KR101053473B1 - 양자점을 이용한 스테로이드 호르몬 검출 키트 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 양자점을 이용한 스테로이드 호르몬 검출에 관한 것으로, 보다 상세하게는 나노입자에 징크설파이드(ZnS) 쉘을 코팅한 양자점과 스테로이드 호르몬 항체가 포접되어 있는 면역반응 측정용 담체, 상기 면역반응 측정용 담체가 고정화되어 있는 센싱막, 상기 센싱막을 포함하는 생물학적 검출키트 및 상기 검출키트를 이용한 생물학적 검출방법에 관한 것으로서, 유기 형광물질에 비해 여러 장점을 갖는 양자점을 이용하여 기존의 스테로이드 분석 방법에 비해 검출 감도가 향상될 뿐만 아니라 생체 내 특정 인자를 검출하는 바이오센서 분야에서 폭넓게 적용될 수 있을 것이다.
양자점, 스테로이드 호르몬, 담체, 센싱막, 키트

Description

양자점을 이용한 스테로이드 호르몬 검출 키트 및 방법{Kits and methods for steroid hormone detection using quantum dots}
본 발명은 양자점을 이용한 스테로이드 호르몬 검출에 관한 것으로, 보다 상세하게는 나노입자에 징크설파이드(ZnS) 쉘을 코팅한 양자점과 스테로이드 호르몬 항체가 포접되어 있는 면역반응 측정용 담체, 상기 면역반응 측정용 담체가 고정화되어 있는 센싱막, 상기 센싱막을 포함하는 생물학적 검출키트 및 상기 검출키트를 이용한 생물학적 검출방법에 관한 것이다.
다양한 응용가능성을 가진 반도체 나노입자 양자점(quantum dots;QDs)이 발명된 것은 1970년대로 거슬러 올라가지만, 이 물질을 생명 과학 분야에 응용하기 시작한 것은 불과 4~5 년 정도이다. 카드뮴셀레나이드(CdSe) 코어에 징크설파이드(ZnS)쉘을 입힌 양자점(quantum dots;QDs)은 직경이 수 나노미터에서 수십 나노미터에 이르는 구형의 물질로서, 입자의 크기에 따라서 다른 파장의 형광을 방출하는 특징을가지고 있어서 세포생물학과 같은 기초 생명과학 뿐 아니라 각종 단백질 칩 및 바이오센서 분야와 같은 응용 생명과학에도 다양하게 사용될 수 있다. 양자점은 UV에서 붉은색까지 어느 파장으로도 여기(excitation)가 가능하며, 조절 가능 한 좁은 방출 스펙트럼을 갖는다. 무기물이므로 화학반응에 안정하고 표면의 처리에 의하여 생체물질과의 결합이 용이하다. Jaiswal 등(문헌 [Jaiswal et al., Nature Biotechnology 21, 47-51, 2003])의 실험에서는, 아비딘 포접된 양자점에 바이오티닐화된 일차 항체를 붙여서 살아있는 세포의 영상을 관찰하였고, 음하전된 양자점에 양하전된 단백질 G-류신 지퍼 융합 단백질을 코팅하고 여기에 일차 항체를 붙여서 영상분석을 하였다. 이 실험에서 가장 의미 있는 결과는 양자점을 이용하면, 장시간에 걸친 레이저광의 조사에도 방출강도의 손실 없이 연속적으로 살아있는 세포의 영상을 얻을 수 있다는 사실이다. 이러한 특징들은 기존의 유기 형광물질(fluorophores)의 한계를 뛰어넘는 획기적 성질로서 향후 세포생물학 분야에서 활발히 이용될 것이 기대된다.
양자점은 광안정성이 우수하고 실시간으로 연속적인 모니터링이 가능하기 때문에 바이오센서 분야에서도 매력적인 물질이다. 그러나 소수성에서 친수성 형태로 전환되거나 다른 물질과 포접 시 광발광성 양자 수율이 상당히 감소되므로 바이오센서 분야에의 적용이 제한되어 왔다. 최근에는 양자점이 양자점과 수용체 분자 사이의 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET)을 위한 전자 공여체로 사용되는 일부 표적 분석물에 대한 센서를 개발하는데 연구가 집중되고 있다. 형광 공명 에너지 전이 이외에도, 양자점의 많은 장점은 방출 파장, 전압, 또는 형광강도의 변화를 기초로 하는 센서의 개발을 위해 이용되고 있다.
한편, 스테로이드 호르몬은 보통 부신피질·정소·난소·태반·황체에서 분비된다. 세부적으로, 안드로겐(안드로스테론·테스토스테론 등)은 정소에서 만들어 지며 남성의 2차 성징을 유지한다. 에스트로겐(에스트라디올 등)은 여포에서 생성되며 여성의 2차 성징을 유지에 관여하며, 혈액으로 분비되는 양에 따라서 동물은 발정기 또는 비발정기에 속하게 되는데 발정기에는 자궁과 여성의 다른 생식관 부위가 발달한다. 프로게스테론은 난소의 황체에서 분비되고, 자궁에서 임신이 되도록 하고 임신을 유지한다. 당질코르티코이드는 부실피질에서 생산되며 단백질을 포도당과 간의 글리코겐으로 전환시키는 기능을 하며, 홍채염(虹彩炎)이나 관절염과 같은 여러 염증의 통증을 덜어주는 역할을 한다. 무기질코르티코이드는 생체에 있어 전해질과 수분의 균형 유지의 기능을 한다. 이처럼, 스테로이드 호르몬은 신체의 생리활성에 중요한 역할을 하는데 이들의 생체 내 분비량에 따라 질환이 발생하기도 한다. 스테로이드 호르몬에 관련된 질환을 알기 위해서는 생체 내에서 분비되는 스테로이드 호르몬의 양을 측정해야하는데 기존의 검출 방법들은 방사선동위원소를 이용한 방사선 면역측정법(RIA)와 효소면역측정법(ELISA)의 문제점인 낮은 검출 감도(sensitivity)와 분석 시간이 길고, 방사선을 사용해야 하는 이용의 불편함이 있다. 현재 스테로이드 호르몬의 검출을 위해 많은 방법들이 사용되어 왔지만, 아직 양자점을 이용한 스테로이드 호르몬 검출법은 개발되지 않았다.
본 발명은 상기 양자점을 이용한 호르몬 검출법을 지속적인 연구를 수행한 결과 나노입자에 징크설파이드(ZnS) 쉘을 코팅한 양자점을 친수성 계면 활성제로 코팅한 후 스테로이드 호르몬 항체가 포접되어 있는 면역반응 측정용 담체가 검출감도가 좋으면서 분석시간이 짧아 여러 생물학적 물질의 검출에 효율적으로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 이르렀다.
본 발명의 목적은 나노입자에 징크설파이드(ZnS) 쉘을 코팅한 양자점(quantum dots;QDs)과 스테로이드 호르몬 항체가 포접되어 있는 면역반응 측정용 담체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 상기 면역반응 측정용 담체가 고정화 되어있는 센싱막을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 상기 센싱막을 포함하는 생물학적 검출 키트 및 상기 검출키트를 이용한 생물학적 검출방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 친수성 계면활성제로 코팅된, 나노입자에 징크설파이드(ZnS) 쉘을 코팅한 양자점(quantum dots;QDs)과 스테로이드 호르몬 항체가 포접되어 있는 면역반응 측정용 담체를 제공한다.
상기 나노입자는 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴텔로리움(CdTe), 징크텔로리움(ZnTe), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크옥사이드(ZnO), 머큐리텔로리움(HgTe), 및 머큐리셀레나이드(HgSe)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 상기 친수성 계면활성제는 N-메틸프로피온아마이드, N-메틸아세트아마이드, 메탄설폰산, 디티오트레이톨, 글루타티온, 히스티딘 또는 티올-함유 실란인 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 면역반응 측정용 담체가 표면에 고정화되어 있는 센싱막을 제공한다. 본 발명에서 고정화는 졸-겔(sol-gel)법에 의해 수행된다.
본 발명은 상기 센싱막을 포함하는 생물학적 검출 키트 및 상기 검출키트를 이용한 생물학적 검출방법을 제공한다. 본 발명의 키트는 테스테로테론, 프로게스테론, 에스트로겐, 안드로스테론, 당질코르티고이드 및 무기질코르티코이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 주입한 반응으로부터 발산되는 형광강도를 측정한다
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 나노입자에 징크설파이드(ZnS) 쉘을 코팅한 양자점(quantum dots;QDs)과 스테로이드 호르몬 항체가 포접되어 있는 면역반응 측정용 담체를 제공하는 것으로 상기 나노입자는 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴텔로리움(CdTe), 징크텔로리움(ZnTe), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크옥사이드(ZnO), 머큐리텔로리움(HgTe), 및 머큐리셀레나이드(HgSe)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어 본 발명에 사용되는 CdSe/ZnS 코어-쉘 양자점은 Qu와 Peng(문헌 [L. Qu, X. Peng, J. Am. Chem. Soc. 124(2002) 2049-2051]), 및 Gaunt 등(문헌 J. A. Gaunt et al., J. Coll. Interf. Sci. 290(2005)]의 기존의 카드뮴셀레나이드(CdSe)입자를 변성하여 합성하고, 친수성 계면활성제 즉, N-메틸프로피온아마이 드, N-메틸아세트아마이드, 메탄설폰산, 디티오트레이톨, 글루타티온, 히스티딘 또는 티올-함유 실란 등으로 코팅할 수 있다. 상기 코팅된 코팅된 CdSe/ZnS 양자점과 스테로이드 호르몬 항체를 혼합하여 면역반응 측정용 담체를 얻는다.
상기 스테로이드 호르몬 항체는 테스테로테론 항체, 프로게스테론 항체, 에스트로겐 항체, 안드로스테론 항체, 당질코르티고이드 항체 및 무기질코르티코이드 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것으로 이들로 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 양자점과 스테로이드 호르몬 항체와의 혼합비는 1 : 0.001 내지 1, 특히 1: 0.01인 것이 바람직하며, 이는 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), N-하이드록시숙신이미드(NHS)의 존재하에 화학적으로 가교된다.
상기 양자점은 1 내지 15nm 크기인 것으로, 가장 바람직하게는 2 내지 4.5nm일 때 높은 감도를 유지할 수 있게 한다. 나아가, 한국출원 제10-2007-0014736호(이 출원의 내용은 전체로 본 출원에 참조로서 도입된다)에 개시된 바와 같이, 상기 스테로이드 호르몬 항체와 양자점을 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS) 단독 또는 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS)와 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS)의 혼합물로 이루어진 졸-겔 상에 고정화하여 센싱막을 제조할 수 있다. 졸-겔의 에폭시 그룹과 효소의 아민 그룹의 공유결합은 세척 시 스테로이드 호르몬 항체가 제거되는 것을 방지하며, 센싱막의 높은 감도를 유지할 수 있게 한다.
스테로이드 호르몬 항체 고정화나 유기물질과 생물질의 캡슐화에 적용된 졸- 겔의 전형적인 특성은 생물학적 물질 검출을 위한 센싱막의 감도와 안정성에 크게 기여한다. 졸-겔에서 상기 실란의 혼합비율은 생물학적 물질의 농도를 검출하는 센싱막 의 상이한 응답속도 등 상이한 특성을 초래하는 바, 본 발명의 면역반응 측정용 담체의 고정화를 위해서는 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS)를 2 내지 4:1, 특히 2:1의 부피비로 포함하며, 상기 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS)은 0.1 내지 1% 글루타르알데히드(Glutaraldehyde), 더욱 바람직하게는 0.1%로 활성화된 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS)이다.
본 발명에서는, 상기 면역반응 측정용 담체 또는 센싱막을 지지체 상에 형성함으로써, 생물학적 검출키트를 제조할 수 있으며 상기 검출키트는 테스테로테론, 프로게스테론, 에스트로겐, 안드로스테론, 당질코르티고이드 및 무기질코르티코이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 주입한 반응으로부터 발산되는 형광강도를 측정하며, 상기 지지체는 당업계에 통상적으로 알려진 것들 중에서 선택하여 사용할 수 있는 바, 예를 들면 유리판, 폴리스티렌판, 마이크로타이터 플레이트 등을 사용할 수 있으나, 이들로 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 친수성 계면활성제로 코팅된 면역반응 측정용 담체는 생체 내 분비되는 스테로이드 호르몬을 빠른 시간에 검출할 수 있어 기존의 스테로이드 분석 방법에 비해 검출 감도가 향상될 뿐만 아니라 생체 내 특정 인자를 검출하는 바이오센서 분야에서 폭넓게 적용될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.
이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.
또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
[제조예 1] CdSe/ZnS 코어-쉘 양자점(QDs)의 합성
CdSe/ZnS 코어-쉘 양자점은 기존의 합성방법을 변형하여 합성하였다. 먼저, 카드뮴셀레나이드(CdSe) 나노입자를 Qu와 Peng(문헌 [L. Qu, X. Peng, J. Am. Chem. Soc. 124(2002) 2049-2051]), 및 Gaunt 등(문헌 J. A. Gaunt et al., J. Coll. Interf. Sci. 290(2005)]의 방법을 변형하여 합성하였다. 카드뮴 아세테이트 데하이드레이트(0.6mM, 147㎎)와 스테아르산(2.13mM, 607㎎)을 50㎖ 삼구 플라스크에 로딩하고, 무색 액체가 얻어질 때까지 150℃ 진공조건하에서 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후 헥사데실아민(1.94g)과 트리옥틸포스핀 옥사이드(trioctylphosphine oxide; TOPO)(2.2g)를 플라스크에 가하였다. 그 후 혼합물은 펌프를 이용하여 탈기하고 진공 하에서 120 내지 150℃로 가열하였다. 그 후 반응 용기를 질소 가스로 충진시키고 310 내지 320℃로 가열하고, 이 시점에서, 트리옥틸포스핀(trioctylphosphine; TOP)(2.5㎖)에 셀레늄(211g)을 용해시킨 용액을 격렬하게 교반하면서 신속하게 주입하였다. 이 용액을 가열 맨틀로부터 플라스크를 제거하기 전 25초 동안 가열한 후 실온으로 방냉하였다. 반응혼합물을 클로로포름에 용해시킨 후, 동일 부피의 메탄올로 침전시켜 생성된 카드뮴셀레나이드(CdSe) 나노 입자를 정제하였다. 다음 단계에서, 정제된 카드뮴셀레나이드(CdSe) 입자를 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(CZ-QDs)를 합성하는데 사용하였다. 헥사데실아민(2g)과 TOPO(2.5g)의 혼합물을 50㎖ 삼구 플라스크에 로딩한 후 탈기하고 180℃로 가열하였다. 180℃에서 2㎖의 클로로포름에 분산된 정제 카드뮴셀레나이드(CdSe) 입자를 이 용액에 가하였다. 펌프를 이용하여 클로로포름을 완전히 제거하고 플라스크에 질소 가스를 충진하고, 반응온도를 180 내지 185℃로 상승시켰다. 1㎖ TOP에 용해된 아연아세테이트(54㎎)와 헥사메틸디실라티안(hexamethyldisilathiane, 0.05㎖)의 혼합물을 5 내지 10 분간 적가하였다. 적가 후, 혼합물을 180 내지 185℃에서 1 시간 동안 교반하여 CZ-QDs를 합성하였다.
[제조예 2] 친수성 계면활성제 코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs의 합성
상기 제조예 1에서 합성된 CdSe/ZnS 코어-쉘 양자점을 기존의 방법을 약간 변형하여 N-메틸프로피온아마이드(MPA)으로 코팅하였다. TOP-TOPO-헥사데실아민 중 200㎎의 CdSe/ZnS 코어-쉘 양자점을 각각 무수 클로로포름과 에탄올에 용해시키고 침전시켜 정제하였다. 습윤 침전물을 2㎖ N,N-디메틸포름아미드(DMF)와 0.25㎖ N-메틸프로피온아마이드의 혼합물에 분산시켰다. 혼합물이 투명해질 때까지 약 30분 간 초음파 처리하여 실온에서 1 주간 저장하였다. 다음 단계에서, N,N-디메틸포름아미드(DMF)에 용해된 0.5 내지 0.7㎖ 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 가하고(50㎎ DMAP/1.0㎖ DMF) 용액을 5000rpm에서 30 분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 침전물은 데시케이터에서 건조한 후 10mM 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해하였다. 생성된 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)를 스테로이드 호르몬 검출에 사용하였다.
[제조예 3] MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs와 스테로이드 호르몬 항체의 바이오컨주게이트 합성
고정된 양의 스테로이드 호르몬(프로게스테론) 항체를 각기 다른 부피의 제조예 2에서 제조된 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)와 혼합하거나 다양한 양의 스테로이드 호르몬(프로게스테론) 항체에 일정한 부피의 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)를 가한 후 여기에 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 32mg/ml와 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 30mg/ml을 첨가하였다.
이들의 포접과 상호작용의 평가를 교반 3 내지 24시간 후에 수행하고 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)와 스테로이드 호르몬 항체의 포접을 100V의 전압을 40분 동안 전기영동(2% 아가로스)으로 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)와 스테로이드 호르몬 항체의 분명한 결합이 도 2의 사진 영상에서 확인하였다. 상기의 결합은 스테로이드 호르몬 항체의 아민 그룹이 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)의 표면의 카르복실 그룹과 쉽게 결합하여, 스테로 이드 호르몬 항체와 포접한 후, MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)-스테로이드 호르몬 항체의 크기는 증가하고, 일정한 양의 스테로이드 호르몬 항체와 혼합되는 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)의 농도를 증가할 때도 동일한 경향이 나타나, MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)-스테로이드 호르몬 항체의 크기는 증가되고 이동이 느려지는 것을 확인하였다(도 2(a) 참조). 또한, 스테로이드 호르몬 항체의 양이 증가할수록 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs) 표면의 결합 위치에 결합된 스테로이드 호르몬 항체의 양이 증가하였다(도 2(b) 참조). 한천 겔에서 스테로이드 호르몬 항체와 결합한 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)는 스테로이드 호르몬 항체가 결합되지 않은 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs(MPA-QDs)보다 느리게 이동하였다. MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs와 스테로이드 호르몬 항체의 면역반응 측정용 담체 합성을 위한 최적의 결합 비율은 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs 1.6mg/ml에 스테로이드 호르몬 항체가 250ng/ml 인 것을 확인하였다.
[실시예 1] MPA-QDs와 스테로이드 호르몬 항체-포접된 MPA-QDs의 광학 특성 측정
MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs와 스테로이드 호르몬 항체-포접된 면역반응 측정용 담체의 흡수 및 방출 스펙트럼을 멀티스캔 스펙트럼(Multiskan spectrum)(Thermo electron corporation, 핀란드)과 형광 스펙트로포토미터(모델: F-4500, Hitachi Co., 일본)를 사용하여 측정하였다. CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs는 양자 수율(QY)이 64%, 입자크기가 2 내지 4.5㎚일 때 형광강도가 가장 높았다.
도 4는 제조예 2에서 제조된 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs와 제조예 3에 서 제조된 면역반응 측정용 담체의 형광 스펙트럼을 보여주는 것이다. 이들의 광범위한 형광 스펙트럼은 단일 광원으로 여러 QD-기초한 형광물질의 효율적인 여기를 가능하게 한다. 즉, 마이크로플레이트 리더의 방출 필터를 이용한 용이한 조절과 수용체를 직접 여기 시키지 않는 단파장에서의 여기가 가능하다. MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs의 2차원 형광 스펙트럼에서 520 내지 590㎚의 여기 파장과 300 내지 530㎚의 방출 파장에서 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs의 형광강도가 변화하는 것을 관찰하였다(도 4a). 반면에 스테로이드 호르몬 항체-포접된 MPA-QDs의 형광강도는 560㎚ 여기 및 380㎚ 방출 파장에서 형광이 증가되었다. 즉, MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs과 스테로이드 호르몬 항체-포접된 MPA-QDs의 형광강도는 그들의 포접 및 상호 작용, 활성 및 관련된 각 성분의 양에 의해 변화한다.
[실시예 2] 스테로이드 호르몬 항체에 접합된 MPA-QDs의 분리 정제
도 3에 나타낸 바와 같이, MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs에 포접된 스테로이드 호르몬 항체의 면역반응 측정용 담체의 혼합체는 포집되지 않은 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 QDs, 스테로이드 호르몬 항체, NHS, EDS의 잉여분이 남을 수 있다. 이들 물질을 제거하고 순수한 MPA-QDs에 포접된 스테로이드 호르몬 항체의 면역반응 측정용 담체를 얻기 위해서, 세파덱스 지-100(Sephadex G-100)을 충진된 컬럼을 이용하여 초여과-원심분리(ultra-filter-centrifugation)를 하여 정제하였다.
[실시예 3] 졸-겔 법에 의한 센싱막의 제조
한국출원 제10-2007-0014736호에 기재된 방법에 따라, 졸-겔 법을 이용하여 센싱막을 제조하였다. 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 아미노프로필 -트리메톡시실란(APTMS)를 2:1의 부피비로 포함하는 혼합물(GA2)을 각각 99% 에탄올에 혼합하여 졸-겔을 제조하였다. 혼합용액에 35% HCl을 40㎕/㎖의 부피로 첨가하였다. HCl 첨가 후, 졸-겔은 다음 단계에서 사용되기 전 최소 2 시간 동안 실온에서 보관하였다. GPTMS/APTMS 졸-겔 용액과 APTMS(Glutaradehyde처리된) 졸-겔 5㎕를 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 바닥면에 분주하고 상온에서 5 내지 10분 동안 처리한 후 제조예 3에서 분리 정제된 MPA-QDs에 포접된 스테로이드 호르몬 항체의 면역반응 측정용 담체를 100㎕를 분주한 후 4℃에서 24시간 동안 고정화시켰다.
[실시예 4] 스테로이드 호르몬의 농도 측정
스테로이드 호르몬(프로게스테론)을 스테로이드 호르몬 항체에 접합된 면역반응 측정용 담체가 고정화된 졸-겔 센싱막을 이용하여 측정하였다. 스테로이드 호르몬 항체에 접합된 면역반응 측정용 담체가 고정화된 졸-겔 센싱막에 다양한 농도의 스테로이드 호르몬(프로게스테론) 용액 100㎕가 분주된 마이크로타이터 플레이트웰에 가하였다.
제조예 3의 면역반응 측정용 담체가 고정화된 졸-겔 센싱막에 다양한 농도의 스테로이드 호르몬 및 면역반응 측정용 담체와 스테로이드 호르몬의 반응을 처리 시간 3시간, 6시간, 24시간에 따른 형광을 측정한 것으로 24시간이 선형 농도구간에서 감도(기울기)가 매우 높았으나, 3시간에서부터 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 면역반응 측정용 담체가 고정화된 졸-겔에 스테로이드 호르몬의 다양 한 농도를 노출한 후 형광을 측정한 결과, 스테로이드 호르몬 농도의 증가에 따라 형광 값이 증가됨을 확인하였다.
도 1은 본 발명에 따른 면역반응 측정용 담체를 이용한 스테로이드 호르몬의 검출반응을 보여주는 모식도이다.
(a: 다이렉트(Direct) 검출 반응, b: 샌드위치(Sandwich) 검출 반응)
도 2는 MPA-코팅된 CdSe/ZnS 코어-쉘 양자점과 스테로이드 호르몬 항체의 결합도를 한천 겔 전기영동으로 확인한 결과이다.
(a: 스테로이드 호르몬 항체(250ng/ml)에 따른 다양한 농도의 MPA-QDs(0.4 내지 3.2mg/ml)의 처리, b: MPA-QDs(3.2mg/ml)에 따른 다양한 농도의 스테로이드 호르몬 항체(62.5 내지 1000ng/ml)의 처리)
도 3은 본 발명에 따른 면역반응 측정용 담체를 세파덱스 지-100(Sephadex G-100)가 충진된 컬럼을 이용하여 분리 정제한 결과이다.
(a: 초여과-원심분리 처리한 전 FPLC 결과, b: 초여과-원심분리 처리한 후 FPLC 결과)
도 4는 본 발명에 따른 면역반응 측정용 담체 및 MPA-QDs의 광학 특성 측정을 결과로서 형광 스펙트럼을 보여주는 것이다.
(a: MPA-QDs의 2차원 형광 스펙트럼, b: 면역반응 측정용 담체의 2차원 형광 스펙트럼)
도 5는 본 발명의 면역반응 측정용 담체가 고정된 면역반응 측정용 광학 센싱막의 스테로이드 호르몬의 농도 및 처리 시간에 따른 형광을 측정한 결과이다.
(a: 3시간, b: 6시간, c: 24시간)
도 6은 본 발명의 면역반응 측정용 담체가 고정된 면역반응 측정용 광학 센싱막의 스테로이드 호르몬 농도에 따른 형광을 측정한 결과이다.
(a: 프로게스테론의 농도 측정한 형광값, b: 테스토스테론의 농도 측정한 형광값, c: 에스트로겐의 농도 측정한 형광값)

Claims (12)

  1. 친수성 계면활성제로 코팅된 양자점(quantum dots;QDs)을 제조하고, N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)의 존재 하에 상기 제조된 양자점과 스테로이드 호르몬 항체를 1: 0.01 내지 1의 혼합비로 가교 결합시켜 포접한 후, 초여과-원심분리(ultra-filter-centrifugation)하여 수득되어 제조되는 담체에 있어서, 상기 양자점은 나노입자에 징크설파이드(ZnS) 쉘이 코팅된 2 내지 4.5 nm 입자크기의 코어-쉘 양자점인 것을 특징으로 하는 하는 스테로이드 호르몬 검출용 담체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 나노입자는 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴텔로리움(CdTe), 징크텔로리움(ZnTe), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크옥사이드(ZnO), 머큐리텔로리움(HgTe), 및 머큐리셀레나이드(HgSe)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스테로이드 호르몬 검출용 담체.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 스테로이드 호르몬 항체는 테스토스테론 항체, 프로게스테론 항체, 에스트로겐 항체, 안드로스테론 항체, 당질코르티고이드 항체 및 무기질코르티코이드 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스테로이드 호르몬 검출용 담체.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 친수성 계면활성제는 N-메틸프로피온아마이드, N-메틸아세트아마이드, 메탄설폰산, 디티오트레이톨, 글루타티온, 히스티딘 또는 티올-함유 실란으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 스테로이드 호르몬 검출용 담체.
  9. 지지체 상에, 제 1항, 제 2항 제 4항, 제 8항 중 선택되는 어느 한 항에 따른 스테로이드 호르몬 검출용 담체가 100 ㎕ 부피로 고정된 스테로이드 호르몬 검출용 광학 센싱막(sensing membrane).
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 스테로이드 호르몬 검출용 담체는 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란(GPTMS) 및 아미노프로필-트리메톡시실란(APTMS)을 2 내지 4:1의 부피비로 포함하는 졸-겔 내에 고정화 되는 것을 특징으로 하는 스테로이드 호르몬 검출용 광학 센싱막(sensing membrane).
  11. 제 9항에 따른 스테로이드 호르몬 검출용 광학 센싱막을 포함하는 생물학적 검출키트.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 검출키트는 테스테로테론, 프로게스테론, 에스트로겐, 안드로스테론, 당질코르티고이드 및 무기질코르티코이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 주입한 반응으로부터 발산되는 형광강도를 측정하는 것을 특징으로 하는 생물학적 검출키트.
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