WO2019058791A1 - レーザ脱離イオン化法及び質量分析方法 - Google Patents

レーザ脱離イオン化法及び質量分析方法 Download PDF

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matrix solution
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holes
sample support
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康秀 内藤
小谷　政弘
孝幸 大村
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浜松ホトニクス株式会社
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    • H01J49/16—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission
    • H01J49/161—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission using photoionisation, e.g. by laser
    • H01J49/164—Laser desorption/ionisation, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI]

Definitions

  • the present disclosure relates to laser desorption ionization and mass spectrometry.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • the present disclosure aims to provide a laser desorption ionization method and a mass spectrometry method capable of ionizing a high molecular weight sample and improving the resolution of an image in imaging mass spectrometry.
  • a laser desorption ionization method comprising: a substrate having a plurality of through holes opened in first and second surfaces facing each other; and a conductive layer provided on at least the first surface. And a second step of placing the sample support on the sample such that the sample is placed on the placement surface of the placement unit and the second surface is in contact with the sample. And a third step in which the matrix solution is introduced into the plurality of through holes, a state in which the sample is disposed between the mounting portion and the sample support, a voltage is applied to the conductive layer while the voltage is applied to the first surface. And a fourth step of ionizing components of the sample that has been mixed with the matrix solution and moved to the first surface side from the second surface side through the through holes by being irradiated with the laser light.
  • a sample support is placed on a sample, and a matrix solution is introduced into a plurality of through holes.
  • the matrix solution moves from the first surface side to the second surface side through each through hole and mixes with the components of the sample.
  • the components of the sample mix with the matrix solution and move from the second surface side to the first surface side through the respective through holes.
  • a voltage is applied to a conductive layer, energy is transmitted to the component of the sample which moved to the 1st surface side. Thereby, the components of the sample are ionized.
  • the components of the sample can be ionized with certainty. Further, the components of the sample move to the first surface side through the plurality of through holes. For this reason, in the component of the sample moved to the first surface side of the substrate, the position information of the sample (two-dimensional distribution information of the molecules constituting the sample) is maintained. In this state, the laser beam is irradiated to the first surface of the substrate while a voltage is applied to the conductive layer, so that the component of the sample is ionized while the positional information of the sample is maintained. This can improve the resolution of the image in imaging mass spectrometry. As described above, according to this laser desorption ionization method, it is possible to ionize a high molecular weight sample and to improve the resolution of an image in imaging mass spectrometry.
  • a laser desorption ionization method comprising: a substrate having a plurality of through holes opened in first and second surfaces facing each other; and a conductive layer provided on at least the first surface.
  • a sample support having a matrix solution introduced into a plurality of through holes is disposed on a sample.
  • the components of the sample mix with the matrix solution and move from the second surface side to the first surface side through the respective through holes.
  • a voltage is applied to a conductive layer, energy is transmitted to the component of the sample which moved to the 1st surface side.
  • the components of the sample are ionized.
  • the components of the high molecular weight sample can be ionized with certainty.
  • the components of the sample move to the first surface side through the plurality of through holes. For this reason, in the component of the sample moved to the first surface side of the substrate, the position information of the sample (two-dimensional distribution information of the molecules constituting the sample) is maintained.
  • the laser beam is irradiated to the first surface of the substrate while a voltage is applied to the conductive layer, so that the component of the sample is ionized while the positional information of the sample is maintained.
  • This can improve the resolution of the image in imaging mass spectrometry.
  • this laser desorption ionization method it is possible to ionize a high molecular weight sample and to improve the resolution of an image in imaging mass spectrometry.
  • the matrix solution in the third step, may be dropped from the first surface side to the plurality of through holes. In this case, the matrix solution can be easily introduced into each through hole.
  • the matrix solution in the second step, may be dropped to the plurality of through holes from the first surface side or the second surface side. In this case, the matrix solution can be easily introduced into each through hole.
  • the sample support in the second step, may be immersed in a matrix solution.
  • the matrix solution can be easily introduced into each through hole.
  • the sample may be a dry sample.
  • the components of the sample are mixed and moved with the matrix solution, the components of the sample can be smoothly moved even if the sample is a dry sample.
  • the laser desorption ionization method is provided with a sample support including a substrate having conductivity and having a plurality of through holes opening in the first surface and the second surface facing each other.
  • a second step in which the sample support is placed on the sample such that the sample is placed on the placement surface of the placement unit and the second surface is in contact with the sample;
  • a third step in which the solution is introduced and in a state in which the sample is disposed between the mounting portion and the sample support
  • the conductive layer can be omitted in the sample support, and the same effect as in the case of using the sample support provided with the conductive layer as described above can be obtained.
  • the laser desorption ionization method is provided with a sample support including a substrate having conductivity and having a plurality of through holes opening in the first surface and the second surface facing each other.
  • the second step in which the matrix solution is introduced into the plurality of through holes, and the sample is mounted on the sample such that the sample is mounted on the mounting surface of the mounting portion and the second surface is in contact with the sample
  • the third step in which the body is arranged and the sample is arranged between the mounting portion and the sample support
  • the conductive layer can be omitted in the sample support, and the same effect as in the case of using the sample support provided with the conductive layer as described above can be obtained.
  • the mass spectrometry according to one aspect of the present disclosure includes the steps of the laser desorption ionization method, and a fifth step in which the component ionized in the fourth step is detected.
  • this mass spectrometry method it is possible to perform imaging mass spectrometry that can ionize a high molecular weight sample and improve the resolution of an image.
  • a laser desorption ionization method and a mass spectrometry method capable of ionizing a high molecular weight sample and improving the resolution of an image in imaging mass spectrometry.
  • FIG. 1 is a plan view of a sample support used in the laser desorption ionization method and the mass spectrometry method of the first embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the sample support along the line II-II shown in FIG.
  • FIG. 3 is an enlarged view of a substrate of the sample support shown in FIG.
  • FIG. 4 is a view showing the steps of the mass spectrometry method of the first embodiment.
  • FIG. 5 is a diagram showing the steps of the mass spectrometry method of the first embodiment.
  • FIG. 6 is a view showing the steps of the mass spectrometry method of the first embodiment.
  • (A) of FIG. 7 is a two-dimensional image by the mass spectrometry method of the comparative example.
  • FIG. 7 is a mass spectrum by the mass spectrometry method of the comparative example.
  • A) of FIG. 8 is a two-dimensional image by the mass spectrometry method of the embodiment.
  • B) of FIG. 8 is a mass spectrum by the mass spectrometry method of the example.
  • A) of FIG. 9 is a two-dimensional image by the mass spectrometry method of another embodiment.
  • (B) of FIG. 9 is a mass spectrum by the mass spectrometry method of another embodiment.
  • FIG. 10 is a view showing the steps of the mass spectrometry method of the second embodiment.
  • FIG. 11 is a view showing the steps of the mass spectrometry method of the second embodiment.
  • the sample support 1 includes a substrate 2, a frame 3 and a conductive layer 4.
  • the substrate 2 has a first surface 2a and a second surface 2b facing each other.
  • a plurality of through holes 2 c are formed uniformly (with uniform distribution).
  • Each through hole 2c extends along the thickness direction of the substrate 2 (direction perpendicular to the first surface 2a and the second surface 2b), and is open to the first surface 2a and the second surface 2b. .
  • the substrate 2 is formed in, for example, a rectangular plate shape by an insulating material.
  • the length of one side of the substrate 2 when viewed from the thickness direction of the substrate 2 is, for example, about several cm, and the thickness of the substrate 2 is, for example, about 1 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the shape of the through hole 2c when viewed in the thickness direction of the substrate 2 is, for example, substantially circular.
  • the width of the through hole 2c is 1 nm to 700 nm.
  • the width of the through hole 2c means the diameter of the through hole 2c when the shape of the through hole 2c when viewed in the thickness direction of the substrate 2 is substantially circular, and the shape is other than substantially circular.
  • the pitch between the through holes 2c is 1 to 1000 nm.
  • the pitch between the through holes 2c means the distance between the centers of the respective circles when the shape of the through holes 2c when viewed in the thickness direction of the substrate 2 is substantially circular.
  • it means the distance between the central axes of the virtual maximum cylinder that fits in the through hole 2c.
  • the frame 3 is provided on the first surface 2 a of the substrate 2. Specifically, the frame 3 is fixed to the first surface 2 a of the substrate 2 by the adhesive layer 5. As a material of the adhesive layer 5, it is preferable to use an adhesive material (for example, low melting point glass, an adhesive for vacuum, etc.) with little emitted gas.
  • the frame 3 has an outer shape substantially the same as that of the substrate 2 when viewed in the thickness direction of the substrate 2.
  • An opening 3 a is formed in the frame 3. A portion of the substrate 2 corresponding to the opening 3a functions as an effective region R for moving a component of the sample described later to the first surface 2a side.
  • the frame 3 is formed in, for example, a rectangular plate shape by an insulating material.
  • the length of one side of the frame 3 when viewed from the thickness direction of the substrate 2 is, for example, about several centimeters, and the thickness of the frame 3 is, for example, 1 mm or less.
  • the shape of the opening 3a in the thickness direction of the substrate 2 is, for example, circular, and the diameter of the opening 3a in that case is, for example, about several mm to several tens of mm.
  • Such a frame 3 facilitates handling of the sample support 1 and suppresses deformation of the substrate 2 caused by temperature change or the like.
  • the conductive layer 4 is provided on the first surface 2 a of the substrate 2.
  • conductive layer 4 is a region of first surface 2a of substrate 2 corresponding to opening 3a of frame 3 (ie, a region corresponding to effective region R), the inner surface of opening 3a, and the substrate in frame 3 It is formed in a line (integrally) on the surface 3 b opposite to 2.
  • the conductive layer 4 covers a portion of the first surface 2 a of the substrate 2 in which the through holes 2 c are not formed. That is, in the effective region R, each through hole 2c is exposed to the opening 3a.
  • the conductive layer 4 is formed of a conductive material. However, as the material of the conductive layer 4, it is preferable to use a metal having a low affinity (reactivity) with the sample S and a high conductivity for the reason described below.
  • the conductive layer 4 is formed of a metal such as Cu (copper) having a high affinity to a sample such as a protein
  • the sample adheres to a sample molecule in a state where a Cu atom is attached in the process of ionization of the sample described later. It is ionized. And there exists a possibility that a detection result may shift
  • the higher the conductivity of the metal the easier and more stable the application of a constant voltage becomes. Therefore, when the conductive layer 4 is formed of a metal having high conductivity, it is possible to apply a voltage uniformly to the first surface 2 a of the substrate 2 in the effective region R. Also, the higher the conductivity of the metal, the higher the thermal conductivity. Therefore, when the conductive layer 4 is formed of a metal having high conductivity, the energy of the laser beam irradiated to the substrate 2 can be efficiently transmitted to the sample via the conductive layer 4. Therefore, as a material of the conductive layer 4, it is preferable to use a metal with high conductivity.
  • Au gold
  • Pt platinum
  • the conductive layer 4 is formed to a thickness of about 1 nm to 350 nm by, for example, a plating method, an atomic layer deposition (ALD), an evaporation method, a sputtering method, or the like.
  • ALD atomic layer deposition
  • evaporation method evaporation method
  • sputtering method evaporation method
  • a material of the conductive layer 4 for example, Cr (chromium), Ni (nickel), Ti (titanium) or the like may be used.
  • FIG. 3 is a view showing a magnified image of the substrate 2 when viewed from the thickness direction of the substrate 2.
  • the black portion is the through hole 2c
  • the white portion is the partition between the through holes 2c.
  • a plurality of through holes 2 c having a substantially constant width are uniformly formed in the substrate 2.
  • the aperture ratio of the through holes 2c in the effective area R (the ratio of all the through holes 2c to the effective area R when viewed from the thickness direction of the substrate 2) is 10 to 80% in practical use, and in particular It is preferably 60 to 80%.
  • the sizes of the plurality of through holes 2c may be uneven, or the plurality of through holes 2c may be partially connected to each other.
  • the substrate 2 shown in FIG. 3 is an alumina porous film formed by anodizing Al (aluminum). Specifically, the substrate 2 can be obtained by anodizing the Al substrate and peeling the oxidized surface portion from the Al substrate.
  • the substrate 2 is made of Ta (tantalum), Nb (niobium), Ti (titanium), Hf (hafnium), Zr (zirconium), Zn (zinc), W (tungsten), Bi (bismuth), Sb (antimony) Or the like may be formed by anodizing a valve metal other than Al, or may be formed by anodizing Si (silicon).
  • FIG. 4 to FIG. 6 the illustration of the through hole 2c, the conductive layer 4 and the adhesive layer 5 in the sample support 1 is omitted.
  • the dimensional ratio and the like of the sample support 1 shown in FIGS. 1 and 2 and the sample support 1 shown in FIGS. 4 to 6 are different.
  • the sample support 1 described above is prepared (first step).
  • the sample support 1 may be prepared by a person who implements the laser desorption ionization method and the mass spectrometry method, or may be prepared by being obtained from the manufacturer or seller of the sample support 1 It may be done.
  • the sample S to be subjected to mass analysis is placed on the placement surface 6 a of the slide glass (placement unit) 6 (second step).
  • the slide glass 6 is a glass substrate on which a transparent conductive film such as an ITO (Indium Tin Oxide) film is formed, and the surface of the transparent conductive film is a mounting surface 6 a.
  • ITO Indium Tin Oxide
  • the member (For example, the board
  • the sample support 1 is disposed on the sample S such that the second surface 2 b is in contact with the sample S (second step). At this time, the sample S is disposed in the effective area R when viewed from the thickness direction of the substrate 2.
  • the sample S is, for example, a thin film biological sample such as a tissue section.
  • the sample S is a dry sample.
  • a solution for example, an acetonitrile mixed solution or the like for reducing the viscosity of the component S1 may be mixed with the sample S. Subsequently, as shown in (a) of FIG.
  • the sample support 1 is fixed to the slide glass 6 in a state where the second surface 2 b of the substrate 2 is in contact with the sample S. At this time, the sample support 1 is fixed to the slide glass 6 by a conductive tape 7 (for example, a carbon tape or the like).
  • a conductive tape 7 for example, a carbon tape or the like.
  • the matrix solution 81 is introduced into the plurality of through holes 2c (see FIG. 2) of the sample support 1 (third step). Specifically, the matrix solution 81 is dropped, for example, by the pipette 8 from the side of the first surface 2 a of the sample support 1 to the plurality of through holes 2 c. The matrix solution 81 is dropped onto substantially the entire effective region R so as to reach the entire region of the sample S. More preferably, the matrix solution 81 is applied in a substantially uniform amount to the plurality of through holes 2c from the first surface 2a side of the sample support 1, for example, by an air brush or the like.
  • the matrix solution 81 moves from the side of the first surface 2 a of the sample support 1 toward the side of the second surface 2 b through the through holes 2 c. Then, the matrix solution 81 is mixed with the sample S in contact with the second surface 2 b of the sample support 1 in each through hole 2 c.
  • the matrix solution 81 may be prepared by a person who implements the laser desorption ionization method and the mass spectrometry method, or may be prepared by being obtained from the manufacturer or distributor of the matrix solution 81. It is also good.
  • the matrix solution 81 is a solution containing a matrix.
  • the matrix solution 81 is, for example, a solution prepared by dissolving 10 mg of matrix in 1 ml of acetonitrile.
  • the matrix is an organic compound that absorbs laser light.
  • the matrix is, for example, 2.5-dihydroxybenzoic acid (DHB) or the like.
  • the component S1 of the sample S is mixed with the matrix solution 81 moved to the second surface 2 b side of the sample support 1 in each through hole 2 c. It moves toward the 1st surface 2a side from the 2nd surface 2b side via each penetration hole 2c.
  • the mixture S2 of the component S1 and the matrix solution 81 remains on the first surface 2a side of the sample support 1 in each through hole 2c due to surface tension.
  • the laser light L is irradiated to the first surface 2 a of the substrate 2 through the opening 3 a of the frame 3 by the laser light irradiation unit 13 of the mass spectrometer 10 (fourth step). That is, the laser light L is applied to a region of the first surface 2 a of the substrate 2 corresponding to the opening 3 a of the frame 3 (that is, a region corresponding to the effective region R).
  • the laser beam irradiation unit 13 scans the laser beam L in a region corresponding to the effective region R.
  • region R can be implemented by at least one of the support part 12 and the laser beam irradiation part 13 being operated.
  • the component S1 moved to the first surface 2a side of the substrate 2 is ionized,
  • the sample ion S3 (ionized component S1) is released (fourth step).
  • the matrix in the matrix solution 81 moved to the first surface 2a side of the substrate 2 together with the conductive layer 4 (see FIG. 2) and the component S1 absorbs the energy of the laser light L. This energy causes the matrix to vaporize with component S1.
  • the component S1 that has been vaporized becomes a sample ion S3 by adding a proton or a cation to the molecule.
  • the above first to fourth steps correspond to the laser desorption ionization method using the sample support 1.
  • the released sample ions S3 move while accelerating toward a ground electrode (not shown) provided between the sample support 1 and the ion detection unit 15. That is, the sample ions S3 move while accelerating toward the ground electrode by the potential difference generated between the conductive layer 4 to which the voltage is applied and the ground electrode. Then, the sample ion S3 is detected by the ion detection unit 15 of the mass spectrometer 10 (fifth step).
  • the ion detection unit 15 detects the sample ion S3 so as to correspond to the scanning position of the laser light L. Thereby, the two-dimensional distribution of the molecules constituting the sample S can be imaged.
  • the mass spectrometer 10 is a scanning mass spectrometer that uses time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS). The above first to fifth steps correspond to a mass spectrometry method using the sample support 1.
  • the sample support 1 is disposed on the sample S, and the matrix solution 81 is introduced into the plurality of through holes 2c.
  • the matrix solution 81 moves from the side of the first surface 2a to the side of the second surface 2b via the through holes 2c, and mixes with the component S1 of the sample S.
  • the component S1 mixes with the matrix solution 81 and moves from the second surface 2b side to the first surface 2a side via the respective through holes 2c.
  • energy is transmitted to the component S1 moved to the first surface 2a side.
  • the component S1 is ionized.
  • the component S1 of the high molecular weight sample S can be ionized with certainty. Further, the component S1 moves to the first surface 2a side via the plurality of through holes 2c. For this reason, in the component S1 moved to the first surface 2a side of the substrate 2, position information of the sample S (two-dimensional distribution information of molecules constituting the sample S) is maintained. In this state, since the first surface 2a of the substrate 2 is irradiated with the laser beam L while a voltage is applied to the conductive layer 4, the component S1 of the sample S is ionized while the positional information of the sample S is maintained. .
  • this laser desorption ionization method it is possible to ionize the high molecular weight sample S and to improve the resolution of the image in imaging mass spectrometry.
  • the matrix solution 81 is dropped from the first surface 2a side to the plurality of through holes 2c.
  • the matrix solution 81 can be easily introduced into each through hole 2c.
  • the sample S is a dry sample.
  • the component S1 of the sample S mixes with the matrix solution 81 and moves, so that the component S1 can be moved smoothly even if the sample S is a dry sample.
  • the mass spectrometry of the first embodiment it is possible to perform imaging mass spectrometry capable of ionizing the high molecular weight sample S and improving the resolution of the image.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of the mass analysis method of the comparative example.
  • the sample support 1 was used, and the matrix solution 81 was not used to image the two-dimensional distribution of the molecular weight of the dried mouse brain slice (sample S).
  • sample S the dried mouse brain slice
  • FIG. 7A the contour L1 of the sample S is indicated by an imaginary line.
  • a signal of phospholipid could not be obtained.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of the mass spectrometry method of the example.
  • the sample support 1 and the matrix solution 81 (DHB matrix) were used to image the two-dimensional distribution of the molecular weight of the dried mouse brain slice (sample S) as in the comparative example.
  • an ion image of phospholipid could be obtained.
  • the contour L2 of the sample S is indicated by an imaginary line.
  • a phospholipid signal could be obtained.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of mass spectrometry according to another embodiment.
  • sample support 1 and matrix solution 81 (DHB matrix) were used to image the two-dimensional distribution of molecular weight of dried mouse liver sections (sample S).
  • DVB matrix matrix solution 81
  • an ion image of phospholipid could be obtained.
  • FIG. 9A the contour L3 of the sample S is indicated by an imaginary line.
  • a phospholipid signal could be obtained.
  • each through hole 2c is 1 to 700 nm, it is possible to obtain sufficient signal strength for a high molecular weight sample.
  • the laser desorption ionization method and the mass spectrometry method of the second embodiment using the sample support 1 will be described.
  • the sample support 1 into which the matrix solution 81 is introduced is introduced onto the sample S after the matrix solution 81 is introduced into the through holes 2 c of the sample support 1.
  • the arrangement is mainly different from the laser desorption ionization method and the mass spectrometry method of the first embodiment. That is, in the laser desorption ionization method and the mass spectrometry method of the second embodiment, the order of the second step and the third step of the laser desorption ionization method and the mass spectrometry method of the first embodiment is switched.
  • the rest of the laser desorption ionization method and the mass spectrometry method according to the second embodiment are the same as the laser desorption ionization method and the mass spectrometry method according to the first embodiment, and thus detailed description will be omitted.
  • FIG. 10 and FIG. 11 the illustration of the through hole 2c, the conductive layer 4 and the adhesive layer 5 in the sample support 1 is omitted. Further, for the sake of illustration, the dimensional ratio and the like differ between the sample support 1 shown in FIGS. 1 and 2 and the sample support 1 shown in FIGS. 10 and 11.
  • the sample support 1 described above is prepared (first step).
  • the matrix solution 81 is introduced into the plurality of through holes 2c (see FIG. 2) of the sample support 1 (second step).
  • the matrix solution 81 is dropped, for example, by the pipette 8 from the first surface 2 a of the sample support 1 to the plurality of through holes 2 c.
  • the matrix solution 81 is dropped onto substantially the entire effective region R. More preferably, the matrix solution 81 is applied in a substantially uniform amount to the plurality of through holes 2c from the first surface 2a side of the sample support 1, for example, by an air brush or the like.
  • the matrix solution 81 moves from the side of the first surface 2 a of the sample support 1 toward the side of the second surface 2 b through the through holes 2 c.
  • Each through hole 2 c is filled with a matrix solution 81.
  • the sample S is mounted on the mounting surface 6a of the slide glass 6 (third step).
  • the sample support 1 is disposed on the sample S such that the second surface 2 b is in contact with the sample S (third step).
  • the sample support 1 is fixed to the slide glass 6 by the tape 7 as in the first embodiment.
  • the matrix solution 81 in each through hole 2c mixes with the sample S in contact with the second surface 2b of the sample support 1 in each through hole 2c.
  • the component S1 of the sample S is mixed with the matrix solution 81 in each through hole 2c, and moves from the second surface 2b side of the sample support 1 toward the first surface 2a side through each through hole 2c.
  • the mixture S2 of the component S1 and the matrix solution 81 remains on the first surface 2a side of the sample support 1 in each through hole 2c due to surface tension.
  • the conductive layer 4 is formed by the voltage application unit 14. While the voltage is applied to (see FIG. 2), the laser light L is irradiated to the first surface 2 a of the sample support 1 by the laser light irradiation unit 13. As a result, the component S1 moved to the first surface 2a side of the substrate 2 is ionized, and the sample ion S3 (ionized component S1) is released (fourth step).
  • sample ion S3 is detected by the ion detection part 15 of the mass spectrometer 10 similarly to 1st Embodiment (5th process).
  • the laser desorption ionization method of the second embodiment includes the steps up to the fourth step described above.
  • the mass spectrometry method of the second embodiment includes the steps up to the fifth step described above.
  • the sample support 1 in which the matrix solution 81 is introduced into the plurality of through holes 2 c is disposed on the sample S.
  • the component S1 of the sample S mixes with the matrix solution 81 and moves from the second surface 2b side to the first surface 2a side via the respective through holes 2c.
  • the high molecular weight sample S is ionized and the resolution of the image in the imaging mass spectrometry is improved as in the laser desorption ionization method of the first embodiment described above. Can.
  • the matrix solution 81 is dropped from the first surface 2a side to the plurality of through holes 2c.
  • the matrix solution 81 can be easily introduced into each through hole 2c.
  • the present disclosure is not limited to the embodiments described above.
  • the conductive layer 4 may be provided at least on the first surface 2 a of the substrate 2, it may not be provided on the second surface 2 b of the substrate 2 and the inner surface of the through hole 2 c.
  • the conductive layer 4 may be provided on the second surface 2 b of the substrate 2 and the inner surface of the through hole 2 c.
  • the sample support 1 may be fixed to the slide glass 6 by means other than the tape 7 (for example, a means using an adhesive, a fixing tool, etc.).
  • a voltage may be applied to the conductive layer 4 without the placement surface 6 a of the slide glass 6 and the tape 7.
  • the slide glass 6 and the tape 7 may not have conductivity.
  • the substrate 2 may have conductivity, and a voltage may be applied to the substrate 2 in the fourth step.
  • the conductive layer 4 can be omitted in the sample support 1, and the same effect as in the case of using the sample support 1 provided with the conductive layer 4 as described above can be obtained.
  • the laser light irradiation unit 13 collectively irradiates the area corresponding to the effective area R with the laser light L, and the ion detection unit 15 detects the two-dimensional area of the area
  • the sample ion S3 may be detected while maintaining the information. That is, the mass spectrometer 10 may be a projection mass spectrometer.
  • the above-described laser desorption ionization method of each embodiment is used not only for imaging mass spectrometry for imaging the two-dimensional distribution of molecules constituting the sample S but also for other measurements and experiments such as ion mobility measurement. be able to.
  • the matrix solution 81 is dropped from the first surface 2a to the plurality of through holes 2c in the second step, but the matrix solution 81 is from the second surface 2b. It may be dropped to a plurality of through holes 2c.
  • the sample support 1 may be immersed in the matrix solution 81 in the second step. In any case, the matrix solution 81 can be easily introduced into each through hole 2c.
  • the opening 3a of the frame 3 has a circular shape when viewed from the thickness direction of the substrate 2.
  • the opening 3a may have various shapes.
  • the shape of the opening 3a of the frame 3 may be, for example, rectangular.
  • sample S may be a water-containing sample.
  • the sample S may be directly mounted on the support portion 12 of the mass spectrometer 10.
  • the support 12 of the mass spectrometer 10 corresponds to the slide glass 6.

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Abstract

レーザ脱離イオン化法は、互いに対向する第１表面（２ａ）及び第２表面（２ｂ）に開口する複数の貫通孔が形成された基板（２）と、少なくとも第１表面に設けられた導電層と、を備える試料支持体（１）が用意される第１工程と、試料（Ｓ）が載置部（６）の載置面（６ａ）に載置され、試料に第２表面が接触するように試料上に試料支持体が配置される第２工程と、複数の貫通孔にマトリックス溶液（８１）が導入される第３工程と、載置部と試料支持体との間に試料が配置された状態で、導電層に電圧が印加されつつ第１表面に対してレーザ光（Ｌ）が照射されることにより、マトリックス溶液と混合すると共に第２表面側から貫通孔を介して第１表面側に移動した試料の成分（Ｓ１）がイオン化される第４工程と、を備える。

Description

レーザ脱離イオン化法及び質量分析方法
　本開示は、レーザ脱離イオン化法及び質量分析方法に関する。
　従来、質量分析等を行うために生体試料等の試料をイオン化する手法として、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ：Matrix-Assisted　Laser　Desorption/Ionization）が知られている。ＭＡＬＤＩは、レーザ光を吸収するマトリックスと呼ばれる低分子量の有機化合物を試料に加え、これにレーザ光を照射することにより、試料をイオン化する手法である。この手法によれば、熱に不安定な物質や高分子量物質を非破壊でイオン化すること（いわゆるソフトイオン化）が可能である。
米国特許第７６９５９７８号明細書
　しかしながら、試料を構成する分子の二次元分布を画像化するイメージング質量分析に上述したようなＭＡＬＤＩを利用した場合には、画像の解像度を高めるに限界があった。
　そこで、本開示は、高分子量の試料をイオン化すると共にイメージング質量分析における画像の解像度を向上させることができるレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法を提供することを目的とする。
　本開示の一側面のレーザ脱離イオン化法は、互いに対向する第１表面及び第２表面に開口する複数の貫通孔が形成された基板と、少なくとも第１表面に設けられた導電層と、を備える試料支持体が用意される第１工程と、試料が載置部の載置面に載置され、試料に第２表面が接触するように試料上に試料支持体が配置される第２工程と、複数の貫通孔にマトリックス溶液が導入される第３工程と、載置部と試料支持体との間に試料が配置された状態で、導電層に電圧が印加されつつ第１表面に対してレーザ光が照射されることにより、マトリックス溶液と混合すると共に第２表面側から貫通孔を介して第１表面側に移動した試料の成分がイオン化される第４工程と、を備える。
　このレーザ脱離イオン化法では、試料支持体が試料上に配置され、複数の貫通孔にマトリックス溶液が導入される。マトリックス溶液は、第１表面側から各貫通孔を介して第２表面側に移動し、試料の成分と混合する。試料の成分は、マトリックス溶液と混合すると共に第２表面側から各貫通孔を介して第１表面側に移動する。そして、導電層に電圧が印加されつつ第１表面に対してレーザ光が照射されると、第１表面側に移動した試料の成分にエネルギーが伝達される。これにより、試料の成分がイオン化される。このレーザ脱離イオン化法では、試料の成分がマトリックス溶液と混合してイオン化されるため、高分子量の試料の成分を確実にイオン化することができる。また、試料の成分は、複数の貫通孔を介して第１表面側に移動する。このため、基板の第１表面側に移動した試料の成分においては、試料の位置情報（試料を構成する分子の二次元分布情報）が維持される。この状態で、導電層に電圧が印加されつつ基板の第１表面に対してレーザ光が照射されるため、試料の位置情報が維持されつつ試料の成分がイオン化される。これにより、イメージング質量分析における画像の解像度を向上させることができる。以上により、このレーザ脱離イオン化法によれば、高分子量の試料をイオン化すると共にイメージング質量分析における画像の解像度を向上させることができる。
　本開示の一側面のレーザ脱離イオン化法は、互いに対向する第１表面及び第２表面に開口する複数の貫通孔が形成された基板と、少なくとも第１表面に設けられた導電層と、を備える試料支持体が用意される第１工程と、複数の貫通孔にマトリックス溶液が導入される第２工程と、試料が載置部の載置面に載置され、試料に第２表面が接触するように試料上に試料支持体が配置される第３工程と、載置部と試料支持体との間に試料が配置された状態で、導電層に電圧が印加されつつ第１表面に対してレーザ光が照射されることにより、マトリックス溶液と混合すると共に第２表面側から貫通孔を介して第１表面側に移動した試料の成分がイオン化される第４工程と、を備える。
　このレーザ脱離イオン化法では、複数の貫通孔にマトリックス溶液が導入された試料支持体が試料上に配置される。試料の成分は、マトリックス溶液と混合すると共に第２表面側から各貫通孔を介して第１表面側に移動する。そして、導電層に電圧が印加されつつ第１表面に対してレーザ光が照射されると、第１表面側に移動した試料の成分にエネルギーが伝達される。これにより、試料の成分がイオン化される。このレーザ脱離イオン化法では、試料の成分がマトリックス溶液と混合してイオン化されるため、高分子量の試料の成分を確実にイオン化することができる。また、試料の成分は、複数の貫通孔を介して第１表面側に移動する。このため、基板の第１表面側に移動した試料の成分においては、試料の位置情報（試料を構成する分子の二次元分布情報）が維持される。この状態で、導電層に電圧が印加されつつ基板の第１表面に対してレーザ光が照射されるため、試料の位置情報が維持されつつ試料の成分がイオン化される。これにより、イメージング質量分析における画像の解像度を向上させることができる。以上により、このレーザ脱離イオン化法によれば、高分子量の試料をイオン化すると共にイメージング質量分析における画像の解像度を向上させることができる。
　本開示の一側面のレーザ脱離イオン化法では、第３工程においては、マトリックス溶液が第１表面側から複数の貫通孔に対して滴下されてもよい。この場合、マトリックス溶液を各貫通孔に容易に導入することができる。
　本開示の一側面のレーザ脱離イオン化法では、第２工程においては、マトリックス溶液が第１表面側又は第２表面側から複数の貫通孔に対して滴下されてもよい。この場合、マトリックス溶液を各貫通孔に容易に導入することができる。
　本開示の一側面のレーザ脱離イオン化法では、第２工程においては、試料支持体がマトリックス溶液に浸漬されてもよい。この場合、マトリックス溶液を各貫通孔に容易に導入することができる。
　本開示の一側面のレーザ脱離イオン化法では、試料は、乾燥試料であってもよい。このレーザ脱離イオン化法では、試料の成分がマトリックス溶液と混合すると共に移動するため、試料が乾燥試料であっても、試料の成分をスムーズに移動させることができる。
　本開示の一側面のレーザ脱離イオン化法は、導電性を有し、互いに対向する第１表面及び第２表面に開口する複数の貫通孔が形成された基板を備える試料支持体が用意される第１工程と、試料が載置部の載置面に載置され、試料に第２表面が接触するように試料上に試料支持体が配置される第２工程と、複数の貫通孔にマトリックス溶液が導入される第３工程と、載置部と試料支持体との間に試料が配置された状態で、基板に電圧が印加されつつ第１表面に対してレーザ光が照射されることにより、マトリックス溶液と混合すると共に第２表面側から貫通孔を介して第１表面側に移動した試料の成分がイオン化される第４工程と、を備える。
　このレーザ脱離イオン化法によれば、試料支持体において導電層を省略することができると共に、上述したように導電層を備える試料支持体を用いる場合と同様の効果を得ることができる。
　本開示の一側面のレーザ脱離イオン化法は、導電性を有し、互いに対向する第１表面及び第２表面に開口する複数の貫通孔が形成された基板を備える試料支持体が用意される第１工程と、複数の貫通孔にマトリックス溶液が導入される第２工程と、試料が載置部の載置面に載置され、試料に第２表面が接触するように試料上に試料支持体が配置される第３工程と、載置部と試料支持体との間に試料が配置された状態で、基板に電圧が印加されつつ第１表面に対してレーザ光が照射されることにより、マトリックス溶液と混合すると共に第２表面側から貫通孔を介して第１表面側に移動した試料の成分がイオン化される第４工程と、を備える。
　このレーザ脱離イオン化法によれば、試料支持体において導電層を省略することができると共に、上述したように導電層を備える試料支持体を用いる場合と同様の効果を得ることができる。
　本開示の一側面の質量分析法は、上記レーザ脱離イオン化法の各工程と、第４工程においてイオン化された成分が検出される第５工程と、を備える。
　この質量分析方法によれば、高分子量の試料をイオン化すると共に画像の解像度を向上させることができるイメージング質量分析を行うことが可能となる。
　本開示によれば、高分子量の試料をイオン化すると共にイメージング質量分析における画像の解像度を向上させることができるレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法を提供することが可能となる。
図１は、第１実施形態のレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法に用いられる試料支持体の平面図である。 図２は、図１に示されるII－II線に沿っての試料支持体の断面図である。 図３は、図１に示される試料支持体の基板の拡大像を示す図である。 図４は、第１実施形態の質量分析方法の工程を示す図である。 図５は、第１実施形態の質量分析方法の工程を示す図である。 図６は、第１実施形態の質量分析方法の工程を示す図である。 図７の（ａ）は、比較例の質量分析方法による二次元画像である。図７の（ｂ）は、比較例の質量分析方法によるマススペクトルである。 図８の（ａ）は、実施例の質量分析方法による二次元画像である。図８の（ｂ）は、実施例の質量分析方法によるマススペクトルである。 図９の（ａ）は、他の実施例の質量分析方法による二次元画像である。図９の（ｂ）は、他の実施例の質量分析方法によるマススペクトルである。 図１０は、第２実施形態の質量分析方法の工程を示す図である。 図１１は、第２実施形態の質量分析方法の工程を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、各図において同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
［第１実施形態］
　最初に、第１実施形態及び第２実施形態のレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法に用いられる試料支持体について説明する。図１及び図２に示されるように、試料支持体１は、基板２と、フレーム３と、導電層４と、を備えている。基板２は、互いに対向する第１表面２ａ及び第２表面２ｂを有している。基板２には、複数の貫通孔２ｃが一様に（均一な分布で）形成されている。各貫通孔２ｃは、基板２の厚さ方向（第１表面２ａ及び第２表面２ｂに垂直な方向）に沿って延在しており、第１表面２ａ及び第２表面２ｂに開口している。
　基板２は、例えば、絶縁性材料によって長方形板状に形成されている。基板２の厚さ方向から見た場合における基板２の一辺の長さは、例えば数ｃｍ程度であり、基板２の厚さは、例えば１μｍ～５０μｍ程度である。基板２の厚さ方向から見た場合における貫通孔２ｃの形状は、例えば略円形である。貫通孔２ｃの幅は、１ｎｍ～７００ｎｍである。貫通孔２ｃの幅とは、基板２の厚さ方向から見た場合における貫通孔２ｃの形状が略円形である場合には、貫通孔２ｃの直径を意味し、当該形状が略円形以外である場合には、貫通孔２ｃに収まる仮想的な最大円柱の直径（有効径）を意味する。各貫通孔２ｃ間のピッチは、１～１０００ｎｍである。各貫通孔２ｃ間のピッチとは、基板２の厚さ方向から見た場合における貫通孔２ｃの形状が略円形である場合には、当該各円の中心間距離を意味し、当該形状が略円形以外である場合には、貫通孔２ｃに収まる仮想的な最大円柱の中心軸間距離を意味する。
　フレーム３は、基板２の第１表面２ａに設けられている。具体的には、フレーム３は、接着層５によって基板２の第１表面２ａに固定されている。接着層５の材料としては、放出ガスの少ない接着材料（例えば、低融点ガラス、真空用接着剤等）が用いられることが好ましい。フレーム３は、基板２の厚さ方向から見た場合に基板２と略同一の外形を有している。フレーム３には、開口３ａが形成されている。基板２のうち開口３ａに対応する部分は、後述する試料の成分を第１表面２ａ側に移動させるための実効領域Ｒとして機能する。
　フレーム３は、例えば、絶縁性材料によって長方形板状に形成されている。基板２の厚さ方向から見た場合におけるフレーム３の一辺の長さは、例えば数ｃｍ程度であり、フレーム３の厚さは、例えば１ｍｍ以下である。基板２の厚さ方向から見た場合における開口３ａの形状は、例えば円形であり、その場合における開口３ａの直径は、例えば数ｍｍ～数十ｍｍ程度である。このようなフレーム３によって、試料支持体１のハンドリングが容易化すると共に、温度変化等に起因する基板２の変形が抑制される。
　導電層４は、基板２の第１表面２ａに設けられている。具体的には、導電層４は、基板２の第１表面２ａのうちフレーム３の開口３ａに対応する領域（すなわち、実効領域Ｒに対応する領域）、開口３ａの内面、及びフレーム３における基板２とは反対側の表面３ｂに一続きに（一体的に）形成されている。導電層４は、実効領域Ｒにおいて、基板２の第１表面２ａのうち貫通孔２ｃが形成されていない部分を覆っている。つまり、実効領域Ｒにおいては、各貫通孔２ｃが開口３ａに露出している。
　導電層４は、導電性材料によって形成されている。ただし、導電層４の材料としては、以下に述べる理由により、試料Ｓとの親和性（反応性）が低く且つ導電性が高い金属が用いられることが好ましい。
　例えば、タンパク質等の試料と親和性が高いＣｕ（銅）等の金属によって導電層４が形成されていると、後述する試料のイオン化の過程において、試料分子にＣｕ原子が付着した状態で試料がイオン化される。そして、Ｃｕ原子が付着した分だけ、後述する質量分析法において検出結果がずれるおそれがある。したがって、導電層４の材料としては、試料との親和性が低い金属が用いられることが好ましい。
　一方、導電性の高い金属ほど一定の電圧を容易に且つ安定して印加し易くなる。そのため、導電性が高い金属によって導電層４が形成されていると、実効領域Ｒにおいて基板２の第１表面２ａに均一に電圧を印加することが可能となる。また、導電性の高い金属ほど熱伝導性も高い傾向にある。そのため、導電性が高い金属によって導電層４が形成されていると、基板２に照射されたレーザ光のエネルギーを、導電層４を介して試料に効率的に伝えることが可能となる。したがって、導電層４の材料としては、導電性の高い金属が用いられることが好ましい。
　以上の観点から、導電層４の材料としては、例えば、Ａｕ（金）、Ｐｔ（白金）等が用いられることが好ましい。導電層４は、例えば、メッキ法、原子層堆積法（ＡＬＤ：Atomic　Layer　Deposition）、蒸着法、スパッタ法等によって、厚さ１ｎｍ～３５０ｎｍ程度に形成される。なお、導電層４の材料としては、例えば、Ｃｒ（クロム）、Ｎｉ（ニッケル）、Ｔｉ（チタン）等が用いられてもよい。
　図３は、基板２の厚さ方向から見た場合における基板２の拡大像を示す図である。図３において、黒色の部分は貫通孔２ｃであり、白色の部分は貫通孔２ｃ間の隔壁部である。図３に示されるように、基板２は、略一定の幅を有する複数の貫通孔２ｃが一様に形成されている。実効領域Ｒにおける貫通孔２ｃの開口率（基板２の厚さ方向から見た場合に実効領域Ｒに対して全ての貫通孔２ｃが占める割合）は、実用上は１０～８０％であり、特に６０～８０％であることが好ましい。複数の貫通孔２ｃの大きさは互いに不揃いであってもよいし、部分的に複数の貫通孔２ｃ同士が互いに連結していてもよい。
　図３に示される基板２は、Ａｌ（アルミニウム）を陽極酸化することにより形成されたアルミナポーラス皮膜である。具体的には、Ａｌ基板に対して陽極酸化処理を施し、酸化された表面部分をＡｌ基板から剥離することにより、基板２を得ることができる。なお、基板２は、Ｔａ（タンタル）、Ｎｂ（ニオブ）、Ｔｉ（チタン）、Ｈｆ（ハフニウム）、Ｚｒ（ジルコニウム）、Ｚｎ（亜鉛）、Ｗ（タングステン）、Ｂｉ（ビスマス）、Ｓｂ（アンチモン）等のＡｌ以外のバルブ金属を陽極酸化することにより形成されてもよいし、Ｓｉ（シリコン）を陽極酸化することにより形成されてもよい。
　次に、試料支持体１を用いた第１実施形態のレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法について説明する。図４～図６においては、試料支持体１における貫通孔２ｃ、導電層４及び接着層５の図示が省略されている。また、図１及び図２に示される試料支持体１と図４～図６に示される試料支持体１とでは、図示の便宜上、寸法の比率等が異なっている。
　まず、上述した試料支持体１が用意される（第１工程）。試料支持体１は、レーザ脱離イオン化法及び質量分析方法を実施する者によって製造されることで用意されてもよいし、試料支持体１の製造者又は販売者等から取得されることで用意されてもよい。
　続いて、図４の（ａ）に示されるように、質量分析対象となる試料Ｓがスライドガラス（載置部）６の載置面６ａに載置される（第２工程）。スライドガラス６は、ＩＴＯ（Indium　Tin　Oxide)膜等の透明導電膜が形成されたガラス基板であり、透明導電膜の表面が載置面６ａとなっている。なお、スライドガラス６に限定されず、導電性を確保し得る部材（例えば、ステンレス等の金属材料等からなる基板等）を載置部として用いることができる。続いて、図４の（ｂ）に示されるように、試料Ｓに第２表面２ｂが接触するように試料Ｓ上に試料支持体１が配置される（第２工程）。このとき、試料Ｓは、基板２の厚さ方向から見た場合に実効領域Ｒ内に配置される。ここで、試料Ｓは、例えば組織切片等の薄膜状の生体試料である。試料Ｓは、乾燥試料である。また、試料Ｓの成分Ｓ１（図６参照）の移動をスムーズにするために、成分Ｓ１の粘性を低くするための溶液（例えばアセトニトリル混合液等）を試料Ｓに混ぜてもよい。続いて、図５の（ａ）に示されるように、試料Ｓに基板２の第２表面２ｂが接触させられた状態で、スライドガラス６に対して試料支持体１が固定される。このとき、試料支持体１は、導電性を有するテープ７（例えば、カーボンテープ等）によって、スライドガラス６に対して固定される。
　続いて、図５の（ｂ）に示されるように、試料支持体１の複数の貫通孔２ｃ（図２参照）にマトリックス溶液８１が導入される（第３工程）。具体的には、マトリックス溶液８１は、例えばピペット８によって試料支持体１の第１表面２ａ側から複数の貫通孔２ｃに対して滴下される。マトリックス溶液８１は、試料Ｓの全領域に届くように、実効領域Ｒのほぼ全領域に滴下される。より好ましくは、マトリックス溶液８１は、例えばエアブラシ等によって、試料支持体１の第１表面２ａ側から複数の貫通孔２ｃに対して略均一な量塗布される。マトリックス溶液８１は、試料支持体１の第１表面２ａ側から各貫通孔２ｃを介して第２表面２ｂ側に向かって移動する。そして、マトリックス溶液８１は、各貫通孔２ｃにおいて試料支持体１の第２表面２ｂと接触している試料Ｓと混合する。マトリックス溶液８１は、レーザ脱離イオン化法及び質量分析方法を実施する者によって製造されることで用意されてもよいし、マトリックス溶液８１の製造者又は販売者等から取得されることで用意されてもよい。
　マトリックス溶液８１は、マトリックスを含んだ溶液である。マトリックス溶液８１は、例えば１０ｍｇのマトリックスを１ｍｌのアセトニトリルに溶解させることによって調製された溶液等である。マトリックスは、レーザ光を吸収する有機化合物である。マトリックスは、例えば、２．５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）等である。
　図６の（ａ）に示されるように、試料Ｓの成分Ｓ１は、各貫通孔２ｃにおいて、試料支持体１の第２表面２ｂ側に移動したマトリックス溶液８１と混合すると共に試料支持体１の第２表面２ｂ側から各貫通孔２ｃを介して第１表面２ａ側に向かって移動する。そして、成分Ｓ１とマトリックス溶液８１との混合物Ｓ２は、表面張力によって各貫通孔２ｃにおいて試料支持体１の第１表面２ａ側に留まる。
　続いて、図６の（ｂ）に示されるように、スライドガラス６と試料支持体１との間に試料Ｓが配置された状態で、スライドガラス６、試料支持体１及び試料Ｓが、質量分析装置１０の支持部１２（例えば、ステージ）上に載置される。続いて、質量分析装置１０の電圧印加部１４によって、スライドガラス６の載置面６ａ及びテープ７を介して試料支持体１の導電層４（図２参照）に電圧が印加される（第４工程）。続いて、質量分析装置１０のレーザ光照射部１３によって、フレーム３の開口３ａを介して、基板２の第１表面２ａに対してレーザ光Ｌが照射される（第４工程）。つまり、レーザ光Ｌは、基板２の第１表面２ａのうちフレーム３の開口３ａに対応する領域（すなわち、実効領域Ｒに対応する領域）に対して照射される。ここでは、レーザ光照射部１３は、実効領域Ｒに対応する領域に対してレーザ光Ｌを走査する。なお、実効領域Ｒに対応する領域に対するレーザ光Ｌの走査は、支持部１２及びレーザ光照射部１３の少なくとも１つが動作させられることにより、実施可能である。
　このように、導電層４に電圧が印加されつつ基板２の第１表面２ａに対してレーザ光Ｌが照射されることにより、基板２の第１表面２ａ側に移動した成分Ｓ１がイオン化され、試料イオンＳ３（イオン化された成分Ｓ１）が放出される（第４工程）。具体的には、導電層４（図２参照）、及び、成分Ｓ１と共に基板２の第１表面２ａ側に移動したマトリックス溶液８１中のマトリックスが、レーザ光Ｌのエネルギーを吸収する。このエネルギーによって、マトリックスは成分Ｓ１と共に気化する。そして、気化した成分Ｓ１は、その分子にプロトン又はカチオンが付加されることで、試料イオンＳ３となる。以上の第１工程～第４工程が、試料支持体１を用いたレーザ脱離イオン化法に相当する。
　放出された試料イオンＳ３は、試料支持体１とイオン検出部１５との間に設けられたグランド電極（図示省略）に向かって加速しながら移動する。つまり、試料イオンＳ３は、電圧が印加された導電層４とグランド電極との間に生じた電位差によって、グランド電極に向かって加速しながら移動する。そして、質量分析装置１０のイオン検出部１５によって試料イオンＳ３が検出される（第５工程）。ここでは、イオン検出部１５は、レーザ光Ｌの走査位置に対応するように、試料イオンＳ３を検出する。これにより、試料Ｓを構成する分子の二次元分布を画像化することができる。なお、ここでの質量分析装置１０は、飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ－ＭＳ：Time-of-Flight　Mass　Spectrometry）を利用する走査型質量分析装置である。以上の第１工程～第５工程が、試料支持体１を用いた質量分析方法に相当する。
　以上説明したように、第１実施形態のレーザ脱離イオン化法では、試料支持体１が試料Ｓ上に配置され、複数の貫通孔２ｃにマトリックス溶液８１が導入される。マトリックス溶液８１は、第１表面２ａ側から各貫通孔２ｃを介して第２表面２ｂ側に移動し、試料Ｓの成分Ｓ１と混合する。成分Ｓ１は、マトリックス溶液８１と混合すると共に第２表面２ｂ側から各貫通孔２ｃを介して第１表面２ａ側に移動する。そして、導電層４に電圧が印加されつつ第１表面２ａに対してレーザ光Ｌが照射されると、第１表面２ａ側に移動した成分Ｓ１にエネルギーが伝達される。これにより、成分Ｓ１がイオン化される。このレーザ脱離イオン化法では、成分Ｓ１がマトリックス溶液８１と混合してイオン化されるため、高分子量の試料Ｓの成分Ｓ１を確実にイオン化することができる。また、成分Ｓ１は、複数の貫通孔２ｃを介して第１表面２ａ側に移動する。このため、基板２の第１表面２ａ側に移動した成分Ｓ１においては、試料Ｓの位置情報（試料Ｓを構成する分子の二次元分布情報）が維持される。この状態で、導電層４に電圧が印加されつつ基板２の第１表面２ａに対してレーザ光Ｌが照射されるため、試料Ｓの位置情報が維持されつつ試料Ｓの成分Ｓ１がイオン化される。これにより、イメージング質量分析における画像の解像度を向上させることができる。以上により、このレーザ脱離イオン化法によれば、高分子量の試料Ｓをイオン化すると共にイメージング質量分析における画像の解像度を向上させることができる。
　また、第１実施形態のレーザ脱離イオン化法では、第３工程において、マトリックス溶液８１が第１表面２ａ側から複数の貫通孔２ｃに対して滴下される。この場合、マトリックス溶液８１を各貫通孔２ｃに容易に導入することができる。
　また、第１実施形態のレーザ脱離イオン化法では、試料Ｓが、乾燥試料である。このレーザ脱離イオン化法では、試料Ｓの成分Ｓ１がマトリックス溶液８１と混合すると共に移動するため、試料Ｓが乾燥試料であっても、成分Ｓ１をスムーズに移動させることができる。
　第１実施形態の質量分析法によれば、高分子量の試料Ｓをイオン化すると共に画像の解像度を向上させることができるイメージング質量分析を行うことが可能となる。
　図７は、比較例の質量分析方法による結果を示す図である。比較例では、試料支持体１を用い、マトリックス溶液８１を用いずに、乾燥したマウスの脳切片（試料Ｓ）の分子量の二次元分布を画像化した。図７の（ａ）に示されるように、比較例の質量分析方法では、リン脂質のイオン像を得ることができなかった。なお、図７の（ａ）では、試料Ｓの輪郭Ｌ１を仮想線で示している。また、図７の（ｂ）に示されるように、比較例の質量分析方法では、リン脂質の信号を得ることができなかった。
　図８は、実施例の質量分析方法による結果を示す図である。実施例では、試料支持体１、及びマトリックス溶液８１（ＤＨＢマトリックス）を用いて、比較例と同様に、乾燥したマウスの脳切片（試料Ｓ）の分子量の二次元分布を画像化した。図８の（ａ）に示されるように、実施例の質量分析方法では、リン脂質のイオン像を得ることができた。なお、図８の（ａ）では、試料Ｓの輪郭Ｌ２を仮想線で示している。また、図８の（ｂ）に示されるように、実施例の質量分析方法では、リン脂質の信号を得ることができた。
　図９は、他の実施例の質量分析方法による結果を示す図である。他の実施例では、試料支持体１、及びマトリックス溶液８１（ＤＨＢマトリックス）を用いて、乾燥したマウスの肝臓切片（試料Ｓ）の分子量の二次元分布を画像化した。図９の（ａ）に示されるように、他の実施例の質量分析方法では、リン脂質のイオン像を得ることができた。なお、図９の（ａ）では、試料Ｓの輪郭Ｌ３を仮想線で示している。また、図９の（ｂ）に示されるように、実施例の質量分析方法では、リン脂質の信号を得ることができた。
　また、実施例及び他の実施例の質量分析方法では、各貫通孔２ｃの幅が、１～７００ｎｍであるため、高分子量の試料に対する十分な信号強度を得ることができた。
［第２実施形態］
　次に、試料支持体１を用いた第２実施形態のレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法について説明する。第２実施形態のレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法は、試料支持体１の貫通孔２ｃにマトリックス溶液８１が導入された後に、マトリックス溶液８１が導入された試料支持体１が試料Ｓ上に配置される点で、第１実施形態のレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法と主に相違している。つまり、第２実施形態のレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法では、第１実施形態のレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法の第２工程と第３工程との順番が入れ替わっている。第２実施形態のレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法のその他は、第１実施形態のレーザ脱離イオン化法及び質量分析方法と同様であるため、詳細な説明については省略する。図１０及び図１１においては、試料支持体１における貫通孔２ｃ、導電層４及び接着層５の図示が省略されている。また、図１及び図２に示される試料支持体１と図１０及び図１１に示される試料支持体１とでは、図示の便宜上、寸法の比率等が異なっている。
　まず、図１０の（ａ）に示されるように、上述した試料支持体１が用意される（第１工程）。続いて、試料支持体１の複数の貫通孔２ｃ（図２参照）にマトリックス溶液８１が導入される（第２工程）。具体的には、マトリックス溶液８１は、例えばピペット８によって試料支持体１の第１表面２ａから複数の貫通孔２ｃに対して滴下される。マトリックス溶液８１は、実効領域Ｒのほぼ全領域に滴下される。より好ましくは、マトリックス溶液８１は、例えばエアブラシ等によって、試料支持体１の第１表面２ａ側から複数の貫通孔２ｃに対して略均一な量塗布される。マトリックス溶液８１は、試料支持体１の第１表面２ａ側から各貫通孔２ｃを介して第２表面２ｂ側に向かって移動する。各貫通孔２ｃは、マトリックス溶液８１によって充填される。
　続いて、図１０の（ｂ）に示されるように、試料Ｓがスライドガラス６の載置面６ａに載置される（第３工程）。続いて、図１１の（ａ）に示されるように、試料Ｓに第２表面２ｂが接触するように試料Ｓ上に試料支持体１が配置される（第３工程）。続いて、図１１の（ｂ）に示されるように、第１実施形態と同様に、テープ７によって試料支持体１がスライドガラス６に固定される。各貫通孔２ｃ内のマトリックス溶液８１は、各貫通孔２ｃにおいて試料支持体１の第２表面２ｂと接触している試料Ｓと混合する。試料Ｓの成分Ｓ１は、各貫通孔２ｃにおいて、マトリックス溶液８１と混合すると共に、試料支持体１の第２表面２ｂ側から各貫通孔２ｃを介して第１表面２ａ側に向かって移動する。そして、成分Ｓ１とマトリックス溶液８１との混合物Ｓ２は、表面張力によって各貫通孔２ｃにおいて試料支持体１の第１表面２ａ側に留まる。
　続いて、第１実施形態と同様に（図６の（ｂ）参照）、スライドガラス６と試料支持体１との間に試料Ｓが配置された状態で、電圧印加部１４によって、導電層４（図２参照）に電圧が印加されつつ、レーザ光照射部１３によって、試料支持体１の第１表面２ａに対してレーザ光Ｌが照射される。これにより、基板２の第１表面２ａ側に移動した成分Ｓ１がイオン化され、試料イオンＳ３（イオン化された成分Ｓ１）が放出される（第４工程）。
　そして、第１実施形態と同様に、質量分析装置１０のイオン検出部１５によって試料イオンＳ３が検出される（第５工程）。なお、第２実施形態のレーザ脱離イオン化法は、上述した第４工程までの各工程を含んでいる。第２実施形態の質量分析方法は、上述した第５工程までの各工程を含んでいる。
　以上説明したように、第２実施形態のレーザ脱離イオン化法では、複数の貫通孔２ｃにマトリックス溶液８１が導入された試料支持体１が試料Ｓ上に配置される。試料Ｓの成分Ｓ１は、マトリックス溶液８１と混合すると共に第２表面２ｂ側から各貫通孔２ｃを介して第１表面２ａ側に移動する。第２実施形態のレーザ脱離イオン化法によれば、上述した第１実施形態のレーザ脱離イオン化法と同様に、高分子量の試料Ｓをイオン化すると共にイメージング質量分析における画像の解像度を向上させることができる。
　また、第２実施形態のレーザ脱離イオン化法では、第２工程において、マトリックス溶液８１が第１表面２ａ側から複数の貫通孔２ｃに対して滴下される。この場合、マトリックス溶液８１を各貫通孔２ｃに容易に導入することができる。
　本開示は、上述した実施形態に限定されない。各実施形態では、例えば、導電層４が、少なくとも基板２の第１表面２ａに設けられていれば、基板２の第２表面２ｂ及び貫通孔２ｃの内面に設けられていなくてもよい。また、導電層４は、基板２の第２表面２ｂ及び貫通孔２ｃの内面に設けられていてもよい。また、試料支持体１は、テープ７以外の手段（例えば、接着剤、固定具等を用いる手段）で、スライドガラス６に対して固定されてもよい。
　また、各実施形態の第４工程においては、スライドガラス６の載置面６ａ及びテープ７を介さずに導電層４に電圧が印加されてもよい。その場合、スライドガラス６及びテープ７は、導電性を有していなくてもよい。また、基板２が導電性を有していてもよく、第４工程において基板２に電圧が印加されてもよい。その場合、試料支持体１において導電層４を省略することができると共に、上述したように導電層４を備える試料支持体１を用いる場合と同様の効果を得ることができる。
　また、各実施形態では、質量分析装置１０において、レーザ光照射部１３が、実効領域Ｒに対応する領域に対してレーザ光Ｌを一括で照射し、イオン検出部１５が、当該領域の二次元情報を維持しながら、試料イオンＳ３を検出してもよい。つまり、質量分析装置１０は、投影型質量分析装置であってもよい。
　また、各実施形態の上述したレーザ脱離イオン化法は、試料Ｓを構成する分子の二次元分布を画像化するイメージング質量分析だけでなく、イオンモビリティ測定等の他の測定・実験にも利用することができる。
　また、第２実施形態では、第２工程において、マトリックス溶液８１が、第１表面２ａから複数の貫通孔２ｃに対して滴下される例を示したが、マトリックス溶液８１は、第２表面２ｂから複数の貫通孔２ｃに対して滴下されてもよい。また、第２実施形態では、第２工程において、試料支持体１がマトリックス溶液８１に浸漬されてもよい。いずれの場合でも、マトリックス溶液８１を各貫通孔２ｃに容易に導入することができる。
　また、各実施形態では、基板２の厚さ方向から見た場合におけるフレーム３の開口３ａの形状が円形である例を示したが、開口３ａは様々な形状を呈していてもよい。フレーム３の開口３ａの形状は、例えば矩形であってもよい。
　また、各実施形態では、試料Ｓが乾燥試料である例を示したが、試料Ｓは、含水試料であってもよい。
　また、各実施形態では、試料Ｓがスライドガラス６に載置される例を示したが、試料Ｓは、直接質量分析装置１０の支持部１２に載置されてもよい。この際、質量分析装置１０の支持部１２がスライドガラス６に相当する。
　１…試料支持体、２…基板、２ａ…第１表面、２ｂ…第２表面、２ｃ…貫通孔、４…導電層、６…スライドガラス（載置部）、６ａ…載置面、８１…マトリックス溶液、Ｌ…レーザ光、Ｓ…試料、Ｓ１…成分。

Claims (9)

  1. 　互いに対向する第１表面及び第２表面に開口する複数の貫通孔が形成された基板と、少なくとも前記第１表面に設けられた導電層と、を備える試料支持体が用意される第１工程と、
    　試料が載置部の載置面に載置され、前記試料に前記第２表面が接触するように前記試料上に前記試料支持体が配置される第２工程と、
    　前記複数の貫通孔にマトリックス溶液が導入される第３工程と、
    　前記載置部と前記試料支持体との間に前記試料が配置された状態で、前記導電層に電圧が印加されつつ前記第１表面に対してレーザ光が照射されることにより、前記マトリックス溶液と混合すると共に前記第２表面側から前記貫通孔を介して前記第１表面側に移動した前記試料の成分がイオン化される第４工程と、を備えるレーザ脱離イオン化法。
  2. 　互いに対向する第１表面及び第２表面に開口する複数の貫通孔が形成された基板と、少なくとも前記第１表面に設けられた導電層と、を備える試料支持体が用意される第１工程と、
    　前記複数の貫通孔にマトリックス溶液が導入される第２工程と、
    　試料が載置部の載置面に載置され、前記試料に前記第２表面が接触するように前記試料上に前記試料支持体が配置される第３工程と、
    　前記載置部と前記試料支持体との間に前記試料が配置された状態で、前記導電層に電圧が印加されつつ前記第１表面に対してレーザ光が照射されることにより、前記マトリックス溶液と混合すると共に前記第２表面側から前記貫通孔を介して前記第１表面側に移動した前記試料の成分がイオン化される第４工程と、を備えるレーザ脱離イオン化法。
  3. 　前記第３工程においては、前記マトリックス溶液が前記第１表面側から前記複数の貫通孔に対して滴下される、請求項１に記載のレーザ脱離イオン化法。
  4. 　前記第２工程においては、前記マトリックス溶液が前記第１表面側又は前記第２表面側から前記複数の貫通孔に対して滴下される、請求項２に記載のレーザ脱離イオン化法。
  5. 　前記第２工程においては、前記試料支持体が前記マトリックス溶液に浸漬される、請求項２に記載のレーザ脱離イオン化法。
  6. 　前記試料は、乾燥試料である、請求項１～５の何れか一項に記載のレーザ脱離イオン化法。
  7. 　導電性を有し、互いに対向する第１表面及び第２表面に開口する複数の貫通孔が形成された基板を備える試料支持体が用意される第１工程と、
    　試料が載置部の載置面に載置され、前記試料に前記第２表面が接触するように前記試料上に前記試料支持体が配置される第２工程と、
    　前記複数の貫通孔にマトリックス溶液が導入される第３工程と、
    　前記載置部と前記試料支持体との間に前記試料が配置された状態で、前記基板に電圧が印加されつつ前記第１表面に対してレーザ光が照射されることにより、前記マトリックス溶液と混合すると共に前記第２表面側から前記貫通孔を介して前記第１表面側に移動した前記試料の成分がイオン化される第４工程と、を備えるレーザ脱離イオン化法。
  8. 　導電性を有し、互いに対向する第１表面及び第２表面に開口する複数の貫通孔が形成された基板を備える試料支持体が用意される第１工程と、
    　前記複数の貫通孔にマトリックス溶液が導入される第２工程と、
    　試料が載置部の載置面に載置され、前記試料に前記第２表面が接触するように前記試料上に前記試料支持体が配置される第３工程と、
    　前記載置部と前記試料支持体との間に前記試料が配置された状態で、前記基板に電圧が印加されつつ前記第１表面に対してレーザ光が照射されることにより、前記マトリックス溶液と混合すると共に前記第２表面側から前記貫通孔を介して前記第１表面側に移動した前記試料の成分がイオン化される第４工程と、を備えるレーザ脱離イオン化法。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載のレーザ脱離イオン化法の各工程と、
    　前記第４工程においてイオン化された前記成分が検出される第５工程と、を備える質量分析方法。
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