WO2011067971A1 - 甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質 - Google Patents

甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質 Download PDF

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WO2011067971A1
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sweet taste
sweetness
human
receptor
acting
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PCT/JP2010/065367
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啓子 阿部
巧 三坂
藤原　聡
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長谷川香料株式会社
国立大学法人東京大学
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    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Definitions

  • the present invention relates to a sweet taste-regulating substance acting on a human sweet receptor for a sweet substance, and more specifically, a cultured cell line in which both a human sweet receptor (hT1R2 + hT1R3) and a G protein ⁇ subunit are functionally and stably expressed is used.
  • the present invention relates to a human sweetness receptor-acting sweetness regulating substance for sweetening substances, which is obtained by objectively evaluating sweetness intensity.
  • Taste is a sensation that occurs when a substance binds to specific receptors present on the surface of the tongue, especially when the substance is put into the mouth.
  • Mammalian taste is composed of five basic tastes, namely salty taste, sour taste, sweet taste, umami taste, and bitter taste, and these basic tastes are thought to be formed by integration.
  • saltiness and sourness are said to be detected through several ion channel receptors expressed on the cell membrane on the proximal side of taste cells present in the taste buds on the tongue surface, especially Regarding sourness, it is considered that an ion channel type receptor composed of PKD2L1 + PKD1L3, which is a TRP channel family, functions.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • the G protein is composed of three subunits, ⁇ , ⁇ , and ⁇ .
  • the state in which the three subunits ⁇ , ⁇ , and ⁇ are bound is inactive.
  • GDP guanosine 5 ′ diphosphate
  • sweetness has a characteristic that the minimum sensitivity (threshold value) is higher than other basic tastes, and it is difficult to detect in a small amount.
  • the sweetness is too strong, unhealthy images such as high calories and obesity are induced. Therefore, when producing a food or drink with sweetness, it is important to adjust the intensity of sweetness so that the sweetness can be perceived by humans and is preferably accepted.
  • Flavors have been used to improve the flavor of foods and drinks.
  • Flavor is a perceptual psychological sensation sensed from taste, smell, and the like. Flavors are also used to enhance the intensity of sweetness, and examples of flavors that have actually been confirmed to have an effect of enhancing sweetness include ethyl butyrate, ethyl vanillin, sedanenolide, and alapyridine.
  • the flavor improving effect by flavor is considered to be an action through the olfactory sensation by the flavor of the flavor.
  • the flavor improving effect of flavor has been conventionally verified mainly by human sensory evaluation.
  • sensory evaluation information sensed from taste and olfaction is evaluated in an integrated manner, so it is difficult to verify whether the flavor acts on the taste and brings about a taste improvement effect.
  • sensory evaluation or sensory test cannot ignore the variation in evaluation between well-trained evaluators (called panels or panelists).
  • sweetness is a central taste in determining palatability of foods and drinks
  • a substance that acts on a sweet taste receptor to enhance sweetness can be identified.
  • beneficial effects such as improvement in taste of foods and drinks, pharmaceuticals, etc., reduction in the amount of sweetener used, and reduction in calorie intake can be achieved. Therefore, there is a great deal of interest in such sweetness-enhancing substances from industries such as foods and beverages and flavors.
  • Patent Document 2 also discloses a stable HEK-expressing hT1R2-1 domain comprising hT1R2N-terminal extracellular domain and hT1R1C-terminal 7-transmembrane domain, hT1R3, and chimeric G protein G16-t25. 293 cells, and a stable HEK-293 cell that stably expresses hT1R1 and the domain named hT1R1-2, consisting of the hT1R1 extracellular domain and the hT1R2C-terminal seven-transmembrane domain, hT1R3, and the chimeric G protein G16g44. It is described as being useful in assays for identifying taste modifiers.
  • Patent Document 3 discloses cells transfected with HEK-293T cells expressing G ⁇ 16gust44 with a linearized pcDNA4-T0 vector containing cDNA encoding human receptor protein T1R2-TMD or CSR: T1R chimeric receptor. An assay has been described that uses the system to identify sweetness enhancers.
  • JP 2008-13570 A Special table 2009-517003 WO2007-121604
  • the efficiency of introduction of each vector into the cell is not the same, either of them may be introduced preferentially, and the introduced target gene may be introduced into the cell's genome. Inserted at random, and in extreme cases, the introduced target gene may be inserted into an inactive portion of the genome that is not transcribed. Therefore, in the conventional cell system, a certain amount of G protein is expressed, and the expression level is not so different between cells, but the expression level and expression ratio of hT1R2 and hT1R3 are between cells. Large variations were observed.
  • hT1R2 and hT1R3 are not expressed, and some of them do not substantially have a series of intracellular signal transduction mechanisms. It was not a functional cell line.
  • conventional sweet receptor-expressing cell lines do not reflect human sweet taste response mechanisms and are not appropriate models for screening for sweet taste modulators that act on sweet receptors. Therefore, even if a candidate substance for a sweet taste modulator is screened using a sweet receptor-expressing cell line prepared by a conventional method, the selected substance actually acts on the human sweet taste receptor to control the sweet taste. It could not be said that the substance has been verified to be effective.
  • the present invention provides a human sweetness receptor for sweet substances whose sweet taste-regulating effect is objectively confirmed by an assay using stable cultured cells that equally express hT1R2 and hT1R3. It is an object to provide an active sweet taste regulator.
  • the present inventors encode stable cultured cells that express hT1R2 and hT1R3 equally high, specifically, hT1R2 and hT1R3, and G protein ⁇ subunit.
  • An in vitro test system using cultured cells in which an expression construct with cDNA inserted in the same plasmid is introduced into a given cell and expressed is provided with a receptor system close to taste cells that feel sweetness.
  • the present inventors have found that the model is very suitable for selecting a sweet taste-regulating substance that acts on a receptor, and based on this finding, the present invention has been completed.
  • the present invention provides an expression construct obtained by inserting each cDNA encoding hT1R2 and hT1R3 and the G protein ⁇ subunit into the same plasmid, and has one FRT (Flippase Recognition Target) site in the genomic DNA.
  • the present invention provides a human sweetness receptor-acting sweetness-regulating substance for sweet substances identified by measurement of physiological responses with sweet substances using cultured cell lines introduced and expressed in incorporated 293 cells. .
  • the present invention can provide a human sweet taste receptor-acting sweet taste regulating substance whose sweetness regulating effect via human sweet taste receptor is objectively confirmed, and can be applied to various foods and drinks to improve taste, It is possible to obtain beneficial effects such as saving sweeteners, reducing calories, and reducing caries.
  • pcDNA5 / FRT The structure of pcDNA5 / FRT (Invitrogen) is shown. Downstream of the EF-1 ⁇ promoter, it has a sequence in which a cDNA encoding hT1R2 and a cDNA encoding hG16gust44 are inserted by inserting an IRES sequence, and hT1R3 is encoded downstream of the CMV promoter downstream of this sequence.
  • 1 shows the structure of pcDNA5 / FRT (Invitrogen) into which a sequence obtained by inserting an IRES sequence and a cDNA encoding hG16gust44 is inserted.
  • sucrose concentration-response curve when neohesperidin dihydrochalcone, cyclamate, p-methoxycinnamic aldehyde, and cycloten are administered at a predetermined concentration to cells expressing hT1R2, hT1R3, and hG16gust44 with respect to sucrose.
  • FIG. 4 is an aspartame concentration-response curve when neohesperidin dihydrochalcone is administered to aspartame at a predetermined concentration in cells expressing hT1R2, hT1R3 and hG16gust44.
  • 5 is a stevia concentration-response curve when neohesperidin dihydrochalcone is administered to stevia at a predetermined concentration to cells expressing hT1R2, hT1R3 and hG16gust44. It is a saccharin concentration-response curve when neohesperidin dihydrochalcone is administered to saccharin at a predetermined concentration to cells expressing hT1R2, hT1R3 and hG16gust44.
  • a human sweetness receptor-acting sweetness regulating substance for a sweetness substance is obtained by acting on a human sweetness receptor (hT1R2 + hT1R3) by coexistence with a specific sweetness substance.
  • human sweetness receptor-acting sweetness-enhancing substances that increase the intensity of sweetness by increasing the physiological response of the sweetener from the human sweetness receptor, reducing the physiological response and increasing the intensity of sweetness Examples include human sweetness receptor-acting sweetness-inhibiting substances that are decreased.
  • human sweet taste receptor-acting sweet taste regulating substances those which are themselves sweet substances are also included.
  • the sweet substance that is subject to sweetness regulation by the human sweetness receptor-acting sweet taste regulating substance of the present invention, as long as it is a substance capable of exhibiting sweetness that can be sensed by humans.
  • the human sweet receptor is a hetero-oligomeric receptor constructed by combining two subunits of hT1R2 and hT1R3, and all parts of each subunit, that is, seven transmembrane regions and All regions of the transmembrane domain consisting of the corresponding cytoplasm and extracellular loop, Venus fly trap domain, high cysteine domain and C-terminal domain are included.
  • human sweetness receptor-acting sweet taste-enhancing substance of the present invention include neohesperidin dihydrochalcone (NHDC) (Chemical Formula 1), cyclamate (Chemical Formula 2), p-methoxycinnamic aldehyde (Chemical Formula 3), cycloten (Chemical formula 4) is exemplified.
  • NHDC neohesperidin dihydrochalcone
  • Cyamate Chemical Formula 2
  • p-methoxycinnamic aldehyde Chemical Formula 3
  • cycloten Chemical formula 4
  • human sweetness receptor-acting sweetness suppressing substance of the present invention examples include lactisol (Chemical Formula 5), vanillin (Chemical Formula 6), ethyl vanillin (Chemical Formula 7), Creosol (Chemical Formula 8), and maltol (Chemical Formula 9). ) Is exemplified. The chemical structure of each substance is shown below.
  • the human sweet taste receptor-acting sweet taste enhancer of the present invention is a preparation comprising the human sweet taste receptor-acting sweet taste enhancing substance of the present invention as an active ingredient, and the potentiating substance may be used directly or as necessary. Accordingly, it may be used by dissolving in an appropriate liquid or mixed with a powder, and if necessary, an emulsifier, a suspending agent, a stabilizer and the like are appropriately added and used. The concentration of the active ingredient may be appropriately determined in consideration of the desired degree of sweetness.
  • the human sweet taste receptor-acting sweetness suppressant of the present invention is a preparation comprising the human sweetness receptor-acting sweet taste suppressing substance of the present invention as an active ingredient, and the enhancing substance may be used directly as it is or necessary. Accordingly, it may be used by dissolving in an appropriate liquid or mixed with a powder, and if necessary, an emulsifier, a suspending agent, a stabilizer and the like are appropriately added and used.
  • concentration of the active ingredient may be appropriately determined in consideration of the desired degree of sweetness.
  • the human sweet taste receptor-acting sweet taste-regulating substance of the present invention comprises an expression construct obtained by inserting each cDNA encoding hT1R2 and hT1R3 and the G protein ⁇ subunit into the same plasmid, and FRT (Flipase) in the genomic DNA.
  • Each cDNA encoding hT1R2 and hT1R3 and G protein ⁇ subunit may be obtained by any method.
  • a method of cloning cDNA from mRNA encoding the protein, chemistry based on known nucleotide sequence information It can be obtained by a known method such as synthesis or a method of isolating and splicing genomic DNA.
  • Other various genes used in the present invention can be obtained in the same manner.
  • cDNA means complementary DNA and is a reverse transcription reaction product of mRNA transcript.
  • Examples of the cDNA encoding the G protein ⁇ subunit include cDNA encoding G15, hG16, or a variant obtained by modifying a part of the sequence.
  • cDNA encoding hG16gust44 is preferable from the viewpoint that it can efficiently carry out information transmission with an intracellular effector.
  • hG16gust44 is a chimeric G protein in which the C-terminal portion 44 amino acid residues of human G ⁇ 16 are replaced with Ggust.
  • an expression construct refers to a DNA fragment obtained by linking a desired coding sequence and an appropriate nucleic acid sequence such as a promoter, terminator, marker gene, and gene encoding an FRT site necessary for expressing the coding sequence,
  • an appropriate nucleic acid sequence such as a promoter, terminator, marker gene, and gene encoding an FRT site necessary for expressing the coding sequence
  • the promoter functioning as a transcription initiation signal is not limited as long as it has a function of expressing a gene to be introduced in the 293 cells, and examples thereof include CMV (cytomegalovirus), EF-1 ⁇ , SR ⁇ , CAG and the like.
  • the An example of the terminator that is a nucleic acid sequence that terminates transcription is SV40 pA.
  • SV40 pA is contained on a 237 bp BamHI / BcII restriction fragment, resulting in both termination and polyadenylation, and many are derived from bovine growth hormone (BGH).
  • Marker genes that are introduced as a marker for confirming that the target gene has been introduced include hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, chloramphenic acid.
  • An example is a call resistance gene.
  • the gene encoding the FRT site corresponds to the base sequence of 2087-2147 disclosed in pFRT ⁇ GAL (STRATAGE, protocol, SEQUENCE AND SITES, Catalog # 218403, May 28, 1991).
  • hT1R2, hT1R3, and G protein ⁇ subunit can be expressed in 293 cells in which one FRT site is incorporated in the genomic DNA.
  • FRT site is incorporated in the genomic DNA.
  • Specific examples include pFRT / lacZeo, pUC12, pUC13, pUC19, pBR322, pBR325, pSH15, pSH19, pUB110, and pC194.
  • pcDNA5 / FRT (5070 bp, Invitrogen) in which a hygromycin B resistance gene is arranged at one end of the gene encoding the FRT site is preferably used as the plasmid.
  • pcDNA5 / FRT (Invitrogen) has a hygromycin B resistance gene, and when recombination occurs at the FRT site of a host cell having an FRT site, it becomes hygromycin B resistant and zeocin sensitive, whereas the FRT site contains When it is incorporated into another site without being incorporated, it becomes hygromycin B sensitive, so it can be easily distinguished whether or not the target gene has been incorporated into the FRT site.
  • the structure of pcDNA5 / FRT (5070 bp, Invitrogen) is shown in FIG.
  • cDNA encoding hT1R2 and cDNA encoding hG16gust44 are downstream of the EF-1 ⁇ promoter.
  • a sequence in which an IRES sequence is inserted and a cDNA encoding hT1R3 and a cDNA encoding hG16gust44 are inserted downstream of the CMV promoter downstream of this sequence is inserted.
  • PcDNA5 / FRT Invitrogen is preferred (FIG. 2).
  • hT1R2, hT1R3, and hG16gust44 can be expressed at the same time, and a cultured cell line that is highly sensitive to a ligand that acts on a sweet receptor can be obtained. is there.
  • an EcoRV recognition sequence is placed immediately below the recognition sequence (base numbers 12-17) of the restriction enzyme Bgl II of pcDNA5 / FRT (Invitrogen) (base numbers 18-23).
  • the aspect to introduce is mentioned.
  • This embodiment can be carried out, for example, by following the following sub-steps (a1) to (a5).
  • (A1) Design and prepare a sense primer having a Bgl II recognition sequence (5′-AGATCT-3 ′) at the 5 ′ end and an EcoRV recognition sequence immediately below it.
  • an antisense primer having a sequence in the BGH pA sequence is designed and produced.
  • A2 A sequence obtained by performing polymerase chain reaction (PCR) using pcDNA5 / FRT (Invitrogen) as a template using the sense primer and antisense primer prepared in (a1), and linking the recognition sequences of Bgl II and EcoRV A DNA fragment containing is amplified.
  • A3 The DNA fragment amplified in (a2) is digested with Bgl II and Not I.
  • pcDNA5 / FRT Invitrogen
  • step (B) The cDNA encoding hT1R3 is inserted into the multicloning site (base numbers 895-1010) of the vector prepared in step (a).
  • This step (b) can be carried out, for example, by following the following substeps (b1) to (b8).
  • (B1) A sense primer having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and immediately after the coding region of hT1R3, Design and create antisense primers.
  • PCR is performed using a sequence containing a cDNA sequence encoding hT1R3 as a template to amplify the cDNA encoding hT1R3.
  • B3 The cDNA fragment encoding hT1R3 obtained in (b2) is digested with restriction enzymes Asc I and Not I.
  • B4 pEAK10 (Edge Biosystems) is digested with restriction enzymes Asc I and Not I.
  • the cDNA fragment encoding hT1R3 obtained in (b3) and pEAK10 (Edge Biosystems) obtained in (b4) were combined with Ligation high Ver.
  • the cDNA encoding hT1R3 is inserted into pEAK10 (Edge Biosystems) by ligation by ligation reaction such as 2 (TOYOBO).
  • pEAK10 Edge Biosystems obtained in (b5) is digested with restriction enzymes Hind III and Not I, the DNA fragments are separated by agarose electrophoresis, and the hT1R3 cDNA fragment is purified.
  • the vector prepared in (a5) is digested with Hind III and Not I.
  • the cDNA fragment encoding hT1R3 obtained in (b6) and the vector obtained in (b7) were combined with Ligation high Ver.
  • the cDNA encoding hT1R3 is inserted into the multicloning site of the vector prepared in (a5) by binding by ligation reaction such as 2 (TOYOBO).
  • C A vector (IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK (-) having a sequence (IRES2-hG16gust44 sequence) in which an IRES sequence and cDNA encoding hG16gust44 are inserted into pBluescript II SK (-). )).
  • An IRES sequence refers to a sequence that encodes an internal ribosome entry site. This step (c) can be carried out, for example, by following the following sub-steps (c1) to (c11).
  • C1 A sense primer having an Eco52I recognition sequence (5′-CGGCCG-3 ′) immediately before the IRES sequence is designed and prepared.
  • an antisense primer corresponding to the end of the IRES sequence is designed and produced.
  • C2 Using the sense primer and antisense primer prepared in (c1), PCR is performed using pIRES2-EGFP (Clontech) as a template to amplify the IRES sequence. Note that EGFP is an abbreviation of Enhanced Green Fluorescence Protein.
  • C3 A sense primer and an antisense primer having a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) are designed and prepared immediately before and after the coding region of hG16gust44, and a cDNA sequence encoding hG16gust44 is prepared. PCR is performed using the contained sequence as a template, and a cDNA encoding hG16gust44 is amplified. Amplified fragment Digest with I.
  • C4 pEAK10 (Edge Biosystems) is digested with Not I.
  • C5 The cDNA fragment encoding hG16gust44 obtained in (c3) and pEAK10 (Edge Biosystems) obtained in (c4) were combined with Ligation high Ver. 2 (TOYOBO) and the like, and a vector (hG16gust44 / pEAK10) in which cDNA encoding hG16gust44 is inserted into pEAK10 (Edge Biosystems) is prepared.
  • C6 An 18-base sense primer containing the start codon of hG16gust44 is designed and prepared.
  • an antisense primer having a sequence in the hGH pA sequence is designed and produced.
  • C7 Using hG16gust44 / pEAK10 obtained in (c5) as a template, PCR is performed using the sense primer and antisense primer prepared in (c6) to amplify cDNA encoding hG16gust44.
  • C8 The IRES sequence obtained in (c2) is digested with Eco52I.
  • C9 The cDNA encoding hG16gust44 obtained in (c7) is digested with NotI.
  • C10) pBluescript II SK ( ⁇ ) is digested with Not I.
  • the IRES sequence obtained in (c8), the cDNA fragment encoding hG16gust44 obtained in (c9), and the pBluescript II SK (-) obtained in (c10) were ligated to Ver.
  • the IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK (-) is prepared by ligation reaction using 2 (TOYOBO) or the like.
  • step (D) The sequence (IRES2-hG16gust44 sequence) in which the IRES sequence and the cDNA encoding hG16gust44 are linked is inserted immediately after the DNA sequence encoding hT1R3 of the vector prepared in step (b).
  • This step (d) can be carried out, for example, by following the following substeps (d1) to (d3).
  • (D1) The IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK ( ⁇ ) prepared in (c11) is digested with Eco52I, the cDNA fragment is separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hG16gust44 sequence is purified.
  • the vector prepared in (b8) is digested with Not I, and the portion immediately after the DNA sequence encoding hT1R3 in the vector is cleaved.
  • D3 The IRES2-hG16gust44 sequence obtained in (d1) and the vector obtained in (d2) were combined with Ligation high Ver.
  • the IRES2-hG16gust44 sequence is inserted immediately after the DNA sequence encoding hT1R3 of the vector prepared in (b8) after ligation by 2 (TOYOBO) or the like. This results in pcDNA5 / FRT containing the hT1R3-IRES2-hG16gust44 sequence.
  • E The cDNA encoding hT1R2 is inserted into pEAK10 (Edge Biosystems). This step can be performed, for example, by following the following substeps (e1) to (e5).
  • E1 A sense primer having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and after the coding region of hT1R2, respectively. Design and create antisense primers.
  • E2 Using the sense primer and antisense primer prepared in (e1), PCR is performed using a sequence containing a DNA sequence encoding hT1R2 as a template to amplify a cDNA encoding hT1R2.
  • E3 The cDNA encoding hT1R2 obtained in (e2) is digested with Asc I and Not I.
  • E4 pEAK10 (Edge Biosystems) is digested with Asc I and Not I.
  • E5 The cDNA fragment encoding hT1R2 obtained in (e3) and pEAK10 (Edge Biosystems) obtained in (e4) were combined with Ligation high Ver.
  • the cDNA encoding hT1R2 is inserted into pEAK10 (Edge Biosystems) by ligation by ligation reaction such as 2 (TOYOBO).
  • the IRES2-hG16gust44 sequence is inserted immediately after the DNA sequence encoding hT1R2 of the vector prepared in step (e). This step can be performed, for example, by following the following substeps (f1) to (f3).
  • F1 The IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK ( ⁇ ) prepared in (c11) is digested with Eco52I, the cDNA fragment is separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hG16gust44 sequence is purified.
  • the vector obtained in (e5) is digested with Not I, and the portion immediately after the cDNA encoding hT1R2 in the vector is cleaved.
  • step (G) The vector obtained in step (d) is digested with EcoRV, and the hT1R2-IRES2-hG16gust44 sequence obtained in step (f) is inserted upstream of the hT1R3-IRES2-hG16gust44 sequence, and hT1R2 and An expression construct is obtained in which each cDNA encoding hT1R3 and the G protein ⁇ subunit is inserted into the same plasmid.
  • a preferable example of the expression construct is that the EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-IRES2-hG16gust44-hGH pA sequence of the vector prepared in (f3) is located upstream of the hT1R3-IRES2-hG16gust44 sequence of the vector prepared in (d3).
  • the inserted expression construct ie, a CMV promoter having a sequence in which a cDNA encoding hT1R2 and a cDNA encoding hG16gust44 are inserted and inserted downstream of the EF-1 ⁇ promoter with the IRES sequence inserted.
  • This step (g) can be carried out, for example, by following the following substeps (g1) to (g3).
  • (G1) A primer for performing the In-Fusion reaction is designed and prepared, and the region of EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-IRES2-hG16gust44-hGH pA is used using the vector prepared in (f3) as a template. Amplify by PCR. The primer is designed so that about 15 bases homologous to the end of the vector obtained in (d3) linearized with a restriction enzyme are added to the DNA fragment in the region. (G2) The vector obtained in (d3) is digested with EcoRV.
  • the EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-IRES2-hG16gust44-hGH pA sequence fragment obtained in (g1) and the vector obtained in (g2) were mixed, In-Fusion enzyme and a predetermined buffer are added, and the reaction is usually performed at 37 ° C. for 15 minutes and then at 50 ° C. for 15 minutes.
  • In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech) it is possible to clone a target DNA fragment even with a long-chain DNA fragment without being restricted by restriction enzyme sites.
  • an expression construct necessary for obtaining a cultured cell line used for identifying the human sweet taste receptor-acting sweet taste regulator of the present invention is obtained.
  • the cultured cell line was prepared by using the Flp-In system (Invitrogen) to copy the above expression construct and the Flp recombinase expression vector pOG44 into 293 cells in which one FRT site was incorporated in the genomic DNA. This is done by transfection.
  • Flp-In system Invitrogen
  • a transiently expressed Flp recombinase cleaves the FRT site retained in the genomic DNA of 293 cells, introduces a foreign gene into that portion, and expresses the gene. To do.
  • each gene encoding hT1R2 and hT1R3 and hG16gust44 is converted into chromosomes of 293 cells by site-specific recombination using an Flp recombinase derived from Saccharomyces cerevisiae and an FRT site that is a target site of the Flp recombinase.
  • Flp recombinase derived from Saccharomyces cerevisiae
  • FRT site that is a target site of the Flp recombinase.
  • each gene encoding hT1R2 and hT1R3 and hG16gust44 is transcribed into two mRNAs and then translated into three proteins, namely hT1R2 and hT1R3 and hG16gust44.
  • 293 cells in which one FRT site is incorporated into genomic DNA can be prepared as follows. First, pFRT / lacZeo, which is a vector for introducing an FRT site, is introduced into a host cell 293 cell, and the introduced cells are selected with zeocin. Since pFRT / lacZeo has a fusion gene of lacZ and a zeocin resistance gene, cells into which pFRT / lacZeo has been introduced into the genome express ⁇ -galactosidase and become zeocin resistant. The degree of zeocin sensitivity can be confirmed by ⁇ -galactosidase assay. Next, Southern blotting is performed on the lacZ gene. This confirms that the FRT site is integrated only at one position in the genome where transcription is possible. It is convenient to use commercially available Flp-In-293 cells (Invitrogen) as 293 cells in which one FRT site is incorporated into genomic DNA.
  • Flp-In-293 cells Invitrog
  • the production of the cultured cell line used to identify the human sweet taste receptor-acting sweet taste regulator of the present invention is the above expression construct and Flp recombinase expression vector in 293 cells into which one FRT site is incorporated. This can be done by cotransfecting pOG44 and selecting a hygromycin B resistant cell line in a selective medium containing hygromycin B.
  • Flp recombinase is a kind of enzyme that performs a site-specific recombination reaction
  • pOG44 which is an expression vector for the enzyme
  • the expressed Flp recombinase inserts the expression construct into the FRT site of the 293 cell, and the 293 cell changes to hygromycin B resistance and zeocin sensitivity. By using resistance as an index, it can be easily determined whether or not the target gene has been inserted.
  • Methods for cotransfection include known methods such as lipofection, electroporation, calcium phosphate-DNA precipitation, calcium chloride, calcium chloride / rubidium, liposome, DEAE-dextran, and microinjection. Etc., can be selected as appropriate.
  • a cultured cell line can be obtained in which the expression construct enters the same position in the genome and hT1R2, hT1R3 and hG16gust44 are expressed simultaneously.
  • Expression of hT1R2 and hT1R3 and hG16gust44 can be confirmed by Western blotting using an antibody capable of recognizing hT1R2 antibody, hT1R3 antibody, and chimeric protein hG16gust44 by extracting a protein from a cultured cell line.
  • the stably expressing cells are grown and / or maintained by culturing in a nutrient medium.
  • the specific method for the growth and / or maintenance of the stably expressing cells may be appropriately determined.
  • glucose for example, low glucose supplemented with L-glutamine to 4 mM. (1,000 mg / ml) Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) medium (Virology, Vol. 8, p. 396, 1959), 10% HI-FBS (Heat Inactivated Fetal Bovine Serum) and 100 ⁇ g / ml hygromycin B ( It is preferable to perform growth and / or maintenance at 37 ° C. using a product added with Invitrogen).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle
  • the human sweet taste receptor-acting sweet taste-regulating substance of the present invention uses the above-mentioned stable cultured cell line, contacts a specific sweet substance with the cultured cell line, and measures the physiological response generated thereby, Subsequently, the sweet substance added with a candidate substance for a sweet taste receptor-acting sweet taste-regulating substance is brought into contact with the above-mentioned cultured cell line, and the physiological response generated thereby is measured, and the results of both measurements are compared. To be identified.
  • a candidate substance for a human sweet taste receptor-acting sweet taste regulating substance is screened, for example, as follows. First, as described above, a cultured cell line in which the expression construct is expressed is obtained, and then a predetermined number of the cultured cells has a large number of wells (24 holes, 48 holes, 96 holes, 384 holes, etc.). Each well of the microplate is spread (for example, 10,000 to 500,000 / well) and cultured in a predetermined medium (for example, DMEM medium) for one day.
  • a predetermined medium for example, DMEM medium
  • the physiological response generated in the stable culture cell line is measured.
  • the measured value in the case is compared with the measured value when the candidate substance is added, and the human sweetness receptor-acting sweetness regulating substance for the sweetness substance is identified based on the degree of the difference.
  • the candidate substance includes any substance prepared in addition to a substance existing in nature.
  • an event that changes with the activation of the sweet receptor is appropriately selected as the physiological response.
  • various phenomena are then initiated in the cell.
  • IP 3 intracellular triphosphate
  • examples of the physiological response to be measured include changes in intracellular second messengers that change with the activation of sweet taste receptors, changes in intracellular calcium concentration, and the like.
  • the physiological response to a sweet substance is preferably measured by a calcium imaging method in which a change in intracellular calcium concentration caused by a sweet stimulus is observed from outside the cell by using a fluorescent calcium indicator. It is.
  • a calcium imaging method in which a change in intracellular calcium concentration caused by a sweet stimulus is observed from outside the cell by using a fluorescent calcium indicator.
  • Fluorescent calcium indicators require that the fluorescence properties change at physiologically variable calcium concentrations, and that the change is induced specifically for calcium, so complex formation sites and fluorescence are now present.
  • a compound having a structure in which a chromophore is bound is widely used as a fluorescent indicator.
  • Fluo-4 AM and Fura-2 AM which are such fluorescent calcium indicators.
  • the present invention it is possible to verify whether a sweetness regulating action actually occurs at the level of the human sweet receptor by quantifying and visualizing a physiological response to a sweet substance using a calcium imaging method.
  • a calcium imaging method for example, the cellular response is digitized by a simultaneous assay using a multi-plate reader, and further, imaging with a microscope is used to visualize changes in intracellular calcium concentration to determine whether each cell is responding. Observe. By performing microscopic observation using a fluorescent indicator different from the fluorescent indicator used in the simultaneous assay by the multiplate reader, it is possible to confirm that the cell response is not due to the artifact.
  • a simultaneous assay using a multiplate reader may be appropriately performed according to a known method. However, it is simple and quick to perform automated fluorescent calcium imaging using FlexStation 3 (Molecular Devices), and a high-throughput assay is possible. FlexStation 3 is a multi-plate reader that combines the performance of SpectraMax M5e (Molecular Devices) with an 8-channel pipettor.
  • Automated fluorescence imaging using FlexStation 3 can be performed, for example, according to the following procedure. First, cells are suspended in low glucose (1,000 mg / ml) DMEM medium excluding hygromycin B, and 70 to 80,000 cells are plated on each well of a 96-well plate (Corning, CellBIND Surface).
  • low glucose 1,000 mg / ml
  • DMEM medium excluding hygromycin B
  • HEPES 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid
  • a fluorescent calcium indicator Add HEPES buffer containing Fluo-4 AM (included with Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit).
  • the fluorescent indicator Fluo-4 (excitation wavelength: 495 nm, fluorescence wavelength: 518 nm) has a lipid-soluble acetoxymethyl group introduced in order to facilitate its transfer into the cell. It is taken up into cells and hydrolyzed by intracellular esterases.
  • the 96-well plate for fluorescence observation has a plastic bottom and a film bottom, and since the plastic bottom plate has good cell adhesion and growth, it is used in a simultaneous assay using a multiplate reader for observing the whole well. However, this plastic bottom plate has poor UV wavelength transmission and uses Fluo-4 because it inhibits transmission of Fura-2 excitation light.
  • a taste stimulus is performed at 27 to 37 ° C. by adding a sweet substance of a specific concentration or a solution of the sweet substance and the substance to be tested to this.
  • the response of sweet receptor-expressing cells to a sweet stimulus can be quantified by measuring the fluorescence reaction (525 nm fluorescence with 485 nm excitation) immediately after the addition of the sweet substance or sweet substance and the substance to be tested. it can.
  • Fluorescent calcium imaging using a fluorescence microscope can be performed according to the following procedure. First, the cells are suspended in low glucose (1,000 mg / ml) DMEM medium excluding hygromycin B, and 40 to 80,000 cells are plated on each well of a 96-well plate (Greiner, Lumox).
  • HEPES buffer containing a fluorescent calcium indicator (Fura-2 AM) is further added.
  • the fluorescence indicator Fura-2 (excitation wavelength: 340 nm / 380 nm, fluorescence wavelength: 510 nm) increases the fluorescence intensity of 340 nm excitation and decreases the fluorescence intensity of 380 nm excitation when the calcium ion concentration increases.
  • a fluorescence image in the microscope field (510 nm fluorescence with 340 nm excitation and 380 nm excitation) is captured 60 to 300 seconds later, and the ratio of the two wavelength excitation fluorescence is simulated. By displaying in color, the response of sweet receptor-expressing cells to sweetness stimuli can be observed.
  • a physiological response is measured, in the calcium imaging method, by combining the two types of fluorescent indicators having different fluorescence characteristics, a universal phenomenon independent of the observation system can be obtained. Can be observed.
  • Example 1 Preparation of a cultured cell line in which a human sweet taste receptor (hT1R2 + hT1R3) and a chimeric G protein (hG16gust44) are both functionally and stably expressed
  • a cDNA encoding hT1R2 downstream of the EF-1 ⁇ promoter A cDNA encoding hG16gust44 has a sequence linked by inserting an IRES sequence, and a cDNA encoding hT1R3 and a cDNA encoding hG16gust44 are inserted downstream of the CMV promoter downstream of this sequence.
  • PcDNA5 / FRT Invitrogen
  • a sense primer (SEQ ID NO: 1: TATAGATCTGATATCCCCCTATGGTGCACTCTC) having a Bgl II recognition sequence (5′-AGATCT-3 ′) at the 5 ′ end and an EcoRV recognition sequence immediately below it, and an antisense primer (sequence) in the BGHpA sequence Number 2: TAGAAGGCACAGTCGAGG) was designed and manufactured. Then, using these sense primers and antisense primers, a polymerase chain reaction (PCR) was performed using pcDNA5 / FRT (Invitrogen) as a template, and a DNA fragment containing a sequence in which each recognition sequence of Bgl II and EcoRV was linked was obtained. Amplified.
  • the amplified DNA fragment was then digested with Bgl II and Not I, and pcDNA5 / FRT (Invitrogen) was digested with Bgl II and Not I. These were ligated high Ver. Using 2 (TOYOBO), the Bgl of pcDNA5 / FRT (Invitrogen) was bound by ligation reaction. A vector having an EcoRV recognition sequence immediately under the II recognition sequence was prepared.
  • a sense primer (sequence) having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and immediately after the coding region of hT1R3, respectively.
  • No. 3: GATCGGCGCGCCGCCATGCTGGGCCCTGCTGTC) and an antisense primer (SEQ ID NO: 4: GATCGCGGCCGCTCACTCATGTTTCCCCTG) were designed and prepared.
  • PCR was performed using a sequence containing a cDNA sequence encoding hT1R3 as a template to amplify the cDNA encoding hT1R3.
  • the amplified cDNA fragment encoding T1R3 was digested with Asc I and Not I, and pEAK10 (Edge Biosystems) was digested with Asc I and Not I. And these are referred to as Ligation high Ver. 2 (TOYOBO) was used for binding by ligation reaction, and cDNA encoding hT1R3 was inserted into pEAK10 (Edge Biosystems). Subsequently, this was digested with Hind III and Not I, the DNA fragment was separated by agarose electrophoresis, and the cDNA fragment of hT1R3 was purified.
  • pEAK10 Edge Biosystems
  • a sense primer (SEQ ID NO: 5: GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCC) having an Eco52I recognition sequence (5′-CGGCCG-3 ′) immediately before the IRES sequence and an antisense primer (SEQ ID NO: 6) corresponding to the end of the IRES sequence : GGTTGTGGCCATATTATC) was designed and produced.
  • PCR was performed using pIRES2-EGFP (Clontech) as a template to amplify the IRES sequence.
  • a sense primer (SEQ ID NO: 7: GATCGCGGCCGCATGGCCCGCTCGCTGACC) and an antisense primer (SEQ ID NO: 8: GATCGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTT A) having a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and immediately after the coding region of hG16gust44 Designed and produced.
  • PCR was performed using a sequence containing a cDNA sequence encoding hG16gust44 as a template to amplify cDNA encoding hG16gust44.
  • the amplified fragments were digested with Not I, pEAK10 (Edge Biosystems) was digested with Not I, and these were ligated high Ver.
  • the IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK ( ⁇ ) described above was digested with Eco52I, the DNA fragments were separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hG16gust44 sequence was purified. Then, the pcDNA5 / FRT (Invitrogen) in which the cDNA encoding hT1R3 was inserted into the multicloning site was digested with Not I, and the portion immediately after the DNA sequence encoding hT1R3 in the vector was cleaved. This vector and the IRES2-hG16gust44 sequence described above were ligated to Ligation high Ver.
  • a sense primer (sequence) having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and immediately after the coding region of hT1R2, respectively.
  • No. 11: GATCGGCGCGCCGCCATGGGGCCCAGGGCAAAG) and an antisense primer (SEQ ID NO: 12: GATCGCGGCCGCCTAGTCCCTCCTCATGGT) were designed and prepared.
  • PCR was performed using a sequence containing a DNA sequence encoding hT1R2 as a template to amplify cDNA encoding hT1R2.
  • the obtained cDNA encoding hT1R2 was designated as Asc I and Not. I
  • pEAK10 Edge Biosystems
  • Asc I and Not I pEAK10
  • Asc I and Not I ligated high Ver. 2 (TOYOBO) was used for binding by ligation reaction
  • cDNA encoding hT1R2 was inserted into pEAK10 (Edge Biosystems).
  • the IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK ( ⁇ ) described above was digested with Eco52I, the cDNA fragment was separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hG16gust44 sequence was purified.
  • pEAK10 Edge Biosystems
  • pEAK10 Edge Biosystems into which the cDNA encoding hT1R2 was inserted was digested with Not I, and the portion immediately after the cDNA encoding hT1R2 in the vector was cleaved. This vector and the above IRES2-hG16gust44 sequence were ligated to Ligation high Ver.
  • primers for carrying out the In-Fusion reaction are designed and prepared, and using this, pEAK10Bio (Egyst) containing the hT1R2-IRES2-hG16gust44 sequence described above.
  • pEAK10Bio Egyst
  • the region of EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-IRES2-hG16gust44-hGH pA was amplified by PCR.
  • this EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-IRES2-hG16gust44-hGH pA sequence fragment, pcR5 / FRT containing hR1R3-IRES2-hG16gust44 sequence digested with EcoRV, and In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (Cloning Kit) To construct an expression construct in which the hT1R2-IRES2-hG16gust44 sequence was inserted upstream of the hT1R3-IRES2-hG16gust44 sequence.
  • this cultured cell line was treated with 10% HI-FBS (Heat Inactivated Fetal Bovine Serum), 100 ⁇ g / ml hygromycin B (Invitrogen), L-glutamine 4 mM low glucose (1,000 mg / ml) Dulbecco's modified eagle ( Grown and maintained at 37 ° C. in DMEM) medium.
  • HI-FBS Heat Inactivated Fetal Bovine Serum
  • 100 ⁇ g / ml hygromycin B Invitrogen
  • L-glutamine 4 mM low glucose 1,000 mg / ml
  • Dulbecco's modified eagle Grown and maintained at 37 ° C. in DMEM
  • Example 2 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when neohesperidin dihydrochalcone (NHDC) is added to sucrose stimulation
  • the physiological response of sweet receptor-expressing cells by sucrose is obtained by adding neohesperidin dihydrochalcone.
  • the change was analyzed by automated fluorescence imaging.
  • the sweet receptor-expressing cells obtained in Example 1 were trypsinized, suspended in the DMEM medium, the cell density was measured, and about 80,000 cells were plated on each well of a 96-well plate (Corning, CellBIND Surface). . After culturing at 37 ° C.
  • HEPES buffer containing sucrose was added to the cells so that the final concentration of sucrose was as described in Table 1, and sucrose stimulation was performed at 27 ° C.
  • HEPES buffer containing sucrose is added to the cells to be subjected to automated fluorescence imaging so that the final concentration of sucrose is the concentration described in Table 2, and the final concentration of neohesperidin dihydrochalcone is further increased. Conc. So that it becomes 2v / v%.
  • a HEPES buffer containing neohesperidin dihydrochalcone is added and stimulation is performed at 27 ° C., and a fluorescence reaction (525 nm fluorescence with 485 nm excitation) immediately after the addition of the solution is performed using FlexStation 3 (Molecular Devices).
  • Example 3 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when cyclamate is added in response to sucrose stimulation. Automation of how the physiological response of sweet receptor-expressing cells by sucrose changes with the addition of cyclamate. Analysis was performed by fluorescence imaging. In the same manner as in Example 2, HEPES buffer containing sucrose was added to cells subjected to automated fluorescence imaging so that the final concentration of sucrose was the concentration described in Table 3, and the final concentration of cyclamate was 1 mM.
  • Example 4 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when p-methoxycinnamic aldehyde is added to sucrose stimulation
  • the physiological response of sweet receptor-expressing cells by sucrose is due to the addition of p-methoxycinnamic aldehyde.
  • the change was analyzed by automated fluorescence imaging.
  • HEPES buffer containing sucrose was added to cells subjected to automated fluorescence imaging so that the final concentration of sucrose was the concentration described in Table 4, and p-methoxycinnamic aldehyde was further added. Conc. So that the final concentration of conc.
  • a HEPES buffer containing p-methoxycinnamic aldehyde was added and stimulation was performed at 27 ° C., and the fluorescence reaction (525 nm fluorescence with 485 nm excitation) was performed immediately after the addition of the solution, and FlexStation 3 (Molecular Devices) was used.
  • the response of sweet receptor-expressing cells when p-methoxycinnamic aldehyde was added to sucrose was quantified. The results are shown in Table 4 and FIG.
  • Example 5 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when cycloten is added in response to sucrose stimulation. Automation of how the physiological response of sweet receptor-expressing cells by sucrose is changed by adding cycloten. Analysis was performed by fluorescence imaging. In the same manner as in Example 2, HEPES buffer containing sucrose was added to cells subjected to automated fluorescence imaging so that the final concentration of sucrose was the concentration described in Table 5, and the final concentration of cycloten was 0.
  • sucrose is synergistically increased by adding cycloten in a cultured cell line in which both human sweetness receptor (hT1R2 + hT1R3) and chimeric G protein (hG16gust44) are expressed functionally and stably. Admitted to do.
  • the concentration of each substance tested in Examples 2-5 is below the concentration at which a cellular response is observed when the substance is administered alone, but synergistically increases the sensitivity of the cellular response to sucrose. I was able to.
  • the degree of sweetness of sucrose is weak, the response of sweetness receptor cells is not observed unless it is added at a concentration of about 50 mM.
  • a sucrose solution having a concentration exceeding 200 mM is added, cells are affected by osmotic pressure, making it difficult to measure a normal cell response. Therefore, normally, the sweetness level of sucrose in a sweetness assay system using cells is limited to a narrow range of about 50 to 200 mM. If used, the lower limit of the limit value can be further lowered.
  • Example 6 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when neohesperidin dihydrochalcone is added to sucrose stimulation How the physiological response of sweet receptor-expressing cells by sucrose is increased by adding neohesperidin dihydrochalcone. The change was analyzed by fluorescent calcium imaging using a fluorescence microscope. First, the sweetness receptor-expressing cells obtained in Example 1 were suspended in a low glucose (1,000 mg / ml) DMEM medium excluding hygromycin B, and about each well of a 96-well plate (Greiner, Lumox) was suspended. I got 80,000 each. Then, after culturing at 37 ° C.
  • a HEPES buffer containing sucrose is added to cells subjected to fluorescent calcium imaging so that the final concentration of sucrose is 100 mM, and the final concentration of neohesperidin dihydrochalcone is 5 v / v%.
  • Conc. Stimulation was performed at room temperature by adding a HEPES buffer containing neohesperidin dihydrochalcone, and the state of the cells was observed with a fluorescence image. The results are shown in FIG.
  • Example 7 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when cyclamate is added to sucrose stimulation Fluorescence of how the physiological response of sweet receptor-expressing cells by sucrose changes with the addition of cyclamate Analysis was performed by fluorescent calcium imaging using a microscope.
  • sucrose stimulation was performed at room temperature by adding a HEPES buffer containing sucrose to cells subjected to fluorescent calcium imaging so that the final concentration of sucrose was 100 mM, and a sucrose solution was added.
  • the fluorescence image in the microscope visual field 30 seconds later (510 nm fluorescence with 340 nm excitation and 380 nm excitation) was captured, and the ratio of the two wavelength excitation fluorescence was displayed in pseudo color, and the cell response due to sucrose was observed. The results are shown in FIG.
  • Example 6 In the same manner as in Example 6, the cells subjected to fluorescent calcium imaging were stimulated at room temperature by adding a HEPES buffer containing cyclamate so that the final concentration of cyclamate was 0.5 mM, and the state of the cells was fluorescent. The image was observed. The results are shown in FIG.
  • Example 6 In the same manner as in Example 6, a HEPES buffer containing sucrose was added to cells subjected to fluorescent calcium imaging so that the final concentration of sucrose was 100 mM, and the final concentration of cyclamate was 0.5 mM. Stimulation was performed at room temperature by adding a HEPES buffer containing cyclamate, and the state of the cells was observed with a fluorescence image. The results are shown in FIG.
  • the physiological response by sucrose is increased by adding cyclamate in a cultured cell line in which both the human sweet receptor (hT1R2 + hT1R3) and the chimeric G protein (hG16gust44) are expressed functionally and stably. It was confirmed visually.
  • Example 8 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when p-methoxycinnamic aldehyde is added to sucrose stimulation The physiological response of sweet receptor-expressing cells by sucrose is due to the addition of p-methoxycinnamic aldehyde. The change was analyzed by fluorescent calcium imaging using a fluorescence microscope.
  • sucrose stimulation was performed at room temperature by adding a HEPES buffer containing sucrose to cells subjected to fluorescent calcium imaging so that the final concentration of sucrose was 100 mM, and a sucrose solution was added.
  • the fluorescence image in the microscope visual field 30 seconds later (510 nm fluorescence with 340 nm excitation and 380 nm excitation) was captured, and the ratio of the two wavelength excitation fluorescence was displayed in pseudo color, and the cell response due to sucrose was observed. The results are shown in FIG.
  • Example 6 In the same manner as in Example 6, the cells subjected to fluorescent calcium imaging were subjected to conc. So that the final concentration of p-methoxycinnamic aldehyde was 5 v / v%. Stimulation was performed at room temperature by adding a HEPES buffer containing p-methoxycinnamic aldehyde, and the state of the cells was observed with a fluorescence image. The results are shown in FIG.
  • HEPES buffer containing sucrose was added to cells subjected to fluorescent calcium imaging so that the final concentration of sucrose was 100 mM, and the final concentration of p-methoxycinnamic aldehyde was 5 v / con. Stimulation was performed at room temperature by adding a HEPES buffer containing p-methoxycinnamic aldehyde, and the state of the cells was observed with a fluorescence image. The results are shown in FIG.
  • Example 9 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when cycloten is added to sucrose stimulation Fluorescence of how the physiological response of sweet receptor-expressing cells due to sucrose is changed by adding cycloten Analysis was performed by fluorescent calcium imaging using a microscope.
  • sucrose stimulation was performed at room temperature by adding a HEPES buffer containing sucrose to cells subjected to fluorescent calcium imaging so that the final concentration of sucrose was 100 mM, and a sucrose solution was added.
  • the fluorescence image in the microscope visual field 30 seconds later (510 nm fluorescence with 340 nm excitation and 380 nm excitation) was captured, and the ratio of the two wavelength excitation fluorescence was displayed in pseudo color, and the cell response due to sucrose was observed. The results are shown in FIG.
  • Example 6 In the same manner as in Example 6, the cells were subjected to fluorescent calcium imaging, and the cells were stimulated at room temperature by adding a HEPES buffer containing cycloten so that the final concentration of cycloten was 0.5 mM. The image was observed. The results are shown in FIG.
  • HEPES buffer containing sucrose was added to the cells subjected to fluorescent calcium imaging so that the final concentration of sucrose was 100 mM, and the final concentration of cycloten was 0.5 mM. Then, stimulation was performed at room temperature by adding a HEPES buffer containing cycloten, and the state of the cells was observed with a fluorescence image. The results are shown in FIG.
  • the physiological response by sucrose is increased by adding cycloten in a cultured cell line in which both the human sweet receptor (hT1R2 + hT1R3) and the chimeric G protein (hG16gust44) are functionally and stably expressed. It was confirmed visually.
  • Example 10 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when neo-hesperidin dihydrochalcone is added to aspartame stimulation How is the physiological response of sweet receptor-expressing cells by aspartame added by neo-hesperidin dihydrochalcone? The changes were analyzed by automated fluorescence imaging. A HEPES buffer containing aspartame was added to the cells subjected to automated fluorescence imaging prepared in the same manner as in Example 2 so that the final concentration of aspartame was the concentration described in Table 6, and aspartame stimulation was performed at 27 ° C. It was.
  • HEPES buffer containing aspartame was added to the cells subjected to automated fluorescence imaging prepared in the same manner as in Example 2 so that the final concentration of aspartame was the concentration described in Table 7, Conc. So that the final concentration of neohesperidin dihydrochalcone is 5 v / v%.
  • a HEPES buffer containing neohesperidin dihydrochalcone is added and stimulation is performed at 27 ° C., and a fluorescence reaction (525 nm fluorescence with 485 nm excitation) immediately after the addition of the solution is performed using FlexStation 3 (Molecular Devices).
  • Example 10 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when neohesperidin dihydrochalcone is added in response to stevia stimulation How is the physiological response of sweet receptor-expressing cells induced by stevia by adding neohesperidin dihydrochalcone? The changes were analyzed by automated fluorescence imaging. Stevia stimulation was performed at 27 ° C. by adding HEPES buffer containing stevia so that the final concentration of stevia becomes the concentration described in Table 8 to cells subjected to automated fluorescence imaging prepared in the same manner as in Example 2. It was.
  • HEPES buffer containing stevia was added to cells to be subjected to automated fluorescence imaging prepared in the same manner as in Example 2 so that the final concentration of stevia was the concentration described in Table 9, Conc. So that the final concentration of neohesperidin dihydrochalcone is 5 v / v%.
  • a HEPES buffer containing neohesperidin dihydrochalcone is added and stimulation is performed at 27 ° C., and a fluorescence reaction (525 nm fluorescence with 485 nm excitation) immediately after the addition of the solution is performed using FlexStation 3 (Molecular Devices).
  • Example 10 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when neohesperidin dihydrochalcone is added in response to saccharin stimulation. The changes were analyzed by automated fluorescence imaging. HEPES buffer containing saccharin was added to cells subjected to automated fluorescence imaging prepared in the same manner as in Example 2 so that the final concentration of saccharin was the concentration described in Table 10, and saccharin stimulation was performed at 27 ° C. It was. Then, the fluorescence reaction (525 nm fluorescence with 485 nm excitation) immediately after the addition of the HEPES buffer containing saccharin was measured using FlexStation 3 (Molecular Devices), and the sweetness receptor-expressing cells against sweetness stimulation by saccharin were measured. Response was quantified by automated fluorescence imaging. The results are shown in Table 10 and FIG.
  • HEPES buffer containing saccharin was added to cells to be subjected to automated fluorescence imaging prepared in the same manner as in Example 2 so that the final concentration of saccharin was the concentration described in Table 11, and Conc. So that the final concentration of neohesperidin dihydrochalcone is 5 v / v%.
  • HEPES buffer containing neohesperidin dihydrochalcone is added and stimulation is performed at 27 ° C., and the fluorescence reaction (525 nm fluorescence with 485 nm excitation) immediately after the addition of the solution is performed using FlexStation 3 (Molecular Devices).
  • Example 11 Physiological response of sweet receptor-expressing cells when ethyl vanillin or maltol is added to sucrose stimulation. How is the physiological response of sweet receptor-expressing cells by sucrose added by adding ethyl vanillin or maltol? The change was analyzed by fluorescent calcium imaging using a fluorescence microscope. In the same manner as in Example 2, sucrose stimulation was performed at room temperature by adding a HEPES buffer containing sucrose to cells subjected to automated fluorescence imaging so that the final concentration of sucrose was 200 mM.
  • a HEPES buffer containing sucrose is added to cells subjected to fluorescent calcium imaging so that the final concentration of sucrose is 200 mM, and further, ethyl vanillin is added so that the final concentration of ethyl vanillin is 1 mM.
  • the cells were stimulated at room temperature by adding a HEPES buffer containing and the state of the cells was observed with a fluorescence image. The results are shown in FIG.
  • a HEPES buffer containing sucrose is added to cells subjected to fluorescent calcium imaging so that the final concentration of sucrose is 200 mM, and maltitol is further adjusted so that the final concentration of maltol is 1 mM.
  • the cells were stimulated at room temperature by adding a HEPES buffer containing and the state of the cells was observed with a fluorescence image. The results are shown in FIG.
  • the present invention it is possible to provide a human sweet taste receptor-acting sweet taste regulating substance whose sweetness regulating effect via a human sweet taste receptor is objectively confirmed, and to improve taste by applying it to a wide range of foods and drinks.
  • beneficial effects such as saving sweeteners, reducing calories, and lower caries can be obtained.

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Abstract

【課題】種々の飲食品に適用することにより、味の改善、甘味料の節約、低カロリー化、低う蝕性などの有益な効果を得ることができる甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を提供する。 【解決手段】本発明のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質は、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各ｃＤＮＡを同一のプラスミドに挿入して得られた発現コンストラクトを、ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ）部位が１か所組み込まれた２９３細胞に導入して発現させた培養細胞株を用いた、甘味物質による生理的応答の測定によって同定される。

Description

甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質
本発明は、甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質に関し、詳しくは、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とＧタンパク質αサブユニットを共に機能的に安定して発現させた培養細胞株を用いて、甘味強度を客観的に評価することによって得られた、甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質に関する。
味覚は、物質を口にした時に、特に舌の表面に存在する特異的な受容体と物質が結合することによって生じる感覚である。哺乳類の味覚は、５つの基本味、すなわち、塩味、酸味、甘味、うま味、苦味で構成されており、これらの基本味が統合することによって形成されると考えられている。現在のところ、塩味、酸味は、舌の表面の味蕾に存在する味細胞の近位側の細胞膜上に発現するいくつかのイオンチャネル型受容体を介して感知されると言われており、特に酸味については、ＴＲＰチャネルファミリーであるＰＫＤ２Ｌ１＋ＰＫＤ１Ｌ３からなるイオンチャネル型受容体が機能していると考えられている。
一方、甘味、うま味、苦味については、味細胞に存在する膜タンパク質であるＧタンパク質共役受容体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ））と、それに共役するＧタンパク質を介したシグナル伝達によって感知されると考えられており、具体的には、甘味はＴ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（甘味受容体）、うま味はＴ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（うま味受容体）で受容され、苦味はＴ２Ｒファミリーと命名された約３０種類の分子（苦味受容体）で受容されることが明らかにされている。
上記Ｇタンパク質は、α、β、γの３つのサブユニットで構成されている。α、β、γの３つのサブユニットが結合した状態は不活性型であり、味物質がＧタンパク質共役受容体に結合すると、αサブユニットに結合していたＧＤＰ（グアノシン５’二リン酸）がＧＴＰに置換されて、ＧＴＰ-αサブユニットとβ-γサブユニットの結合体に解離した活性型になる。
味覚情報の伝達機構のしくみについては、完全に解明されたわけではないが、一般には以下のように理解されている。すなわち、まず、味物質が味細胞の受容体に結合すると、細胞内のセカンドメッセンジャー（ＩＰ３、ＤＡＧ）などを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇し、次いで、細胞内に供給されたカルシウムイオンは、神経伝達物質をシナプスに放出させて神経細胞に活動電位を発生させ、その結果、受容体を起点とした味覚シグナルが味神経から脳に伝達されて味覚情報が識別、判断される、というのが通説である。また、最近、カルシウムイオンがＴＲＰＭ５という新規な陽イオンチャネルを開口させ、一価陽イオンが細胞内に流入することで脱分極するという説も認められつつある。
上述した、塩味、酸味、甘味、うま味、苦味からなる５つの基本味のうち、特に甘味は、血液中の糖分が減少したときに、非常に美味しく感じる味であり、また、糖を含むエネルギー源としてのイメージをヒトに与え、さらには、他の基本味に比べて強い満足感、幸福感を引き起こし、ヒトの情動と深く関係していることから、飲食品などの嗜好性を決定する上で中心となる味である。
しかしながら、甘味は、他の基本味に比べて最小感度（閾値）が高く、少量では感知しにくいという特性がある。他方、甘味が強すぎると、ハイカロリー、肥満などの健康的でないイメージを誘起することになる。そのため、甘味を付与した飲食品などを製造する場合、ヒトが感知できる甘味であって、かつ、好ましく受け入れられる甘味になるように、甘味の強度を調節することが重要である。
ところで、従来、飲食品などの風味を改善するために、食品香料（フレーバー）が使用されている。風味は、味覚、嗅覚などから感知される知覚心理学的な感覚である。フレーバーは、甘味の強度を増強する場合にも使用されており、実際に甘味の増強効果が確認されているフレーバーとしては、例えば、エチルブチレート、エチルバニリン、セダネノライド、アラピリダインなどがある。
一般的に、フレーバーによる風味改善効果は、フレーバーが有する香気による嗅覚を介した作用であると考えられている。フレーバーの風味改善効果は、従来、主として、ヒトの官能評価によって検証されている。しかし、官能評価では、味覚と嗅覚から感知される情報を統合的に評価することになるため、フレーバーが味覚に作用して風味改善効果をもたらすのかどうかを検証することは困難である。特に、複数のフレーバー間において、味覚を介した風味改善の程度の違いを客観的に評価することは非常に困難である。また、官能評価あるいは官能検査では、良く訓練された評価者（パネル又はパネラーと呼ばれる）間の評価のバラツキも無視することはできない。
ヒトによる官能評価に代えて、舌の表面の味蕾に存在する味細胞を単離し、これを用いて風味改善効果を評価することも考えられる。しかし、舌の表面の味蕾に存在する味細胞を単離したものは、培養プレートへの接着が非常に弱く、すぐに死んでしまうため、時間を要する評価には使用することができない。
前述したように、甘味は、飲食品などの嗜好性を決定する上で中心となる味であることから、甘味受容体に作用して甘味を増強する物質を同定することができれば、同定された該物質を使用して、飲食品、医薬品などの味の改善、甘味料の使用量の削減、摂取カロリーの低下などの有益な効果を達成することができる。そのため、飲食品、フレーバーなどの産業界からは、そのような甘味増強物質に対して多大な関心が寄せられている。
そこで、産業界からのそうした関心に応えるべく、甘味調節物質を客観的に同定する方法として、Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマーである甘味受容体を発現させた細胞系を用いるアッセイが報告されている。
具体的には、例えば、特許文献１の実施例１１において、Ｇα１５発現細胞株（Ａｕｒｏｒａ　ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＨＥＫ-２９３細胞株）に、ｈＴ１Ｒ２の発現コンストラクト（プラスミドＳＡＶ２４８６）を含む線状化したｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）由来ベクターと、ｈＴ１Ｒ３の発現コンストラクト（プラスミドＳＸＶ５５０）を含むｐＣＤＮＡ３．１／ＺＥＯ由来（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターとを、トランスフェクションすることにより、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３を共発現させて生成した細胞株を用いて、甘味の調節化合物を同定することが報告されている。
また、特許文献２には、ｈＴ１Ｒ２Ｎ－末端細胞外ドメインとｈＴ１Ｒ１Ｃ－末端７回膜貫通ドメインからなるｈＴ１Ｒ２－１と名づけられたドメイン、ｈＴ１Ｒ３、及びキメラＧタンパク質Ｇ１６－ｔ２５を発現する安定なＨＥＫ-２９３細胞、及びｈＴ１Ｒ１細胞外ドメインとｈＴ１Ｒ２Ｃ－末端７回膜貫通ドメインからなるｈＴ１Ｒ１－２と名づけられたドメイン、ｈＴ１Ｒ３、及びキメラＧタンパク質Ｇ１６ｇ４４を安定に発現する安定なＨＥＫ-２９３細胞が、甘味の味覚改変物質を同定するアッセイにおいて有用であることが記載されている。
また、特許文献３には、ヒト受容体タンパク質Ｔ１Ｒ２－ＴＭＤ又はＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラ受容体をコードするｃＤＮＡを含む線状化ｐｃＤＮＡ４－Ｔ０ベクターを、Ｇα１６ｇｕｓｔ４４を発現するＨＥＫ-２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした細胞系を用いて、甘味の増強物質を同定するアッセイが記載されている。
特開２００８－１３５７０号公報 特表２００９－５１７００３号公報 ＷＯ２００７－１２１６０４号公報
従来の甘味受容体を発現させた細胞系は、いずれも所定のＧタンパク質を発現する細胞を事前に作製、入手しておき、これにＴ１Ｒ２をコードする遺伝子を含むベクター、及びＴ１Ｒ３をコードする遺伝子を含むベクターをそれぞれトランスフェクションすることによって作製されている。
しかしながら、そのような方法によって細胞系を作製すると、各ベクターの細胞への導入効率が同一ではなく、いずれかが優位に導入されることがあり、また、導入した目的遺伝子が細胞のゲノム中にランダムに挿入され、極端な場合には、導入した目的遺伝子がゲノム中の転写されない不活性部分に挿入されることがある。
そのため、従来の細胞系では、Ｇタンパク質に関しては一定量が発現されており、その発現量は細胞間でさほど差は認められないものの、ｈＴ１Ｒ２、ｈＴ１Ｒ３の発現量及び発現比率に関しては、細胞間で大きなバラツキが認められた。
また、従来の細胞系の中には、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３のいずれか一方又は両方が発現されておらず、中には、細胞内の一連のシグナル伝達機構を実質的に備えていないものもあり、機能的な細胞系とは言えなかった。
このように、従来の甘味受容体の発現細胞系は、ヒトの甘味受容応答機構を反映しておらず、甘味受容体に作用する甘味調節物質をスクリーニングする上で、適切なモデルではなかった。
したがって、従来方法で作製された甘味受容体の発現細胞系を用いて、甘味調節物質の候補物質をスクリーニングしても、選択された物質が実際にヒト甘味受容体に作用して、甘味の調節効果を発揮することが検証された物質であるとは言えなかった。
そこで、こうした状況に鑑み、本発明は、ｈＴ１Ｒ２とｈＴ１Ｒ３を同等に高発現する安定培養細胞を用いたアッセイによって、味覚を介する甘味調節効果が客観的に確認された、甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質の提供を課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、ｈＴ１Ｒ２、ｈＴ１Ｒ３を同等に高発現する安定培養細胞、具体的には、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３、並びにＧタンパク質αサブユニットをコードするｃＤＮＡを同一のプラスミドに挿入した発現コンストラクトを所定の細胞に遺伝子導入して発現させた培養細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系が、甘味を感じる味細胞に近い受容システムを備えており、ヒト甘味受容体に作用する甘味調節物質を選択するのに非常に適したモデルであることを見出し、かかる知見に基づき、本発明を完成するに至った。
　かくして、本発明は、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各ｃＤＮＡを同一のプラスミドに挿入して得られた発現コンストラクトを、ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ）部位が１か所組み込まれた２９３細胞に導入して発現させた培養細胞株を用いた、甘味物質による生理的応答の測定によって同定された、甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を提供するものである。
　本発明は、ヒト甘味受容体を介する甘味調節効果が客観的に確認されたヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を提供することができ、種々の飲食品に適用することにより、味の改善、甘味料の節約、低カロリー化、低う蝕性などの有益な効果を得ることができる。
ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の構造を示す。 ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列が導入されたｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の構造を示す。 スクロースに対して、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、シクラメート、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒド、シクロテンをそれぞれ所定の濃度で、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の発現させた細胞に投与した際のスクロース濃度-応答曲線である。 スクロースに対して、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、シクラメート、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒド、シクロテンをそれぞれ所定の濃度で、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４を発現させた細胞に投与した際の蛍光イメージ画像を示す図である。 アスパルテームに対して、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを所定の濃度で、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４を発現させた細胞に投与した際のアスパルテーム濃度-応答曲線である。 ステビアに対して、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを所定の濃度で、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４を発現させた細胞に投与した際のステビア濃度-応答曲線である。 サッカリンに対して、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを所定の濃度で、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４を発現させた細胞に投与した際のサッカリン濃度-応答曲線である。 スクロースに対して、エチルバニリン又はマルトールをそれぞれ所定の濃度で、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４を発現させた細胞に投与した際の蛍光イメージ画像を示す図である。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明において、甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質とは、ある特定の甘味物質と共存させた場合に、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）に作用することによって、該甘味物質単独で得られるヒト甘味受容体からの生理的応答、すなわち、甘味の強度を改変させる物質を意味する。具体的には、甘味物質によるヒト甘味受容体からの生理的応答を増大させて、甘味の強度を増大させるヒト甘味受容体作用性甘味増強物質、生理的応答を減少させて、甘味の強度を減少させるヒト甘味受容体作用性甘味阻害物質などが挙げられる。上記ヒト甘味受容体作用性甘味調節物質の中には、それ自体、甘味物質であるものも含まれる。
本発明のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質による甘味調節の対象となる甘味物質は、ヒトが感知できる甘味を呈することができる物質であれば特に限定されず、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロース、スクロース、マルトース、乳糖、水飴、異性化糖、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、イソマルトール、還元水飴、還元パラチノース、和三盆、黒糖、三温糖、蜂蜜、糖蜜、甘草抽出物及びメープルシロップなどの糖質系甘味料、及び、アスパルテーム、サッカリン、ズルチン、ステビオシド、ステビア抽出物、グリチルリチン、アセスルファム－Ｋ、スクラロース（登録商標；三栄源エフ・エフ・アイ）、シクラメート、アリテーム、ネオテーム、ペリラルチン、モネリン、クルクリン（登録商標；ＡＤＥＫＡ）などの非糖質系甘味料が広く含まれる。
ヒト甘味受容体とは、前述したように、ｈＴ１Ｒ２とｈＴ１Ｒ３の２つのサブユニットを組み合わせることによって構成されるヘテロオリゴマー受容体であり、各サブユニットの全ての部分、すなわち、７つの膜貫通領域及び対応する細胞質及び細胞外のループからなる膜貫通ドメイン、ビーナス・フライ・トラップドメイン、高システインドメイン及びＣ末端ドメインの全ての領域が含まれる。
本発明のヒト甘味受容体作用性甘味増強物質としては、具体的には、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＣ）（化１）、シクラメート（化２）、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒド（化３）、シクロテン（化４）が例示される。各物質の化学構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
本発明のヒト甘味受容体作用性甘味抑制物質としては、具体的には、ラクチゾール（化５）、バニリン（化６）、エチルバニリン（化７）、クレオソール（化８）、マルトール（化９）が例示される。各物質の化学構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
 
本発明のヒト甘味受容体作用性甘味増強剤は、本発明のヒト甘味受容体作用性甘味増強物質を有効成分とする製剤であり、該増強物質をそのまま直接使用してもよいし、必要に応じて、適当な液体に溶解するか、又は粉末と混合して使用してもよく、必要な場合には、乳化剤、懸濁剤、安定剤などを適宜加えて使用される。上記有効成分の濃度は、所望する甘味の程度などを考慮して適宜決定すればよい。
本発明のヒト甘味受容体作用性甘味抑制剤は、本発明のヒト甘味受容体作用性甘味抑制物質を有効成分とする製剤であり、該増強物質をそのまま直接使用してもよいし、必要に応じて、適当な液体に溶解するか、又は粉末と混合して使用してもよく、必要な場合には、乳化剤、懸濁剤、安定剤などを適宜加えて使用される。上記有効成分の濃度は、所望する甘味の程度などを考慮して適宜決定すればよい。
本発明のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質は、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各ｃＤＮＡを同一のプラスミドに挿入して得られた発現コンストラクトを、ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ）部位が１か所組み込まれた２９３細胞に導入して発現させた培養細胞株を用いて、
（ｉ）ある特定の甘味物質を上記培養細胞株に接触させて、発生した生理的応答を測定し、
（ｉｉ）該甘味物質にヒト甘味受容体作用性甘味調節物質の候補物質を添加したものを上記培養細胞株に接触させて、発生した生理的応答を測定し、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）、（ｉｉ）のそれぞれで得られた生理的応答の測定結果を比較することによって同定されたものである。
ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各ｃＤＮＡは、いかなる方法で入手されるものでもよく、例えば、該タンパク質をコードするｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、既知の塩基配列情報に基づく化学合成、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシングする方法など、公知の方法で入手することができる。本発明で用いられる他の各種遺伝子も同様にして得られる。ｃＤＮＡは、相補的ＤＮＡを意味し、ｍＲＮＡ転写産物の逆転写反応産物である。
また、Ｇタンパク質αサブユニットをコードするｃＤＮＡとしては、Ｇ１５、ｈＧ１６、あるいはそれらの配列の一部を改変した変異体をコードするｃＤＮＡが挙げられる。特に、ヒト甘味受容体を発現させる場合には、細胞内のエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）との間の情報伝達を効率的に担うことができる点から、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡが好ましい。ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４は、ヒトＧα１６のＣ末端部分４４アミノ酸残基をＧｇｕｓｔに入れ替えたキメラＧタンパク質である。
本発明において、発現コンストラクトとは、所望のコード配列及び該コード配列を発現させるために必要なプロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子、ＦＲＴ部位をコードする遺伝子などの適切な核酸配列を連結したＤＮＡ断片を、ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞に移動させる核酸分子の意味であり、発現ベクターと同様の意味である。
転写開始シグナルとして機能するプロモーターは、該２９３細胞で導入する遺伝子を発現する機能を有するものであれば限定されず、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＥＦ－１α、ＳＲα、ＣＡＧなどが例示される。
また、転写を終結させる核酸配列であるターミネーターとしては、ＳＶ４０　ｐＡが例示される。ＳＶ４０　ｐＡは、２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃＩＩ制限酵素断片上に含まれ、終結及びポリアデニル化の両方をもたらし、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来するものが多く利用されている。
また、目的とする遺伝子が導入されたことを確認するための目印として導入される遺伝子であるマーカー遺伝子としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが例示される。
また、ＦＲＴ部位をコードする遺伝子は、ｐＦＲＴβＧＡＬ（ＳＴＲＡＴＡＧＥ、ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＤ　ＳＩＴＥＳ、Ｃａｔａｌｏｇ＃２１８４０３、Ｍａｙ　２８、１９９１）に開示される２０８７－２１４７の塩基配列が該当する。
上述した各ｃＤＮＡを挿入する同一のプラスミドとしては、ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞内で、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを発現することができるのであれば、特に制限されない。具体的には、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＳＨ１５、ｐＳＨ１９、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４などが例示される。
本発明においては、上記プラスミドとして、ＦＲＴ部位をコードする遺伝子の片端にハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が配置されたｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（５０７０ｂｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が好適に使用される。ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を持ち、ＦＲＴ部位を有する宿主細胞のＦＲＴ部位で組換えを生じた場合には、ハイグロマイシンＢ耐性かつゼオシン感受性となり、一方、ＦＲＴ部位には組み込まれずに別の部位に組み込まれた場合には、ハイグロマイシンＢ感受性となるため、目的遺伝子がＦＲＴ部位に組み込まれたか否かを容易に区別することができる。ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（５０７０ｂｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の構造を図１に示す。
ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各ｃＤＮＡを同一のプラスミドに挿入して得られる発現コンストラクトとしては、ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列が導入されたｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が好適である（図２）。その理由は、該発現コンストラクトを用いることにより、ｈＴ１Ｒ２、ｈＴ１Ｒ３、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４を同時に発現させることができ、甘味受容体に作用するリガンドに対して非常に感度が良い培養細胞株を得ることができるからである。
本発明において規定されるｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各ｃＤＮＡを同一のプラスミドに挿入して得られる発現コンストラクトは、例えば、以下の工程（ａ）～（ｇ）に従って調製することができる。
（ａ）　ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイト（塩基番号８９５－１０１０）以外の場所に６塩基の置換を行い、制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列（５’-GATATC-３’）を新たに作製する。
この工程（ａ）の好適な態様の１つとして、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の制限酵素Ｂｇｌ ＩＩの認識配列（塩基番号１２―１７）の直下（塩基番号１８―２３）にＥｃｏＲＶの認識配列を導入する態様が挙げられる。この態様は、例えば、以下のサブ工程（ａ１）～（ａ５）に従うことにより、実施することができる。
（ａ１）　５’末端にＢｇｌ ＩＩの認識配列（５’-AGATCT-３’）、その直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つセンスプライマーを設計、作製する。一方、ＢＧＨ ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ａ２）　（ａ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、Ｂｇｌ ＩＩとＥｃｏＲＶの各認識配列が連結した配列を含むＤＮＡ断片を増幅する。
（ａ３）　（ａ２）で増幅したＤＮＡ断片を、Ｂｇｌ ＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ａ４）　ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｂｇｌ
ＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ａ５）　（ａ３）で得られたＤＮＡ断片と、（ａ４）で得られたｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを、ライゲーション反応によって結合させることにより、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌ ＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターを作製する。
ライゲーション反応は、通常のＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて行えばよいが、迅速かつ簡便に処理を行うために、１液タイプのＤＮＡライゲーション試薬であるＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いることが好ましい。
（ｂ）　工程（ａ）で作製したベクターのマルチクローニングサイト（塩基番号８９５－１０１０）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
この工程（ｂ）は、例えば、以下のサブ工程（ｂ１）～（ｂ８）に従うことにより、実施することができる。
（ｂ１）　ｈＴ１Ｒ３のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｂ２）　（ｂ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｂ３）　（ｂ２）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片を、制限酵素Ａｓｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化する。　
（ｂ４）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素Ａｓｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ｂ５）　（ｂ３）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｂ４）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ｂ６）　（ｂ５）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片を精製する。
（ｂ７）　（ａ５）で作製したベクターを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ｂ８）　（ｂ６）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｂ７）で得られたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させることにより、（ａ５）で作製したベクターのマルチクローニングサイトに、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ｃ）　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）に、ＩＲＥＳ配列と、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡとを挿入し、これらが連結された配列（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列）を有するベクター（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-））を作製する。ＩＲＥＳ配列とは、内部リボソーム侵入部位(ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ)をコードする配列を意味する。
この工程（ｃ）は、例えば、以下のサブ工程（ｃ１）～（ｃ１１）に従うことにより、実施することができる。
（ｃ１）　ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマーを設計、作製する。一方、ＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｃ２）　（ｃ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅する。なお、ＥＧＦＰは、Ｅｎｈａｎｓｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎの略である。
（ｃ３）　ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４のコード領域の直前及び直後に、Ｎｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製し、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅する。増幅断片を、Ｎｏｔ
Ｉで消化する。
（ｃ４）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｎｏｔ Ｉで消化する。
（ｃ５）　（ｃ３）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｃ４）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを挿入したベクター（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０）を作製する。
（ｃ６）　ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマーを設計、作製する。一方、ｈＧＨ ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマーを設計、作製する。　
（ｃ７）　（ｃ５）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、（ｃ６）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｃ８）　（ｃ２）で得られたＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化する。
（ｃ９）　（ｃ７）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、Ｎｏｔ Ｉで消化する。
（ｃ１０）　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｎｏｔ Ｉで消化する。
（ｃ１１）　（ｃ８）で得られたＩＲＥＳ配列と、（ｃ９）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｃ１０）で得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を作製する。
（ｄ）　工程（ｂ）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ配列とｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを連結した配列（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列）を挿入する。
この工程（ｄ）は、例えば、以下のサブ工程（ｄ１）～（ｄ３）に従うことにより、実施することができる。
（ｄ１）　（ｃ１１）で作製したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製する。
（ｄ２）　（ｂ８）で作製したベクターをＮｏｔ Ｉで消化し、該ベクター中のｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に存在する部分を切断する。
（ｄ３）　（ｄ１）で得られたＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列と、（ｄ２）で得られたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、（ｂ８）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。この結果、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴが得られる。
（ｅ）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入する。
この工程は、例えば、以下のサブ工程（ｅ１）～（ｅ５）に従うことにより、実施することができる。
（ｅ１）　ｈＴ１Ｒ２のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｅ２）　（ｅ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｅ３）　（ｅ２）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、Ａｓｃ　Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ｅ４）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ａｓｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ｅ５）　（ｅ３）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｅ４）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ｆ）　工程（ｅ）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。
この工程は、例えば、以下のサブ工程（ｆ１）～（ｆ３）に従うことにより、実施することができる。
（ｆ１）　（ｃ１１）で作製したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製する。
（ｆ２）　（ｅ５）で得られたベクターを、Ｎｏｔ Ｉで消化し、該ベクター中のｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に存在する部分を切断する。
（ｆ３）　（ｆ１）で得られたＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列と、（ｆ２）で得られたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、（ｅ５）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。この結果、ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が得られる。
（ｇ）　工程（ｄ）で得られたベクターを、ＥｃｏＲＶで切断し、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列の上流に、工程（ｆ）で得られたｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入して、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各ｃＤＮＡを同一のプラスミドに挿入した発現コンストラクトを得る。
該発現コンストラクトの好適な例は、（ｄ３）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列の上流に、（ｆ３）で作製したベクターのＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡ配列を挿入した発現コンストラクト、すなわち、ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列が導入されたｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴからなる発現コンストラクトである。
この工程（ｇ）は、例えば、以下のサブ工程（ｇ１）～（ｇ３）に従うことにより、実施することができる。
（ｇ１）　Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うためのプライマーを設計、作製し、これを用いて、（ｆ３）で作製したベクターをテンプレートとして、ＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡの領域をＰＣＲによって増幅する。上記プライマーは、（ｄ３）で得られたベクターを制限酵素で線状化したものの末端と相同な約１５塩基を、上記領域のＤＮＡ断片に付加するようにして設計する。
（ｇ２）　（ｄ３）で得られたベクターを、ＥｃｏＲＶで消化する。
（ｇ３）　（ｇ１）で得られたＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡ配列断片と、（ｇ２）で得られたベクターとを、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合させて、（ｄ３）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列の上流に、（ｆ３）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入した発現コンストラクトを作製する。Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）による結合は、（ｇ１）で得られたＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡ配列断片と、（ｇ２）で得られたベクターを混合し、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ酵素と所定のバッファーを加えて、通常、３７℃で１５分、次いで、５０℃で１５分反応を行う。Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によれば、制限酵素サイトの制約を受けることなく、また、長鎖ＤＮＡ断片でも、目的ＤＮＡ断片のクローニングが可能である。
以上の方法によって、本発明のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を同定する際に使用する培養細胞株を得るために必要な発現コンストラクトが得られる。
次に、本発明のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を同定するために使用する培養細胞株の作製方法について説明する。
該培養細胞株の作製は、Ｆlｐ-Ｉｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞に、上記発現コンストラクトと、Ｆｌｐリコンビナーゼ発現ベクターであるｐＯＧ４４をコトランスフェクションすることによって行われる。Ｆlｐ-Ｉｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によれば、トランジエントに発現したＦｌｐリコンビナーゼにより、２９３細胞のゲノムＤＮＡ中に保持されたＦＲＴ部位が開裂して、その部分に外来遺伝子が導入され、該遺伝子が発現する。すなわち、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードする各遺伝子は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＦｌｐリコンビナーゼと、Ｆｌｐリコンビナーゼの標的部位であるＦＲＴ部位を利用した部位特異的組換えにより、２９３細胞の染色体のＦＲＴ部位に挿入され、その結果、安定的にｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４を発現する培養細胞株が迅速かつ効果的に得られる。この培養細胞株において、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードする各遺伝子は、２つのｍＲＮＡに転写された後、３つのタンパク質、すなわち、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４に翻訳される。
ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞は、例えば、以下のようにして作製することができる。
まず、宿主細胞である２９３細胞に、ＦＲＴ部位を導入するためのベクターであるｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏを遺伝子導入し、導入された細胞をゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）で選択する。ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏは、ｌａｃＺとゼオシン耐性遺伝子の融合遺伝子を持つため、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏがゲノムに導入された細胞は、β-ガラクトシダーゼを発現し、ゼオシン耐性となる。ゼオシン感受性の程度をβ-ガラクトシダーゼアッセイにより確認することができる。
次いで、ｌａｃＺ遺伝子に対してのサザンブロット法を行う。これにより、ゲノム中の転写されうる位置の１か所だけにＦＲＴ部位が組み込まれていることが確認される。ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞として、市販されているＦｌｐ-Ｉｎ-２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるのが簡便である。
　本発明のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を同定するのに使用する培養細胞株の作製は、ＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞に、上記発現コンストラクト及びＦｌｐリコンビナーゼの発現ベクターであるｐＯＧ４４をコトランスフェクションし、ハイグロマイシンＢを含む選択培地にて、ハイグロマイシンＢ耐性の細胞株を選択することによって行うことができる。
Ｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異的な組換え反応を行う酵素の一種であり、該酵素の発現ベクターであるｐＯＧ４４が公知である。上記発現コンストラクト及びｐＯＧ４４をコトランスフェクションすると、発現したＦｌｐリコンビナーゼにより、上記発現コンストラクトは上記２９３細胞のＦＲＴ部位に挿入されて、２９３細胞はハイグロマイシンＢ耐性、ゼオシン感受性に変化するので、これらの薬剤耐性を指標とすることによって目的の遺伝子が挿入されたか否かを容易に判定することができる。
コトランスフェクションする方法としては、公知の方法、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム-ＤＮＡ沈殿法、塩化カルシウム法、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥ-デキストラン法、マイクロインジェクション法など、適宜選択することができる。
こうして、ゲノム中の同じ位置に発現コンストラクトが入り、ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４が同時に発現された培養細胞株を得ることができる。ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の発現は、培養細胞株からタンパク質を抽出し、ｈＴ１Ｒ２抗体、ｈＴ１Ｒ３抗体、及びキメラタンパク質ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４を認識可能な抗体を用いたウェスタンブロット法により確認することができる。
上記安定発現細胞は、栄養培地で培養することにより、増殖及び／又は維持される。該安定発現細胞の増殖及び／又は維持の具体的方法に関しては適宜決定すればよいが、グルコースによる脱感作を最小限にするため、例えば、L-グルタミンを４ｍＭになるよう補足された低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ダルベッコ改変イーグル(ＤＭＥＭ)培地（Vｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６、１９５９）に、１０％ＨＩ-ＦＢＳ（Ｈｅａｔ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）及び１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を加えたものを用いて、３７℃で増殖及び／又は維持を行うことが好ましい。
本発明のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質は、上記安定培養細胞株を利用して、ある特定の甘味物質を該培養細胞株に接触させて、それによって発生した生理的応答を測定し、次いで、該甘味物質にヒト甘味受容体作用性甘味調節物質の候補物質を添加したものを上記養細胞株に接触させて、それによって発生した生理的応答を測定し、両方の測定結果を比較することによって同定される。
本発明のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を同定するために、ヒト甘味受容体作用性甘味調節物質の候補物質をスクリーニングするには、例えば、以下のようにして行う。
まず、前述したように、上記発現コンストラクトを発現させた培養細胞株を取得し、次いで、該培養細胞の所定の数を多数のウェル（２４穴、４８穴、９６穴、３８４穴など）を有するマイクロプレートの各ウェルに撒き（例えば、１万～５０万個／ウェル）、所定の培地（例えば、ＤＭＥＭ培地）中で１日培養する。
その後、特定の甘味物質又は甘味物質とヒト甘味受容体作用性甘味調節物質の候補物質とを添加した各場合において、上記安定培養細胞株に発生した生理的応答を測定し、甘味物質が単独の場合の測定値と、候補物質を添加した場合の測定値とを比較し、その差異の程度に基づいて、甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を同定する。該候補物質には、自然界に存在する物質のほか、人工的に調製された任意の物質が含まれる。
培養細胞株に発生した生理的応答を測定する場合、生理的応答としては、甘味受容体の活性化に伴って変化する事象が適宜選択される。甘味受容体が活性化されると、その後、細胞内で種々の現象が開始される。味物質が受容体に結合すると、細胞内のセカンドメッセンジャー（ＩＰ３（イノシトール三リン酸）、ＤＡＧ）などを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇する。したがって、測定対象とする生理的応答としては、甘味受容体の活性化に伴って変化する細胞内のセカンドメッセンジャーの変化、細胞内のカルシウム濃度の変化などが挙げられる。
本発明においては、甘味物質に対する生理的応答の測定は、甘味刺激によって惹起される細胞内のカルシウム濃度の変化を、蛍光カルシウム指示薬を用いることにより細胞外から観察するカルシウムイメージング法で行うのが好適である。これにより、従来の官能評価とは異なり、受容体レベルでの甘味増強効果又は抑制効果の客観的な評価が可能となる。また、甘味増強又は抑制の程度を数値化することにより、各種物質の甘味増強効果又は抑制効果を相互に比較することができる。
甘味物質が単独の場合の測定結果と、ヒト甘味受容体作用性甘味調節物質の候補物質を添加した場合の測定結果とを比較し、その差異の程度に基づいて、甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を同定するが、どの程度の差異があることをもって、本発明のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質とするかについては、例えば、カルシウムイメージング法による場合、測定された細胞応答に統計学的に有意な差が認められる場合には、本発明のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質であると判断できる。
蛍光カルシウム指示薬には、生理的に変化し得るカルシウム濃度において蛍光特性が変化すること、及びそのときの変化がカルシウム特異的に誘導されること、が要求されるため、現在、錯形成部位と蛍光発色団が結合した構造を有する化合物が蛍光指示薬として汎用されている。本発明では、そのような蛍光カルシウム指示薬であるＦｌｕｏ-４　ＡＭ、Ｆｕｒａ-２　ＡＭを使用することが好適である。
本発明においては、カルシウムイメージング法を用いて、甘味物質に対する生理的応答を数値化及び可視化することにより、ヒト甘味受容体のレベルで実際に甘味調節作用が起きているのかどうかを検証することが好ましい。そのために、例えば、マルチプレートリーダーによる同時アッセイにより、細胞応答の数値化を行い、さらに、顕微鏡を用いたイメージングにより、細胞内のカルシウム濃度の変化を画像化して、各細胞が応答しているかを観察する。マルチプレートリーダーによる同時アッセイに使用した蛍光指示薬とは異なる蛍光指示薬を使用した顕微鏡観察を行うことにより、細胞応答がアーティファクトによるものでないことを確認できる。
マルチプレートリーダーによる同時アッセイは、公知の方法に従って適宜行えばよいが、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、自動化蛍光カルシウムイメージングを行うのが簡便かつ迅速であり、ハイスループットアッセイが可能となる。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　Ｍ５ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）の性能と、８チャンネルピペッターを融合させたマルチプレートリーダーである。 
ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いた自動化蛍光イメージングは、例えば、以下の手順に従って行うことができる。
まず、ハイグロマイシンＢを除いた低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ＤＭＥＭ培地で細胞を懸濁し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　Ｓｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、７～８万個ずつ撒く。
次いで、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、適当量のＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸）バッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲ　Ｃａ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏ-４　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに添加する。蛍光指示薬Ｆｌｕｏ-４（励起波長：４９５ｎｍ、蛍光波長：５１８ｎｍ）は、細胞内への移行を容易にするため、脂溶性のアセトキシメチル基が導入されており、培地中に添加されると容易に細胞内に取り込まれ、細胞内のエステラーゼにより加水分解される。加水分解されたＦｌｕｏ-４は、細胞膜を透過しにくくなり、細胞内に拡散してカルシウムと錯形成し、強い蛍光を発する。蛍光観察用の９６ウェルプレートには、プラスチック底とフィルム底があり、プラスチック底のプレートは細胞の接着性及び成長が良いので、ウェル全体を観察するマルチプレートリーダーを用いた同時アッセイ時に使用されるが、このプラスチック底のプレートは、ＵＶ波長の透過性が悪く、Ｆｕｒａ-２の励起光の透過を阻害するため、Ｆｌｕｏ-４を用いる。
次いで、２７～３７℃で３０～６０分間インキュベートした後、これに特定濃度の甘味物質又は甘味物質と試験する物質の溶液を添加することにより、２７～３７℃で味刺激を行う。
甘味物質又は甘味物質と試験する物質の添加直後から６０～１２０秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を測定することにより、甘味刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を定量することができる。
蛍光顕微鏡を用いた蛍光カルシウムイメージングは、以下の手順に従って行うことができる。
まず、ハイグロマイシンＢを除いた低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ＤＭＥＭ培地で細胞を懸濁し、９６ウェルプレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｌｕｍｏｘ)の各ウェル上に４～８万個ずつ撒く。
次いで、３７℃で２４～４８時間培養した後、培地を除去し、適当量のＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｆｕｒａ-２　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに添加する。
次いで、２７～３７℃で３０～６０分間インキュベートした後、細胞外の蛍光指示薬を除去し、最終的に適当量のＨＥＰＥＳバッファーで置換し、１０～２０分間室温にて静置する。これに特定濃度の甘味物質又は甘味物質と試験する物質の溶液を適当量添加することにより室温で味刺激を行う。蛍光指示薬Ｆｕｒａ-２（励起波長：３４０ｎｍ／３８０ｎｍ、蛍光波長：５１０ｎｍ）は、カルシウムイオン濃度が高くなると３４０ｎｍ励起の蛍光強度が上昇し、３８０ｎｍ励起の蛍光強度が低下する。
次いで、甘味物質又は甘味物質と試験する物質の溶液の添加直後から６０～３００秒後にかけて、顕微鏡視野中の蛍光像（３４０ｎｍ，３８０ｎｍ励起で５１０ｎｍ蛍光）を取り込み、２波長励起蛍光の比率を擬似カラーで表示することにより、甘味刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を観察することができる。
以上のようにして、本発明では、生理的応答を測定する際に、カルシウムイメージング法において、蛍光特性の異なる２種類の上記蛍光指示薬を併用することにより、観察系によらない普遍的な現象を観察することができる。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
（実施例１）
ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株の調製
まず、発現コンストラクトとして、ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有するｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（図２）を、以下の手順に従って作製した。
　５’末端にＢｇｌ ＩＩの認識配列（５’-AGATCT-３’）、その直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つセンスプライマー（配列番号１：TATAGATCTGATATCCCCCTATGGTGCACTCTC）及びＢＧＨｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマー（配列番号２：TAGAAGGCACAGTCGAGG）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、Ｂｇｌ ＩＩとＥｃｏＲＶの各認識配列が連結した配列を含むＤＮＡ断片を増幅した。
次いで、この増幅したＤＮＡ断片を、Ｂｇｌ ＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｂｇｌ ＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化した。これらをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させることにより、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌ
ＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターを作製した。
次いで、ｈＴ１Ｒ３のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号３：GATCGGCGCGCCGCCATGCTGGGCCCTGCTGTC）及びアンチセンスプライマー（配列番号４：GATCGCGGCCGCTCACTCATGTTTCCCCTG）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを増幅した。
増幅したＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片を、Ａｓｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化し、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ａｓｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化した。そして、これらをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入した。次いで、これをＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片を精製した。
このｃＤＮＡ断片と、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化した、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌ ＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させることにより、該ベクターのマルチクローニングサイトに、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入した。　　　　　
次いで、ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号５：GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCCCC）及びＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマー（配列番号６：GGTTGTGGCCATATTATC）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅した。
ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４のコード領域の直前及び直後に、Ｎｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号７：GATCGCGGCCGCATGGCCCGCTCGCTGACC）、アンチセンスプライマー（配列番号８：GATCGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTT A）を設計、作製した。ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅した。増幅断片をＮｏｔ Ｉで消化し、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＮｏｔ Ｉで消化して、これらをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを挿入したベクター（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０）を作製した。
次いで、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマー（配列番号９：　ATGGCCCGCTCGCTGACC）及びｈＧＨ ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマー（配列番号１０：CTGGATGCAGGCTACTCTA）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅した。
次いで、Ｅｃｏ５２Ｉで消化した上記ＩＲＥＳ配列と、Ｎｏｔ Ｉで消化した上記ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡと、Ｎｏｔ Ｉで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を作製した。
次いで、前述したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製した。
そして、マルチクローニングサイトにｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入した上記ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＮｏｔ Ｉで消化し、該ベクター中のｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に存在する部分を切断した。このベクターと上記のＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入してなる、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴを得た。
次いで、ｈＴ１Ｒ２のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号１１：GATCGGCGCGCCGCCATGGGGCCCAGGGCAAAG）及びアンチセンスプライマー（配列番号１２：GATCGCGGCCGCCTAGTCCCTCCTCATGGT）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅した。得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、Ａｓｃ　Ｉ及びＮｏｔ
Ｉで消化し、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ａｓｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化して、これらをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入した。
次いで、前述したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製した。
そして、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入したｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＮｏｔ Ｉで消化し、該ベクター中のｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に存在する部分を切断した。このベクターと上記ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入し、ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を得た。
次いで、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うためのプライマー（配列番号１３：ATCGGGAGATCTGATGCATAACTAGTGAGGCTC及び配列番号１４：GCACCATAGGGGGATAGCGGATCCAGACATGAT）を設計、作製し、これを用いて、上記のｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をテンプレートとして、ＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡの領域をＰＣＲによって増幅した。
そして、このＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡ配列断片と、ＥｃｏＲＶで消化したｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴとを、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合させて、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列の上流に、ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入した発現コンストラクトを作製した。
次いで、上記発現コンストラクト０．８μｇと、ｐＯＧ４４　７．２μｇとをリポフェクション法で、２００万個のＦｌｐ-Ｉｎ-２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。トランスフェクション２日後より、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を含む培地によりハイグロマイシン耐性の細胞を選択した。同様の培地を用いて培養を続けることで、以下の実施例においてヒト甘味受容体作用性甘味調節物質の同定に使用するヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とＧタンパク質αサブユニットを共に機能的に安定して発現する培養細胞株を樹立した。
その後、この培養細胞株を１０％ＨＩ-ＦＢＳ（Ｈｅａｔ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)、L-グルタミン４ｍＭを含む低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ダルベッコ改変イーグル(ＤＭＥＭ)培地で、３７℃で増殖、維持した。
（実施例２）
スクロース刺激に対して、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＣ）を添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
スクロースによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加することにより、どのように変化するかについて、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例１で得た甘味受容体発現細胞をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　Ｓｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。　
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲ　Ｃａ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏ-４　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、スクロースの終濃度が表１に記載された濃度となるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でスクロース刺激を行った。
そして、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、スクロース刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表１及び図３に示す。
上記と同様にして、自動化蛍光イメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が表２に記載された濃度となるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの終濃度が２ｖ／ｖ％となるように、ｃｏｎｃ．ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して２７℃で刺激を行い、該溶液の添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、スクロースにネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の応答を定量した。結果を表２及び図３に示す。図３の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のスクロース濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、スクロースによる生理的応答がネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加することにより相乗的に上昇することが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（実施例３）
スクロース刺激に対して、シクラメートを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
スクロースによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、シクラメートを添加することにより、どのように変化するかについて、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例２と同様にして、自動化蛍光イメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が表３に記載された濃度となるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、シクラメートの終濃度が１ｍＭとなるように、シクラメートを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して２７℃で刺激を行い、該溶液の添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、スクロースにシクラメートを添加した場合の甘味受容体発現細胞の応答を定量した。結果を表３及び図３に示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、スクロースによる生理的応答がシクラメートを添加することにより相乗的に上昇することが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（実施例４）
スクロース刺激に対して、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒドを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
スクロースによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒドを添加することにより、どのように変化するかについて、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例２と同様にして、自動化蛍光イメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が表４に記載された濃度となるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒドの終濃度が０．２５ｖ／ｖ％となるように、ｃｏｎｃ．ｐ－メトキシシンナミックアルデヒドを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して２７℃で刺激を行い、該溶液の添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、スクロースにｐ－メトキシシンナミックアルデヒドを添加した場合の甘味受容体発現細胞の応答を定量した。結果を表４及び図３に示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、スクロースによる生理的応答がｐ－メトキシシンナミックアルデヒドを添加することにより相乗的に上昇することが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
（実施例５）
スクロース刺激に対して、シクロテンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
スクロースによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、シクロテンを添加することにより、どのように変化するかについて、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例２と同様にして、自動化蛍光イメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が表５に記載された濃度となるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、シクロテンの終濃度が０．２５ｍＭとなるように、シクロテンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して２７℃で刺激を行い、該溶液の添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、スクロースにシクロテンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の応答を定量した。結果を表５及び図３に示す。
この結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、スクロースによる生理的応答がシクロテンを添加することにより相乗的に上昇することが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
実施例２～５で試験された各物質の濃度は、いずれも該物質を単独で投与した際に細胞応答が観察される濃度以下であるが、スクロースに対する細胞応答の感度を相乗的に上昇させることができた。
なお、スクロースは甘味の程度が弱いため、５０ｍＭ程度の濃度で添加しないと甘味受容体細胞の応答は観察されない。しかし、逆に２００ｍＭを超える濃度のスクロース溶液を添加すると、細胞が浸透圧の影響を受けるため、正常な細胞応答を測定することが困難になる。したがって、通常、細胞を用いた甘味アッセイ系でスクロースの甘味度を数値化できるのは約５０から２００ｍＭという狭い範囲に限定されるが、上記細胞系及び当該ヒト甘味受容体作用性甘味増強物質を利用すれば、この限界値の下限を更に低くすることが可能になる。
（実施例６）
スクロース刺激に対して、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
スクロースによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加することにより、どのように変化するかについて、蛍光顕微鏡を用いた蛍光カルシウムイメージングにより解析した。
まず、ハイグロマイシンＢを除いた低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ＤＭＥＭ培地で、実施例１で得た甘味受容体発現細胞を懸濁し、９６ウェルプレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｌｕｍｏｘ)の各ウェル上に約８万個ずつ撒いた。
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｆｕｒａ-２　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。
次いで、２７℃で３０分間インキュベートした後、細胞外の蛍光指示薬を除去し、最終的に１００μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、１５分間室温にて静置して、蛍光顕微鏡を用いた蛍光カルシウムイメージングに供する細胞を調製した。
この細胞に、スクロースの終濃度が１００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温でスクロース刺激を行った。
そして、該スクロース溶液を添加してから３０秒後の顕微鏡視野中の蛍光像（３４０ｎｍ、３８０ｎｍ励起で５１０ｎｍ蛍光）を取り込み、２波長励起蛍光の比率を擬似カラーで表示し、スクロースによる細胞応答を観察した。結果を図４に示す。
上記と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの終濃度が５ｖ／ｖ％となるように、ｃｏｎｃ．ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温で刺激を行い、細胞の状態を蛍光画像で観察した。結果を図４に示す。
上記と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が１００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの終濃度が５ｖ／ｖ％となるように、ｃｏｎｃ．ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温で刺激を行い、細胞の状態を蛍光画像で観察した。結果を図４に示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、スクロースによる生理的応答がネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加することにより増大することが視覚的に確認できた。
（実施例７）
スクロース刺激に対して、シクラメートを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
スクロースによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、シクラメートを添加することにより、どのように変化するかについて、蛍光顕微鏡を用いた蛍光カルシウムイメージングにより解析した。
実施例６と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が１００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温でスクロース刺激を行い、スクロース溶液を添加してから３０秒後の顕微鏡視野中の蛍光像（３４０ｎｍ、３８０ｎｍ励起で５１０ｎｍ蛍光）を取り込み、２波長励起蛍光の比率を擬似カラーで表示し、スクロースによる細胞応答を観察した。結果を図４に示す。
実施例６と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、シクラメートの終濃度が０．５ｍＭとなるように、シクラメートを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温で刺激を行い、細胞の状態を蛍光画像で観察した。結果を図４に示す。
実施例６と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が１００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、シクラメートの終濃度が０．５ｍＭとなるように、シクラメートを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温で刺激を行い、細胞の状態を蛍光画像で観察した。結果を図４に示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、スクロースによる生理的応答がシクラメートを添加することにより増大することが視覚的に確認できた。
（実施例８）
スクロース刺激に対して、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒドを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
スクロースによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒドを添加することにより、どのように変化するかについて、蛍光顕微鏡を用いた蛍光カルシウムイメージングにより解析した。
実施例６と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が１００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温でスクロース刺激を行い、スクロース溶液を添加してから３０秒後の顕微鏡視野中の蛍光像（３４０ｎｍ、３８０ｎｍ励起で５１０ｎｍ蛍光）を取り込み、２波長励起蛍光の比率を擬似カラーで表示し、スクロースによる細胞応答を観察した。結果を図４に示す。
実施例６と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒドの終濃度が５ｖ／ｖ％となるように、ｃｏｎｃ．ｐ－メトキシシンナミックアルデヒドを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温で刺激を行い、細胞の状態を蛍光画像で観察した。結果を図４に示す。
実施例６と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が１００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒドの終濃度が５ｖ／ｖ％となるように、ｃｏｎｃ．ｐ－メトキシシンナミックアルデヒドを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温で刺激を行い、細胞の状態を蛍光画像で観察した。結果を図４に示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、スクロースによる生理的応答がｐ－メトキシシンナミックアルデヒドを添加することにより増大することが視覚的に確認できた。
（実施例９）
スクロース刺激に対して、シクロテンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
スクロースによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、シクロテンを添加することにより、どのように変化するかについて、蛍光顕微鏡を用いた蛍光カルシウムイメージングにより解析した。
実施例６と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が１００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温でスクロース刺激を行い、スクロース溶液を添加してから３０秒後の顕微鏡視野中の蛍光像（３４０ｎｍ、３８０ｎｍ励起で５１０ｎｍ蛍光）を取り込み、２波長励起蛍光の比率を擬似カラーで表示し、スクロースによる細胞応答を観察した。結果を図４に示す。
実施例６と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、シクロテンの終濃度が０．５ｍＭとなるように、シクロテンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温で刺激を行い、細胞の状態を蛍光画像で観察した。結果を図４に示す。
実施例６と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が１００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、シクロテンの終濃度が０．５ｍＭとなるように、シクロテンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温で刺激を行い、細胞の状態を蛍光画像で観察した。結果を図４に示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、スクロースによる生理的応答がシクロテンを添加することにより増大することが視覚的に確認できた。
（実施例１０）
アスパルテーム刺激に対して、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
アスパルテームによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加することにより、どのように変化するかについて、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例２と同様に調製した自動化蛍光イメージングに供する細胞に、アスパルテームの終濃度が表６に記載された濃度となるように、アスパルテームを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でアスパルテーム刺激を行った。
そして、アスパルテームを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、アスパルテームによる甘味刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表６及び図５に示す。
上記と同様にして、実施例２と同様に調製した自動化蛍光イメージングに供する細胞に、アスパルテームの終濃度が表７に記載された濃度となるように、アスパルテームを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの終濃度が５ｖ／ｖ％となるように、ｃｏｎｃ．ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して２７℃で刺激を行い、該溶液の添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、アスパルテームにネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の応答を定量した。結果を表７及び図５に示す。図５の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のアスパルテーム濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、アスパルテームによる生理的応答がネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加することにより相乗的に上昇することが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（実施例１０）
ステビア刺激に対して、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
ステビアによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加することにより、どのように変化するかについて、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例２と同様に調製した自動化蛍光イメージングに供する細胞に、ステビアの終濃度が表８に記載された濃度となるように、ステビアを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でステビア刺激を行った。
そして、ステビアを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から４０秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、ステビアによる甘味刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表８及び図６に示す。
上記と同様にして、実施例２と同様に調製した自動化蛍光イメージングに供する細胞に、ステビアの終濃度が表９に記載された濃度となるように、ステビアを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの終濃度が５ｖ／ｖ％となるように、ｃｏｎｃ．ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して２７℃で刺激を行い、該溶液の添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、ステビアにネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の応答を定量した。結果を表９及び図６に示す。図６の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のステビア濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、ステビアによる生理的応答がネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加することにより相乗的に上昇することが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
（実施例１０）
サッカリン刺激に対して、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
サッカリンによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加することにより、どのように変化するかについて、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例２と同様に調製した自動化蛍光イメージングに供する細胞に、サッカリンの終濃度が表１０に記載された濃度となるように、サッカリンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でサッカリン刺激を行った。
そして、サッカリンを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、サッカリンによる甘味刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表１０及び図７に示す。
上記と同様にして、実施例２と同様に調製した自動化蛍光イメージングに供する細胞に、サッカリンの終濃度が表１１に記載された濃度となるように、サッカリンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの終濃度が５ｖ／ｖ％となるように、ｃｏｎｃ．ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して２７℃で刺激を行い、該溶液の添加直後から４０秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、サッカリンにネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加した場合の甘味受容体発現細胞の応答を定量した。結果を表１１及び図７に示す。図７の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のサッカリン濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、サッカリンによる生理的応答がネオヘスペリジンジヒドロカルコンを添加することにより相乗的に上昇することが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
  
（実施例１１）
スクロース刺激に対して、エチルバニリン又はマルトールを添加した場合の甘味受容体発現細胞の生理的応答
スクロースによる甘味受容体発現細胞の生理的応答が、エチルバニリン又はマルトールを添加することにより、どのように変化するかについて、蛍光顕微鏡を用いた蛍光カルシウムイメージングにより解析した。
実施例２と同様にして、自動化蛍光イメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が２００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温でスクロース刺激を行った。
そして、該スクロース溶液を添加してから３０秒後の顕微鏡視野中の蛍光像（３４０ｎｍ、３８０ｎｍ励起で５１０ｎｍ蛍光）を取り込み、２波長励起蛍光の比率を擬似カラーで表示し、スクロースによる細胞応答を観察した。結果を図８に示す。
上記と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が２００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、エチルバニリンの終濃度が１ｍＭとなるように、エチルバニリンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温で刺激を行い、細胞の状態を蛍光画像で観察した。結果を図８に示す。
また、上記と同様にして、蛍光カルシウムイメージングに供する細胞に、スクロースの終濃度が２００ｍＭとなるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加し、さらに、マルトールの終濃度が１ｍＭとなるように、マルトールを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加することにより室温で刺激を行い、細胞の状態を蛍光画像で観察した。結果を図８に示す。
得られた結果から、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とキメラＧタンパク質（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４）を共に機能的に安定して発現させた培養細胞株において、スクロースによる生理的応答がエチルバニリン又はマルトールを添加することにより抑制されることが視覚的に確認できた。
本発明によれば、ヒト甘味受容体を介する甘味調節効果が客観的に確認されたヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を提供することができ、幅広い飲食品に適用することにより、味の改善、甘味料の節約、低カロリー化、低う蝕性などの有益な効果を得ることができる。

Claims (10)

  1. ｈＴ１Ｒ２及びｈＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各ｃＤＮＡを同一のプラスミドに挿入して得られた発現コンストラクトを、ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ）部位が１か所組み込まれた２９３細胞に導入して発現させた培養細胞株を用いた、甘味物質による生理的応答の測定によって同定された、甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味調節物質。
  2. Ｇタンパク質αサブユニットが、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４である請求項１に記載のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質。
  3. 甘味物質が、スクロースである請求項１又は２に記載のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質。
  4. 甘味物質に対する生理的応答の測定が、カルシウムイメージングによる測定である請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質。
  5. ヒト甘味受容体作用性甘味調節物質が、ヒト甘味受容体作用性甘味増強物質である請求項１～４のいずれか１項に記載のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質。
  6. 請求項５に記載のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を含むヒト甘味受容体作用性甘味増強剤。
  7. ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＣ）、シクラメート、ｐ－メトキシシンナミックアルデヒド又はシクロテンを含む、甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味増強剤。
  8. ヒト甘味受容体作用性甘味調節物質が、ヒト甘味受容体作用性甘味抑制物質である請求項１～４のいずれか１項に記載のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質。
  9. 請求項８に記載のヒト甘味受容体作用性甘味調節物質を含むヒト甘味受容体作用性甘味抑制剤。
  10. ラクチゾール、バニリン、エチルバニリン、クレオソール、又はマルトールを含む、甘味物質に対するヒト甘味受容体作用性甘味抑制剤。
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