WO2011067970A1 - 甘味受容体発現コンストラクト、これを発現させた細胞体、及びその利用 - Google Patents

甘味受容体発現コンストラクト、これを発現させた細胞体、及びその利用 Download PDF

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WO2011067970A1
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WO
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sweet
hg16gust44
expression construct
subunit
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PCT/JP2010/065366
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啓子 阿部
巧 三坂
隆将 今田
藤原　聡
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長谷川香料株式会社
国立大学法人東京大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates

Definitions

  • the present invention relates to a sweet receptor expression construct, a cell body in which the sweet receptor expression construct is expressed, and use thereof, and more specifically, a sweet receptor (T1R2 + T1R3) and a G protein are both functionally and stably expressed to obtain a desired sweet taste receptor.
  • the present invention relates to a sweet receptor expression construct useful for producing somatically-expressing cells, a cell body in which the sweet receptor is expressed, and use thereof.
  • Sense of taste is a sensation that occurs when a substance binds to a specific receptor present on the surface of the tongue, especially when the substance is put into the mouth.
  • Mammalian taste is composed of five basic tastes, namely salty taste, sour taste, sweet taste, umami taste, and bitter taste, and these basic tastes are thought to be formed by integration.
  • saltiness and sourness are said to be detected through several ion channel receptors expressed on the cell membrane on the proximal side of taste cells present in the taste buds on the tongue surface, especially Regarding sourness, it is considered that an ion channel type receptor composed of PKD2L1 + PKD1L3, which is a TRP channel family, functions.
  • sweet taste is a heterodimer of T1R2 + T1R3 (sweet receptor)
  • umami is a taste of T1R1 + T1R3. It has been shown that it is accepted by heterodimers (umami receptors), and bitterness is accepted by about 30 molecules (bitter taste receptors) named T2R family.
  • the G protein is composed of three subunits, ⁇ , ⁇ , and ⁇ .
  • the ⁇ , ⁇ , and ⁇ subunits are bound in an inactive state.
  • the GDP (guanosine 5 ′ diphosphate) bound to the ⁇ subunit becomes GTP.
  • To form an active form dissociated into a conjugate of GTP- ⁇ subunit and ⁇ - ⁇ subunit.
  • sweetness has a characteristic that the minimum sensitivity (threshold value) is higher than other basic tastes, and it is difficult to detect in a small amount.
  • the sweetness is too strong, unhealthy images such as high calories and obesity are induced. Therefore, when producing a food or drink with sweetness, it is important to adjust the intensity of sweetness so that the sweetness can be perceived by humans and is preferably accepted.
  • the intensity of sweetness sensed when a human contains food or drink in the mouth has been verified mainly by human sensory evaluation.
  • sensory evaluation information sensed from taste and olfaction is evaluated in an integrated manner, so it is difficult to verify how much a substance acts on taste.
  • it is very difficult to verify the degree of sweetness of substances having sweetness below the threshold because humans cannot perceive sweetness at a level below the threshold.
  • sensory evaluation or sensory test cannot ignore the variation in evaluation between well-trained evaluators (called panels or panelists).
  • sweetness is a central taste in determining palatability of foods and drinks
  • a substance that acts on a sweet taste receptor to enhance sweetness can be identified
  • identification By using the prepared substance, it is possible to achieve beneficial effects such as improving tastes of foods and drinks, pharmaceuticals, etc., reducing the amount of sweetener used, and reducing calorie intake. Therefore, there is a great deal of interest in such sweetness-enhancing substances from industries such as foods and beverages and flavors.
  • a G ⁇ 15-expressing cell line (Aurora Bioscience's HEK-293 cell line) is derived from a linearized pEAK10 containing the expression construct of hT1R2 (plasmid SAV2486) (Edge Biosystems) and a cell line produced by co-expressing hT1R2 / hT1R3 by transfecting a pCDNA3.1 / ZEO-derived (Invitrogen) vector containing the hT1R3 expression construct (plasmid SXV550).
  • plasmid SAV2486 Edge Biosystems
  • Example 6 of Patent Document 2 a vector containing hT1R2 cDNA, a vector containing hT1R3 cDNA, a vector containing a gene encoding a chimeric G ⁇ protein, and a transfection efficiency marker pDsRed2-N1 (Takara Bio Inc.) )
  • a HEK-293T cell using Lipofectamine 2000 reagent so that the DNA introduction ratio is a weight ratio (4: 4: 1: 0.2) and the introduction amount is 4.6 to 5.5 ⁇ g.
  • a signaling system in which hT1R2-hT1R3 and a chimeric G ⁇ protein are coexpressed in HEK-293T cells has been disclosed.
  • Example 7 of Patent Document 3 a linear pIRES2-Puro vector (Clontech) containing cDNA encoding hT1R3 was transfected into cells expressing G ⁇ 16gust44, and then linear containing cDNA encoding hT1R2 A cell line produced by co-expressing hT1R2 / hT1R3 by transfecting pcDNA4-TO vector (Invitrogen) is described.
  • Any cell line expressing a conventional sweet taste receptor has previously prepared or obtained a cell expressing a predetermined G protein, a vector containing a gene encoding T1R2, and a gene encoding T1R3 Each of which is produced by transfecting a vector containing.
  • the efficiency of introduction of each vector into the cell is not the same, either of them may be introduced preferentially, and the introduced target gene may be introduced into the cell's genome. Inserted at random, and in extreme cases, the introduced target gene may be inserted into an inactive portion of the genome that is not transcribed. Therefore, the obtained cell line has the following problems. (1) Some conventional cell lines do not express either or both of T1R2 and T1R3, and some of them do not substantially have a series of intracellular signal transduction mechanisms. It was. That is, the conventional cell line cannot be said to be a functionally superior model having a sweetness receiving / transmitting mechanism.
  • this invention is providing the expression construct which can solve the said problem, and the stable expression cell body which expressed this expression construct.
  • the inventors of the present invention have the same FRT site, which is a specific recognition site for Flp recombinase, and the same genes encoding T1R2, T1R3, and G protein.
  • An expression construct inserted into a plasmid is prepared, and introduced into a predetermined cell to express T1R2, T1R3, and G protein, whereby both the sweet receptor (T1R2 + T1R3) and the G protein ⁇ subunit function with high expression efficiency.
  • the present invention has been completed based on this finding.
  • the present invention provides a sweet receptor expression construct obtained by inserting each gene encoding the sweet receptor subunits T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit into the same plasmid.
  • the present invention provides a method for transfecting a sweet receptor expression construct according to any one of claims 1 to 12 into a 293 cell in which an FRT (Flippase Recognition Target) sequence is integrated at one site in the genome.
  • the present invention provides a cell line in which the sweet taste receptor subunits T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit are simultaneously expressed.
  • the present invention is also the use of the above cell line for measuring a physiological response to a sweet substance.
  • the present invention adds a sweetness-enhancing substance to a specific sweet substance identified by measuring a physiological response to a sweet substance using the above cell line when measuring the physiological response of the sweet substance.
  • the physiological response of the sweet substance is measured at a concentration below the sweetness threshold of the sweet substance.
  • the sweet receptor expression construct of the present invention can functionally express T1R2, T1R3, and a G protein conjugated thereto so that intracellular signal transduction by sweet receptor stimulation occurs. Therefore, the cell line in which the construct is expressed is an optimal model that can objectively evaluate the perception of sweetness caused by actual sweetness acceptance in vivo, and identifies sweet substances, sweet taste regulators, etc. Can be used as a taste sensor of choice, and is particularly useful in high throughput screening assays.
  • the sweet taste-regulating substance means a substance that alters the physiological response from the sweet taste receptor obtained by the sweet taste substance alone, that is, the sweetness intensity by acting on the sweet taste receptor (T1R2 + T1R3).
  • the sweet taste receptor expression construct of the present invention can functionally express T1R2, T1R3, and the G protein conjugated thereto at an equivalent ratio. Therefore, according to the cell line of the present invention, it is possible to perform comparative experiments by direct comparison with respect to a sweet receptor into which different point mutants are introduced or a plurality of stable expression lines in which various G proteins are expressed.
  • the cell line of the present invention can express T1R2, T1R3, and G protein conjugated to them over a long period of time, and has high stability. Regardless of the number of passages, changes in the expression levels of T1R2, T1R3, and G proteins conjugated to them are small, so that they can be used after passage for a long time.
  • the cell line of the present invention When producing the cell line of the present invention, it is not necessary to prepare and obtain cells that express the desired G protein, as in the prior art. (5) Since the cell line of the present invention shows high responsiveness to sweet substances, the intensity of sweetness can be evaluated even if the intensity of sweetness is below a threshold value.
  • the sweet taste receptor expression construct (A) as the first preferred specific embodiment
  • the sweet taste receptor expression construct (B) as the second preferred specific embodiment
  • Example 5 it is a figure which shows the product obtained at the preparation process (d) of a sweet taste receptor expression construct (A). It is a figure which shows the product obtained at the preparation process (e) of a sweet taste receptor expression construct (A). It is a figure which shows the product obtained at the preparation process (f) of a sweet taste receptor expression construct (A). It is a figure which shows the product obtained at the preparation process (g) of a sweet taste receptor expression construct (A).
  • Example 5 it is a figure which shows a part of structure of the expression construct used as a comparison. It is a figure which shows the result of the response cell number with respect to aspartame stimulation.
  • NHDC neohesperidin dihydrochalcone
  • an expression construct refers to a desired coding sequence and a DNA fragment linked with an appropriate nucleic acid sequence such as a promoter, terminator, marker gene, and gene encoding an FRT site necessary for expressing the coding sequence. Is the same as an expression vector.
  • a promoter that functions as a transcription initiation signal is not limited as long as it has a function of expressing a gene to be introduced into a cell, and examples thereof include CMV (cytomegalovirus), EF-1 ⁇ , SR ⁇ , and CAG.
  • CMV cytomegalovirus
  • EF-1 ⁇ EF-1 ⁇
  • SR ⁇ SR ⁇
  • CAG CAG
  • SV40 pA is exemplified as a terminator that is a nucleic acid sequence that terminates transcription.
  • SV40 pA is contained on a 237 bp BamHI / BcII restriction enzyme fragment and causes both termination and polyadenylation, and many are derived from bovine growth hormone (BGH).
  • BGH bovine growth hormone
  • Marker genes that are introduced as a marker for confirming the introduction of the target gene include hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, chloramphenicol resistance Examples thereof include genes.
  • the gene encoding the FRT site corresponds to the nucleotide sequence of 2087-2147 disclosed in pFRT ⁇ GAL (STRATAGE, protocol, SEQUENCE AND SITES, Catalog # 218403, May 28, 1991).
  • the sweet receptor is a hetero-oligomeric receptor constituted by combining two subunits of T1R2 and T1R3.
  • sweet receptor subunits T1R2 and T1R3 include not only human sweet receptor subunits (hT1R2, hT1R3) but also other animal species such as rats, mice, pigs, dogs (mammals, fish, reptiles). , Amphibians, birds, etc.) sweet receptor subunits.
  • sweet receptor subunits T1R2 and T1R3 include all parts of each subunit, that is, a transmembrane domain consisting of seven transmembrane regions and a corresponding cytoplasm and extracellular loop, Venus fly trap domain, All regions of the high cysteine domain and the C-terminal domain are included.
  • Sweet receptor subunits T1R2 and T1R3 also include point mutants and chimeras of T1R2 and T1R3.
  • the G protein ⁇ subunit includes G protein ⁇ subunits of various animals (mammals, fish, reptiles, amphibians, birds, etc.) such as humans, rats, and mice, specifically, G15, hG16, or sequences thereof. And mutants (hG16gust44, hG16gust25, G15Gi3) that are partially modified.
  • the G protein ⁇ subunit may be appropriately determined according to the type of the selected sweet receptor subunits T1R2 and T1R3, etc., but when expressing the human sweet receptor, an intracellular effector is used.
  • HG16gust44 is preferable because it can efficiently carry information between the two.
  • hG16gust44 is a chimeric G protein in which the 44 amino acid residues of the C-terminal part of hG ⁇ 16 are replaced with Ggust.
  • Each cDNA encoding T1R2 and T1R3 and G protein ⁇ subunit may be obtained by any method, for example, a method of cloning cDNA from mRNA encoding the protein, chemistry based on known nucleotide sequence information It can be obtained by a known method such as synthesis or a method of isolating and splicing genomic DNA. Base sequence information of various DNAs can be obtained using a database such as NCBI. Other various genes used in the present invention can be obtained in the same manner.
  • CDNA means complementary DNA and is a reverse transcription reaction product of mRNA transcript.
  • nucleic acid base sequence includes those in which substitution, deletion, insertion or addition mutation is appropriately introduced in addition to the specific sequence described in the present specification.
  • substitution, deletion, insertion or addition mutation is appropriately introduced in addition to the specific sequence described in the present specification.
  • homologous sequences having degenerate codons are particularly limited.
  • the same plasmid into which the above cDNA is inserted is not particularly limited, and specific examples include pFRT / lacZeo, pUC12, pUC13, pUC19, pBR322, pBR325, pSH15, pSH19, pUB110, and pC194.
  • a sweet receptor-expressing cell can be efficiently obtained as long as it is a plasmid capable of expressing T1R2, T1R3, and G protein ⁇ subunit in 293 cells in which one FRT site is incorporated into genomic DNA. This is preferable.
  • FIG. 1 shows the structure of pcDNA5 / FRT (Invitrogen).
  • the sweet receptor expression construct of the present invention is characterized in that all genes encoding the sweet receptor subunits T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit are inserted into the same plasmid.
  • any cell line expressing a conventional sweet taste receptor has previously prepared or obtained a cell expressing a predetermined G protein, a vector containing a gene encoding T1R2, and T1R3. It was prepared by transfecting the cells with the vector containing the encoding gene separately. As a result, there was a problem that the expression levels and expression ratios of T1R2 and T1R3 differed greatly between cell lines.
  • the sweet receptor expression construct of the present invention can express each gene encoding the sweet receptor subunits T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit rapidly and simultaneously by having the above characteristics.
  • These three genes after being transcribed into one or two mRNAs, are translated into three proteins, namely T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit, to express each gene simultaneously, as described above There is no problem.
  • the genes encoding the sweet receptor subunits T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit have the same transcription direction. Those inserted in the same plasmid so as to be oriented are preferable.
  • sweet receptor subunits T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit or genes encoding two of them are linked via an IRES sequence. And those obtained by inserting the above genes into the same plasmid so that the transcription directions are the same.
  • a gene encoding the G protein ⁇ subunit is linked via an IRES sequence immediately after the gene encoding the sweet receptor subunit T1R2, and further downstream thereof. And a gene encoding a G protein ⁇ subunit via an IRES sequence immediately after the gene encoding the sweet taste receptor subunit T1R3.
  • the genes are preferably oriented so that the transcription directions are the same.
  • a gene encoding the sweet taste receptor subunit T1R3 is linked downstream of the gene encoding the sweet taste receptor subunit T1R2, and immediately after that, further via an IRES sequence. And those obtained by linking genes encoding the G protein ⁇ subunit.
  • the genes are preferably oriented so that the transcription directions are the same.
  • a gene encoding the sweet receptor subunit T1R2 is linked via an IRES sequence immediately after the gene encoding the sweet receptor subunit T1R3, and immediately after that. Furthermore, those obtained by linking a gene encoding a G protein ⁇ subunit via an IRES sequence are included.
  • the genes are preferably oriented so that the transcription directions are the same.
  • a sequence in which a cDNA encoding hT1R2 and a cDNA encoding hG16gust44 are inserted downstream of the EF-1 ⁇ promoter with an IRES sequence inserted inserted.
  • the genes are preferably oriented so that the transcription directions are the same.
  • FIG. 2A shows part of the structure.
  • a CMV promoter having a cDNA sequence encoding hT1R2 downstream of the EF-1 ⁇ promoter and downstream of this sequence.
  • a sweet receptor expression construct having a sequence in which a cDNA encoding hT1R3 and a cDNA encoding hG16gust44 are linked by inserting an IRES sequence can be mentioned downstream.
  • the genes are preferably oriented so that the transcription directions are the same.
  • FIG. 2B shows part of the structure.
  • a cDNA encoding hT1R3 and a cDNA encoding hT1R2 are linked downstream of the CMV promoter with an IRES sequence inserted
  • a sweet receptor expression construct having a sequence in which the cDNA encoding hT1R2 and the cDNA encoding hG16gust44 are linked by inserting an IRES sequence can be mentioned.
  • the genes are preferably oriented so that the transcription directions are the same. A part of the structure is shown in FIG.
  • the sweet receptor expression construct of the first preferred specific embodiment described above can be prepared, for example, according to the following steps (a) to (g).
  • (A) Substituting 6 bases at a place other than the multiple cloning site (base number 895-1010) of pcDNA5 / FRT (Invitrogen) to newly create a recognition sequence (5′-GATATC-3 ′) of restriction enzyme EcoRV (See FIG. 3).
  • a restriction enzyme Bgl of pcDNA5 / FRT is used.
  • an EcoRV recognition sequence is introduced directly under the II recognition sequence (base numbers 12-17) (base numbers 18-23).
  • This embodiment can be carried out, for example, by following the following sub-steps (a1) to (a5).
  • A1 Design and prepare a sense primer having a Bgl II recognition sequence (5′-AGATCT-3 ′) at the 5 ′ end and an EcoRV recognition sequence immediately below it.
  • an antisense primer having a sequence in the BGH pA sequence is designed and produced.
  • A2) Polymerase chain reaction (PCR) is performed using pcDNA5 / FRT (Invitrogen) as a template using the sense primer and antisense primer prepared in (a1), and Bgl A DNA fragment containing a sequence in which the recognition sequences of II and EcoRV are linked is amplified.
  • PCR is a technique for amplifying a DNA sequence between a sense primer and an antisense primer.
  • Amplification means increasing the copy number of a gene sequence.
  • PCR may be performed under optimized conditions as appropriate, but as a specific example, 98 ° C. for 30 seconds ⁇ 1 cycle (98 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 55 seconds) ⁇ 30 A cycle, 10 minutes ⁇ 72 cycles at 72 ° C., and then cooling to 4 ° C. is exemplified.
  • A3 The DNA fragment amplified in (a2) Digest with II and Not I.
  • step (B) Insert the cDNA encoding hT1R3 into the multicloning site (base numbers 895-1010) of the vector prepared in step (a) (see FIG. 4).
  • This step (b) can be carried out, for example, by following the following substeps (b1) to (b8).
  • (B1) A sense primer having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and immediately after the coding region of hT1R3, Design and create antisense primers.
  • the cDNA encoding hT1R3 is inserted into pEAK10 (Edge Biosystems) by ligation by ligation reaction such as 2 (TOYOBO).
  • B6 pEAK10 (Edge Biosystems) obtained in (b5) was replaced with restriction enzyme Hind.
  • the hT1R3 cDNA fragment is purified by digestion with III and Not I, separation of the DNA fragments by agarose electrophoresis.
  • the cDNA fragment encoding hT1R3 obtained in (b6) and the vector obtained in (b7) were ligated. high Ver.
  • the cDNA encoding hT1R3 is inserted into the multicloning site of the vector prepared in (a5) by binding by ligation reaction such as 2 (TOYOBO).
  • C A vector (IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK (-) having a sequence (IRES2-hG16gust44 sequence) in which an IRES sequence and cDNA encoding hG16gust44 are inserted into pBluescript II SK (-). )) Is produced (see FIG. 5).
  • An IRES sequence refers to a sequence that encodes an internal ribosome entry site. This step (c) can be carried out, for example, by following the following sub-steps (c1) to (c11).
  • C1 A sense primer having an Eco52I recognition sequence (5′-CGGCCG-3 ′) immediately before the IRES sequence is designed and prepared.
  • an antisense primer corresponding to the end of the IRES sequence is designed and produced.
  • C2 Using the sense primer and antisense primer prepared in (c1), PCR is performed using pIRES2-EGFP (Clontech) as a template to amplify the IRES sequence.
  • pIRES2-EGFP (Clontech) as a template to amplify the IRES sequence.
  • EGFP is an abbreviation of Enhanced Green Fluorescence Protein.
  • a sense primer and an antisense primer having a recognition sequence of I (5′-GCGGCCGC-3 ′) are designed and prepared, PCR is performed using a sequence containing a cDNA sequence encoding hG16gust44 as a template, and cDNA encoding hG16gust44 Amplify.
  • Amplified fragment Digest with I. C4) pEAK10 (Edge Biosystems) Digest with I. (C5) Ligation of the cDNA fragment encoding hG16gust44 obtained in (c3) and pEAK10 (Edge Biosystems) obtained in (c4) high Ver.
  • hG16gust44 / pEAK10 a vector in which cDNA encoding hG16gust44 is inserted into pEAK10 (Edge Biosystems) is prepared.
  • C6 An 18-base sense primer containing the start codon of hG16gust44 is designed and prepared.
  • hGH An antisense primer having a sequence in the pA sequence is designed and prepared.
  • the pA sequence (polyadenylation sequence) is a DNA sequence that directs termination of the RNA transcript and polyadenylation in order to stabilize the recombinant transcript.
  • the pA sequence may be endogenous that is present in the plasmid.
  • a commonly used pA sequence is the SV40 polyA sequence, which is contained in a 237 bp restriction enzyme BamHI / BcII fragment.
  • BGH bovine growth hormone
  • C7 Using hG16gust44 / pEAK10 obtained in (c5) as a template, PCR is performed using the sense primer and antisense primer prepared in (c6) to amplify cDNA encoding hG16gust44.
  • the IRES sequence obtained in (c2) is digested with Eco52I.
  • C9 cDNA encoding hG16gust44 obtained in (c7) was Digest with I.
  • C10) pBluescript II SK ( ⁇ ) is digested with Not I.
  • C11 The IRES sequence obtained in (c8), the cDNA fragment encoding hG16gust44 obtained in (c9), and the pBluescript II SK (-) obtained in (c10) were ligated to Ver.
  • the IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK (-) is prepared by ligation reaction using 2 (TOYOBO) or the like.
  • step (D) The sequence (IRES2-hG16gust44 sequence) in which the IRES sequence and the cDNA encoding hG16gust44 are linked is inserted immediately after the DNA sequence encoding hT1R3 of the vector prepared in step (b) (see FIG. 6).
  • This step (d) can be carried out, for example, by following the following substeps (d1) to (d3).
  • (D1) The IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK ( ⁇ ) prepared in (c11) is digested with Eco52I, the cDNA fragment is separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hG16gust44 sequence is purified.
  • E The cDNA encoding hT1R2 is inserted into pEAK10 (Edge Biosystems) (see FIG. 7). This step can be performed, for example, by following the following substeps (e1) to (e5).
  • E1 A sense primer having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and after the coding region of hT1R2, respectively. Design and create antisense primers.
  • E2 Using the sense primer and antisense primer prepared in (e1), PCR is performed using a sequence containing a DNA sequence encoding hT1R2 as a template to amplify a cDNA encoding hT1R2.
  • E3 The cDNA encoding hT1R2 obtained in (e2) was replaced with Asc I and Not. Digest with I.
  • E4 pEAK10 (Edge Biosystems) was replaced with Asc Digest with I and Not I.
  • E5 Ligation of the cDNA fragment encoding hT1R2 obtained in (e3) and pEAK10 (Edge Biosystems) obtained in (e4) high Ver.
  • the cDNA encoding hT1R2 is inserted into pEAK10 (Edge Biosystems) by ligation by ligation reaction such as 2 (TOYOBO).
  • the IRES2-hG16gust44 sequence is inserted immediately after the DNA sequence encoding hT1R2 of the vector prepared in step (e) (see FIG. 8). This step can be performed, for example, by following the following substeps (f1) to (f3).
  • F1 The IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK ( ⁇ ) prepared in (c11) is digested with Eco52I, the cDNA fragment is separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hG16gust44 sequence is purified.
  • F2 Notify the site immediately after the cDNA encoding hT1R2 of the vector obtained in (e5). Digest with I.
  • step (G) The vector obtained in step (d) was digested with EcoRV, and the hT1R2-IRES2-hG16gust44 sequence obtained in step (f) was inserted upstream of the hT1R3-IRES2-hG16gust44 sequence.
  • the expression construct of the first preferred embodiment is obtained (see FIG. 9).
  • This step (g) can be carried out, for example, by following the following substeps (g1) to (g3).
  • (G1) A primer for performing the In-Fusion reaction is designed and prepared, and the region of EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-IRES2-hG16gust44-hGH pA is used using the vector prepared in (f3) as a template. Amplify by PCR.
  • the primer is designed so that about 15 bases homologous to the end of the vector obtained in (d3) linearized with a restriction enzyme are added to the DNA fragment in the region.
  • the vector obtained in (d3) is digested with EcoRV.
  • G3 Using the In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech), the EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-IRES2-hG16gust44-hGH pA sequence fragment obtained in (g1) and the vector obtained in (g2) are used.
  • the sweetness of the first specific embodiment in which the hT1R2-IRES2-hG16gust44 sequence of the vector prepared in (f3) is inserted upstream of the hT1R3-IRES2-hG16gust44 sequence of the vector obtained in (d3) A receptor expression construct is made.
  • the EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-IRES2-hG16gust44-hGH pA sequence fragment obtained in (g1) and the vector obtained in (g2) were mixed, In-Fusion enzyme and a predetermined buffer are added, and the reaction is usually performed at 37 ° C. for 15 minutes and then at 50 ° C. for 15 minutes.
  • In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit it is possible to clone a target DNA fragment even with a long-chain DNA fragment without being restricted by restriction enzyme sites.
  • steps (a) to (e) described in the preparation of the expression construct of the first preferred specific embodiment are performed in the same manner.
  • a primer for carrying out the In-Fusion reaction is designed and prepared, and the EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-hGH pA region is amplified by PCR using the vector prepared in step (e) as a template.
  • the obtained EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-hGH pA sequence fragment and the vector obtained in step (d) digested with EcoRV are ligated using In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech).
  • the sweet receptor expression construct (see FIG. 2C), which is the third preferred specific embodiment described above, can be prepared, for example, according to the following steps (a ′) to (g ′). .
  • a ′ The cDNA encoding hT1R3 is inserted into the multicloning site (base numbers 895-1010) of pcDNA5 / FRT (Invitrogen).
  • This step (a ′) can be carried out, for example, by following the following substeps (a′1) to (a′8).
  • (A′1) Sense having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and after the coding region of hT1R3, respectively.
  • A′2 Using the sense primer and antisense primer prepared in (a′1), PCR is performed using a sequence containing a cDNA sequence encoding hT1R3 as a template to amplify a cDNA encoding hT1R3.
  • A′3 The cDNA fragment encoding hT1R3 obtained in (a′2) was subjected to restriction enzyme Asc. Digest with I and Not I.
  • A′4 pEAK10 (Edge Biosystems) was added to the restriction enzyme Asc Digest with I and Not I.
  • A′5 The cDNA fragment encoding hT1R3 obtained in (a′3) and pEAK10 (Edge Biosystems) obtained in (a′4) were ligated. high Ver. The cDNA encoding hT1R3 is inserted into pEAK10 (Edge Biosystems) by ligation by ligation reaction such as 2 (TOYOBO).
  • A′6 pEAK10 (Edge Biosystems) obtained in (a′5) was replaced with restriction enzyme Hind. The hT1R3 cDNA fragment is purified by digestion with III and Not I, separation of the DNA fragments by agarose electrophoresis.
  • A'7 pcDNA5 / FRT (Invitrogen) is replaced with Hind Digest with III and Not I.
  • A′8 The cDNA fragment encoding hT1R3 obtained in (a′6) and the vector obtained in (a′7) were combined with Ligation high Ver.
  • the cDNA encoding hT1R3 is inserted into the multicloning site of pcDNA5 / FRT (Invitrogen) by binding by ligation reaction such as 2 (TOYOBO).
  • (B ′) A vector (IRES2-hT1R2 / pBluescript II SK () having a sequence (IRES2-hT1R2 sequence) in which an IRES sequence and cDNA encoding hT1R2 are inserted and inserted into pBluescript II SK ( ⁇ ). -)).
  • This step (b ′) can be carried out, for example, by following the following substeps (b′1) to (b′16).
  • (B′1) A sense primer having an Eco52I recognition sequence (5′-CGGCCG-3 ′) immediately before the IRES sequence is designed and prepared.
  • an antisense primer corresponding to the end of the IRES sequence is designed and produced.
  • B′2 Using the sense primer and antisense primer prepared in (b′1), PCR is performed using pIRES2-EGFP (Clontech) as a template to amplify the IRES sequence.
  • B′3 Senses having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and after the coding region of hT1R2, respectively. Design and prepare primers and antisense primers.
  • B′4 Using these sense primer and antisense primer, PCR is performed using a sequence containing a DNA sequence encoding hT1R2 as a template to amplify cDNA encoding hT1R2.
  • hGH An antisense primer having a sequence in the pA sequence is designed and prepared.
  • B'9 Using hT1R2 / pEAK10 obtained in (b'7) as a template, PCR is performed using the sense primer and antisense primer prepared in (b'8) to amplify the cDNA encoding hT1R2. .
  • B′10 The IRES sequence obtained in (b′2) is digested with Eco52I.
  • B′11 cDNA encoding hT1R2 obtained in (b′9) was Digest with I.
  • B′12 pBluescript II SK ( ⁇ ) is digested with Not I.
  • step (C ′) Immediately after the DNA sequence encoding hT1R3 of the vector prepared in step (a ′), a sequence (IRES2-hT1R2 sequence) in which an IRES sequence and cDNA encoding hT1R2 are linked is inserted.
  • This step (c ′) can be carried out, for example, by following the following sub-steps (c′1) to (c′3).
  • (C′1) The IRES2-hT1R2 / pBluescript II SK ( ⁇ ) prepared in (b′13) is digested with Eco52I, the cDNA fragment is separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hT1R2 sequence is purified.
  • C′2 The site present immediately after the DNA sequence encoding hT1R3 of the vector prepared in (a′8) is Not Digest with I.
  • C′3 The IRES2-hT1R2 sequence obtained in (c′1) and the vector obtained in (c′2) were combined with Ligation high Ver.
  • the IRES2-hT1R2 sequence is inserted immediately after the DNA sequence encoding hT1R3 of the vector prepared in (a′8) after ligation by 2 (TOYOBO) or the like. This results in pcDNA5 / FRT containing the hT1R3-IRES2-hT1R2 sequence.
  • (D ′) A vector (IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK (IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK ()) having a sequence (IRES2-hG16gust44 sequence) in which an IRES sequence and a cDNA encoding hG16gust44 are inserted into pBluescript II SK ( ⁇ ). -)).
  • This step (d ′) can be carried out, for example, by following the following substeps (d′ 1) to (d′ 11).
  • (D′ 1) A sense primer having an Eco52I recognition sequence (5′-CGGCCG-3 ′) immediately before the IRES sequence is designed and prepared.
  • an antisense primer corresponding to the end of the IRES sequence is designed and produced.
  • D′ 2 Using the sense primer and antisense primer prepared in (d′ 1), PCR is performed using pIRES2-EGFP (Clontech) as a template to amplify the IRES sequence.
  • D′ 3 Not before and immediately after the code region of hG16gust44, A sense primer and an antisense primer having a recognition sequence of I (5′-GCGGCCGC-3 ′) are designed and prepared, PCR is performed using a sequence containing a cDNA sequence encoding hG16gust44 as a template, and cDNA encoding hG16gust44 Amplify. Amplified fragment Digest with I. (D′ 4) pEAK10 (Edge Biosystems) was Digest with I.
  • E ′ The IRES2-hG16gust44 sequence is inserted immediately after the DNA sequence encoding hT1R3-IRES2-hT1R2 of the vector prepared in step (c ′). This step can be performed, for example, by following the following substeps (e′1) to (e′3).
  • E′1 The IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK ( ⁇ ) prepared in (d′ 11) is digested with Eco52I, the cDNA fragment is separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hG16gust44 sequence is purified.
  • E′2 The site present immediately after the cDNA encoding hT1R2 of the vector obtained in (c′3) is Not Digest with I.
  • the obtained sweet receptor expression construct of the present invention is used for transfection into host cells.
  • the host cells include 293 cells, CHO cells, 32D cells, HeLa cells, COS cells, BHK cells and the like. Eukaryotic cells.
  • 293 cells in which one FRT (Flippass Recognition Target) sequence is incorporated in the genome are preferable. A method for producing this cell line will be described.
  • the cultured cell line is prepared by using the Flp-In system (Invitrogen), the above-mentioned sweet receptor expression construct, and the Flp recombinase expression vector in 293 cells in which one FRT site is incorporated into genomic DNA. This is done by cotransfecting pOG44.
  • the FRT recombinase expressed transiently cleaves the FRT site retained in the genomic DNA of 293 cells, and a foreign gene is introduced into that portion, and the gene is expressed.
  • each gene encoding T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit is obtained by site-specific recombination using an Flp recombinase derived from Saccharomyces cerevisiae and an FRT site that is a target site of the Flp recombinase.
  • a cultured cell line that is inserted into the FRT site of the chromosome of 293 cells and stably expresses T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit can be obtained quickly and effectively.
  • each gene encoding T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit is transcribed into one or two mRNAs, and then into three proteins, namely T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit.
  • Translated When the sweet receptor expression construct of the present invention is transfected into a host cell, it is preferable to use an enzyme that cleaves and recombines DNA in a site-specific manner.
  • Flp recombinase, ⁇ integrase, Kw Examples include recombinase.
  • 293 cells in which one FRT site is incorporated into genomic DNA can be prepared as follows. First, pFRT / lacZeo, which is a vector for introducing an FRT site, is introduced into a host cell 293 cell, and the introduced cell is selected with Zeocin (registered trademark). Since pFRT / lacZeo has a fusion gene of lacZ and a zeocin resistance gene, cells into which pFRT / lacZeo has been introduced into the genome express ⁇ -galactosidase and become zeocin resistant. The degree of zeocin sensitivity can be confirmed by ⁇ -galactosidase assay. Next, Southern blotting is performed on the lacZ gene. This confirms that the FRT site is integrated only at one position in the genome where transcription is possible. It is convenient to use commercially available Flp-In-293 cells (Invitrogen) as 293 cells in which one FRT site is incorporated into genomic DNA.
  • the cultured cell line of the present invention was prepared by co-transfecting the above expression construct and pOG44, which is an expression vector for Flp recombinase, into 293 cells into which one FRT site was incorporated, and using a selective medium containing hygromycin B. This can be done by selecting a cell line resistant to hygromycin B.
  • Flp recombinase (Flippase) is a kind of enzyme that performs site-specific recombination reaction, and pOG44, which is an expression vector for the enzyme, is known.
  • the expressed Flp recombinase inserts the expression construct into the FRT site of the 293 cell, and the 293 cell changes to hygromycin B resistance and zeocin sensitivity. By using resistance as an index, it can be easily determined whether or not the target gene has been inserted.
  • Methods for cotransfection include known methods such as lipofection, electroporation, calcium phosphate-DNA precipitation, calcium chloride, calcium chloride / rubidium, liposome, DEAE-dextran, and microinjection. Etc., can be selected as appropriate.
  • T1R2 and T1R3 and G protein ⁇ subunit are simultaneously expressed.
  • Expression of T1R2 and T1R3 and G protein ⁇ subunit can be confirmed by Western blotting using a protein extracted from a cultured cell line and using antibodies capable of recognizing T1R2 antibody, T1R3 antibody, and G protein ⁇ subunit. it can.
  • the stably expressing cells are grown and / or maintained by culturing in a nutrient medium.
  • the specific method for the growth and / or maintenance of the stably expressing cells may be appropriately determined.
  • glucose for example, low glucose supplemented with L-glutamine to 4 mM. (1,000 mg / ml) Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) medium (Virology, Vol. 8, p. 396, 1959), 10% HI-FBS (Heat Inactivated Fetal Bovine Serum) and 100 ⁇ g / ml hygromycin B ( It is preferable to perform growth and / or maintenance at 37 ° C. using a product added with Invitrogen).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle
  • T1R2 and T1R3 and the G protein ⁇ subunit are functionally expressed, so that the perception of sweetness caused by actual sweetness reception can be objectively evaluated in vivo. And can be used as a taste sensor for selecting a sweet substance. That is, using the cultured cell line of the present invention, the sweetness of the sweet substance is evaluated by, for example, contacting a specific sweet substance with the cultured cell line and measuring the physiological response generated thereby. be able to.
  • the sweet substance that is the target for measuring the physiological response using the cultured cell line of the present invention is a substance that can exhibit a sweet taste that can be sensed by humans.
  • a cultured cell line in which the sweet receptor expression construct is expressed is obtained, and then a predetermined number of the cultured cells is obtained in a number of wells (24 holes, 48 holes, 96 holes, 384 holes, etc.).
  • a predetermined number of the cultured cells is obtained in a number of wells (24 holes, 48 holes, 96 holes, 384 holes, etc.).
  • a predetermined medium for example, DMEM medium.
  • an event that changes with the activation of the sweet receptor is appropriately selected as the physiological response.
  • various phenomena are then initiated in the cell.
  • IP 3 intracellular triphosphate
  • examples of the physiological response to be measured include changes in intracellular second messengers that change with the activation of sweet taste receptors, changes in intracellular calcium concentration, and the like.
  • the physiological response to a sweet substance is preferably measured by a calcium imaging method in which a change in intracellular calcium concentration caused by a sweet stimulus is observed from outside the cell by using a fluorescent calcium indicator. It is.
  • a calcium imaging method in which a change in intracellular calcium concentration caused by a sweet stimulus is observed from outside the cell by using a fluorescent calcium indicator. It is.
  • This enables objective evaluation of sweetness at the receptor level, unlike conventional sensory evaluation.
  • the intensity of sweetness of various substances can be compared with each other by quantifying the degree of sweetness.
  • Fluorescent calcium indicators require that the fluorescence properties change at physiologically variable calcium concentrations, and that the change is induced specifically for calcium, so complex formation sites and fluorescence are now present.
  • a compound having a structure in which a chromophore is bound is widely used as a fluorescent indicator.
  • Fluo-4 AM and Fura-2 AM which are such fluorescent calcium indicators.
  • a physiological response to a sweet substance When measuring a physiological response to a sweet substance, it is preferable to quantify and visualize the physiological response to the sweet substance using a calcium imaging method.
  • a cellular response is digitized by a simultaneous assay using a multi-plate reader, and a change in intracellular calcium concentration is imaged by imaging using a microscope to observe whether each cell is responding.
  • a fluorescent indicator different from the fluorescent indicator used in the simultaneous assay by the multiplate reader, it is possible to confirm that the cell response is not due to the artifact.
  • a simultaneous assay using a multiplate reader may be appropriately performed according to a known method. However, it is simple and quick to perform automated fluorescent calcium imaging using FlexStation 3 (Molecular Devices), and a high-throughput assay is possible. FlexStation 3 is a multi-plate reader that combines the performance of SpectraMax M5e (Molecular Devices) with an 8-channel pipettor.
  • Automated fluorescence imaging using FlexStation 3 can be performed, for example, according to the following procedure. First, cells are suspended in low glucose (1,000 mg / ml) DMEM medium excluding hygromycin B, and 70 to 80,000 cells are plated on each well of a 96-well plate (Corning, CellBIND Surface).
  • low glucose 1,000 mg / ml
  • DMEM medium excluding hygromycin B
  • HEPES 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid
  • a fluorescent calcium indicator Add HEPES buffer containing Fluo-4 AM (included with Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit).
  • the fluorescent indicator Fluo-4 (excitation wavelength: 495 nm, fluorescence wavelength: 518 nm) has a lipid-soluble acetoxymethyl group introduced in order to facilitate its transfer into the cell. It is taken up into cells and hydrolyzed by intracellular esterases.
  • the 96-well plate for fluorescence observation has a plastic bottom and a film bottom, and since the plastic bottom plate has good cell adhesion and growth, it is used in a simultaneous assay using a multiplate reader for observing the whole well. However, this plastic bottom plate has poor UV wavelength transmission and uses Fluo-4 because it inhibits transmission of Fura-2 excitation light.
  • a taste stimulus is performed at 27 to 37 ° C. by adding a sweet substance of a specific concentration or a solution of the sweet substance and the substance to be tested to this.
  • the response of sweet receptor-expressing cells to a sweet stimulus can be quantified by measuring the fluorescence reaction (525 nm fluorescence with 485 nm excitation) immediately after the addition of the sweet substance or sweet substance and the substance to be tested. it can.
  • Fluorescent calcium imaging using a fluorescence microscope can be performed according to the following procedure. First, the cells are suspended in low glucose (1,000 mg / ml) DMEM medium excluding hygromycin B, and 40 to 80,000 cells are plated on each well of a 96-well plate (Greiner, Lumox).
  • HEPES buffer containing a fluorescent calcium indicator (Fura-2 AM) is further added.
  • the fluorescence indicator Fura-2 (excitation wavelength: 340 nm / 380 nm, fluorescence wavelength: 510 nm) increases the fluorescence intensity of 340 nm excitation and decreases the fluorescence intensity of 380 nm excitation when the calcium ion concentration increases.
  • a fluorescence image in the microscope field (510 nm fluorescence with 340 nm excitation and 380 nm excitation) is captured 60 to 300 seconds later, and the ratio of the two wavelength excitation fluorescence is simulated. By displaying in color, the response of sweet receptor-expressing cells to sweetness stimuli can be observed.
  • a physiological response is measured, in the calcium imaging method, by combining the two types of fluorescent indicators having different fluorescence characteristics, a universal phenomenon independent of the observation system can be obtained. Can be observed.
  • the physiological response to a sweet substance can be measured using the cell line of the present invention.
  • a sweetness enhancing substance for a specific sweet substance identified using measurement of a physiological response to a sweet substance using the cell line of the present invention is added when measuring the physiological response of the sweet substance.
  • the physiological response can be measured at a concentration below the sweetness threshold of the sweet substance.
  • Example 1 Preparation of sweet receptor expression construct (A) Downstream of the EF-1 ⁇ promoter, it has a sequence in which a cDNA encoding hT1R2 and a cDNA encoding hG16gust44 are linked by inserting an IRES sequence, and downstream of this sequence.
  • a sweet receptor expression construct (A) (see FIG. 2 (A)) having a sequence in which a cDNA encoding hT1R3 and a cDNA encoding hG16gust44 are inserted downstream of a CMV promoter and inserted with an IRES sequence, is Prepared according to the procedure.
  • a sense primer (SEQ ID NO: 1: TATAGATCTGATATCCCCCTATGGTGCACTCTC) having a Bgl II recognition sequence (5′-AGATCT-3 ′) at the 5 ′ end and an EcoRV recognition sequence immediately below it and an antisense primer having a sequence in the BGH pA sequence ( SEQ ID NO: 2: TAGAAGGCACAGTCGAGG) was designed and produced. Then, using these sense primer and antisense primer, polymerase chain reaction (PCR) is performed using pcDNA5 / FRT (Invitrogen) as a template, and Bgl A DNA fragment containing a sequence in which the recognition sequences of II and EcoRV were linked was amplified.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCRs including the examples described later, were performed at 98 ° C. for 30 seconds ⁇ 1 cycle, (98 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 55 seconds) ⁇ 30 cycles, 72 ° C. for 10 minutes ⁇ One cycle was performed, followed by cooling to 4 ° C.
  • the amplified DNA fragment is then converted into Bgl Digested with II and Not I, and pcDNA5 / FRT (Invitrogen) was digested with Bgl II and Not I. Ligation of these restriction enzyme digestion products high Ver. Using 2 (TOYOBO), a vector having an EcoRV recognition sequence immediately under the Bgl II recognition sequence of pcDNA5 / FRT (Invitrogen) was prepared by ligation reaction.
  • a sense primer (sequence) having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and after the coding region of hT1R3, respectively.
  • PCR was performed using a sequence containing a cDNA sequence encoding hT1R3 as a template to amplify the cDNA encoding hT1R3.
  • a sense primer (SEQ ID NO: 5: GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCC) having an Eco52I recognition sequence (5′-CGGCCG-3 ′) immediately before the IRES sequence and an antisense primer (SEQ ID NO: 6) corresponding to the end of the IRES sequence : GGTTGTGGCCATATTATC) was designed and produced.
  • PCR was performed using pIRES2-EGFP (Clontech) as a template to amplify the IRES sequence.
  • a sense primer (SEQ ID NO: 7: GATCGCGGCCGCATGGCCCGCTCGCTGACC) and antisense primer (SEQ ID NO: 8: GATCGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTA) having a recognition sequence of I (5′-GCGGCCGC-3 ′) were designed and prepared.
  • PCR was performed using a sequence containing a cDNA sequence encoding hG16gust44 as a template to amplify cDNA encoding hG16gust44. Amplify the fragment into Not I, pEAK10 (Edge Biosystems) was digested with Not I, and these were ligated high Ver.
  • the IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK ( ⁇ ) described above was digested with Eco52I, the DNA fragments were separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hG16gust44 sequence was purified. Then, the above pcDNA5 / FRT (Invitrogen) in which cDNA encoding hT1R3 is inserted into the multicloning site is notated. Digested with I, the portion immediately after the DNA sequence encoding hT1R3 in the vector was cleaved. This vector and the above IRES2-hG16gust44 sequence were ligated. high Ver.
  • a sense primer (sequence) having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and after the coding region of hT1R2, respectively.
  • No. 11: GATCGGCGCGCCGCCATGGGGCCCAGGGCAAAG) and antisense primer (SEQ ID NO: 12: GATCGCGGCCGCCTAGTCCCTCCTCATGGT) were designed and prepared.
  • PCR was performed using a sequence containing a DNA sequence encoding hT1R2 as a template to amplify cDNA encoding hT1R2.
  • the obtained cDNA encoding hT1R2 was designated as Asc I and Not. I
  • pEAK10 Edge Biosystems
  • Asc I and Not I pEAK10
  • Asc I and Not I ligated high Ver. 2 (TOYOBO) was used for binding by ligation reaction
  • cDNA encoding hT1R2 was inserted into pEAK10 (Edge Biosystems).
  • the IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK ( ⁇ ) described above was digested with Eco52I, the cDNA fragment was separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hG16gust44 sequence was purified. Then, pEAK10 (Edge Biosystems) into which cDNA encoding hT1R2 was inserted was Not Not. After digestion with I, the portion immediately after the cDNA encoding hT1R2 in the vector was cleaved. This vector and the above IRES2-hG16gust44 sequence were ligated. high Ver.
  • primers for carrying out the In-Fusion reaction are designed and prepared, and using this, pEAK10Bio (Egyst) containing the hT1R2-IRES2-hG16gust44 sequence described above.
  • pEAK10Bio Egyst
  • the region of EF-1 ⁇ promoter-hT1R2-IRES2-hG16gust44-hGH pA was amplified by PCR.
  • Example 2 Production of Sweet Receptor Expression Construct (B) A cDNA encoding hT1R3 is downstream of the EF-1 ⁇ promoter, and a hV16gust44 cDNA encoding hT1R3 is downstream of the CMV promoter downstream of this sequence.
  • a sweet receptor expression construct (B) (see FIG. 2 (B)) having a sequence in which a cDNA encoding IRS was inserted by inserting an IRES sequence was prepared according to the following procedure.
  • Bgl of pcDNA5 / FRT (Invitrogen) The steps from preparation of a vector having an EcoRV recognition sequence immediately below the II recognition sequence to insertion of cDNA encoding hT1R2 into pEAK10 (Edge Biosystems) were performed.
  • primers SEQ ID NO: 15: ATCGGGAGATCTGATGCATAACTAGTGAGGCTC and SEQ ID NO: 16: GCACCATAGGGGGATAGCGGATCCAGACATGAT
  • a pEAK10 template Edge Biosystems
  • Example 3 Preparation of sweet receptor expression construct (C) Downstream of the CMV promoter, cDNA encoding hT1R3 and cDNA encoding hT1R2 are linked by inserting an IRES sequence, and the cDNA encoding hT1R2 and hG16gust44 are A sweet receptor expression construct (C) (see FIG. 2 (C)) having a sequence in which the cDNA encoding is linked by inserting an IRES sequence was prepared according to the following procedure.
  • Sense primers (SEQ ID NO: 17) having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and after the coding region of hT1R3, respectively. : GATCGGCGCGCCGCCATGCTGGGCCCTGCTGTC) and antisense primer (SEQ ID NO: 18: GATCGCGGCCGCTCACTCATGTTTCCCCTG) were designed and prepared. Using these sense and antisense primers, PCR was performed using a sequence containing a cDNA sequence encoding hT1R3 as a template to amplify the cDNA encoding hT1R3.
  • the obtained cDNA fragment encoding hT1R3 was subjected to restriction enzyme Asc. Digested with I and Not I, and pEAK10 (Edge Biosystems) was digested with restriction enzymes Asc I and Not I. These restriction enzyme digestion products are ligated high Ver. 2 (TOYOBO) was used to bind by ligation reaction to obtain pEAK10 (Edge Biosystems) having cDNA encoding hT1R3. Then, this pEAK10 (Edge Biosystems) is replaced with the restriction enzyme Hind. After digestion with III and Not I, the DNA fragment was separated by agarose electrophoresis, and the cDNA fragment of hT1R3 was purified.
  • a sense primer (SEQ ID NO: 19: GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCCCC) having an Eco52I recognition sequence (5′-CGGCCG-3 ′) immediately before the IRES sequence and an antisense primer (SEQ ID NO: 20) corresponding to the end of the IRES sequence : GGTTGTGGCCATATTATC) was designed and produced. And using these sense primer and antisense primer, PCR was performed using pIRES2-EGFP (Clontech) as a template to amplify the IRES sequence.
  • a sense primer (sequence) having an Asc I recognition sequence (5′-GGCGCGCC-3 ′) and a Not I recognition sequence (5′-GCGGCCGC-3 ′) immediately before and after the coding region of hT1R2, respectively.
  • No. 21: GATCGGCGCGCCGCCATGGGGCCCAGGGCAAAG) and an antisense primer (SEQ ID NO: 22: GATCGCGGCCGCCTAGTCCCTCCTCATGGT) were designed and prepared.
  • PCR was performed using a sequence containing a DNA sequence encoding hT1R2 as a template to amplify cDNA encoding hT1R2.
  • the obtained cDNA encoding hT1R2 was designated as Asc I and Not. I
  • pEAK10 Edge Biosystems
  • Asc I and Not I pEAK10
  • Asc I and Not I ligated high Ver. 2
  • cDNA encoding hT1R2 was inserted into pEAK10 (Edge Biosystems).
  • an 18-base sense primer SEQ ID NO: 23: ATGGGGCCCAGGGCAAAG
  • an antisense primer SEQ ID NO: 24: CTGGATGCAGGCTACTCTA
  • PCR was performed using hT1R2 / pEAK10 as a template to amplify cDNA encoding hT1R2.
  • the IRES sequence described above was then digested with Eco52I and the cDNA encoding hT1R2 was Digestion with I and pBluescript II SK (-) with Not I to ligate these restriction enzyme digestion products high Ver. 2 (TOYOBO) was used for binding by a ligation reaction to produce IRES2-hT1R2 / pBluescript II SK (-).
  • IRES2-hT1R2 / pBluescript II SK (-) was digested with Eco52I, the cDNA fragment was separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hT1R2 sequence was purified. Then, the IRES2-hT1R2 sequence and pcDNA5 / FRT (Invitrogen) having cDNA encoding hT1R3 digested with Not I were ligated. high Ver. 2 (TOYOBO) was used to bind by ligation reaction to obtain pcDNA5 / FRT containing hT1R3-IRES2-hT1R2 sequence.
  • a sense primer (SEQ ID NO: 25: GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCC) having an Eco52I recognition sequence (5′-CGGCCG-3 ′) immediately before the IRES sequence and an antisense primer (SEQ ID NO: 26) corresponding to the end of the IRES sequence : GGTTGTGGCCATATTATC) was designed and produced. And using these sense primer and antisense primer, PCR was performed using pIRES2-EGFP (Clontech) as a template to amplify the IRES sequence.
  • a sense primer (SEQ ID NO: 27: GATCGCGGCCGCATGGCCCGCTCGCTGACC) and an antisense primer (SEQ ID NO: 28: GATCGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTA) having a recognition sequence of I (5′-GCGGCCGC-3 ′) were designed and prepared.
  • PCR was performed using a sequence containing a cDNA sequence encoding hG16gust44 as a template to amplify cDNA encoding hG16gust44. Amplify the fragment into Not I, pEAK10 (Edge Biosystems) was digested with Not I, and these were ligated high Ver.
  • PCR was carried out using hG16gust44 / pEAK10 as a template to amplify cDNA encoding hG16gust44.
  • the generated IRES sequence was then digested with Eco52I and the cDNA encoding hG16gust44 was Digested with I, and pBluescript II SK (-) with Not I, and these restriction enzyme digests were ligated high Ver. 2 (TOYOBO) was used for ligation reaction to produce a vector having an IRES2-hG16gust44 sequence (IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK (-)).
  • this IRES2-hG16gust44 / pBluescript II SK (-) was digested with Eco52I, the cDNA fragment was separated by agarose electrophoresis, and the IRES2-hG16gust44 sequence was purified.
  • the site immediately after the cDNA encoding hT1R2 of pcDNA5 / FRT containing the hT1R3-IRES2-hT1R2 sequence is determined as Not. Digested with I. This restriction enzyme digestion product and the IRES2-hG16gust44 sequence were ligated to Ligation high Ver.
  • Example 4 Preparation of cultured cell lines (A) to (C) expressing human sweet taste receptor (hT1R2 + hT1R3) and hG16gust44 0.8 ⁇ g of the sweet receptor expression construct (A) produced in Example 1 and 7.2 ⁇ g of pOG44 48 hours after transfection into 2 million Flp-In-293 cells (Invitrogen) by the lipofection method, screening was performed in a medium supplemented with hygromycin B (100 ⁇ g / ml), and a cultured cell line that is a stable expression strain (A) was obtained.
  • RT-PCR was performed on cultured cell lines (A) to (C), and bands of hT1R2 fragment, hT1R3 fragment and hG16gust44 fragment were observed by agarose electrophoresis, and human sweet receptor (hT1R2 + hT1R3) and hG16gust44 were expressed. I confirmed that
  • the cultured cell line (B) and the cultured cell line (C ) was produced. Thereafter, these cultured cell lines (A) to (C) were mixed with 10% HI-FBS (Heat Inactivated Fetal Bovine Serum), 100 ⁇ g / ml hygromycin B (Invitrogen), low glucose (1, 1) containing 4 mM L-glutamine. 000 mg / ml) Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) medium and grown and maintained at 37 ° C.
  • HI-FBS Heat Inactivated Fetal Bovine Serum
  • 100 ⁇ g / ml hygromycin B Invitrogen
  • low glucose (1, 1) containing 4 mM L-glutamine.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle
  • Example 5 Comparison of physiological responses of cultured cell lines (A) to (C) prepared in Example 4 to aspartame stimulation
  • Each of the cultured cell lines (A) to (C) prepared in Example 4 contains a fluorescent calcium indicator Fura -2 AM was loaded and taken up into cells. Then, cells loaded with Fura-2 AM were excited at 340 nm and 380 nm, and a fluorescence image observed at 510 nm was obtained using a fluorescence microscope and a CCD camera. During image acquisition, aspartame having a final concentration of 10 mM was administered to the cells, and then images were continuously acquired. 100 cells were randomly selected from the field of view of the acquired image, and the number of responding cells was counted. For comparison, an expression construct (Fig.
  • a cultured cell line (D) was prepared in the same manner as in Example 4, and the number of responding cells was measured in the same manner as described above. The measurement results are shown in FIG.
  • Example 6 Physiological response of cultured cell line (A) to aspartame stimulation
  • the cultured cell line (A) prepared in Example 4 was loaded with the fluorescent calcium indicator Fura-2 AM and incorporated into cells. Then, cells loaded with Fura-2 AM were excited at 340 nm and 380 nm, and a fluorescence image observed at 510 nm was obtained using a fluorescence microscope and a CCD camera. During the image acquisition, cells were administered aspartame at final concentrations of 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, and 5 mM, and then images were continuously acquired. Images at the time when the strongest response was observed at each concentration are shown in FIG. As can be seen from the results, when aspartame was used as the sweetener to be administered, a concentration-dependent sweetness response was observed in the range of 0.1 mM to 5 mM.
  • Example 7 Physiological response of cultured cell line (A) to sucrose stimulation
  • the cultured cell line (A) prepared in Example 4 was loaded with the fluorescent calcium indicator Fura-2 AM and incorporated into cells. Then, cells loaded with Fura-2 AM were excited at 340 nm and 380 nm, and a fluorescence image observed at 510 nm was obtained using a fluorescence microscope and a CCD camera.
  • cells were administered with sucrose at final concentrations of 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 500 mM, and 1 M, and then images were continuously acquired. An image when the strongest response was observed at each concentration is shown in FIG. As can be seen from the results, when sucrose was used as the sweetener to be administered, a concentration-dependent sweetness response was observed in the range of 20 mM to 1M.
  • Example 8 Physiological response of cultured cell line (A) to sucrose stimulation
  • the cultured cell line (A) prepared in Example 4 was loaded with the fluorescent calcium indicator Fura-2 AM and incorporated into cells. Then, cells loaded with Fura-2 AM were excited at 340 nm and 380 nm, and a fluorescence image observed at 510 nm was obtained using a fluorescence microscope and a CCD camera. During the image acquisition, sucrose having a final concentration of 500 mM was administered to the cells, and then images were continuously acquired. An image when the strongest response was observed is shown in FIG.
  • sucrose having a final concentration of 500 mM and lactisol having a concentration of 1.25 mM were simultaneously administered to the cells, fluorescence images were obtained in the same manner as described above, and an image when the strongest response was observed is shown in FIG. As can be seen from the results, it was confirmed that the addition of lactisole known as a T1R3 inhibitor suppressed the cellular response. From this result, it was speculated that the cellular response to sucrose was a response via the T1R3 subunit.
  • Example 9 Physiological response of cultured cell line (A) to sucrose stimulation The physiological response of cultured cell line (A) to sucrose stimulation was analyzed by automated fluorescence imaging.
  • the cultured cell line (A) prepared in Example 4 was trypsinized, suspended in the DMEM medium, the cell density was measured, and about 80,000 cells were plated on each well of a 96-well plate (Corning, CellBIND Surface). It was. After culturing at 37 ° C. for 24 hours, the medium is removed, replaced with 50 ⁇ l of HEPES buffer, and further a HEPES buffer containing a fluorescent calcium indicator (Fluo-4 AM attached to Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit) is further added. 50 ⁇ l was added.
  • the cells were then incubated for 45 minutes at 27 ° C. to prepare cells for automated fluorescence imaging.
  • HEPES buffer containing sucrose was added to the cells so that the final concentration of sucrose was as described in Table 1, and sucrose stimulation was performed at 27 ° C.
  • the fluorescence reaction (525 nm fluorescence with 485 nm excitation) immediately after addition of the HEPES buffer containing sucrose was measured using FlexStation 3 (Molecular Devices), and the response of sweet receptor-expressing cells to sucrose stimulation was measured. Quantified by automated fluorescence imaging. The results are shown in Table 1 and FIG. The vertical axis in FIG.
  • sucrose concentration mM in logarithm.
  • the sweetness assay system using cells can quantify the sweetness of sucrose within a narrow range of about 50 to 200 mM.
  • the lower limit of this limit value can be further increased. It becomes possible to lower.
  • Example 10 Physiological response of cultured cell line (A) to D-phenylalanine stimulation The physiological response of cultured cell line (A) to D-phenylalanine stimulation was analyzed by automated fluorescence imaging.
  • the cultured cell line (A) prepared in Example 4 was trypsinized, suspended in the DMEM medium, the cell density was measured, and about 80,000 cells were plated on each well of a 96-well plate (Corning, CellBIND Surface). It was. After culturing at 37 ° C.
  • HEPES buffer containing a fluorescent calcium indicator (Fluo-4 AM attached to Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit) is further added. 50 ⁇ l was added. The cells were then incubated for 45 minutes at 27 ° C. to prepare cells for automated fluorescence imaging. Next, a HEPES buffer containing D-phenylalanine was added to the cells so that the final concentration of D-phenylalanine was the concentration described in Table 2, and D-phenylalanine stimulation was performed at 27 ° C.
  • a HEPES buffer containing D-phenylalanine was added to the cells so that the final concentration of D-phenylalanine was the concentration described in Table 2, and D-phenylalanine stimulation was performed at 27 ° C.
  • Example 11 Physiological response of cultured cell line (A) to aspartame stimulation The physiological response of cultured cell line (A) to aspartame stimulation was analyzed by automated fluorescence imaging.
  • the cultured cell line (A) prepared in Example 4 was trypsinized, suspended in the DMEM medium, the cell density was measured, and about 80,000 cells were plated on each well of a 96-well plate (Corning, CellBIND Surface). It was. After culturing at 37 ° C. for 24 hours, the medium is removed, replaced with 50 ⁇ l of HEPES buffer, and further a HEPES buffer containing a fluorescent calcium indicator (Fluo-4 AM attached to Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit) is further added.
  • Fluo-4 AM attached to Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit
  • Example 12 Physiological response of cultured cell line (A) to saccharin stimulation The physiological response of cultured cell line (A) to saccharin stimulation was analyzed by automated fluorescence imaging.
  • the cultured cell line (A) prepared in Example 4 was trypsinized, suspended in the DMEM medium, the cell density was measured, and about 80,000 cells were plated on each well of a 96-well plate (Corning, CellBIND Surface). It was. After culturing at 37 ° C. for 24 hours, the medium is removed, replaced with 50 ⁇ l of HEPES buffer, and further a HEPES buffer containing a fluorescent calcium indicator (Fluo-4 AM attached to Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit) is further added.
  • Fluo-4 AM attached to Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit
  • Example 13 Physiological response of cultured cell line (A) to stevia stimulation The physiological response of cultured cell line (A) to stevia stimulation was analyzed by automated fluorescence imaging.
  • the cultured cell line (A) prepared in Example 4 was trypsinized, suspended in the DMEM medium, the cell density was measured, and about 80,000 cells were plated on each well of a 96-well plate (Corning, CellBIND Surface). It was. After culturing at 37 ° C. for 24 hours, the medium is removed, replaced with 50 ⁇ l of HEPES buffer, and further a HEPES buffer containing a fluorescent calcium indicator (Fluo-4 AM attached to Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit) is further added.
  • Fluo-4 AM attached to Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit
  • Example 14 Physiological response of cultured cell line (A) to neohesperidin dihydrochalcone (NHDC) stimulation
  • the physiological response of cultured cell line (A) to neohesperidin dihydrochalcone stimulation was analyzed by automated fluorescence imaging.
  • the cultured cell line (A) prepared in Example 4 was trypsinized, suspended in the DMEM medium, the cell density was measured, and about 80,000 cells were plated on each well of a 96-well plate (Corning, CellBIND Surface). It was. After culturing at 37 ° C.
  • HEPES buffer containing neohesperidin dihydrochalcone was added to the cells so that the final concentration of neohesperidin dihydrochalcone was the concentration described in Table 6, and neohesperidin dihydrochalcone stimulation was performed at 27 ° C. .
  • Example 15 Physiological response of cultured cell line (A) to cyclamate stimulation The physiological response of cultured cell line (A) to cyclamate stimulation was analyzed by automated fluorescence imaging.
  • the cultured cell line (A) prepared in Example 4 was trypsinized, suspended in the DMEM medium, the cell density was measured, and about 80,000 cells were plated on each well of a 96-well plate (Corning, CellBIND Surface). It was. After culturing at 37 ° C. for 24 hours, the medium is removed, replaced with 50 ⁇ l of HEPES buffer, and further a HEPES buffer containing a fluorescent calcium indicator (Fluo-4 AM attached to Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit) is further added.
  • Fluo-4 AM attached to Molecular Devices, FLIPR Ca 4 Assay Kit
  • a stable expression cell of a sweet receptor can be obtained.
  • the expressed cells can be used for analyzing the sweetness response of various substances.

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Abstract

【課題】甘味受容体（Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）とＧタンパク質αサブユニットを共に高い発現効率 で機能的に安定して発現させることができる甘味受容体発現コンストラクト、及び該発現 コンストラクトを発現させた安定発現細胞体を提供する。 【解決手段】本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を同一のプラスミドに挿入してなる。また、本発明の細胞体は、ゲノム中にＦＲＴ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ）配列を１か所組み込まれた２９３細胞に、本発明の甘味受容体発現コンストラクトを遺伝子導入して甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを同時に発現させてなる。

Description

甘味受容体発現コンストラクト、これを発現させた細胞体、及びその利用
本発明は、甘味受容体発現コンストラクト、これを発現させた細胞体、及びその利用に関し、詳しくは、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）とＧタンパク質を共に機能的に安定に発現させて、所望する甘味受容体発現細胞を生産させるのに有用な甘味受容体発現コンストラクト、これを発現させた細胞体、及びその利用に関する。
　味覚は、物質を口にした時に、特に舌の表面に存在する特異的な受容体と物質が結合することによって生じる感覚である。哺乳類の味覚は、５つの基本味、すなわち、塩味、酸味、甘味、うま味、苦味で構成されており、これらの基本味が統合することによって形成されると考えられている。現在のところ、塩味、酸味は、舌の表面の味蕾に存在する味細胞の近位側の細胞膜上に発現するいくつかのイオンチャネル型受容体を介して感知されると言われており、特に酸味については、ＴＲＰチャネルファミリーであるＰＫＤ２Ｌ１＋ＰＫＤ１Ｌ３からなるイオンチャネル型受容体が機能していると考えられている。
一方、甘味、うま味、苦味については、味細胞に存在する膜タンパク質であるＧタンパク質共役受容体（Ｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ））と、それに共役するＧタンパク質を介したシグナル伝達によって感知されると考えられており、具体的には、甘味はＴ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（甘味受容体）、うま味はＴ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー（うま味受容体）で受容され、苦味はＴ２Ｒファミリーと命名された約３０種類の分子（苦味受容体）で受容されることが明らかにされている。
上記Ｇタンパク質は、α、β、γの３つのサブユニットで構成されている。α、β、γのサブユニットが結合した状態は不活性型であり、味物質がＧタンパク質共役受容体に結合すると、αサブユニットに結合していたＧＤＰ（グアノシン５’二リン酸）がＧＴＰに置換されて、ＧＴＰ-αサブユニットとβ-γサブユニットの結合体に解離した活性型になる。
味覚情報の伝達機構のしくみについては、完全に解明されたわけではないが、一般には以下のように理解されている。すなわち、まず、味物質が味細胞の受容体に結合すると、細胞内のセカンドメッセンジャー（ＩＰ３、ＤＡＧ）などを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇し、次いで、細胞内に供給されたカルシウムイオンは、神経伝達物質をシナプスに放出させて神経細胞に活動電位を発生させ、その結果、受容体を起点とした味覚シグナルが味神経から脳に伝達されて味覚情報が識別、判断される、というのが通説である。また、最近、カルシウムイオンがＴＲＰＭ５という新規な陽イオンチャネルを開口させ、一価陽イオンが細胞内に流入することで脱分極するという説も認められつつある。
　上述した、塩味、酸味、甘味、うま味、苦味からなる５つの基本味のうち、特に甘味は、血液中の糖分が減少したときに、非常に美味しく感じる味であり、また、糖を含むエネルギー源としてのイメージをヒトに与え、さらには、他の基本味に比べて強い満足感、幸福感を引き起こし、ヒトの情動と深く関係していることから、飲食品などの嗜好性を決定する上で中心となる味である。
しかしながら、甘味は、他の基本味に比べて最小感度（閾値）が高く、少量では感知しにくいという特性がある。他方、甘味が強すぎると、ハイカロリー、肥満などの健康的でないイメージを誘起することになる。そのため、甘味を付与した飲食品などを製造する場合、ヒトが感知できる甘味であって、かつ、好ましく受け入れられる甘味になるように、甘味の強度を調節することが重要である。
ヒトが飲食品などを口中に含んだ時に感知する甘味の強度は、従来、主として、ヒトの官能評価によって検証されている。しかし、官能評価では、味覚と嗅覚から感知される情報を統合的に評価することになるため、物質が味覚に対してどの程度作用しているのかを検証することは困難である。特に、閾値以下の甘味を有する物質については、閾値以下のレベルの甘味をヒトは感知できないことから、甘味の程度を検証することは非常に困難である。さらに、物質間における甘味強度の違いを客観的に評価することも非常に困難である。また、官能評価あるいは官能検査では、良く訓練された評価者（パネル又はパネラーと呼ばれる）間の評価のバラツキも無視することはできない。
そこで、ヒトによる官能評価に代えて、舌の表面の味蕾に存在する味細胞を単離し、これを用いて甘味強度を評価することも考えられる。しかし、舌の表面の味蕾に存在する味細胞を単離したものは、培養プレートへの接着が非常に弱く、すぐに死んでしまうため、時間を要する評価には使用することができない。
前述したように、甘味は、飲食品などの嗜好性を決定する上で中心となる味であることから、例えば、甘味受容体に作用して甘味を増強する物質を同定することができれば、同定された該物質を使用して、飲食品、医薬品などの味の改善、甘味料の使用量の削減、摂取カロリーの低下などの有益な効果を達成することができる。そのため、飲食品、フレーバーなどの産業界からは、そのような甘味増強物質に対して多大な関心が寄せられている。
そこで、官能評価に代わる新たな甘味強度の評価方法として、甘味受容体を実際に発現させた細胞系を用いて、物質の甘味強度を客観的に測定、評価する方法が報告されている。
具体的には、例えば、特許文献１の実施例１１において、Ｇα１５発現細胞株（Ａｕｒｏｒａ　ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＨＥＫ-２９３細胞株）に、ｈＴ１Ｒ２の発現コンストラクト（プラスミドＳＡＶ２４８６）を含む線状化したｐＥＡＫ１０由来（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ベクターと、ｈＴ１Ｒ３の発現コンストラクト（プラスミドＳＸＶ５５０）を含むｐＣＤＮＡ３．１／ＺＥＯ由来（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターとを、トランスフェクトすることにより、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３を共発現させて生成した細胞株が報告されている。
また、特許文献２の実施例６には、ｈＴ１Ｒ２のｃＤＮＡを含むベクター、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡを含むベクター、キメラＧαタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、及びトランスフェクション効率のマーカーｐＤｓＲｅｄ２－Ｎ１（タカラバイオ社）を、ＤＮＡ導入比率が重量比（４：４：１：０．２）、導入量４．６～５．５μｇとなるようにして、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ-２９３Ｔ細胞に導入して、ｈＴ１Ｒ２－ｈＴ１Ｒ３、及びキメラＧαタンパク質をＨＥＫ-２９３Ｔ細胞に共発現させたシグナリング系が開示されている。
また、特許文献３の実施例７には、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを含む線状ｐＩＲＥＳ２-Ｐｕｒｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、Ｇα１６ｇｕｓｔ４４を発現する細胞にトランスフェクトし、次いで、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡ含む線状ｐｃＤＮＡ４-ＴＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクトすることにより、ｈＴ１Ｒ２／ｈＴ１Ｒ３を共発現させて生成した細胞株が記載されている。
特開２００８－１３５７０号公報 特開２００８－２２８６９０号公報 ＷＯ２００７－１２１６０４号公報
従来の甘味受容体を発現させた細胞系は、いずれも所定のＧタンパク質を発現する細胞を事前に作製あるいは入手しておき、これにＴ１Ｒ２をコードする遺伝子を含むベクター、及びＴ１Ｒ３をコードする遺伝子を含むベクターをそれぞれトランスフェクトすることによって作製されている。
しかしながら、そのような方法によって細胞系を作製すると、各ベクターの細胞への導入効率が同一ではなく、いずれかが優位に導入されることがあり、また、導入した目的遺伝子が細胞のゲノム中にランダムに挿入され、極端な場合には、導入した目的遺伝子がゲノム中の転写されない不活性部分に挿入されることがある。
そのため、得られた細胞系には、以下の問題点があった。
（１）従来の細胞系の中には、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３のいずれか一方又は両方が発現されておらず、中には、細胞内の一連のシグナル伝達機構を実質的に備えていないものがあった。すなわち、従来の細胞系は、甘味の受容・伝達機構を備えた機能的に優れたモデルであるとは言えなかった。
（２）Ｇタンパク質は細胞間で一定量が発現されるものの、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３の発現量及び発現比率が細胞間で異なり、バラツキが大きかった。そのため、甘味に関する評価結果について、細胞間での直接比較、特に各種点変異体コンストラクトを用いて発現させた細胞間での直接比較は困難であった。
(３)細胞の継代に伴い、導入されたＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３をコードする遺伝子が排除されることが高頻度で起こり、したがって、連続して継代的に甘味受容体を安定的に発現できる細胞系ではなかった。
（４）細胞系のＧタンパク質を変更する場合には、所望するＧタンパク質を発現する細胞を新たに作製、入手しておく必要があった。
（５）スクロース等の閾値が高い甘味物質に対しては、細胞の応答性が実用上必ずしも十分とは言えなかった。
そこで、本発明は、上記問題点を解決することができる発現コンストラクト、及び該発現コンストラクトを発現させた安定発現細胞体を提供することにある。
　本発明者らは、上記問題点を解決するために検討を重ねた結果、Ｆｌｐリコンビナーゼの特異的認識部位であるＦＲＴ部位を含み、かつ、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、Ｇタンパク質をコードする各遺伝子を同一のプラスミドに挿入した発現コンストラクトを作製し、これを所定の細胞に導入してＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、Ｇタンパク質を発現させることによって、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）とＧタンパク質αサブユニットを共に高い発現効率で機能的に安定して発現させることができることを見出し、かかる知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
　かくして、本発明は、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を同一のプラスミドに挿入してなる甘味受容体発現コンストラクトを提供するものである。
また、本発明は、ゲノム中にＦＲＴ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ）配列を１か所組み込まれた２９３細胞に、請求項１～１２のいずれか１項に記載の甘味受容体発現コンストラクトを遺伝子導入して甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを同時に発現させた細胞株を提供するものである。
　また、本発明は、甘味物質に対する生理的応答を測定するための上記細胞株の使用である。
　また、本発明は、上記細胞株を使用した、甘味物質に対する生理的応答の測定により同定された、特定の甘味物質に対する甘味増強物質を、該甘味物質の生理的応答を測定する際に添加することにより、該甘味物質の甘味の閾値以下の濃度で該甘味物質の生理的応答を測定する方法である。
本発明によって、以下に示す効果が得られる。
（１）本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、甘味受容体刺激による細胞内シグナル伝達が生じるように、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びそれらに共役するＧタンパク質を機能的に発現することができる。したがって、上記コンストラクトを発現させた細胞株は、実際の甘味受容によって生じる甘味の知覚を、ｉｎ　ｖｉｖｏで客観的に評価することができる最適なモデルとなり、また、甘味物質、甘味調節物質などを同定、選択する味覚センサーとして使用することができ、特に高スループットスクリーニングアッセイにおいて極めて有用である。なお、甘味調節物質とは、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３）に作用することによって、甘味物質単独で得られる甘味受容体からの生理的応答、すなわち、甘味の強度を改変させる物質を意味する。
（２）本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びそれらに共役するＧタンパク質を同等の比率で機能的に発現することができる。したがって、本発明の細胞株によれば、異なる点変異体を導入した甘味受容体、あるいは種々のＧタンパク質を発現させた複数の安定発現株について、直接比較による比較実験を行うことができる。
（３）本発明の細胞株は、長期にわたってＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びそれらに共役するＧタンパク質を発現することができ、安定性が高い。継代数にかかわらず、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、及びそれらに共役するＧタンパク質の発現量の変化が小さいため、長期間継代して利用することができる。
（４）本発明の細胞株を作製する場合、従来のように、所望するＧタンパク質を発現する細胞を作製、入手しておく必要がない。
（５）本発明の細胞株は、甘味物質に対して高い応答性を示すため、甘味の強度が閾値以下にある物質であっても、甘味の強度を評価することができる。
ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の構造を示す図である。 本発明の甘味受容体発現コンストラクトにおいて、第一の好適な具体的態様である甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）、第二の好適な具体的態様である甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）、第三の好適な具体的態様である甘味受容体発現コンストラクト（Ｃ）の構造の一部を示す図である。 甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ａ）で得られる生成物を示す図である。 甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｂ）で得られる生成物を示す図である。 甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｃ）で得られる生成物を示す図である。 甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｄ）で得られる生成物を示す図である。 甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｅ）で得られる生成物を示す図である。 甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｆ）で得られる生成物を示す図である。 甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製工程（ｇ）で得られる生成物を示す図である。 実施例５において、比較として使用した発現コンストラクトの構造の一部を示す図である。 アスパルテーム刺激に対する応答細胞数の結果を示す図である。 培養細胞株（Ａ）にアスパルテームを投与した際の蛍光イメージ画像を示す図である。 培養細胞株（Ａ）にスクロースを投与した際の蛍光イメージ画像を示す図である。 培養細胞株（Ａ）にスクロースとラクチゾールを投与した際の蛍光イメージ画像を示す図である。 培養細胞株（Ａ）にスクロースを投与した際のスクロース濃度-応答曲線である。 培養細胞株（Ａ）にD-フェニルアラニンを投与した際のD-フェニルアラニン濃度-応答曲線である。 培養細胞株（Ａ）にアスパルテームを投与した際のアスパルテーム濃度-応答曲線である。 培養細胞株（Ａ）にサッカリンを投与した際のサッカリン濃度-応答曲線である。 培養細胞株（Ａ）にステビアを投与した際のステビア濃度-応答曲線である。 培養細胞株（Ａ）にネオヘスペリジンジヒドロカルコン（NHDC）を投与した際のネオヘスペリジンジヒドロカルコン（NHDC）濃度-応答曲線である。 培養細胞株（Ａ）にシクラメートを投与した際のシクラメート濃度-応答曲線である。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明において、発現コンストラクトとは、所望のコード配列及び該コード配列を発現させるために必要なプロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子、ＦＲＴ部位をコードする遺伝子などの適切な核酸配列を連結したＤＮＡ断片を細胞に移動させる核酸分子の意味であり、発現ベクターと同様の意味である。
転写開始シグナルとして機能するプロモーターは、細胞に導入する遺伝子を発現する機能を有するものであれば限定されず、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＥＦ－１α、ＳＲα、ＣＡＧなどが例示される。
転写を終結させる核酸配列であるターミネーターとしては、ＳＶ４０　ｐＡが例示される。ＳＶ４０　ｐＡは、２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃＩＩ制限酵素断片上に含まれ、終結及びポリアデニル化の両方をもたらし、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来するものが多く利用されている。
目的とする遺伝子が導入されたことを確認するための目印として導入される遺伝子であるマーカー遺伝子としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが例示される。
ＦＲＴ部位をコードする遺伝子は、ｐＦＲＴβＧＡＬ（ＳＴＲＡＴＡＧＥ、ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＤ　ＳＩＴＥＳ、Ｃａｔａｌｏｇ＃２１８４０３、Ｍａｙ　２８、１９９１）に開示される２０８７－２１４７の塩基配列が該当する。
甘味受容体とは、前述したように、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３の２つのサブユニットを組み合わせることによって構成されるヘテロオリゴマー受容体である。本発明において、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３には、ヒトの甘味受容体サブユニット（ｈＴ１Ｒ２、ｈＴ１Ｒ３）だけでなく、ラット、マウス、ブタ、イヌなど、他の動物種（哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類など）の甘味受容体サブユニットも含まれる。
また、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３には、各サブユニットの全ての部分、すなわち、７つの膜貫通領域及び対応する細胞質及び細胞外のループからなる膜貫通ドメイン、ビーナス・フライ・トラップドメイン、高システインドメイン及びＣ末端ドメインの全ての領域が含まれる。
また、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３には、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の点変異体、キメラも含む。
Ｇタンパク質αサブユニットは、ヒト、ラット、マウスなど、各種動物（哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類など）のＧタンパク質αサブユニットを含み、具体的には、Ｇ１５、ｈＧ１６、あるいはそれらの配列の一部を改変した変異体（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４、ｈＧ１６ｇｕｓｔ２５、Ｇ１５Ｇｉ３）などが挙げられる。Ｇタンパク質αサブユニットは、選択された甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の種類などに応じて適宜決定すればよいが、ヒト甘味受容体を発現させる場合には、細胞内のエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）との間の情報伝達を効率的に担うことができる点から、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４が好ましい。なお、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４は、ｈＧα１６のＣ末端部分４４アミノ酸残基をＧｇｕｓｔに入れ替えたキメラＧタンパク質である。
Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各ｃＤＮＡは、いかなる方法で入手されるものでもよく、例えば、該タンパク質をコードするｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、既知の塩基配列情報に基づく化学合成、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシングする方法など、公知の方法で入手することができる。各種ＤＮＡの塩基配列情報は、ＮＣＢＩなどのデータベースを利用して取得できる。本発明で用いられる他の各種遺伝子も同様にして得られる。なお、ｃＤＮＡは、相補的ＤＮＡを意味し、ｍＲＮＡ転写産物の逆転写反応産物である。
ところで、本発明においては、特に断りがない限り、核酸の塩基配列には、本明細書に記載される特定の配列に加えて、適宜置換、欠失、挿入又は付加変異を導入したものも含み、例えば、縮重コドンを有する相同的配列なども含む。
上記のｃＤＮＡを挿入する同一のプラスミドとしては、特に制限されず、具体的には、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＳＨ１５、ｐＳＨ１９、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４などが例示される。ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞内で、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを発現することができるプラスミドであれば、効率良く甘味受容体発現細胞を得ることができる点で好ましい。したがって、本発明では、上記の各ｃＤＮＡを挿入する同一のプラスミドとして、市販されているｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるのが好適である。
Ｆlｐ-Ｉｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、安定的にＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを発現する培養細胞株を迅速かつ効果的に得ることができる。図１に、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の構造を示す。
本発明の甘味受容体発現コンストラクトの特徴は、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする全ての遺伝子を同一のプラスミドに挿入してなるという点にある。前述したように、従来の甘味受容体を発現させた細胞系は、いずれも所定のＧタンパク質を発現する細胞を事前に作製あるいは入手しておき、Ｔ１Ｒ２をコードする遺伝子を含むベクター、及びＴ１Ｒ３をコードする遺伝子を含むベクターをそれぞれ別個に上記細胞にトランスフェクションすることによって作製されていた。その結果、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３の発現量及び発現比率が細胞株間で大きく異なるなどの問題点があった。
それに対し、本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、上記特徴を有することにより、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を迅速かつ同時に発現することができる。これら３つの遺伝子は、1つもしくは２つのｍＲＮＡに転写された後、３つのタンパク質、すなわち、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットに翻訳されて、各遺伝子を同時に発現させるため、上記のような問題点は生じない。
本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットの発現効率を高めるため、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を転写方向が同じ向きになるように、同一のプラスミドに挿入してなるものが好ましい。
また、本発明の甘味受容体発現コンストラクトには、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットのすべて、あるいはそれらのうち２者をコードする各遺伝子を、ＩＲＥＳ配列を介して連結してなる遺伝子断片を含み、かつ、上記各遺伝子を転写方向が同じ向きになるように、同一のプラスミドに挿入してなるものが含まれる。
また、本発明の甘味受容体発現コンストラクトには、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結し、さらに、その下流に存在する甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなるものが含まれる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。
また、本発明の甘味受容体発現コンストラクトには、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子の下流に、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子を連結し、その直後にさらに、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなるものが含まれる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。
また、本発明の甘味受容体発現コンストラクトには、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子を連結し、その直後にさらに、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなるものが含まれる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。
本発明の甘味受容体発現コンストラクトにおいて、第一の好適な具体的態様としては、ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する発現コンストラクトを挙げることができる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。図２（Ａ）にその構造の一部を示す。
本発明の甘味受容体発現コンストラクトにおいて、第二の好適な具体的態様としては、ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクトを挙げることができる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。図２（Ｂ）にその構造の一部を示す。
本発明の甘味受容体発現コンストラクトにおいて、第三の好適な具体的態様としては、ＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結してなり、かつ、該ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクトを挙げることができる。上記各遺伝子は転写方向が同じ向きになるように配向させるのが好ましい。図２（Ｃ）にその構造の一部を示す。
上述した第一の好適な具体的態様の甘味受容体発現コンストラクト（図２（Ａ）参照）は、例えば、以下の工程（ａ）～（ｇ）に従って作製することができる。
（ａ）　ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイト（塩基番号８９５－１０１０）以外の場所に６塩基の置換を行い、制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列（５’-GATATC-３’）を新たに作製する（図３参照）。
この工程（ａ）の好適な態様の１つとして、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の制限酵素Ｂｇｌ
ＩＩの認識配列（塩基番号１２―１７）の直下（塩基番号１８―２３）にＥｃｏＲＶの認識配列を導入する態様が挙げられる。この態様は、例えば、以下のサブ工程（ａ１）～（ａ５）に従うことにより、実施することができる。
（ａ１）　５’末端にＢｇｌ ＩＩの認識配列（５’-AGATCT-３’）、その直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つセンスプライマーを設計、作製する。一方、ＢＧＨ ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ａ２）（ａ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、Ｂｇｌ
ＩＩとＥｃｏＲＶの各認識配列が連結した配列を含むＤＮＡ断片を増幅する。なお、ＰＣＲとは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの間のＤＮＡ配列を増幅する技術であり、増幅とは、遺伝子配列のコピー数を増加させることをいう。
ＰＣＲについては、適宜最適化された条件で行えばよいが、具体例として、９８℃で３０秒間×１サイクル、（９８℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で５５秒間）×３０サイクル、７２℃で１０分間×１サイクル、その後、４℃に冷却する条件が例示される。
（ａ３）　（ａ２）で増幅したＤＮＡ断片を、Ｂｇｌ
ＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ａ４）　ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｂｇｌ
ＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ａ５）　（ａ３）で得られたＤＮＡ断片と、（ａ４）で得られたｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを、ライゲーション反応によって結合させることにより、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌ
ＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターを作製する。
ライゲーション反応は、通常のＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて行えばよいが、迅速かつ簡便に処理を行うために、１液タイプのＤＮＡライゲーション試薬であるＬｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いることが好ましい。
（ｂ）　工程（ａ）で作製したベクターのマルチクローニングサイト（塩基番号８９５－１０１０）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する（図４参照）。
この工程（ｂ）は、例えば、以下のサブ工程（ｂ１）～（ｂ８）に従うことにより、実施することができる。
（ｂ１）　ｈＴ１Ｒ３のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｂ２）　（ｂ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｂ３）　（ｂ２）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片を、制限酵素Ａｓｃ
Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化する。　
（ｂ４）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素Ａｓｃ
Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ｂ５）　（ｂ３）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｂ４）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ｂ６）　（ｂ５）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片を精製する。
（ｂ７）　（ａ５）で作製したベクターを、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ｂ８）　（ｂ６）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｂ７）で得られたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させることにより、（ａ５）で作製したベクターのマルチクローニングサイトに、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ｃ）　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）に、ＩＲＥＳ配列と、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡとを挿入し、これらが連結された配列（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列）を有するベクター（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-））を作製する（図５参照）。ＩＲＥＳ配列とは、内部リボソーム侵入部位(ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ)をコードする配列を意味する。
この工程（ｃ）は、例えば、以下のサブ工程（ｃ１）～（ｃ１１）に従うことにより、実施することができる。
（ｃ１）　ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマーを設計、作製する。一方、ＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｃ２）　（ｃ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅する。なお、ＥＧＦＰは、Ｅｎｈａｎｓｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎの略である。
（ｃ３）　ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４のコード領域の直前及び直後に、Ｎｏｔ
Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製し、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅する。増幅断片を、Ｎｏｔ
Ｉで消化する。
（ｃ４）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｎｏｔ
Ｉで消化する。
（ｃ５）　（ｃ３）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｃ４）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを挿入したベクター（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０）を作製する。
（ｃ６）　ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマーを設計、作製する。一方、ｈＧＨ
ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマーを設計、作製する。　なお、ｐＡ配列（ポリアデニル化配列）は、組換え転写産物を安定化するために、ＲＮＡ転写産物の終結及びポリアデニル化を指示するＤＮＡ配列である。ｐＡ配列以外にも、種々の終結配列が公知であり、本発明の甘味受容体発現コンストラクトに使用しうる。ｐＡ配列は、プラスミドに存在する内在性のものでもよい。通常使用されるｐＡ配列は、ＳＶ４０のポリＡ配列であり、このポリＡ配列は２３７ｂｐの制限酵素ＢａｍＨＩ／ＢｃＩＩ断片に含まれる。また、通常使用されるｐＡ配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ：Ｂｏｖｉｎｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ）遺伝子に由来する。
（ｃ７）　（ｃ５）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、（ｃ６）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｃ８）　（ｃ２）で得られたＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化する。
（ｃ９）　（ｃ７）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、Ｎｏｔ
Ｉで消化する。
（ｃ１０）　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｎｏｔ Ｉで消化する。
（ｃ１１）　（ｃ８）で得られたＩＲＥＳ配列と、（ｃ９）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｃ１０）で得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を作製する。
（ｄ）　工程（ｂ）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ配列とｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを連結した配列（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列）を挿入する（図６参照）。
この工程（ｄ）は、例えば、以下のサブ工程（ｄ１）～（ｄ３）に従うことにより、実施することができる。
（ｄ１）　（ｃ１１）で作製したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製する。
（ｄ２）　（ｂ８）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に存在する部位をＮｏｔ
Ｉで消化する。
（ｄ３）　（ｄ１）で得られたＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列と、（ｄ２）で得られたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、（ｂ８）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。この結果、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴが得られる。
（ｅ）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入する（図７参照）。
この工程は、例えば、以下のサブ工程（ｅ１）～（ｅ５）に従うことにより、実施することができる。
（ｅ１）　ｈＴ１Ｒ２のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｅ２）　（ｅ１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｅ３）　（ｅ２）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、Ａｓｃ　Ｉ及びＮｏｔ
Ｉで消化する。
（ｅ４）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ａｓｃ
Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ｅ５）　（ｅ３）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｅ４）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ｆ）　工程（ｅ）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する（図８参照）。
この工程は、例えば、以下のサブ工程（ｆ１）～（ｆ３）に従うことにより、実施することができる。
（ｆ１）　（ｃ１１）で作製したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製する。
（ｆ２）　（ｅ５）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に存在する部位をＮｏｔ
Ｉで消化する。
（ｆ３）　（ｆ１）で得られたＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列と、（ｆ２）で得られたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、（ｅ５）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。この結果、ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が得られる。
（ｇ）　工程（ｄ）で得られたベクターを、ＥｃｏＲＶで切断し、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列の上流に、工程（ｆ）で得られたｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入して、前述した第一の好適な具体的態様の発現コンストラクトを得る（図９参照）。
この工程（ｇ）は、例えば、以下のサブ工程（ｇ１）～（ｇ３）に従うことにより、実施することができる。
（ｇ１）　Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うためのプライマーを設計、作製し、これを用いて、（ｆ３）で作製したベクターをテンプレートとして、ＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡの領域をＰＣＲによって増幅する。上記プライマーは、（ｄ３）で得られたベクターを制限酵素で線状化したものの末端と相同な約１５塩基を、上記領域のＤＮＡ断片に付加するようにして設計する。
（ｇ２）　（ｄ３）で得られたベクターを、ＥｃｏＲＶで消化する。
（ｇ３）　（ｇ１）で得られたＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡ配列断片と、（ｇ２）で得られたベクターとを、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合させて、（ｄ３）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列の上流に、（ｆ３）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入した第一の具体的な態様の甘味受容体発現コンストラクトを作製する。Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）による結合は、（ｇ１）で得られたＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡ配列断片と、（ｇ２）で得られたベクターを混合し、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ酵素と所定のバッファーを加えて、通常、３７℃で１５分、次いで、５０℃で１５分反応を行う。Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によれば、制限酵素サイトの制約を受けることなく、また、長鎖ＤＮＡ断片でも、目的ＤＮＡ断片のクローニングが可能である。
次に、上述した第二の好適な態様である甘味受容体発現コンストラクト（図２（Ｂ）参照）の作製について述べる。
まず、第一の好適な具体的態様の発現コンストラクトの作製で述べた工程（ａ）～（ｅ）を同様にして行う。その後、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うためのプライマーを設計、作製し、これを用いて、工程（ｅ）で作製したベクターをテンプレートとして、ＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ｈＧＨ　ｐＡの領域をＰＣＲによって増幅する。そして、得られたＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ｈＧＨ　ｐＡ配列断片と、　ＥｃｏＲＶで消化した工程（ｄ）で得られたベクターとを、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合させることにより、工程（ｄ）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列の上流に、上記ＰＣＲ産物であるＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ｈＧＨ　ｐＡの配列を挿入して、上述した第二の好適な具体的態様の甘味受容体発現コンストラクトを作製する。
次に、上述した第三の好適な具体的態様である甘味受容体発現コンストラクト（図２（ｃ）参照）は、例えば、以下の工程（ａ’）～（ｇ’）に従って作製することができる。
（ａ’）　ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイト（塩基番号８９５－１０１０）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
この工程（ａ’）は、例えば、以下のサブ工程（ａ’１）～（ａ’８）に従うことにより、実施することができる。
（ａ’１）　ｈＴ１Ｒ３のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ａ’２）　（ａ’１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ａ’３）　（ａ’２）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片を、制限酵素Ａｓｃ
Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化する。　
（ａ’４）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素Ａｓｃ
Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ａ’５）　（ａ’３）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、（ａ’４）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ａ’６）　（ａ’５）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片を精製する。
（ａ’７）　ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ａ’８）　（ａ’６）で得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、（ａ’７）で得られたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させることにより、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトに、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ｂ’）　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）に、ＩＲＥＳ配列と、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとを挿入し、これらが連結された配列（ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列）を有するベクター（ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-））を作製する。
この工程（ｂ’）は、例えば、以下のサブ工程（ｂ’１）～（ｂ’１６）に従うことにより、実施することができる。
（ｂ’１）　ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマーを設計、作製する。一方、ＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｂ’２）　（ｂ’１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅する。
（ｂ’３）　ｈＴ１Ｒ２のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｂ’４）　これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｂ’５）　（ｂ’４）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、Ａｓｃ　Ｉ及びＮｏｔ
Ｉで消化する。
（ｂ’６）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ａｓｃ
Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化する。
（ｂ’７）　（ｂ’５）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｂ’６）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入する。
（ｂ’８）　ｈＴ１Ｒ２の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマーを設計、作製する。一方、ｈＧＨ
ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマーを設計、作製する。　
（ｂ’９）　（ｂ’７）で得られたｈＴ１Ｒ２／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、（ｂ’８）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｂ’１０）　（ｂ’２）で得られたＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化する。
（ｂ’１１）　（ｂ’９）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、Ｎｏｔ
Ｉで消化する。
（ｂ’１２）　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｎｏｔ Ｉで消化する。
（ｂ’１３）　（ｂ’１０）で得られたＩＲＥＳ配列と、（ｂ’１１）で得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｂ’１２）で得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を作製する。
（ｃ’）　工程（ａ’）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ配列とｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを連結した配列（ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列）を挿入する。
この工程（ｃ’）は、例えば、以下のサブ工程（ｃ’１）～（ｃ’３）に従うことにより、実施することができる。
（ｃ’１）　（ｂ’１３）で作製したＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を精製する。
（ｃ’２）　（ａ’８）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に存在する部位をＮｏｔ
Ｉで消化する。
（ｃ’３）　（ｃ’１）で得られたＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列と、（ｃ’２）で得られたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、（ａ’８）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を挿入する。この結果、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴが得られる。
（ｄ’）　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）に、ＩＲＥＳ配列と、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡとを挿入し、これらが連結された配列（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列）を有するベクター（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-））を作製する。
この工程（ｄ’）は、例えば、以下のサブ工程（ｄ’１）～（ｄ’１１）に従うことにより、実施することができる。
（ｄ’１）　ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマーを設計、作製する。一方、ＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマーを設計、作製する。
（ｄ’２）　（ｄ’１）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅する。
（ｄ’３）　ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４のコード領域の直前及び直後に、Ｎｏｔ
Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー、アンチセンスプライマーを設計、作製し、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅する。増幅断片を、Ｎｏｔ
Ｉで消化する。
（ｄ’４）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｎｏｔ
Ｉで消化する。
（ｄ’５）　（ｄ’３）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｄ’４）で得られたｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを挿入したベクター（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０）を作製する。
（ｄ’６）　ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマーを設計、作製する。一方、ｈＧＨ
ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマーを設計、作製する。　
（ｄ’７）　（ｄ’５）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、（ｄ’６）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅する。
（ｄ’８）　（ｄ’２）で得られたＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化する。
（ｄ’９）　（ｄ’７）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、Ｎｏｔ
Ｉで消化する。
（ｄ’１０）　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｎｏｔ Ｉで消化する。
（ｄ’１１）　（ｄ’８）で得られたＩＲＥＳ配列と、（ｄ’９）で得られたｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ断片と、（ｄ’１０）で得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を作製する。
（ｅ’）　工程（ｃ’）で作製したベクターのｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。
この工程は、例えば、以下のサブ工程（ｅ’１）～（ｅ’３）に従うことにより、実施することができる。
（ｅ’１）　（ｄ’１１）で作製したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製する。
（ｅ’２）　（ｃ’３）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に存在する部位をＮｏｔ
Ｉで消化する。
（ｅ’３）　（ｅ’１）で得られたＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列と、（ｅ’２）で得られたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）などによるライゲーション反応によって結合させて、（ｃ’３）で得られたベクターのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入する。これにより、上述した第三の好適な具体的態様の甘味受容体発現コンストラクトが得られる。　　
得られた本発明の甘味受容体発現コンストラクトは、宿主細胞にトランスフェクションするために使用されるが、その宿主細胞としては、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、３２Ｄ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞などの真核細胞が挙げられる。本発明の細胞株を作製する場合、ゲノム中にＦＲＴ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ）配列を１か所組み込まれた２９３細胞が好適である。この細胞株の作製方法について説明する。
該培養細胞株の作製は、Ｆlｐ-Ｉｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞に、上記甘味受容体発現コンストラクトと、Ｆｌｐリコンビナーゼ発現ベクターであるｐＯＧ４４をコトランスフェクションすることによって行われる。Ｆlｐ-Ｉｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によれば、トランジエントに発現したＦｌｐリコンビナーゼにより、２９３細胞のゲノムＤＮＡ中に保持されたＦＲＴ部位が開裂して、その部分に外来遺伝子が導入され、該遺伝子が発現する。すなわち、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子は、サッカロマイセス・セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)由来のＦｌｐリコンビナーゼと、Ｆｌｐリコンビナーゼの標的部位であるＦＲＴ部位を利用した部位特異的組換えにより、２９３細胞の染色体のＦＲＴ部位に挿入され、その結果、安定的にＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを発現する培養細胞株が迅速かつ効果的に得られる。この培養細胞株は、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子は、１つあるいは２つのｍＲＮＡに転写された後、３つのタンパク質、すなわち、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットに翻訳される。このように、本発明の甘味受容体発現コンストラクトを宿主細胞にトランスフェクションする場合、部位特異的にＤＮＡを切断かつ再結合する酵素を使用することが好ましく、Ｆｌｐリコンビナーゼのほか、λインテグラーゼ、Ｋｗリコンビナーゼなどが挙げられる。
ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞は、例えば、以下のようにして作製することができる。
まず、宿主細胞である２９３細胞に、ＦＲＴ部位を導入するためのベクターであるｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏを遺伝子導入し、導入された細胞をゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ、登録商標）で選択する。ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏは、ｌａｃＺとゼオシン耐性遺伝子の融合遺伝子を持つため、ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏがゲノムに導入された細胞は、β-ガラクトシダーゼを発現し、ゼオシン耐性となる。ゼオシン感受性の程度をβ-ガラクトシダーゼアッセイにより確認することができる。
次いで、ｌａｃＺ遺伝子に対してのサザンブロット法を行う。これにより、ゲノム中の転写されうる位置の１か所だけにＦＲＴ部位が組み込まれていることが確認される。ゲノムＤＮＡ中にＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞として、市販されているＦｌｐ-Ｉｎ-２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるのが簡便である。
　本発明の培養細胞株の作製は、ＦＲＴ部位が１か所組み込まれた２９３細胞に、上記発現コンストラクト及びＦｌｐリコンビナーゼの発現ベクターであるｐＯＧ４４をコトランスフェクションし、ハイグロマイシンＢを含む選択培地にて、ハイグロマイシンＢ耐性の細胞株を選択することによって行うことができる。
Ｆｌｐリコンビナーゼ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ）は、部位特異的な組換え反応を行う酵素の一種であり、該酵素の発現ベクターであるｐＯＧ４４が公知である。上記発現コンストラクト及びｐＯＧ４４をコトランスフェクションすると、発現したＦｌｐリコンビナーゼにより、上記発現コンストラクトは上記２９３細胞のＦＲＴ部位に挿入されて、２９３細胞はハイグロマイシンＢ耐性、ゼオシン感受性に変化するので、これらの薬剤耐性を指標とすることによって目的の遺伝子が挿入されたか否かを容易に判定することができる。
コトランスフェクションする方法としては、公知の方法、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム-ＤＮＡ沈殿法、塩化カルシウム法、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥ-デキストラン法、マイクロインジェクション法など、適宜選択することができる。
こうして、ゲノム中の同じ位置に甘味受容体発現コンストラクトが入り、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットが同時に発現された培養細胞株を得ることができる。Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットの発現は、培養細胞株からタンパク質を抽出し、Ｔ１Ｒ２抗体、Ｔ１Ｒ３抗体、及びＧタンパク質αサブユニットを認識可能な抗体を用いたウェスタンブロット法により確認することができる。
上記安定発現細胞は、栄養培地で培養することにより、増殖及び／又は維持される。該安定発現細胞の増殖及び／又は維持の具体的方法に関しては適宜決定すればよいが、グルコースによる脱感作を最小限にするため、例えば、L-グルタミンを４ｍＭになるよう補足された低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ダルベッコ改変イーグル(ＤＭＥＭ)培地（Vｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６、１９５９）に、１０％ＨＩ-ＦＢＳ（Ｈｅａｔ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）及び１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を加えたものを用いて、３７℃で増殖及び／又は維持を行うことが好ましい。
本発明の培養細胞株は、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットが機能的に発現されているため、実際の甘味受容によって生じる甘味の知覚を、ｉｎ　ｖｉｖｏで客観的に評価することができる最適なモデルとなり、甘味物質を選択する味覚センサーとして使用することができる。すなわち、本発明の培養細胞株を用いて、例えば、ある特定の甘味物質を該培養細胞株に接触させて、それによって発生した生理的応答を測定することにより、該甘味物質の甘味を評価することができる。
本発明の培養細胞株を用いて生理的応答を測定する対象となる甘味物質は、ヒトが感知できる甘味を呈することができる物質であれば特に限定されず、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラフィノース、キシロース、スクロース、マルトース、乳糖、水飴、異性化糖、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、イソマルトール、還元水飴、還元パラチノース、和三盆、黒糖、三温糖、蜂蜜、糖蜜、甘草抽出物及びメープルシロップなどの糖質系甘味料、及び、アスパルテーム、サッカリン、ズルチン、ステビオシド、ステビア抽出物、グリチルリチン、アセスルファム－Ｋ、スクラロース（登録商標；三栄源エフ・エフ・アイ）、シクラメート、アリテーム、ネオテーム、ペリラルチン、モネリン、クルクリン（登録商標；ＡＤＥＫＡ）などの非糖質系甘味料が広く含まれる。
本発明の培養細胞株を用いてある特定の甘味物質の甘味を評価するには、例えば、以下のようにして行う。
まず、前述したように、上記甘味受容体発現コンストラクトを発現させた培養細胞株を取得し、次いで、該培養細胞の所定の数を多数のウェル（２４穴、４８穴、９６穴、３８４穴など）を有するマイクロプレートの各ウェルに撒き（例えば、１万～５０万個／ウェル）、所定の培地（例えば、ＤＭＥＭ培地）中で培養する。
その後、特定の甘味物質を添加した場合において、上記安定培養細胞株に発生した生理的応答を測定し、その測定結果に基づいて甘味物質の甘味を評価する。
培養細胞株に発生した生理的応答を測定する場合、生理的応答としては、甘味受容体の活性化に伴って変化する事象が適宜選択される。甘味受容体が活性化されると、その後、細胞内で種々の現象が開始される。味物質が受容体に結合すると、細胞内のセカンドメッセンジャー（ＩＰ３（イノシトール三リン酸）、ＤＡＧ）などを介する情報伝達過程を経て、細胞内のカルシウム濃度が上昇する。したがって、測定対象とする生理的応答としては、甘味受容体の活性化に伴って変化する細胞内のセカンドメッセンジャーの変化、細胞内のカルシウム濃度の変化などが挙げられる。
本発明においては、甘味物質に対する生理的応答の測定は、甘味刺激によって惹起される細胞内のカルシウム濃度の変化を、蛍光カルシウム指示薬を用いることにより細胞外から観察するカルシウムイメージング法で行うのが好適である。これにより、従来の官能評価とは異なり、受容体レベルでの甘味の客観的な評価が可能となる。また、甘味の程度を数値化することにより、各種物質の甘味の強度を相互に比較することができる。
蛍光カルシウム指示薬には、生理的に変化し得るカルシウム濃度において蛍光特性が変化すること、及びそのときの変化がカルシウム特異的に誘導されること、が要求されるため、現在、錯形成部位と蛍光発色団が結合した構造を有する化合物が蛍光指示薬として汎用されている。本発明では、そのような蛍光カルシウム指示薬であるＦｌｕｏ-４　ＡＭ、Ｆｕｒａ-２　ＡＭを使用することが好適である。
甘味物質に対する生理的応答を測定する場合、カルシウムイメージング法を用いて、甘味物質に対する生理的応答を数値化及び可視化することが好ましい。例えば、マルチプレートリーダーによる同時アッセイにより、細胞応答の数値化を行い、さらに、顕微鏡を用いたイメージングにより、細胞内のカルシウム濃度の変化を画像化して、各細胞が応答しているかを観察する。マルチプレートリーダーによる同時アッセイに使用した蛍光指示薬とは異なる蛍光指示薬を使用した顕微鏡観察を行うことにより、細胞応答がアーティファクトによるものでないことを確認できる。
マルチプレートリーダーによる同時アッセイは、公知の方法に従って適宜行えばよいが、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、自動化蛍光カルシウムイメージングを行うのが簡便かつ迅速であり、ハイスループットアッセイが可能となる。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　Ｍ５ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）の性能と、８チャンネルピペッターを融合させたマルチプレートリーダーである。
ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いた自動化蛍光イメージングは、例えば、以下の手順に従って行うことができる。
まず、ハイグロマイシンＢを除いた低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ＤＭＥＭ培地で細胞を懸濁し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　Ｓｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、７～８万個ずつ撒く。
次いで、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、適当量のＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸）バッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲ　Ｃａ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏ-４　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに添加する。蛍光指示薬Ｆｌｕｏ-４（励起波長：４９５ｎｍ、蛍光波長：５１８ｎｍ）は、細胞内への移行を容易にするため、脂溶性のアセトキシメチル基が導入されており、培地中に添加されると容易に細胞内に取り込まれ、細胞内のエステラーゼにより加水分解される。加水分解されたＦｌｕｏ-４は、細胞膜を透過しにくくなり、細胞内に拡散してカルシウムと錯形成し、強い蛍光を発する。蛍光観察用の９６ウェルプレートには、プラスチック底とフィルム底があり、プラスチック底のプレートは細胞の接着性及び成長が良いので、ウェル全体を観察するマルチプレートリーダーを用いた同時アッセイ時に使用されるが、このプラスチック底のプレートは、ＵＶ波長の透過性が悪く、Ｆｕｒａ-２の励起光の透過を阻害するため、Ｆｌｕｏ-４を用いる。
次いで、２７～３７℃で３０～６０分間インキュベートした後、これに特定濃度の甘味物質又は甘味物質と試験する物質の溶液を添加することにより、２７～３７℃で味刺激を行う。
甘味物質又は甘味物質と試験する物質の添加直後から６０～１２０秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を測定することにより、甘味刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を定量することができる。
蛍光顕微鏡を用いた蛍光カルシウムイメージングは、以下の手順に従って行うことができる。
まず、ハイグロマイシンＢを除いた低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ＤＭＥＭ培地で細胞を懸濁し、９６ウェルプレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｌｕｍｏｘ)の各ウェル上に４～８万個ずつ撒く。
次いで、３７℃で２４～４８時間培養した後、培地を除去し、適当量のＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｆｕｒａ-２　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに添加する。
次いで、２７～３７℃で３０～６０分間インキュベートした後、細胞外の蛍光指示薬を除去し、最終的に適当量のＨＥＰＥＳバッファーで置換し、１０～２０分間室温にて静置する。これに特定濃度の甘味物質又は甘味物質と試験する物質の溶液を適当量添加することにより室温で味刺激を行う。蛍光指示薬Ｆｕｒａ-２（励起波長：３４０ｎｍ／３８０ｎｍ、蛍光波長：５１０ｎｍ）は、カルシウムイオン濃度が高くなると３４０ｎｍ励起の蛍光強度が上昇し、３８０ｎｍ励起の蛍光強度が低下する。
次いで、甘味物質又は甘味物質と試験する物質の溶液の添加直後から６０～３００秒後にかけて、顕微鏡視野中の蛍光像（３４０ｎｍ，３８０ｎｍ励起で５１０ｎｍ蛍光）を取り込み、２波長励起蛍光の比率を擬似カラーで表示することにより、甘味刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を観察することができる。
以上のようにして、本発明では、生理的応答を測定する際に、カルシウムイメージング法において、蛍光特性の異なる２種類の上記蛍光指示薬を併用することにより、観察系によらない普遍的な現象を観察することができる。
　以上のように、本発明の細胞株を使用して、甘味物質に対する生理的応答を測定することができる。また、本発明の細胞株を使用した、甘味物質に対する生理的応答の測定を用いて同定された、特定の甘味物質に対する甘味増強物質を、該甘味物質の生理的応答を測定する際に添加することにより、該甘味物質の甘味の閾値以下の濃度で生理的応答を測定することもできる。
　以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
（実施例１）
甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製
ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）（図２（Ａ）参照）を、以下の手順に従って作製した。
　５’末端にＢｇｌ ＩＩの認識配列（５’-AGATCT-３’）、その直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つセンスプライマー（配列番号１：TATAGATCTGATATCCCCCTATGGTGCACTCTC）及びＢＧＨ ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマー（配列番号２：TAGAAGGCACAGTCGAGG）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、Ｂｇｌ
ＩＩとＥｃｏＲＶの各認識配列が連結した配列を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、後述する実施例も含め、全て、９８℃で３０秒間×１サイクル、（９８℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で５５秒間）×３０サイクル、７２℃で１０分間×１サイクル、その後、４℃に冷却する条件で行った。
次いで、この増幅したＤＮＡ断片を、Ｂｇｌ
ＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化し、また、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｂｇｌ ＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化した。これらの制限酵素消化産物をＬｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させることにより、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌ ＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターを作製した。
次いで、ｈＴ１Ｒ３のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号３：GATCGGCGCGCCGCCATGCTGGGCCCTGCTGTC）及びアンチセンスプライマー（配列番号４：TAGAAGGCACAGTCGAGG）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを増幅した。
増幅したＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片を、Ａｓｃ
Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化し、また、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ａｓｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化した。そして、これらの制限酵素消化産物をＬｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入した。次いで、これをＨｉｎｄ
ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片を精製した。
このｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片と、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化した、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌ ＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターとを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させることにより、該ベクターのマルチクローニングサイトに、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入した。　
次いで、ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号５：GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCCCC）及びＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマー（配列番号６：GGTTGTGGCCATATTATC）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅した。
ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４のコード領域の直前及び直後に、Ｎｏｔ
Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号７：GATCGCGGCCGCATGGCCCGCTCGCTGACC）、アンチセンスプライマー（配列番号８：GATCGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTA）を設計、作製した。ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅した。増幅断片をＮｏｔ
Ｉで消化し、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＮｏｔ Ｉで消化して、これらをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを挿入したベクター（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０）を作製した。
次いで、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマー（配列番号９：ATGGCCCGCTCGCTGACC）及びｈＧＨ ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマー（配列番号１０：CTGGATGCAGGCTACTCTA）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅した。
次いで、Ｅｃｏ５２Ｉで消化した上記ＩＲＥＳ配列と、Ｎｏｔ
Ｉで消化した上記ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡと、Ｎｏｔ Ｉで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を作製した。
次いで、前述したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製した。
そして、マルチクローニングサイトにｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを挿入した上記ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＮｏｔ
Ｉで消化し、該ベクター中のｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に存在する部分を切断した。このベクターと上記のＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ３をコードするＤＮＡ配列の直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入してなる、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴを得た。
次いで、ｈＴ１Ｒ２のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号１１：GATCGGCGCGCCGCCATGGGGCCCAGGGCAAAG）及びアンチセンスプライマー（配列番号１２：GATCGCGGCCGCCTAGTCCCTCCTCATGGT）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅した。得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、Ａｓｃ　Ｉ及びＮｏｔ
Ｉで消化し、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ａｓｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化して、これらをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入した。
次いで、前述したＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製した。
そして、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入したｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＮｏｔ
Ｉで消化し、該ベクター中のｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に存在する部分を切断した。このベクターと上記ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入し、ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を得た。
次いで、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うためのプライマー（配列番号１３：ATCGGGAGATCTGATGCATAACTAGTGAGGCTC及び配列番号１４：GCACCATAGGGGGATAGCGGATCCAGACATGAT）を設計、作製し、これを用いて、上記のｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をテンプレートとして、ＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡの領域をＰＣＲによって増幅した。
そして、このＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４-ｈＧＨ　ｐＡ配列断片と、ＥｃｏＲＶで消化したｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴとを、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合させて、甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）を作製した。得られた甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）は、ＤＮＡシーケンシングにより、塩基配列に誤りがないことを確認した。
（実施例２）
甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）の作製
ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）（図２（Ｂ）参照）を、以下の手順に従って作製した。
まず、実施例１の甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の作製で述べた工程に従って、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌ
ＩＩの認識配列の直下にＥｃｏＲＶの認識配列を持つベクターの作製から、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入するまでの工程を実施した。
その後、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うためのプライマー（配列番号１５：ATCGGGAGATCTGATGCATAACTAGTGAGGCTC及び配列番号１６：GCACCATAGGGGGATAGCGGATCCAGACATGAT）を設計、作製し、これを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入したｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をテンプレートとして、ＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ｈＧＨ　ｐＡの領域をＰＣＲによって増幅した。そして、得られたＥＦ-１αプロモーター-ｈＴ１Ｒ２-ｈＧＨ　ｐＡ配列断片と、　ＥｃｏＲＶで消化したｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合させて、甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）を作製した。得られた甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）は、ＤＮＡシーケンシングにより、塩基配列に誤りがないことを確認した。
（実施例３）
甘味受容体発現コンストラクト（Ｃ）の作製
ＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結してなり、かつ、該ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクト（Ｃ）（図２（Ｃ）参照）を、以下の手順に従って作製した。
ｈＴ１Ｒ３のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号１７：GATCGGCGCGCCGCCATGCTGGGCCCTGCTGTC）及びアンチセンスプライマー（配列番号１８：GATCGCGGCCGCTCACTCATGTTTCCCCTG）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを増幅した。
次いで、得られたｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片を、制限酵素Ａｓｃ
Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化し、また、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素Ａｓｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化した。これらの制限酵素消化産物を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを持つｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を得た。
　そして、このｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離して、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡ断片を精製した。
次いで、このｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡ断片と、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉで消化したｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させることにより、マルチクローニングサイトに、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを持つｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を作製した。
次いで、ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号１９：GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCCCC）及びＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマー（配列番号２０：GGTTGTGGCCATATTATC）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅した。
次いで、ｈＴ１Ｒ２のコード領域の直前及び直後に、それぞれＡｓｃ　Ｉの認識配列（５’-GGCGCGCC-３’）及びＮｏｔ Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号２１：GATCGGCGCGCCGCCATGGGGCCCAGGGCAAAG）及びアンチセンスプライマー（配列番号２２：GATCGCGGCCGCCTAGTCCCTCCTCATGGT）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２をコードするＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅した。得られたｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、Ａｓｃ　Ｉ及びＮｏｔ
Ｉで消化し、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ａｓｃ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化して、これらをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを挿入した。
　次いで、ｈＴ１Ｒ２の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマー（配列番号２３： ATGGGGCCCAGGGCAAAG）及びｈＧＨ ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマー（配列番号２４：CTGGATGCAGGCTACTCTA）を設計、作製した。
そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｈＴ１Ｒ２／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを増幅した。
次いで、前述したＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、また、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、Ｎｏｔ
Ｉで消化し、また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｎｏｔ Ｉで消化して、これらの制限酵素消化産物をＬｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を作製した。
次いで、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を精製した。
そして、ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列と、Ｎｏｔ Ｉで消化したｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡを持つｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴを得た。
次いで、ＩＲＥＳ配列の直前にＥｃｏ５２Ｉの認識配列（５’-CGGCCG-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号２５：GATCCGGCCGGCCCCTCTCCCTCCCCCC）及びＩＲＥＳ配列の終了する部分に相当するアンチセンスプライマー（配列番号２６：GGTTGTGGCCATATTATC）を設計、作製した。そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＩＲＥＳ配列を増幅した。
次いで、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４のコード領域の直前及び直後に、Ｎｏｔ
Ｉの認識配列（５’-GCGGCCGC-３’）を持つようなセンスプライマー（配列番号２７：GATCGCGGCCGCATGGCCCGCTCGCTGACC）、アンチセンスプライマー（配列番号２８：GATCGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTA）を設計、作製した。ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡ配列を含む配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅した。増幅断片をＮｏｔ
Ｉで消化し、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＮｏｔ Ｉで消化して、これらをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを挿入したベクター（ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０）を作製した。
次いで、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の開始コドンを含む１８塩基のセンスプライマー（配列番号２９：ATGGCCCGCTCGCTGACC）及びｈＧＨ ｐＡ配列中の配列を持つアンチセンスプライマー（配列番号３０：CTGGATGCAGGCTACTCTA）を設計、作製した。そして、これらのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、上記ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＥＡＫ１０をテンプレートとして、ＰＣＲを行い、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを増幅した。　
次いで、作製したＩＲＥＳ配列を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、また、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、Ｎｏｔ
Ｉで消化し、また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｎｏｔ Ｉで消化し、これらの制限酵素消化産物を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を有するベクター（ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-））を作製した。
次いで、このＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（-）を、Ｅｃｏ５２Ｉで消化し、アガロース電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を分離して、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を精製した。
そして、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に存在する部位をＮｏｔ
Ｉで消化した。この制限酵素消化産物とＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ライゲーション反応によって結合させて、ｈＴ１Ｒ３-ＩＲＥＳ２-ｈＴ１Ｒ２配列を含むｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴのｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの直後に、ＩＲＥＳ２-ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４配列を挿入することにより、甘味受容体発現コンストラクト（Ｃ）を作製した。得られた甘味受容体発現コンストラクト（Ｃ）は、ＤＮＡシーケンシングにより、塩基配列に誤りがないことを確認した。
（実施例４）
　ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）とｈＧ１６ｇｕｓｔ４４を発現させた培養細胞株（Ａ）～（Ｃ）の作製
実施例１で作製した甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）０．８μｇと、ｐＯＧ４４　７．２μｇとをリポフェクション法で、２００万個のＦｌｐ-Ｉｎ-２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションして４８時間経過後、ハイグロマイシンＢ添加（１００μｇ／ｍｌ）培地でスクリーニングを行い、安定発現株である培養細胞株（Ａ）を取得した。
次いで、ハイグロマイシンＢに対して生存した細胞を増殖させ、その一部をゼオシン添加（１００μｇ／ｍｌ）培地で培養して、ゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）によって細胞が死滅していたことから、培養細胞株（Ａ）には、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）及びｈＧ１６ｇｕｓｔ４４の遺伝子がＦＲＴ部位に導入されていることを確認した。
また、培養細胞株（Ａ）～（Ｃ）について、ＲＴ-ＰＣＲを行い、アガロース電気泳動により、ｈＴ１Ｒ２断片、ｈＴ１Ｒ３断片及びｈＧ１６ｇｕｓｔ４４断片のバンドが認められ、ヒト甘味受容体（ｈＴ１Ｒ２＋ｈＴ１Ｒ３）及びｈＧ１６ｇｕｓｔ４４が発現していることを確認した。
同様に、甘味受容体発現コンストラクト（Ａ）の代わりに、実施例２で作製した甘味受容体発現コンストラクト（Ｂ）、（Ｃ）をそれぞれ用いて、培養細胞株（Ｂ）及び培養細胞株（Ｃ）を作製した。
その後、これらの培養細胞株（Ａ）～（Ｃ）を１０％ＨＩ-ＦＢＳ（Ｈｅａｔ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)、L-グルタミン４ｍＭを含む低グルコース（１，０００ｍｇ／ｍｌ）ダルベッコ改変イーグル(ＤＭＥＭ)培地で、３７℃で増殖、維持した。
（実施例５）
アスパルテーム刺激に対する、実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）～（Ｃ）の生理的応答の比較
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）～（Ｃ）のそれぞれに、蛍光カルシウム指示薬Ｆｕｒａ-２　ＡＭを負荷して、細胞に取り込ませた。そして、Ｆｕｒａ-２　ＡＭを負荷した細胞を３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起し、５１０ｎｍにおいて観察される蛍光画像を蛍光顕微鏡ならびにＣＣＤカメラを用いて取得した。画像取得中に細胞に終濃度１０ｍＭのアスパルテームを投与し、その後、継続して画像の取得を行った。取得した画像の視野中から細胞１００個をランダムに選択し、応答細胞数を計測した。
また、比較として、ＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結してなる配列を有するｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴからなる発現コンストラクト（図１０）を用いて、実施例４と同様に培養細胞株（Ｄ）を作製し、上記と同様に応答細胞数を計測に供した。
　上記計測の結果を図１１に示す。この結果からわかるように、培養細胞株（Ａ）については、アスパルテーム投与により、非常に強い細胞応答が観察され、また、培養細胞株（Ｂ）、（Ｃ）については、培養細胞株（Ａ）に比べて、弱い細胞応答が観察されたのに対し、培養細胞株（Ｄ）では、細胞応答が観察されなかった。したがって、培養細胞株（Ａ）～（Ｃ）は、ヒト甘味受容体が機能的に発現していることが確認された。
（実施例６）
アスパルテーム刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）に、蛍光カルシウム指示薬Ｆｕｒａ-２　ＡＭを負荷して、細胞に取り込ませた。そして、Ｆｕｒａ-２　ＡＭを負荷した細胞を３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起し、５１０ｎｍにおいて観察される蛍光画像を蛍光顕微鏡ならびにＣＣＤカメラを用いて取得した。画像取得中に細胞に終濃度０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭの各濃度のアスパルテームを投与し、その後、継続して画像の取得を行った。各濃度において最も強い応答が観察された時点の画像を図１２に示した。結果からわかるように、投与する甘味料としてアスパルテームを用いた場合、０．１ｍＭから５ｍＭの範囲において濃度依存的な甘味応答が観察された。
（実施例７）
スクロース刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）に、蛍光カルシウム指示薬Ｆｕｒａ-２　ＡＭを負荷して、細胞に取り込ませた。そして、Ｆｕｒａ-２　ＡＭを負荷した細胞を３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起し、５１０ｎｍにおいて観察される蛍光画像を蛍光顕微鏡ならびにＣＣＤカメラを用いて取得した。画像取得中に細胞に終濃度２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、１Ｍの各濃度のスクロースを投与し、その後、継続して画像の取得を行った。各濃度において最も強い応答が観察された時点の画像を図１３に示した。
　結果からわかるように、投与する甘味料としてスクロースを用いた場合、２０ｍＭから１Ｍの範囲において濃度依存的な甘味応答が観察された。
（実施例８）
スクロース刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）に、蛍光カルシウム指示薬Ｆｕｒａ-２　ＡＭを負荷して、細胞に取り込ませた。そして、Ｆｕｒａ-２　ＡＭを負荷した細胞を３４０ｎｍと３８０ｎｍで励起し、５１０ｎｍにおいて観察される蛍光画像を蛍光顕微鏡ならびにＣＣＤカメラを用いて取得した。画像取得中に細胞に終濃度５００ｍＭのスクロースを投与し、その後、継続して画像の取得を行った。最も強い応答が観察された時点の画像を図１４に示した。
また、終濃度が５００ｍＭのスクロースと１．２５ｍＭのラクチゾールを同時に細胞に投与し、上記と同様にして蛍光画像を取得し、最も強い応答が観察された時点の画像を図１４に示した。
　結果からわかるように、Ｔ１Ｒ３インヒビターとして知られるラクチゾールの添加により、細胞の応答が抑制されたことが確認できた。この結果より、スクロースに対する細胞応答は、Ｔ１Ｒ３サブユニットを介した応答であると推測された。
（実施例９）
スクロース刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
スクロース刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　Ｓｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。　
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲ　Ｃａ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏ-４　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、スクロースの終濃度が表１に記載された濃度となるように、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でスクロース刺激を行った。
そして、スクロースを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、スクロース刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表１及び図１５に示す。図１５の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のスクロース濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、スクロースの甘味を評価できることが確認できた。スクロースは甘味の程度が弱いため、５０ｍＭ程度の濃度で添加しないと甘味受容体細胞の応答は観察されない。しかし、逆に２００ｍＭを超える濃度のスクロース溶液を添加すると、細胞が浸透圧の影響を受けるため、正常な細胞応答を測定することができなくなる。したがって、通常、細胞を用いた甘味アッセイ系でスクロースの甘味度を数値化できるのは約５０から２００ｍＭという狭い範囲に限定されるが、上記細胞系を利用すれば、この限界値の下限を更に低くすることが可能になる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
（実施例１０）
Ｄ-フェニルアラニン刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
Ｄ-フェニルアラニン刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　Ｓｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。　
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲ　Ｃａ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏ-４　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、D-フェニルアラニンの終濃度が表２に記載された濃度となるように、D-フェニルアラニンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でD-フェニルアラニン刺激を行った。
そして、Ｄ-フェニルアラニンを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、Ｄ-フェニルアラニン刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表２及び図１６に示す。図１６の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のＤ-フェニルアラニン濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、Ｄ-フェニルアラニンの甘味を評価できることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
（実施例１１）
アスパルテーム刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
アスパルテーム刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　Ｓｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。　
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲ　Ｃａ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏ-４　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、アスパルテームの終濃度が表３に記載された濃度となるように、アスパルテームを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でアスパルテーム刺激を行った。
そして、アスパルテームを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、アスパルテーム刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表３及び図１７に示す。図１７の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のアスパルテーム濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、アスパルテームの甘味を評価できることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例１２）
サッカリン刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
サッカリン刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　Ｓｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。　
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲ　Ｃａ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏ-４　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、サッカリンの終濃度が表４に記載された濃度となるように、サッカリンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でサッカリン刺激を行った。
そして、サッカリンを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、サッカリン刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表４及び図１８に示す。図１８の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のサッカリン濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、サッカリンの甘味を評価できることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
（実施例１３）
ステビア刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
ステビア刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　Ｓｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。　
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲ　Ｃａ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏ-４　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、ステビアの終濃度が表５に記載された濃度となるように、ステビアを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でステビア刺激を行った。
そして、ステビアを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、ステビア刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表５及び図１９に示す。図１９の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のステビア濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、ステビアの甘味を評価できることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
（実施例１４）
ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（NHDC）刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
ネオヘスペリジンジヒドロカルコン刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　Ｓｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。　
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲ　Ｃａ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏ-４　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの終濃度が表６に記載された濃度となるように、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でネオヘスペリジンジヒドロカルコン刺激を行った。
そして、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表６及び図２０に示す。図２０の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のネオヘスペリジンジヒドロカルコン濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの甘味を評価できることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
（実施例１５）
シクラメート刺激に対する、培養細胞株（Ａ）の生理的応答
シクラメート刺激に対して、培養細胞株（Ａ）の生理的応答を、自動化蛍光イメージングにより解析した。
実施例４で作製した培養細胞株（Ａ）をトリプシナイズし、該ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞密度を計測し、９６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣｅｌｌＢＩＮＤ　Ｓｕｒｆａｃｅ)の各ウェル上に、約８万個ずつ撒いた。　
そして、３７℃で２４時間培養した後、培地を除去し、５０μｌのＨＥＰＥＳバッファーで置換し、蛍光カルシウム指示薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦＬＩＰＲ　Ｃａ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏ-４　ＡＭ)を含むＨＥＰＥＳバッファーをさらに５０μｌ添加した。次いで、２７℃で４５分間インキュベートして、自動化蛍光イメージングに供する細胞を調製した。
次いで、この細胞に、シクラメートの終濃度が表７に記載された濃度となるように、シクラメートを含むＨＥＰＥＳバッファーを添加して、２７℃でシクラメート刺激を行った。
そして、シクラメートを含むＨＥＰＥＳバッファーの添加直後から１００秒後にかけての蛍光反応（４８５ｎｍ励起で５２５ｎｍ蛍光）を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ　３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定し、シクラメート刺激に対する甘味受容体発現細胞の応答を自動化蛍光イメージングにより定量した。結果を表７及び図２１に示す。図２１の縦軸は、刺激直後と刺激後１００秒後の間における蛍光強度の変化量の最大値（ΔＦ）、すなわち、細胞の応答強度であり、横軸は、対数表示のシクラメート濃度（ｍＭ）を示す。
得られた結果から、本発明の培養細胞株（Ａ）を用いて、シクラメートの甘味を評価できることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
本発明により、甘味受容体の安定な発現細胞を取得することができる。この発現細胞は種々の物質の甘味応答の解析に利用することができる。

Claims (15)

  1. 甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を同一のプラスミドに挿入してなる甘味受容体発現コンストラクト。
  2. 甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットをコードする各遺伝子を転写方向が同じ向きになるように、同一のプラスミドに挿入してなる甘味受容体発現コンストラクト。
  3. 甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットのすべて、あるいはそれらのうち２者をコードする各遺伝子を、ＩＲＥＳ配列を介して連結してなる遺伝子断片を含み、かつ、上記各遺伝子を転写方向が同じ向きになるように、同一のプラスミドに挿入してなる甘味受容体発現コンストラクト。　
  4. 　プラスミドが、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である請求項１～３のいずれか１項に記載の甘味受容体発現コンストラクト。
  5. 　Ｇタンパク質αサブユニットが、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４である請求項１～４のいずれか１項に記載の甘味受容体発現コンストラクト。
  6. 甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子の下流に、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子を連結し、その直後にさらに、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の甘味受容体発現コンストラクト。
  7. 甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結し、さらに、その下流に存在する甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の甘味受容体発現コンストラクト。
  8. 甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３をコードする遺伝子の直後に、ＩＲＥＳ配列を介して、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２をコードする遺伝子を連結し、その直後にさらに、ＩＲＥＳ配列を介して、Ｇタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子を連結してなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の甘味受容体発現コンストラクト。
  9. ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクト。
  10. ＥＦ-１αプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡの配列を有し、かつ、この配列の下流にあるＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクト。
  11. ＣＭＶプロモーターの下流に、ｈＴ１Ｒ３をコードするｃＤＮＡとｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結してなり、かつ、該ｈＴ１Ｒ２をコードするｃＤＮＡとｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳ配列を挿んで連結した配列を有する甘味受容体発現コンストラクト。
  12. 　以下の（ａ）～（ｇ）の工程により作製される甘味受容体発現コンストラクト。
    （ａ）　ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイト以外の場所に６塩基の置換を行い、ＥｃｏＲＶの認識配列を新たに作製する工程、
    （ｂ）　工程（ａ）で得られたベクターのマルチクローニングサイトにＴ１Ｒ３をコードする遺伝子を挿入する工程、
    （ｃ）　ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来するＩＲＥＳ配列とｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードする遺伝子を結合する工程、
    （ｄ）　工程（ｂ）で得られたベクターのＴ１Ｒ３をコードする遺伝子の直後に存在する部位をＮｏｔ
    Ｉで切断し、工程（ｃ）で得られたＩＲＥＳ配列とｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードする遺伝子を結合した配列を挿入する工程、
    （ｅ）　ｐＥＡＫ１０（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にＴ１Ｒ２をコードする遺伝子を挿入する工程、
    （ｆ）　工程（ｅ）で得られたベクターのＴ１Ｒ２をコードする遺伝子の直後に存在する部位をＮｏｔ
    Ｉで切断し、工程（ｃ）で得られたＩＲＥＳ配列とｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をコードする遺伝子を結合した配列を挿入する工程、
    （ｇ）　工程（ｄ）で得られたベクターをＥｃｏＲ Ｖで切断し、Ｔ１Ｒ３、ＩＲＥＳ、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をそれぞれコードする各遺伝子が連結した配列の上流に、工程（ｆ）で得られたＴ１Ｒ２、ＩＲＥＳ、ｈＧ１６ｇｕｓｔ４４をそれぞれコードする各遺伝子が連結した配列を挿入する工程。　
  13. ゲノム中にＦＲＴ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｒｇｅｔ）配列を１か所組み込まれた２９３細胞に、請求項１～１２のいずれか１項に記載の甘味受容体発現コンストラクトを遺伝子導入して甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３並びにＧタンパク質αサブユニットを同時に発現させた細胞株。
  14. 甘味物質に対する生理的応答を測定するための請求項１３に記載の細胞株の使用。
  15. 　請求項１３に記載の細胞株を使用した、甘味物質に対する生理的応答の測定により同定された、特定の甘味物質に対する甘味増強物質を、該甘味物質の生理的応答を測定する際に添加することにより、該甘味物質の甘味の閾値以下の濃度で該甘味物質の生理的応答を測定する方法。
     
PCT/JP2010/065366 2009-12-02 2010-09-08 甘味受容体発現コンストラクト、これを発現させた細胞体、及びその利用 WO2011067970A1 (ja)

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