KR100914455B1

KR100914455B1 - 양자점을 이용한 생물학적 검출키트 및 방법

Info

Publication number: KR100914455B1
Application number: KR1020070051354A
Authority: KR
Inventors: 이종일
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2007-05-28
Filing date: 2007-05-28
Publication date: 2009-08-28
Also published as: KR20080104495A; WO2008146966A1

Abstract

본 발명은 카드뮴셀레나이드(CdSe) 코어에 황화아연(ZnS) 쉘을 입힌 양자점(quantum dots; QDs)과 각종 산화효소(oxidases)의 바이오컨주게이트(bioconjugates), 상기 바이오컨주게이트가 고정화되어 있는 센싱막(sensing membranes), 상기 센싱막을 포함하는 생물학적 검출키트, 및 상기 검출키트를 이용한 생물학적 검출방법에 관한 것으로서, 유기 형광물질에 비해 여러 장점을 갖는 QDs를 이용하여 단당류, 다당류, 유기산 등을 검출할 수 있으며, 특히 글루코스를 넓은 농도범위에서 효율적으로 검출할 수 있다.

양자점, CdSe/ZnS, 바이오센서, 글루코스, 산화효소, FRET

Description

양자점을 이용한 생물학적 검출키트 및 방법{Kits and methods for biological detection using quantum dots}

도 1은 CdSe/ZnS QDs에 포접된 GOD/HRP를 이용한 글루코스의 글루콘산으로의 산화의 반응식을 보여주는 도면이고;

도 2의 (a)는 CdSe(550 ㎚), CZ-QDs(580 ㎚) 및 MPA-QDs(580 ㎚)의 흡수 스펙트럼, (b)는 여기파장 480 ㎚에서 CdSe(560 ㎚), CZ-QDs(590 ㎚) 및 MPA-QDs(590 ㎚)의 방출 스펙트럼, (c)는 효소(GOD, HRP)와 QDs의 흡수 및 방출 스펙트럼의 중첩, 및 (d)는 UV 광 하에 CdSe(좌측) 및 CdSe/ZnS(우측)의 영상을 보여주는 도면이며;

도 3의 (a)는 상이한 양의 GOD(GOD = 10, 50, 100, 150, 200, 250 및 300 U)를 함유하는 Enz-QDs의 젤 전기영동의 사진 영상과 0.5 g/ℓ 글루코스 용액에서 여기파장 445 ㎚에서 고정된 양의 QDs(3.145 ㎎/㎖)와 HRP(10 U)를 이용한 방출 스펙트럼, 및 (b)는 상이한 농도의 QDs(QDs = 0.4309, 0.8622, 1.7254, 2.5872, 3.445 ㎎/㎖)에서 Enz-QDs의 젤 전기영동의 사진 영상과 0.5 g/ℓ 글루코스 용액에서 여기파장 445 ㎚에서 고정된 양의 GOD(200 U)와 HRP(10 U)를 이용한 방출 스펙트럼을 보여주는 도면이고;

도 4는 MPA-QDs 존재 및 부재 하에서 효소의 방출 스펙트럼(445 ㎚(ex)/525 ㎚(em))을 보여주는 도면이며;

도 5는 상이한 글루코스 농도 및 글루코스 용액에 첨가된 QDs/GOD/HRP의 상이한 부피비에서 QD-FRET-기초한 프로브의 형광강도 변화를 보여주는 도면이고;

도 6은 글루코스 측정 중 반응용액의 pH와 온도의 영향을 보여주는 도면이며;

도 7은 1 g/ℓ 글루코스 용액의 측정 중 MPA-QDs의 형광 방출에 대한 Fe³⁺ 이온의 영향을 보여주는 도면이다.

본 발명은 양자점(quantum dots; QDs)을 이용한 생물학적 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 카드뮴셀레나이드(CdSe) 코어에 황화아연(ZnS) 쉘을 입힌 QDs와 각종 산화효소(oxidases)의 바이오컨주게이트(bioconjugates), 상기 바이오컨주게이트가 고정화되어 있는 센싱막(sensing membranes), 상기 센싱막을 포함하는 생물학적 검출키트, 및 상기 검출키트를 이용한 생물학적 검출방법에 관한 것이다.

다양한 응용가능성을 가진 반도체 나노입자 QDs가 발명된 것은 1970년대로 거슬러 올라가지만, 이 물질을 생명과학 분야에 응용하기 시작한 것은 불과 4~5 년 정도이다. CdSe 코어에 ZnS 쉘을 입힌 QDs는 직경이 수 나노미터에서 수십 나노미터에 이르는 구형의 물질로서, 입자의 크기에 따라서 다른 파장의 형광을 방출하는 특징을 가지고 있어서 세포생물학과 같은 기초 생명과학 뿐 아니라 각종 단백질 칩 및 바이오센서 분야와 같은 응용 생명과학에도 다양하게 사용될 수 있다. 양자점은 UV에서 붉은색까지 어느 파장으로도 여기(excitation)가 가능하며, 조절가능한 좁은 방출 스펙트럼을 갖는다. 무기물이므로 화학반응에 안정하고 표면의 처리에 의하여 생체물질과의 결합이 용이하다. Jaiswal 등(문헌 [Jaiswal et al., Nature Biotechnology 21, 47-51, 2003])의 실험에서는, 아비딘 포접된 양자점에 바이오티닐화된 일차 항체를 붙여서 살아있는 세포의 영상을 관찰하였고, 음하전된 양자점에 양하전된 단백질 G-류신 지퍼 융합 단백질을 코팅하고 여기에 일차 항체를 붙여서 영상분석을 하였다. 이 실험에서 가장 의미있는 결과는 QDs를 이용하면 장시간에 걸친 레이저광의 조사에도 방출강도의 손실 없이 연속적으로 살아있는 세포의 영상을 얻을 수 있다는 사실이다. 이러한 특징들은 기존의 유기 형광물질(fluorophores)의 한계를 뛰어넘는 획기적 성질로서 향후 세포생물학 분야에서 활발히 이용될 것이 기대된다.

QDs는 광안정성이 우수하고 실시간으로 연속적인 모니터링이 가능하기 때문에 바이오센서 분야에서도 매력적인 물질이다. 그러나 소수성에서 친수성 형태로 전환되거나 다른 물질과 포접 시 광발광성 양자 수율이 상당히 감소되므로 바이오센서 분야에의 적용이 제한되어 왔다. 최근에는 QDs가 QDs(공여체)와 수용체 분자 사이의 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET)을 위한 전자 공여체로 사용되는 일부 표적 분석물에 대한 센서를 개발하는데 연구가 집중되고 있다. FRET 이외에도, QDs의 많은 장점은 방출 파장, 전압, 또는 형광강도의 변화를 기초로 하는 센서의 개발을 위해 이용되고 있다.

한편, 글루코스는 생물공학적 공정에서 미생물을 위한 중요한 영양원으로, 글루코스 농도의 측정은 다양한 식품 및 생물공학적 공정의 제어뿐만 아니라, 많은 대사성 장애의 진단, 특히 당뇨병의 진단 및 치료에 유용하다. 현재 글루코스의 검출을 위해 많은 방법들이 사용되어 왔지만, 아직 QDs를 이용한 글루코스 검출법은 개발되지 않았다.

본 발명자들은 CdSe 코어에 ZnS 쉘을 입힌 QDs를 바이오센서 분야에 효율적으로 적용하기 위해 지속적인 연구를 수행해온 결과, QDs를 친수성 계면활성제로 코팅한 후 각종 산화효소와 포접한 바이오컨주게이트가 글루코스를 비롯한 단당류, 다당류, 유기산 등의 여러 생물학적 물질의 검출에 효율적으로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 제1목적은 QDs와 산화효소의 바이오컨주게이트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제2목적은 상기 바이오컨주게이트가 고정화되어 있는 센싱막을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제3목적은 상기 센싱막을 포함하는 생물학적 검출키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제4목적은 상기 검출키트를 이용한 생물학적 검출방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제1면은 친수성 계면활성제로 코팅된, CdSe 코어에 ZnS 쉘을 입힌 QDs에 산화효소가 포접되어 있는 바이오컨주게이트에 관한 것이다. 상기 산화효소는 글루코스 옥시다아제(GOD), 락테이트 옥시다아제(LOD), 타이라민 옥시다아제(TOD), 콜레스테롤 옥시다아제, 콜린 옥시다아제, 알콜 옥시다아제, 아스코르브산 옥시다아제 및 크산틴 옥시다아제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 상기 친수성 계면활성제는 머캅토프로피온산(mercaptopropionic acid; MPA), 머캅토아세트산(mercaptoacetic acid; MAA), 머캅토석신산(mercaptosuccinic acid; MSA), 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT), 글루타티온(glutathione), 히스티딘(histidine) 또는 티올-함유 실란(thiol-containing silanes)인 것이 바람직하다. 본 발명의 바이오컨주게이트는 추가로 퍼옥시다아제, 특히 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP)와 포접될 수 있다.

본 발명의 제2면은 상기 바이오컨주게이트가 표면에 고정화되어 있는 센싱막에 관한 것이다. 본 발명에서, 고정화는 졸-겔(sol-gel) 법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 제3면은 상기 바이오컨주게이트 또는 상기 센싱막을 포함하는 생물학적 검출키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 단당류, 다당류, 유기산, 알콜, 콜레스테롤, 콜린, 크산틴 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질을 검출하기 위한 것일 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 바이오컨주게이트 또는 센싱막이 유리판, 폴리스티렌판 또는 마이크로타이터 플레이트 상에 형성되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 제4면은

1) 상기 검출키트에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하고,

2) 상기 반응으로부터 방출되는 형광강도를 측정하는:

단계를 포함하는, 생물학적 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에서는, Fe³⁺ 이온의 존재 하에서 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 형광강도는 광학적 방법에 의하거나 전기적 신호로 변화하여 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs를 이용한 생물학적 물질의 검출에 관한 것이다. 본 발명에서는, 글루코스, 락테이트, 타이라민, 아스코르브산 등을 포함한 단당류, 다당류 또는 유기산, 알콜, 콜레스테롤, 콜린, 크산틴 등을 감지하는데 친수성 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs을 사용한다. 본 발명의 대표적 일례에서는, QDs의 형광 감쇠(quenching)를 수용액 중 글루코스의 농도를 측정하기 위해 사용한다. 감쇠 과정은 QDs로부터 글루코스의 산화/환원 반응을 촉매하는 효소(글루코스 옥시다아제(GOD), 호스래디쉬퍼옥시다아제(HRP))로의 전자의 이동을 기초로 한다. QDs은 효소와 포접된 후 글루코스 용액에 직접 가해짐으로써 글루코스를 검출하는데 사용 될 수 있다. 도 1에 CdSe/ZnS 양자점(QDs)에 포접된 GOD/HRP를 이용한 글루코스의 글루콘산으로의 산화의 반응식을 나타내었다. 본 발명에서는 상기 화학적 변화에 의한 형강강도의 변화를 측정함으로써 글루코스를 검출하게 되는 바, 당업계에 통상적으로 알려져 있는 검출방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 광학적 방법을 이용하거나 전기적 신호로 변환하여 검출하는 방법 등을 이용할 수 있으나, 이들로 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 사용되는 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs는 기존의 합성방법을 변형하여 합성하고, 친수성 계면활성제(예: MPA, MAA, MSA, DTT, 글루타티온, 히스티딘, 티올-함유 실란 등)로 코팅할 수 있다. 코팅된 CdSe/ZnS QDs와 효소(예: GOD 및 HRP)를 혼합하여 포접체를 얻을 수 있다. 본 발명에서는, 산화효소로서 글루코스 옥시다아제(GOD), 락테이트 옥시다아제(LOD), 타이라민 옥시다아제(TOD), 콜레스테롤 옥시다아제, 콜린 옥시다아제, 알콜 옥시다아제, 아스코르브산 옥시다아제, 크산틴 옥시다아제 등을 사용할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 나아가, 한국출원 제10-2007-0014736호(이 출원의 내용은 전체로 본 출원에 참조로서 도입된다)에 개시된 바와 같이, 상기 효소와 QDs를 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 단독 또는 GPTMS와 메틸-트리에톡시실란(MTES) 또는 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS)의 혼합물로 이루어진 졸-겔 상에 고정화하여 센싱막을 제조할 수 있다. 졸-겔의 에폭시 그룹과 효소의 아민 그룹의 공유결합은 세척 시 효소가 제거되는 것을 방지하며, 센싱막의 높은 감도를 유지할 수 있게 한다.

효소 고정화나 유기물질과 생물질의 캡슐화에 적용된 졸-겔의 전형적인 특성 은 생물학적 물질 검출을 위한 센싱막의 감도와 안정성에 크게 기여한다. 졸-겔에서 실란의 혼합비율은 생물학적 물질의 농도를 검출하는 센싱막의 상이한 응답속도 등 상이한 특성을 초래하는 바, QDs의 고정화를 위해서는 GPTMS 및 MTES를 1:1~2, 특히 1:2의 부피비로 포함하는 것이 바람직하며, 효소 고정화를 위해서는 GPTMS 및 APTMS를 2~4:1, 특히 4:1의 부피비로 포함하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명에 따른 센싱막은 예를 들어 GPTMS 및 MTES를 1:1~2, 특히 1:2의 부피비로 포함하는 졸-겔 내에 고정화된 QDs, 및 GPTMS 및 APTMS를 2~4:1, 특히 4:1의 부피비로 포함하는 졸-겔 내에 고정화된 효소를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서는, 상기 바이오컨주게이트 또는 센싱막을 기판 상에 형성함으로써 생물학적 검출키트를 제조할 수 있으며, 기판으로는 당업계에 통상적으로 알려진 것들 중에서 선택하여 사용할 수 있는 바, 예를 들면 유리판, 폴리스티렌판, 마이크로타이터 플레이트 등을 사용할 수 있으나, 이들로 특별히 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.

제조예 1: CdSe/ZnS 코어-쉘 양자점(QDs)의 합성

CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs는 기존의 합성방법을 변형하여 합성하였다. 먼저, CdSe 나노입자를 Qu와 Peng(문헌 [L. Qu, X. Peng, J. Am. Chem. Soc. 124(2002) 2049-2051]), 및 Gaunt 등(문헌 J. A. Gaunt et al., J. Coll. Interf. Sci. 290(2005)]의 방법을 변형하여 합성하였다. 카드뮴 아세테이트 데하이드레이트(0.6 mM, 147 ㎎)와 스테아르산(2.13 mM, 607 ㎎)을 50 ㎖ 삼구 플라스크에 로딩하고, 무색 액체가 얻어질 때까지 150 ℃ 진공조건 하에서 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후 헥사데실아민(1.94 g)과 트리옥틸포스핀 옥사이드(trioctylphosphine oxide; TOPO)(2.2 g)를 플라스크에 가하였다. 그 후 혼합물은 펌프를 이용하여 탈기하고 진공 하에서 120~150 ℃로 가열하였다. 그 후 반응용기를 질소 가스로 충진시키고 310~320 ℃로 가열하고, 이 시점에서, 트리옥틸포스핀(trioctylphosphine; TOP)(2.5 ㎖)에 셀레늄(211 g)을 용해시킨 용액을 격렬하게 교반하면서 신속하게 주입하였다. 이 용액을 가열 맨틀로부터 플라스크를 제거하기 전 25 초 동안 가열한 후 실온으로 방냉하였다. 반응혼합물을 클로로포름에 용해시킨 후, 동일 부피의 메탄올로 침전시켜 생성된 CdSe 나노입자를 정제하였다. 다음 단계에서, 정제된 CdSe 입자를 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(CZ-QDs)를 합성하는데 사용하였다. 헥사데실아민(2 g)과 TOPO(2.5 g)의 혼합물을 50 ㎖ 삼구 플라스크에 로딩한 후 탈기하고 180 ℃로 가열하였다. 180 ℃에서 2 ㎖의 클로로포름에 분산된 정제 CdSe 입자를 이 용액에 가하였다. 펌프를 이용하여 클로로포름을 완전히 제거하고 플라스크에 질소 가스를 충진하고, 반응온도를 180~185 ℃로 상승시켰다. 1 ㎖ TOP에 용해된 아연아세테이트(54 ㎎)와 헥사메틸디실라티안(hexamethyldisilathiane; (TMS)₂S)(0.05 ㎖)의 혼합물을 5~10 분간 적가하였다. 적가 후, 혼합물을 180~185 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다.

제조예 2: 친수성 계면활성제 코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs의 합성

제조예 1에서 합성된 CZ-QDs를 기존의 방법을 약간 변형하여 머캅토프로피온산(MPA)으로 코팅하였다. TOP-TOPO-헥사데실아민 중 200 ㎎의 CZ-QDs를 각각 무수 클로로포름과 에탄올에 용해시키고 침전시켜 정제하였다. 습윤 침전물을 2 ㎖ N,N-디메틸포름아미드(DMF)와 0.25 ㎖ 3-머캅토프로피온산의 혼합물에 분산시켰다. 혼합물이 투명해질 때까지 약 30 분간 초음파 처리하여 실온에서 1 주간 저장하였다. 다음 단계에서, DMF에 용해된 0.5~0.7 ㎖ 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 가하고(50 ㎎ DMAP/1.0 ㎖ DMF) 용액을 5000 rpm에서 30 분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 침전물은 데시케이터에서 건조한 후 10 mM 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해하였다. 생성된 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)를 글루코스 검출에 사용하였다.

실시예 1: MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs와 산화효소의 바이오컨주게이트 합성

고정된 양의 효소를 각기 다른 부피의 MPA-QDs와 혼합하거나 다양한 양의 효소에 일정한 부피의 MPA-QDs를 가하였다. 이들의 포접과 상호작용의 평가를 배양 3~24 시간 후에 수행하고 MPA-QDs와 효소의 포접을 전기영동(2% 아가로스)에 의해 측정하였다. 100 V의 전압을 1 시간 동안 젤에 걸어주었다. GOD-포접 또는 -비포접 MPA-QDs의 효소활성을 0.5 g/ℓ 글루코스 존재 하에서 퍼옥시다아제 기질로서 디암모늄 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설포네이트)(ABTS)를 사용하여 측정하였다. 이 기질은 녹색을 띠고 405 ㎚에서 분광학적으로 판독될 수 있는 수용성 최종산물을 생성한다(반응식 1 참조). 마이크로타이터 플레이트 리더(Wallac Victor 2, Perkin-Elmer Co. USA)를 흡광도 측정에 사용하였다.

[반응식 1]

H₂O₂ + 환원된 ABTS ---(HRP)---> H₂O + 0.5O₂ + 산화된 ABTS

실시예 2: QDs의 광학 특성 측정

CdSe 나노입자, MPA-QDs 및 효소-포접된 MPA-QDs의 흡수 및 방출 스펙트럼을 멀티스캔 스펙트럼(Multiskan spectrum)(Thermo electron corporation, 핀란드)과 형광 스펙트로포토미터(모델: F-4500, Hitachi Co., 일본)를 사용하여 측정하였다.

CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs는 양자 수율(QY)이 64%, 입자크기가 2~4.5 ㎚일 때 형광강도가 가장 높았다. 도 2(a)는 CdSe 입자, CZ-QDs 및 MPA-QDs의 흡수 스펙트럼을 보여주는 것이다. 이들의 광범위한 흡수 스펙트럼은 단일 광원으로 여러 QD-기초한 형광물질의 효율적인 여기를 가능하게 한다. 즉, 마이크로플레이트 리더의 방출 필터를 이용한 용이한 조절과 수용체를 직접 여기시키지 않는 단파장에서의 여기가 가능하다. 도 2(b)에서, QDs(예: MPA-QDs)의 방출 파장은 40 ㎚의 FWHM(최 대 방출 스펙트럼의 1/2에서의 전체 폭)에서 590 ㎚이고, 이것은 GOD와 HRP의 흡수 밴드와 중첩된다(도 2(c)). 이러한 특성은 QDs로부터 효소로의 전자 이동을 통해 글루코스 검출을 위한 QDs의 사용에 이용되었다. 표면에 카르복실기(MPA)를 덮은 후 QDs의 양자 수율은 초기값의 약 50%로 감소되었다.

MPA-QDs와 효소(HRP 및 GOD)의 2차원 형광 스펙트럼에서 260~320 ㎚/445 ㎚의 여기 파장과 280~450 ㎚/525 ㎚의 방출 파장에서 효소의 형광강도가 변화하는 것을 관찰하였다(결과 미도시). 반면에 QDs의 형광강도는 280~550 ㎚ 여기 및 580~610 ㎚ 방출 파장에서 변화하였다. 즉, QDs와 효소의 형광강도는 그들의 포접 및 상호작용, 활성 및 관련된 각 성분의 양에 의해 변화한다.

QDs와 효소의 분명한 결합이 도 3의 사진 영상에서 관찰되었다. 효소의 아민 그룹은 QDs의 표면의 카르복실 그룹과 쉽게 결합한다. 효소와 포접한 후, QDs의 크기는 증가하고, GOD의 양이 증가할수록 QD 표면의 결합 위치에 결합된 효소의 양이 증가하였다(도 3(a) 참조). 젤 플레이트에서 효소와 결합한 QDs는 MPA-QDs가 더 소량 포함된 효소-포접 MPA-QDs(Enz-QDs)보다 느리게 이동하였다. 그러므로 젤에서의 이동거리는 GOD를 소량 포함한 MPA-QDs보다 약간 짧았다. 일정한 양의 효소와 혼합되는 QD 농도가 증가할 때 동일한 경향이 나타나, 더 많은 양자점이 효소와 포접되고 그들의 이동이 더 느렸다. 사진에서, QDs의 밴드는 QDs가 염기성 조건에서 응집하여 단지 소량의 QDs만이 양극으로 이동하기 때문에 분명하지 않았고, 효소나 QDs 양의 변화는 효소와 QDs의 형광강도의 변화를 초래하였다. 도 3(a)는 GOD의 양이 증가할 때 590 ㎚의 방출파장에서 QDs의 형광감쇠를 보여주고 있다. 또한, 효소는 여기된 QDs로부터 에너지를 받을 수 있으며, 그들의 형광강도가 증가한다. 효소의 형광강도 증가는 또한 525 ㎚의 방출파장에서 관찰되었다. 이러한 현상은 효소의 양 증가와 QDs로부터 효소로의 형광 공명 에너지 전이(FRET)와 관련되어 있다. 상이한 농도의 QDs와 포접된 일정한 양의 GOD의 사용은 효소 포접된 QDs에 비해, 효소의 형광강도를 증가시키며 QDs의 형광강도는 감소시키므로, FRET는 도 3(b)에도 나타나 있다.

실시예 3: 효소활성에 대한 MPA-QDs의 영향 평가

160,000 Da의 구조적으로 견고한 당단백질인 GOD는 43 Å의 유체역학적 반경을 가지고 두개의 동일한 폴리펩타이드 사슬로 구성되어 있다. GOD의 견고한 특성은 친수성 외피를 형성하는 다당류로부터 유래한다. 전자가 산화환원 효소와 글루코스의 O₂-생촉매된 산화 시 생성된 전기화학적으로 환원된 형태의 H₂O₂ 사이에서 이동하면, 기질(예: 글루코스, H₂O₂, O₂)과 생촉매(GOD 및 HRP)는 물론, QDs와 효소 사이의 전자 교환의 전환율(turnover rate)은 신속하게 증가된다. 따라서 감쇠된 형광물질과 관련된 QDs의 전달된 물리적 에너지는 시스템에서 기질의 농도를 반영한다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 효소의 형광 방출과 활성은 MPA-QDs와 포접된 후 상당히 변화된다. GOD와 HRP를 MPA-QDs와 함께 3 또는 12 시간 배양 후, ex: 445 ㎚/em: 525 ㎚에서의 형광강도는 각각 원래 값의 약 30% 또는 43% 증가하였다. GOD만을 MPA-QDs와 함께 3 또는 12 시간 배양한 경우, GOD의 형광강도는 각각 원래 값의 20% 또는 41%로 신속하게 감소하였다. 이것은 활성을 보유한 효소가 여기된 QDs로부터 다량의 에너지를 받아, 그들의 형광 방출이 원래 효소의 것 보다 강력해지는 반면, MPA-QDs 표면의 관능기가 효소활성을 저해함을 의미한다. 또한, MPA-QDs의 형광 방출은 장시간 배양 후 감소되었다(결과 미도시).

실시예 4: 글루코스 농도 측정

글루코스를 MPA-QDs, GOD와 HRP을 이용하여 측정하였다. 효소(GOD, HRP)와 MPA-QDs를 다양한 농도의 글루코스 용액 100 ㎕가 분주된 마이크로타이터 플레이트 웰에 가하였다. 10:10:10, 10:5:5 및 10:5:0(㎕/웰) 비율의 MPA-QDs, GOD 및 HRP의 혼합물을 사용하였다. 그 후 마이크로타이터 플레이트를 즉시 플레이트 리더의 측정 챔버 내부로 삽입하고, 485/525 ㎚의 여기/방출 파장에서 형광강도를 3 분 간격으로 40회 측정하였다.

상기한 바와 같이, 효소, 특히 산화환원 효소의 직접적인 전기적 활성화는 효소 기질의 생전기촉매된 산화(또는 환원)의 자극을 위한 일반적인 접근법이다. 도 5는 다양한 농도의 글루코스에 노출한 후 QD-FRET-기초한 프로브의 출력신호에 대한 글루코스 용액 중 MPA-QDs, GOD 및 HRP의 부피비와 효소와 MPA-QDs 사이의 비율의 영향을 보여준다. QDs, GOD 및 HRP의 부피비가 10/10/10일 때, 낮은 글루코스 농도에서 형광강도가 크게 변하였으며 R값이 0.990인 0~1.0 g/ℓ의 선형 농도구간에서 감도(기울기)가 매우 높았다(S=-11360). QDs, GOD 및 HRP의 부피비가 10/10/5, 10/5/3 또는 10/5/0에서 사용된 HRP의 양이 감소함에 따라 QD-FRET-기초한 프로브의 감도나 반응효율은 감소하였다. 게다가 낮은 글루코스 농도(0.2~1.0 g/ℓ)에서 HRP 양의 감소에 따라 형광강도도 감소하였다. 즉, 글루코스의 선형 검출구간은 QDs/GOD/HRP의 부피비가 10/5/5일 때 0~5.0 g/ℓ(R=0.992), 부피비 10/5/3일 때 0.2~5.0 g/ℓ(R=0.985), 부피비가 10/5/0일 때 0~5.0 g/ℓ(R=0.982)였다. 여기된 QDs로부터 과산화수소(H₂O₂) 환원반응으로의 전자 전달의 경로가 억제되거나 방지되었다. 따라서 전자 수 감소는 전자 교환의 전환율 감소를 일으켜, QDs의 낮은 광발광 감쇠와 글루코스에 대한 낮은 감도를 나타낸다.

신호 안정성을 얻기 위한 QD-FRET-기초한 프로브의 반응시간은 30 분이었다. 이전의 연구에서 개발한 다른 글루코스 검출 시스템보다 반응시간은 느리지만 본 시스템은 기존의 시스템과 제조와 작동방식이 다르기 때문에 비교하기가 어렵다. 본 프로브의 늦은 응답시간은 유리(free) 환경에서 분자의 낮은 확산속도 때문일 수 있으며, 반응에서 성분의 이질성을 초래한다. 하지만 이것은 용액 상에서 글루코스를 검출하는데 있어서 QD-FRET-기초한 프로브로 사용하기 위한 QDs의 잠재력을 증명한다. 글루코스 검출에서 느린 응답시간과 QDs와 효소의 혼합용액의 안정성은 GPTMS와 APTMS의 졸-겔 층으로 효소와 MPA-QDs를 고정화하여 향상시킬 수 있었다.

실시예 5: 졸-겔 법에 의한 센싱막의 제조

한국출원 제10-2007-0014736호에 기재된 방법에 따라, 졸-겔 법을 이용하여 센싱막을 제조하였다. 즉, GPTMS와 MTES를 1:2의 부피비로 포함하는 혼합물(GM2)과 GPTMS와 APTMS를 4:1의 부피비로 포함하는 혼합물(GA2)을 각각 99% 에탄올에 혼합하여 졸-겔을 제조하였다. 혼합용액에 35% HCl을 40 ㎕/㎖의 부피로 첨가하였다. HCl 첨가 후, 졸-겔은 다음 단계에서 사용되기 전 최소 2 시간 동안 실온에서 보관하였다.

200 ㎕의 졸-겔 GM2에 제조예 2에서 합성된 MPA-코팅된 QDs 50 ㎕를 첨가하여 트랜스듀서를 제조하였다. MPA-코팅된 QDs와 졸-겔의 혼합물을 기계적 교반에 의해 완전히 혼합한 후, 2 시간 동안 실온에서 저장하였다. 5 ㎕ MPA-코팅된 QDs 혼합물을 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 바닥면에 분주하여 95 ℃에서 18 시간 동안 건조시켰다. 열처리 후, 트랜스듀서 상에 졸-겔 GA2를 가하고 그 위에 40 ㎕의 효소 용액(GOD: 100 유닛, LOD: 1 유닛, 또는 TOD: 0.005 유닛)을 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 가하였다. 효소를 18 시간 동안 실온에서 고정화하였다.

실시예 6: pH와 온도의 영향 평가

글루코스 검출에 대한 pH와 온도의 영향을 GOD, HRP 및 MPA-QDs의 혼합물을 사용하여 조사하였다. 본 실시예에서 사용한 일반(universal) 완충용액은 0.1 M Na₂SO₄, 0.04 M NaOAc, 0.04 M H₃BO₃ 및 0.04 M NaH₂PO₄를 함유하는 것으로, 완충용액의 pH를 pH 미터(Metrohm Co., 스위스)를 이용하여 pH 4~11로 3 N NaOH와 3 M HCl 을 사용하여 조정하였다. 주어진 pH에서 일반 완충용액에서 제조된 100 ㎕의 글루코스 용액(1 g/ℓ)과 20 ㎕의 GOD, HRP 및 MPA-QDs 혼합용액을 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에 분주하고 형광강도를 측정하였다. 측정에 대한 온도의 간섭(interference) 효과를 조사하기 위해, 1.0 g/ℓ의 글루코스 농도에서 반응 혼합용액 120 ㎕를 23~37 ℃에서 배양한 후 485/525 ㎚의 여기/방출 파장에서 형광강도를 측정하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 온도와 pH는 글루코스 측정에 약간만 영향을 미쳤다. 형광강도의 변화는 낮은 pH(4~5) 또는 높은 pH(11)에서 다르게 나타났다. 비록 낮은 pH 또는 높은 pH에서의 형광강도가 중성 pH에서보다 높더라도, QD 나노입자는 강한 산이나 염기 조건에서 응집되고 침전되기 때문에 사용할 수 없다. QD의 형광강도에 대한 pH의 영향을 다루었던 기존 논문의 연구에서 pH 8~11.5의 범위에서 pH가 증가함에 따라 형광강도도 증가한다는 결과를 바탕으로, 이러한 pH 범위를 용액 특성의 변화에 대한 MPA-QDs의 안정성 영역으로 사용할 수 있다. 6~10의 pH 범위가 측정을 위한 안정한 환경이다. 또한 온도 증가는 반응시간의 감소를 초래한다. 실제로 반응시간은 26 ℃ 이상의 온도에서 60% 이상 감소하였다. 그러나 26 ℃ 이상의 온도에서 QDs의 자가형광 감쇠현상 때문에 형광강도가 급속히 감소하며 29~37 ℃의 온도에서는 형광강도의 큰 차이가 없었다.

실시예 7: 간섭 연구

본 실시예에서는 다양한 이온(NH₄ ⁺, NO₃ ^-, Na⁺, Cl^-, CO₃ ^2-, Fe³⁺)의 영향을 알아보고자 하였으며, 사용한 이온의 농도 범위는 0.01~200 mM이었다. 100 ㎕ 이온 용액을 마이크로타이터 웰에 가하고 10 g/ℓ 글루코스와 혼합하여 1 g/ℓ의 최종 글루코스 농도를 얻었다. 상이한 농도의 각 이온 용액을 대조 샘플(이온이 없는)과 함께 복수측정 형태로 마이크로타이터 플레이트 상에 준비하였다. 그 후, 상이한 이온 농도에서 1 g/ℓ 글루코스 용액을 함유하는 각 웰에 20 ㎕ MPA-QDs를 가하여 형광강도를 측정하였다. 효소 혼합물(GOD/HRP: 각각 30 U/3 U)을 이러한 샘플에 가하고 두 번째로 형광강도를 측정하였다. 효소 첨가 전후의 샘플과 대조 샘플의 형광 차이를 인스타트(Instat) 소프트웨어를 이용하여 ANOVA에 의해 통계학적으로 처리하였다.

시험된 0.01~200 mM 농도 범위의 NH₄ ⁺, NO₃ ^-, Na⁺, Cl^-, CO₃ ^2-, Fe³⁺와 같은 다양한 이온들은 글루코스 반응에 참여한 MPA-QDs의 형광강도에 큰 영향을 미치지 않았다. 그러나 이러한 이온들은 효소 첨가 전후의 글루코스 샘플과 대조 샘플의 형광강도를 비교하였을 때, p값이 0.05보다 크게 측정되었다. 200 mM의 CO₃ ^2-이온은 글루코스 첨가 전 MPA-QDs의 형광강도에 미세한 영향을 주었고, 표 1에 나타낸 바와 같이, Fe³⁺ 이온은 글루코스 산화반응에서 MPA-QDs의 형광 방출에 많은 영향을 미침을 알 수 있었다.

이온 (mM)	CO₃ ² ^-		Fe³ ⁺
이온 (mM)	무 효소	효소	무 효소	효소
0.01	ns	ns	ns	ns
0.1	ns	ns	*	ns
0.5	ns	ns	***	***
1.0	ns	ns	***	***
10	ns	ns	***	ns
50	ns	ns	***	**
100	ns	ns	***	***
200	*	ns	***	***

(ns: 유의성 없음, *P<0.05: **P<0.01: ***P<0.001)

글루코스 용액에 효소를 첨가하기 전에, MPA-QDs의 형광 방출은 0.1 mM의 Fe³⁺이온 농도에서 감쇠되었고 0.5 mM 이상의 농도에서 강한 형광감쇠가 발생하였다(도 7). 효소 첨가 후, 낮은 농도(0.5 mM 및 1.0 mM)의 Fe³⁺이온에서 형광강도가 감소하였다. 이론상, Fe³⁺ 이온은 적절한 산화 잠재력을 가진 매개물질로 작용하여 글루코스 산화반응 시 산소를 대체한다. 그러므로 효소 첨가 후 응답신호는 매우 빠르며 높은 Fe³⁺의 이온농도에서 효소 첨가 전의 10배에 이르는 형광강도가 측정되었다.

본 발명에 따르면, 친수성 계면활성제로 코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs는 산화효소와 포접할 수 있으며 이웃하는 분자간 에너지 전이 특성을 가지므로, 바이오센서 분야에서 폭넓게 적용될 수 있으며, 특히 글루코스를 넓은 농도범위에서 효율적으로 검출할 수 있는 것으로 나타났다.

Claims

친수성 계면활성제로 코팅된, 카드뮴셀레나이드(CdSe) 코어에 황화아연(ZnS) 쉘을 입힌 양자점(quantum dots; QDs)에 산화효소(oxidases)가 포접되어 있는, 단당류, 다당류, 유기산, 알콜, 콜레스테롤, 콜린, 크산틴 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질을 검출하기 위한 바이오컨주게이트(bioconjugates).
제1항에 있어서, 산화효소가 글루코스 옥시다아제, 락테이트 옥시다아제, 타이라민 옥시다아제, 콜레스테롤 옥시다아제, 콜린 옥시다아제, 알콜 옥시다아제, 아스코르브산 옥시다아제 및 크산틴 옥시다아제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 바이오컨주게이트.
제1항에 있어서, 추가로 퍼옥시다아제가 포접되어 있는 바이오컨주게이트.
제3항에 있어서, 양자점, 산화효소 및 퍼옥시다아제의 부피비가 1:1:1인 바이오컨주게이트.
제1항에 있어서, 친수성 계면활성제가 머캅토프로피온산, 머캅토아세트산, 머캅토석신산, 디티오트레이톨, 글루타티온, 히스티딘 또는 티올-함유 실란인 바이오컨주게이트.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 바이오컨주게이트가 표면에 고정화되어 있는 센싱막(sensing membrane).
제6항에 있어서, 졸-겔(sol-gel) 법에 의해 고정화되어 있는 센싱막.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 바이오컨주게이트, 또는 상기 바이오컨주게이트가 표면에 고정화되어 있는 센싱막을 포함하는 생물학적 검출키트.
삭제
제8항에 있어서, 바이오컨주게이트 또는 센싱막이 유리판, 폴리스티렌판 또는 마이크로타이터 플레이트 상에 형성되어 있는 키트.
1) 제8항에 따른 검출키트에 생물학적 시료를 주입하여 반응을 수행하고,

2) 상기 반응으로부터 방출되는 형광강도를 측정하는:

단계를 포함하는, 생물학적 검출방법.
제11항에 있어서, Fe³⁺ 이온의 존재 하에 반응을 수행하는 생물학적 검출방 법.
제11항에 있어서, 단계 2)에서 형광강도를 광학적 방법에 의하거나 전기적 신호로 변환하여 측정하는 방법.