WO2019066567A1 - 다중 양자점 기반 고감도 생체분자 검출법 - Google Patents

다중 양자점 기반 고감도 생체분자 검출법 Download PDF

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silica
quantum
embedding layer
layer
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전봉현
윤성욱
김광석
이윤식
최동옥
헝 팜수안
김태한
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(주)바이오스퀘어
건국대학교 산학협력단
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/588—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with semiconductor nanocrystal label, e.g. quantum dots

Definitions

  • the present disclosure relates to a multi-quantum dot-based highly sensitive biomolecule detection method, and more particularly, to a bio-platform and a highly sensitive biomolecule detection method capable of providing improved light emission efficiency (QY) and brightness at the time of detecting biomolecules .
  • QY light emission efficiency
  • Bioplatforms in which biomolecules generated by application of nanotechnology as a microfabrication technology to nanostructured nanostructures in orderly manner are applied to these biotechnologies have been shown to maintain the activity of biomolecules as compared to disordered molecular assembly, Can be used as a biosensor capable of reducing the amount of sample required and capable of detecting a minute amount and having good selectivity.
  • Quantum dots are examples of nanomaterials applicable to such biosensors.
  • the quantum dot is a nano material that can be applied in various ways such as light emission and electroluminescence, and is a spherical shape having a layer of about 5 to 10 atoms and has a radius of usually 10 nm or less. Therefore, when some oxidation proceeds on the surface of the quantum dots due to the penetration of moisture or oxygen, there arises a problem that the luminescence characteristics inherent in the quantum dots decrease or disappear.
  • the related arts such as the structure of the capped quantum dots or the structure in which the quantum dots are coated with an inorganic film are being developed in various ways.
  • the structure in which the inorganic coating is applied to the quantum dots can secure oxidation stability by moisture and oxygen, but it has a disadvantage that it can not strongly support the ligand.
  • the silica shell is merely provided as a coating film, and a considerable number of quantum dots are detached during post-processing or when applied to a bio-platform.
  • the present invention is to provide a structure-related technology capable of improving optical stability by maintaining stable bonding in quantum dots coated with an inorganic film for overcoming the drawbacks described above and for biological applications.
  • the object of the present invention is to provide a multi-layer multi quantum dot doped nanoparticle having core particles, a quantum dot-laid layer, a silica / quantum dot complex shell structure, and a multi- Method.
  • Polymeric or inorganic core particles A quantum dot embedding layer which is formed by bonding a plurality of quantum dots to a surface of the core particle to entirely surround the surface of the core particle; And a silica / quantum dot complex shell surrounding the quantum dot embedding layer.
  • step (b) injecting and reacting a quantum dot coated with a hydrophobic organic compound in the reactant of step (a) to form a quantum dot embedding layer surrounding the quantum dot along the outer periphery of the core particle;
  • step (c) surface modifying the reactant of step (b) with a material providing a quantum dot binding site;
  • step (d) supplying a base to the reactant in the step (c) and reacting to form a spot where a quantum dot is to be additionally bonded to the surface of the quantum dot outer layer;
  • step (e) injecting a silanol reactant and a base into the reactant in step (d), reacting and purifying the reaction product to form a silica / quantum dot composite shell having a plurality of layer structures sequentially surrounding the core particles with multiple layers of quantum dots Doped nanoparticles of the present invention.
  • the quantum dot-doped nanoparticle comprises a sensing membrane having a surface fixed to the surface, the quantum dot-doped nanoparticle comprising a polymeric or inorganic core particle; A quantum dot embedding layer formed by doping the core particles with quantum dots; And a silica / quantum dot complex shell surrounding the quantum dot embedding layer.
  • the quantum dot doped nanoparticles form a magnetic bead and a sandwich assay structure, wherein the quantum dot doped nanoparticle comprises a polymeric or inorganic core particle; A quantum dot embedding layer in which quantum dots are formed by doping the polymer or inorganic core particles; And a silica / quantum dot complex shell surrounding the quantum dot embedding layer.
  • the quantum dot-doped nanoparticle comprises a polymer or inorganic core particle; A quantum dot embedding layer in which a plurality of quantum dots are bonded to a surface of the core particle and the quantum dots entirely surround the core particle surface; And a silica / quantum dot complex shell surrounding the quantum dot embedding layer, wherein the quantum dots in the quantum dot embedding layer surround the core particle surface, wherein the encapsulating forms are laminated in a plurality of layers.
  • Performing a reaction by injecting a biological sample into a bio-platform in which the quantum dot-doped nanoparticles form a magnetic bead and a sandwich assay structure; And measuring the fluorescence intensity emitted from the reaction, wherein the quantum dot-doped nanoparticle comprises a polymer or inorganic core particle; A quantum dot embedding layer formed by doping the core particles with quantum dots; And a silica / quantum dot complex shell surrounding the quantum dot embedding layer.
  • a multi-layered multi-quantum dot-doped nanoparticle having a polymer or inorganic core particle, a quantum dot-laid layer and a silica / quantum dot complex shell structure is produced while maintaining stable binding with a high occupied area, QY) and brightness, it has an effect of providing a biological application including a better bio platform and a highly sensitive biomolecule detection method.
  • FIG. 1 is a schematic view of a multi-quantum dot-based nanoparticle, wherein A represents a structure of a silica core particle, a quantum dot-laid layer and a silica shell as conventional multiple quantum dots, B represents a silica core particle, , And the structure of the silica / quantum dot complex shell.
  • FIG. 2 is an electron micrograph of the multi-quantum dot-based nanoparticle of FIG. 1, wherein A is a photograph of multiple quantum dots having a structure of a conventional silica core particle, a quantum dot laying layer, and a silica shell, B is a silica core particle, A quantum dot embedding layer, and a silica / quantum dot composite shell.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the quantum dot-containing nanoparticles (denoted as QD-COOH), the conventional multiple quantum dot-containing nanoparticles (denoted as sQD) (QD2, expressed as mQD) of multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticles according to the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the possibility of functioning as a (multi) labeling spot when quantum dots of various sizes are applied as the multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic enlarged view of a relevant area and a diagram schematically showing a case where the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention are applied to a biosensor detection kit.
  • FIG. 6 is a view showing a case where the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention are applied to an actual biosensor detection kit.
  • FIG. 7 is a diagram schematically showing a case where the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention are applied to a sandwich assay.
  • FIG. 8 is a diagram showing the detection of a target material such as a case where the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention is applied to an actual sandwich assay through real-time PCR.
  • the present invention relates to a polymeric or inorganic core particle; A quantum dot embedding layer which is formed by bonding a plurality of quantum dots to a surface of the core particle to entirely surround the surface of the core particle; And a silica / quantum dot complex shell surrounding the quantum dot embedding layer.
  • quantum dot embedding layer &quot refers to a layer which surrounds a plurality of quantum dots along an outer periphery of the core particle, unless otherwise specified, Refers to the interface wrapped in a composite shell.
  • the multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticles according to the present invention is an improvement of conventional multi-quantum-dot-containing nanoparticles containing no quantum dots in the silica shell, so-called single quantum dot-containing nanoparticles.
  • a polymer or inorganic core particle A quantum dot embedding layer which is formed by bonding a plurality of quantum dots to a surface of the core particle to entirely surround the surface of the core particle; And a silica / quantum dot complex shell surrounding the quantum dot embedding layer.
  • the quantum dots constituting the quantum dot embedding layer form a crosslinking bond with the silica material constituting the silica / quantum dot complex shell, and the quantum dots are randomly bonded to the silica material formed through the crosslinking Lt; / RTI >
  • the cross-linking has a functional group at both ends, one end of which includes a functional group binding to the surface of the quantum dot, and the other end of which has a functional group capable of binding to the core particles or the silica particles constituting the silica / And may be formed by a spot-forming substance.
  • the quantum dot binding site provides a structure corresponding to the structure of the conventional quantum dot embedding layer.
  • the present invention also includes the surface of the quantum dot embedding layer and provides crosslinking, the conventional multi quantum dot or single quantum dot Unlike the corresponding silica-only shells, a silica / quantum dot complex shell can be provided.
  • the quantum dot binding site providing material includes, for example, a material having functional groups at both ends, one end of which contains a functional group binding to the surface of the quantum dot constituting the quantum dot embedding layer, and the other end of which contains the silica / And is preferably a substance having a functional group capable of binding to the constituent silica substance.
  • One end of the quantum dot binding site providing material may be, for example, a silane group, a thiol group, a carbon-containing hydrophobic functional group, a carboxyl group, an amine group, or the like.
  • the other terminal of the quantum dot binding site-providing substance may be, for example, a thiol group, an amine group and other amines, an epoxy group, a halogen group, a carbon group, and the like.
  • the coupling agent having both terminals may be selected from 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, mercaptomethyldiethoxysilane, 3-mercaptopropylmethyldimethoxysilane, 3-mercaptopropyltriethoxysilane, 2- Aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltriethoxysilane, diphenylphosphinoethyldimethoxysilane, 3-aminopropylmethyldiethoxysilane, 3-aminopropyldimethylethoxysilane, (Meth) aminophenoxy) propyltrimethoxysilane, and n - (2-aminoethyl) -3-aminopropylmethyldimethoxysilane, and the like have.
  • the quantum dots constituting the silica / quantum dot complex shell may be, for example, quantum dot nanoparticles unbound to the quantum dot laying layer or separated quantum dot nanoparticles bonded to the quantum dot laying layer. If necessary, quantum dots can be added and combined.
  • the thickness of the silica / quantum dot complex shell may be 7 nm to 1,000 nm, or 7 nm to 300 nm. Below the above range, the protective effect of the silica shell is insignificant, and if it exceeds the above range, the particles become heavy and the application may be restricted due to precipitation.
  • the core of the present invention comprises polymer core particles or inorganic core particles.
  • the polymer core particle may be a styrene-based or acrylic-based polymer such as polystyrene or polymethylmethacrylate.
  • the inorganic core particles may be composed of silica, alumina, titanium dioxide or zinc dioxide.
  • the diameter of the core particles is preferably from 10 nm to 100,000 nm, or from 80 nm to 1,000 nm in terms of handling and further post-treatment.
  • the quantum dots When stable particles such as the inorganic core particles are used as the support of the quantum dots, it is easy to control the size of the core particles, so that the quantum dot-containing particles of various sizes can be produced with a stable structure, It has a characteristic that a label can be obtained. In addition, it can prevent the absorption of biomolecules during the bios assay and provide accurate analysis results.
  • the quantum dots constituting the core particle and the quantum dot embedding layer are substances having a functional group at both terminals, one end of which contains an atom binding to the quantum dot nanoparticle, ≪ / RTI > can be coupled using a compound having a functional group that binds to the functional group.
  • one terminal may contain an atom selected from sulfur, nitrogen or phosphorus, and the other terminal may be a silane group, an amino group, a sulfonic group, a carboxyl group or a hydroxy group.
  • the quantum dot may be a single core structure composed of a group II-VI system semiconductor, a group III-V system semiconductor, or a group IV-IV system semiconductor, or a core / Cap structure.
  • the diameter of the quantum dot nanoparticles may be 1 nm to 50 nm, or 1 nm to 20 nm.
  • the quantum dots corresponding to the core of a single core or a core / cap structure may be any of the above types of semiconductors.
  • III-V group semiconductors include GaAs, InAs, InP, and the like.
  • II-VI series semiconductors are preferably used as cores, and their diameters are from 1 nm to 20 nm, or from 2 nm to 10 nm.
  • a cap refers to a semiconductor quantum dot which forms a coating layer on the surface of a core semiconductor by bonding with the core semiconductor quantum dots.
  • the core / cap structure it is possible to obtain nanoparticles having higher luminous efficiency than a single core structure.
  • the cap has a band gap larger than that of the core semiconductor and serves as a passivation layer for protecting the core semiconductor from the outside.
  • a semiconductor of a II-VI family having a high bandgap is used.
  • ZnS, CdS or ZnSe can be preferably used.
  • ZnS can be used as a cap
  • CdSe or ZnSe is used as a cap when the core is CdSe
  • Various combinations can be used without limitation.
  • the quantum dot may be a Type I quantum dot.
  • it may have a structure of a group 12-group 16 shell on a group 12 -16 core including a zinc sulfide (ZnS) shell on a cadmium selenide (CdSe) core.
  • ZnS zinc sulfide
  • CdSe cadmium selenide
  • it is a proven technology that exhibits improved luminescence characteristics by capping a shell having a high band gap in a core particle having a low gap, for example, a ZnS layer is formed on a CdSe quantum dot Capping to adjust the emission wavelength from blue to red by obtaining strong luminescence properties at room temperature (35-50% quantum yields) and adjusting the size of the powder.
  • the ZnS capping protects the surface of the core and can provide excellent stability of the quantum dot.
  • the quantum dot embedding layer may have a layer structure in which an embedded layer formed by multiple doping of quantum dots coated with a hydrophobic organic compound on the outer periphery of the core particle sequentially surrounds the core particles.
  • the quantum dot constituting the quantum dot embedding layer may have 1 to 400,000, 1 to 4,000, or 400 to 500 quantum dots.
  • the silica / quantum dot complex shell may form a plurality of layer structures in which the silica / quantum dot complex layer formed in the outer portion of the quantum dot embedding layer sequentially surrounds the quantum dot embedding layer.
  • the quantum dots included in the silica / quantum dot complex shell may be 10 to 100,000, or 200 to 5,000, for example.
  • the multi-layered multiple quantum dots of the present invention may further comprise a silica-based sheath surrounding the silica / quantum dot complex shell.
  • the silica-based sheath can provide a stable template when using alumina, titanium dioxide, zinc dioxide, or the like in combination. The use of such a stable template facilitates size control and allows for centrifuge and washing.
  • FIG. 1B The resulting multi-quantum dot-based nanoparticles are shown in FIG. 1B.
  • FIG. 1B the structure of silica core particles, a quantum dot-laid layer, and a silica / quantum dot composite shell are shown as multi-layered multiple quantum dots according to the present invention.
  • a method of feeding the quantum dot binding site-providing substance in advance and performing a crosslinking reaction followed by feeding a base such as ammonia water, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide,
  • a base such as ammonia water, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide
  • the functional group at one end constituting the quantum dot binding site providing substance is bonded to the surface of the quantum dot constituting the quantum dot placing layer, and the functional group at the other end is bonded to the silica substance constituting the silica /
  • a silica / quantum dot complex shell unique to the present invention can be formed, and as a result, a multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticle is provided.
  • the multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticles thus prepared can exhibit uniform and high fluorescence signals compared to conventional quantum dot nanoparticles.
  • FIG. 1A shows the structure of a silica core particle, a quantum dot-laid layer, and a silica shell as conventional multi quantum dots.
  • the quantum dot binding site-providing substance is simultaneously supplied with the base, It is impossible to provide the multi-layer multi-quantum-dot-containing nanoparticle structure as in the present invention.
  • FIG. 2 is an electron micrograph of the multi-quantum dot-based nanoparticle of FIG. 1, wherein A is a photograph of multiple quantum dots having a structure of a conventional silica core particle, a quantum dot laying layer, and a silica shell, B is a silica core particle, A quantum dot embedding layer, and a silica / quantum dot composite shell.
  • the density of the layer occupied by the quantum dots on the surfaces of the quantum dot-laid layer may be 5% or more, or 20% or more, of the surface area occupied by the core particles.
  • the density of the layer occupied by the quantum dots on the surface of the silica / quantum dot complex shell may be 10% or more, or 60% or more, of the surface area occupied by the (virtual) surface area of the quantum dot mounting layer.
  • the method for producing the multi-layer multiple quantum dot-containing nanoparticles according to the present invention can be performed as follows, but is not limited thereto.
  • a polymer or inorganic core particle is surface-modified with a material providing a quantum dot binding site.
  • the core particle may be reacted with a material providing a quantum dot binding site to form a core having a QD binding site on its surface.
  • step (b) a quantum dot coated with a hydrophobic organic compound is injected into the reactant of step (a) and reacted to form a quantum dot embedding layer surrounding the quantum dot along the outer periphery of the core particle. Then, a hydrophobic organic solvent is injected into and reacted with the reactant in the step (b), thereby binding unbound quantum dots to the quantum dot binding site of the core surface and stabilizing the reaction.
  • a hydrophobic solvent such as dichloromethane, dichloroethane, a solvent containing benzene (benzene, toluene, collobenzene, ethylbenzene etc.), an alkyl chain (hexane, heptane, cyclohexane, etc.)
  • benzene toluene, collobenzene, ethylbenzene etc.
  • an alkyl chain hexane, heptane, cyclohexane, etc.
  • step (c) the reactant of step (b) is surface-modified with a material providing a quantum dot binding site.
  • the step (c) may further include injecting a quantum dot binding site-providing substance into the reactant in the step (b) and reacting the resultant to bond the functional group at one end to the surface of the quantum dot constituting the quantum dot- May serve as a site for bonding with the silica material constituting the silica / quantum dot complex shell of step (e) below.
  • step (d) a base is supplied to the reactant of step (c) and reacted to form a site where the quantum dots are to be additionally bonded to the surface of the quantum dot outer layer.
  • step (e) a silanol reaction material and a base are injected into the reactant in step (d), and the reaction and purification are performed to form a silica / alumina layer having a plurality of layer structures sequentially surrounding the core particles, To form a quantum dot complex shell.
  • the steps (c) and (d) may be repeated a predetermined number of times as necessary to form a silica / quantum dot complex shell. For example, when repeating 3 to 4 times, a silica / quantum dot composite shell having a thickness of 20 to 500 nm can be provided.
  • a process of layering multiple layers of quantum dots can be performed, for example, by introducing 3-mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTS) and quantum dots as a material for providing a quantum dot binding site, Accordingly, a quantum dot unbound to the quantum dot mounting layer or a quantum dot bonded to the quantum dot mounting layer is bonded to the quantum dot bonding site and is then included in the silica shell, thereby providing a silica / quantum dot composite shell.
  • MPTS 3-mercaptopropyltrimethoxysilane
  • the volume ratio of the quantum dots, the core particles and the binding site providing material may be in the range of 1: 0.000001 to 60: 0.000001 to 890, preferably in the range of 1: 0.01 to 20: 0.01 to 300 And more preferably in the range of 1: 1 to 2: 2 to 3.
  • the thickness ratio of the core particles, the quantum dot-laid layer and the silica / quantum dot composite shell may be in the range of 1: 0.1 to 9: 1 to 10, preferably 1: 0.4 to 4: 4, and more preferably within the range of 1: 1 to 2: 1 to 2.
  • the multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention are stable in that a plurality of quantum dots are stably bonded to the surface of the core particle. Furthermore, since quantum dots are included in the shell, the number of quantum dots can be maximized, It can serve as a (multi) labeling spot for biological applications because it has the advantage of providing luminescence efficiency and brightness enough to observe each luminescent color according to its size.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the quantum dot-containing nanoparticles (denoted as QD-COOH), the conventional multiple quantum dot-containing nanoparticles (denoted as sQD) Luminescence efficiency and brightness between multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles (denoted QD2, mQD) according to the invention were compared.
  • FIG. 3A the QY results of QD-COOH (control), silica coated QD and multi-layered quantum dot-containing nanoparticles (QD 2 ) were confirmed.
  • FIG. 3B As shown in FIG. 3C, which was measured under UV lamp equipment at 365 nm, single QD and multi-layered quantum dot-containing nanoparticles were observed on a UV lamp which can be confirmed by real eyes, I could confirm.
  • FIG. 4 is a diagram showing the possibility of functioning as a (multi) labeling spot when quantum dots of various sizes are applied as the multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention.
  • the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention having improved luminous efficiency and brightness and exhibiting different luminescent colors or fluorescent colors depending on sizes by applying quantum dots of various sizes can be effectively used for biological applications including a bio- have.
  • by possessing sensitivity at real-time PCR level it is possible to carry out precise rapid diagnosis of new infectious pathogens requiring ultra-high sensitivity and have wide dynamic range of log 10 or more, so that biomarkers of various concentrations can be analyzed at the same time.
  • the biological detection kit according to the present invention is a biological detection kit comprising a sensing membrane having a surface-immobilized quantum dot-doped nanoparticle, wherein the quantum dot-doped nanoparticle is a polymer or inorganic core particle ; A quantum dot embedding layer formed by doping the core particles with quantum dots; And a silica / quantum dot complex shell surrounding the quantum dot embedding layer.
  • the sensing film may be fixed by a dehydration-condensation method, for example.
  • the sensing film may be formed on a glass plate, a polystyrene plate, or a microtiter plate, for example.
  • the biological detection kit may be, for example, a kit for detecting a substance selected from the group consisting of monosaccharide, polysaccharide, organic acid, alcohol, cholesterol, choline, xanthine and mixtures thereof .
  • FIG. 5 is a schematic enlarged view of a relevant area and a diagram schematically showing a case where the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention are applied to a biosensor detection kit.
  • FIG. 5 is a diagram showing an actual application using multiple quantum dot-containing nanoparticles on a kit, wherein a partial enlargement diagram is a view showing a multi-quantum dot-containing nanoparticle to which antibodies are bonded in a red line portion on a nitrocellulose membrane (NC membrane) And capture antibody reactions.
  • NC membrane nitrocellulose membrane
  • bio platform when a magnetic bead is prepared and applied to a sandwich assay, a bio platform can be collected by a simple process using a magnet.
  • bio platform used in the present invention refers to a platform used for molecular diagnostics such as immunodiagnosis unless otherwise specified.
  • the bio-platform can provide the shell surface of the multi-layered multi-quantum dot containing nanoparticles to (multi) labeling sites.
  • the multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticles included in the bio-platform are used in combination with various quantum dot sizes, various light emitting materials can be provided with various efficiencies and brightness with a very small amount only for various target materials, Lt; / RTI >
  • an antibody binding to the target substance is bound to the multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticle so that the antibody bound to the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticle captures the biological sample (target substance) Can be provided.
  • the multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticle is modified with a ligand for binding an antibody that binds complementarily to a biological sample (target material), and then the antibody is bound.
  • a structure for capturing the biological sample (target material) can be provided.
  • the ligand may be a receptor-ligand pair which is capable of causing a receptor-ligand reaction, including streptavidin-biotin, avidin-biotin, or asialoglycoprotein-galactose, as known in the art.
  • the biological sample may be, for example, an antigen, a receptor, a virus, an enzyme, an infectious immunoglobulin, a cytokine or other infectious agent.
  • the biological sample (target material) can provide a sandwich assay structure captured with magnetic beads so that stable light emission measurement can be performed later.
  • the magnetic beads also include an antibody that binds complementarily to a biological sample (target material), and the antibody bound to the magnetic beads is separated from the antibody bound to the multi-layered multiple quantum dot- Material) can be provided.
  • the magnetic beads are modified with a ligand for binding an antibody that binds complementarily to a biological sample (target material), and then the antibody is bound, and the antibody bound to the magnetic bead captures the biological sample Lt; / RTI >
  • the ligand may be a receptor-ligand pair capable of causing a receptor-ligand reaction, including streptavidin-biotin, avidin-biotin, or asialoglycoprotein-galactose.
  • a bioplatform according to the present invention is a bio platform in which quantum dot-doped nanoparticles form a magnetic bead and a sandwich assay structure, and the quantum dot-doped nanoparticles include a polymer or inorganic core particle; A quantum dot embedding layer formed by doping the core particles with quantum dots; And a silica / quantum dot complex shell surrounding the quantum dot embedding layer.
  • the magnetic beads may have a diameter in the range of 1 to 5 um so as to be suitable for separation and purification of the sample.
  • the magnetic beads may have the form of a polymer bead-like polymer containing a magnetic substance.
  • the outer periphery of the magnetic beads may be surrounded by a silica shell. The silica shell protects the magnetic beads, and the surface can be modified with various ligands for assays.
  • the magnetic beads is, for example, a bead-like copolymer obtained by copolymerizing a mixture of a polystyrene seed and a styrene monomer with a styrene derivative, an emulsifier, or a liposoluble-based polymerization initiator, wherein a styrene ring constituting the skeleton of the copolymer has a sulfonic acid functional group
  • a poly (styrene-co-styrene derivative) copolymer in the form of a bead containing a silica shell and surrounded by an iron ion bonded to the sulfonic acid functional group while surrounding the outer surface of the membrane makes it possible to prevent non- .
  • the steps of preparing the magnetic beads may be prepared in the following order:
  • a polystyrene seed is prepared by emulsion polymerization of a styrene monomer together with a dispersion stabilizer and a radical initiator by emulsion polymerization.
  • the polystyrene seed is pre-swollen to a polystyrene seed under a plasticizer including dibutyl phthalate.
  • a mixture of the pre-swollen polystyrene seed and styrene monomer is subjected to water-dispersion copolymerization with a styrene derivative, an emulsifier and a liposoluble peroxide polymerization initiator to prepare a poly (styrene-co-divinylbenzene) do.
  • a poly (styrene-co-divinylbenzene) copolymer on the bead is reacted with a sulfonating agent to prepare a bead-shaped poly (styrene-co-divinylbenzene) copolymer containing a sulfonic acid functional group.
  • a sulfonating agent for example, at least one selected from chlorosulfonic acid, acetyl sulfate and concentrated sulfuric acid may be used as the sulfonating agent at a temperature range of 60 to 95 ° C.
  • the poly (styrene-co-divinylbenzene) copolymer on the bead containing the sulfonic acid functional group is magnetized using a superporous ion precursor.
  • a superporous ion precursor As a specific example, a mixture of ferrous chloride (FeCl 2 ) and ferric chloride (FeCl 3 ) is used, and the molar ratio of the mixture is FeCl 2 .4H 2 O: FeCl 3 .6H 2 O 1: 500 To 10,000, or from 1: 1 to 2.
  • a silica shell is formed so as to surround the outer periphery of the magnetic bead-like poly (styrene-co-divinylbenzene) copolymer.
  • the biological detection method using the bio platform can be proceeded as follows.
  • a biological sample (target material) is injected into a bio-platform in which the quantum dot-doped nanoparticles form a magnetic bead and a sandwich assay structure, and the fluorescence intensity emitted from the reaction is measured.
  • the quantum dot doped nanoparticles may include polymer or inorganic core particles; A quantum dot embedding layer formed by doping the core particles with quantum dots; And a silica / quantum dot complex shell surrounding the quantum dot embedding layer.
  • the quantum dot doped nanoparticles constituting the bio platform may be used in combination with nanoparticles having various quantum dots to serve as (multi) labeling sites for the biological sample (s) on the shell surface of each nanoparticle.
  • the fluorescence intensity is not limited to this, but it can be measured by an optical method or an electrical signal.
  • the bio-platform can be used as follows. 7 is a diagram schematically showing a case where the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention are applied to a sandwich assay.
  • the multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticles or one of the magnetic beads is introduced into the biological sample (target material) -containing aqueous solution or organic solvent, and the biological sample (target material)
  • a solution having a structure in which the antibody of the magnetic beads is coupled is prepared, and the multi-layered multi-quantum dot-containing nanoparticles or the substance not added in the magnetic beads are introduced into the solution.
  • a biological sample (target substance) is bound to an antibody in which the antibody of the magnetic beads binds to the biological sample (target substance) bound to the antibody bound to the multi-layered multiple quantum dots or to the antibody bonded to the magnetic bead,
  • a solution having a platform structure in which an antibody bound to a multi-layered multiple quantum dot is subsequently bound is prepared.
  • the magnetic beads are collected by contacting the magnetic beads to the solution, and the absorbance or fluorescence intensity of the quantum dots contained in the quantum dot containing particles can be measured at the site where the magnetic beads are collected.
  • the target substance-containing solution may be, for example, a myocardial scanning multiple test solution, an infectious immunoglobulin simultaneous diagnosis, a cytokine simultaneous diagnosis or a blood screening solution.
  • Silica particles having a diameter of 120 nm (10 mg / ml) were prepared by a storage method.
  • quantum dot nanoparticles were used to couple quantum dots that generate fluorescence to the outside of the core particle into which the thiol group was introduced.
  • the nanoparticles that formed the sites for further binding of the quantum dots on the surface of the quantum dot laying layer were washed with ethanol three times and then 50 ⁇ l of tetraethyl orthosilicate and 25% ammonia water as a base were reacted at 68 rpm for 20 hours And then washed three times with ethanol. After the introduction of the quantum dots, the mixture was stirred for 5 minutes, a chloroform solution was added, and further stirred for 10 minutes to form a silica / quantum dot complex shell containing multilayer quantum dots in the silica shell.
  • FIG. 1B is a structural schematic diagram of the obtained silica core, the quantum dot-laid layer, and the silica / quantum dot composite shell. From Fig. 1B, it can be seen that the multi-layer multiple quantum dots are randomly contained in each shell of each layer. An electron micrograph of the multi-layered multiple quantum dot-containing nanoparticles having the structure of the obtained silica core, the quantum dot-laid layer, and the silica / quantum dot composite shell is shown in FIG. 2B. As shown in FIG. 2B, the multilayered structure can be confirmed.
  • FIG. 1A The structural schematic diagram of the obtained silica core, the quantum dot-laid layer and the silica shell is shown in Fig. 1A. From Fig. 1A, it can be seen that a multi-quantum dot is randomly contained in a shell of one layer. An electron micrograph of the obtained multi-quantum dot-containing nanoparticles having a structure of a silica core, a quantum dot-laid layer, and a silica shell is shown in FIG. 2A. As shown in FIG. 2A, a single layered structure can be confirmed.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of a conventional water-soluble ligand, quantum dot-containing nanoparticles modified with COOH functional groups (denoted QD-COOH), multiple quantum dot-containing nanoparticles according to Comparative Example 1 (denoted as single silica QD, sQD) These figures are for the comparison of luminous efficiency and brightness between multiple quantum dot containing nanoparticles (denoted QD2, mQD). As shown in FIG.
  • the multilayered quantum dot-containing nanoparticles prepared in Example 1 were Red color QD2, and the same steps as those of Example 1 were carried out except that the sizes of the quantum dots were adjusted to 2 nm, 2.5 nm and 3 nm, respectively Blue color QD2, green color QD2, and yellow color QD2, respectively.
  • FIG. 4 is a graph showing the luminous efficiency and brightness of each color.
  • FIG. 4A the results of the QY of the multilayered quantum dot-containing nanoparticles into which the respective quantum dots are introduced can be confirmed.
  • FIG. 4B As shown in FIG. 4C, which shows the fluorescence intensity (Nomalize) of the multi-layered quantum dot-containing nanoparticles having a size of 365 nm, the multi-layered quantum dot- The results were confirmed by observing the particles on a UV lmap which can be confirmed with real eyes.
  • FIG. 5 is a schematic enlarged view of a relevant area and a diagram schematically showing a case where the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention are applied to a biosensor detection kit.
  • Example 1 1 mg of the multi-layer multiple quantum dot-containing nanoparticles of Example 1 was added to (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTS solution, 5% v / v, 1 mL) and stirred for 1 hour at room temperature. Thereafter, the resultant was washed three times with ethanol, and 500 mg of 2-methyl-2-pyrrolidone (NMP) solution and 75.0 mg of N, N-diisopropylethylamine (DIEA) were added to 75 mg of succinic anhydride and stirred for 2 hours.
  • NMP 2-methyl-2-pyrrolidone
  • DIEA N, N-diisopropylethylamine
  • FIG. 6 is a view showing a case where the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention are applied to an actual biosensor detection kit.
  • the capture antibody was labeled with a capture abtibody and a target substance on a line having a capture antibody on the absorptive pad side.
  • the fluorescence intensity of the line indicated by the line in the kit was confirmed through the kit analyzer.
  • Antigen-bound quantum multi-layer nanoparticles were subjected to sandwich assay using antibody-bound magnetic beads in the same manner as shown in FIG. 7 in the same manner as in Example 1 above.
  • the magnetic beads were prepared as follows:
  • Monodisperse macroporous-polystyrene-divinylbenzene beads were prepared by seed polymerization, and specifically monodisperse polystyrene seeds (4 um) were prepared by a dispersion polymerization method.
  • As the dispersion medium ethanol / 2-methoxyethanol (3: 2 by volume) containing 1 g of polyvinylpyrrolidone-40 (PVP-40) was used as a steric stabilizer (90 mL).
  • Azobisisobutyronitrile (AIBN, 150 mg) was dissolved in styrene (15 mL) from which the inhibitor had been removed and added to the prepared dispersion medium. After the surface treatment for 10 minutes, dispersion polymerization was carried out in a cylindrical reaction chamber while stirring at 120 ° C for 20 hours at 70 ° C. The suspension was centrifuged and the precipitate was centrifuged and washed with distilled water, and the polystyrene seed was washed with ethanol and vacuum dried overnight to give polystyrene seed (4 um, 8.3 g).
  • the resultant polystyrene seed (4 um, 700 mg) was dissolved in dibutyl phthalate (DBP, 0.7 mL) containing 0.25% (w / w) sodium dodecyl sulfate (SDS) in a glass reactor equipped with an overhead stirrer and a reflux condenser. And dispersed in a medium (100 mL).
  • DBP dibutyl phthalate
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the obtained dispersion medium was stirred at 400 rpm for 20 hours at room temperature, and the polystyrene seed was swollen in a DBP mixture of styrene (4.6 mL) and divinylbenzene (DVB, 2.3 mL) in which BP (240 mg) was dissolved and then the aqueous medium homogenizer And immersed in a 100 mL solution containing 0.25% (w / w) sodium dodecyl sulfate (SDS) for 1 minute.
  • the emulsion monomer solution was added to the polystyrene seed dispersion medium diluted with dibutyl phthalate (DBP) while stirring.
  • DBP dibutyl phthalate
  • Monomers were run at room temperature for 20 hours with continuous stirring at 400 rpm. After the expansion process, a dispersion medium was added to a 10% (w / v) polyvinyl alcohol (PVA) aqueous solution in deionized water (10 mL) and purged for 30 minutes under a nitrogen atmosphere. The seed polymerization was stirred at 200 rpm continuously at 70 ⁇ for 20 hours to obtain a monodispersed PS-DVB bead.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • the resulting beads were washed and centrifuged and washed with deionized water (50 < 0 > C). The recovered beads were then washed with ethanol and tetrahydrofuran (THF) to remove dibutyl phthalate (DBP) and linear polymer. The beads were then vacuum dried at 30 [deg.] C for 24 hours to give macroporous PS-DVB beads (7.5 [mu] m, 2.5 g).
  • the resulting monodispersed PS-DVB (1 g) was added to 5 mL acetic acid in an ice bath. Sulfuric acid (50 mL) was then slowly added to the beads at room temperature, and the temperature was raised to 90 DEG C, and the resin mixture was stirred for 30 minutes to 2 hours. The dispersion by stirring was poured into ice water (400 mL) to stop the reaction and the sulfonated PS-DVB beads were collected by centrifugation. Centrifugation was repeated and the beads were washed thoroughly with deionized water. The sulfonated beads were then washed three times with ethanol and dried under vacuum to give 1.1 g.
  • Sulfonated macroporous PS-DVB beads 500 mg were dispersed in deionized water (10 mL) at room temperature while nitrogen was purged with mechanical stirring (200 rpm).
  • Deionized water (10mL) was added to of FeCl 3 .6H 2 O (618mg, 2.26mmol) and FeCl 2 .4H 2 O dispersion for adsorbing the mixture of a freshly prepared (257mg, 1.28mmol).
  • the antigen dispersed in PBS (pH 7.2) was added to 100 ⁇ g of the antibody-bound magnetic beads and stirred at room temperature for 1 hour. Then, using a magnet as shown in the right drawing of FIG. 7, And washed. 100 ⁇ g of quantum dot multi-layer nanoparticles bound with antibody were added thereto, stirred at room temperature for 1 hour, and then washed with a magnet four times with PBS (pH 7.2). Finally, 300 ⁇ l of PBS (pH 7.2) was dispersed to prepare a bio-platform.
  • the quantitative fluorescence signal was observed using a UV-vis spectrometer, as shown in the right-hand view of FIG. 7, of the platform obtained in Application Example 2.
  • a UV-vis spectrometer as shown in the right-hand view of FIG. 7, of the platform obtained in Application Example 2.
  • 300 [mu] l of platform was filled with a black 96-well plate.
  • the UV excitation wavelength was 385 nm and the emission wavelength was 625 nm.
  • FIG. 8 is a view showing a case where the multi-layer multi-quantum dot-containing nanoparticles of the present invention are applied to an actual sandwich assay.
  • fluorescence detection results in the range of 3.2 to 3.2 ⁇ 10 -4 HAU were confirmed.

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Abstract

본 발명은 무기물 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카/양자점 복합쉘 구조를 갖는 다중 양자점 도핑 나노입자를 높은 점유면적과 안정한 결합을 유지하면서 제조하여 생체분자 검출시 개선된 발광효율(QY)과 밝기(brightness)를 제공함에 따라 바이오플랫폼 및 고감도 생체분자 검출법을 비롯한 생물학적 용도를 제공하는 효과가 있다.

Description

다중 양자점 기반 고감도 생체분자 검출법
본 명세서에 개시된 기술은 다중 양자점 기반 고감도 생체분자 검출법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체분자 검출시 개선된 발광효율(QY)과 밝기(brightness)를 제공할 수 있는 바이오플랫폼 및 고감도 생체분자 검출법에 관한 것이다.
나노과학과 나노기술이 발전하면서 생명공학, 신약개발 및 의료를 비롯한 바이오분야에서 나노기술과 융합된 바이오소자에 대한 연구가 진행되고 있다.
이러한 바이오 기술에 극미세 가공기술로서 나노기술이 응용되어 생성된 생물분자를 나노수준에서 질서정연하게 고정화한 바이오플랫폼(bioplatform)은, 무질서한 분자조립에 비해 생물분자의 활성이 보존되고 개별 분자별로 일정한 기능을 수행할 수 있어 소요되는 시료의 양을 줄일 수 있고, 미세한 양을 검출할 수 있는 감도(sensitivity)가 좋고 선택성(selectivity)이 좋은 바이오센서로 활용될 수 있다.
이러한 바이오센서로 응용 가능한 나노소재로서 양자점을 들 수 있다. 양자점은 빛 발광, 전기발광 등 다양한 방식으로 응용 가능한 나노소재로서, 원자가 5 내지 10층 정도의 층을 이룬 구형이면서 반지름이 통상 10nm 이하이다. 따라서 수분 또는 산소의 침투로 양자점 표면에 일부 산화가 진행되면 양자점 고유의 발광특성이 저하되거나 사라지는 문제점이 발생한다. 이에 캡핑된 양자점의 구조, 혹은 양자점에 무기물 피막을 입힌 구조 등 관련된 기술들이 다양하게 개발 중에 있다.
이 중에서 양자점에 무기물 피막을 입힌 구조는 수분 및 산소에 의한 산화 안정성을 확보할 수 있지만 리간드를 강하게 지지하지 못하는 단점이 있다. 예를 들어, 종래 싱글(single) 양자점 함유 나노입자 관련 기술에서는 실리카 쉘이 단지 피막 역할로 제공될 뿐으로, 후 공정 도중, 혹은 바이오플랫폼으로 적용시 상당수 양자점이 탈착되는 단점이 있다.
이에 안정한 결합을 유지하면서 양자점의 점유면적은 높여 발광효율(QY)과 밝기(brightness)를 개선시킬 수 있는 기술이 필요한 실정이다.
선행문헌 정보: 한국등록 제821192호
본 발명은 상술한 단점을 극복하고 생물학적으로 응용하기 위해 무기물 피막을 입힌 양자점에 있어 안정한 결합을 유지함에 따라 광학적 안정성을 향상시킬 수 있는 구조 관련 기술을 제공하려는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 목적은 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카/양자점 복합쉘 구조를 갖는 다층 다중 양자점 도핑 나노입자, 및 상기 다층 다중 양자점 도핑 나노입자를 높은 점유면적과 안정한 결합을 유지하면서 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 다층 다중 양자점 도핑 나노입자가 생체분자 검출시 개선된 발광효율(QY)과 밝기(brightness)를 제공함에 따라 탁월한 감도를 보이는 바이오플랫폼 및 고감도 생체분자 검출법을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면,
고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자의 표면에 복수의 양자점이 결합되어 상기 코어 입자 표면을 전체적으로 둘러싸는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 양자점 도핑 나노입자를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면,
(a) 고분자 또는 무기물 코어 입자를 양자점 결합자리 제공물질로 표면 개질하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 반응물에 소수성 유기화합물로 코팅된 양자점을 주입하고 반응시켜 상기 코어 입자의 외곽을 따라 양자점이 감싸는 양자점 포설층을 형성하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 반응물을 양자점 결합자리 제공물질로 표면 개질하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 반응물에 염기를 공급하고 반응시켜 상기 양자점 외포층의 표면에 양자점이 추가 결합할 자리를 형성하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 반응물에 실란올 반응물질과 염기를 주입하고 반응 및 정제하여 여러 겹의 양자점이 상기 코어 입자를 순차적으로 둘러싸는 복수의 층 구조를 갖는 실리카/양자점 복합쉘을 형성하는 단계를 포함하는 양자점 도핑 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
양자점 도핑 나노입자가 표면에 고정되어 있는 센싱막(sensing membrane)을 포함하는 생물학적 검출키트로서, 상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자에 양자점이 도핑되어 형성되는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 것인 생물학적 검출키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
양자점 도핑 나노입자가 자성비드와 샌드위치 어세이 구조를 형성하는 바이오플랫폼으로서, 상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 고분자 또는 무기물 코어 입자에 양자점이 도핑되어 형성되는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 것인 바이오플랫폼(bioplatform)을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
상술한 바이오플랫폼에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하는 단계; 및 상기 반응으로부터 방출되는 형광강도를 측정하는 단계를 포함하되, 상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자의 표면에 복수의 양자점이 결합되어 상기 코어 입자 표면을 양자점이 전체적으로 둘러싸는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하되, 상기 양자점 포설층 내 양자점들은 상기 코어 입자 표면을 둘러싸며, 이때 둘러싸는 형태가 복수층으로 적층되는 것인 생물학적 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
양자점 도핑 나노입자가 표면에 고정되어 있는 센싱막(sensing membrane)을 포함하는 생물학적 검출키트에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하는 단계; 및 상기 반응으로부터 방출되는 형광강도를 측정하는 단계를 포함하되, 상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자에 양자점이 도핑되어 형성되는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 것인 생물학적 검출방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
양자점 도핑 나노입자가 자성비드와 샌드위치 어세이 구조를 형성하는 바이오플랫폼에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하는 단계; 및 상기 반응으로부터 방출되는 형광강도를 측정하는 단계를 포함하되, 상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자에 양자점이 도핑되어 형성되는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 것인 생물학적 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 고분자 또는 무기물 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카/양자점 복합쉘 구조를 갖는 다층 다중 양자점 도핑 나노입자를 높은 점유면적과 안정한 결합을 유지하면서 제조하여 생체분자 검출시 개선된 발광효율(QY)과 밝기(brightness)를 제공함에 따라 보다 우수한 바이오플랫폼 및 고감도 생체분자 검출법을 비롯한 생물학적 용도를 제공하는 효과가 있다.
도 1은 다중 양자점 기반 나노입자의 모식도로서, A는 종래 다중 양자점으로서 실리카 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카 쉘의 구조를 나타내고, B는 본 발명에 따른 다층 다중 양자점으로서 실리카 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카/양자점 복합쉘의 구조를 나타낸다.
도 2는 도 1의 다중 양자점 기반 나노입자의 전자 현미경 사진으로서, A는 종래 실리카 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카 쉘의 구조를 갖는 다중 양자점의 사진이고, B는 본 발명에 따른 실리카 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카/양자점 복합쉘의 구조를 갖는 다층 다중 양자점의 전자 현미경 사진이다.
도 3은 도 1의 다중 양자점 기반 나노입자들, 수용성 리간드인 COOH 작용기로 개질된 양자점 함유 나노입자(QD-COOH로 표기), 종래 다중 양자점 함유 나노입자(single silica QD, sQD로 표기)과 본 발명에 따른 다층 다중 양자점 함유 나노입자(QD2, mQD로 표기)간 발광 효율과 밝기(brightness)를 대비한 도면들이다.
도 4는 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자로서 다양한 사이즈의 양자점을 적용한 경우 (멀티)라벨링 자리로서 작용 가능성을 살펴본 도면으로서, 발광 효율과 밝기를 도시한 도면들이다.
도 5는 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자를 생체물질 검출키트에 적용하는 경우를 모식적으로 나타낸 도면과 관련 영역의 부분 확대도이다.
도 6은 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자를 실제 생체물질 검출키트에 적용한 경우를 나타낸 도면들이다.
도 7은 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자를 샌드위치 어세이에 적용하는 경우를 모식적으로 나타낸 도면들이다.
도 8은 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자를 실제 샌드위치 어세이에 적용한 경우와 같은 타겟물질을 실시간 PCR을 통해 검출한 것을 나타낸 도면들이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자의 표면에 복수의 양자점이 결합되어 상기 코어 입자 표면을 전체적으로 둘러싸는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 양자점 도핑 나노입자를 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 양자점 포설층은 달리 특정하지 않는 한, 상기 코어 입자의 외곽을 따라 복수의 양자점이 감싸는 층을 지칭하는 것으로, 상기 양자점의 최외곽을 따라 연결한 가상의 층으로서 실리카/양자점 복합쉘로 감싸지는 경계면을 지칭한다.
본 발명에 따른 다층 다중 양자점 함유 나노입자는, 실리카 쉘에 양자점이 포함되지 않던 종래 다중 양자점 함유 나노입자, 이른바 싱글(single) 양자점 함유 나노입자를 개량한 기술로서, 실리카 쉘에 양자점이 포함된 실리카/양자점 복합쉘의 구조를 통하여 다층 다중 양자점을 제공함에 따라 발광 효율과 밝기(brightness)를 현저하게 개선시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자의 표면에 복수의 양자점이 결합되어 상기 코어 입자 표면을 전체적으로 둘러싸는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 양자점 도핑 나노입자를 제공한다.
본 발명에서, 상기 양자점 포설층을 구성하는 양자점은 상기 실리카/양자점 복합쉘을 구성하는 실리카 물질과 가교 결합을 형성하며, 상기 가교 결합을 통해 형성된 실리카 물질에 상기 양자점이 랜덤 결합된 구조를 제공하는 것일 수 있다.
상기 가교 결합은 양 말단에 작용기를 구비하되, 일 말단은 상기 양자점 표면에 결합하는 작용기를 포함하고 다른 말단은 상기 코어 입자 혹은 실리카/양자점 복합쉘을 구성하는 실리카 입자와 결합가능한 작용기를 갖는 양자점 결합자리 제공물질에 의해 형성되는 것일 수 있다.
상기 양자점 결합자리 제공물질은 종래 상기 양자점 포설층에 해당하는 구조를 형성하도록 제공하는 물질이었으나, 본 발명에서는 상기 양자점 포설층의 표면에도 또한 포함하고 가교 결합을 제공함에 따라 종래 다중 양자점 혹은 싱글 양자점에 해당하는 실리카 단독 쉘과 달리 실리카/양자점 복합쉘을 제공할 수 있다.
상기 양자점 결합자리 제공물질은, 일례로 양 말단에 관능기를 구비한 물질로서, 일 말단은 상기 양자점 포설층을 구성하는 양자점 표면에 결합하는 작용기를 포함하고, 다른 말단은 상기 실리카/양자점 복합쉘을 구성하는 실리카 물질과 결합가능한 작용기를 갖는 물질인 것이 바람직하다.
상기 양자점 결합자리 제공물질의 일 말단은 일례로 실란기, 싸이올기, 탄소 포함 소수성 작용기, 카르복실기, 아민기 등일 수 있다. 또한, 상기 양자점 결합자리 제공물질의 다른 말단은 일례로 싸이올기, 아민기 및 기타 아민류, 에폭시기, 할로겐류, 카본류 등일 수 있다.
구체적인 예로, 이러한 양 말단을 갖는 커플링제는 3-머캅토프로필트리메톡시실란, 머캅토메틸디에톡시실란, 3-머캅토프로필메틸디메톡시실란, 3-머캅토프로필트리에톡시실란, 2-디페닐포스피노에틸트리에톡시실란, 디페닐포스피노에틸디메틸에톡시실란, 3-아미노프로필메틸디에톡시실란, 3-아미노프로필디메틸에톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란, 4-아미노부틸트리메톡시실란, 3-(메타-아미노페녹시)프로필트리메톡시실란, 및 노르말-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란 등일 수 있다.
상기 실리카/양자점 복합쉘을 구성하는 양자점은 일례로 양자점 포설층에 미결합된 양자점 나노입자이거나, 양자점 포설층에 결합된 다음 분리되어진 양자점 나노입자일 수 있다. 필요에 따라, 양자점을 추가 투입하고 결합시킬 수도 있다.
상기 실리카/양자점 복합 쉘의 두께는 7 nm 내지 1,000 nm, 혹은 7 nm 내지 300 nm일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 실리카 쉘의 보호효과가 미미하고, 상기 범위 초과에서는 입자가 무거워져서 침전으로 인해 응용에 제약이 있을 수 있다.
본 발명의 코어는 고분자 코어 입자 또는 무기물 코어 입자를 포함한다. 여기서 고분자 코어 입자는 폴리스티렌이나 폴리메틸메타크릴레이트와 같은 스티렌계 또는 아크릴계 고분자일 수 있다. 한편 상기 무기물 코어 입자는 실리카, 알루미나, 이산화티타늄 또는 이산화아연으로 이루어질 수 있다. 상기 코어 입자의 직경은 10 nm 내지 100,000 nm, 혹은 80 nm 내지 1,000 nm인 것이 핸들링 및 추가 후처리 측면에서 바람직하다. 상기 무기물 코어 입자와 같이 안정적인 입자를 양자점의 지지체로서 사용할 경우, 상기 코어 입자의 크기를 조절하는 것이 용이하기 때문에, 다양한 크기의 양자점 함유 입자를 안정적인 구조로 제조할 수 있으며, 이로 인해 다양한 특성의 형광 표지를 얻을 수 있는 특징을 갖는다. 또한 바이오어세이 과정에서 생체분자의 흡수를 막아 정확한 분석 결과를 제공할 수 있다.
특히, 상기 코어 입자에 양자점을 공유결합(covalent bonding)에 의하여 결합할 경우 양자간 강한 결합에 의하여 포토블리칭(photobleaching)에 의한 안정성 저하를 방지하는 역할을 하고, 오랜 기간 지속적인 사용에도 양자점이 가지는 발광특성을 유지할 수 있도록 한다. 상기 공유결합에 의하여 결합하는 경우, 상기 코어 입자와 상기 양자점 포설층을 구성하는 양자점은 양 말단에 작용기를 갖는 물질로서, 일 말단은 양자점 나노입자와 결합하는 원자를 포함하고, 다른 말단은 코어 입자와 결합하는 작용기를 갖는 화합물을 사용하여 결합될 수 있다. 여기서 일 말단에는 황, 질소 또는 인 중에서 선택된 원자를 포함하는 것일 수 있고, 다른 말단에는 실란기, 아미노기, 설폰기, 카르복시기 또는 하이드록시기일 수 있다.
상기 양자점은 II-VI족 계열의 반도체, III-V족 계열의 반도체 또는 IV-IV족 계열의 반도체로 이루어진 단일 코어 구조이거나, 상기 단일 코어 구조에 II-IV족 계열의 반도체가 캡핑된 코어/캡 구조일 수 있다. 상기 양자점 나노입자의 직경은 1 nm 내지 50 nm, 혹은 1 nm 내지 20 nm일 수 있다. 여기서, 단일 코어(core) 또는 중심/캡(core/cap) 구조 중 코어(core)에 해당하는 양자점은, 상기 모든 종류의 반도체를 사용할 수 있으며, 예를 들어 II-VI족 계열의 반도체는 주기율표상의 IIB족 원소 중 적어도 하나와, VIB족 원소 중 적어도 하나가 결합된 것으로서, 이러한 II-VI족 계열의 반도체의 예로서는 CdS, CdSe, CdTe, ZnSe, ZnS, PbS, PbSe, HgS, HgSe, HgTe, CdHgTe 및 CdSexTe1-x 등을 들 수 있다. 또한 III-V족 계열의 반도체로서는 GaAs, InAs, InP 등을 들 수 있다. 상기 반도체 물질 중 II-VI족 계열의 반도체가 코어로서 바람직하게 사용되며, 그 직경은 1 nm 내지 20 nm, 혹은 2 nm 내지 10 nm인 것을 사용한다.
또한, 코어/캡(core/cap) 구조에 있어서, 캡(cap)이란 상기 코어(core) 반도체 양자점과 결합하여 코어 반도체의 표면에 코팅층을 형성하는 반도체 양자점을 말하며, 상기 코어/캡(core/cap) 구조에 의하여 단일 코어 구조보다 더 발광효율이 뛰어난 나노입자를 얻을 수 있다. 상기 캡(cap)은 코어 반도체보다 더 큰 밴드 갭(band gap)을 가지며, 코어 반도체를 외부로부터 보호하는 보호층(passivation laer) 역할을 한다. 이러한 캡으로는 높은 밴드 갭을 지닌 II-VI족 계열의 반도체를 사용하며, 예를 들어 ZnS, CdS 또는 ZnSe를 바람직하게 사용할 수 있다. 이를 이용한 코어/캡(core/cap) 구조의 조합에 있어서, 코어를 CdSe 또는 CdS로 구성할 경우, 캡은 ZnS를 사용할 수 있고, 코어가 CdSe인 경우, 캡으로서 CdSe 또는 ZnSe를 사용하는 등, 여러 가지 조합을 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 양자점은 Type I 양자점일 수 있다. 일례로, 카드뮴셀레나이드(CdSe) 코어에 황화아연(ZnS) 쉘을 입힌 것을 비롯한 12족-16족 코어에 12족-16족 쉘의 구조를 갖는 것일 수 있다. 참고로, 낮은 갭을 가진 코어 분말(core particle)에 높은 밴드 갭을 가진 껍질을 캡핑(capping)함에 따라, 향상된 발광특성을 발휘하는 것은 입증된 기술로서, 예를 들어, CdSe 양자점에 ZnS층을 캡핑하여, 실온에서 강한 발광특성(35 내지 50% 발광효율(quantum yields))을 얻고, 분말의 크기를 조절하여, 발광파장을 청색에서 적색까지 조절할 수 있다. 더욱이, 상기 ZnS 캡핑은 코어의 표면을 보호하여, 양자점의 우수한 안정성을 제공할 수 있다.
또한, 상기 양자점 포설층은 상기 코어 입자의 외곽부에 소수성 유기화합물로 코팅된 양자점이 다중 도핑되어 형성된 포설층이 상기 코어 입자를 순차적으로 둘러싸는 층 구조를 형성하는 것일 수 있다. 상기 양자점 포설층을 구성하는 양자점은 1 내지 400,000개, 1 내지 4,000개, 혹은 400 내지 500개일 수 있다.
상기 실리카/양자점 복합쉘은 상기 양자점 포설층의 외곽부에 형성된 실리카/양자점 복합층이 상기 양자점 포설층을 순차적으로 둘러싸는 복수의 층 구조를 형성하는 것일 수 있다. 상기 실리카/양자점 복합쉘에 포함되는 양자점은 일례로 10 내지 100,000개, 혹은 200 내지 5,000개일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 실리카/양자점 복합쉘의 양자점이 차지하는 층 밀도는 밀도=중량/체적의 수식으로 계산한 결과 양자점 포설층의 가상 표면적 대비 0.00001~99.99999% 범위 내일 수 있고, 바람직하게는 30~90% 범위 내일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 70~80% 범위 내일 수 있다. 상기 범위에서 다층 다중 양자점의 발광효율 및 밝기가 향상될 수 있다.
본 발명의 다층 다중 양자점은 상기 실리카/양자점 복합쉘을 감싸는 실리카계 외피를 더 포함할 수 있다. 상기 실리카계 외피는 알루미나, 이산화티타늄, 이산화아연 등을 병용하는 경우 안정적인 템플릿을 제공할 수 있다. 이러한 안정적인 템플릿을 사용하면 크기 조절이 용이하며 원심분리(centrifuge) 및 세척(washing)가 가능한 장점이 있다.
결과 수득된 다중 양자점 기반 나노입자의 모식도를 도 1B에 나타내었다. 도 1B를 참조하면, 본 발명에 따른 다층 다중 양자점으로서 실리카 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카/양자점 복합쉘의 구조를 나타낸다. 이하에서 구체적으로 살펴보겠지만, 본 발명에서는 상기 양자점 결합자리 제공물질을 선 공급하여 가교 반응시킨 다음 암모니아수, 수산화나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘, 수산화 마그네슘 등을 비롯한 염기를 후 공급하는 방식을 도입함에 따라 상기 양자점 결합자리 제공물질을 구성하는 일 말단의 작용기가 상기 양자점 포설층을 구성하는 양자점 표면에 결합되고, 다른 말단의 작용기가 이후 형성될 실리카/양자점 복합쉘을 구성하는 실리카 물질과 결합할 자리로서 제공될 수 있고, 여기에 염기를 후 공급하고 양자점이 결합될 자리를 추가로 제공하는데 기술적 특징을 갖는다.
이로부터 본 발명 특유의 실리카/양자점 복합쉘을 형성할 수 있고, 그 결과 다층 다중 양자점 함유 나노입자를 제공하게 된다. 이렇게 제조된 다층 다중 양자점 함유 나노입자는 종래의 양자점 나노입자에 비해 균일하고 높은 형광신호를 나타낼 수 있다.
한편, 도 1A는 종래 다중 양자점으로서 실리카 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카 쉘의 구조를 나타낸다. 이와 같이, 실리카 쉘이 양자점이 포함되지 않은채 피막 역할로만 제공되는 종래 싱글(single) 양자점 함유 나노입자 제조기술에서는 상기 양자점 결합자리 제공물질을 염기와 동시 공급함에 따라 양자점과 실리카 쉘 단독간 가교 결합을 제공할 수밖에 없으므로, 본 발명과 같은 다층 다중 양자점 함유 나노입자 구조는 결코 제공할 수 없다.
도 2는 도 1의 다중 양자점 기반 나노입자의 전자 현미경 사진으로서, A는 종래 실리카 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카 쉘의 구조를 갖는 다중 양자점의 사진이고, B는 본 발명에 따른 실리카 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카/양자점 복합쉘의 구조를 갖는 다층 다중 양자점의 전자 현미경 사진이다.
본 발명에서 양자점 포설층 표면 중에서 양자점이 차지하는 층의 밀도는 상기 코어 입자의 표면적 대비 표면적 점유율이 5% 이상, 혹은 20% 이상일 수 있다. 본 발명에서 상기 실리카/양자점 복합쉘 표면 중에서 양자점이 차지하는 층의 밀도는 상기 양자점 포설층의 (가상) 표면적 대비 표면적 점유율이 10% 이상, 혹은 60% 이상일 수 있다. 하기 실시예에서 보듯이, 상기 코어의 표면에 강한 결합을 할 수 있는 싸이올기가 도입된 경우 물리적인 방해(steric hindrance)가 없다면 양자점은 코어의 외곽을 따라 포설될 수 있다(양자점 포설층 형성). 실리카/양자점 복합쉘은 양자점이 코어의 표면에 단층으로 도입되어야 한다는 제약을 없앨 수 있어 더욱 많은 양자점의 도입을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 다층 다중 양자점 함유 나노입자의 제조방법은 다음과 같이 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
우선, (a) 단계로서, 고분자 또는 무기물 코어 입자를 양자점 결합자리 제공물질로 표면 개질한다. 구체적으로, 상기 (a) 단계는 상기 코어 입자에 양자점 결합자리 제공물질을 반응시켜 표면에 양자점 결합자리가 형성된 코어를 제조하는 것일 수 있다.
이어서 (b) 단계로서, 상기 (a) 단계의 반응물에 소수성 유기화합물로 코팅된 양자점을 주입하고 반응시켜 상기 코어 입자의 외곽을 따라 양자점이 감싸는 양자점 포설층을 형성한다. 그런 다음 상기 (b) 단계의 반응물에 소수성 유기 용매를 주입하고 반응시켜 상기 코어 표면의 양자점 결합자리에 미결합 양자점을 결합하고 반응을 안정화하는 것이 바람직하다. 일례로 디클로로메탄, 디클로로에탄, 벤젠 포함 용매 (벤젠, 톨루엔, 콜로로벤젠, 에틸벤젠 등), 알킬 체인 포함 용매 (헥세인, 헵테인, 사이클로 헥세인 등) 등을 비롯한 소수성 용매를 넣고 30초 내지 60초 정도 교반함에 따라 양자점이 충분히 결합되어 양자점 포설층을 형성하는 나노입자를 제공할 수 있다.
그런 다음 (c) 단계로서, 상기 (b) 단계의 반응물을 양자점 결합자리 제공물질로 표면 개질한다. 구체적으로, 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계의 반응물에 양자점 결합자리 제공물질을 추가로 주입하고 반응시켜 일 말단의 작용기가 상기 양자점 포설층을 구성하는 양자점의 표면에 결합되고, 다른 말단의 작용기가 하기 (e) 단계의 실리카/양자점 복합쉘을 구성하는 실리카 물질과 결합할 자리로 제공할 수 있다.
나아가 (d) 단계로서, 상기 (c) 단계의 반응물에 염기를 공급하고 반응시켜 상기 양자점 외포층의 표면에 양자점이 추가 결합할 자리를 형성한다.
이후, (e) 단계로서, 상기 (d) 단계의 반응물에 실란올 반응물질과 염기를 주입하고 반응 및 정제하여 여러 겹의 양자점이 상기 코어 입자를 순차적으로 둘러싸는 복수의 층 구조를 갖는 실리카/양자점 복합쉘을 형성한다.
필요에 따라서는 상기 (c) 단계와 (d) 단계를 소정 횟수만큼 필요한 만큼 반복하여 실리카/양자점 복합쉘을 형성할 수 있다. 일례로 3~4 회 정도 반복할 경우 20~500nm 두께의 실리카/양자점 복합쉘을 제공할 수 있어 바람직하다.
전술한 바와 같이, 여러 겹의 양자점을 적층 코팅할 수 있는 공정, 예를 들어 양자점 결합자리 제공물질로서 3-머캅토프로필트리메톡시실란(MPTS)와 양자점을 선 주입한 다음 염기를 이후 주입함에 따라 양자점 포설층에 미결합된 양자점 혹은 양자점 포설층에 결합 후 분리된 양자점이 양자점 결합자리에 결합되어 이후 실리카 쉘에 포함되는 방식으로 실리카/양자점 복합쉘을 제공하게 된다. 참고로, MPTS와 염기를 양자점과 함께 넣을 경우 도 1A에서 제시한 단층 코팅만 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서 상기 양자점, 코어 입자 및 상기 결합자리 제공물질의 부피비가 1: 0.000001~60: 0.000001~890의 범위 내일 수 있고, 바람직하게는 1: 0.01~20: 0.01~300의 범위 내일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1: 1~2: 2~3의 범위 내일 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서 상기 코어 입자, 상기 양자점 포설층 및 실리카/양자점 복합쉘의 두께비가 1: 0.1~9: 1~10의 범위 내일 수 있고, 바람직하게는 1: 0.4~4: 1~4의 범위 내일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1: 1~2: 1~2의 범위 내일 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서 실리카/양자점 복합쉘의 양자점이 차지하는 층 밀도로서 밀도=중량/체적의 수식으로 계산한 결과 양자점 포설층의 가상 표면적 대비 0.00001~99.99999% 범위 내일 수 있고, 바람직하게는 30~90% 범위 내일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 70~80% 범위 내일 수 있다.
이상 수득된 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자는 코어 입자의 표면에 복수의 양자점이 안정적으로 결합되는 구성에서 나아가 쉘에도 양자점이 포함됨에 따라 양자점의 개수를 최대화할 수 있을 뿐 아니라 다양한 사이즈의 양자점을 적용하더라도 사이즈에 따른 발광 색상 별로 관찰하기에 충분할 정도로 발광 효율과 밝기를 제공하는 장점을 가짐으로써 생물학적 용도에 응용시 (멀티)라벨링 자리로서 작용할 수 있다.
도 3은 도 1의 다중 양자점 기반 나노입자들, 수용성 리간드인 COOH 작용기로 개질된 양자점 함유 나노입자(QD-COOH로 표기), 종래 다중 양자점 함유 나노입자(single silica QD, sQD로 표기)과 본 발명에 따른 다층 다중 양자점 함유 나노입자(QD2, mQD로 표기)간 발광 효율과 밝기(brightness)를 대비하였다. 도 3A에서 보듯이, QD-COOH (Control), silica coated QD 및 멀티레이어드 양자점 함유 나노입자 (QD2)의 QY 결과를 확인할 수 있었고, 도 3B에서 보듯이, single QD와 멀티레이어드 양자점 함유 나노입자의 fluorescence intensity 값의 결과를 확인할 수 있었으며, UV lamp 장비를 365 nm 하에 측정한 도 3C에서 보듯이, single QD와 멀티레이어드 양자점 함유 나노입자를 실제 눈으로 확인 할 수 있는 UV 램프 상에서 관찰하여 결과를 확인할 수 있었다.
도 4는 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자로서 다양한 사이즈의 양자점을 적용한 경우 (멀티)라벨링 자리로서 작용 가능성을 살펴본 도면으로서, 발광 효율과 밝기를 도시하였다. 도 4에서 보듯이, 개선된 발광 효율과 밝기를 갖고, 다양한 사이즈의 양자점을 적용하여 사이즈별로 다른 발광색 혹은 형광색을 나타내는 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자는 바이오플랫폼을 비롯한 생물학적 용도로 효과적으로 사용할 수 있다. 즉, 실시간 PCR 수준의 민감도를 보유함으로써 초고민감도가 필요한 신종 감염성 병원체에 대한 정밀 신속 진단이 가능하고, log 10 이상의 넓은 Dynamic range를 가짐으로써, 다양한 농도의 바이오마커를 동시에 분석할 수 있다.
상기 생물학적 용도의 구체적인 예로, 본 발명에 따른 생물학적 검출키트는 양자점 도핑 나노입자가 표면에 고정되어 있는 센싱막(sensing membrane)을 포함하는 생물학적 검출키트로서, 상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자에 양자점이 도핑되어 형성되는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 것일 수 있다.
상기 센싱막은 일례로 탈수-축합법에 의해 고정된 것일 수 있다.
상기 센싱막은 일례로 유리 플레이트, 폴리스티렌 플레이트 또는 마이크로타이터 플레이트 상에 형성되어 있는 것일 수 있다.
상기 생물학적 검출키트는 일례로 단당류, 다당류, 유기산, 알콜, 콜레스테롤, 콜린, 크산틴 및 이들의 혼합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 물질을 검출하기 위한 키트일 수 있다.
상기 생물학적 검출키트는 도 5를 참고하여 설명하면 다음과 같이 이용될 수 있다. 도 5는 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자를 생체물질 검출키트에 적용하는 경우를 모식적으로 나타낸 도면과 관련 영역의 부분 확대도이다. 도 5는 키트상에서 다중 양자점 함유 나노입자를 이용한 실제 적용을 나타낸 도면이며, 여기서 부분확대도는 키트의 Nitrocellulose membrane (NC membrane)상의 빨간 줄 부분에서 항체가 접합되어 있는 다중 양자점 함유 나노입자, 목표 물질 및 포획항체간 반응을 설명하는 도면이다.
다른 구체적인 예로, 자성비드를 제작하여 샌드위치 어세이에 적용할 경우 자석을 사용하여 간단한 공정으로 바이오플랫폼을 수집할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 바이오플랫폼은 달리 특정하지 않는 한 면역진단과 같은 분자진단에 사용되는 플랫폼을 지칭한다. 상기 바이오플랫폼은 상기 다층 다중 양자점 함유 나노입자의 쉘 표면을 (멀티)라벨링 자리로 제공할 수 있다.
상기 바이오플랫폼에 포함되는 다층 다중 양자점 함유 나노입자는 다양한 양자점 사이즈를 갖는 형태로 병용 사용함에 따라 다양한 표적물질들에 대하여도 극미량만으로 다양한 발광을 개선된 효율과 밝기로 제공하여 (멀티)라벨링 자리로 작용할 수 있다.
일례로, 상기 다층 다중 양자점 함유 나노입자에, 타겟물질 (생물학적 시료)에 상보적 결합하는 항체를 결합시켜 상기 다층 다중 양자점 함유 나노입자에 결합된 항체가 상기 생물학적 시료(타겟물질)을 포착하는 구조를 제공할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 다층 다중 양자점 함유 나노입자에, 생물학적 시료(타겟물질)에 상보적 결합하는 항체를 결합하기 위한 리간드로 개질한 다음 항체를 결합하고, 상기 다층 다중 양자점 함유 나노입자에 결합된 항체가 상기 생물학적 시료(타겟물질)을 포착하는 구조를 제공할 수 있다. 상기 리간드는 이 분야에서 공지되어 있는 스트렙타비딘-바이오틴, 아비딘-바이오틴, 또는 아시알로당당백질(asialoglycoprotein)-갈락토오스를 비롯한 수용체-리간드 반응을 일으킬 수 있는 수용체-리간드 쌍일 수 있다.
상기 생물학적 시료(타겟물질)은 일례로 항원, 수용체, 바이러스, 효소, 감염성 면역글로블린, 사이토카인 또는 기타 감염인자일 수 있다.
나아가 상기 생물학적 시료(타겟물질)은 추후 안정적인 발광 측정을 행할 수 있도록 자성비드로 포착된 샌드위치 어세이 구조를 제공할 수 있다. 이 경우 상기 자성비드 역시 생물학적 시료(타겟물질)에 상보적 결합하는 항체를 포함하고, 상기 자성비드에 결합된 항체가 전술한 다층 다중 양자점 함유 나노입자에 결합된 항체와 별개로 상기 생물학적 시료(타겟물질)을 포착하는 구조를 제공할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 자성비드를 생물학적 시료(타겟물질)에 상보적 결합하는 항체를 결합하기 위한 리간드로 개질한 다음 항체를 결합하고, 상기 자성비드에 결합된 항체가 상기 생물학적 시료(타겟물질)을 포착하는 구조를 제공할 수 있다. 상기 리간드는 스트렙타비딘-바이오틴, 아비딘-바이오틴, 또는 아시알로당당백질(asialoglycoprotein)-갈락토오스를 비롯한 수용체-리간드 반응을 일으킬 수 있는 수용체-리간드 쌍일 수 있다.
관련된 구체적인 예로, 본 발명에 따른 바이오플랫폼(bioplatform)은 양자점 도핑 나노입자가 자성비드와 샌드위치 어세이 구조를 형성하는 바이오플랫폼으로서, 상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자에 양자점이 도핑되어 형성되는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 것일 수 있다.
상기 자성비드는 샘플의 분리 및 정제에 적절하도록 직경이 1~5 um 범위를 가질 수 있다. 상기 자성비드는 자성 물질을 함유한 고분자 비드상 중합체의 형태를 가질 수 있다. 상기 자성비드의 외곽은 실리카 쉘로 둘러싸일 수 있다. 상기 실리카 쉘은 상기 자성비드를 보호하며, 표면은 어세이를 위해 각종 리간드로 개질될 수 있다. 상기 자성비드는 일례로, 폴리스티렌 시드와 스티렌 단량체의 혼합물을 스티렌 유도체, 유화제, 지용성 퍼옥사이드계 중합개시제와 공중합시킨 비드상 공중합체로서, 상기 공중합체의 골격을 구성하고 있는 스티렌 고리에 술폰산 관능기가 도입되어 있고, 상기 술폰산 관능기에 철 이온이 결합되어 있으면서 외곽을 둘러싸도록 실리카 쉘을 포함하고 자성을 띠는 비드상의 폴리(스티렌-co-스티렌 유도체) 공중합체를 사용하는 것이 비특이적 결합을 막는 측면을 고려할 때 바람직하다.
구체적인 예로, 상기 자성비드를 준비하는 단계는 다음과 같은 순서로 제조될 수 있다:
우선, a) 단계로서, 스티렌 단량체를 분산 안정화제, 라디칼 개시제와 함께 유화제 프리 에멀젼 중합시켜 폴리스티렌 시드를 준비한다.
b) 단계로서, 상기 폴리스티렌 시드를 디부틸 프탈레이트를 비롯한 가소제 하에 프리팽윤된 폴리스티렌 시드를 제조한다.
c) 단계로서, 상기 프리팽윤된 폴리스티렌 시드와 스티렌 단량체의 혼합물을 스티렌 유도체, 유화제, 지용성 퍼옥사이드계 중합개시제와 함께 수분산 공중합하여 비드상의 폴리(스티렌-co-디비닐벤젠) 공중합체를 제조한다.
d) 단계로서, 상기 비드상의 폴리(스티렌-co-디비닐벤젠) 공중합체를 술폰화제와 반응시켜 술폰산 관능기를 포함하는 비드상의 폴리(스티렌-co-디비닐벤젠) 공중합체를 제조한다. 구체적인 예로, 술폰화제로서 클로로술폰산, 아세틸설페이트 및 진한 황산 중에서 선택된 1종 이상을 사용하여 60 ~ 95℃의 온도 범위에서 수행할 수 있다.
e) 단계로서, 상기 술폰산 관능기를 포함하는 비드상의 폴리(스티렌-co-디비닐벤젠) 공중합체를 초상자성 이온 전구체를 사용하여 자화시킨다. 구체적인 예로, 염화제1철(FeCl2) 및 염화제2철(FeCl3)의 혼합물을 사용하여 수행하며, 상기 혼합물의 몰비는 FeCl2.4H2O: FeCl3.6H2O가 1:500~10,000, 혹은 1:1~2의 범위일 수 있다.
그런 다음 f) 단계로서, 상기 자성을 띠는 비드상의 폴리(스티렌-co-디비닐벤젠) 공중합체의 외곽을 둘러싸도록 실리카 쉘을 형성한다.
상기 바이오플랫폼을 이용한 생물학적 검출 방법은 다음과 같이 진행될 수 있다.
우선 양자점 도핑 나노입자가 자성비드와 샌드위치 어세이 구조를 형성하는 바이오플랫폼에 생물학적 시료(타겟 물질)를 주입하여 반응을 수행하고, 상기 반응으로부터 방출되는 형광강도를 측정한다.
여기서 상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자에 양자점이 도핑되어 형성되는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함할 수 있다.
상기 바이오플랫폼을 구성하는 양자점 도핑 나노입자는 다양한 양자점 사이즈를 갖는 나노입자들을 병용하여 각 나노입자의 쉘 표면을 생물학적 시료(들)에 대한 (멀티)라벨링 자리로 작용할 수 있다.
또한, 상기 형광강도는 이에 한정하는 것은 아니나, 광학적 방법에 의하거나 전기적 신호로 변환하여 측정할 수 있다.
상기 바이오플랫폼은 도 7을 참고하여 설명하면 다음과 같이 이용될 수 있다. 도 7은 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자를 샌드위치 어세이에 적용하는 경우를 모식적으로 나타낸 도면들이다.
도 7을 참조하면 다음과 같다. 즉, 상기 다층 다중 양자점 함유 나노입자 혹은 상기 자성비드 중 일종을 상기 생물학적 시료(타겟물질) 함유 수용액 혹은 유기용매에 투입하고 상기 생물학적 시료(타겟물질)의 일측에 상기 다층 다중 양자점 함유 나노입자의 항체 혹은 상기 자성비드의 항체가 결합된 구조를 갖는 용액을 준비하고, 상기 용액에 상기 다층 다중 양자점 함유 나노입자 혹은 상기 자성비드 중에서 투입하지 않았던 물질을 투입한다.
그런 다음 상기 다층 다중 양자점에 결합된 항체에 결합된 생물학적 시료(타겟물질)을 상기 자성비드의 항체가 결합하고 있거나 혹은 상기 자성비드에 결합되어 있는 항체에 생물학적 시료(타겟물질)가 결합된 다음 상기 다층 다중 양자점에 결합된 항체가 이어서 결합하고 있는 플랫폼 구조를 갖는 용액을 제조한다.
이어서 상기 용액에 자성체를 접촉시켜 자성비드를 수집하고, 상기 자성비드가 수집된 부위에서 상기 양자점 함유입자에 포함된 양자점의 흡광도 혹은 형광 세기를 측정할 수 있다.
상기 타겟물질 함유 용액은 일례로 심근검색 다중검사 용액, 감염성 면역글로불린 동시진단, 사이토카인 동시진단 또는 혈액스크리닝 용액일 수 있다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 관련 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명을 이에 한정하거나 제한 해석하려는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1-다층 다중 양자점 함유 나노입자 제조
<코어 입자>
스토버법으로 직경 120 nm 크기(10mg/ml)의 실리카 입자를 준비하였다.
<양자점 포설층>
상기 코어 입자에 양자점 결합자리 제공물질로서 1%(v/v) 3-머캅토프로필트리메톡시실란(MPTS) 10㎕를 첨가하고 25℃에서 12시간 동안 교반하여, 상기 코어 입자 표면에 싸이올기를 도입하였다.
상기 싸이올기가 도입된 코어 입자 외곽에 형광을 발생시키는 양자점을 다중 결합시키기 위하여, 다음과 같은 양자점 나노입자를 사용하였다.
소수성 유기화합물로서 올레산을 사용하여 코팅된 고상 양자점 나노입자(CdSe/ZnS, 10nm) 7 mg을 도입한 다음 소수성 용매로서 4mL의 디클로로메탄을 넣고 추가로 30~60초간 교반하여 미결합된 양자점을 추가 결합시켰다.
이어서 양자점 결합자리 제공물질로서 50㎕ 머캅토프로필트리에톡시실란(MPTES)를 투입하고 15분 동안 교반한 다음 염기로서 25% 암모니아수(NH4OH(aq) 50㎕를 투입하고 15분간 추가로 교반하여 상기 코어 입자의 외곽을 감싸는 양자점 포설층 구조를 형성하면서 상기 양자점 포설층 표면에 양자점이 추가로 결합할 자리를 갖는 나노입자를 준비하였다.
<복합쉘 / 다층 다중 양자점 함유 나노입자>
상기 양자점 포설층의 표면에 양자점이 추가로 결합할 자리를 만들어놓은 나노입자를 3회 에탄올로 세척한 다음 실란올 반응물질로서 50㎕ 테트라에틸 오르소실리케이트와 염기로서 25% 암모니아수를 20시간동안 68rpm 하에 교반한 다음 3회 에탄올 세척하여 양자점 도입후 5분동안 교반하고 클로로폼(chloroform) 용액을 첨가하고 10분간 더 교반하여 실리카 쉘 내에 다층 양자점이 포함된 실리카/양자점 복합쉘을 형성하였다.
수득된 실리카 코어, 양자점 포설층, 실리카/양자점 복합쉘의 구조 모식도를 도 1B에 나타내었다. 도 1B로부터, 각 층의 쉘마다 다층 다중 양자점이 랜덤하게 내포된 구조를 확인할 수 있다. 수득된 실리카 코어, 양자점 포설층, 실리카/양자점 복합쉘의 구조를 갖는 다층 다중 양자점 함유 나노입자의 전자 현미경 사진을 도 2B에 나타내었다. 도 2B에서 보듯이, 멀티레이어드 구조를 확인할 수 있다. 또한, 실리카/양자점 복합쉘의 양자점이 차지하는 층 밀도로서 밀도=중량/체적의 수식으로 계산한 결과 양자점 포설층의 가상 표면적 대비 0.00001~99.99999% 범위 내인 70~80%로 계산되었다.
비교예 1-다중 양자점 함유 나노입자 제조
상기 실시예 1의 <양자점 포설층> 항목에서, 50㎕ 머캅토프로필트리에톡시실란(MPTES)와 염기로서 25% 암모니아수(NH4OH(aq) 50㎕를 순차 투입하지 않고, 50㎕ 머캅토프로필트리에톡시실란(MPTES)와 25% 암모니아수(NH4OH(aq) 50㎕를 동시에 투입한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 <양자점 포설층> 항목에 개시된 공정을 수행하였다. 결과 실리카 쉘 내에 다중 양자점이 포함된 실리카 단독 쉘을 형성하였다.
수득된 실리카 코어, 양자점 포설층, 실리카 쉘의 구조 모식도를 도 1A에 나타내었다. 도 1A로부터, 1층의 쉘에 다중 양자점이 랜덤하게 내포된 구조를 확인할 수 있다. 수득된 실리카 코어, 양자점 포설층, 실리카 쉘의 구조를 갖는 다중 양자점 함유 나노입자의 전자 현미경 사진을 도 2A에 나타내었다. 도 2A에서 보듯이, 싱글레이어드 구조를 확인할 수 있다.
<실험예 1>
상기 실시예 1과 비교예 1의 다중 양자점 함유 나노입자의 발광 효율과 밝기를 측정하여 도 3에 정리하였다. 도 3은 종래 수용성 리간드, COOH 작용기로 개질된 양자점 함유 나노입자(QD-COOH로 표기), 비교예 1에 따른 다중 양자점 함유 나노입자(single silica QD, sQD로 표기)와 실시예 1에 따른 다층 다중 양자점 함유 나노입자(QD2, mQD로 표기)간 발광 효율과 밝기(brightness)를 대비한 도면들이다. 도 3A에서 보듯이, QD-COOH (Control), silica coated QD 및 멀티레이어드 양자점 함유 나노입자 (QD2)의 QY 결과를 확인할 수 있었고, 도 3B에서 보듯이, single QD와 멀티레이어드 양자점 함유 나노입자의 fluorescence intensity 값의 결과를 확인할 수 있었으며, UV lamp 장비를 365 nm 하에 측정한 도 3C에서 보듯이, single QD와 멀티레이어드 양자점 함유 나노입자를 실제 눈으로 확인 할 수 있는 UV 램프 상에서 관찰하여 결과를 확인할 수 있었다.
<실시예 2>
본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자들에 사이즈를 달리한 다양한 양자점을 적용한 경우 (멀티)라벨링 자리로서 작용 가능성을 살펴보기 위한 실험이다.
구체적으로는, 실시예 1에서 제조된 멀티레이어드 양자점 함유 나노입자는 Red color QD2이었으며, 여기에 양자점의 사이즈를 각각 2nm, 2.5nm, 3nm으로 조절한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 공정을 반복하여 각각 Blue color QD2, Green color QD2, Yellow color QD2를 제조하였다.
도 4는 각 칼라별 발광 효율과 밝기를 도시한 도면으로서, 도 4A에서 보듯이, 각각의 양자점이 도입 된 멀티레이어드 양자점 함유 나노입자의 QY의 결과를 확인할 수 있었고, 도 4B에서 보듯이, 각 사이즈의 멀티레이어드 양자점 함유 나노입자의 fluorescence intensity (Nomalize) 결과를 확인할 수 있었으며, UV lamp장비를 365 nm 하에 측정한 도 4C에서 보듯이, 각각의 사이즈가 다른 나노입자를 도입한 멀티레이어드 양자점 함유 나노입자를 실제 눈으로 확인 할 수 있는 UV lmap상에서 관찰하여 결과를 확인할 수 있었다.
<적용예 1 생물학적 검출키트>
이하, 도 5를 참조하여 다층 다중 양자점 함유 나노입자의 생물학적 검출키트로의 적용예를 설명한다. 도 5는 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자를 생체물질 검출키트에 적용하는 경우를 모식적으로 나타낸 도면과 관련 영역의 부분 확대도이다.
<다층 다중 양자점 함유 나노입자의 표면 개질>
상기 실시예 1의 다층 다중 양자점 함유 나노입자 1mg을 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTS 용액, 5% v/v, 1mL)에 첨가하고 실온 하에 1시간 교반하였다. 이후 에탄올로 3회 세척하고, 무수 숙신산 75mg을 2-메틸-2-피롤리돈(NMP) 용액 500㎕, N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA) 3.50 ㎕을 넣고 2시간 동안 교반하였다.
이어서 디메틸포름아미드(DMF)로 3회 세척하고 디메틸피리딘(DMP) 100㎕ 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 2.1mg를 추가하고 DIC 27㎕을 추가하여 실온에서 1시간 동안 교반하였고, 2-메틸-2-피롤리돈(NMP) 2회, 트리스포스페이트 버퍼 용액(TPBS) 1회, 포스페이트 버퍼 용액(PBS, pH 7.2) 1회씩 세척하고 포스페이트 버퍼 용액(PBS, pH 7.2)에 분산시켜 항체를 결합하기 위한 표면 개질을 수행하였다.
<항체 결합>
이렇게 표면 개질시킨 양자점 다층 나노입자 100㎍에 10pmole 항체를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 PBS(pH 7.2)로 4회 세척하고 항체가 결합된 양자점 다층 나노입자에 소혈청 알부민(BSA) 용액(5% w/w, 1mL)을 첨가하고 실온에서 1시간 교반하였다.
이를 도 6에 나타낸 것과 같이 키트로 제작하여 항원에 대한 포착 실험을 수행하였다. 도 6은 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자를 실제 생체물질 검출키트에 적용한 경우를 나타낸 도면들이다. 도 6A에서 보듯이, 항원을 포착할 경우 Absorbent pad 쪽의 capture antibody가 있는 줄에 capture abtibody 및 target 물질과 결합되어 표시되었다. 또한 도 6B에서 보듯이, 키트분석장비를 통해 키트에서 줄이 표시된 곳의 fluorescence intensity를 확인할 수 있었다.
<적용예 2-샌드위치 어세이>
상기 실시예 1과 동일하게 항체 결합된 양자점 다층 나노입자에 도 7에 나타낸 것과 같은 방식으로 항체 결합된 자성비드를 사용하여 항원을 샌드위치 어세이를 수행하였다.
여기서 자성비드는 다음과 같이 제조하였다:
<자성비드 제조예>
<폴리스티렌 시드>
단분산 매크로포러스 폴리스티렌-디비닐벤젠 비드를 시드 중합법에 의해 제조한 것으로, 구체적으로는 분산 중합법을 이용하여 단분산 폴리스티렌 시드(4um)를 제조하였다. 분산매로는 입체 안정제(90mL)로 1g의 폴리비닐피롤리돈-40(PVP-40)을 함유하는 에탄올/2-메톡시에탄올(3:2 부피비)을 사용하였다.
아조비스이소부티로니트릴 (AIBN, 150mg) 을 억제제가 제거된 스티렌(15mL)에 용해 후 조제한 분산 매체에 첨가하였다. 10분간 표면처리 후, 70℃에서 20시간 교반(120cpm)하면서 원통형 반응 챔버 내에서 분산 중합을 수행하였다. 현탁액을 원심분리하고 침전물을 원심분리하면서 증류수로 세척하고 폴리스티렌 시드를 에탄올로 세척 및 밤새 진공건조하여 폴리스티렌 시드(4um, 8.3g)를 수득하였다.
<단분산 매크로포러스 폴리스티렌-co-DVB 중합>
수득된 폴리스티렌 시드(4um, 700mg)을 오버헤드 교반기와 환류 냉각기를 구비한 유리 반응기에서 0.25% (w/w) 소디움 도데실 설페이트(SDS)를 포함하는 디부틸프탈레이트 (DBP, 0.7mL) 유화 수성 매질(100mL)에 분산시켰다. 얻어진 분산매를 실온에서 20시간 동안 400 rpm 하에 교반하고 BP(240mg)을 용해한 스티렌(4.6mL) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.3mL)의 DBP 혼합물에서 폴리스티렌 시드를 팽윤시킨 다음 수성 매체 호모게나이저를 사용하여 0.25%(w/w) 소디움 도데실 설페이트(SDS)를 포함하는 100mL 용액에 1분간 침지하였다. 해당 에멀젼 단량체 용액을 교반하면서 디부틸 프탈레이트(DBP) 팽창시킨 폴리스티렌 시드 분산매에 첨가하였다.
<매크로다공성 PS-DVB 비드 제조>
모노머를 400rpm 하에 연속 교반하면서 실온에서 20시간 수행하였다. 팽창 과정 후 탈이온수(10mL) 중 10%(w/v) 폴리비닐알코올(PVA) 수용액에 분산매를 투입하고 질소 분위기하에 30분간 퍼지하였다. 시드 중합은 70℃에서 20시간 연속하여 200rpm으로 교반하고 단분산된 PS-DVB 비드를 수득하였다.
수득된 비드를 세척 및 원심분리하고 탈이온수(50℃)에서 세척하였다. 이어서 회수된 비드를 에탄올과 테트라하이드로푸란(THF)으로 세척하였으며 디부틸 프탈레이트(DBP)와 선형 고분자를 제거하였다. 그런 다음 비드를 30℃에서 24시간 진공 건조시켜 매크로다공성 PS-DVB 비드(7.5um, 2.5g)를 수득하였다.
<매크로다공성 PS-DVB 비드의 술폰화>
수득된 단분산 PS-DVB (1g)을 얼음욕조에서 5mL 아세트산에 첨가하였다. 이어서 실온에서 비드에 황산(50mL)을 천천히 첨가하고 온도를 90℃까지 승온하여 수지 혼합물을 30분 내지 2시간 동안 교반하였다. 교반에 의한 분산액을 얼음물(400mL)에 부어 반응을 정지시키고 술폰화된 PS-DVB 비드를 원심분리시켜 수집하였다. 원심분리를 반복하고 비드를 탈이온수로 충분히 세척하였다. 이어서 술폰화된 비드를 에탄올로 3회 세척하고 진공 하에 건조시켜 1.1g을 수득하였다.
<술폰화된 매크로다공성 PS-DVB 비드의 자화>
기계적 교반(200rpm)으로 질소를 퍼지하면서 술폰화 매크로다공성 PS-DVB 비드(500mg)를 탈이온수(10mL)에 실온 분산시켰다. 탈이온수(10mL) 중의 FeCl3.6H2O(618mg, 2.26mmol) 및 FeCl2.4H2O(257mg, 1.28mmol)의 새로 제조한 혼합물을 흡착용 분산액에 첨가하였다.
2시간 후, 연속 교반하면서 비드 현탁액에 28% 수산화암모늄(50mL)을 40분간 적하하였다. 자화된 매크로다공성 비드는 원심분리시켜 혼합물로 분리시켰고, 25% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 세척하고 이어서 탈이온수와 에탄올로 세척하였다. 마지막으로 자화된 매크로다공성 비드를 진공하여 건조시켜 7.5um, 653mg을 수득하였다.
<쉘>
수득된 100mg의 자화된 비드를 (3-아미노프로필)트리에톡시실란 용액(1% (v/v), 100mL)을 첨가하고 실온에서 10분간 교반하였다. 이후 수산화암모늄(28%, 2mL)를 비드 분산액에 첨가하고 실온 하에 20분간 교반하였다. 상기 분산액에 TEOS(2mL)을 첨가하여 실온에서 12시간 격렬하게 교반하였다. 수득된 실리카 코팅 자성비드를 자석으로 수집하고 에탄올로 5회 세척하였다.
<자성비드의 표면 개질>
상기 실시예 1의 <양자점 다층 나노입자의 표면 개질> 항목과 동일한 공정을 반복하였다.
<항체 결합>
이와 같이 표면 개질된 자성비드 100㎍에 도 7에 도시한 것과 같이 10uM 항체를 첨가하고 실온에서 2시간 교반하였다. 이후 PBS(pH 7.2)로 4회 세척하고, 항체가 결합된 자성비드에 BSA 용액(5% (w/w) 1mL)을 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 이후 PBS(pH 7.2)로 4회 세척하고 PBS(pH 7.2)에 분산시켰다.
<샌드위치 면역어세이>
PBS(pH 7.2)에 분산된 항원을 항체가 결합된 자성비드 100㎍에 첨가하고 실온에서 1시간 교반시킨 다음 도 7의 우측 도면에 도시한 것과 같이 자석을 사용하여 PBS(pH 7.2)로 4회 세척하였다. 여기에 항체가 결합된 양자점 다층 나노입자 100 ㎍을 투입하고 실온에서 1시간 교반한 다음 자석으로 PBS(pH 7.2)로 4회 세척하였다. 마지막으로 PBS(pH 7.2) 300㎕에 분산시켜 바이오플랫폼을 제작하였다.
상기 적용예 2에서 수득된 플랫폼을 도 7의 우측 도면에 도시한 것과 같이 UV-vis 분광계를 사용하여 정량적 형광 신호를 관찰하였다. 구체적으로는 300 ㎕의 플랫폼을 흑색 96웰 플레이트로 충진하였다. 이때 UV 여기 파장은 385 nm이었고 방출 파장은 625nm이었다.
도 8은 본 발명의 다층 다중 양자점 함유 나노입자를 실제 샌드위치 어세이에 적용한 경우를 나타낸 도면들이다. 도 8의 좌측 도면에서 보듯이, 3.2~3.2×10-4 HAU 범위이상의 형광검출이 가능한 결과를 확인할 수 있었고, 도 8의 우측 도면에서 보듯이 실시간 PCR에서 같은 타겟물질을 검출하였을 때 큰 차이가 없는 결과를 보였다. 즉, 실시간 PCR 수준의 정밀 신속 진단이 가능하고, log 10 이상의 넓은 Dynamic range를 갖는 효과를 제공하는 것을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 고분자 또는 무기물 코어 입자, 양자점 포설층, 실리카/양자점 복합쉘 구조를 갖는 다중 양자점 도핑 나노입자를 높은 점유면적과 안정한 결합을 유지하면서 제조하여 생체분자 검출시 개선된 발광효율(QY)과 밝기(brightness)를 제공함에 따라 바이오플랫폼 및 고감도 생체분자 검출법을 비롯한 생물학적 용도를 제공할 수 있다.

Claims (26)

  1. 고분자 또는 무기물 코어 입자;
    상기 코어 입자의 표면에 복수의 양자점이 결합되어 상기 코어 입자 표면을 전체적으로 둘러싸는 양자점 포설층; 및
    상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 양자점 도핑 나노입자.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 양자점 포설층을 구성하는 양자점은 상기 실리카/양자점 복합쉘을 구성하는 실리카 물질과 가교 결합을 형성하며, 상기 가교 결합을 통해 형성된 실리카 물질에 상기 양자점이 랜덤 결합된 구조를 제공하는 것인 양자점 도핑 나노입자.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 가교 결합은 양 말단에 작용기를 구비하되, 일 말단은 상기 양자점 표면에 결합하는 작용기를 포함하고 다른 말단은 상기 코어 입자 혹은 실리카/양자점 복합쉘을 구성하는 실리카 입자와 결합가능한 작용기를 갖는 양자점 결합자리 제공물질에 의해 형성되는 것인 양자점 도핑 나노입자.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 양자점 포설층은 상기 코어 입자의 외곽부에 소수성 유기화합물로 코팅된 양자점이 다중 도핑되어 형성된 포설층이 상기 코어 입자를 순차적으로 둘러싸는 층 구조를 형성하는 것인 양자점 도핑 나노입자.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 실리카/양자점 복합쉘은 상기 양자점 포설층의 외곽부에 형성된 실리카/양자점 복합층이 상기 양자점 포설층을 순차적으로 둘러싸는 복수의 층 구조를 형성하는 것인 양자점 도핑 나노입자.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 실리카/양자점 복합쉘을 감싸는 실리카계 외피를 더 포함하는 것인 양자점 도핑 나노입자.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 양자점은 Type I 양자점인 양자점 도핑 나노입자.
  8. (a) 고분자 또는 무기물 코어 입자를 양자점 결합자리 제공물질로 표면 개질하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 반응물에 소수성 유기화합물로 코팅된 양자점을 주입하고 반응시켜 상기 코어 입자의 외곽을 따라 양자점이 감싸는 양자점 포설층을 형성하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 반응물을 양자점 결합자리 제공물질로 표면 개질하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계의 반응물에 염기를 공급하고 반응시켜 상기 양자점 외포층의 표면에 양자점이 추가 결합할 자리를 형성하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계의 반응물에 실란올 반응물질과 염기를 주입하고 반응 및 정제하여 여러 겹의 양자점이 상기 코어 입자를 순차적으로 둘러싸는 복수의 층 구조를 갖는 실리카/양자점 복합쉘을 형성하는 단계를 포함하는 양자점 도핑 나노입자의 제조방법.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 (c) 단계와 (d) 단계를 소정 횟수만큼 반복 수행한 다음 (e) 단계를 수행하는 것인 양자점 도핑 나노입자의 제조방법.
  10. 제8 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 코어 입자에 양자점 결합자리 제공물질을 반응시켜 표면에 양자점 결합자리가 형성된 코어를 제조하는 것인 양자점 도핑 나노입자의 제조방법.
  11. 제8 항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 반응물에 소수성 유기 용매를 주입하고 반응시켜 상기 코어 표면의 양자점 결합자리에 미결합 양자점을 결합하고 반응을 안정화하는 것인 양자점 도핑 나노입자의 제조방법.
  12. 제8 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계의 반응물에 양자점 결합자리 제공물질을 추가로 주입하고 반응시켜 일 말단의 작용기가 상기 양자점 포설층을 구성하는 양자점의 표면에 결합되고, 다른 말단의 작용기가 하기 (e) 단계의 실리카/양자점 복합쉘을 구성하는 실리카 물질과 결합할 자리로 제공하는 것인 양자점 도핑 나노입자의 제조방법.
  13. 제8 항에 있어서,
    상기 양자점, 코어 입자 및 상기 결합자리 제공물질의 부피비가 1: 0.000001~60: 0.000001~890인 양자점 도핑 나노입자의 제조방법.
  14. 제8 항에 있어서,
    상기 코어 입자, 양자점 포설층, 및 실리카/양자점 복합쉘의 두께비가 1:0.1~9:1~10인 양자점 도핑 나노입자의 제조방법.
  15. 양자점 도핑 나노입자가 표면에 고정되어 있는 센싱막(sensing membrane)을 포함하는 생물학적 검출키트로서, 상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자에 양자점이 도핑되어 형성되는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 것인 생물학적 검출키트.
  16. 양자점 도핑 나노입자가 자성비드와 샌드위치 어세이 구조를 형성하는 바이오플랫폼으로서, 상기 자성비드는 자성 물질을 함유한 고분자 비드상 중합체의 형태를 가지는 것인 바이오플랫폼.
  17. 제16 항에 있어서,
    상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 및 상기 코어 입자의 표면에 복수의 양자점이 결합되어 상기 코어 입자 표면을 전체적으로 둘러싸는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 바이오플랫폼.
  18. 제17 항에 있어서,
    상기 양자점 포설층 내 양자점들은 상기 코어 입자 표면을 둘러싸며, 이때 둘러싸는 형태가 복수층으로 적층되는 것인 바이오플랫폼.
  19. 제18 항에 있어서,
    상기 양자점 도핑 나노입자는 상기 코어 입자 : 상기 양자점 포설층 ; 상기 실리카/양자점 복합쉘의 두께비가 1: 0.1~9 : 1~10인 바이오플랫폼.
  20. 제16 항 내지 제19 항 중에서 선택된 어느 한 항의 바이오플랫폼에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하는 단계; 및 상기 반응으로부터 방출되는 형광강도를 측정하는 단계를 포함하되, 상기 양자점 도핑 나노입자는 고분자 또는 무기물 코어 입자; 상기 코어 입자의 표면에 복수의 양자점이 결합되어 상기 코어 입자 표면을 양자점이 전체적으로 둘러싸는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하되, 상기 양자점 포설층 내 양자점들은 상기 코어 입자 표면을 둘러싸며, 이때 둘러싸는 형태가 복수층으로 적층되는 것인 생물학적 검출 방법.
  21. 양자점 도핑 나노입자가 표면에 고정되어 있는 센싱막(sensing membrane)을 포함하는 생물학적 검출키트에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하는 단계; 및 상기 반응으로부터 방출되는 형광강도를 측정하는 단계를 포함하되,
    상기 양자점 도핑 나노입자는 무기물 코어 입자; 상기 무기물 코어 입자에 양자점이 도핑되어 형성되는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 것인 생물학적 검출방법.
  22. 제21 항에 있어서,
    상기 양자점 도핑 나노입자는 다양한 양자점 사이즈를 갖는 나노입자들을 병용하여 각 나노입자의 쉘 표면을 생물학적 시료(들)에 대한 (멀티)라벨링 자리로 작용하는 것인 생물학적 검출 방법.
  23. 제21 항에 있어서,
    상기 형광강도를 광학적 방법에 의하거나 전기적 신호로 변환하여 측정하는 것인 생물학적 검출 방법.
  24. 양자점 도핑 나노입자가 자성비드와 샌드위치 어세이 구조를 형성하는 바이오플랫폼에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하는 단계; 및 상기 반응으로부터 방출되는 형광강도를 측정하는 단계를 포함하되,
    상기 양자점 도핑 나노입자는 무기물 코어 입자; 상기 무기물 코어 입자에 양자점이 도핑되어 형성되는 양자점 포설층; 및 상기 양자점 포설층을 감싸는 실리카/양자점 복합쉘을 포함하는 것인 생물학적 검출 방법.
  25. 제24 항에 있어서,
    상기 바이오플랫폼을 구성하는 양자점 도핑 나노입자는 다양한 양자점 사이즈를 갖는 나노입자들을 병용하여 각 나노입자의 쉘 표면을 생물학적 시료(들)에 대한 (멀티)라벨링 자리로 작용하는 것인 생물학적 검출 방법.
  26. 제24 항에 있어서,
    상기 형광강도를 광학적 방법에 의하거나 전기적 신호로 변환하여 측정하는 것인 생물학적 검출 방법.
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