CMV CMV promoter
  • FIG. 2 shows the results of measurement of the response of the T2R16 stable expression strain to the bitter taste substance salicin.
  • FIG. 3 shows the results of measurement of the response of the T2R40 stable expression strain to the bitter taste substance difenidol and the response of the T2R43 stable expression strain to the bitter taste substance quinine.
  • FIG. 4 shows the results of measurement of the response of T2R16 transiently expressing cells to the bitter taste substance salicin.
  • FIG. 5 shows the results of measurement of the response to T2R-independent G ⁇ 16 agonist (isoproterenol) in T2R16 transiently expressing cells.
  • FIG. 6 shows the results of measurement of the expression level of T2R16 in T2R16 transiently expressing cells.
  • FIG. 7 shows the results of comparison of response strengths before and after cryopreservation of T2R16 stable expression strains.
  • FIG. 8 shows the result of examining the correlation by comparing the response strength to T2R40 agonist of G ⁇ -T2R40 stable expression strain with the response strength to G ⁇ agonist.
  • FIG. 9 shows the results of measurement of the expression level of T1R2 in a cell line (G ⁇ -T1R2 + T1R3) in which G ⁇ -T1R2 and T1R3 were co-transfected and transiently expressed.
  • FIG. 10 shows the results of measurement of the response to T2R-independent G ⁇ 16 agonist (isoproterenol) in a cell line (G ⁇ -T1R2 + T1R3) co-transfected with G ⁇ -T1R2 and T1R3 and transiently expressed .
  • FIG. 11 shows the results of measurement of the response to the sweetener aspartame in a cell line (G ⁇ -T1R2 + T1R3) in which G ⁇ -T1R2 and T1R3 were co-transfected and transiently expressed.
  • FIG. 12 shows the results of measurement of the expression level of T1R3 in a cell line (G ⁇ -T1R3 + T1R2) in which G ⁇ -T1R3 and T1R2 were co-transfected and transiently expressed.
  • FIG. 13 shows the results of measurement of the response to a T2R-independent G ⁇ 16 agonist (isoproterenol) in a cell line (G ⁇ -T1R3 + T1R2) in which G ⁇ -T1R3 and T1R2 were co-transfected and transiently expressed.
  • FIG. 13 shows the results of measurement of the response to a T2R-independent G ⁇ 16 agonist (isoproterenol) in a cell line (G ⁇ -T1R3 + T1R2) in which G ⁇ -T1R3 and T1R2 were co-transfected and transiently expressed.
  • FIG. 14 shows the results of measurement of the response to the sweetener cyclamate in a cell line (G ⁇ -T1R3 + T1R2) in which G ⁇ -T1R3 and T1R2 were co-transfected and transiently expressed.
  • FIG. 15 shows the results of measurement of the expression level of EmGFP when green fluorescent protein (EmGFP) was expressed upstream and downstream of IRES.
  • FIG. 16 shows the results of examining the expression level of T2R16 in HEL293T cells in which pEAK10-T2R16-G ⁇ and pEAK10-G ⁇ -T2R16 were transiently expressed.
  • FIG. 17 shows the results of examining the responses of transiently expressing cells to each agonist (bitter substance) for seven T2R subtypes (bitter taste receptors).
  • FIG. 18 shows the results of examining the responses of stably expressing cells to an agonist (6-n-propylthiouracil) for the T2R38 subtype (bitter taste receptor). Black is the result of T2R38, and hatched is the result of the control (a cell line not incorporating the expression vector G ⁇ -T2R38 (HEK293T)).
  • FIG. 19 shows the results of comparison of the expression levels of 14 T2R subtypes (bitter taste receptors) in transiently expressing cells (compared to T2R4).
  • FIG. 20 shows the results of examining the response in transiently expressing cells of the olfactory receptor (OR3A1).
  • the hatched lines show the results of introducing OR3A1-G ⁇ olf and the black shows the result of introducing G ⁇ olf-OR3A1.
  • the dotted line shows the results of introducing genes OR3A1 and G ⁇ olf individually into pcDNA and co-transfecting HEK293T293T.
  • FIG. 20 shows the expression levels of OR3A1 and G ⁇ olf in transiently expressing cells of the olfactory receptor (OR3A1).
  • the hatching indicates the result of OR3A1
  • the black indicates the result of G ⁇ olf.
  • “OR3A1 + G ⁇ olf” is the result when each gene of OR3A1 and G ⁇ olf was individually introduced into pcDNA and co-introduced into HEK293T293T.
  • the present invention provides a construct for expressing a G protein-coupled receptor or a subunit thereof, a transformed cell into which the construct of the present invention has been transfected, a method of measuring a physiological response of a substance using the transformed cell of the present invention,
  • the present invention relates to a use of the transformed cell of the present invention for measuring a physiological response of a substance, a kit comprising the transformed cell of the present invention, for use in a method of measuring a physiological response of a substance.
  • modes for carrying out the present invention will be described without limitation.
  • a construct for expressing a G protein coupled receptor or a subunit thereof The present invention relates, in one aspect, a construct for expressing a G protein coupled receptor or a subunit thereof.
  • the construct of the present invention encodes a G protein ⁇ subunit protein-encoding nucleic acid, a nucleic acid containing an IRES sequence, and a G protein coupled receptor protein or a subunit thereof in sequence from the 5 'side in a single vector It is characterized in that it contains a nucleic acid.
  • G protein-coupled receptor or subunit thereof [G protein-coupled receptor (G PCR)] is present on the cytoplasmic membrane of eukaryote or on the inner membrane of cells It is one of the types of receptors. Seven helical structures penetrate the cell membrane (or the constituent membrane in the cell), the N terminus is outside the membrane, and the C terminus is located inside the membrane, also called "7-transmembrane receptor". Be done. The extramembrane loop contains two well-conserved cysteine residues, which stabilize the receptor structure by disulfide bonds.
  • G protein coupled receptor When various signals (neurotransmitters, hormones, chemicals, light, etc.) from the extracellular (extramembrane) are received, the G protein coupled receptor undergoes a structural change, and the trimer G bound to the inner side of the membrane Signal transduction is performed by activating the protein.
  • G protein-coupled receptors control many basic physiochemical responses in intracellular signal networks such as olfactory sensation, taste, vision, neurotransmission, metabolism, cell differentiation and cell proliferation, inflammatory responses and immune responses. ing.
  • G protein coupled receptors are classified into six classes based on similarity of amino acid sequences, pharmacological dynamics, functions, etc. (Molecular BioSystems, 7, p. 911-919, 2011).
  • Class A rhodopsin-like receptor class B: secretin receptor family class C: metabotropic glutamate receptor / metabolic pheromone receptor class D: mating factor receptor of fungus class E: cyclic AMP (cAMP) receptor class F : Frizzled, Smoothed (Smoothened)
  • Class A Rhodopsin-Like Receptor
  • the rhodopsin-like receptor of class A has a relatively short N-terminal extracellular domain, and a plurality of transmembrane domains form a ligand binding site.
  • Class A rhodopsin-like receptors account for 80% or more of G protein coupled receptors, and include bitter taste receptors, olfactory receptors, rhodopsin, adrenoceptors, muscarinic acetylcholine receptors and the like.
  • the amino acid sequence conserved in the rhodopsin-like receptor includes the E / DRY (Asp / Glu, Arg, Tyr) motif located inside the membrane of the third transmembrane region.
  • Bitter taste receptors are G protein coupled receptors that belong to rhodopsin-like receptors. It was identified as T2R family on human and mouse chromosome 6. At least 35 types in mice and 25 types in humans function as bitter taste receptors.
  • An example of the relationship between human T2R and its ligand is as follows.
  • T2R4 Denatonium benzoate
  • T2R10 strychnine
  • T2R14 nonspecifically binding bitter substances with many different structural features
  • T2R16 ⁇ -glucopyranoside (salicin)
  • T2R31 aristochia acid
  • T2R38 a bitter substance having an isothiocyanate group, for example, phenylthiocarbamide (PTC), propylthiouracil (PROP)
  • PTC phenylthiocarbamide
  • PROP propylthiouracil
  • T2R40 Diphenidol
  • T2R43 Quinine
  • T2R46 Abscinthine, strychnine, denatonium
  • amino acid sequences of the mouse and human T2R proteins and the nucleic acid sequences of the genes are known.
  • amino acid sequences and gene sequences of 25 human T2R bitter taste receptors are registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) or GenBank under the accession numbers described in Table 1 below.
  • nucleic acid is used synonymously with nucleic acid unless otherwise specified, and includes embodiments in which a control sequence such as a promoter is not included. Nucleic acids also include DNA (including both genomic DNA and cDNA), RNA (mRNA), and chimeras of DNA and RNA. By "gene sequence" of a particular protein is meant a DNA sequence (without introns) encoding the amino acid sequence of the protein.
  • Olfactory receptors are also G protein coupled receptors that belong to rhodopsin-like receptors as bitter taste receptors. Olfactory receptors are on average about 310 amino acid residues long and share several motif sequences. Particularly characteristic is a motif sequence of MAYDRYVAIC which is present from the third transmembrane site to the fourth intramembrane loop. Among these motif sequences, three amino acid residues of DRY (Asp / Glu, Arg, Tyr) are common to other rhodopsin-like receptors and are considered to be important for G protein activation. The amino acid and gene nucleic acid sequences of many olfactory receptor proteins are known.
  • amino acid sequences and gene sequences of human olfactory receptors are registered in NCBI or GenBank under the accession numbers described in Table 2 below.
  • Class C Metabotropic glutamate receptor / metabolic pheromone receptor Class C is a metabotropic glutamate receptor, a metabolic pheromone receptor, a sweet taste receptor, a umami receptor, a GABA (type B) receptor Including the body, calcium sensing receptors etc.
  • class C means the whole.
  • Class C receptors function as homo- or hetero-dimers and have the largest extracellular domain of about 500 to 600 residues among G protein coupled receptors.
  • the ligand binding domain of the extracellular domain has a structure called the Venus Flytrap module (VFTM) structure.
  • the sweet taste receptor is a class C receptor and functions as a heterodimer of T1R2 / T1R3.
  • N-terminal domain of human T1R2 for acceptance of artificial sweetener aspartame and neotame, transmembrane domain of human T1R3 for acceptance of artificial sweetener cyclamate and sweetness suppressant lactizole, sweetness modifier Neoculin has been reported that the N-terminal domain of human T1R3 is important for each reception. It is reported that the human T1R3 C-rich domain of the sweet protein brazein is important for sensitivity.
  • Umami receptors are receptors belonging to class C and function as heterodimers of T1R1 / T1R3.
  • the umami substances glutamic acid and inosinic acid (IMP) have been shown to bind to the N-terminal domain of T1R1.
  • T1R1, T1R2 and T1R3 constituting the sweet taste receptor and the umami receptor are registered in NCBI under the accession numbers described in Table 3 below.
  • the G protein coupled receptor protein or the subunit thereof may be expressed using the construct of the present invention.
  • a construct that expresses only one type of subunit, T1R2, T1R3 or T1R1 is included, which is a subunit that constitutes a dimeric sweet taste receptor or umami taste receptor.
  • the other subunit constituting the dimer may be cotransfected with another construct.
  • the construct may be constructed such that nucleic acids encoding multiple subunits constituting the G protein coupled receptor protein are contained in a single vector.
  • the construct is constructed such that the nucleic acid encoding at least one subunit is located 3 'of the IRES.
  • Class B Secretin Receptor Family In the secretin receptor family of class B, the extracellular region at the N-terminal side is long to form a ligand binding site. It is divided into two subgroups: secretin-like receptors (in a narrow sense) and Adhesion-type G protein coupled receptors. Secretin-like receptors (in a narrow sense) include receptors that bind to peptide hormones such as secretin, glucagon, glucagon-like peptide (GLP), calcitonin, parathyroid hormone and the like. The adhesion type G protein coupled receptor has various domain structures at a large N-terminal site, suggesting an interaction such as extracellular matrix.
  • secretin-like receptors in a narrow sense
  • Adhesion-type G protein coupled receptors include receptors that bind to peptide hormones such as secretin, glucagon, glucagon-like peptide (GLP), calcitonin, parathyroid hormone and the like.
  • GLP glucagon-like
  • Class F Frizzled, Smoothed Class F G-protein coupled receptors include 10 Frizzled proteins that function in the Wnt signaling pathway and Smoothened, which functions in the hedgehog signaling pathway.
  • the class F receptor has a region consisting of about 120 amino acid residues called extracellular cysteine-rich domain (CRD) outside the cell, and is a binding region of a ligand such as Wnt.
  • CCD extracellular cysteine-rich domain
  • the type of the G protein coupled receptor or the subunit thereof is not particularly limited.
  • the effect of the present invention on at least several types of bitter taste receptor T2R belonging to class A, and subunits T1R2 (constituting sweet taste receptors) and T1R3 (constituting sweet taste receptors and umami taste receptors) belonging to different class C Has been confirmed.
  • the G protein coupled receptor or a subunit thereof is a class of rhodopsin-like receptors (class A) or a class of metabotropic glutamate receptor / metabolic pheromone receptor (Class C) G protein coupled receptor.
  • the G protein coupled receptor is a G protein coupled receptor of the rhodopsin-like receptor class. More preferably, the G protein coupled receptor is a bitter taste receptor.
  • the G protein coupled receptor protein is derived from an animal, more preferably from a mammalian species. Mammals include, for example, humans, rats, monkeys, dogs, pigs, sheep, horses, mice and the like. In one aspect of the invention, the G protein coupled receptor protein is a human G protein coupled receptor protein.
  • G protein (guanidine nucleotide binding protein) is a protein belonging to the group of GTPases, and is generally composed of three subunits of ⁇ , ⁇ , and ⁇ . It refers to heterotrimers.
  • G protein is bound to the inner surface of the cell membrane, and G ⁇ dimer is tightly bound to G ⁇ subunit.
  • G protein bound to G protein coupled receptor separates its own GDP from G ⁇ subunit and binds to a new molecule of GTP (GDP type ⁇ Conversion to GTP type). This conversion separates each of the G ⁇ subunit, the G ⁇ dimer and the G protein coupled receptor. The separated G ⁇ subunit activates its downstream effector protein.
  • the G protein alpha subunit consists of two domains, a GTPase domain and an alpha helical domain. At present, at least 20 types of G ⁇ subunits are known and mainly classified into four families.
  • the type of G protein ⁇ subunit is not particularly limited.
  • the G protein ⁇ subunit protein is, without limitation, G protein ⁇ subunit protein of Gq family, G protein ⁇ subunit protein of Gi family, G protein ⁇ subunit protein of Gs family, Alternatively, these chimeric proteins.
  • the G protein ⁇ subunit protein is G ⁇ 16, G ⁇ gust or G ⁇ olf, or a chimeric protein thereof.
  • the species from which the G protein subunit is derived is not particularly limited. Preferably it is from an animal, more preferably from a mammalian species. Mammals include, for example, humans, rats, monkeys, dogs, pigs, sheep, horses, mice and the like. In one aspect of the invention, the G protein is a human G protein coupled receptor protein.
  • Human G ⁇ 16 is described, for example, in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, p. 5587-5591, 1991, and the sequence of mRNA is registered in GenBank under accession number M63904.1.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of human G ⁇ 16 are also described as SEQ ID NOs: 65 and 66 in the sequence listing of the present application.
  • the gene encoding human G ⁇ 16 can also be obtained, for example, from cultured cells such as HL60 cells.
  • rat Gastducin mRNA The sequence of rat Gastducin mRNA is registered at NCBI under accession number NM_173139.1. The nucleotide sequence and amino acid sequence of rat Gastducin are also described as SEQ ID NOs: 67 and 68 in the sequence listing of the present application.
  • the mRNA sequence of human Gaolf is registered in GenBank under accession number AF493893.1.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of human Gaolf are also described as SEQ ID NOS: 69 and 70 in the sequence listing of the present application.
  • the G protein alpha subunit protein may be a chimeric protein.
  • the chimeric protein may be a fusion protein of different types of G protein ⁇ subunits from the same species, or a fusion protein of the same type of G protein ⁇ subunits from different species, or It may be a fusion protein of different types of G protein ⁇ subunits derived from different biological species.
  • the chimeric protein of G protein ⁇ subunit protein n may differ from the original G protein ⁇ subunit protein in characteristics such as binding specificity to G protein coupled receptor, binding strength or stability.
  • the G protein ⁇ subunit protein is human G ⁇ 16 / rat G ⁇ gust.
  • Human G ⁇ 16 / rat G ⁇ gust is a chimeric protein in which the C-terminal side of human G ⁇ 16 is replaced with the C-terminal sequence of rat G ⁇ gust.
  • a chimeric protein in which the C-terminal side of G ⁇ 16 is replaced with the C-terminal sequence of G ⁇ gust with 37 or more amino acid residues has been reported to respond to bitter taste receptor T2R (The Journal of Neuroscience, 23 (19), p. 7376-7380, 2003).
  • the C-terminal sequence of rat G ⁇ gust that substitutes human G ⁇ 16 is preferably at least 25 amino acid groups or more, 30 amino acid groups or more, 35 amino acid residues or more, 37 amino acid residues or more, 40 amino acid groups or more, 43 amino acid residues or more .
  • the C-terminal sequence of rat G ⁇ gust that substitutes human G ⁇ 16 is preferably 60 amino acid residues or less, 50 amino acid groups or less, 45 amine acid groups or less, and 43 amino acid groups or less.
  • the G protein ⁇ subunit protein is human G ⁇ 16 / rat G ⁇ gust43.
  • 132 bases (corresponding to a sequence encoding 43 amino acids at the C terminus) of the 3 'end of SEQ ID NO: 65 of human G ⁇ 16 correspond to the corresponding sequence of rat Gastducin, It was substituted to 132 bases (corresponding to a sequence encoding 43 amino acids at the C terminus including the termination codon) of the 3 'end of SEQ ID NO: 67 (G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 (G ⁇ )).
  • IRES The construct of the present invention comprises the downstream (3 'side) of the nucleic acid encoding the G protein ⁇ subunit protein and the upstream of the nucleic acid encoding the G protein coupled receptor protein or a subunit thereof in a single vector At the side) contains a nucleic acid comprising an IRES sequence.
  • IRES is an abbreviation of Internal ribosome entry site (an internal ribosome entry site), and is an RNA factor that enables cap-independent translation initiation in order to further increase the efficiency of protein synthesis.
  • IRESs are present in the 5'UTR (5 'untranslated region) of RNA viruses, it has been suggested that IRESs are also present in cellular mRNAs of mammalian cells.
  • Viral IRESs discovered to date are roughly divided into five classes (Journal of Virology, Vol. 86, No. 3, p. 1468-1486, 2012).
  • the first class is the dicistrovirus IRES group.
  • the second class includes the hepatitis C virus (HCV) and the IRES of viruses of the pestivirus genus, as well as the IRES of a number of structurally similar viruses.
  • HCV hepatitis C virus
  • IRES IRES-like RES
  • type 1 to type 3 three classes of IRES, known as type 1 to type 3. These are all identical in the 5 'UTR of the Picornaviridae family.
  • type 2 is mainly an IRES found in the genus Aphthovirus, Cardiovirus, and Parechovirus. Furthermore, divergent members also exist in the genus Erbovirus and genus Cosavirus. Cardiovirus genus (Cardiovirus) includes encephalomyocarditis virus (Encephalomyocarditis virus) (EMCV) and tylovirus (Theilovirus). Type 2 IRESs are about 450 bases in length, 3'-terminal Yn-Xm-AUG (Yn is a pyrimidine tract, n is an integer of 8-10, and m is 18-20. There is a case in which the AUG triplet is the initiation codon.
  • Type 2 IRESs contain five major domains: H, I, J, K and L.
  • Type 2 IRESs function without involvement of eukaryotic translation initiation factor IF4E and factors involved in ribosomal scanning, such as eIF1 and eIF1A.
  • IRES transactivators ITAF is a cellular RNA binding protein such as pyrimidine tract binding protein (PTB).
  • Type 1 IRESs are those found only in the Enterovirus genus. Type 1 IRESs contain five major domains of II-VI. Type 2 IRESs are approximately 450 bases in length and, like type 2, have a 3'-terminal Yn-Xm-AUG motif. However, in the type 1 IRES this motif is separated from the start codon by a non-conserved spacer. Type 3 is an IRES found only in hepatitis A virus.
  • the cellular IRES is described, for example, in GENES & DEVELOPMENT, Vol, 15, p. 1593-1612, 2001.
  • the type of IRES is not particularly limited.
  • the IRES is a viral IRES.
  • the IRES sequence is a type 2 IRES sequence, eg an IRES sequence from encephalomyocarditis virus.
  • the nucleic acid sequence of the IRES derived from encephalomyocarditis virus is registered in GenBank under Accession No. M81861.1.
  • the IRES sequence used in the examples of the present specification is SEQ ID NO: 71, which is partially modified from the sequence of GenBank Accession No. M81861.1, to mimic the IRES site of the pIRES2-EGFP vector (Clontech). There is. Specifically, in SEQ ID NO: 71, G is added to base number 1 and A is added to base number 512.
  • the construct of the present invention is a nucleic acid encoding a G protein-coupled receptor protein or its subunit
  • a nucleic acid encoding a polypeptide having a function of enhancing transfer of the G protein coupled receptor protein or its subunit to the cell membrane is included.
  • a fusion protein in which such a polypeptide is bound is expressed on the N′-terminal side of the G protein-coupled receptor protein or its subunit. Therefore, in cells transformed with the construct, transfer of the G protein-coupled receptor protein or its subunit to the cell membrane is improved. Transformed cells in which more G protein coupled receptors are translocated to the cell membrane are made more accessible by the method of measuring the physiological response of the substance.
  • the type of polypeptide having the function of enhancing the transfer of the G protein-coupled receptor protein or its subunit to the cell membrane is “the transfer of the G protein coupled receptor protein or its subunit to the cell membrane is enhanced” It is not particularly limited as long as it has a function.
  • the phrase “enhance the transfer of the G protein coupled receptor protein or its subunit to the cell membrane” means that when the polypeptide is bound to the N-terminal side of the G protein coupled receptor protein or its subunit, it is not bound Compared to the case, this means that the rate at which the expressed G protein-coupled receptor protein or a subunit thereof translocates from the nucleus of the transformed cell to the cell membrane is (significantly) increased.
  • the polypeptide that enhances the translocation of the G protein-coupled receptor protein or its subunit to the cell membrane includes, but is not limited to, a polypeptide comprising all or part of rat somatostatin receptor, all or part of bovine rhodopsin Containing polypeptides (Archives of Phisiology and Biochemistry Vol. 110 p. 137-45, 2002; Nature Genetics, Vol. 32, p. 397-401, 2002; Cell, Vol. 100, p. 703-711, 2000 ).
  • a polypeptide that enhances the translocation of a G protein coupled receptor protein or subunit thereof to the cell membrane is a polypeptide comprising the N-terminal 45 amino acids of rat somatostatin receptor, N-terminal 39 of bovine rhodopsin. It is a polypeptide comprising an amino acid or a polypeptide comprising the N-terminal 21 amino acids of human rhodopsin.
  • the sequence of the rat somatostatin receptor mRNA is registered at NCBI under accession number NM_ 133522.1.
  • the nucleotide and amino acid sequences of rat somatostatin receptor are also described as SEQ ID NOs: 72 and 73 in the sequence listing of the present application.
  • 135 bases at the 5 'end of SEQ ID NO: 72 were linked to the 5' side of the nucleotide sequence encoding the G protein coupled receptor.
  • the sequence of human rhodopsin mRNA is registered at NCBI under accession number NM_000539.1.
  • the nucleotide and amino acid sequences of human rhodopsin are also described as SEQ ID NOs: 74 and 75 in the sequence listing of the present application.
  • the construct of the present invention comprises a nucleic acid encoding a G protein ⁇ subunit protein, a nucleic acid containing an IRES sequence, and a nucleic acid encoding a G protein coupled receptor protein or a subunit thereof in a single vector Including in order from the 5 'side.
  • the nucleic acid encoding the G protein ⁇ subunit protein, the nucleic acid containing the IRES sequence, the nucleic acid encoding the G protein coupled receptor protein or the subunit thereof be arranged in order from the 5 'side . It is a conventional theory that the protein encoded by the nucleic acid at the 3 'side of IRES is not high in expression level.
  • the present inventors conceived the present invention based on the discovery that, in the case of the G protein-coupled receptor protein or its subunit, the expression level is enhanced by arranging it on the 3 'side of the 5' side of the IRES.
  • the G protein-coupled receptor encodes one of the subunits constituting the dimer.
  • the nucleic acids may be included in a single vector along with the IRES, a nucleic acid encoding a G protein alpha subunit protein, as described above.
  • the nucleic acid encoding the other subunit may be contained in another vector and cotransfected with the above vector.
  • the type of vector is not particularly limited as long as it is an expression vector capable of expressing a protein in a desired cell.
  • Nonlimiting examples include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, viral vectors and the like. Those skilled in the art can appropriately select a vector depending on the type of cell in which the protein is expressed.
  • the vector is a plasmid vector.
  • the plasmid vector includes, for example, pFRT / lacZeo, pUC12, pUC13, pUC19, pBR322, pBR325, pSH15, pSH19, pUB110, pC194 and the like.
  • Thermo Fisher Scientific pcDNATM series (pcDNA3 and pcDNA5 can be used as expression vectors in mammalian cells.
  • expression vectors in mammalian cells may also use pEAK10 (Edge biosystem). it can.
  • the vector of the present invention preferably comprises a promoter.
  • the type of promoter is not particularly limited, and includes, for example, human cytomegalovirus-derived promoter (CMV promoter), EF1 ⁇ promoter and the like.
  • the vector is a plasmid vector containing a CMV promoter or a plasmid vector containing an EF1 ⁇ promoter.
  • the vector of the present invention preferably contains a selection marker for selecting transformed cells.
  • the type of selectable marker is not particularly limited, and includes known promoters such as drug resistance genes and fluorescent protein genes. By including a selection marker, it becomes possible to select cell lines that stably express the protein.
  • the selectable marker is a drug resistance gene.
  • Drug resistant genes include, but are not limited to, hygromycin resistant gene, puromycin resistant gene, neomycin resistant gene, blasticidin resistant gene and the like.
  • the vector is a plasmid vector comprising a CMV promoter and a hygromycin resistance gene.
  • a plasmid vector comprising a CMV promoter and a hygromycin resistance gene.
  • An example of such a vector is the pcDNA3.1 Hygro (+) vector (Thermo Fisher Scientific) used in the examples herein.
  • the vector is a plasmid vector containing an EF1 ⁇ promoter and a puromycin resistance gene.
  • a plasmid vector containing an EF1 ⁇ promoter and a puromycin resistance gene.
  • An example of such a vector is pEAK10 (Edge biosystem).
  • SEQ ID NOS: 80 and 81 The sequences of pcDNA3.1 Hygro (+) vector and pEAK10 vector used in the examples of the present specification are shown as SEQ ID NOS: 80 and 81, respectively, in the sequence listing of the present application.
  • Bases 895 to 942 of SEQ ID NO: 80 are a multiple cloning site (MCS) into which a target gene is inserted.
  • Nucleotides 1922 to 2823 in SEQ ID NO: 81 correspond to the EF-1 ⁇ promoter sequence, 2843 to 2845 to the site where the target gene is inserted, and 2293 to 3892 correspond to the puromycin resistance gene sequence.
  • the present invention also relates to a transformed cell into which the construct of the present invention has been introduced.
  • the type of host cell for producing a transformed cell by gene transfer of the construct of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell that can be transformed by introducing an exogenous nucleic acid by gene transfer.
  • the cells are selected from the group consisting of animal cells, insect cells, plant cells, yeast and bacteria.
  • the origin of animal cells is not particularly limited.
  • Vertebrate phyla include anthracnose and anopharyngeal supramaxillary, and umnnopharyngeal includes amammal, avian, amphibian, helminth and the like.
  • cells derived from an animal belonging to the class of mammals generally referred to as mammals. Mammals are preferably, but not limited to, mice, rats, humans, monkeys, pigs, dogs, sheep, goats and the like.
  • Mammalian-derived cells include “cell lines”, which are cultured cells maintained outside the body for a long period of time to have certain stable properties, and capable of semi-permanent passage.
  • PC12 cells derived from rat adrenal medulla
  • CHO cells derived from Chinese hamster ovary
  • HEK293 cells derived from human fetal kidney
  • HL-60 cells derived from human white blood cells
  • HeLa cells derived from human cervical cancer
  • cell lines derived from various tissues of various species including humans such as Vero cells (derived from African green monkey kidney epithelial cells), MDCK cells (derived from canine kidney tubular epithelial cells) and HepG2 cells (derived from human liver cancer).
  • Vero cells derived from African green monkey kidney epithelial cells
  • MDCK cells derived from canine kidney tubular epithelial cells
  • HepG2 cells derived from human liver cancer.
  • the origin of the plant cell in the present specification is not particularly limited.
  • the cells of plants including moss plants, ferns, and seed plants are targeted. Plants from which seed plant cells are derived include both monocotyledonous and dicotyledonous plants.
  • the origin of the insect cell in the present specification is also not particularly limited.
  • the types of archaebacteria and bacteria in the present specification are also not particularly limited.
  • eukaryotic cells such as HEK 293 cells, CHO cells, 32D cells, HeLa cells, COS cells, BHK cells and the like can be used as host cells for producing the transformed cells of the present invention.
  • the host cell is a HEK 293 cell.
  • the method for gene transfer (transformation) of host cells using the construct of the present invention is not particularly limited. Methods suitable for gene transfer of nucleic acid into animal cells, plant cells, and bacteria are each known methods (eg, MOLECULAR CLONING: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Michael R Green and Joseph Sambrook, 2012, (Cold) Spring Harbor Laboratory Press)). Those skilled in the art can use appropriate gene transfer methods as appropriate depending on the type of vector, type of cell, and the like. For example, in the case of non-viral vectors such as plasmid vectors, gene transfer methods such as lipofection method, electroporation method and microinjection method are known.
  • the transformed cell may be a cell (stable expression strain) stably expressing the G protein-coupled receptor protein or a subunit thereof or a cell transiently expressing (transient expressing cell) May be
  • the “stable expression strain” is, for example, confirmed by the selection marker that the nucleic acid contained in the construct has been stably incorporated into the genome of the host cell by gene transfer, and thus, the G protein coupled receptor protein or its subunit is stabilized. Refers to cell lines that are expressed.
  • the "transiently expressing cell” is not confirmed to stably integrate the nucleic acid contained in the construct into the genome of the host cell, and stably expressing the G protein coupled receptor protein or a subunit thereof Means a cell that can not be confirmed.
  • the transformed cell of the present invention has an increased expression level of the G protein coupled receptor protein or a subunit thereof, and / or an increased responsiveness to a ligand substance of the G protein coupled receptor protein or a subunit thereof It has the feature that it does.
  • the expression level of the G protein coupled receptor protein or its subunit is increased refers to the expression of the G protein coupled receptor protein or its subunit as compared with the case where the G protein coupled receptor protein or its subunit is expressed using conventional techniques. It means that the amount is rising.
  • the responsiveness of the G protein coupled receptor protein or its subunit to the ligand substance is increased means that the G protein coupled receptor protein or its subunit was expressed using the prior art prior to the present invention Compared to the case, it means that the response to the ligand substance is increased.
  • Co-gene transfer (1a) A host cell is cotransfected with a vector containing a nucleic acid encoding a G ⁇ protein and a vector containing a nucleic acid encoding a G protein coupled receptor protein or a subunit thereof; (1 b) A cell line in which G ⁇ protein is stably expressed is transformed with a vector containing a nucleic acid encoding a G protein coupled receptor protein or a subunit thereof.
  • a promoter-G protein coupled receptor protein or a nucleic acid encoding a subunit thereof is transformed with a single vector containing a nucleic acid encoding an IRES-G ⁇ protein.
  • the transformed cell of the present invention is superior in stability to the case where a G protein coupled receptor protein or a subunit thereof is expressed using conventional techniques.
  • the stability includes the stability in culture conditions of normal cells and the stability in storage conditions such as cryopreservation.
  • cryopreservation Even when stored for about 1 month in cryopreservation, the response strength to the ligand was hardly reduced to 0.8 or more as compared with that before cryopreservation.
  • double gene transfer double stable
  • the response strength to the ligand decreased to less than 0.6 relative to each other during freezing.
  • the invention further relates to a method of measuring the physiological response of a substance.
  • the measuring method of the present invention comprises the steps of adding a substance to the transformed cell of the present invention and measuring the physiological response of the substance.
  • the “substance” is not particularly limited as long as it is a substance that can bind to a G protein coupled receptor and become an agonist. Substances cause structural change in G protein-coupled receptors, activate G proteins bound to the inside of the membrane to perform signal transduction, and include chemicals, odor molecules, and the like contained in foods and beverages. Includes neurotransmitters, hormones, etc. The signal causes a physiological response in intracellular signal networks such as olfactory sensation, taste, vision, neurotransmission, metabolism, cell differentiation and cell proliferation, inflammatory response and immune response. Substances differ depending on the type of G protein coupled receptor.
  • the substance is a bitter-tasting substance, an odorant, a umami substance or a sweetening substance, or a modulator to these substances.
  • bitter substance is not particularly limited as long as it is a substance that can sense bitter taste in humans.
  • a high acid denatonium acid strykinine, ⁇ -glucopyranoside (salicin), aristoric acid, a bitter taste substance having an isothiocyanate group (eg, phenylthiocarbamide (PTC), propylthiouracil (PROP)), diphenidol, quinine , Abscincin and denatonium.
  • PTC phenylthiocarbamide
  • PROP propylthiouracil
  • the "odorant substance” is a low molecular weight compound having a molecular weight of about 30 to about 300.
  • the basic skeleton of serotonin which is a brain hormone
  • indole a substance with a fecal odor
  • dopamine and adrenalin resembles vanillin, which is the odor of vanilla.
  • Any substance of low molecular weight organic compound having the property of volatility can be an odor substance. Odors are emitted from various foods, plants and animals, and it is said that about 10,000 types of human beings who are said to have deteriorated sense of smell can be identified.
  • odor substance As an example of “odor substance”, muscone which is a main component of musk (mush) odor, shibeton which is a main component of spirit cat incense (shibette) incense, and violet flower as specific examples of “odor substance” Examples thereof include ⁇ -ionone which exudes a scent, ⁇ -terpineol which is the main component of the flower scent of Lila, ( ⁇ ) 5R-carvone which produces a scent of spearmint, and further, methylamine, dimethylamine and trimethylamine which cause fish odor.
  • Umami substance is not particularly limited as long as it is a substance that can be detected by humans, for example.
  • glutamic acid and inosinic acid (IMP) are examples of glutamic acid and inosinic acid (IMP).
  • the “sweetening substance” is not particularly limited as long as it is, for example, a substance that can detect sweetness by humans.
  • cyclamate cyclamate
  • Ritemu neotame
  • perillartine monellin
  • curculin registered trademark; ADEKA
  • bittering substances, odorants, umami substances or modulators of sweetening substances alone does not produce bitter taste, smell, umami or sweetness, but is accepted together with bitter substances, odorants, umami substances or sweetening substances Thus, the taste and smell of each substance are enhanced, modified or suppressed.
  • a modulator of a bitter taste substance includes Benecort BMI (Kao), broveneside and the like.
  • the "odorants” include 2.4.6-trichloroanisole, geraniol and the like which are olfactory inhibitors.
  • the “sweetener modulators” include the sweetness suppressant lactizole, the sweetness suppressant gymnemic acid, the sweetness modifier neocurin and the like.
  • a predetermined number of the transformed cells of the present invention is plated on each well of a microplate having a large number of wells (24 wells, 48 wells, 96 wells, 384 wells, etc.) (eg, 10,000 to 500,000 cells / well),
  • the cells are cultured in a predetermined medium (eg, DMEM medium).
  • a predetermined medium eg, DMEM medium.
  • the physiological response generated in the stable culture cell line is measured, and the physiological response of the substance is evaluated based on the measurement result.
  • events that change with activation of the G protein coupled receptor are appropriately selected depending on the type of substance.
  • a taste receptor such as a bitter taste receptor, a sweet taste receptor, and a umami receptor
  • IP3 intracellular second messengers
  • DAG intracellular calcium concentration
  • physiological responses to be measured include changes in intracellular second messengers, changes in intracellular calcium concentration, and the like, which change with activation of taste receptors.
  • it is possible to measure the physiological response by measuring changes in intracellular second messenger or calcium concentration.
  • the calcium imaging method can be performed by observing a change in intracellular calcium concentration caused by taste stimulation such as bitter taste, sweet taste or umami taste by using a fluorescent calcium indicator.
  • a fluorescent calcium indicator is required to have a change in fluorescence characteristics at a calcium concentration that can be physiologically changed, and a calcium-specific induction of the change at that time.
  • fluorescent calcium indicators examples include Fluo-8 (registered trademark) (AAT Bioquest) (excitation wavelength 490 nm, fluorescence wavelength 514 nm), Fluo-4 AM ((AAT Bioquest)) (excitation wavelength 490 nm, fluorescence wavelength 525 nm), Fura 2 AM (Thermo Fisher Inc.) (excitation wavelength 340 nm, fluorescence wavelength 380 nm) is included.
  • a method of measuring the change in intracellular cAMP concentration caused by the olfactory stimulus of the odorant is used for measuring the physiological response of the odorant.
  • a method of measuring intracellular cAMP a fluorescence polarization immunoassay or competitive type immunoassay using cAMP labeled with an enzyme such as fluorescent or HRP and an anti-cAMP antibody, or luciferase inserted downstream of a cAMP response element (CRE) Methods such as gene transfer of a vector and measurement by luciferase assay can be mentioned.
  • the invention comprises the use of the transformed cells according to the invention for measuring the physiological response of a substance.
  • the present invention includes a nucleic acid encoding a G protein ⁇ subunit protein and a nucleic acid encoding a G protein coupled receptor protein or a subunit thereof in a single vector. Therefore, it is presumed that the expression levels of the G protein ⁇ subunit protein and the G protein coupled receptor protein in the transformed cell are positively correlated.
  • the responsiveness of the G protein coupled receptor to the G protein coupled receptor agonist and the response strength to the G alpha agonist show a high positive correlation (Example 7, FIG. 8). Therefore, it is also possible to estimate the physiological response strength to the substance by measuring the response strength of the G protein ⁇ subunit to the G ⁇ agonist in the transformed cells to which the substance (G protein coupled receptor agonist) is added. is there.
  • kits for use in a method of measuring a physiological response of a substance The present invention further provides a substance, which comprises the transformed cell of the present invention, adds a substance to the transformed cell, and measures a physiological response by the substance.
  • the present invention relates to a kit for use in a method of measuring a physiological response of
  • the kit of the present invention may contain, in addition to the transformed cells of the present invention, materials necessary for use in the method of measuring a physiological response of a substance, instructions for use, and the like.
  • the materials necessary for use in the method of measuring the physiological response of a substance include, for example, the medium for maintaining and culturing transformed cells, the concentration of second messengers or calcium produced by the physiological response of the substance Reagents (eg, a fluorescent calcium indicator for measuring calcium concentration etc.) and the like.
  • the present invention relates to an apparatus for use in a method of measuring a physiological response of a substance, which comprises the transformed cell, which adds the substance to the transformed cell and measures a physiological response by the substance.
  • the device of the present invention includes the kit of the present invention, a second messenger produced by the physiological response of the substance, or a device for measuring the concentration of calcium.
  • a device for measuring a physiological response to a taste substance such as a bitter taste substance, an odorant substance, a umami substance or a sweet taste substance, or a modulator to these substances
  • a taste substance such as a bitter taste substance, an odorant substance, a umami substance or a sweet taste substance, or a modulator to these substances
  • Intelligent Sensor Technology Inc. Has developed an “artificial lipid membrane taste sensor” (http://www.insent.co.jp/products/taste#sensor#index.html).
  • This taste sensor is a computer that detects, as a sensor output, displacement of the membrane potential of the artificial lipid membrane due to electrostatic interaction or hydrophobic interaction with various taste substances.
  • Intelligent Sensor Technology Inc. More taste recognition devices TS-5000Z are sold.
  • the device of the present invention utilizes the transformed cell of the present invention instead of the artificial lipid membrane in such a sensor.
  • the transformed cell of the present invention is replaced with an artificial membrane, fixed to a device, the substance is allowed to act, and the physiological response of the substance is measured by measuring changes in intracellular second messenger or calcium concentration. taking measurement.
  • the device of the present invention can be used for repeated measurements by removing the test substance by washing or the like after use.
  • Example 1 Construction and Production Method of Construct
  • the construct of the present invention comprises a nucleic acid encoding the G protein ⁇ subunit protein, a nucleic acid containing an IRES sequence, and a nucleic acid encoding a G protein coupled receptor protein in order from the 5 'side in a single vector.
  • T2R16 Human bitter taste receptor (T2R16) expression gene (ssr / T2R16 / V5) with the gene sequence of the 135th base from the start codon of rat somatostatin receptor 3 (ssr3) at the 5 'end and the V5 epitope sequence added at the 3' end )
  • the V5 epitope sequence is an antibody recognition tag for examining the protein expression level of T2R (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 76); -IRES derived from encephalomyocarditis virus (Encephalomyocarditis virus); and-G ⁇ 16 / gust expression gene (G ⁇ 16) in which the terminal 129 bases of human G protein ⁇ subunit G16 are replaced with the terminal 129 bases of rat gustducin (Ggust) / G ⁇ gust 43) (SEQ ID NO: 77).
  • the obtained gene fragment was inserted into the multiple cloning site of pcDNA3.1 Hygro (+) vector (Thermo Fisher Scientific) using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech).
  • the insertion order is as follows.
  • Vectors of the Invention G ⁇ -T2R16 G ⁇ 16 / G ⁇ gust43-IRES-ssr / T2R16 / V5
  • Vector of Comparative Example T2R16-G ⁇ ssr / T2R16 / V5-IRES-G ⁇ 16 / G ⁇ gust43
  • the construction of each vector is shown in FIG.
  • Example 2 Preparation of a Stable Expression Strain Containing the Construct of the Present Invention
  • a cell line (T2R16 stable expression strain) stably expressing the bitter taste receptor T2R16 is constructed by incorporating the construct (G ⁇ -T2R16) of the present invention. did.
  • Example 2 5 ⁇ g of each of the G ⁇ -T2R16 and T2R16-G ⁇ plasmid vectors prepared in Example 1 was added to Lipofectamine in a human embryonic kidney cell line HEK293T (obtained from RIKEN) in which 1 ⁇ 10 6 cells were seeded in a culture vessel.
  • the gene was introduced using (registered trademark) 3000 (Thermo Fisher Scientific).
  • drug resistance screening was performed by adding 100 ⁇ g / mL hygromycin B to the medium and culturing for about 15 days. Cells that acquired drug resistance were cloned by seeding each well of the 96-well plate one by one. After culturing for about 10 days, a stable expression strain was obtained.
  • Example 3 Response Measurement of Stable Expression Strain to Bitter Taste Substance
  • (1) Response Measurement of G ⁇ -T2R16 Stable Expression Strain the response to the bitter taste substance of the T2R16 stable expression strain of Example 2 was measured.
  • T2R16 stable expression strains prepared based on the method described in Example 2 were each seeded at 2 ⁇ 10 4 cells / well in a 96-well plate.
  • the culture medium for cells contained the green fluorescent calcium indicator Fluo-8 (registered trademark) (AAT Bioquest), and the uptake of Fluo-8 into the cell line was examined.
  • Fluo-8® is suitable for detection of intracellular calcium dynamics and is an indicator of GPCR activity.
  • G ⁇ -T2R40 stable expression strain including G ⁇ 16 / G ⁇ gust43-IRES-ssr / T2R40 / V5
  • G ⁇ -T2R43 stable expression strain G ⁇ 16 in the same manner as the methods described in Example 1 and Example 2.
  • G ⁇ gust 43-IRES-ssr / T 2 R 43 / V 5 was produced.
  • a G ⁇ -T2R40 stable expression strain and a G ⁇ -T2R43 stable expression strain were produced using a method similar to the method described in Example 2.
  • Each agonist (T2R40: diphenidol, T2R43: quinine) was allowed to act on these cell lines at 100 ⁇ M or 300 ⁇ M, and the maximum value of fluorescence intensity at 40 seconds after addition was obtained.
  • the increase rate of the maximum value of the fluorescence intensity to the fluorescence intensity at the start of measurement was calculated as the response intensity of T2R40 and T2R43 for the agonist.
  • the results are shown in FIG. As compared with T2R40-G ⁇ and T2R43-G ⁇ , G ⁇ -T2R40 and G ⁇ -T2R43 showed higher response strength to each agonist.
  • Example 4 Measurement of Response of Transiently Expressing Cells to Bitter Taste Substance HEK293T seeded at 2 ⁇ 10 4 in a 96-well plate, 0.1 ⁇ g of each plasmid vector of G ⁇ -T2R16 and T2R16-G ⁇ , Lipofectamine® 3000 It was used for gene transfer. After 30 hours of culture, the response intensity to salicin was measured using the same procedure as in Example 3 (1) (maximum fluorescence intensity at 40 seconds after the addition of salicin). The drug resistance screening with hygromycin B as in Example 2 was not conducted (transiently expressing cells).
  • the following cells were also prepared, and the response to salicin was measured.
  • the G ⁇ 16 / G ⁇ gust43gust expression vector and the ssr-T2R16-V5 expression vector were simultaneously transfected with a total of 0.1 ⁇ g of the G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 expression gene and the ssr-T2R16-V5 expression gene in which the G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 expression gene and the ssr-T2R16-V5 expression gene were respectively integrated Over-expressed cells (cotransfection); and G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 stable expression strain (drug resistance screened with hygromycin B) prepared using the same procedure as in Example 2; 0.1 ⁇ g of ssr-T2R16 -A cell (G ⁇ stable) into which a V5 expression vector has been introduced and transiently expressed.
  • G.alpha.-T2R16 also shows higher response intensity than T.sub.2R.sub.16-G.alpha.
  • the previously reported transient expression system cotransfection and G.alpha. Stable. It has been confirmed that it exhibits a high response strength as compared with.
  • Example 5 Expression Levels of G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 and Bitter Taste Receptor T2R16
  • IRES-mediated translation of mRNA is considered to be less efficient compared to cap-dependent translation from the 5 'end.
  • the expression levels of G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 and bitter taste receptor T2R16 were examined for cap-dependent translation and IRES-dependent translation.
  • the response strength to isoproterenol is considered to be proportional to the expression level of G ⁇ 16.
  • the expression level of T2R16-G ⁇ translated by IRES is lower in G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 compared to G ⁇ -T2R16 co-transfection that is translated in a cap-dependent manner.
  • the expression level of G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 was shown to be cap-dependent> IRES-dependent.
  • T2R16-G ⁇ , G ⁇ -T2R16 (the present invention) and ssr-T2R16-V5 only (T2R16 single) transiently expressed cells the expression level of T2R16 was measured by In cell ELISA method Compared.
  • In cell ELISA In Cell ELISA Kit (BOO Bioscientific) was used, and for detection of T2R16, an anti-V5-HRP antibody (Thermo Fisher Scientific) that recognizes V5 epitope added to the C-terminus was used.
  • the relative expression level of T2R16 was obtained by measuring the color development of the HRP substrate by measuring the absorbance at 450 nm.
  • G ⁇ -T2R16 of the present invention causes both G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 (and G ⁇ 16) and T2R16 to be highly expressed. Furthermore, similar results were observed for subtypes (T2R40 and T2R43) other than the bitter taste receptor T2R16 (data not shown).
  • Example 6 Storage Stability of G ⁇ -T2R16 Stable Expression Strain
  • response strengths before and after freezing storage of the G ⁇ -T2R16 stable expression strain were examined.
  • G ⁇ -T2R16 of this example was prepared in the same manner as the G ⁇ -T2R16 stable expression strain of Example 2. However, instead of “ssr / T2R16 / V5”, pEAK10 (Edge biosystem) is used as an expression vector. "Ssr / T2R16" (without V5) was inserted. Also, drug resistance screening was performed with 1 ⁇ g / mL of puromycin instead of hygromycin B.
  • ssr-T2R16 expression vector is transfected into a G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 stable expression strain (prevented by drug resistance screening with puromycin) prepared using the same method as in Example 2, and then puromycin A stable expression cell line (Double stable) of G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 stable expression + T2R16 stable expression, which was created by performing drug resistance screening using
  • Example 7 Response strength to T2R40 agonist of G ⁇ -T2R40 stable expression strain and response strength to G ⁇ agonist
  • response strength to T2R40 agonist diphenidol
  • G ⁇ to the G ⁇ -T2R40 stable expression strain of the present invention The correlation of the response strength to the agonist (isoproterenol) was examined.
  • Example 3 (2) a G ⁇ -T2R40 stable expression strain was produced using the method similar to the method described in Example 1 and Example 2, and 15 clones were cloned.
  • the correlation of responses to isoproterenol (10 ⁇ M) and difenidol (300 ⁇ M) for 15 clones is shown in FIG. As a result, a high correlation was obtained between the response to T2R40 agonist difenidol and G ⁇ 16 agonist isoproterenol.
  • a desired cell line that expresses both G ⁇ subunit and T2R proteins can be obtained by only one evaluation of either T2R or G ⁇ subunit proteins.
  • genes expressing G.alpha. Subunit and T.sub.2R proteins are sequentially introduced into cells, and the screening is advanced while evaluating whether or not each protein is stably expressed each time. I needed it. Specifically, after a G ⁇ stable expression strain is produced and screened (evaluation 1), a gene encoding a T2R protein is introduced to maintain (high) expression of G ⁇ protein (evaluation 2), and also a T2R protein ( High) Expressing (Evaluation 3) Obtain a cell line. Thus, three evaluations are required to obtain the desired cell line.
  • the working efficiency for obtaining a G ⁇ -T2R40 stable expression strain is remarkably improved.
  • Example 8 IRES-mediated expression system of sweet taste receptor T1R2 / T1R3 1: Investigation of T1R2 Sweet taste receptor is a metabotropic glutamate receptor / metabolic pheromone receptor consisting of a combination of two subunits of T1R2 and T1R3 Class of G protein coupled receptors. In this example, IRES-mediated expression system T1R2 of sweet taste receptor T1R2 / T1R3 was examined.
  • T1R2 A cell line (G ⁇ -T1R2 + T1R3) co-transfected with G ⁇ -T1R2 and T1R3 by a method similar to the method described in Example 4 was obtained.
  • T1R2-G ⁇ and T1R3 were co-transfected to obtain a transiently expressed cell line (T1R2-G ⁇ + T1R3).
  • T1R2 The expression level of T1R2 was examined by In cell ELISA using an In Cell ELISA Kit (BOO Bioscientific) by the same method as in Example 5 (2). The results are shown in FIG. The expression level of T1R2 showed a tendency that “G ⁇ -T1R2 + T1R3” was higher than “T1R2-G ⁇ + T1R3”. As in the bitter taste receptor (T2R), cap-dependent ⁇ IRES-dependent.
  • T1R2 agonist The response to T1R2 agonist was examined for “G ⁇ -T1R2 + T1R3” and “T1R2-G ⁇ + T1R3”. Aspartame (10 mM) was added and the maximum value of fluorescence intensity at 40 seconds after addition was obtained. The increase rate of the maximum value of the fluorescence intensity to the fluorescence intensity at the start of measurement was calculated as the response intensity of T1R2 to the agonist.
  • T1R2-G ⁇ + T1R3 As a comparative example, “T1R2-G ⁇ + T1R3”, as well as “cells cotransfected with three types of vectors each containing a gene encoding each of T1R2, T1R3 and G ⁇ 16 / G ⁇ gust43 proteins (T1R2 + T1R3 + G ⁇ )”, and “T1R2 A cell (T1R2-G ⁇ + T1R3-G ⁇ ) co-transfected with -G ⁇ and T1R3-G ⁇ was used. As shown in FIG. 11, “G ⁇ -T1R2 + T1R3” showed the highest response to the T1R2 agonist.
  • Example 9 IRES-Mediated Expression System of Sweetness Receptor T1R2 / T1R3 2: Examination of T1R3
  • T1R3 of the expression system mediated by IRES of the sweetness receptor T1R2 / T1R3 was examined.
  • T1R3 A cell line (G ⁇ -T1R3 + T1R2) co-transfected with G ⁇ -T1R3 and T1R2 by a method similar to the method described in Example 4 was obtained.
  • T1R3-G ⁇ and T1R2 were co-transfected, and a transiently expressed cell line (T1R3-G ⁇ + T1R2) was obtained.
  • T1R3 The amount of expression of T1R3 was examined by In cell ELISA using an In Cell ELISA Kit (BOO Bioscientific) by the same method as in Example 5 (2). The results are shown in FIG. The expression level of T1R3 was larger in "G ⁇ -T1R3 + T1R2" than in "T1R3-G ⁇ + T1R2". The expression level of T1R3 was cap-dependent ⁇ IRES-dependent.
  • T1R3 agonist The response to T1R3 agonist was examined for “G ⁇ -T1R3 + T1R2” and “T1R3-G ⁇ + T1R2”. Cyclamate (10 mM) was added, and the maximum value of fluorescence intensity at 40 seconds after addition was obtained. The increase rate of the maximum value of the fluorescence intensity to the fluorescence intensity at the start of measurement was calculated as the response intensity of T1R3 to the agonist.
  • T1R3-G ⁇ + T1R2 a cell cotransfected with three types of vectors each containing a gene encoding each protein of T1R2, T1R3 and G ⁇ 16 / G ⁇ gust43”, and “T1R2-G ⁇ and A cell in which T1R3-G ⁇ was differentially infected was used.
  • T1R3-G ⁇ + T1R2 a cell cotransfected with three types of vectors each containing a gene encoding each protein of T1R2, T1R3 and G ⁇ 16 / G ⁇ gust43
  • T1R2-G ⁇ and A cell in which T1R3-G ⁇ was differentially infected was used.
  • G ⁇ -T1R3 + T1R2 showed the highest response to the T1R3 agonist.
  • Example 10 Expression of Protein via IRES
  • proteins other than GPCR proteins were expressed upstream and downstream of IRES.
  • EmGFP green fluorescent protein
  • base sequence: SEQ ID NO: 78 GenBank Accession No. EU056363.1
  • amino acid sequence: SEQ ID NO: 79 was used as the protein.
  • a construct containing the following nucleic acid sequence of A to D in a pcDNA vector was prepared, introduced into cell line HEK293T, and transiently expressed.
  • ssr-EmGFP-IRES-G ⁇ B EmGFP-IRES-G ⁇ C: G ⁇ -IRES-ssr-EmGFP D: G ⁇ -IRES-EmGFP Control: pcDNA vector without insert gene
  • EmGFP EmGFP
  • Example 11 T2R16 Expression in Cells Transiently Expressed pEAK10-T2R16-G ⁇ and pEAK10-G ⁇ -T2R16
  • pEAK10-IRES-T2R16-G ⁇ and pEAK10-G ⁇ -IRES-T2R16 were introduced, and The amount of T2R16 expression in transiently expressed HEL293T cells was examined.
  • IRS IGF-IRES
  • the gene sequences encoding T2R16-IRES-G ⁇ and G ⁇ -IRES-T2R16 were subcloned into pEAK10 vector (Edge Biosystem) to construct expression vectors pEAK10-T2R16-G ⁇ and pEAK10-G ⁇ -T2R16.
  • the pEAK10 vector is a plasmid vector containing the EF1 ⁇ promoter and the puromycin resistance gene.
  • the prepared expression vector was introduced into HEK293T cells by the same method as in Example 4 to prepare cells in which these were transiently expressed.
  • T2R16 expression in transiently expressed cells was evaluated by In cell ELISA using the same method as in Example 5 (2).
  • HEK293T cells into which a pEAK expression vector without a gene inserted was introduced.
  • an anti-V5-HRP antibody (Thermo Fisher Scientific) that recognizes the V5 epitope added to the C-terminus was used for detection.
  • the cells into which the expression vector pEAK10-G ⁇ -T2R16 had been introduced showed a higher amount of T2R16 expression than the cells into which the expression vector pEAK10-T2R16-G ⁇ had been introduced. From this, it was shown that the effect of the present invention is not influenced by the gene sequence unique to the vector such as promoter and non-translated region.
  • Example 12 Response measurement of transiently expressing cells to bitter-tasting substance (2)
  • T2R subtypes bitter taste receptors
  • Example 13 Response measurement of stably expressing cells to bitter taste substance (2)
  • T2R38 subtype bitter taste receptor
  • Example 14 Expression Level of Bitter Taste Receptor in Transiently Expressing Cells
  • the expression level of transiently expressing cells of 14 types of T2R subtypes was examined.
  • Example 4 In place of the gene encoding T2R16 of G ⁇ -T2R16 in Example 4, 14 types of expression vectors containing genes encoding each of 14 types of T2R subtype genes shown in Table 6 were prepared, Example 4 By the same method as in the above, cells in which each T2R and G ⁇ were transiently expressed were prepared.
  • T2R expression level of T2R in each cell was measured by In cell ELISA using the same method as in Example 5 (2).
  • the expression level of each T2R obtained was compared with the T2R4 expression level of transiently expressing cells of G ⁇ -T2R4 in which a response to a known agonist was confirmed in Example 12.
  • T2R4 expression level of transiently expressing cells of G ⁇ -T2R4 in which a response to a known agonist was confirmed in Example 12.
  • Example 15 Response measurement and expression amount in transiently expressing cells of olfactory receptor
  • response measurement and expression amount in transiently expressing cells of olfactory receptor (OR3A1) were examined.
  • Rho-OR3A1 having N-terminal 21 amino acid (Rho) of human rhodopsin added to the N-terminus of OR3A1 and an expression vector OR3A1-G ⁇ olf in which a gene encoding G ⁇ olf was introduced together with an IRES by the same method as in Example 1 And G ⁇ olf-OR3A1 were prepared.
  • cells transiently expressed in HEK293T were prepared in the same manner as in Example 4.
  • each gene of OR3A1 and G ⁇ olf was separately introduced into pcDNA and co-introduced into HEK293T293T was used.
  • Rho-OR3A1 and G ⁇ olf were compared by In Cell ELISA using anti-Rho antibody (Merck) and anti-G ⁇ olf antibody (SANTA CRUZ).
  • HEK293T cells into which pcDNA without any inserted gene was introduced were used.
  • cells into which G ⁇ olf-OR3A1 had been introduced showed higher expression levels of G ⁇ olf and OR3A1 compared to cells into which OR3A1-G ⁇ olf had been introduced (FIG. 21).

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Abstract

本発明は、Ｇタンパク質共役受容体を発現するためのコンストラクト及びその利用を提供することを目的とする。　本発明のコンストラクトは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトであって、単一ベクター中に、５'側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含む、ことを特徴とする。

Description

Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト及びその利用
　本発明は、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト、本発明のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞、本発明の形質転換細胞を用いた物質の生理的応答の測定方法、物質の生理的応答を測定するための本発明の形質転換細胞の利用、本発明の形質転換細胞を含む、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキットに関する。
　１．Ｇタンパク質共役受容体及びＧタンパク質を介したシグナル伝達
　Ｇタンパク質共役受容体は、真核生物の細胞質膜上又は細胞内部の構成膜上に存在する受容体の形式の１種である。細胞外（膜外）からの様々なシグナル（神経伝達物質、ホルモン、化学物質、光等）を受容すると、Ｇタンパク質共役受容体は構造変化を起こし、膜内側に結合している三量体Ｇタンパク質を活性化させてシグナル伝達が行われる。
　Ｇタンパク質は、細胞膜の内表面に結合し、ＧαサブユニットにＧβγ二量体が固く結合しているヘテロ三量体である。Ｇタンパク質共役受容体にリガンドが結合し活性化されると、Ｇタンパク質共役受容体に結合しているＧタンパク質はその保有するＧＤＰをＧαサブユニットから離し、ＧＴＰの新しい分子と結合する（ＧＤＰ型→ＧＴＰ型への変換）。この変換により、Ｇαサブユニット、Ｇβγ二量体及びＧタンパク質共役受容体が各々分離する。分離したＧαサブユニットは、その下流のエフェクタータンパク質を活性化する。
　Ｇタンパク質共役受容体及びその下流のＧタンパク質は、嗅覚、味覚、視覚、神経伝達、代謝、細胞分化及び細胞増殖、炎症反応及び免疫応答などの細胞内シグナルネットワークにおける、多くの基礎的な生理化学的な反応を制御している。
　２．味覚及び嗅覚に関する知見
　味覚は、物質を口にした時に、特に舌の表面に存在する特異的な受容体と物質が結合することによって生じる感覚である。哺乳類の味覚は、５つの基本味、すなわち、塩味、酸味、甘味、旨味、苦味で構成されており、これらの基本味が統合することによって形成されると考えられている。現在のところ、塩味、酸味は、舌の表面の味蕾に存在する味細胞の近位側の細胞膜上に発現するいくつかのイオンチャネル型受容体を介して感知されると言われている。
　甘味、旨味、苦味については、味細胞に存在するＧタンパク質共役受容体と、それに共役するＧタンパク質を介したシグナル伝達によって感知されると考えられている。具体的には、苦味はＴ２Ｒファミリーと命名された分子（苦味受容体）（ヒトで２５種類）で受容され、甘味はＴ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（甘味受容体）、旨味はＴ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（旨味受容体）で受容されることが明らかにされている。
　味覚情報の伝達機構のしくみについては、一般には、以下のように理解されている。すなわち、まず、味物質が味細胞の受容体に結合すると、細胞内のセカンドメッセンジャー（ＩＰ３、ＤＡＧ）などを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇する。次いで、細胞内に供給されたカルシウムイオンは、神経伝達物質をシナプスに放出させて神経細胞に活動電位を発生させ、その結果、受容体を起点とした味覚シグナルが味神経から脳に伝達されて味覚情報が識別、判断される、というのが通説である。
　嗅覚受容体も、苦味受容体、甘味受容体、旨味受容体等の味覚受容体と同様に、Ｇタンパク質共役受容体である。嗅覚受容体は嗅上皮の嗅細胞上に存在する。嗅細胞は、神経細胞が外界と直接接している人体で唯一の場所であり、そのもう一方の端は、脳の嗅球という領域に直接つながっている。「匂い物質」は、分子量３０から３００程度までの低分子化合物であり、地球上には数十万個もの匂い物質が存在すると言われている。ヒトにおいて４００以上もの嗅覚受容体が同定されている。嗅覚受容体に匂い物質が結合すると、苦味受容体、甘味受容体、旨味受容体等の味覚受容体と同様に、細胞内のセカンドメッセンジャーなどを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇する。
　３．Ｇタンパク質共役受容体作動薬の評価
　食品、飲料品等に含まれる化学物質、神経伝達物質、ホルモンなどは、Ｇタンパク質共役受容体に結合して構造変化を起こせしめ、膜内側に結合しているＧタンパク質を活性化させるという、一連のシグナル伝達におけるＧタンパク質共役受容体作動薬となる可能性がある。これらのＧタンパク質共役受容体作動薬の候補物質の生理的応答の評価を簡便に効率よく行えることが望ましい。タンパク質共役受容体作動薬の候補物質の生理的応答の評価を適切に行うことができれば、飲食品、医薬品等の味、品質等の改善、タンパク質共役受容体作動薬の使用量の調節などの有益な効果を達成することができる。
　また一方で、上記食品、飲料品等に含まれる物質においては官能試験による評価も行われてきた。しかしながら官能試験による評価は、評価の客観性の担保が容易でない、評価に人的、時間的、費用的な負担が大きい、大量の物質について短期間で評価を行うことができない、などの本質的な問題を伴うことが知られている。
　そこで、官能試験に代わる評価方法として、Ｇタンパク質共役受容体及びＧαタンパク質を発現させた細胞系を作製し、そのような細胞系にＧタンパク質共役受容体作動薬（候補化合物）を直接添加して効果を評価する方法が報告されている。
　Ｇタンパク質共役受容体作動薬の評価のための細胞系では、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質とＧαタンパク質とが同じ細胞で発現している必要がある。２種類のタンパク質を発現させるには、一般に、各タンパク質コードする核酸を含む２種類のベクターを同時に、あるいは、順番に遺伝子導入する共遺伝子導入法が広く使用されている。これは例えば、以下のような態様である。
　（ａ）Ｇαタンパク質をコードする核酸を含むベクターと、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで宿主細胞をコトランスフェクトする；
　（ｂ）Ｇαタンパク質を安定発現させた細胞株を、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで形質転換する。
　共遺伝子導入法を用いた例は、例えば、苦味受容体についてChem. Senses 35, p.157-170, 2010; The Journal of Neuroscience, 23(19), p.7376-7380, 2003; Biochem Biophys Res Commun 25, 365(4): p.851-855,2008に記載されている。また、甘味受容体については、特開２００８－１３５７０号公報、特開２００８－２２８６９０号公報、ＷＯ２００７－１２１６０４号公報に記載されている。
　しかしながら、いずれの場合も作製難易度が高く（成功率が低い）、安定したデータを取得することができない。よって、Ｇタンパク質共役受容体作動薬の評価を行うのに使用するのに十分な品質を有する細胞系であるとは言えない。
　２種類のタンパク質を発現させる方法としては、共遺伝子導入法の他に、２種類のタンパク質を発現する各々の核酸を１つのベクターに挿入した共発現ベクターを用いる方法が知られている。一般に、単一のベクターに２種類のタンパク質を発現する２種類の核酸をタンデムにそのまま挿入しても、プロモーターから離れた位置にある核酸ほど翻訳がされにくく、タンパク質の発現量が低い。そのため、プロモーターから離れた位置にある核酸ほど翻訳効率を上昇させるための工夫が必要である。
　特許５９０５１８７は、「味受容体の味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を同一のプラスミドに挿入してなる甘味受容体発現コンストラクトであって、ＥＦ-１αプロモーターの下流に位置する、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結し、さらに、その下流に存在するＣＭＶプロモーターの下流に位置する、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなる、甘味受容体発現コンストラクト」を記載している。特許５９０５１８７のコンストラクトは、５’側から順に、ＥＦ-１αプロモーター　－　Ｔ１Ｒ２　－ＩＲＥＳ　－　Ｇα　－　ＣＭＶプロモーター　－　ＴＩＲ３　－　ＩＲＥＳ　－　Ｇα」という特定の構造を有するものである。このコンストラクトにおいて、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３は各々特定のプロモーターの下流、そして、ＩＲＥＳの上流に配置されている。
　ＩＲＥＳは、タンパク質合成の効率をより上昇させるために、キャップ非依存的な翻訳開始を可能にするＲＮＡ因子である。ＩＲＥＳを介した翻訳は、一般にキャップ依存的な翻訳を受ける上流のタンパクと比較し低効率な傾向にあることが知られている。
　本発明前に、Ｇタンパク質共役受容体作動薬の評価を行うのに使用するのに十分な品質を有する細胞系は得られていなかった。
特開２００８－１３５７０号公報 特開２００８－２２８６９０号公報 ＷＯ２００７－１２１６０４号公報
Chem. Senses 35, p.157-170, 2010; The Journal of Neuroscience, 23(19), p.7376-7380, 2003; Biochem Biophys Res Commun 25, 365(4): p.851-855,2008 Molecular BioSystems, 7, p.911-919, 2011 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.88, p.5587-5591, 1991 Journal of Virology, Vol.86, No.3, p.1468-1486, 2012 GENES & DEVELOPMENT, Vol,15, p.1593-1612, 20 Archives of Physiology and Biochemistry Vol.110 p.137-45,2002 Nature Genetics, Vol.32, p.397-401, 2002; Cell, Vol.100, p.703-711, 2000
　本発明者らは、上記問題解決の為に鋭意研究に努めた結果、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトにおいて、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸と配置させることにより、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを高効率で発現し、Ｇタンパク質共役受容体作動薬に対して高効率で応答することを見出し、本発明を想到した。
　ＩＲＥＳの３’側に配置された遺伝子によりコードされるタンパク質は、発現量が低いと考えられている。よって、本発明において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットが高効率で発現することは従来の知見に反することであり特徴的である。
　限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトであって、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含む、前記コンストラクト。
［態様２］
　Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットが、ロドプシン様受容体のクラス又は代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である、態様１のコンストラクト。
［態様３］
　Ｇタンパク質共役受容体が、ロドプシン様受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である、態様１のコンストラクト。
［態様４］
　Ｇタンパク質共役受容体が、苦味受容体である、態様１のコンストラクト。
［態様５］
　ベクターがプラスミドベクターである、態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様６］
　ベクターが、ＣＭＶプロモーターを含むプラスミドベクターである、態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様７］
　ベクターが、ＣＭＶプロモーター及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである、態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様８］
　ベクターが、ＥＦ１αプロモーターを含むプラスミドベクターである。態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様９］
　ベクターが、ＥＦ１αプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである。態様１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１０］
　ＩＲＥＳ配列が、タイプ２のＩＲＥＳ配列である、態様１－９のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１１］
　ＩＲＥＳ配列が、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ配列である、態様１－１０のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１２］
　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の５’側に、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチドをコードする核酸を含む、態様１－７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１３］
　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高めるポリペプチドが、ラットのソマトスタチン受容体のＮ末端４５アミノ酸を含むポリペプチド、又はウシのロドプシンのＮ末端３９アミノ酸を含むポリペプチドである、態様１２のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１４］
　Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ＧｑファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｉファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｓファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、あるいは、これらのキメラタンパク質である、態様１－１３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１５］
　Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、Ｇα１６、Ｇαｇｕｓｔ又はＧαｏｌｆ、あるいは、これらのキメラタンパク質である、態様１－１４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１６］
　Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔである、態様１－１５のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１７］
　Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔ４３である、態様１６に記載のコンストラクト。
［態様１８］
　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質が、ヒトのＧタンパク質共役受容体タンパク質である、態様１－１７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
［態様１９］
　態様１－１８のいずれか１項に記載のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞。
［態様２０］
　態様１９に記載の形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法。
［態様２１］
　物質が、苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質、あるいはこれらの物質に対する調節物質である、態様２０の測定方法。
［態様２２］
　物質の生理的応答を測定するための、態様１９に記載の形質転換細胞の使用。
［態様２３］
　態様１９記載の形質転換細胞を含む、当該形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキット。
　本発明のコンストラクトで形質転換された細胞は、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを高効率で発現し、Ｇタンパク質共役受容体作動薬に対して高効率で応答する。本発明の形質転換細胞は、Ｇタンパク質共役受容体作動薬の評価を行うのに使用するのに十分な品質を有する細胞系を提供する。
図１は、実施例１で作製したコンストラクトの構成を図示したものである。図１中、「ＣＭＶ」はＣＭＶプロモーターを意味する。 図２は、Ｔ２Ｒ１６安定発現株の苦味物質サリシンに対する応答を測定した結果である。 図３は、Ｔ２Ｒ４０安定発現株の苦味物質ジフェニドールに対する応答、及び、Ｔ２Ｒ４３安定発現株の苦味物質キニーネに対する応答を測定した結果である。 図４は、Ｔ２Ｒ１６一過性発現細胞の苦味物質サリシンに対する応答を測定した結果である。 図５は、Ｔ２Ｒ１６一過性発現細胞におけるＴ２Ｒ非依存的Ｇα１６作動薬（イソプロテレノール）に対する応答を測定した結果である。 図６は、Ｔ２Ｒ１６一過性発現細胞におけるＴ２Ｒ１６の発現量を測定した結果である。 図７は、Ｔ２Ｒ１６安定発現株の凍結保存の前後における応答強度を比較した結果である。 図８は、Ｇα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株のＴ２Ｒ４０作動薬に対する応答強度とＧα作動薬に対する応答強度を比較して、相関性を調べた結果である。 図９は、Ｇα－Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）におけるＴ１Ｒ２の発現量を測定した結果である。 図１０は、Ｇα－Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）における、Ｔ２Ｒ非依存的Ｇα１６作動薬（イソプロテレノール）に対する応答を測定した結果である。 図１１は、Ｇα－Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）における、甘味物質アスパルテームに対する応答を測定した結果である。 図１２は、Ｇα－Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２）におけるＴ１Ｒ３の発現量を測定した結果である。 図１３は、Ｇα－Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２）におけるＴ２Ｒ非依存的Ｇα１６作動薬（イソプロテレノール）に対する応答を測定した結果である。 図１４は、Ｇα－Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２）における甘味物質シクラメートに対する応答を測定した結果である。 図１５は、緑色蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）をＩＲＥＳの上流及び下流で発現させた場合の、ＥｍＧＦＰの発現量を測定した結果である。 図１６は、ｐＥＡＫ１０－Ｔ２Ｒ１６－ＧαおよびｐＥＡＫ１０－Ｇα－Ｔ２Ｒ１６を一過性発現させたＨＥＬ２９３Ｔ細胞におけるＴ２Ｒ１６発現量を調べた結果である。 図１７は、７種類のＴ２Ｒサブタイプ（苦味受容体）に関し、各作動薬（苦味物質）に対する一過性発現細胞の応答を調べた結果である。 図１８は、Ｔ２Ｒ３８サブタイプ（苦味受容体）に関し、作動薬（６－ｎ－プロピルチオウラシル）に対する安定発現細胞の応答を調べた結果である。黒がＴ２Ｒ３８の結果、斜線がコントロール（発現ベクターＧα－Ｔ２Ｒ３８を組み込まない細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ））の結果である。 図１９は、１４種類のＴ２Ｒサブタイプ（苦味受容体）の一過性発現細胞における発現量を調べた結果（Ｔ２Ｒ４との比較）である。 図２０は、嗅覚受容体（ＯＲ３Ａ１）の一過性発現細胞における応答を調べた結果である。斜線がＯＲ３Ａ１－Ｇαｏｌｆを、黒がＧαｏｌｆ－ＯＲ３Ａ１を導入した結果を示す。点線（ＯＲ３Ａ１＋Ｇαｏｌｆ）は、ＯＲ３Ａ１、Ｇαｏｌｆの各遺伝子を個別にｐｃＤＮＡに導入し、ＨＥＫ２９３Ｔ２９３Ｔに共遺伝子導入した結果を示す。 図２０は、嗅覚受容体（ＯＲ３Ａ１）の一過性発現細胞における、ＯＲ３Ａ１、Ｇαｏｌｆの発現量を示す。斜線がＯＲ３Ａ１の、黒がＧαｏｌｆの結果を示す。「ＯＲ３Ａ１＋Ｇαｏｌｆ」は、ＯＲ３Ａ１、Ｇαｏｌｆの各遺伝子を個別にｐｃＤＮＡに導入し、ＨＥＫ２９３Ｔ２９３Ｔに共遺伝子導入した場合の結果である。
　本発明は、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト、本発明のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞、本発明の形質転換細胞を用いた物質の生理的応答の測定方法、物質の生理的応答を測定するための本発明の形質転換細胞の利用、本発明の形質転換細胞を含む、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキットに関する。以下、非限定的に本発明を実施するための形態を説明する。
　Ｉ．Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクト
　本発明は、一態様において、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトに関する。本発明のコンストラクトは、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含む、ことを特徴とする。
　（１）Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニット
　「Ｇタンパク質共役（型）受容体」（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＰＣＲ）は、真核生物の細胞質膜上又は細胞内部の構成膜上に存在する受容体の形式の１種である。７つのヘリックス構造が細胞膜（又は細胞内の構成膜）を貫通し、Ｎ末端は膜外にＣ末端は膜内に位置する特徴的な構造から、別名「７回膜貫通型受容体」とも呼称される。膜外ループには２つのよく保存されたシステイン残基が含まれ、ジスルフィド結合によって受容体構造を安定化している。細胞外（膜外）からの様々なシグナル（神経伝達物質、ホルモン、化学物質、光等）を受容すると、Ｇタンパク質共役受容体は構造変化を起こし、膜内側に結合している三量体Ｇタンパク質を活性化させてシグナル伝達が行われる。Ｇタンパク質共役受容体は、嗅覚、味覚、視覚、神経伝達、代謝、細胞分化及び細胞増殖、炎症反応及び免疫応答などの細胞内シグナルネットワークにおける、多くの基礎的な生理化学的な反応を制御している。
　Ｇタンパク質共役受容体は、アミノ酸配列、薬理学的動態、機能等の類似に基づいて６つのクラスに分類されている（Molecular BioSystems, 7, p.911-919, 2011）。
　クラスＡ：ロドプシン様受容体
　クラスＢ：セクレチン受容体ファミリー
　クラスＣ：代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体
　クラスＤ：真菌の接合因子受容体
　クラスＥ：サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）受容体
　クラスＦ：フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）、スムーセンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）
　（ｉ）クラスＡ：ロドプシン様受容体
　クラスＡのロドプシン様受容体は、Ｎ末端の細胞外領域が比較的短く、複数個の膜貫通領域によってリガンド結合部位が形成される。クラスＡのロドプシン様受容体はＧタンパク質共役受容体の８０％以上を占め、苦味受容体、嗅覚受容体、ロドプシン、アドレナリン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体等を含む。ロドプシン様受容体に保存されているアミノ酸配列として、３つ目の膜貫通領域の膜内側に位置するＥ／ＤＲＹ（Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ａｒｇ、Ｔｙｒ）モチーフがある。
　苦味受容体は、ロドプシン様受容体に属するＧタンパク質共役受容体である。ヒト及びマウスの第６番染色体において、Ｔ２Ｒファミリーとして同定された。少なくともマウスで３５種類、ヒトで２５種類のＴ２Ｒが苦味受容体として機能している。ヒトのＴ２Ｒとそのリガンドの関係の例は以下の通りである。
　Ｔ２Ｒ４：安息香酸デナトニウム；
　Ｔ２Ｒ１０：ストリキニーネ；
　Ｔ２Ｒ１４：多くの構造的特徴の異なる苦味物質を非特異的に結合
　Ｔ２Ｒ１６：β－グルコピラノシド（サリシン（ｓａｌｉｃｉｎ））
　Ｔ２Ｒ３１：アリストキア酸
　Ｔ２Ｒ３８：イソチオシアネート基を有する苦味物質、例えば、ファニルチオカルバミド（ＰＴＣ）、プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）
　Ｔ２Ｒ４０：ジフェニドール
　Ｔ２Ｒ４３：キニーネ
　Ｔ２Ｒ４６：アブシンチン、ストリキニーネ、デナトニウム
　マウス及びヒトのＴ２Ｒのタンパク質のアミノ酸配列及び遺伝子の核酸配列は公知である。例えば、ヒトの２５種類のＴ２Ｒ苦味受容体のアミノ酸配列及び遺伝子配列は、以下の表１に記載のアクセッション番号でＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）又は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、本明細書において「遺伝子」は、特に明記しない限り核酸と同義で用いており、プロモーター等の制御配列を含まない態様も含む。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡの双方を含む）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡとＲＮＡのキメラも含む。ある特定のタンパク質の「遺伝子配列」とは、当該タンパク質のアミノ酸配列をコードする（イントロンを含まない）ＤＮＡ配列を意味する。
　嗅覚受容体も、苦味受容体と同様にロドプシン様受容体に属するＧタンパク質共役受容体である。嗅覚受容体は平均して約３１０アミノ酸残基の長さからなり、いくつかのモチーフ配列を共有する。特に特徴的なのは、３番目の膜貫通部位から４番目の膜内ループにかけて存在するＭＡＹＤＲＹＶＡＩＣというモチーフ配列である。このモチーフ配列のうち、ＤＲＹ（Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ａｒｇ、Ｔｙｒ）の３アミノ酸残基は、他のロドプシン様受容体とも共通しており、Ｇタンパク質の活性化に重要と考えられている。多数の嗅覚受容体のタンパク質のアミノ酸及び遺伝子の核酸配列は公知である。
　例えば、ヒトの嗅覚受容体のアミノ酸配列及び遺伝子配列は、以下の表２に記載のアクセッション番号でＮＣＢＩ又はＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（ｉｉ）クラスＣ：代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体
　クラスＣは、代謝性グルタミン酸受容体、代謝性フェロモン受容体の他に、甘味受容体、旨味受容体、ＧＡＢＡ（Ｂ型）受容体、カルシウム感知受容体等を含む。本明細書及び特許請求の範囲において「代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラス」と呼称する場合には、特に明記しない限り、クラスＣに全体を意味する。クラスＣの受容体は、ホモ又はヘテロの二量体として機能し、Ｇタンパク質共役受容体のなかで最も大きな５００～６００残基程度の細胞外領域を有する。細胞外領域のリガンド結合ドメインは、Ｖｅｎｕｓ　Ｆｌｙｔｒａｐモジュール（ＶＦＴＭ）構造と呼称される構造をとる。
　甘味受容体はクラスＣに属する受容体で、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のヘテロ二量体として機能する。人工甘味料であるアスパルテーム（ａｓｐａｒｔａｍｅ）とネオテームの受容にはヒトＴ１Ｒ２のＮ末端ドメインが、人工甘味料シクラメート（ｃｙｃｌａｍａｔｅ）や甘味抑制物質ラクチゾールの受容にはヒトヒトＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインが、甘味修飾物質ネオクリンはヒトＴ１Ｒ３のＮ末端ドメインが各々受容に重要であることが報告されている。甘味タンパク質ブラゼインのヒトＴ１Ｒ３のＣリッチドメインが感受性に重要である、と報告されている。
　旨味受容体は、クラスＣに属する受容体で、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３のヘテロ二量体として機能する。旨味物質のグルタミン酸及びイノシン酸（ＩＭＰ）は、Ｔ１Ｒ１のＮ末端ドメインに結合することが明らかにされている。
　甘味受容体、旨味受容体を構成するヒトＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３ののアミノ酸配列及び遺伝子配列は、以下の表３に記載のアクセッション番号でＮＣＢＩに登録されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明のコンストラクトを用いて発現されるのは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質全体であっても、あるいは、そのサブユニットであってもよい。例えば、二量体である甘味受容体又は旨味受容体を構成するサブユニット、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、Ｔ１Ｒ１のいずれか１種類のサブユニットのみを発現するコンストラクトが含まれる。その場合、二量体を構成するもう片方のサブユニットは別のコンストラクトでコトランスフェクトしてもよい。あるいは、単一のベクター中にＧタンパク質共役受容体タンパク質を構成する複数のサブユニットをコードする核酸が含まれるようにコンストラクトを構築してもよい。本発明において、少なくとも１つのサブユニットをコードする核酸がＩＲＥＳの３'側に配置されるようにコンストラクトを構成する。
　（ｉｉｉ）クラスＢ：セクレチン受容体ファミリー
　クラスＢのセクレチン受容体ファミリーは、Ｎ末端側の細胞外領域が長くリガンド結合部位を形成する。セクレチン様受容体（狭義）とＡｄｈｅｓｉｏｎ型Ｇタンパク質共役受容体の２つのサブグループに分かれる。セクレチン様受容体（狭義）には、セクレチン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン等のペプチドホルモンに結合する受容体が含まれる。Ａｄｈｅｓｉｏｎ型Ｇタンパク質共役受容体は、巨大なＮ末端部位に様々なドメイン構造を有し、細胞外マトリックス等の相互作用が示唆されている。
　（ｉｖ）クラスＦ：フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）、スムーセンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）
　クラスＦのＧタンパク質共役受容体は、Ｗｎｔシグナル伝達経路で機能する１０種類のフリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）タンパク質と、ヘッジホッグシグナル伝達経路で機能するスムーセンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）を含む。クラスＦの受容体は、細胞外にシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と呼ばれる約１２０アミノ酸残基からなる領域を有し、Ｗｎｔなどのリガンドの結合領域となっている。
　本発明において、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットの種類は特に限定されない。少なくともクラスＡに属する苦味受容体Ｔ２Ｒの複数のタイプ、並びに、異なるクラスＣに属するサブユニットＴ１Ｒ２（甘味受容体を構成）及びＴ１Ｒ３（甘味受容体及び旨味受容体を構成）において、本発明の効果が確認されている。
　非限定的に、本発明の一態様において、好ましくは、Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットは、ロドプシン様受容体のクラス（クラスＡ）又は代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラス（クラスＣ）のＧタンパク質共役受容体である。本発明の一態様において、Ｇタンパク質共役受容体は、ロドプシン様受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である。より好ましくは、Ｇタンパク質共役受容体は、苦味受容体である。
　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質が由来する生物種は特に限定されない。好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物種由来である。哺乳動物は、例えば、ヒト、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、マウス等を含む。本発明の一態様において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質はヒトのＧタンパク質共役受容体タンパク質である。
　（２）Ｇタンパク質αサブユニット
　「Ｇタンパク質（グアニジンヌクレオチド結合タンパク質）」は、ＧＴＰアーゼのグループに属するタンパク質で、一般に、α、β、γの３つのサブユニットから構成される、膜受容体関連ヘテロ三量体を指す。
　Ｇタンパク質は、細胞膜の内表面に結合し、ＧαサブユニットにＧβγ二量体が固く結合している。Ｇタンパク質共役受容体にリガンドが結合し活性化されると、Ｇタンパク質共役受容体に結合しているＧタンパク質は持っているＧＤＰをＧαサブユニットから離し、ＧＴＰの新しい分子と結合する（ＧＤＰ型→ＧＴＰ型への変換）。この変換により、Ｇαサブユニット、Ｇβγ二量体及びＧタンパク質共役受容体が各々分離する。分離したＧαサブユニットは、その下流のエフェクタータンパク質を活性化する。
　Ｇタンパク質αサブユニットはＧＴＰアーゼドメインとαヘリックスドメインの２つのドメインからなる。現在、少なくとも２０種類のＧαサブユニットが知られており、主に４つのファミリーに分類されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明において、Ｇタンパク質αサブユニットの種類は特に限定されない。本発明の一態様において、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質は、非限定的に、ＧｑファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｉファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｓファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、あるいは、これらのキメラタンパク質である。本発明の一態様において、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質は、Ｇα１６、Ｇαｇｕｓｔ又はＧαｏｌｆ、あるいは、これらのキメラタンパク質である。
　Ｇタンパク質サブユニットが由来する生物種は特に限定されない。好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物種由来である。哺乳動物は、例えば、ヒト、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、マウス等を含む。本発明の一態様において、Ｇタンパク質はヒトのＧタンパク質共役受容体タンパク質である。
　ヒトのＧα１６は、例えばProc.Natl.Acad.Sci.USA, Ｖｏｌ．８８，ｐ．５５８７－５５９１，　１９９１に記載されており、ｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｍ６３９０４．１で登録されている。ヒトのＧα１６の塩基配列及びアミノ酸配列はまた、本出願の配列表の配列番号６５及び６６として記載されている。ヒトＧα１６をコードする遺伝子は、例えば、ＨＬ６０細胞等の培養細胞から入手することも可能である。
　ラットＧａｓｔｄｕｃｉｎのｍＲＮＡの配列は、ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿１７３１３９．１で登録されている。ラットＧａｓｔｄｕｃｉｎの塩基配列及びアミノ酸配列はまた、本出願の配列表の配列番号６７及び６８として記載されている。
　ヒトのＧαｏｌｆのｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＦ４９３８９３．１で登録されている。ヒトのＧαｏｌｆの塩基配列及びアミノ酸配列はまた、本出願の配列表の配列番号６９及び７０として記載されている。
　Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質は、キメラタンパク質であってもよい。キメラタンパク質は、同じ生物種由来の異なる種類のＧタンパク質αサブユニットの融合タンパク質であってもよく、異なる生物種由来の同じ種類のＧタンパク質αサブユニットの融合タンパク質であってもよく、あるいは、異なる生物種由来の異なる種類のＧタンパク質αサブユニットの融合タンパク質であってもよい。Ｇタンパク質αサブユニットタンパクｎのキメラタンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体への結合特異性、結合強度、あるいは、安定性などの特徴が元来のＧタンパク質αサブユニットタンパク質と異なる場合がある。このようなキメラタンパク質をコードする核酸を含むコンストラクトを利用することにより、所望の特徴を有する形質転換細胞を得ることができる。そして、所望の特徴を有する形質転換細胞は、物質の生理的応答の測定方法に適宜利用することができる。
　本発明の一態様において、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質は、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔである。ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔは、ヒトＧα１６のＣ末端側をラットＧαｇｕｓｔのＣ末端配列に置換したキメラタンパク質である。Ｇα１６のＣ末端側を３７アミノ酸残基以上のＧαｇｕｓｔのＣ末端配列に置換したキメラタンパク質は、苦味受容体Ｔ２Ｒに応答することが報告されている（The Journal of Neuroscience, 23(19), p.7376-7380, 2003）。
　ヒトＧα１６を置換するラットＧαｇｕｓｔのＣ末端配列は、好ましくは少なくとも２５アミノ酸基以上、３０アミノ酸基以上、３５アミノ酸残基以上、３７アミノ酸残基以上、４０アミノ酸基以上、４３アミノ酸残基以上である。ヒトＧα１６を置換するラットＧαｇｕｓｔのＣ末端配列は、好ましくは、６０アミノ酸残基以下、５０アミノ酸基以下、４５アミン酸基以下、４３アミノ酸基以下である。本発明の一態様において、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質は、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔ４３である。
　本明細書の実施例では、ヒトのＧα１６の配列番号６５の３’末端の１３２塩基（終始コドン含む）Ｃ末端の４３アミノ酸をコードする配列に相当）を、ラットＧａｓｔｄｕｃｉｎの相当する配列、即ち、配列番号６７の３’末端の１３２塩基（終始コドン含む、Ｃ末端の４３アミノ酸をコードする配列に相当）に置換した（Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３（Ｇα））。
　（３）ＩＲＥＳ
　本発明のコンストラクトは、単一ベクター中のＧタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸の下流（３’側）、かつ、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の上流（５’側）の位置に、ＩＲＥＳ配列を含む核酸を含む。ＩＲＥＳは、Internal ribosome entry site（内部リボソーム進入部位）の略称であり、タンパク質合成の効率をより上昇させるために、キャップ非依存的な翻訳開始を可能にするＲＮＡ因子である。多くのＩＲＥＳは、ＲＮＡウイルスの５'ＵＴＲ（５’非翻訳領域）に存在するが、哺乳動物細胞の細胞性ｍＲＮＡの中にもＩＲＥＳが存在することが示唆されている。
　現在までに発見されているウイルス性ＩＲＥＳは、５つのクラスに大別される（Journal of Virology, Vol.86, No.3, p.1468-1486, 2012)。
　１つめのクラスは、ジシストロウイルスのＩＲＥＳ群である。２つめのクラスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びペスチウイルス属のウイルスのＩＲＥＳ，さらに、構造的に類似した多くのウイルスのＩＲＥＳを含む。
　さらに、タイプ１～タイプ３と呼称される３つのクラスのＩＲＥＳが知られている。これらは、いずれも、ピコルナウイルス科の５'ＵＴＲにおいて同手されたものである。
　これらのうちタイプ２は、主に、アフトウイルス属（Aphthovirus）、カルジオウイルス属（Cardiovirus）、パレコウイルス属（Parechovirus）に見出されるＩＲＥＳである。さらに、エルボウイルス属（Erbovirus）、コサウイルス属（Cosavirus）にも分岐メンバーが存在する。カルジオウイルス属（Cardiovirus）は、脳心筋炎ウイルス（Encephalomyocarditis virus） (EMCV)、タイロウイルス（Theilovirus）を含む。タイプ２のＩＲＥＳは、約４５０塩基の長さで、３'－末端Ｙｎ－Ｘｍ－ＡＵＧ（Ｙｎはピリミジントラクトであり、ｎは８－１０の整数であり、そして、ｍは、１８－２０である。）のモチーフを有し、ＡＵＧトリプレットが開始コドンとなる場合がある。タイプ２のＩＲＥＳは、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬの５つの主たるドメインを含む。タイプ２のＩＲＥＳは、真核生物の翻訳開始因子ＩＦ４Ｅ及びリボソームスキャンニングに関与する因子、例えば、ｅＩＦ１及びｅＩＦ１Ａ等の関与なしに機能する。ただし、タイプ２のＩＲＥＳのうちいくつかは、１又は複数のＩＲＥＳトランス活性因子（ＩＴＡＦｓ）を必要とする。ＩＴＡＦは、ピリミジントラクト結合タンパク質（ＰＴＢ）などの細胞性ＲＮＡ結合タンパク質である。
　タイプ１のＩＲＥＳは、エンテロウイルス属（Enterovirus）のみに見出されるＩＲＥＳである。タイプ１のＩＲＥＳは、ＩＩ－ＶＩの５つの主たるドメインを含む。タイプ２のＩＲＥＳは、約４５０塩基の長さで、タイプ２と同様に３'－末端Ｙｎ－Ｘｍ－ＡＵＧのモチーフを有する。ただし、タイプ１のＩＲＥＳではこのモチーフは非保存スペーサーによって開始コドンから離されている。タイプ３は、Ａ型肝炎ウイルスのみで見出されるＩＲＥＳである。
　細胞性ＩＲＥＳについては、例えば、GENES & DEVELOPMENT, Vol,15, p.1593-1612, 2001に記載されている。
　本発明において、ＩＲＥＳの種類は特に限定されない。非限定的に、本発明の一態様において、ＩＲＥＳはウイルス性のＩＲＥＳである。本発明の一態様において。ＩＲＥＳ配列は、タイプ２のＩＲＥＳ配列、例えば、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ配列である。脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳの核酸配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｍ８１８６１．１で登録されている。本明細書の実施例で用いたＩＲＥＳ配列は配列番号７１で、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｍ８１８６１．１の配列に対し、ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＩＲＥＳ部位を模して、一部修正している。具体的には、配列番号７１において塩基番号１にＧが、塩基番号５１２にＡが追加されている。
　（４）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチド
　本発明のコンストラクトは、一態様において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の５’側に、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチドをコードする核酸を含む。
　このようなコンストラクトを用いた場合、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのＮ'末端側に、このようなポリペプチドが結合した融合タンパク質が発現する。従って、当該コンストラクトで形質転換された細胞において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行が向上する。より多くのＧタンパク質共役受容体が細胞膜へ移行している形質転換細胞は、物質の生理的応答の測定方法により利用しやすくなる。
　本発明において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチドの種類は、「Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める」という機能を有する限り、特に限定されない。「Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める」とは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのＮ末端側に当該ポリププチドが結合している場合、結合していない場合と比較して、発現したＧタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットが形質転換細胞の核から細胞膜へ移行する割合が（有意に）上昇することを意味する。
　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高めるポリペプチドは、非限定的に、ラットのソマトスタチン受容体の全体又は一部を含むポリペプチド、ウシのロドプシンの全体又は一部を含むポリペプチドを含む（Archives of Phisiology and Biochemistry Vol.110 p.137-45,2002; Nature Genetics, Vol.32, p.397-401, 2002; Cell, Vol.100, p.703-711, 2000）。本発明の一態様において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高めるポリペプチドは、ラットのソマトスタチン受容体のＮ末端４５アミノ酸を含むポリペプチド、ウシのロドプシンのＮ末端３９アミノ酸を含むポリペプチド、又は、ヒトのロドプシンのＮ末端２１アミノ酸を含むポリペプチドである。
　ラットのソマトスタチン受容体のｍＲＮＡの配列は、ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿１３３５２２．１で登録されている。ラットソマトスタチン受容体の塩基配列及びアミノ酸配列はまた、本願の配列表の配列番号７２及び７３として記載されている。本願明細書の実施例では、配列番号７２の５’末端の１３５塩基をＧタンパク質共役受容体をコードする塩基配列の５'側に結合した。
　ヒトのロドプシンのｍＲＮＡの配列は、ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿０００５３９．１で登録されている。ヒトロドプシンの塩基配列及びアミノ酸配列はまた、本願の配列表の配列番号７４及び７５として記載されている。
　（５）ベクター
　本発明のコンストラクトは、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、並びに、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を、単一ベクター中に５’側から順に含む。単一ベクター中に上記核酸を上記順に含むことにより、形質転換細胞において、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの発現量が上昇する、並びに／或いは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのリガンド物質への応答性が上昇する、という効果が得られる。ベクターにおいて、５’側から、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の順序で並んでいることが重要である。ＩＲＥＳの３’側の核酸にコードされるタンパク質は発現量が高くない、というのが従来の定説であった。本発明者らは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの場合、ＩＲＥＳの５’側よりも３'側に配置することで発現量が高まる、という発見に基づき本発明を想到した。
　なお、Ｇタンパク質共役受容体が、例えば、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３）、旨味受容体（Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３）のような二量体の場合、二量体を構成する一方のサブユニットをコードする核酸のみを、上述のように、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳとともに単一ベクターに含ませてもよい。もう片方のサブユニットをコードする核酸を別のベクターに含ませ、上記ベクターとコトランスフェクトしてもよい。
　ベクターの種類は、所望の細胞においてタンパク質を発現できる発現ベクターであれば特に限定されない。非限定的に、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等を含む。当業者は、タンパク質を発現させる細胞の種類に応じて、適宜ベクターを選択可能である。
　本発明の一態様において、ベクターはプラスミドベクターである。プラスミドベクターは、例えば、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＳＨ１５、ｐＳＨ１９、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４等を含む。Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のｐｃＤＮＡ（商標）シリーズ（ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ５は、哺乳動物細胞における発現ベクターとして使用しうる。哺乳動物細胞における発現ベクターとしては、その他に、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）も使用することができる。
　本発明のベクターは好ましくは、プロモーターを含む。プロモーターの種類は特に限定されない、例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来プロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ＥＦ１αプロモーター等が含まれる。本発明の一態様において、ベクターはＣＭＶプロモーターを含むプラスミドベクター、あるいは、ＥＦ１αプロモーターを含むプラスミドベクターである。
　本発明のベクターは、好ましくは、形質転換された細胞を選択するための選択マーカーを含む。選択マーカーの種類は特に限定されず、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等、公知のプロモーターを含む。選択マーカーを含むことにより、安定してタンパク質を発現する細胞株を選択することが可能になる。
　本発明の一態様として、選択マーカーは薬剤耐性遺伝子である。薬剤耐性遺伝子は、非限定的に、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等を含む。
　本発明の一態様において、ベクターは、ＣＭＶプロモーター及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである。このようなベクターの一例は、本明細書の実施例で用いた、ｐｃＤＮＡ３．１　Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）である。
　本発明の別の一態様において、ベクターは、ＥＦ１αプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである。このようなベクターの一例は、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）である。
　本明細書の実施例で使用したｐｃＤＮＡ３．１　Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター及びｐＥＡＫ１０ベクターの配列を各々本願の配列表の配列番号８０及び８１で示す。配列番号８０の塩基８９５―９４２は、目的遺伝子が挿入されるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）である。配列番号８１の塩基１８９２－２８２３はＥＦ－１αプロモーター配列、塩基２８４４－２８４５は目的遺伝子が挿入される部位、塩基３２９３－３８９２はピューロマイシン耐性遺伝子配列に相当する。
　ＩＩ．形質転換細胞
　本発明はまた、上記本発明のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞に関する。本発明のコンストラクトを遺伝子導入し形質転換細胞を作製するための宿主細胞の種類は、遺伝子導入により外因性核酸を導入し形質転換可能な細胞であれば、特に限定されない。
　例えば、細胞は、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
　哺乳動物由来の細胞は、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞である「株化細胞」を含む。例えば、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ－６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する株化細胞が存在する。
　本明細書における植物細胞の由来は特に限定されない。コケ植物、シダ植物、種子植物を含む植物の細胞が対象となる。種子植物細胞が由来する植物は、単子葉植物、双子葉植物のいずれも含まれる。本明細書における昆虫細胞の由来も特に限定されない。本明細書における古細菌及び細菌の種類も特に限定されない。
　非限定的に、本発明の形質転換細胞を作製するための宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、３２Ｄ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞などの真核細胞を利用できる。本発明の一態様において、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞である。
　本発明のコンストラクトを用いて、宿主細胞を遺伝子導入（形質転換する）方法は特に限定されない。動物細胞、植物細胞、細菌へ核酸を遺伝子導入する方法については、各々適した方法が公知である（例えば、MOLECULAR CLONING: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Michael R Green and Joseph Sambrook, 2012, (Cold Spring Harbor Laboratory Press)）。当業者は、ベクターの種類、細胞の種類等に応じて、適宜適切な遺伝子導入法を使用しうる。例えば、プラスミドベクター等の非ウイルスベクターの場合、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などの遺伝子導入法が知られている。
　形質転換細胞は、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを安定的に発現する細胞（安定発現株）であってもよいし、一過性に発現する細胞（一過性発現細胞）であってもよい。「安定発現株」は、例えば、遺伝子導入によりコンストラクトに含まれる核酸が宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれたことが選択マーカーによって確認され、従って、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを安定して発現する細胞株をいう。「一過性発現細胞」は、コンストラクトに含まれる核酸が宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれたことが確認されておらず、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを安定して発現することが確認できていない細胞を意味する。
　本発明の形質転換細胞は、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの発現量が上昇している、並びに／或いは、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのリガンド物質への応答性が上昇している、という特徴を有する。「Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの発現量が上昇している」とは、従来技術を用いてＧタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現させた場合と比較して、その発現量が上昇していることを意味する。「Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットのリガンド物質への応答性が上昇している」とは、本発明前の従来技術を用いてＧタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現させた場合と比較して、そのリガンド物質への応答性が上昇していることを意味する。
　「従来技術」とは例えば、以下の態様を含む。
　（１）共遺伝子導入
　（１ａ）Ｇαタンパク質をコードする核酸を含むベクターと、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで宿主細胞をコトランスフェクトする；
　（１ｂ）Ｇαタンパク質を安定発現させた細胞株を、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含むベクターで形質転換する。
　（２）ＩＲＥＳを含む共発現ベクター
　５’側から順に、プロモーター　－　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸　－　ＩＲＥＳ　－　Ｇαタンパク質をコードする核酸を含む単一ベクターで形質転換する。
　本発明の形質転換細胞は、従来技術を用いてＧタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現させた場合と比較して、安定性が優れている。安定性とは、通常の細胞の培養条件における安定性、凍結保存等の保存条件における安定性を含む。例えば、本明細書の実施例において、凍結保存で１ヶ月程度保存した場合でも、リガンドに対する応答強度が凍結保存前と比較して０．８以上とほとんど低下しなかった。これに対し、共遺伝子導入（Ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔａｂｌｅ）では、リガンドに対する応答強度が凍結間相互に、０．６未満に低下していた。
　ＩＩＩ．物質の生理的応答の測定方法。
　本発明はさらに、物質の生理的応答の測定方法に関する。本発明の測定方法は、本発明の形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する工程を含む。
　「物質」は、Ｇタンパク質共役受容体に結合し作動薬となり得る物質であれば、特に限定されない。物質は、Ｇタンパク質共役受容体に構造変化を起こし、膜内側に結合しているＧタンパク質を活性化させてシグナル伝達を行うものであり、食品、飲料品等に含まれる化学物質、匂い分子、神経伝達物質、ホルモン等を含む。シグナルは、嗅覚、味覚、視覚、神経伝達、代謝、細胞分化及び細胞増殖、炎症反応及び免疫応答などの細胞内シグナルネットワークにおける、生理的応答を引き起こす。物質は、Ｇタンパク質共役受容体の種類に応じて異なる。
　一態様において、物質は、苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質、あるいはこれらの物質に対する調節物質である。
　「苦味物質」は、ヒトが苦味を感知できる物質であれば特に限定されない。例えば、安息高酸デナトニウム、ストリキニーネ、β－グルコピラノシド（サリシン（ｓａｌｉｃｉｎ））、アリストキア酸、イソチオシアネート基を有する苦味物質（例えば、ファニルチオカルバミド（ＰＴＣ）、プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ））、ジフェニドール、キニーネ、アブシンチン、デナトニウムを含む。
　「匂い物質」は、分子量３０から３００程度までの低分子化合物である。例えば、脳内ホルモンであるセロトニンの基本骨格はインドールという糞臭の物質であり、ドーパミンやアドレナリンの骨格は、バニラのにおいであるバニリンと似ている。揮発性という性質をもっている低分子有機化合物であればどんな物質でも匂い物質になりうる。匂いは、様々な食べ物、植物、動物から発せられ、嗅覚が退化したといわれている人間でも１万種類くらいは識別できるといわれている。「匂い物質」の例として、具体的な「匂い物質」の例として、麝香（ムスク）臭の主成分であるムスコン、霊猫香（シベット）香の主成分であるシベトンや、スミレの花の香りを醸し出すα－ヨノン、リラの花の香りの主成分α－テルピネオール、スペアミントの香りを成す（－）５Ｒ－カルボン、更に魚臭を成すメチルアミン、ジメチルアミンやトリメチルアミン等が挙げられる。
　「旨味物質」は、例えば、ヒトが旨味を感知できる物質であれば特に限定されない。例えば、グルタミン酸及びイノシン酸（ＩＭＰ）を含む。
　「甘味物質」は、例えば、ヒトが甘味を感知できる物質であれば特に限定されない。例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロース、スクロース、マルトース、乳糖、水飴、異性化糖、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、イソマルトール、還元水飴、還元パラチノース、和三盆、黒糖、三温糖、蜂蜜、糖蜜、甘草抽出物及びメープルシロップなどの糖質系甘味料、及び、アスパルテーム（ａｓｐａｒｔａｍｅ）、サッカリン、ズルチン、ステビオシド、ステビア抽出物、グリチルリチン、アセスルファム－Ｋ、スクラロース（登録商標；三栄源エフ・エフ・アイ）、シクラメート（ｃｙｃｌａｍａｔｅ）、アリテーム、ネオテーム、ペリラルチン、モネリン、クルクリン（登録商標；ＡＤＥＫＡ）などの非糖質系甘味料が広く含まれる。
　「苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質の調節物質」とは、単独では、苦味、匂い、旨味、甘味を生じないが、苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質と共に受容されることにより、各物質の味覚、嗅覚を増強、修飾、又は抑制するものである。
　例えば、「苦味物質の調節物質」には、ベネコートＢＭＩ（花王）、ブロベネシド等が含まれる。「匂い物質の調節物質」には、嗅覚抑制剤である、２．４．６－トリクロロアニソール、ゲラニオール等が含まれる。「甘味物質の調節物質」には、甘味抑制物質ラクチゾール、甘味抑制物質ギムネマ酸、甘味修飾物質ネオクリン等が含まれる。
　本発明の形質転換細胞を用いてある物質の生理的応答を測定するためには、例えば、以下のようにして行う。
　本発明の形質転換細胞の所定の数を多数のウェル（２４穴、４８穴、９６穴、３８４穴など）を有するマイクロプレートの各ウェルに撒き（例えば、１万～５０万個／ウェル）、所定の培地（例えば、ＤＭＥＭ培地）中で培養する。細胞培養後、特定の物質を添加した場合において、上記安定培養細胞株に発生した生理的応答を測定し、その測定結果に基づいて物質の生理的応答を評価する。生理的応答を測定は、物質の種類に応じて、Ｇタンパク質共役受容体の活性化に伴って変化する事象が適宜選択される。
　例えば、苦味受容体、甘味受容体、旨味受容体などの味覚受容体が活性化されると、細胞内のセカンドメッセンジャー（ＩＰ3（イノシトール三リン酸）、ＤＡＧ）などを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇する。したがって、測定対象とする生理的応答としては、味覚受容体の活性化に伴って変化する細胞内のセカンドメッセンジャーの変化、細胞内のカルシウム濃度の変化などが挙げられる。よって、細胞内のセカンドメッセンジャー又はカルシウム濃度の変化を測定することによって、生理的応答を測定することが可能である。
　例えば、苦味、甘味又は旨味等の味覚刺激によって惹起される細胞内カルシウム濃度変化を、蛍光カルシウムインジケーターを用いることにより観察するカルシウムイメージング法で行うことができる。蛍光カルシウムインジケーターには、生理的に変化し得るカルシウム濃度において蛍光特性が変化すること、及びそのときの変化がカルシウム特異的に誘導されることが要求される。蛍光カルシウムインジケーターの例は、Ｆｌｕｏ－８（登録商標）（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社）（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１４ｎｍ）、Ｆｌｕｏ-４　ＡＭ（（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社）（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２５ｎｍ）、Ｆｕｒａ-２　ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）（励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍ）を含む。
　匂い物質の生理的応答の測定は、例えば、匂い物質の生理応答測定には匂い物質の嗅覚刺激によって惹起される細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定する手法が用いられる。細胞内ｃＡＭＰを測定する方法としては、蛍光若しくはＨＲＰ等の酵素を標識したｃＡＭＰと抗ｃＡＭＰ抗体を用いた蛍光偏光イムノアッセイ又は競合型イムノアッセイ、あるいは、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の下流にルシフェラーゼを挿入したベクターを遺伝子導入し、ルシフェラーゼアッセイにより測定する手法、などが挙げられる。
　本発明は、物質の生理的応答を測定するための本発明の記載の形質転換細胞の使用を含む。
　本発明は、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸とＧタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を、単一ベクター中に含む。よって、形質転換細胞におけるＧタンパク質αサブユニットタンパク質とＧタンパク質共役受容体タンパク質の発現量は正の相関関係があると推定される。本発明の形質転換細胞において、Ｇタンパク質共役受容体のＧタンパク質共役受容体作動薬に対する応答性とＧα作動薬に対する応答強度は高い正の相関性を示す（実施例７，図８）。従って、物質（Ｇタンパク質共役受容体作動薬）を添加した形質転換細胞において、Ｇタンパク質αサブユニットのＧα作動薬に対する応答強度を測定することにより、物質に対する生理応答強度を推測することも可能である。
　ＩＶ．物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキット
　本発明はさらにまた、本発明の形質転換細胞を含む、当該形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキットに関する。
　本発明のキットは、本発明の形質転換細胞の他に、物質の生理的応答の測定方法に使用するために必要な材料、使用説明書などを含むことができる。物質の生理的応答の測定方法に使用するために必要な材料とは、例えば、形質転換細胞を維持・培養するための培地、物質の生理的応答により生じたセカンドメッセンジャー又はカルシウムの濃度を測定するための試薬（例えば、カルシウム濃度を測定するための蛍光カルシウムインジケーター等）などである。
　本発明は、形質転換細胞を含む、当該形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法に使用するための装置に関する。本発明の装置は、本発明のキット、物質の生理的応答により生じたセカンドメッセンジャー又はカルシウムの濃度を測定するための機器等を含む。
　苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質、あるいはこれらの物質に対する調節物質などの呈味物質に対する生理的応答を測定するための装置の例として、例えば、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｓｅｎｓｏｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．により「人工脂質膜味覚センサー」が開発されている（http://www.insent.co.jp/products/taste#sensor#index.html）。この味覚センサーは、種々の呈味物質と静電相互作用や疎水性相互作用することによる人工脂質膜の膜電位の変位をセンサー出力として、コンピュータにより検知する、というものである。例えば、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｓｅｎｓｏｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．より味認識装置TS-5000Zが販売されている。本発明の装置は、このようなセンサー中の人工脂質膜の代わりに、本発明の形質転換細胞を利用するものである。具体的には、本発明の形質転換細胞を、人工膜と置き換えて装置に固定し、物質を作用させ、細胞内のセカンドメッセンジャー又はカルシウム濃度の変化を測定することによって、物質の生理的応答を測定する。本発明の装置は、使用後、洗浄等により試験物質を除去することにより、繰り返し測定に使用することが可能である。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　実施例１　コンストラクトの構成及び作製方法
　本実施例では、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質を発現するためのコンストラクトを作製した。本発明のコンストラクトは、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質をコードする核酸を含む。
　以下の３種類の遺伝子をそれぞれＰＣＲによって増幅した。
　－５’末端にラットソマトスタチン受容体３（ｓｓｒ３）の開始コドンから１３５塩基目の遺伝子配列を、３’末端にＶ５エピトープ配列を付加したヒト苦味受容体（Ｔ２Ｒ１６）発現遺伝子（ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５）
　なお、Ｖ５エピトープ配列は、Ｔ２Ｒのタンパク質発現量を調べるための抗体認識タグである（塩基配列：配列番号７６）；
　－脳心筋炎ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ）由来のＩＲＥＳ；及び
　－ヒトのＧタンパク質αサブユニットＧ１６の末端１２９塩基をラットのガストデューシン（Ｇｇｕｓｔ）の末端１２９塩基に置換したＧα１６／ｇｕｓｔ発現遺伝子（Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３）（配列番号７７）。
　得られた遺伝子断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｐｃＤＮＡ３．１　Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のマルチクローニングサイトに、挿入した。挿入順は以下の通りである。
　本発明のベクター：　Ｇα－Ｔ２Ｒ１６
　　Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５
　比較例のベクター：　Ｔ２Ｒ１６－Ｇα
　ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５　－ＩＲＥＳ－Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３
　各ベクターの構成を図１に示す。
　実施例２　本発明のコンストラクトを含む安定発現株の作製
　本実施例では、本発明のコンストラクト（Ｇα－Ｔ２Ｒ１６）を組み込み、苦味受容体Ｔ２Ｒ１６を安定に発現する細胞株（Ｔ２Ｒ１６安定発現株）を作製した。
　具体的には、培養容器に１×１０6個播種したヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（理化学研究所より入手）に、実施例１で作製したＧα－Ｔ２Ｒ１６及びＴ２Ｒ１６－Ｇαの各プラスミドベクター５μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて遺伝子導入した。４８時間培養後、培地に１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを添加し１５日程度培養することで薬剤耐性スクリーニングを行った。薬剤耐性を獲得した細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに１個ずつとなるよう播種することでクローニングした。１０日程度培養後、安定発現株を取得した。
　実施例３　苦味物質に対する安定発現株の応答測定
　（１）Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株の応答測定
　本実施例において、実施例２のＴ２Ｒ１６安定発現株の苦味物質に対する応答を測定した。
　実施例２に記載の方法に基づき作製したＴ２Ｒ１６安定発現株を、９６ウェルプレートに２×１０4個／ウェルでそれぞれ播種した。細胞の培養培地には、緑色蛍光カルシウムインジケーターＦｌｕｏ－８（登録商標）（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社）を含ませており、細胞株へのＦｌｕｏ－８の取り込みを調べた。Ｆｌｕｏ－８（登録商標）は、細胞内のカルシウム動態の検出に適しており、ＧＰＣＲ活性の示標となる。
　Ｆｌｕｏ－８（登録商標）を取り込ませた細胞を４９０ｎｍで励起させ、５１４ｎｍの蛍光強度を測定した。測定中にＴ２Ｒ１６作動薬であるサリシン（１０、３、１、０．３、又は０．１ｍＭ）を添加し、添加後４０秒間における蛍光強度の最大値を取得した。測定開始時点の蛍光強度に対する蛍光強度の最大値の増加率を作動薬に対するＴ２Ｒ１６の応答強度として算出した。結果を図２に示す。
　図２に示されるように、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６プラスミドを含む細胞株のみサリシンに対する応答を示した。Ｔ２Ｒ１６－Ｇαプラスミドを含む細胞株ではサリシンに対する応答はほとんど観測されず、応答を示すクローンを単離することができなかった。
　（２）Ｇα－Ｔ２Ｒ４０及びＧα－Ｔ２Ｒ４３の安定発現株の応答測定
　Ｔ２Ｒ１６以外の苦味受容体のサブタイプＴ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４３についても、実施例３（１）と同様に、安定発現株の応答を測定した。
　具体的には、実施例１、実施例２に記載の方法と同様に、Ｇα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株（Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ４０／Ｖ５を含む）及びＧα－Ｔ２Ｒ４３安定発現株（Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ４３／Ｖ５を含む）を作製した。
　実施例２に記載の方法と同様の方法を用いて、Ｇα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株及びＧα－Ｔ２Ｒ４３安定発現株を作製した。これらの細胞株にそれぞれの作動薬（Ｔ２Ｒ４０：ジフェニドール，Ｔ２Ｒ４３：キニーネ）を１００μＭ又は３００μＭ作用させ、添加後４０秒間における蛍光強度の最大値を取得した。測定開始時点の蛍光強度に対する蛍光強度の最大値の増加率を作動薬に対するＴ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４３の応答強度として算出した。結果を図３に示す。Ｔ２Ｒ４０－Ｇα、Ｔ２Ｒ４３－Ｇαと比較して、Ｇα－Ｔ２Ｒ４０及びＧα－Ｔ２Ｒ４３が各々の作動薬に対し高い応答強度を示した。
　実施例４　苦味物質に対する一過性発現細胞の応答測定
　９６ウェルプレートに２×１０4個播種したＨＥＫ２９３Ｔに、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６及びＴ２Ｒ１６－Ｇαの各プラスミドベクター０．１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用いて遺伝子導入した。３０時間培養後、実施例３（１）と同様の手法を用いてサリシンに対する応答強度を測定した（サリシンの添加後４０秒間における蛍光強度の最大値）。なお、実施例２のようなハイグロマイシンＢによる薬剤耐性スクリーニングは行っていない（一過性発現細胞）。
　さらに、比較例としてＴ２Ｒ１６－Ｇα発現細胞以外に、以下の細胞も作製し、サリシンに対する応答を測定した。
　Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３発現遺伝子及びｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５発現遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１　Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターに組込んだＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３ｇｕｓｔ発現ベクターとｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５発現ベクターを計０．１μｇ同時に遺伝子導入し一過性発現させた細胞（コトランスフェクション）；並びに
　実施例２と同様の手法を用いて作製したＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３安定発現株（ハイグロマイシンＢによる薬剤耐性スクリーニング済）に、０．１μｇのｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５発現ベクターを遺伝子導入し、一過性発現させた細胞（Ｇα　ｓｔａｂｌｅ）。
　結果を図４に示す。図４の結果から分かるように、一過性発現系においてもＧα－Ｔ２Ｒ１６がＴ２Ｒ１６－Ｇαと比較して高い応答強度を示し、さらに、既報の一過性発現系（コトランスフェクション及びＧα　ｓｔａｂｌｅ）と比較しても高い応答強度を示すことが確認された。
　実施例５　Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３及び苦味受容体Ｔ２Ｒ１６の発現量
　一般的にＩＲＥＳを介したｍＲＮＡの翻訳は、５’末端からのキャップ依存的な翻訳と比較して低効率と考えられている。本実施例では、キャップ依存的翻訳とＩＲＥＳ依存的翻訳に関し、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３及び苦味受容体Ｔ２Ｒ１６の発現量を調べた。
　（１）Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量
　実施例４で作製したＧα－Ｔ２Ｒ１６（本発明）、Ｔ２Ｒ１６－Ｇα、コトランスフェクションの一過性発現細胞に関し、Ｔ２Ｒ非依存的Ｇα１６作動薬であるイソプロテレノール（３μＭ）に対する応答強度を、実施例３の方法と同様に測定して比較した。その結果を図５に示す。
　イソプロテレノールに対する応答強度は、Ｇα１６の発現量に比例すると考えられる。図５に示されるように、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３がキャップ依存的に翻訳されるＧα－Ｔ２Ｒ１６、ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎと比較し、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３がＩＲＥＳを介して翻訳されるＴ２Ｒ１６－Ｇαの発現量が低いことが確認された。即ち、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量は、キャップ依存的＞ＩＲＥＳ依存的であることが示された。
　（２）Ｔ２Ｒ１６の発現量
　Ｔ２Ｒ１６－Ｇα、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６（本発明）及びｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６－Ｖ５のみ（Ｔ２Ｒ１６　ｓｉｎｇｌｅ）を一過性発現させた細胞を用い、Ｉｎ　ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ法によりＴ２Ｒ１６の発現量を比較した。Ｉｎ　ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡにはＩｎ　Ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＢＯＯ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、Ｔ２Ｒ１６の検出にはＣ末端に付加したＶ５エピトープを認識する抗Ｖ５－ＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。Ｔ２Ｒ１６の相対的発現量はＨＲＰ基質の発色を４５０ｎｍの吸光度を測定することで取得した。
　結果を図６に示す。この結果、Ｔ２Ｒ１６がＩＲＥＳを介して翻訳されるＧα－Ｔ２Ｒ１６のＴ２Ｒ１６発現量が、キャップ依存的にＴ２Ｒ１６が翻訳されるＴ２Ｒ１６－Ｇα及びＴ２Ｒ１６　ｓｉｎｇｌｅより高いことが確認された。即ち、Ｔ２Ｒ１６の発現量は、キャップ依存的＜ＩＲＥＳ依存的であることが示された。同様の結果は、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３よりもＴ２Ｒとの結合性が弱いＧα１６をもちいた場合にも得られた（データ示さず）。
　よって、本発明のＧα－Ｔ２Ｒ１６は、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３（及びＧα１６）、Ｔ２Ｒ１６共に高発現させることが示された。さらに、苦味受容体のＴ２Ｒ１６以外のサブタイプ（Ｔ２Ｒ４０及びＴ２Ｒ４３）でも同様の結果が観察された（データ示さず）。
　実施例６　Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株の保存安定性
　本実施例では、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株の凍結保存前後の応答強度を調べた。
　本実施例のＧα－Ｔ２Ｒ１６は、実施例２のＧα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株と同様に作成したが、発現ベクターとして、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用い、「ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６／Ｖ５」の代わりに、「ｓｓｒ／Ｔ２Ｒ１６」（Ｖ５無し）を挿入した。また、薬剤耐性スクリーニングは、ハイグロマイシンＢの代わりに１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで行った。
　比較例として、実施例２と同様の手法を用いて作製したＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３安定発現株（ピューロマイシンによる薬剤耐性スクリーニング済）に、さらに５μｇのｓｓｒ－Ｔ２Ｒ１６発現ベクターを遺伝子導入し、次いで、ピューロマイシンによる薬剤耐性スクリーニングを行うことにより作成した、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３安定発現＋Ｔ２Ｒ１６安定発現の安定発現細胞株（Ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔａｂｌｅ）を用いた。
　細胞株の凍結保存の前後に、実施例３と同様にサリシン（１又は０．１ｍＭ）に対する応答強度を調べた。凍結保存にはＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社）を用い、液体窒素下で、１ヶ月保存した。凍結保存後の応答強度は、凍結保存した細胞を常温に戻し、２回以上継代を行った後に測定した。結果を図７に示す。
　その結果、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株では凍結による影響はほとんど確認されなかった。これに対し、Ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔａｂｌｅは、凍結後に著しく応答強度が低下する細胞株が散見された。結果の一例を図７に示す。図７において、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６安定発現株では応答強度の凍結後／凍結前の比率がサリシン濃度１ｍＭ、０．１ｍＭのいずれの場合も、０、８以上であった。これに対し、Ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔａｂｌｅは０．６未満であった（特に、サリシン０．１ｍＭの場合０．４以下）。
　実施例７　Ｇα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株のＴ２Ｒ４０作動薬に対する応答強度とＧα作動薬に対する応答強度
　本実施例では、本発明のＧα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株について、Ｔ２Ｒ４０作動薬（ジフェニドール）に対する応答強度とＧα作動薬（イソプロテレノール）に対する応答強度の相関を調べた。
　実施例３（２）に記載の通り、実施例１、実施例２に記載の方法と同様の方法を用いてＧα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株を作製し、１５個クローニングした。１５個のクローンについて、イソプロテレノール（１０μＭ）及びジフェニドール（３００μＭ）に対する応答の相関を図８に示す。この結果、Ｔ２Ｒ４０作動薬であるジフェニドールとＧα１６作動薬であるイソプロテレノールへの応答に高い相関が得られた。
　よって、本発明のコンストラクトを用いる方法では、Ｔ２ＲあるいはＧαサブユニットのいずれかタンパク質に関する１回の評価のみで、ＧαサブユニットとＴ２Ｒの双方のタンパク質を発現する所望の細胞株を得ることができる。これに対し、従来法を用いる場合、ＧαサブユニットとＴ２Ｒの各タンパク質を発現する遺伝子を順に細胞に導入し、その度に、各タンパク質が安定して発現しているかを評価しながらスクリーニングを進める必要があった。具体的には、Ｇα安定発現株を作製しスクリーニング（評価１）後、Ｔ２Ｒタンパク質をコードする遺伝子を導入し、Ｇαタンパク質の（高）発現を維持しつつ（評価２）、かつＴ２Ｒタンパク質も（高）発現する（評価３）細胞株を取得する。即ち、所望の細胞株を得るのに３回の評価が必要である。
　本発明により、Ｇα－Ｔ２Ｒ４０安定発現株を得るための作業効率が著しく向上した。
　実施例８　甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＩＲＥＳを介した発現系１：Ｔ１Ｒ２の検討
　甘味受容体は、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３の２種類のサブユニットの組み合わせからなる代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である。本実施例では、甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＩＲＥＳを介した発現系のＴ１Ｒ２について検討した。
　（１）発現ベクターの作製
　ヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３、並びに、実施例１に記載のＩＲＥＳ及びＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３（Ｇα）を準備した。それらを以下の通り、ｐｃＤＮＡ３．１　Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のマルチクローニングサイトに挿入し、各コンストラクトを得た。
　コンストラクトＧα－Ｔ１Ｒ２
　　Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－Ｔ１Ｒ２／Ｖ５
　　コンストラクトＴ１Ｒ２－Ｇα
　　ｓｓｒ／Ｔ１Ｒ２／Ｖ５－ＩＲＥＳ－Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３
　コンストラクトＴ１Ｒ３
　　Ｔ１Ｒ３
　（２）Ｔ１Ｒ２の発現量
　実施例４に記載された方法と同様の方法により、Ｇα－Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）を得た。比較例として、Ｔ１Ｒ２－Ｇα及びＴ１Ｒ３を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３）を得た。
　実施例５（２）と同様の方法により、Ｉｎ　Ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＢＯＯ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いたＩｎ　ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ法によりＴ１Ｒ２の発現量を調べた。結果を図９に示す。Ｔ１Ｒ２の発現量は、「Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３」が「Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３」よりも高い傾向を示した。苦味受容体（Ｔ２Ｒ）の場合と同様に、キャップ依存的＜ＩＲＥＳ依存的であった。
　（３）Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量
　「Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３」と「Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３」について、実施例５（１）と同様の方法により、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量を調べた。Ｇα１６作動薬であるイソプロテレノールは１０μＭ用いた。図１０に示すように、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量は、Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３の方が高いことが示された。苦味受容体（Ｔ２Ｒ）の場合と同様に、キャップ依存的＞ＩＲＥＳ依存的であった。
　（４）Ｔ１Ｒ２作動薬に対する応答
　「Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３」と「Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３」について、Ｔ１Ｒ２作動薬に対する応答を調べた。アスパルテーム（１０ｍＭ）を添加し、添加後４０秒間における蛍光強度の最大値を取得した。測定開始時点の蛍光強度に対する蛍光強度の最大値の増加率を作動薬に対するＴ１Ｒ２の応答強度として算出した。
　比較例として、「Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３」の他に、「Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３及びＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の各タンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ含む３種類のベクターをコトランスフェクションした細胞（Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３＋Ｇα）」、並びに、「Ｔ１Ｒ２－ＧαとＴ１Ｒ３－Ｇαをコトランスフェクションした細胞（Ｔ１Ｒ２－Ｇα＋Ｔ１Ｒ３－Ｇα）」を用いた。図１１に示すように、「Ｇα－Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３」がＴ１Ｒ２作動薬に対する最も高い応答を示した。
　実施例９　甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＩＲＥＳを介した発現系２：Ｔ１Ｒ３の検討
　本実施例では、甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のＩＲＥＳを介した発現系のＴ１Ｒ３について検討した。
　（１）発現ベクターの作製
　ヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びヒト甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３、並びに、実施例１に記載のＩＲＥＳ及びＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３（Ｇα）を準備した。それらを以下の通り、ｐｃＤＮＡ３．１　Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のマルチクローニングサイトに挿入し、各コンストラクトを得た。
　コンストラクトＧα－Ｔ１Ｒ３
　　Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３－ＩＲＥＳ－ｓｓｒ／Ｔ１Ｒ３／Ｖ５
　　コンストラクトＴ１Ｒ３－Ｇα
　　ｓｓｒ／Ｔ１Ｒ３／Ｖ５－ＩＲＥＳ－Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３
　コンストラクトＴ１Ｒ２
　　Ｔ１Ｒ２
　（２）Ｔ１Ｒ３の発現量
　実施例４に記載された方法と同様の方法により、Ｇα－Ｔ１Ｒ３及びＴ１Ｒ２を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２）を得た。比較例として、Ｔ１Ｒ３－Ｇα及びＴ１Ｒ２を共遺伝子導入し、一過性発現させた細胞株（Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２）を得た。
　実施例５（２）と同様の方法により、Ｉｎ　Ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＢＯＯ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いたＩｎ　ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ法によりＴ１Ｒ３の発現量を調べた。結果を図１２に示す。「Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２」の方が「Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２」よりも、Ｔ１Ｒ３の発現量が多かった。Ｔ１Ｒ３の発現量は、キャップ依存的＜ＩＲＥＳ依存的であった。
　（３）Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量
　「Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２」と「Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２」について、実施例５（１）と同様の方法により、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量を調べた。Ｇα１６作動薬であるイソプロテレノールは１０μＭ用いた。図１３に示すように、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の発現量は、Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２の方が高く、苦味受容体（Ｔ２Ｒ）の場合と同様に、キャップ依存的＞ＩＲＥＳ依存的であった。
　実施例９（２）の結果と併せると、本発明のＧα－Ｔ１Ｒ３は、Ｔ１Ｒ３、Ｇα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３共に高発現させることが示された。
　（４）Ｔ１Ｒ３作動薬に対する応答
　「Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２」と「Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２」について、Ｔ１Ｒ３作動薬に対する応答を調べた。シクラメート（１０ｍＭ）を添加し、添加後４０秒間における蛍光強度の最大値を取得した。測定開始時点の蛍光強度に対する蛍光強度の最大値の増加率を作動薬に対するＴ１Ｒ３の応答強度として算出した。
　比較例として、「Ｔ１Ｒ３－Ｇα＋Ｔ１Ｒ２」の他に、「Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３及びＧα１６／Ｇαｇｕｓｔ４３の各タンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ含む３種類のベクターをコトランスフェクションした細胞」、並びに、「Ｔ１Ｒ２－ＧαとＴ１Ｒ３－Ｇαを異那須フェクトした細胞」を用いた。図１４に示すように、「Ｇα－Ｔ１Ｒ３＋Ｔ１Ｒ２」がＴ１Ｒ３作動薬に対する最も高い応答を示した。
　実施例１０　ＩＲＥＳを介したタンパク質の発現
　ＩＲＥＳがタンパク質の発現量に与える効果を調べるために、ＧＰＣＲタンパク質以外のタンパク質をＩＲＥＳの上流及び下流で発現させた。タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）（塩基配列：配列番号７８（ＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＥＵ０５６３６３．１）；アミノ酸配列：配列番号７９）を用いた。ｐｃＤＮＡベクターに以下のＡ－Ｄの核酸配列を含むコンストラクトを作製し、細胞株ＨＥＫ２９３Ｔに遺伝子導入し、一過性発現させた。
　Ａ：　ｓｓｒ－　ＥｍＧＦＰ　－　ＩＲＥＳ－　Ｇα
　Ｂ：　ＥｍＧＦＰ　－　ＩＲＥＳ　－　Ｇα
　Ｃ：　Ｇα　－　ＩＲＥＳ　－　ｓｓｒ　－　ＥｍＧＦＰ
　Ｄ：　Ｇα　－　ＩＲＥＳ　－　ＥｍＧＦＰ
　コントロール：　挿入遺伝子を含まないｐｃＤＮＡベクター
　４８７ｎｍの波長で励起し、５０９ｎｍの波長の蛍光強度を測定した。蛍光強度はＥｍＧＦＰの発現量に比例する。結果を図１５に示す。ＥｍＧＦＰ遺伝子がＩＲＥＳ上流に配置された場合（Ａ、Ｂ）の方が下流に配置した場合（Ｃ、Ｄ）よりも、ＥｍＧＦＰタンパク質の発現量が高かった。ＥｍＧＦＰタンパク質の発現量は、Ｇαタンパク質と同様にキャップ依存的＞ＩＲＥＳ依存的であった。
　実施例１１　ｐＥＡＫ１０－Ｔ２Ｒ１６－ＧαおよびｐＥＡＫ１０－Ｇα－Ｔ２Ｒ１６を一過性発現させた細胞におけるＴ２Ｒ１６発現量
　本実施例では、ｐＥＡＫ１０－ＩＲＥＳ－Ｔ２Ｒ１６－ＧαおよびｐＥＡＫ１０－Ｇα－ＩＲＥＳ－Ｔ２Ｒ１６を導入し、一過性発現させたＨＥＬ２９３Ｔ細胞におけるＴ２Ｒ１６発現量を調べた。以下、実施例１１－１５において、「ＩＲＥＳ」の記載を省略する場合がある。
　Ｔ２Ｒ１６－ＩＲＥＳ－Ｇα、Ｇα－ＩＲＥＳ－Ｔ２Ｒ１６をコードする遺伝子配列を、ｐＥＡＫ１０ベクター（Ｅｄｇｅ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にサブクローニングし、発現ベクターｐＥＡＫ１０－Ｔ２Ｒ１６－ＧαおよびｐＥＡＫ１０－Ｇα－Ｔ２Ｒ１６を作製した。ｐＥＡＫ１０ベクターは、ＥＦ１αプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである。作製した発現ベクターを実施例４と同様の方法によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、これらを一過性発現させた細胞を作製した。
　実施例５（２）と同様の手法を用いて、Ｉｎ　ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ法により一過性発現細胞のＴ２Ｒ１６の発現量を評価した。コントロールとして、遺伝子を挿入していないｐＥＡＫ発現ベクタ－を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。検出には実施例５（２）と同様に、Ｃ末端に付加したＶ５エピトープを認識する抗Ｖ５－ＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。
　図１６に示されるように、発現ベクターｐＥＡＫ１０－Ｇα－Ｔ２Ｒ１６を導入した細胞が、発現ベクターｐＥＡＫ１０－Ｔ２Ｒ１６－Ｇαを導入した細胞より高いＴ２Ｒ１６発現量を示した。このことから、本発明の効果はプロモーターや非翻訳領域といったベクター固有の遺伝子配列に影響を受けないことが示された。
　実施例１２　苦味物質に対する一過性発現細胞の応答測定（２）
　本実施例では、７種類のＴ２Ｒサブタイプ（苦味受容体）に関し、苦味物質に対する一過性発現細胞の応答測定を行った。
　実施例４における、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６のＴ２Ｒ１６をコードする遺伝子の代わりに、表５に示す７種類のＴ２Ｒサブタイプをコードする遺伝子の各々を含む７種類の発現ベクターを作製し、実施例４と同様の方法により、各サブタイプに対する既知作動薬（表５）に対する一過性発現細胞の応答を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　その結果、いずれのＴ２Ｒサブタイプも作動薬に対する応答を示した（図１７）。
　実施例１３　苦味物質に対する安定発現細胞の応答測定（２）
　本実施例では、Ｔ２Ｒ３８サブタイプ（苦味受容体）に関し、苦味物質に対する安定発現細胞の応答測定を行った。
　実施例１、２におけるＧα－Ｔ２Ｒ１６のＴ２Ｒ１６をコードする遺伝子の代わりに、Ｔ２Ｒ３８サブタイプ（苦味受容体）をコードする遺伝子を含む発現ベクターＧα－Ｔ２Ｒ３８を作製し、実施例１、２と同様の方法により安定発現株を作製した。
　続いて実施例３と同様の方法を用いて、Ｔ２Ｒ３８の既知の作動薬６－ｎ－プロピルチオウラシル（１０００μＭ，３００μＭ）に対する応答を測定した。コントロールとして、発現ベクターＧα－Ｔ２Ｒ３８を組み込まない細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ）を用いた。その結果、６－ｎ－プロピルチオウラシル（１０００μＭ，３００μＭいずれも場合も）に対する応答を示した（図１８）。
　実施例１４　苦味受容体の一過性発現細胞における発現量
　本実施例では１４種類のＴ２Ｒサブタイプ（苦味受容体）の一過性発現細胞における発現量を調べた。
　実施例４における、Ｇα－Ｔ２Ｒ１６のＴ２Ｒ１６をコードする遺伝子の代わりに、表６に示す１４種類のＴ２Ｒサブタイプの遺伝子の各々をコードする遺伝子を含む１４種類の発現ベクターを作製し、実施例４と同様の方法により各Ｔ２ＲおよびＧαをそれぞれ一過性発現させた細胞を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　次いで、実施例５（２）と同様の手法を用いたＩｎ　ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ法により各細胞のＴ２Ｒの発現量を測定した。得られた各Ｔ２Ｒの発現量を、実施例１２にて既知の作動薬への応答が確認されたＧα－Ｔ２Ｒ４の一過性発現細胞のＴ２Ｒ４発現量と比較した。その結果、１４種類全てにおいてＴ２Ｒ４以上のＴ２Ｒ発現量を示した（図１９）。この結果から、１４種類のＴ２Ｒ全てにおいて応答測定を行うに十分なＴ２Ｒ発現量を有していることが示された。
　実施例１５　嗅覚受容体の一過性発現細胞における応答測定と発現量
　本実施例では、嗅覚受容体（ＯＲ３Ａ１）の一過性発現細胞における応答測定と発現量を調べた。
　実施例１と同様の方法により、ＯＲ３Ａ１のＮ末端にヒトロドプシンのＮ末端２１アミノ酸（Ｒｈｏ）を付加したＲｈｏ－ＯＲ３Ａ１、並びにＧαｏｌｆをコードする遺伝子をＩＲＥＳと共にｐｃＤＮＡベクターに導入した発現ベクターＯＲ３Ａ１－ＧαｏｌｆおよびＧαｏｌｆ－ＯＲ３Ａ１を作製した。これらの発現ベクターを用いて、実施例４と同様の方法によりＨＥＫ２９３Ｔに一過性発現させた細胞を作製した。コントロールとして、ＯＲ３Ａ１、Ｇαｏｌｆの各遺伝子を個別にｐｃＤＮＡに導入し、ＨＥＫ２９３Ｔ２９３Ｔに共遺伝子導入したものを用いた。
　次いで、作製した細胞上にＯＲ３Ａ１に対する既知の作動薬であるヘリオナールを添加した（１００μＭ、３０μＭ）。ヘリオナールの添加より２０分後ＯＲ３Ａ１の応答に伴い産生されたｃＡＭＰの量を、ｃＡＭＰ－ＧｌｏＭａｘ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた発光測定により検出した。その結果、発現ベクターＧαｏｌｆ－ＯＲ３Ａ１を導入した細胞で、１００μＭのヘリオナールの添加に伴いｃＡＭＰの増加を示した。発現ベクターＯＲ３Ａ１－Ｇαｏｌｆを導入した場合、ＯＲ３Ａ１、Ｇαｏｌｆの各遺伝子を個別に導入した場合は、いずれもヘリオナールの添加に伴う応答（ｃＡＭＰの増加）は観察されなかった（図２０）。
　さらに、Ｒｈｏ－ＯＲ３Ａ１とＧαｏｌｆの発現量を抗Ｒｈｏ抗体（Ｍｅｒｃｋ）および抗Ｇαｏｌｆ抗体（ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ）を用いたＩｎ　Ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡにより比較した。コントロールとしては、いずでの遺伝子も挿入していないｐｃＤＮＡを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。その結果、Ｇαｏｌｆ－ＯＲ３Ａ１を導入した細胞の方が、ＯＲ３Ａ１－Ｇαｏｌｆを導入した細胞と比較して高いＧαｏｌｆ、ＯＲ３Ａ１発現量を示した（図２１）。

Claims (23)

  1. 　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットを発現するためのコンストラクトであって、単一ベクター中に、５’側から順に、Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質をコードする核酸、ＩＲＥＳ配列を含む核酸、そして、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸を含む、前記コンストラクト。
  2. 　Ｇタンパク質共役受容体若しくはそのサブユニットが、ロドプシン様受容体のクラス又は代謝性グルタミン酸受容体／代謝性フェロモン受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である、請求項１のコンストラクト。
  3. 　Ｇタンパク質共役受容体が、ロドプシン様受容体のクラスのＧタンパク質共役受容体である、請求項１のコンストラクト。
  4. 　Ｇタンパク質共役受容体が、苦味受容体である、請求項１のコンストラクト。
  5. 　ベクターがプラスミドベクターである、請求項１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  6. 　ベクターが、ＣＭＶプロモーターを含むプラスミドベクターである、請求項１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  7. 　ベクターが、ＣＭＶプロモーター及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである、請求項１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  8. 　ベクターが、ＥＦ１αプロモーターを含むプラスミドベクターである。請求項１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  9. 　ベクターが、ＥＦ１αプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターである。請求項１－４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  10. 　ＩＲＥＳ配列が、タイプ２のＩＲＥＳ配列である、請求項１－９のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  11. 　ＩＲＥＳ配列が、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ配列である、請求項１－１０のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  12. 　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットをコードする核酸の５’側に、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高める機能を有するポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１－７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  13. 　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質若しくはそのサブユニットの細胞膜への移行を高めるポリペプチドが、ラットのソマトスタチン受容体のＮ末端４５アミノ酸を含むポリペプチド、又はウシのロドプシンのＮ末端３９アミノ酸を含むポリペプチドである、請求項１２のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  14. 　Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ＧｑファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｉファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、ＧｓファミリーのＧタンパク質αサブユニットタンパク質、あるいは、これらのキメラタンパク質である、請求項１－１３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  15. 　Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、Ｇα１６、Ｇαｇｕｓｔ又はＧαｏｌｆ、あるいは、これらのキメラタンパク質である、請求項１－１４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  16. 　Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔである、請求項１－１５のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  17. 　Ｇタンパク質αサブユニットタンパク質が、ヒトＧα１６／ラットＧαｇｕｓｔ４３である、請求項１６に記載のコンストラクト。
  18. 　Ｇタンパク質共役受容体タンパク質が、ヒトのＧタンパク質共役受容体タンパク質である、請求項１－１７のいずれか１項に記載のコンストラクト。
  19. 　請求項１－１８のいずれか１項に記載のコンストラクトを遺伝子導入した形質転換細胞。
  20. 　請求項１９に記載の形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法。
  21. 　物質が、苦味物質、匂い物質、旨味物質又は甘味物質、あるいはこれらの物質に対する調節物質である、請求項２０の測定方法。
  22. 　物質の生理的応答を測定するための、請求項１９に記載の形質転換細胞の使用。
  23. 　請求項１９記載の形質転換細胞を含む、当該形質転換細胞に物質を添加し、当該物質による生理的応答を測定する、物質の生理的応答の測定方法に使用するためのキット。
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