WO2019066215A1 - 녹차의 줄기세포를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 및 그의 제조방법 - Google Patents

녹차의 줄기세포를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 및 그의 제조방법 Download PDF

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WO2019066215A1
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WO
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composition
hair loss
promoting
cell line
hair growth
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PCT/KR2018/007768
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이용희
은대경
나용주
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(주)아모레퍼시픽
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    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
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    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising stem cells of Camellia Sinensis and a method for producing the same, and more particularly, to a composition for preventing hair loss or promoting hair growth by culturing green tea with plant stem cell culture technology
  • the present invention relates to a composition for preventing hair loss or promoting hair growth, comprising a cell line, a cell lysate thereof, an extract thereof, or a culture solution thereof as an active ingredient to inhibit hair loss or stimulate hair growth.
  • the cycle of hair consists of anagen which grows hair, catagen which is the period of termination of growth and reduction of the size of the moles, taloge which is the period when the papilla stops its activity and keeps its hair on the scalp, Or a generator that generates new hair to depilate old hair.
  • the anagen stage (2-7 years) is the period during which the hair grows, divided into two stages: a hair growth phase where the hair tries to go out from the parent hair to the blanket and a stage where the hard keratin is made in the hair follicle. Hair continues to self-grow until the retrogressive.
  • the catagen stage (2 to 3 weeks) is the period when the metabolic process is slowed down after the growth phase is finished and the hair shape is maintained, and keratin is not produced at this stage. Degenerators account for 1% of total hair. At this time, the mothers shrink and divide into the dermal papilla, surrounded by the hair follicles and go upwards, and the cell division is stopped.
  • the dermal papilla is shrunk and the hair follicles shrink gradually, and the hair follicles are pushed upwards and fall out.
  • the lifespan of the hair until the next stage of growth begins is 3 to 4 months.
  • Minoxidil which is currently used as a hair growth promoter, was developed as a hypertension treatment for expanding blood vessels in the past, but has a capillary vasodilating function to prevent hair loss when applied to the scalp, For some time, the effect of the drug should remain on the scalp for a period of time. Hair growth may occur in other areas where it is not appropriate, and side effects such as rash, inflammation, itching, etc. may occur at the application site.
  • Propecia which is based on the side effects that promote hair growth after being used in the treatment of benign prostatic hyperplasia, inhibits the production of dihydrotestosterone (DHT), a male hormone that causes hair loss,
  • DHT dihydrotestosterone
  • erectile dysfunction such as erectile dysfunction, loss of sexual desire, dizziness, headache, swelling and skin rash, and there is a fear of giving birth to a deformed child when taking it, have.
  • the compounds include cyclosporin derivatives (Korean Patent No. 10-0439467, Korean Patent No. 10-0695611, Digitalis (International Patent Publication No. WO 2010-004303), Oxalate Japanese Patent Laid-Open No. 10-0157667), Chinese cabbage (Chinese cabbage), Chinese cabbage, Chinese cabbage, Chinese cabbage, Chinese cabbage, Chinese cabbage and white cabbage extract (Korean Patent No. 10-0157667) 0259037) have been reported.
  • the green tea extract containing the camphor glycoside obtained from green tea contains camphorol derived from green tea obtained through the decomposition reaction using an acid, a base, an enzyme, or a microorganism producing the enzyme as an active ingredient, And has an effect of promoting collagen biosynthesis, thereby exhibiting an effect of improving wrinkles derived from squalene monoperoxide, which is a lipid oxide produced by ultraviolet rays (UV), and inhibiting the expression of elastase and collagenase It has been known that it has the effect of improving the skin elasticity by the compound synergism of these two activities, thereby improving the anti-aging, wrinkle and skin elasticity.
  • squalene monoperoxide which is a lipid oxide produced by ultraviolet rays (UV)
  • the inventors of the present invention have conducted studies to develop a raw material which is a natural plant-derived ingredient that does not cause side effects of skin and has an effect of preventing hair loss and promoting hair growth.
  • a composition containing components derived from stem cells of Camellia Sinensis, Promoting cell proliferation, enhancing scalp elasticity by activating collagen production, and having an excellent scalp antiinflammatory effect thus completing the present invention.
  • the present invention provides a method for producing a stem cell, which comprises culturing at least one green tea stem cell selected from the group consisting of a cell line derived from Camellia sinensis stem cell, a cell lysate thereof, And a composition for promoting hair loss or promoting hair growth comprising the resulting composition as an active ingredient.
  • the green stem cell-derived component may be contained in an amount of 0.001 to 10% by weight based on the total weight of the composition.
  • the green tea may be at least one region selected from the group consisting of a stomach, a leaf, a branch and a stem of a green tea.
  • the green tea stem cell-derived component may be derived from a green tea forming layer or a procambium layer.
  • the composition for promoting hair loss prevention or hair growth may be transdermal, subcutaneous or dermatological formulations.
  • the composition for promoting hair loss prevention or hair growth may have one or more types selected from the group consisting of solutions, creams, lotions, shampoos, hair tonics, sprays, and gels.
  • the composition for preventing hair loss or promoting hair growth may improve the proliferation of dermal papilla cells.
  • the composition for preventing hair loss or promoting hair growth promotes collagen production to prevent hair loss.
  • a method for producing a composition for promoting hair loss prevention or hair growth comprising the steps of: S1) obtaining at least one member selected from the group consisting of organs, tissues and cells of green tea; S2) culturing at least one species selected from the group consisting of the obtained organs, tissues and cells in a culture medium using a plant stem cell culture technique; And S3) separating cells cultured in at least one group selected from the group consisting of organs, tissues and cells of the green tea to obtain a cell line derived from a green stem cell, a lysate thereof or a culture thereof.
  • a method for producing a composition for promoting hair growth is provided.
  • the step S3) is followed by the steps S4), S3); S5) extracting the cultured cell line with a solvent selected from the group consisting of water, an organic solvent and a mixed solvent thereof to obtain an extract of the cell line.
  • the organic solvent in step S5) is a mixture of C 1 to C 4 lower alcohols, acetone, butylene glycol, ethyl acetate, diethyl acetate, diethyl ether, benzene, chloroform and hexane Any one or more selected from the group can be used daily.
  • composition for preventing hair loss or promoting hair growth provided by the present invention can promote the proliferation of dermal papilla cells.
  • the hair loss preventing or hair growth promoting composition provided by the present invention is excellent in skin safety and promoting collagen synthesis promotion, so that the hair loss phenomenon can be suppressed and the scalp elasticity can be enhanced.
  • composition for preventing hair loss or hair growth promoted by the present invention can exert an excellent anti-inflammatory effect by inhibiting inflammation on the scalp.
  • the present invention can provide a method for producing the composition for preventing hair loss or promoting hair growth, which can be mass-produced.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of evaluating the proliferation effect on the dermal papilla cells of Example 2.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of evaluating the proliferation effect on the dermal papilla cells of Example 2.
  • Fig. 2 is an image showing evaluation of the effect of collagen production in the scalp tissue of Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of evaluating the scalp anti-inflammatory effect of Example 1.
  • composition for preventing hair loss or hair growth is selected from the group consisting of a cell line derived from Camellia Sinensis stem cell, a disruption product of the cell line, an extract of the cell line and a culture solution of the cell line And one or more kinds of green tea stem cell-derived components as an active ingredient.
  • the green stem cell line can be cultured by plant stem cell culture technology.
  • the green stem cell-derived component is extracted using plant stem cell culturing technology, which is currently under widespread use.
  • the callus is induced from seeds, leaves, roots, etc. of green tea and then solid- To obtain a stem cell line and mass production / extraction of the active ingredient through a suspension cell culture.
  • the form of the raw material may be an induced cell line itself, a lysate thereof, an extract thereof, or a culture thereof, and may be used as a cosmetic composition.
  • the cell line, its lysate, the extract or the culture solution is collectively referred to as a component derived from green tea stem cells.
  • &quot plant stem cell culture technology " referred to in the present specification refers to a method of culturing a callus or a single cell population or cultivating a full-function cell line by cultivating asbestos, organ, and cell from an organism into a nutrient- Means a technique of regenerating the plant.
  • &quot means a material containing components contained in a medium obtained by culturing plant stem cells of green tea.
  • the term 'extract' refers to a substance obtained by dissolving a cell line obtained by culturing plant stem cells of green tea in a solvent, and may be concentrated using distillation or evaporation.
  • 'callus' refers to a cell or cell mass (PNAS, 99 (25): 15843, 2002) that has not been differentiated through the process of dedifferentiation.
  • the composition for preventing hair loss or promoting hair growth according to the present invention is characterized in that said green tea stem cell-derived component is contained in an amount of 0.001 to 10% by weight based on the total weight of the composition. If the content is less than 0.001% by weight, it is difficult to expect hair loss prevention or hair growth promoting effect. If the content is more than 10% by weight, the efficacy is not greatly increased. Preferably 0.005 to 1% by weight, more preferably 0.02 to 0.5% by weight, but is not limited thereto.
  • the green tea may be at least one site selected from the group consisting of the stomach, leaves, branches and stems of green tea. If the stomach is a genetically stable and innately undifferentiated cell without a dedifferentiation process, , And is not particularly limited.
  • the green stem stem cell-derived component may be derived from a cambium or procambium of green tea. Specifically, in order to obtain genetically stable and innate undifferentiated cells without undergoing a dedifferentiation process, the component can be derived from a cambium or procambium, which is a cleavage organization having vigorous fission capacity.
  • the formation layer is a structure that allows plants to grow in volume by making the stem and roots of the plant thicker. It is also reported that cambium is the most active cleavage tissue, and that high-speed and high-volume production of cells can be achieved when used as an explant of plant tissue culture.
  • the procambium layer is a one-way thermal tissue that forms a vascular tissue (a primary vaginal tube and a primary vaginal tube), is differentiated into a bundle, and is connected to a mature vascular tissue of the plant.
  • the procambium plays an important role because it forms a vascular tissue at the part where the growing front end and the mature vascular tissue are to be connected.
  • the composition for promoting hair loss prevention or hair growth may be transdermal, subcutaneous or dermatological formulations.
  • the transdermal dosage form is an ointment preparation, which can be prepared by appropriately blending the ointment base, other additives, and the like based on those known in the art.
  • the ointment base may be, for example, a higher fatty acid or an ester thereof (e.g., adipic acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, adipic acid ester, myristic acid ester, palmitic acid ester, (For example, polyoxyethylene alkyl ether phosphate esters), higher alcohols (e.g., cetanol, stearyl alcohol, isopropyl cellosolve, etc.) (Eg, cetostearyl alcohol), silicone oils (eg dimethylpolysiloxane, methylphenylpolysiloxane, glycol methylpolysiloxane, silicone glycol polymer), hydrocarbons (eg hydrophilic and serine, white and serine, refined lanolin, liquid paraffin) , Glycerin, propylene glycol, butylene glycol, sorbitol), an infection inhibitor, and the like.
  • the subcutaneous injection is a form to be directly injected subcutaneously.
  • the external preparation for skin is a formulation to be applied to the skin, and other components may be suitably selected and mixed in order to achieve a desired effect according to a conventional technique in the art.
  • the composition may be a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may be in the form of a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, leave- Type, mist, spray, and the like, but the present invention is not limited thereto. More specifically, the present invention relates to a hair conditioner, a hair conditioner, a hair shampoo, a hair conditioner, a hair conditioner, a hair conditioner, a hair conditioner, a hair conditioner, a hair conditioner, (O / W) type, water-in-oil (O / W) type, and the like.
  • composition for preventing hair loss or hair growth can be appropriately selected and blended by those skilled in the art depending on the kind of the external preparation, the purpose of use, and the like, in addition to the above essential ingredients in each formulation.
  • an ultraviolet screening agent, a hair conditioning agent, a perfume, and the like for example, an ultraviolet screening agent, a hair conditioning agent, a perfume, and the like.
  • the cosmetic composition may contain a cosmetically acceptable medium or base. It may be in any form suitable for topical application, for example as a solution, a gel, a solid or a paste anhydrous product, an emulsion obtained by dispersing an oil phase in water, a suspension, a microemulsion, a microcapsule, a microgranule or an ionic form (liposome) and / In the form of a non-ionic follicle dispersing agent, or in the form of creams, skins, lotions, powders, ointments, sprays or conical sticks. These compositions may be prepared according to conventional methods in the art.
  • a solvent, a dissolving agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, , 3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid esters.
  • the formulation of the present invention is a suspension
  • a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc.
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel
  • an animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier component .
  • lactose When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component.
  • a spray in particular, / Propane or dimethyl ether.
  • the cosmetic composition may further contain an enhancer.
  • the thickening agent included in the cosmetic composition may be selected from the group consisting of methylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxymethylhydroxyguanine, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, carboxyvinyl polymer, polyquaternium, cetearyl alcohol, stearic acid, carrageenan And at least one of carboxymethyl cellulose, carboxyvinyl polymer and polyquaternium can be used, and most preferably, it can be a carboxyvinyl polymer.
  • the cosmetic composition may contain various bases and additives as appropriate, and the kind and amount of these components can be easily selected by the inventors.
  • the composition may contain an additive that is acceptable according to need, and may further include components such as preservatives, pigments, and additives customary in the art.
  • the preservative may be phenoxyethanol or 1,2-hexanediol, and the perfume may be an artificial perfume or the like.
  • the cosmetic composition may comprise a composition selected from the group consisting of water-soluble vitamins, oiliness vitamins, polymer peptides, polymeric polysaccharides, sphingolipids and seaweed extracts.
  • the compounding ingredients that may be added include organic solvents such as a preservative component, a moisturizer, an emollient, a surfactant, an organic and inorganic pigment, an organic powder, an ultraviolet absorbent, a preservative, a bactericide, an antioxidant, a plant extract, a pH adjuster, A blood circulation promoter, a cold agent, a restriction agent, and purified water.
  • the components to be added in addition to these components are not limited thereto, and any of the above components can be compounded within a range that does not impair the objects and effects of the present invention.
  • the composition for preventing hair loss or promoting hair growth according to the present invention may further contain a green tea extract.
  • the green tea extract preferably contains a camphor glycoside, which can be prepared using water or an organic solvent. Specifically, it is preferable to add about 1 to 6 times, preferably about 3 times, water or at least one organic solvent selected from the group consisting of ethanol, methanol, butanol, ether, ethyl acetate and chloroform to green tea leaves or green tea seeds A mixed solvent of a solvent and water is added and the mixture is degassed by stirring at room temperature for 1 to 5 times.
  • the degreased plant is then added with about 1 to 8 times, preferably about 4 times, water or the organic solvent,
  • the mixture was separated by filtration and centrifugation to separate the residue and the filtrate.
  • the separated filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain an extract.
  • the extract was suspended in water and then dissolved in ether , And then the aqueous layer is extracted 1 to 5 times with the organic solvent.
  • the obtained organic solvent layer is concentrated under reduced pressure to obtain the organic solvent extract, It was dissolved, etc.
  • the composition for preventing hair loss or promoting hair growth according to the present invention can induce or promote hair growth by enhancing the proliferation of hair dermal papilla cells and increase the elasticity of scalp by promoting collagen production, thereby suppressing or preventing hair loss phenomenon.
  • the composition for preventing hair loss or for promoting hair growth may alleviate the inflammation in the scalp which induces hair loss phenomenon and inhibits hair growth.
  • a method for preparing a composition for preventing hair loss or hair growth comprises the steps of: S1) obtaining at least one from the group consisting of the organs, tissues and cells of green tea; S2) culturing at least one species selected from the group consisting of the obtained organs, tissues and cells in a culture medium using a plant stem cell culture technique; And S3) separating the cultured cells to obtain a cell line derived from a green stem cell, a lysate thereof or a culture thereof.
  • the step S1) is a step of obtaining at least one kind from the group consisting of the organs, tissues and cells of green tea.
  • the step of S1) is a step of separating the cambium or procambium layer in the neck of green tea, .
  • the step S2) is a step of culturing at least one species from the group consisting of the obtained organs, tissues and cells in a culture medium using a plant stem cell culture technique, Or more can be mixed in the medium or dentate to cultivate the green stem cell line derived cell line. Further, the cultured cell line can be subcultured to increase the number of cells to mass-produce, and the cell line can be stabilized. Preferably, the green tea stem cell-derived cell line is cultured by dipping the cambium or procambium-containing tissue on a medium, but is not limited thereto.
  • the culture may be any one selected from an organ culture, a tissue culture, and a cell culture, but is not limited thereto.
  • the term 'organ culture' means to reproduce genetically identical organisms by cultivating each organ of a plant such as an advantage, stem, leaf, bulb, fire (petal, calyx, surgery, medicine.
  • the 'tissue culture' refers to culturing a tissue that is a part of an organ, and includes regenerating the plant as a differentiation of callus obtained from the culture.
  • the 'cell culture' can be used for the purpose of liberating cells, culturing protoplasts, or attempting breeding of new individuals by fusion of somatic cells by culturing callus in a liquid shake culture.
  • a cell line derived from a green tea stem cell, a lysate thereof, or a culture thereof is obtained by isolating cells cultured in at least one of the group consisting of organs, tissues and cells of the green tea, ),
  • the green tea stem cell-derived cell line, the lysate thereof, or the culture thereof by naturally separating from the culture medium in at least one of the group consisting of the organs, tissues and cells of the green tea in the step
  • the green tea-forming layer or the procambium-derived cell line is obtained by separating the cells cultured from the formation layer of the green tea or the tissue containing the procambium layer, but is not limited thereto.
  • the step S3) is followed by the steps S4), S3); S5) extracting the cultured cell line with a solvent selected from the group consisting of water, an organic solvent and a mixed solvent thereof to obtain an extract of the cell line.
  • the step S4) may be performed by culturing the cell line obtained in the step S3) using a medium containing the same or different components as in the step S2), and the culturing method may be carried out by a conventional method And is not particularly limited as long as it is a method capable of mass production by stabilizing cells and subculturing the cells.
  • the step S5) comprises extracting the cultured cell line with a solvent selected from the group consisting of water, an organic solvent and a mixed solvent thereof to obtain an extract of the cell line, wherein the cell line obtained by culturing is dissolved in a solvent and separated, ,
  • the organic solvent may be any one or more selected from the group consisting of C1 to C4 lower alcohols, acetone, butylene glycol, ethyl acetate, diethyl acetate, diethyl ether, benzene, chloroform and hexane.
  • callus derived from embryo and needle of green tea as a raw material derived from green tea stem cells and callus from a cambium or cambium-derived layer are obtained and then obtained by cell culture It has been confirmed that the cell line proliferation, collagen production and anti-inflammatory effect of the dermal papilla cells are confirmed, but it is obvious to those skilled in the art that the same result can be obtained by using the lysate thereof or the culture thereof something to do.
  • the peeled tissues consist of throat, progenitor (twigs) or cambium (stem), serpentine, cortex, epidermis.
  • the whitened and loose portions with good growth rate were transferred every 21 days with the same fresh medium as the induction medium.
  • the culture medium used for inducing only callus and procambium and cambium-derived cell lines derived from embryo and leaf are shown in Table 1 below.
  • Auxin as a growth regulator was added to the medium at a concentration of 1 to 3 mg / L. Cultivation was carried out in a dark room controlled at 25 ⁇ 1 ° C.
  • the embryo-derived callus and procambium and cambium-derived cell lines were placed in a flask containing the liquid medium of Table 2, and cultured in a shaker at 25 ⁇ 1 ° C. at 100 rpm in a dark condition.
  • the subculture period was fixed to 2 weeks, so that the cultured cells were always able to maintain high vigor in the algebraic growth state.
  • embryo-needle-derived calli, procambium and cambium-derived cells were cultured in an air submerged bioreactor (Airlift bioreactor, Sungwon Cytec, Korea) Respectively.
  • the medium used was the liquid medium of Table 2 and was kept constant at 25 ⁇ 1 ⁇ ⁇ under dark condition.
  • the cell line according to the present invention exhibited a high proliferation rate of about 2 to 3 times when cultured in a flask.
  • the cell line according to the present invention was found to be 5- to 6-fold Of the growth rate.
  • Example 1-4 The cell suspension cultured for 14 days as in Example 1-4 was cultured for 10 days in a medium supplemented with 3 to 5% by weight of raw sugar and 100 ⁇ M of methyl jasmonate in sterilized water, and the cells were collected The following experiment was carried out.
  • the active substance was extracted from the cell line prepared in Example 1 in the following manner.
  • the WST-1 kit was used to evaluate the viability and proliferation promoting effect of the distilled water extract of the green tea-derived cell line of Example 2 in follicular tissues and related cells.
  • the dermal papilla cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the cultured cells were seeded in a 96-well plate (5x10 3 cells / well) and cultured in a 37 ° C CO 2 incubator for 24 hours. Then, the distilled water extract of the green tea-derived cell line of Example 2 was diluted with each concentration (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 wt%), treated in each well, and cultured for 24 hours. Then, the WST-1 reaction solution was diluted 1/10 in the supernatant of the supernatant and 100 ⁇ l of each WST-1 reaction solution was added to each well.
  • the WST-1 reaction solution was added to the incubator at 37 ° C for 1 hour and then immersed in an ELISA microplate reader (SoftMax Pro5, , USA) was used to measure the absorbance at 450 nm.
  • the same mammary gland cells were treated with DMSO (dimethyl sulfoxide) alone to set them as a control group, and the 5% bovine serum not treated with the distilled water extract of the green tea-derived cell line of Example 2 was set as a positive control.
  • the relative absorbance of the positive control and the green tea-derived cell line of Example 2 was calculated in terms of the relative absorbance of 100% of the absorbance of the control group.
  • the distilled water extract of green tea-derived cell lines was treated at different concentrations to measure the growth and viability of the papilla cells. As a result, it was confirmed that the papilla cells did not show damage from low to high concentrations. In addition, the higher the concentration of the green tea-derived cell line of Example 2 in the distilled water extract, the more proliferation of the dermal papilla cells was confirmed. In addition, it was confirmed that the dermal papilla cells treated with the distilled water extract of the green tea-derived cell line of Example 2 at a concentration of 0.1 to 0.5 wt% promoted superior cell proliferation as compared with the positive control.
  • the composition for preventing hair loss or promoting hair growth containing the green tea stem cell-derived component according to the present invention does not lower the viability of the dermal papilla cells, is not toxic, and promotes the proliferation of the dermal papilla cells.
  • a 50 - year - old Korean female was exposed to a 3 - mm punch through the scalp tissue at two sites of the scalp (Dankook University Cheonan dermatology IRB). The scalp was cut so that the direction of the hair coming out of the scalp and the direction coming out of the punch coincided.
  • the biopsied scalp tissue was treated with William's E media (10 ng / ml hydrocortisone, 2 mM L-glutamine, 0.1% Fungizone, 1% anti-biotics / mycotics), a method of culturing hair follicles,
  • William's E media (10 ng / ml hydrocortisone, 2 mM L-glutamine, 0.1% Fungizone, 1% anti-biotics / mycotics), a method of culturing hair follicles.
  • the distilled water extract of the cell line was diluted to each concentration (0.1, 0.5 wt%), and the cells were treated in each well and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. After 2 days incubation, tissue was planted in OCT compound solution and cut into 7 ⁇ m using a cyosection machine. Afterwards, primary antibodies of type I collagen (COL1A1) and type VII collagen (COL7A1) were used for immunofluorescence sta
  • the protein expression of type I collagen and type VII collagen was examined by treating the distilled water extract of the green tea-derived cell line at different concentrations. As a result, the concentration of the green tea- Type I collagen and type VII collagen.
  • composition for promoting hair loss or hair loss which contains the green tea stem cell-derived component according to the present invention, promotes collagen synthesis in the scalp tissue.
  • mice macrophages were cultured in DMEM (Hyclone) medium containing 10% fetal bovine serum (Life Technologies, Inc.), 100 IU / L penicillin and 100 ⁇ g streptomycin antibiotics at 37 ° C And 5% CO 2 .
  • the culture medium of the cells was replaced with fresh medium once every 3 days or 4 days, and when the density of the cells reached the highest, secondary culturing was carried out at a split ratio of 1: 5 to 1:10.
  • the distilled water extract of the green tea-derived cell line of Example 2 showed a significant decrease in nitrogen monoxide concentration.
  • composition for preventing hair loss or hair growth which contains the green tea stem cell-derived component according to the present invention, can inhibit substances that cause expansion of capillaries or induce inflammation without inducing scalp stimulation, I confirmed that I have.

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Abstract

본 발명은 녹차(Camellia Sinensis)의 줄기세포를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 에 관한 것으로, 보다 상세하게는 녹차를 식물줄기세포배양기술(Plant stem cell culture technology)로 배양한 세포주(cell line), 그의 파쇄물, 그의 추출물 또는 그의 배양액을 유효성분으로 함유하여 탈모방지 또는 발모촉진에 효과적인 녹차의 줄기세포를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다.

Description

녹차의 줄기세포를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 및 그의 제조방법
본 출원은 2017년 09월 29일자 한국 특허 출원 제10-2017-0126994호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함한다.
본 발명은 녹차(Camellia Sinensis)의 줄기세포를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 녹차를 식물줄기세포배양기술(Plant stem cell culture technology)로 배양한 세포주(cell line), 그의 파쇄물, 그의 추출물 또는 그의 배양액을 유효성분으로 함유하여 탈모방지 또는 발모촉진에 효과적인 녹차의 줄기세포를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
최근 사회적 스트레스의 증가와 더불어 환경오염 및 인스턴트 식품 등 서구화된 식습관, 잦은 파마와 염색 등으로 인하여 탈모 인구가 점차 증가하고 있다. 모발의 주기는 모발을 성장시키는 성장기(anagen), 성장을 종료하고 모구부가 축소하는 시기인 퇴화기(catagen), 모유두가 활동을 멈추고 모발을 두피에 머무르게 하는 시기인 휴지기(talogen), 모유두가 활동을 시작하거나 또는 새로운 모발을 발생시켜 오래된 모발을 탈모시키는 시기인 발생기로 나눌 수 있다.
성장기(anagen stage; 2~7년)는 모발이 성장하는 기간으로, 다시 모발이 모구로부터 모포로 나가려는 모발 생성 단계와 딱딱한 케라틴이 모낭 안에서 만들어지는 단계로 나누어진다. 모발은 퇴행기까지 자가성장을 계속한다. 퇴행기(catagen stage; 2~3주)는 성장기가 끝나고, 모발의 형태를 유지하면서 대사과정이 느려지는 시기로, 이 단계에서는 케라틴을 만들어내지 않는다. 퇴화기는 전체 모발의 1%를 차지한다. 이때 모구부가 수축하여 모유두로 나눠지며 모낭에 둘러싸여 위쪽으로 올라가고, 세포분열은 정지상태이다. 휴지기(talogen stage; 3개월)는 모유두가 위축되고 모낭이 차츰 쪼그라들며, 모근이 위쪽으로 밀려 올라가 빠진다. 모발이 없어지는 시기로서 다음 성장기 단계가 시작될 때까지의 수명은 3~4개월이다.
정상인 사람이 성장기 상태의 모발이 많은데 비해 탈모증(alopecia)인 사람은 휴지기 상태의 모발이 많아 눈으로 보이는 탈모현상이 나타내게 된다. 탈모가 진행될수록 성장기의 기간이 짧아지고 이로 인해 모발은 점점 소형화된다. 따라서, 탈모의 치료를 위해서는 휴지기 상태의 모낭을 성장기로 빨리갈 수 있도록 하고, 짧아진 성장기를 늘려주는 것이 중요하다. 이로써, 모유두세포의 증식을 촉진시키고, 콜라겐 생성을 활성화여 두피의 탄력을 부여하여 탈모현상을 억제시키는 것이 중요하다.
이에 따라, 전 세계적으로 탈모 방지를 위한 많은 치료제들이 시판되고 있으나, 아직도 치료효과를 만족할 수 있는 약물이나 기술은 미미한 실정이다. 현재 발모제로 사용되고 있는 두피에 바르는 형태인 '미녹시딜(minoxidil)'은 과거 혈관을 확장시키는 고혈압치료제로 개발되었으나 모세혈관 확장 기능이 있어 두피에 바르면 탈모를 방지하지만, 오래 기간 처방해야 하고, 3~4시간 동안 약제가 두피에 머무르도록 해야만 어느 정도 효과가 나타나며, 바르지 않은 다른 부위에서 체모가 자라거나, 발진, 염증, 가려움증 등의 부작용이 도포 부위에서 나타날 수 있다. 또한, 전립선비대증 치료에 사용하다 복용 후 모발의 성장이 촉진되는 부작용에 착안해 만들어진 '프로페시아(Propecia)'는 탈모를 유발하는 남성 호르몬인 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)의 생성을 억제하여 남성형 탈모가 진행되는 것을 예방하는 것으로 알려져 있으나, 발기부전, 성욕 감퇴 등의 성기능 저하와 어지럼증, 두통, 부종 및 피부 발진 등이 나타날 수 있으며, 복용 시 기형아 출산의 우려가 있어 여성에게 처방될 수 없는 문제점이 있다.
그 외에도 탈모방지 및 모발성장에 효과가 있다고 알려진 물질이나 생약성분의 추출물을 이용하여 탈모를 예방하고 치료하려는 시도가 많이 이루어졌다. 예를 들어, 화합물로는 사이클로스포린(Cyclosporin) 유도체(대한민국 등록특허 10-0439467, 대한민국 등록특허 10-0695611), 강심배당체(Digitalis) (국제공개특허 WO 2010-004303), 옥살레이트(Oxalate) (국제공개특허 WO 1994-015574) 등이 있으며, 생약성분 추출물로는 난초과 식물의 추출물(대한민국 등록특허 10-0157667), 반하, 정향, 복분자, 산초, 만형자, 단삼 및 백자인 추출물(대한민국 등록특허 10-0259037) 등이 보고된 바 있다.
그러나 이러한 원료들은 대부분 효능이 미진하거나 자극, 트러블 등의 피부 부작용을 유발하는 등 여러 가지 문제점을 가지고 있었다.
한편, 녹차로부터 수득한 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물은 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용한 분해 반응을 통해 얻어진 녹차 유래의 캄페롤을 유효성분으로 포함하고 있어 지질 과산화 억제 효과, 콜라겐 생합성 촉진 효과를 가지고, 이를 통해 자외선(ultraviolet rays; UV)에 의해 생성된 지질 산화물인 스쿠알렌 모노퍼옥시드로부터 유도된 주름을 개선하는 효과를 나타내며, 엘라스타아제 및 콜라게나아제의 발현 억제 효과를 통해 이 두 가지 활성의 복합 상승 작용으로 피부 탄력을 향상시키는 효과를 나타내어 항노화 및 주름 개선, 피부 탄력 향상 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 최근에는 식물의 전형성능(totipotency)을 이용한 식물세포배양기술이 발전되면서 식물로부터 유래되는 기능성 2차 대사산물(secondary metabolite)에 대한 관심이 증폭되면서, 2차 대사산물은 다양한 생리활성을 갖는 것으로 알려지고 있어 고기능성 화장품의 신원료로 식물 줄기세포 유래 추출물질들이 주목을 받고 있다. 이 기술을 이용하면 천연에 존재하나, 화학적 합성방법으로는 얻기 어려웠던 고기능성 활성물질을 경제적으로 생산할 수 있다는 점에서 지금까지 사용하지 못했던 신성분들을 개발하고 응용할 수 있게 될 것으로 기대되고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 등록특허 제10-0439467호 (모발 성장 효과를 갖는 사이클로스포린 3 위치 유도체를 유효성분으로 하는 모발 성장 촉진제)
국제공개특허 WO 2010-004303 (COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF HAIR LOSS)
본 발명자들은 피부 부작용을 유발하지 않는 천연 식물 유래 성분이면서 탈모방지 및 발모촉진 효과가 뛰어난 원료 개발을 위해 연구를 거듭한 결과, 녹차(Camellia Sinensis)의 줄기세포로부터 유래한 성분을 함유하는 조성물은 모유두 세포의 증식을 촉진시키고 콜라겐생성을 활성화에 의한 두피 탄력 증진, 두피 항염 효과가 우수하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 녹차의 줄기세포 유래 성분들을 이용하여 피부 안전성이 우수하며 탈모방지 및 발모촉진 효과가 뛰어난 조성물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 녹차(Camellia Sinensis) 줄기 세포 유래 세포주(cell line), 상기 세포주의 파쇄물, 상기 세포주의 추출물 및 상기 세포주의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 녹차 줄기세포 유래 성분을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 녹차 줄기세포 유래 성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10 중량%의 양으로 함유될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 녹차는 녹차의 배, 잎, 가지 및 줄기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 부위일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 녹차 줄기세포 유래 성분은 녹차의 형성층 또는 전형성층으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 경피투여, 피하주사 또는 피부외용 제형일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 용액, 크림, 로션, 샴푸, 헤어토닉, 스프레이, 및 겔로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 형태를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 모유두 세포의 증식을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 콜라겐 생성을 증진시켜 탈모현상을 방지할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예 따르면, 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법으로서, S1) 녹차의 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 수득하는 단계; S2) 상기 수득된 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 식물줄기세포배양기술을 이용하여 배지에서 배양하는 단계; 및 S3) 상기 녹차의 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상에서 배양된 세포를 분리하여 녹차 줄기세포 유래 세포주(cell line), 그의 파쇄물 또는 그의 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 S3) 단계 이후, S4) 상기 S3) 단계에서 얻은 세포주를 배양하는 단계; S5) 배양된 세포주를 물, 유기용매 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출하여 세포주의 추출물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 S5) 단계에서의 유기용매는 C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 디에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매일 수 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 모유두 세포의 증식을 촉진시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 의하여 제공되는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 피부에 대한 안전성 및 콜라겐의 합성 촉진 효과가 우수하므로, 탈모현상을 억제할 수 있으며, 두피 탄력을 증진시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 의하여 제공되는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 두피에 일어난 염증을 억제하여 뛰어난 항염효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에 의하여 대량생산 가능한 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 2의 모유두 세포에 대한 증식 효과를 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2은 실시예 2의 두피 조직에서의 콜라겐 생성 효과를 평가하여 나타낸 이미지이다.
도 3는 실시예 1의 두피 항염 효과를 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 녹차(Camellia Sinensis) 줄기 세포 유래 세포주(cell line), 상기 세포주의 파쇄물, 상기 세포주의 추출물 및 상기 세포주의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 녹차 줄기세포 유래 성분을 유효성분으로 포함한다.
이때, 상기 녹차 줄기 세포 유래 세포주는 식물줄기세포배양기술(Plant stem cell culture technology)로 배양될 수 있다.
본 명세서에서, 상기 녹차 줄기세포 유래 성분은 최근 각광받고 있는 식물줄기세포배양기술을 이용하여 추출하는데, 녹차의 씨앗, 잎, 뿌리 등으로부터 캘러스(callus)를 유도한 후 고체배양(solid cell culture)하여 줄기세포주(stem cell line)를 확립하고 현탁배양(suspension cell culture)을 통해 유효 성분을 대량으로 생산/추출하여 얻는다. 그 원료의 형태는 유도된 세포주(cell line) 자체, 그의 파쇄물, 그의 추출물 또는 그의 배양액이 될 수 있으며 화장료 조성물로 사용될 수 있다. 이하 상기 세포주, 그의 파쇄물, 추출물 또는 배양액은 녹차 줄기세포 유래 성분으로 통칭한다.
본 명세서에서 언급하는 '식물줄기세포배양기술'은 물체로부터 기관·조직 및 세포를 적출 분리하여 기내에서 영양분이 함유되어 있는 배지에 무균적으로 배양함으로써 캘러스나 단세포의 집단을 유기하거나 완전한 기능을 가진 식물체로 재생시키는 기술을 의미한다.
본 명세서에서 언급하는 '파쇄물' 녹차의 식물줄기세포를 파쇄시켜서 세포내 및 세포외 물질이 혼합되어 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 언급하는 '배양액'은 녹차의 식물줄기세포를 배양하여 얻은 배지에 포함된 구성 성분을 포함하는 물질을 의미한다.
본 명세서에서 언급하는 '추출물'은 녹차의 식물줄기세포를 배양하여 얻은 세포주를 용매에 녹여 분리한 물질을 의미하며, 증류 또는 증발을 이용하여 농축될 될 수 있다.
본 명세서에서 언급하는 '캘러스'란, 탈분화 과정을 통하여 분화하지 않은 상태로 된 세포 또는 세포덩어리(PNAS, 99(25):15843, 2002)를 말한다.
본 발명에 의한 탈모방지 또는 육모촉진용 조성물은 상기 녹차 줄기세포 유래 성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10중량%로 함유하는 것을 특징으로 한다. 함유량이 0.001중량% 미만일 경우에는 탈모방지 또는 육모촉진 효과를 기대하기 어려우며, 10중량%를 초과하는 경우에는 더 이상이 효능이 크게 증가하지 않아 그 원료 효율성이 크게 떨어지게 된다. 바람직하게는 0.005 ~1중량% 이며, 더욱 바람직하게는 0.02~0.5중량% 이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 녹차는 녹차의 배, 잎, 가지 및 줄기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 부위일 수 있으며, 탈분화 과정을 거치지 않아 유전적으로 안정하고 선천적인 미분화세포인 줄기세포를 다량으로 얻을 수 있는 부위라면, 특별히 제한하지 않는다.
상기 녹차 줄기세포 유래 성분은 녹차의 형성층(cambium) 또는 전형성층(procambium)으로부터 유래될 수 있으며, 구체적으로는 탈분화과정을 거치지 않고 유전적으로 안정하고 선천적인 미분화세포를 획득하기 위해, 녹차 줄기세포 유래 성분은 왕성한 분열능을 가지고 있는 분열조직인 형성층 또는 전형성층으로부터 유래될 수 있다.
여기서, 상기 형성층이란, 식물의 줄기와 뿌리를 굵어지게 해서 식물이 부피생장을 할 수 있도록 하는 조직이다. 또한 형성층은 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직으로써 식물조직배양의 절편체로 사용 시 세포의 고속 및 대량생산이 가능하다고 보고되어 있다.
상기 전형성층이란, 유관속조직(1기물관부와 1기체관부)을 형성하는 1기분열조직으로서, 다발로 분화되며 식물의 성숙한 유관속조직과 연결된다. 또한, 전형성층은 생장하는 정단부와 성숙한 유관속조직 사이를 연결해야 할 부분에서 유관속조직을 형성하기 때문에 중요한 역할을 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 경피투여, 피하주사 또는 피부외용 제형일 수 있다. 예를 들어, 경피투여 제형의 한 양태는 연고제로, 이 제형은 당업계 공지된 바를 기초로 연고기제, 기타 첨가제 등을 적절히 배합 처리함으로써 제조할 수 있다. 연고기제는 예를 들면, 고급 지방산 또는 그의 에스테르류 (예, 아디프산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 아디프산에스테르, 미리스트산에스테르, 팔미트산에스테르, 세바스산디메틸, 라우르산헥실, 이소옥탄산세틸), 납류 (예, 경랍, 밀랍, 셀레신), 계면활성제 (예, 폴리옥시에틸렌알킬에테르인산에스테르), 고급 알코올(예, 세탄올, 스테아릴 알코올, 세토스테아릴알코올), 실리콘유 (예, 디메틸폴리실록산, 메틸페닐폴리실록산, 글리콜메틸폴리실록산, 실리콘글리콜폴리머), 탄화수소류 (예, 친수와세린, 백색와세린, 정제라놀린, 유동파라핀), 물, 보습제 (예, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 소르비톨), 감염방지제 등에서 적절히 선택하여 이용될 수 있다. 또한, 피하주사는 직접 피하에 주입하는 제형이며, 피부외용의 제형은 피부에 도포하는 제형으로 당업계에 통상적인 기술에 따라 목적하는 효과를 이루기 위해 다른 성분들을 적절하게 선택하여 배합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 예컨대, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 리브온(leave-on)형, 미스트 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 샴푸, 린스, 바디클렌저 등의 세정제, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 모발 영양화장수, 헤어에센스, 헤어세럼 스칼프트리트먼트, 헤어트리트먼트, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어로션, 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물, 수중유(O/W)형, 유중수(O/W)형 등의 기초 화장료로 제형화 될 수 있다.
또한, 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은, 각각의 제형에 있어서 상기한 필수성분 이외에 다른 성분들은 기타 외용제의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적합하게 선정하여 배합할 수 있다. 예컨대, 자외선 차단제, 헤어 컨디셔닝제, 향료등을 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유할 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화장료 조성물에 추가적으로 점증제를 함유할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 포함되는 점증제는 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 하이드록시 구아닌, 하이드록시 메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄, 세테아릴 알콜, 스테아릭산, 카라기난 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 카르복시 비닐 폴리머가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 필요에 따라 적절한 각종의 기제와 첨가제를 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예를 들면, 당업계에 통상적인 방부제, 색소, 첨가제 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 방부제는 구체적으로 페녹시에탄올(Phenoxyethanol) 또는 1,2-헥산디올 (1,2-Hexanediol) 등이 될 수 있고, 향료는 인공향료 등이 될 수 있다.
그리고, 본 발명의 일 실시예에서, 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.
또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.
또한, 본 발명에 의한 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 녹차 추출물을 더 함유할 수 있다. 녹차 추출물은 캄페롤 배당체를 함유하는 것이 바람직하며, 이는 물 또는 유기용매를 이용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 녹차잎 또는 녹차씨에 약 1 내지 6배, 바람직하게는 약 3배의 물 또는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상의 유기용매 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 넣고, 상온에서 1 내지 5회 교반하면서 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 식물에 약 1 내지 8배, 바람직하게는 약 4배의 물 또는 상기 유기용매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20 ℃에서 1 내지 3일간 침적시킨 후, 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한 다음, 수층을 상기 유기용매를 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 상기 유기용매 엑기스를 얻은 다음, 이를 소량의 메탄올 등에 녹인 후, 대량의 에틸아세테이트 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜, 캄페롤 배당체를 함유하는 녹차 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 모유두 세포의 증식을 향상시켜 발모생성을 유도하거나 촉진시킬 수 있으며, 콜라겐 생성을 증진시켜 두피의 탄력을 증가되어 탈모현상을 억제 또는 방지할 수 있다. 또한, 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 탈모현상을 유발하고 발모생성을 억제하는 두피 내 염증을 완화시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법은 S1) 녹차의 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 수득하는 단계; S2) 상기 수득된 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 식물줄기세포배양기술을 이용하여 배지에서 배양하는 단계; 및 S3) 상기 배양된 세포를 분리하여 녹차 줄기세포 유래 세포주(cell line), 그의 파쇄물 또는 그의 배양액을 수득하는 단계를 포함한다.
상기 S1) 단계는 녹차의 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 수득하는 단계로, 바람직하게는 녹차의 목부에 형성층 또는 전형성층을 분리하여 형성층 또는 전형성층에 있는 녹차의 줄기세포 조직을 분리시키는 단계이다.
상기 S2) 단계는 상기 수득된 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 식물줄기세포배양기술을 이용하여 배지에서 배양하는 단계로, 상기 녹차의 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종이상을 배지에 혼합하거나 치상하여 녹차 줄기세포 유래 세포주를 배양할 수 있으며, 또한 배양된 세포주를 계대배양하여 세포의 수를 늘려 대량생산이 가능하며, 상기 세포주를 안정화시킬 수 있다. 바람직하게는 녹차의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배지에 치상하여 녹차 줄기세포 유래 세포주를 배양하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 배양은 기관배양, 조직배양 및 세포배양으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 여기서, 상기'기관배양'은 장점, 줄기, 잎, 구근, 화기(꽃잎, 꽃받침, 수술, 약, 자방, 배주)등 식물체의 각 기관을 배양하여 유전적으로 동일한 개체를 재생시키는 것을 의미한다. 또한, 상기 '조직배양'은 기관의 일부인 조직을 분리하여 배양하는 것으로, 배양에서 얻은 캘러스를 분화시켜 식물체로 재생하는 것을 포함한다. 또한, 상기 '세포배양'은 캘러스를 액체 진탕 배양하는 것으로, 세포를 유리시키거나, 원형질체를 배양하거나, 체세포의 융합에 의해 새로운 개체의 육종을 시도하는 목적으로 사용될 수 있다.
상기 S3) 단계는 상기 녹차의 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상에서 배양된 세포를 분리하여 녹차 줄기세포 유래 세포주(cell line), 그의 파쇄물 또는 그의 배양액을 수득하는 단계로, 상기 S2) 단계에서의 녹차의 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상에서 상기 배양액과 자연스럽게 분리되어, 녹차 줄기세포 유래 세포주, 그의 파쇄물 또는 그의 배양액을 수득하는 단계일 수 있다. 바람직하게는 녹차의 형성층 또는 전형성층을 함유한 조직으로부터 배양된 세포를 분리하여 녹차 형성층 또는 전형성층 유래 세포주를 수득하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 S3) 단계 이후, S4) 상기 S3) 단계에서 얻은 세포주를 배양하는 단계; S5) 배양된 세포주를 물, 유기용매 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출하여 세포주의 추출물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 S4) 단계는 상기 S3) 단계에서 얻은 세포주를 배양하는 단계로, 상기 S2) 단계와 동일하거나 다른 성분을 포함한 배지를 이용하여 배양할 수 있으며, 상기 배양방법은 해당기술에서 사용되는 통상적인 방법일 수 있으며, 세포를 안정화하고, 계대배양하여 대량생산이 가능한 방법이라면, 특별히 제한하지 않는다.
상기 S5) 단계는 배양된 세포주를 물, 유기용매 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출하여 세포주의 추출물을 수득하는 단계로, 배양하여 얻은 세포주를 용매에 녹여 분리하는 단계이며, 이때, 유기용매는 C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 디에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매일 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 녹차 줄기세포 유래 원료로서 녹차의 배(embryo)·잎(needle) 유래 캘러스와 형성층 또는 전형성층 유래로부터 캘러스(callus)를 유도한 후 세포 배양(cell culture)하여 얻은 성분으로 그 세포주(cell line)의 모유두세포 증식, 콜라겐 생성 및 항염 효과를 확인하였으나, 그의 파쇄물 또는 그의 배양액을 사용해서도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
[실시예 1] 녹차의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 제조
1-1: 재료의 준비
녹차(Camellia Sinensis)의 씨앗, 잎, 잔가지 및 줄기를 각각 채취한 후, 즉시 항산화제 100㎎/L 아스코르브산(L-ascorbic acid, DUCHEFA, 네덜란드) 용액에 침적하여 운송·보관하였다. 그 후, 혼합용액(1% 베노밀(benomyl, 동부한농화학㈜, 한국), 1% 다코닐(daconil, 동부한농화학㈜, 한국), 1% 스트렙토마이신(sterptomycin sulphate, DUCHEFA, 네덜란드), 0.1% 세포탁심(cefotaxime sodium, DUCHEFA, 네덜란드))에 24시간 전처리 후 페놀 화합물(phenolic compound)과 잔존 화학물질을 제거하기 위하여 수돗물(tap water)로 30분간 세척하였다. 그리고, 70% 에탄올(ethanol, DC Chemical, 한국)에 1분, 30% 과산화수소(hydrogen peroxide, LG Chemical, 한국) 용액에 15분, 1% 클로록스(CLOROX) 용액에 15분, 3% 클로록스(CLOROX용액)에 5분 표면 살균 후 3~4회 세척하였다.
1-2: 각 부분로부터 전형성층 및 형성층 조직 분리
상기 살균과정을 거친 각 부분의 바깥조직들을 세로방향으로 잡아당기면 쉽게 벗겨졌다. 벗겨진 조직들은 목부, 전형성층(잔가지) 또는 형성층(줄기), 사부, 피층, 표피로 구성되는데, 벗겨진 조직들의 가장 안쪽조직 즉, 목부가 배지면에 닿도록 배양하였다.
1-3: 녹차의 전형성층 및 형성층 유래 세포주 유도단계
초기 배양 4~7일째 전형성층 및 형성층으로부터 세포 분열이 육안상으로 관찰되고, 배양 15일 이후에 사부·피층 및 표피로 이루어진 층으로부터 탈분화에 의한 무정형의 캘러스가 유도되기 시작하였다. 그러나 배양기간 내내 목부는 세포분열이 일어나지 않아 형성층의 층(layer)과의 분리가 자연스럽게 이루어졌다. 배양 30일 경과후 형성층의 층(layer)과 사부를 포함한 윗층, 즉 무정형의 캘러스층으로 분리되기 시작했고, 두 층이 자연스럽게 분리될 때까지 기다렸다가 완벽한 분리가 이루어지면 각기 다른 페트리디쉬(petridish)에 분리 배양하였다.
상기와 같이 분리한 후, 생장률이 좋은 희고 무른 부분을 유도배지와 동일한 새로운 배지로 매 21일째 계대하였다. 한편, 배 및 잎 유래 캘러스(callus) 및 전형성층 및 형성층 유래 세포주만을 유도하기 위해 사용한 배지는 하기 표 1과 같다.
구분 조성 함량(mg/L)
무기염 KNO3 1011.1
MgSO4·7H2O 121.56
MnSO4·4H2O 10
ZnSO4·7H2O 2
CuSO4·5H2O 0.025
CaCl2·2H2O 113.23
KI 0.75
CoCl2·6H2O 0.025
NaH2PO4·H2O 130.44
H3BO3 3
Na2MoO4·2H2O 0.25
FeNaEDTA 36.7
비타민 이노시톨(Myo-inositol) 200
티아민-HCl 20
니코틴산 2
피리독신-HCl 2
아스코르브산(L-ascorbic acid) 100
시트르산 150
식물 호르몬 옥신 1~3
지베렐린산 0.1
아미노산 카세인 가수분해물 500
수크로오스 30,000
활성탄 100
배지에 생장 조절제로서 옥신(Auxin)을 1~3mg/L의 농도로 첨가하였다. 배양은 25±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다.
1-4: 분리된 세포주의 증식단계 및 특성관찰
상기 배 및 잎 유래 캘러스(callus) 및 전형성층 및 형성층 유래 세포주를 하기 표 2의 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다.
구분 조성 함량(mg/L)
무기염 KNO3 1011.1
MgSO4·7H2O 121.56
MnSO4·4H2O 10
ZnSO4·7H2O 2
CuSO4·5H2O 0.025
CaCl2·2H2O 113.23
KI 0.75
CoCl2·6H2O 0.025
NaH2PO4·H2O 130.44
H3BO3 3
Na2MoO4·2H2O 0.25
FeNaEDTA 36.7
비타민 이노시톨(Myo-inositol) 200
티아민-HCl 20
니코틴산 2
피리독신-HCl 2
아스코르브산(L-ascorbic acid) 100
시트르산 150
식물 호르몬 옥신 1~3
지베렐린산 0.1
아미노산 아스파르트산 133
아르기닌 175
프롤린 115
글리신 75
수크로오스 20,000
한편, 대량 배양 가능성을 살펴보기 위하여, 3L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, 한국)에서 배(embryo)·잎(needle) 유래 캘러스와 전형성층 및 형성층 유래 세포를 배양하였다. 배지는 상기 표 2의 액상배지를 사용하였고, 암조건에서 25±1℃로 일정하게 유지하였다. 그 결과, 플라스크에서 배양 시 본 발명에 따른 세포주가 2~3배 정도의 높은 증식률을 보임을 확인하였으며, 대량 반응기에서는 본 발명에 따른 세포주가 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 5~6배의 높은 증식률을 보임을 확인하였다.
1-5: 당 및 메틸 자스모네이트의 처리
상기 실시예 1-4와 같이 14일간 현탁배양한 세포주를 멸균수에 원당 3~5중량%(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100μM를 첨가한 배지에서 10일간 암배양한 후, 세포를 수거하여 다음의 실험을 수행하였다.
[실시예 2] 녹차 유래 세포주의 추출물 제조
상기 실시예 1에서 제조된 세포주로부터 다음과 같이 단계별로 유효물질을 추출하였다.
(1) 배양액을 제거시킨 상기 세포주 500g에 500ml의 증류수를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.
(2) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 증류수 가용성물질을 얻었다.
(3) 상기 증류수 가용성 물질을 얻은 후, 남은 증류수 불용성물질에 500ml의 메탄올(methanol)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.
(4) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 메탄올 가용성물질을 얻었다.
(5) 상기 메탄올 가용성물질을 얻은 후, 남은 메탄올 불용성물질에 500ml의 아세톤(acetone)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.
(6) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 아세톤 가용성물질을 얻었다.
(7) 상기에서 얻은 증류수, 메탄올, 아세톤 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다.
(8) 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 세포배양액, 메탄올, 아세톤에 녹여 증류수 추출물, 메탄올 추출물, 아세톤 추출물을 얻었다.
[비교예 1] 녹차 열수 추출물의 제조
녹차 잎 2 ㎏에 증루수 6 ℓ를 넣고, 고온에서 3회 환류 추출한 후, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 녹차 열수 추출물 150 g을 수득하였다.
[시험예 1] 모유두 세포(dermal papilla cell, DP)증식 촉진 효과
상기 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물이 갖는 모낭 조직과 관련 세포에서의 생존능력 및 증식 촉진 효과를 평가하기 위해, WST-1 kit를 이용하였다.
우선적으로 모유두 세포는 10% 우혈청(fetal bovine serum, FBS)와 1% 페니실린(penicillin)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
배양된 세포를 96 well plate에 분주한(5x103cells/well) 후 37℃ CO2 배양기에서 24시간 배양했다. 이 후 상기 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물을 각 농도별(0.01, 0.05, 0.1, 0.5중량%)로 희석시켜 각 well에 처리하여 24시간 동안 배양시켰다. 그 다음, WST-1 반응액을 첨가제(supplement)가 제외된 배지에 1/10로 희석하고 이를 각 well당 100㎕씩 처리하여 37℃ 배양기에 넣고 1시간 후에 ELISA microplate reader(SoftMax Pro5, Molecular Devices, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 동일한 모유도 세포에 DMSO(dimethyl sulfoxide)만을 처리하여 이를 대조군으로 설정하였으며, 상기 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물이 아닌 5% 우혈청을 처리하여 이를 양성대조군으로 설정하였다. 그리고, 대조군의 흡광도 값을 100%로 하여 양성대조군 및 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물에 대한 상대 흡광도를 환산하여 도 1에 그래프로 나타냈다.
상기 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물을 농도별로 처리하여 모유두세포 증식 및 생존력을 측정한 결과, 저농도에서 고농도까지 모유두 세포의 손상을 나타내지 않음을 확인했다. 또한, 상기 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물에 대한 농도가 높아질수록 모유두 세포가 증식되는 것을 확이 했다. 더불어, 상기 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물을 0.1 내지 0.5 중량%의 농도로 처리한 모유두 세포는 양성대조군에 비해 우수한 세포 증식이 촉진되는 것을 확인하였다.
이에 따라 본 발명에 따른 녹차 줄기세포 유래 성분을 함유한 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 모유두 세포의 생존능력을 저하시키지 않으며 독성이 없고, 모유두 세포의 증식을 촉진하는 것을 확인했다.
[시험예 2] 콜라겐 합성 촉진 효과
상기 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물에 대한 두피 탄력 증진 효과를 확인하기 위하여, 탈모현상과 연관되는 콜라겐 생성 정도를 측정하였다.
50세의 한국인 여성 정상 두피의 두정부 부위에서 3mm 펀치로 두피 조직을 생검 하였다(단국대학교 천안 피부과 IRB). 모발이 두피로부터 나오는 방향과 펀치로 나오는 방향이 일치하도록 두피를 절단하였다. 생검한 두피 조직은 모낭(hair follicle)을 배양하는 방법인 William's E media(10ng/ml hydrocortisone, 2mM L-glutamine, 0.1% Fungizone, 1% anti-biotics/mycotics) 을 이용하여 상기 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물을 각 농도별(0.1, 0.5 중량%)로 희석시켜 각 well에 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 2일차 배양 후, OCT compound 용액에 조직을 심고 동결절편(cyosection)기를 이용하여 7㎛로 절단하였다. 이후, 면역형광염색을 하기 위해 타입 Ⅰ 콜라겐(COL1A1)와 타입 Ⅶ 콜라겐(COL7A1)의 1차 항체를 사용하였으며, 형광면역염색이 이루어진 커버글라스는 관찰을 위해 슬라이드에 올려 형광 현미경 또는 공촛점 레이져 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타냈다.
상기 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물을 농도별로 처리하여 타입 Ⅰ 콜라겐 및 타입 Ⅶ 콜라겐의 단백질 발현을 확인한 결과, 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물에 대한 농도가 높아질수록 두피 조직의 타입 Ⅰ 콜라겐 및 타입 Ⅶ 콜라겐의 단백질 발현이 증가되는 것을 확인 했다.
이에 따라 본 발명에 따른 녹차 줄기세포 유래 성분을 함유한 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 두피조직의 콜라겐 합성을 촉진하는 것을 확인했다.
[시험예 3] 두피 항염 효과
상기 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물이 두피 자극을 유발하고 모세혈관을 확장시키는 물질 또는 염증을 유발하는 물질을 억제하는지에 대한 효과를 정략적으로 측정 하기 위하여, 피부 조직 손상의 주요 원인의 일종인 일산화질소(Nitric oxide, NO)의 농도를 측정하였다.
우선, 마우스 대식세포(Raw 264.7)의 배양은 10% 우태아 혈청(Life Technologies, Inc.)과 페니실린 100IU/L 및 스트렙토마이신 100㎍의 항생제를 함유하는 디엠이엠(DMEM, Hyclone)배지에서 37℃ 및 5% CO2 하에서 수행하였다. 상기 세포의 배양액은 신선한 배지로 3일 또는 4일에 한번씩 교체해 주고, 세포의 밀도가 최상에 도달하면 1:5 내지 1:10의 분할비로 2차 배양을 실시하였다.
96웰 접시에 각 웰당 1 x 105 수의 세포를 분주하고 24시간 후에 무혈청 디엠이엠 배지(serum-free DMEM media)를 사용하여 상기 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물의 농도별(0.05, 0.1, 0.5중량%) 처리와 동시에, 일산화질소 유발제인 5㎍/ml의 리포다당질(Lipopolysaccharide, LPS)을 각 웰에 처리하였다. 그 다음, 1일동안 배양하였다. 여기서, 대조군은 LPS를 처리하지 않고DMEM 배지에서 배양하였다. 상기 각 실험군 및 대조군이 처리된 세포 배양액 50㎕와 동량의 그리스 시약(Griess Reagent)을 넣어주고 10분간 상온에서 반응시킨 후 광학분광기(Spectrophotometer)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이의 결과를 도 3에 나타냈다.
상기 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 2의 녹차 유래 세포주의 증류수 추출물은 유의한 수준으로 일산화질소 농도가 감소됨을 확인하였다.
이에 따라 본 발명에 따른 녹차 줄기세포 유래 성분을 함유한 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 두피 자극을 유발하지 않고 모세혈관을 확장시키거나 염증을 유발하는 물질을 억제할 수 있어 두피 항염 또는 진정 효과를 가지는 것을 확인했다.

Claims (12)

  1. 녹차(Camellia Sinensis) 줄기 세포 유래 세포주(cell line), 상기 세포주의 파쇄물, 상기 세포주의 추출물 및 상기 세포주의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 녹차 줄기세포 유래 성분을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 녹차 줄기세포 유래 성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10 중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 녹차는 녹차의 배, 잎, 가지 및 줄기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 부위인 것을 특징으로 하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 녹차 줄기세포 유래 성분은 녹차의 형성층 또는 전형성층으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 경피투여, 피하주사 또는 피부외용 제형인 것을 특징으로 하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 용액, 크림, 로션, 샴푸, 헤어토닉, 스프레이, 및 겔로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 모유두 세포의 증식을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 콜라겐 생성을 증진시켜 탈모현상을 방지하는 것을 특징으로 하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 두피 염증을 완화시키는 것을 특징으로 하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
  10. 제 1항에 따른 상기 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법으로서,
    S1) 녹차의 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 수득하는 단계;
    S2) 상기 수득된 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 식물줄기세포배양기술을 이용하여 배지에서 배양하는 단계; 및
    S3) 상기 녹차의 기관, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 1종 이상에서 배양된 세포를 분리하여 녹차 줄기세포 유래 세포주(cell line), 그의 파쇄물 또는 그의 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 S3) 단계 이후,
    S4) 상기 S3) 단계에서 얻은 세포주를 배양하는 단계;
    S5) 배양된 세포주를 물, 유기용매 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출하여 세포주의 추출물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 S5) 단계에서의 유기용매는 C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 디에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물의 제조방법.
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