WO2019013451A1 - 유전자 변이 특이성이 증가된 dna 중합효소 및 이의 활성 증가용 pcr 버퍼 조성물 - Google Patents

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이휘호
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a DNA polymerase having increased specificity for a gene mutation and a PCR buffer composition for increasing the activity of the DNA polymerase. More specifically, the present invention relates to a DNA polymerase having mutation specificity increased at a specific amino acid position, And a host cell transformed with said vector, wherein said DNA polymerase having an increased specificity for said gene mutation is used to provide at least one mutation or SNP in at least one template to a living body A method for detection in vitro, a composition for detecting a gene mutation or SNP comprising the DNA polymerase, and a PCR kit comprising the composition.
  • the present invention provides a PCR buffer composition for increasing the activity of a DNA polymerase having an increased specificity for the gene mutation, a gene for a gene mutation or a SNP comprising the PCR buffer composition and / or a DNA polymerase having increased gene mutation specificity PCR kit, and methods for in vitro detection of one or more gene mutations or SNPs in one or more templates using the kit.
  • SNPs occupy a major genetic variation in the human genome and cause over 90% of differences among individuals.
  • identifying a variant of a target nucleic acid can be accomplished by hybridizing a nucleic acid sample to be analyzed with a hybridizing primer specific for the sequence variant under appropriate hybridization conditions.
  • PCR has been extensively used in molecular biology and diagnostic test methods for mutation detection such as SNP and other allelic sequence mutants, wherein the target nucleic acid to be tested in consideration of the presence of mutant is subjected to PCR ).
  • hybridization probes for such assays single stranded oligonucleotides are generally used.
  • Modified embodiments of the assay include using fluorescent hybridization probes. In general, efforts have been made to automate methods of measuring SNPs and other sequence variations (Gut, Hum. Mutat. 17, 475-492 (2001)).
  • gene mutation-specific amplification An alternative to the sequence mutation-specific hybridization known in the art is provided by so-called gene mutation-specific amplification.
  • a mutation-specific amplification primer is used, which usually has a so-called differential terminal nucleotide residue at the 3'-end of the primer, and the residue is only one specific variation of the target nucleic acid to be detected Only complementary.
  • the nucleotide variants are measured by the presence or absence of the DNA product after PCR amplification.
  • the principle of gene mutation-specific amplification is based on the formation of a canonical or non-standard primer-template complex at the end of a gene mutation-specific amplification primer. At precisely paired 3 'primer ends, amplification by DNA polymerase occurs while extension at the mismatched primer ends is suppressed.
  • U.S. Pat. Pat. No. 5,595,890 discloses methods for gene mutation-specific amplification and its application for detection of point mutations that are clinically associated with, for example, the k-ras oncogene.
  • U.S. Pat. Pat. No. 5,521,301 discloses an allele-specific amplification method for genotype analysis of the ABO blood group system.
  • U.S.A. Pat. No. 5,639,611 discloses the use of allele-specific amplification associated with the detection of point mutations that cause sickle cell anemia.
  • gene mutation-specific amplification or allele-specific amplification is problematic in that it has low selectivity, which requires more complex and time- and cost-intensive optimization steps.
  • Such a method for detecting sequence mutations, polymorphisms and mainly point mutations is particularly useful when allelic-specific amplification (or deletion) is required when the sequence variant to be detected is deficient compared to the dominant variant of the same nucleic acid segment Gene mutation-specific amplification).
  • the present inventors have made efforts to develop a novel DNA polymerase capable of enhancing the selectivity of gene mutation-specific PCR amplification and a reaction buffer for increasing its activity.
  • mutation And the concentration of KCl, (NH4) 2SO4 and / or TMAC (Tetra methyl ammonium chloride) in the components of the PCR buffer composition is controlled, the DNA mutation specificity is increased
  • the activity of the enzyme was increased, and the present invention was completed.
  • the present invention provides a DNA polymerase for detecting one or more gene mutations or SNPs in a target sequence containing a gene mutation or SNP.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid sequence encoding a DNA polymerase according to the present invention, a vector containing the nucleic acid sequence, and a host cell transformed with the vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing a DNA polymerase according to the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for detecting a gene mutation or SNP comprising a DNA polymerase according to the present invention.
  • Yet another object of the present invention is to provide a method for detecting at least one gene mutation or SNP in vitro in one or more templates using a PCR kit according to the present invention.
  • the present invention provides a DNA polymerase having a Taq polymerase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • substitution of the 507th amino acid residue is replaced by lysine (K) in glutamic acid (E), and substitution of arginine (R) to lysine (K)
  • substitution of the amino acid residue at position 587 is replaced with isoleucine (I) at arginine (R)
  • substitution of the amino acid residue at position 660 is substituted with valine (V) at arginine (R).
  • the DNA polymerase distinguishes between a mismatched primer and a mismatched primer, wherein the mismatched primer and the mismatched primer are hybridized with the target sequence, May include non-standard nucleotides at the 3 ' end thereof for the target sequence to be hybridized.
  • the DNA polymerase has an improved Ct value (higher amplification efficiency) than the amplification of the target sequence containing the mismatched primer in amplification of the target sequence containing the matched primer Lt; / RTI >
  • the present invention also provides a nucleic acid sequence encoding a DNA polymerase according to the present invention, a vector comprising the nucleic acid sequence, and a host cell transformed with the vector.
  • the present invention also relates to a method for producing a host cell comprising the steps of: culturing the host cell; And separating the DNA polymerase from the culture and the culture supernatant thereof.
  • the present invention also relates to a DNA polymerase according to the present invention
  • the one or more matched primers and the mismatched primers are hybridized to the target sequence and the mismatched primers hybridize to non-canonical nucleotides at up to seven base positions from its 3 ' A method for in vitro detection of one or more gene mutations or SNPs in one or more templates.
  • the method may comprise melting point analysis using a double-strand specific dye.
  • the present invention also provides a composition for detecting a gene mutation or SNP comprising a DNA polymerase according to the present invention.
  • the present invention also provides a PCR kit comprising a composition for detecting said gene mutation or SNP.
  • the PCR kit can be used for competitive allele-specific TaqMan PCR, Droplet digital PCR, or MassARRAY.
  • the PCR kit further comprises one or more matched primers, one or more mismatched primers or one or more matched primers and one or more mismatched primers, Primer and one or more mismatched primers are hybridized to the target sequence and the mismatched primer comprises non-canonical nucleotides at positions 3 to 7 bases from its 3 ' end to the hybridizing target sequence .
  • the PCR kit may further comprise nucleoside triphosphate.
  • the PCR kit comprises
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising 25 to 100 mM KCl; And (NH4) 2SO4 at 1 to 15 mM, and a final pH of 8.0 to 9.0.
  • the present invention also provides a PCR buffer composition for increasing the activity of a DNA polymerase having increased gene specificity.
  • the KCl concentration may be 60 to 90 mM.
  • the concentration of (NH4) 2SO4 may be 2 to 8 mM.
  • the concentration of KCl is 70 to 80 mM, and the concentration of (NH4) 2SO4 may be 4 to 6 mM.
  • the present invention also provides a PCR buffer composition for increasing the activity of a DNA polymerase having increased gene mutation specificity, further comprising 5 to 80 mM of Tetra methyl ammonium chloride (TMAC) in the PCR buffer composition described above.
  • TMAC Tetra methyl ammonium chloride
  • the concentration of KCl may be 40 to 90 mM.
  • the concentration of (NH4) 2SO4 may be 1 to 7 mM.
  • the concentration of Tetra methyl ammonium chloride (TMAC) is 15 to 70 mM
  • the concentration of KCl is 50 to 80 mM
  • the concentration of (NH4) 6 mM is 15 to 70 mM
  • the PCR buffer composition may further comprise TrisCl and MgCl2.
  • the present invention also provides a PCR kit for detecting gene mutation or SNP comprising the PCR buffer composition described above.
  • the PCR kit may be a DNA polymerase having a Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and may comprise a DNA polymerase comprising the following amino acid substitutions:
  • substitution of the 507th amino acid residue is replaced by lysine (K) in glutamic acid (E), and substitution of arginine (R) to lysine (K)
  • substitution of the amino acid residue at position 587 is replaced with isoleucine (I) at arginine (R)
  • substitution of the amino acid residue at position 660 is substituted with valine (V) at arginine (R).
  • the PCR kit comprises: a) a nucleoside triphosphate; b) a reagent for quantification binding to double stranded DNA; c) a polymerase blocking antibody; d) one or more control values or control sequences; And e) one or more molds; May be further included.
  • the present invention also provides a method for in vitro detection of one or more gene mutations or SNPs in one or more templates using the PCR kit of the present invention.
  • the DNA polymerase having increased gene mutation specificity of the present invention has a higher mismatch-to-match elongation selectivity as compared with the conventional Taq polymerase, thereby enabling reliable gene mutation-specific amplification without any substrate modification.
  • the kit comprising the PCR buffer composition and / or the DNA polymerase having increased gene mutation specificity of the present invention can effectively detect gene mutation or SNP, and thus can be usefully used for medical diagnosis of diseases and research on recombinant DNA have.
  • FIG. 1 shows a preparation process of a Taq DNA polymerase containing R536K, R660V and R536K / R660V mutations, wherein (a) is a schematic representation of fragment PCR and overlap PCR, and (b) (C) shows the results obtained by amplifying the total length by overlap PCR and confirming the amplified products by electrophoresis.
  • FIG. 1 shows a preparation process of a Taq DNA polymerase containing R536K, R660V and R536K / R660V mutations, wherein (a) is a schematic representation of fragment PCR and overlap PCR, and (b) (C) shows the results obtained by amplifying the total length by overlap PCR and confirming the amplified products by electrophoresis.
  • FIG. 2 shows the results of electrophoresis of the overlap PCR product of purified pUC19 vector treated with SAP and digested with restriction enzyme EcoRI / XbaI and purified (FIG. 1 (c)) for gel extraction.
  • FIG. 3 is a schematic representation of fragment PCR and overlap PCR during the preparation of Taq DNA polymerase comprising E507K, E507K / R536K, E507K / R660V and E507K / R536K / R660V mutations, respectively.
  • FIG. 4 shows the results of electrophoresis of the overlap PCR product of FIG. 3 purified with pUC19 vector treated with SAP after digestion with restriction enzyme EcoRI / XbaI for gel extraction.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a process of preparing a PCR template by collecting oral epithelial cells.
  • 6A to 6D show the results of performing AS-qPCR on rs1408799 using the E507K / R536K, E507K / R660V and E507K / R536K / R660V Taq polymerase of the present invention.
  • Taq polymerase was used as a control group.
  • 8A to 8D show the results of performing AS-qPCR on rs4911414 using Taq polymerase having E507K / R536K, E507K / R660V and E507K / R536K / R660V mutations of the present invention.
  • E507K mutation Was used as a control group.
  • FIG. 9 shows a preparation process of a Taq DNA polymerase including the E507K / R536K / R587I / R660V mutation, wherein (a) is a schematic representation of fragment PCR and overlap PCR, and (b) was confirmed by electrophoresis.
  • 10A to 10D show the results of performing AS-qPCR on a template containing the SNP of Q61H in the KRAS gene using the E507K / R536K / R587I / R660V polymerase.
  • Figs. 10A and 10B show the results of performing AS- 10c and 10d show results using 18-mer primers and Taq polymerase including E507K / R536K / R660V mutation was used as a control group.
  • 11 shows the results of performing AS-qPCR on the template containing the SNP of G13D in the KRAS gene using the E507K / R536K / R587I / R660V polymerase, and the control group includes the E507K / R536K / R660V mutation Taq polymerase was used.
  • FIG. 12 shows the result of performing AS-qPCR on the template containing the SNP of G12S in the KRAS gene using the E507K / R536K / R587I / R660V polymerase, and the control group includes the E507K / R536K / R660V mutation Taq polymerase was used.
  • FIG. 13 shows the result of performing AS-qPCR on a template containing SNP of L585R in the EGFR gene using the E507K / R536K / R587I / R660V polymerase, and the control group includes the E507K / R536K / R660V mutation Taq polymerase was used.
  • FIGS. 14A to 14D are graphs showing the effect of delaying amplification by mismatch according to changes in KCl concentration in a reaction buffer using E507K, E507K / R536K, E507K / R660V and E507K / R536K / R660V Taq polymerase of the present invention.
  • FIG. 15 shows the result of amplification by varying the concentration of (NH4) 2SO4 and constantly fixing the concentration of KCl in the reaction buffer to confirm the optimum KCl concentration, and then confirming the PCR product by electrophoresis.
  • FIG. 16 shows the result of amplifying the (NH4) 2SO4 concentration by fixing the KCl concentration constant and confirming the PCR product by electrophoresis in order to confirm the optimum (NH4) 2SO4 concentration in the reaction buffer .
  • FIG. 17 is a graph showing the effect of delaying the amplification by mismatch depending on the concentration of (NH4) 2SO4 in the reaction buffer.
  • FIGS. 18A and 18B are graphs showing the effect of delaying the amplification due to mismatch according to the concentration of TMAC after constantly fixing the concentrations of KCl and (NH 4) 2 SO 4 in the reaction buffer.
  • FIGS. 19A and 19B are graphs showing the effect of delaying the amplification due to mismatch according to the change in KCl concentration after fixed concentrations of TMAC and (NH 4) 2 SO 4 in the reaction buffer.
  • the DNA polymerase having increased gene mutation specificity of the present invention has a higher mismatch-to-match elongation selectivity as compared with the conventional Taq polymerase, thereby enabling reliable gene mutation-specific amplification without any substrate modification.
  • the kit comprising the PCR buffer composition and / or the DNA polymerase having increased gene mutation specificity of the present invention can effectively detect gene mutation or SNP, and thus can be usefully used for medical diagnosis of diseases and research on recombinant DNA have.
  • amino acid refers to any monomeric unit that can be incorporated into a peptide, polypeptide, or protein.
  • amino acid includes the following 20 natural or genetically encoded alpha-amino acids: alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N) (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Gln or G) (Lys or K), methionine (Met or M), phenylalanine (Phe or F), proline (Pro or P), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan Trp or W), tyrosine (Tyr or Y), and valine (Val or V).
  • Amino acids are typically organic acids, which include substituted or unsubstituted amino groups, substituted or unsubstituted carboxy groups, and one or more side chains or groups, or any analog of these groups.
  • exemplary side chains include, for example, thiol, seleno, sulfonyl, alkyl, aryl, acyl, keto, azido, hydroxyl, hydrazine, cyano, halo, hydrazide, alkenyl, alkynyl, Boronate, boronate, phospho, phosphono, phosphine, heterocyclic, enone, imine, aldehyde, ester, thio acid, hydroxylamine, or any combination of these groups.
  • mutant means a recombinant polypeptide comprising at least one amino acid substitution relative to the corresponding naturally occurring or unmodified DNA polymerase.
  • thermostable polymerase (which refers to a thermostable enzyme) is thermally resistant and has sufficient activity to achieve subsequent polynucleotide elongation reactions and is subjected to elevated temperatures for the time required to achieve denaturation of the double- It is not irreversibly denatured (inactivated). As used herein, it is suitable for use at temperatures that cyclize reactions such as PCR. The irreversible denaturation here is permanent and refers to a complete loss of enzyme activity.
  • the enzyme activity refers to catalyzing the combination of nucleotides in a suitable manner to form a polynucleotide elongation product complementary to the template nucleic acid strand.
  • Thermostable bacterial-derived thermostable DNA polymerases include, for example, the following: Thermotoga maritima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flabus, Thermodipyliporphis, Thermus species DNA polymerase derived from Sps17, Thermus species Z05, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitanica, and Thermosipo africanus.
  • thermoactive refers to an enzyme that retains its catalytic properties at the temperatures typically used in reverse transcription or annealing / extension steps in RT-PCR and / or PCR reactions (i.e., 45-80 ° C).
  • Thermostable enzymes are those that are irreversibly inactivated or denatured when treated with elevated temperatures required for nucleic acid denaturation.
  • the thermoactive enzyme may or may not be thermostable.
  • the thermoactive DNA polymerase may be DNA or RNA that is dependent on thermophilic species or mesophilic species, including, but not limited to,
  • host cell refers to both single-cellular prokaryotic and eukaryotic organisms (e. G., Bacteria, yeast, and actinomycetes) and single cells from higher plants or animals when cultured in cell culture media.
  • vector is a DNA molecule capable of replicating foreign DNA such as a gene to a recipient cell, such as plasmid, phage, and artificial chromosome. &Quot; Plasmid ", " vector “ or “ plasmid vector” may be used interchangeably herein.
  • nucleic acid or " polynucleotide” refers to a polymer that can correspond to DNA or RNA polymers, or analogs thereof.
  • the nucleic acid can be, for example, a chromosome or a chromosome segment, a vector (e.g., an expression vector), an expression cassette, a naked DNA or RNA polymer, a product of a polymerase chain reaction (PCR), an oligonucleotide, Or may include the same.
  • the nucleic acid may be, for example, single-stranded, double-stranded, or tri-stranded, but is not limited to any particular length. Unless otherwise stated, a particular nucleic acid sequence includes or encodes a complementary sequence in addition to any sequence specified.
  • primer refers to a polynucleotide that can act as a starting point for nucleic acid synthesis in the template-orientation when the polynucleotide stretch is placed under the conditions of initiation. Primers can also be used in a variety of other oligonucleotide-mediated synthesis processes, including as de novo RNA synthesis and as initiators of in vitro transcription-related processes.
  • the primer is typically a single-stranded oligonucleotide (e.g., oligodeoxyribonucleotide).
  • the appropriate length of primer will typically depend on the intended use in the range of 6 to 40 nucleotides, more typically 15 to 35 nucleotides.
  • Short primer molecules generally require a lower temperature to form a sufficiently stable hybridization complex with the template.
  • the primer is not required to reflect the correct sequence of the template, but the primer must be sufficiently complementary to hybridize with the template to be elongated.
  • the term "primer pair" includes a 5'-sense primer that is complementarily hybridized to the 5'-end of the nucleic acid sequence to be amplified and a 3'-antisense primer that hybridizes to the 3'end of the amplified sequence ≪ / RTI >
  • the primer can be labeled, if necessary, by incorporating a label that can be detected by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means.
  • useful labels include: 32P, a fluorescent dye, an electron-dense reagent, an enzyme (commonly used in ELISA assays), biotin, or hapten, and a protein from which antisera or monoclonal antibodies can be used.
  • 5'-nucleic acid hydrolase (nuclease) probe refers to an oligonucleotide comprising at least one luminescent marker moiety used in a 5'-nucleic acid hydrolase reaction to target nucleic acid detection.
  • the 5'-nucleic acid hydrolase probe comprises only a single light emitting moiety (e.g., a fluorescent dye, etc.).
  • the 5 ' -nucleic acid hydrolase probe comprises a self-complementary region such that the probe can form a hairpin structure under selected conditions.
  • the 5 ' -nucleic acid hydrolase probe comprises two or more label portions, one of the two labels is separated or degraded from the oligonucleotide and then released with increased radiant intensity.
  • the 5'-nucleic acid hydrolase probe is labeled with two different fluorescent dyes, for example a 5'-terminal reporter dye and a 3'-terminal light quencher dye or moiety.
  • the 5'-nuclease probe is labeled at one or more positions in addition to, or in addition to, the terminus. When the probe is intact, energy transfer typically occurs between the two fluorescent materials so that fluorescence emission from the reporter dye is partially or more extinguished.
  • the 5'-nucleic acid hydrolase probe bound to the template nucleic acid has an activity such that the fluorescence emission of the reporter dye is no longer quenched, for example, Taq polymerase or other Is degraded by the 5 ' to 3 ' -nucleic acid hydrolase activity of the polymerase.
  • a 5'-nucleic acid hydrolase probe can be labeled with two or more different reporter dyes and a 3'-terminal quencher dye or moiety.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • forester resonance energy transfer refers to the transfer of energy between two or more chromophores, a donor chromophore and a receptor chromophore (referred to as a quencher).
  • the donor typically transfers energy to the acceptor when the donor is excited by emitting light of the appropriate wavelength.
  • the receptors typically re-emit energy transferred in the form of light that is emitted at different wavelengths. When the receptor is a "dark" quencher, it disperses the energy transferred in a form other than light. Whether a particular fluorescent substance acts as a donor or acceptor depends on the properties of other members of the FRET pair.
  • FAM-TAMRA pairs FAM-TAMRA pairs.
  • the commonly used quenchers are DABCYL and TAMRA.
  • Commercially available dark quenching agents include: BlackHole Quenchers (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa) And BlackBerry Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).
  • nucleic acid base nucleoside triphosphate, or nucleotide refers to naturally occurring in the polynucleotides described (i.e., for DNA they are dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • dATP dGTP
  • dCTP dCTP
  • dTTP dTTP
  • dITP and 7-deaza-dGTP are frequently used instead of dGTP and can be used in place of dATP in in vitro DNA synthesis reactions such as sequencing.
  • nucleic acid base, nucleoside, or nucleotide refers to a variation, derivative, or modification of a naturally occurring conventional base, nucleoside, or nucleotide in a particular polynucleotide ≪ / RTI > Certain unusual nucleotides are modified at the 2 ' position of the ribose sugar compared to conventional dNTPs.
  • RNA is ribonucleotides (i.e., ATP, GTP, CTP, UTP, aggregated rNTP), because the nucleotides have hydroxyl groups at the 2 '
  • a ribonucleotide is a nucleotide that is not conventional as a substrate for a DNA polymerase.
  • unconventional nucleotides include, but are not limited to, compounds that are used as terminators for nucleic acid sequencing.
  • Exemplary terminator compounds include, but are not limited to, compounds having a 2 ', 3 ' -dideoxy structure, which is referred to as dideoxynucleoside triphosphate.
  • Dideoxy nucleoside triphosphate ddATP, ddTTP, ddCTP and ddGTP are collectively referred to as ddNTP.
  • Additional examples of terminator compounds include the 2'-PO4 analogs of ribonucleotides.
  • Other non-conventional nucleotides include, but are not limited to, phosphorothioate dNTPs ([[?] -S] dNTPs, 5 '- [?] -Borano- dNTPs, [?] - methylphosphonate dNTPs, and ribonucleosides Triphosphate (rNTP).
  • Unusual bases include radioactive isotopes such as 32P, 33P, or 35S; Fluorescent labeling; Labeling of chemiluminescence; Labeling of bioluminescence; Hapten labels such as biotin; Or enzymatic labels such as streptavidin or avidin.
  • Fluorescent labels may include negatively charged dyes, such as dyes of the fluoxane family, or neutrally charged dyes such as the rhodamine family, or positively charged dyes such as the cyanine family.
  • Dyes of the fluoxane family include, for example, FAM, HEX, TET, JOE, NAN and ZOE.
  • the dyes of the Rhodamine family include Texas Red, ROX, R110, R6G, and TAMRA.
  • Various dyes or nucleotides labeled with FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red and TAMRA are available from Perkin-Elmer (Boston, Mass.), Applied Biosystems / Molecular Probes (Eugene, OR).
  • the dyes of the cyanine family include Cy2, Cy3, Cy5, and Cy7 and are marketed by GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England).
  • mismatch discrimination is intended to encompass the term " mismatch discrimination " when a nucleic acid (e.g., a primer or other oligonucleotide) is extended in a template-dependent manner by affixing one or more nucleotides
  • a nucleic acid e.g., a primer or other oligonucleotide
  • a biocatalyst e. G., An enzyme, e. G., A polymerase, ligase, etc.
  • &quot mismatch discrimination " refers to a mismatch-containing (substantially complementary) nucleic acid in which an extended nucleic acid (e.g., a primer or other oligonucleotide) has a mismatch in the 3'-terminal nucleic acid relative to a template in which the nucleic acid is hybridized Quot; refers to the ability of the biocatalyst to distinguish completely complementary sequences from the sequence.
  • the extended nucleic acid comprises a mismatch at the 3 ' -terminus to a fully complementary sequence.
  • the extended nucleic acid comprises a mismatch at the second (N-1) 3'-position and / or N-2 position at the terminus to a fully complementary sequence.
  • the present invention relates to a DNA polymerase having a Taq polymerase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • Taq polymerase was first isolated from the bacterium by a heat-resistant DNA polymerase named Thermus aquaticus, a thermophilic bacterium.
  • Thermos Aqua ticus is a bacterium inhabited by hot springs and hydrothermal vesicles.
  • Taq polymerase has been identified as an enzyme capable of withstanding the protein denaturation conditions (high temperature) required in the PCR process.
  • the optimal activity temperature of Taq polymerase is 75-80 ° C. It has a half-life of 92 hours at 92.5 ° C, 40 minutes at 95 ° C, and 9 minutes at 97.5 ° C. It replicates 1000 base pairs of DNA within 10 seconds at 72 ° C .
  • PCR can be performed at a high temperature (60 ° C or higher).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as the reference sequence.
  • substitution of the 507th amino acid residue is replaced by lysine (K) in glutamic acid (E), and substitution of arginine (R) to lysine (K)
  • substitution of the amino acid residue at position 587 is replaced with isoleucine (I) at arginine (R)
  • substitution of the amino acid residue at position 660 is substituted with valine (V) at arginine (R).
  • the Taq polymerase in which the 507th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was substituted with lysine (K) in glutamic acid (E) was named "E507K” (SEQ ID NO: 2);
  • the Taq polymerase in which the 507th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine (K) in glutamic acid (E) and the lysine (K) in arginine (R) is substituted with the 536th amino acid residue is referred to as "E507K / R536K Quot; (SEQ ID NO: 6);
  • the Taq polymerase in which the 507th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine (K) in glutamic acid (E) and the 660th amino acid residue is substituted with valine (V) in arginine (R) is "E507K / R660V Quot;
  • the mismatched primer is a hybrid oligonucleotide that must be sufficiently complementary to hybridize with the target sequence but does not reflect the exact sequence of the target sequence.
  • the “canonical nucleotide” or “complementary nucleotide” refers to the standard Watson-Crick base pair, A-U, A-T, and G-C.
  • non-canonical nucleotide or “non-complementary nucleotide” refers to A-C, A-G, G-U, G-T, T-C, T-U, A-A, G-G, T-T, U-U, C-C and C-U in addition to the Watson-ray nucleotide
  • the DNA polymerase may exhibit a lower Ct value than the amplification of the target sequence comprising the mismatched primer in amplification of the target sequence comprising the matched primer.
  • a DNA polymerase can elongate primers matched with greater efficiency than mismatched primers in a target sequence-dependent manner by covalently linking one or more nucleotides to the primer.
  • greater efficiency can be observed, for example, lower Ct values for primers matched than mismatched primers in RT-PCR.
  • the Ct value difference between the matched primers and the mismatched primers is at least 10, preferably between 10 and 20, or there may be no synthesis of the amplicon by mismatched primers.
  • the Ct (Threshold Crossing Cycle) value represents the DNA quantification method by quantitative PCR, which relies on plotting fluorescence over log count cycles.
  • the threshold for DNA-based fluorescence detection is set at least slightly higher than the background.
  • the number of cycles for which the fluorescence exceeds the threshold value is called Ct, or Cq (quantification cycle) according to the MIQE guideline.
  • the Ct value for a given reaction is defined as the number of cycles in which the fluorescence emission crosses a fixed limit value.
  • SYBR Green I and fluorescent probes can be used for real-time PCR for template DNA quantification. Fluorescence from the sample is collected every cycle during the PCR and plotted against the number of cycles.
  • the starting template concentration is inversely proportional to the time the fluorescence signal first appears. The higher the concentration of the template, the earlier the signal appears (at low cycle counts).
  • the present invention also relates to a nucleic acid sequence encoding the aforementioned DNA polymerase and a vector and a host cell comprising the nucleic acid sequence.
  • Various vectors can be prepared using the nucleic acid encoding the DNA polymerase of the present invention. Any vector may be used, including replicons and control sequences derived from species compatible with the host cell.
  • the vector of the present invention may be an expression vector and includes a transcriptional and translational control nucleic acid region operably linked to a nucleic acid sequence encoding a DNA polymerase of the present invention. Regulatory sequences refer to DNA sequences required for the expression of coding sequences operatively linked in a particular host organism.
  • control sequences suitable for prokaryotes include promoters, any operative sequences and ribosome binding sites.
  • the vector may contain a " Positive Retroregulatory Element (PRE) " to enhance the half-life of the transcribed mRNA.
  • PRE Positive Retroregulatory Element
  • the transcriptional and translational regulatory nucleic acid domains will generally be appropriate for host cells used to express the polymerase.
  • Various types of appropriate expression vectors, and suitable regulatory sequences are known in the art for a variety of host cells.
  • transcriptional and translational control sequences may include, for example, promoter sequences, ribosomal binding sites, transcription initiation and termination sequences, translation initiation and termination sequences, and enhancers or activation sequences.
  • regulatory sequences include promoters and transcription initiation and termination sequences.
  • the vector also typically comprises a polylinker region containing several restriction sites for insertion of foreign DNA.
  • a " fusion flag " is used to facilitate purification and, if necessary, a tag / flag is subsequently removed (e.g., " His-Tag ").
  • a mesophilic host e. G., E. coli
  • Construction of suitable vectors containing DNA coding replication sequences, regulatory sequences, phenotypic selection genes, and the mutant polymer of interest are prepared using standard recombinant DNA techniques. Isolated plasmids, viral vectors, and DNA fragments are cleaved and truncated and ligated together in a particular order to produce the desired vectors as is known in the art.
  • the expression vector contains a selectable marker gene for selection of the transformed host cell.
  • Selection genes are known in the art and will vary for the host cells used. Suitable selection genes may include gene coding for resistance to ampicillin and / or tetracycline, which can transform cells that cultivate these vectors in the presence of these antibiotics.
  • the nucleic acid sequence encoding the DNA polymerase of the present invention is introduced into cells either alone or in combination with a vector.
  • the introduction or equivalent expression thereof means that the nucleic acid enters the cell in a manner suitable for subsequent integration, amplification and / or expression.
  • Methods of introduction include, for example, CaPO4 precipitation, liposome fusion, LIPOFECTIN®, electrophoresis, viral infection, and the like.
  • Prokaryotes are used as host cells for the initial cloning step of the present invention.
  • Suitable host cells of prokaryotic cells are E. coli K12 strain 94 (ATCC No. 31,446), E. coli strain W3110 (ATCC No. 27,325), E. coli K12 strain DG116 (ATCC No. 53,606), E. coli X1776 ATCC No. 31,537), and E. coli B; It is well known in the art that many different strains of E.
  • Plasmids typically used for transformation of E. coli include pBR322, pUCI8, pUCI9, pUCIl8, pUC119 and Bluescript M13. However, many other suitable vectors may also be used.
  • the present invention also relates to a method for producing a host cell comprising the steps of: culturing the host cell; And separating the DNA polymerase from the culture and the culture supernatant thereof.
  • the DNA polymerase of the present invention is prepared by culturing a host cell transformed with an expression vector containing a nucleic acid sequence encoding a DNA polymerase under appropriate conditions that induce or cause expression of the DNA polymerase. Methods for culturing transformed host cells under conditions suitable for protein expression are known in the art. Suitable host cells for the production of the polymerase from lambda pL promoter-containing plasmid vectors include the E. coli strain DG116 (ATCC No. 53606). Depending on the expression, the polymerase can be harvested and separated.
  • the mismatch discrimination of the DNA polymerase of the present invention can be assayed.
  • mismatch distinguishing activity is measured by comparing the amplification of a target sequence perfectly matched to a primer for amplification of a target with a single base mismatch at the 3-terminus of the primer.
  • Amplification can be detected in real time, for example, by the use of a TaqMan (TM) probe.
  • TM TaqMan
  • the ability of the polymerase to distinguish between two target sequences can be estimated by comparing the Ct of the two reactions.
  • the present invention provides DNA polymerase according to the present invention
  • the mismatched primer comprises one or more mutations or SNPs in one or more templates, including non-canonical nucleotides at up to seven base positions from its 3 'end to the hybridizing target sequence
  • SNP Single Nucleotide Polymorphisms
  • the target sequence may be present in the test sample and include DNA, cDNA or RNA, preferably genomic DNA.
  • the test sample may be a bacterium, a bacterial culture, or a cell lysate prepared from a cell culture.
  • the test sample may be contained in an animal, preferably a vertebrate animal, more preferably a human subject.
  • the target sequence may be comprised in a genomic DNA, preferably a genomic DNA of a subject, more preferably a bacterial or vertebrate animal, most preferably a human subject.
  • the SNP detection method of the present invention can include melting temperature analysis using a double-strand specific dye such as SYBR Green I.
  • Melting temperature curve analysis can be performed in a real-time PCR device such as ABI 5700/7000 (96 well format) or ABI 7900 (384 well format) device containing onboard software (SDS 2.1). Alternatively, the melting temperature curve analysis can be performed as a termination analysis.
  • Dyes that bind to double-stranded DNA " or " double-stranded specific dyes " can be used when they have high fluorescence when bound to double-stranded DNA rather than unbound.
  • examples of such dyes include SOYTO-9, SOYTO-13, SOYTO-16, SOYTO-60, SOYTO-64, SYTO-82, EtBr, SYTOX Orange, TO- TO-PRO-3 or EvaGreen. Except for EtBr and EvaGreen (Quiagen), these dyes have been tested in real-time applications.
  • the in vitro gene mutation or SNP detection method of the present invention can be used for real-time PCR, analysis on agarose gel after standard PCR, gene-specific amplification or allele-specific amplification through real-time PCR, tetra-primer amplification - refractory mutation system PCR or isothermal amplification.
  • the SNP detection method of the present invention can be used for detecting SNPs, such as sequencing, mini-sequencing, allele specific PCR, dynamic allele-specifichybridization (DASH), PCR extension analysis (SBE), PCR-SSCP, PCR-RFLP analysis or TaqMan technique, SNPlex platform (Applied Biosystems), mass spectrometry (eg Sequenom's MassARRAY system) and Bio-Plex system (BioRad) .
  • SNPs such as sequencing, mini-sequencing, allele specific PCR, dynamic allele-specifichybridization (DASH), PCR extension analysis (SBE), PCR-SSCP, PCR-RFLP analysis or TaqMan technique, SNPlex platform (Applied Biosystems), mass spectrometry (eg Sequenom's MassARRAY system) and Bio-Plex system (BioRad) .
  • SNPs such as sequencing, mini-sequencing, allele specific PCR, dynamic allele-
  • the "standard PCR” is a technique for amplifying a single or several copies of DNA or cDNA known to the ordinary skilled artisan. Most PCR uses a Taq polymerase or a thermostable DNA polymerase such as Klen Taq. DNA polymerase enzymatically assemble new DNA strands from nucleotides by using single stranded DNA as template and using oligonucleotides (primers). Amplicons generated by PCR can be analyzed, for example, on agarose gels.
  • the "real time PCR” can monitor the process in real time when performing PCR. Thus, the data are collected throughout the PCR process, not at the end of the PCR.
  • the reaction is characterized by the time point during the cycle when the amplification is first detected rather than the amount of target accumulated after a fixed number of cycles.
  • Two methods mainly dye-based detection and probe-based detection, are used to perform quantitative PCR.
  • ASA Allele Specific Amplification
  • allele-specific amplification or gene mutation-specific amplification by real-time PCR detects a gene mutation or a SNP in a highly efficient manner. Unlike most other methods for detecting gene mutations or SNPs, preliminary amplification of the target gene material is not required.
  • ASA combines amplification and detection in a single reaction based on the distinction between matched and mismatched primer / target sequence complexes.
  • the increase in amplified DNA during the reaction can be monitored in real time by an increase in the fluorescence signal caused by a dye such as SYBR Green I that emits light as it binds to double stranded DNA. Allele-specific amplification or gene mutation-specific amplification by real-time PCR appears to delay or absent the fluorescence signal for mismatches. In gene mutation or SNP detection, this provides information on the presence or absence of a gene mutation or SNP.
  • the " tetra-primer amplification-refractory mutation system PCR” amplifies both wild-type and mutant alleles together with the control fragment in a single-tube PCR reaction.
  • Non-allele-specific control amplicons are amplified by two common (outer) primers on the side of the mutation region.
  • the two allele-specific (inner) primers are designed in the opposite direction to the common primer, and both wild-type and mutant amplicons can be amplified simultaneously with a common primer.
  • the two allele-specific amplicons have different lengths and can be easily separated by standard gel electrophoresis because the mutations are asymmetrically located relative to the common (outer) primer.
  • the control amplicon provides internal control for false negatives as well as amplification failure, and at least one of the two allele-specific amplicons is always present in the tetra-primer amplification-refractory mutant system PCR.
  • isothermal amplification means that the amplification of the nucleic acid is performed at a lower temperature without depending on the thermocycler, preferably without requiring the temperature to change during amplification.
  • the temperature used in isothermal amplification may be between room temperature (22-24 ° C) and about 65 ° C, or about 60-65 ° C, 45-50 ° C, 37-42 ° C, or 22-24 ° C ambient temperature.
  • bioanalyzer which is a chip-based capillary electrophoresis device for analyzing gel electrophoresis, ELISA, enzyme linked oligosorbent assay (ELOSA), real time PCR, ECL (improved chemiluminescence), RNA, DNA and protein or turbidity As shown in FIG.
  • E507K / R536K, E507K / R660V, or E507K / R536K / R660V Taq polymerase to extend mismatched primers for templates containing SNPs (rs1408799, rs1015362 and / or rs4911414) And whether the ability to do so was reduced.
  • the DNA polymerase of the present invention is expected to be useful for medical diagnosis of disease and research of recombinant DNA.
  • a template containing the SNP of Q61H, G13D or G12S in the KRAS gene and a template containing the SNP of L858R in the EGFR gene using E507K / R536K / R / R660V Taq polymerase It was confirmed whether the ability to extend mismatched primers was reduced.
  • Taq DNA polymerase including the E507K / R536K / R587I / R660V mutation was superior to Taq polymerase including the E507K / R536K / R660V mutation And kidney selectivity. Therefore, Taq DNA polymerase including the E507K / R536K / R587I / R660V mutation of the present invention is also expected to be useful for medical diagnosis of diseases and research of recombinant DNA.
  • the present invention also relates to a composition for detecting a gene mutation or SNP comprising a DNA polymerase according to the present invention and a PCR kit containing the same.
  • the PCR kit can be applied to general PCR (first generation PCR), real time PCR (second generation PCR), digital PCR (third generation PCR) or massarray.
  • the digital PCR may be a competitive allele-specific TaqMan PCR or a Droplet digital PCR (ddPCR), more specifically, an allele-specific cast PCR or an allele But is not limited to, specific droplet digital PCR.
  • ddPCR Droplet digital PCR
  • cast PCR is an allele-specific TaqMan qPCR to suppress non-specific amplification from a wild-type allele in such a manner as to detect and quantify a rare mutation in a sample containing a large amount of normal wild-type gDNA Can be combined with gene-specific MGB blocking agents to produce better specificity than traditional allele-specific PCR.
  • the "Droplet digital PCR” is a system for counting the target DNA by dividing 20 ⁇ l of the PCR reaction into 20,000 droplets and amplifying the amplified DNA.
  • the positive drop (1) is detected according to amplification of the target DNA in the droplet, (0), and the number of copies of the target DNA is calculated through the Poisson distribution. Finally, the resultant value can be confirmed by the number of copies per sample ⁇ , and a rare mutation detection, a very small amount of genes Amplification, and mutation types at the same time.
  • the "mass array” is a multiplexing analysis method applicable to various genome studies such as genotyping using a MALDI-TOF mass spectrometer, and is capable of quickly analyzing a large number of samples and targets at a low cost Or if you want to do a customized analysis only for a specific target.
  • the PCR kit of the present invention may include any reagent or other element that is known to the skilled artisan for use in the primer extension process.
  • the PCR kit further comprises one or more matched primers, one or more mismatched primers or one or more matched primers and one or more mismatched primers, Primer and one or more mismatched primers are hybridized to the target sequence and the mismatched primer comprises non-canonical nucleotides at positions 3 to 7 bases from its 3 ' end to the hybridizing target sequence .
  • the PCR kit of the present invention may further comprise a nucleoside triphosphate.
  • the PCR kit of the present invention also includes a) one or more buffers; b) a reagent for quantification binding to double stranded DNA; c) a polymerase blocking antibody; d) one or more control values or control sequences; And e) one or more molds; May be further included.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising 25 to 100 mM KCl; And (NH4) 2SO4 at 1 to 15 mM, and a final pH of 8.0 to 9.0.
  • the present invention also relates to a PCR buffer composition for increasing the activity of a DNA polymerase having increased gene mutation specificity.
  • Polymerase enzymes used in PCR should use an optimal reaction buffer in which various substances are mixed in order to perform their functions.
  • the reaction buffer usually contains a factor for pH stabilization, a metal ion as a cofactor, and a stabilizing element to prevent denaturation of the polymerase.
  • the KCl serves as an essential factor for enzyme stabilization and helps the primer to pair with the target DNA.
  • concentration of KCl in the reaction buffer was adjusted to obtain the optimum concentration, in order to confirm the high cation concentration in which the amplification efficiency by the match was not decreased while maximally delaying the mismatch amplification.
  • E507K / R536K / R660V Taq polymerase 50 mM of E507K / R536K, E507K / R660V and 100 mM of E507K The amplification delay effect by the match was excellent. As a result, it was confirmed that the KCl concentration limit was lowest in E507K / R536K / R660V Taq polymerase, and lower than E507K in E507K / R536K and E507K / R660V.
  • amplification was performed by varying the concentration of KCl in the presence of constant (NH4) 2SO4 concentration in the reaction buffer using E507K / R536K / R660V Taq polymerase to derive the KCl concentration of the titrant .
  • NH4 constant
  • E507K / R536K / R660V Taq polymerase E507K / R536K / R660V Taq polymerase
  • the KCl concentration of the PCR buffer composition of the present invention may be 25-100 mM, preferably 60-90 mM, more preferably 70-80 mM, and most preferably 75 mM.
  • KCl When KCl is included below 25 mM, there is no effect on general target amplification, but differences in amplification by matched primers and amplified by mismatched primers can be reduced, and when contained in excess of 100 mM, The efficiency of the target amplification may be lowered.
  • (NH4) 2SO4 is used to increase the activity of the polymerase enzyme together with Tris as a cofactor required for enzyme activity.
  • concentration of KCl in the reaction buffer is fixed to 75 mM constantly, and the concentration of (NH4) 2SO4 is varied from 2.5 mM to 25 mM, NH4) 2SO4.
  • the amplification product was confirmed at a concentration of (NH4) 2SO4 of 2.5 to 15 mM and the NH4SO4 concentration of the optimal solution was found to be 5 mM.
  • the (NH4) 2SO4 concentration of the PCR buffer composition of the present invention may be 1 to 15 mM, preferably 2.5 to 8 mM, more preferably 4 to 6 mM, and most preferably 5 mM.
  • the optimized PCR buffer composition of the present invention may comprise 70 to 80 mM KCl and 4-6 mM of (NH4) 2SO4, with a final pH of 8.0 to 9.0.
  • the PCR buffer composition of the present invention may further comprise 5 to 80 mM of Tetra methyl ammonium chloride (TMAC).
  • TMAC Tetra methyl ammonium chloride
  • TMAC is generally used to reduce amplification by mismatch or to improve the stringency of the hybridization reaction.
  • concentration of KCl in reaction buffer is fixed to 75 mM
  • concentration of (NH4) 2SO4 is fixed to 5 mM
  • concentration of TMAC is varied from 0 to 80 mM
  • the TMAC concentration of the right line was confirmed.
  • the TMAC When the TMAC is contained in excess of 80 mM, the amplification efficiency is reduced, so that it is preferable to include the TMAC at the concentration within the above range.
  • the concentration of KCl may be 40 to 90 mM, preferably 50 to 80 mM, and the concentration of (NH4) 2SO4 may be 1 to 7 mM, preferably 1.5 to 6 mM.
  • the optimized PCR buffer composition of the present invention comprises 15 to 70 mM TMAC, 50 to 80 mM KCl, 1.5 to 6 mM (NH4) 2SO4, and a final pH of 8.0 to 9.0 .
  • the PCR buffer composition of the present invention may further comprise TrisCl and MgCl2, and may further comprise Tween 20 and bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the present invention also provides a PCR kit for detecting a gene mutation or SNP comprising the aforementioned PCR buffer composition.
  • the PCR kit of the present invention is a DNA polymerase having a Taq polymerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and may further comprise a DNA polymerase comprising the following amino acid substitutions:
  • substitution of the 507th amino acid residue is replaced by lysine (K) in glutamic acid (E), and substitution of arginine (R) to lysine (K)
  • substitution of the amino acid residue at position 587 is replaced with isoleucine (I) at arginine (R)
  • substitution of the amino acid residue at position 660 is substituted with valine (V) at arginine (R).
  • the present invention also provides a kit for detecting gene mutations or SNPs comprising a PCR buffer composition for increasing the activity of a DNA polymerase having increased gene mutation as described above to detect one or more mutations or SNPs in one or more templates in vitro vitro). < / RTI >
  • This method is the same as the method for in vitro detection of one or more gene mutations or SNPs in one or more templates using a DNA polymerase having increased gene mutation specificity of the present invention except for the constitution of the PCR buffer composition Therefore, the description thereof will be omitted.
  • the 536th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with Taq DNA polymerase (hereinafter referred to as "R536K”) substituted with lysine at arginine, the Taq DNA polymerase substituted with valine at arginine (Hereinafter referred to as "R660V”) and a 536th amino acid residue were substituted with lysine in arginine and the 660th amino acid residue was substituted with valine in arginine (hereinafter referred to as "R536K / R660V”) was prepared as follows Respectively.
  • R536K Taq DNA polymerase substituted with valine at arginine
  • Taq DNA polymerase fragments (F1 to F5) were amplified by PCR using the mutation-specific primers shown in Table 1 as shown in Fig. 1 (a). The reaction conditions are shown in Table 2.
  • pUC19 was digested with restriction enzymes EcoRI / XbaI at 37 DEG C for 4 hours under the conditions shown in Table 5, and DNA was purified. The purified DNA was treated with SAP at 37 DEG C for 1 hour under the conditions of Table 6 to prepare a vector .
  • the overlap PCR product of Example 1-2 was purified and digested with restriction enzyme EcoRI / XbaI for 3 hours at 37 ° C under the conditions of Table 7, and then gel-extracted with the prepared vector (FIG. 2 ).
  • E. coli DH5 ⁇ was transformed and selected on a medium containing ampicillin.
  • the prepared plasmids were sequenced from the obtained colonies to obtain Taq DNA polymerase mutants (" R536K “, " R660V “, and " R536K / R660V ”) into which desired mutations were introduced.
  • R536K, R660V, and R536K / R660V produced in Example 1 were tested for activity of Taq polymerase activity (data not shown) as a result of testing the Taq polymerase activity of R536K, R660V, and R536K / R660V ,
  • the E507K mutation substitution of the 507th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with lysine in glutamic acid
  • WT wild type Taq DNA polymerase
  • the Taq DNA polymerase fragments (F6 to F7) were amplified by PCR as shown in Fig.
  • the reaction conditions are shown in Table 10.
  • Each fragment amplified in the above 2-1 was used as a template to amplify the total length using primers (Eco-F and Xba-R primers) at both ends.
  • the reaction conditions are shown in Table 11.
  • Ligation pUC19 was digested with restriction enzyme EcoRI / XbaI for 4 hours at 37 ° C under the conditions shown in Table 5, and DNA was purified. The purified DNA was treated with SAP for 1 hour at 37 ° C under the conditions shown in Table 6, Prepared.
  • the overlap PCR product of Example 2-2 was purified and digested with restriction enzyme EcoRI / XbaI for 3 hours at 37 ° C under the conditions of Table 7, followed by gel extraction with the prepared vector (FIG. 4 ).
  • E. coli was transformed into DH5? Or DH10? And selected on a medium containing ampicillin.
  • the plasmids prepared from the obtained colonies were sequenced to obtain Taq DNA polymerase mutants ("E507K / R536K”, "E507K / R660V” and "E507K / R536K / R660V”) into which the E507K mutation was introduced.
  • a Taq polymerase containing the mutations "E507K / R536K”, “E507K / R660V” and “E507K / R536K / R660V” obtained in Example 2 above was used to extend the mismatched primers for the template containing the SNP The ability to do so was reduced.
  • " E507K” Taq polymerase containing the E507K mutation was used as a control group.
  • the templates containing the SNP used in this Example are rs1408799, rs1015362 and rs4911414, and the genotype of each template and the sequence information of the specific primer (IDT, USA) for each of them are as shown in Tables 12 and 13 below.
  • the probes were double-labeled as shown in Table 15 below.
  • Oral epithelial cells were collected from oral epithelial cell collection kit purchased from Noble Bio, dissolved in 500 ⁇ l of lysis solution, and centrifuged at 12,000 ⁇ g for 3 minutes. The supernatant was transferred to a new tube and used in an amount of 1 ⁇ l per experiment (FIG. 5).
  • the reaction conditions are shown in Table 16, and the reaction buffer composition is shown in Table 17.
  • reaction buffer 50 mM Tris-Cl (pH 8.8) 2.5 mM MgCl2 50 mM KCl 5 mM (NH4) 2SO4 0.1% Tween 20 0.01% BSA
  • the amplification by the mismatched primers was delayed in the case of the Tap polymerase including E507K / R536K, E507K / R660V, or E507K / R536K / R660V mutations compared to E507K which is E507K / R536K / R660V Of the mutants.
  • the Tap DNA polymerase including the E507K / R536K, E507K / R660V, or E507K / R536K / R660V mutants of the present invention had excellent mismatch renal selectivity as compared with the Taq polymerase including the E507K mutation. Therefore, it is expected that the above-mentioned three kinds of Taq DNA polymerase can be usefully used for medical diagnosis of disease and research of recombinant DNA.
  • the Taq plasmid vector (E507K / R536K / R660V) was digested with restriction enzyme KpnI / XbaI for 4 hours at 37 ° C under the conditions shown in Table 20 and then purified (elution: 25 ⁇ l) to prepare a digested linear vector.
  • the infusion cloning reaction was then carried out at 37 ° C for 15 minutes under the conditions of Table 21, and then transformed into E. coli DH5 ⁇ or DH10 ⁇ and screened on a medium containing ampicillin.
  • the prepared plasmid was sequenced from the obtained colonies to obtain a Taq DNA polymerase mutant (" E507K / R536K / R587I / R660V ") into which the R587I mutation was introduced.
  • 5X EZ-fusion mix (ENGNOMICS) 2 ⁇ l
  • the vector digested with Kpn I, Xba I 50 ng / ul) 1 ⁇ l F1 fragment (83 ng / ul) 1 ⁇ l F2 fragment (50 ng / ul) 1 ⁇ l Distilled water 5 ⁇ l 10 ⁇ l
  • Taq polymerase containing the " E507K / R536K / R587I / R660V " mutation obtained in Example 4 the ability to extend the mismatched primer to the template containing the SNP of Q61H in the KRAS gene was reduced Respectively.
  • Taq polymerase including the mutation "E507K / R536K / R660V” was used as a control group.
  • the template containing the SNPs was gDNA (104 copies, 33 ng / rxn) obtained from a HepG2 liver cancer cell line and was obtained through a conventional DNA extraction method.
  • the detection target site was confirmed to be consistent with the NCBI reference sequence (NG_007524.1) and used as a wild type (WT).
  • Sequence information of the specific primers for the template is as shown in Table 22 below.
  • the qPCR conditions (Applied Biosystems 7500 Fast) are the same as in Table 14 of Example 3.
  • the probes were labeled as shown in Table 23 below.
  • reaction conditions are the same as in Table 16 of Example 3, and the composition of the reaction buffer is shown in Table 24 below.
  • reaction buffer 50 mM Tris-Cl (pH 8.8) 2.5 mM MgCl2 60 mM KCl 2.5 mM (NH4) 2SO4 25 mM TMAC 0.1% Tween 20 0.01% BSA
  • the present inventors repeatedly performed the above-mentioned experiment again using the primer of Table 25, which is a short 18mer primer of 24mer length shown in Table 22 above. All conditions were the same as the experiment using the 24-mer length primer except that the reaction buffer composition of Table 26 was used.
  • reaction buffer 50 mM Tris-Cl (pH 8.8) 2.5 mM MgCl2 15 mM (NH4) 2SO4 0.1% Tween 20 0.01% BSA
  • Taq polymerase including E507K / R536K / R587I / R660V mutation compared to E507K / R536K / R660V as a control group was delayed in amplification by mismatched primers .
  • the ⁇ Ct of the polymerase into which R587I was introduced increased more remarkably.
  • Taq polymerase containing the " E507K / R536K / R587I / R660V " mutation obtained in Example 4 the ability to extend the mismatched primer for the template containing the SNP of G13D in the KRAS gene was reduced Respectively.
  • Taq polymerase including the mutation "E507K / R536K / R660V” was used as a control group.
  • the template containing the SNPs was gDNA (104 copies, 33 ng / rxn) obtained from a HepG2 liver cancer cell line and was obtained through a conventional DNA extraction method.
  • the detection target site was confirmed to be consistent with the NCBI reference sequence (NG_007524.1) and used as a wild type (WT).
  • the qPCR conditions (Applied Biosystems 7500 Fast) were the same as in Table 14 of Example 3.
  • the probes were labeled as shown in Table 28 below.
  • Probe Name The sequence (5'-3 ') Tm ( ⁇ ⁇ ) G1213_R FAM AGC TCC AAC TAC CAC AAG TTT ATA TTC AGT (SEQ ID NO: 53) 66.2
  • the reaction conditions were the same as those in Table 16 of Example 3 and the composition of the reaction buffer was the same as that of Table 24 of Example 5-1.
  • the reaction solutions except for the specific primers of Table 27 were the same And qPCR was performed by adding each allele-specific primer.
  • fluorescence signals detected in each tube were merged to analyze the difference in the cycle (Ct) values reaching the threshold fluorescence value calculated and calculated on the AB 7500 software (v2.0.6). It is judged that the longer the Ct value in the amplification by the mismatched primer is, the better the gene mutation specificity or the allele specificity.
  • the AS-qPCR results showed that the Taq polymerase including the E507K / R536K / R587I / R660V mutation was delayed in amplification by the mismatched primer as compared with the control group E507K / R536K / R660V.
  • Taq polymerase containing the " E507K / R536K / R587I / R660V " mutation obtained in Example 4 the ability to extend the mismatched primer for the template containing the G13S SNP in the KRAS gene was reduced Respectively.
  • Taq polymerase including the mutation "E507K / R536K / R660V” was used as a control group.
  • the template containing the SNPs was gDNA (104 copies, 33 ng / rxn) obtained from a HepG2 liver cancer cell line and was obtained through a conventional DNA extraction method.
  • the detection target site was confirmed to be consistent with the NCBI reference sequence (NG_007524.1) and used as a wild type (WT).
  • the qPCR conditions (Applied Biosystems 7500 Fast) are the same as in Table 14 of Example 3.
  • the probes were labeled as shown in Table 30 below.
  • Probe Name The sequence (5'-3 ') Tm ( ⁇ ⁇ ) G1213_F FAM AGC TGT ATC GTC AAG GCA CTC TTG C (SEQ ID NO: 57) 68.2
  • the reaction conditions were the same as those in Table 16 of Example 3 and the composition of the reaction buffer was the same as that of Table 24 of Example 5-1.
  • the reaction solutions except for the specific primers of Table 29 were the same And qPCR was performed by adding each allele-specific primer.
  • fluorescence signals detected in each tube were merged to analyze the difference in the cycle (Ct) values reaching the threshold fluorescence value calculated and calculated on the AB 7500 software (v2.0.6). It is judged that the longer the Ct value in the amplification by the mismatched primer is, the better the gene mutation specificity or the allele specificity.
  • Taq polymerase containing the " E507K / R536K / R587I / R660V " mutation obtained in Example 4 above the ability to extend the mismatched primer for the template containing the SNP of L858R in the EGFR gene was reduced Respectively.
  • Taq polymerase including the mutation "E507K / R536K / R660V” was used as a control group.
  • the template containing the SNPs was gDNA (104 copies, 33 ng / rxn) obtained from a HepG2 liver cancer cell line and was obtained through a conventional DNA extraction method. It was confirmed that all of the detection target sites corresponded to the NCBI reference sequence (NG_007726.3) and used as the wild type (WT).
  • the qPCR conditions (Applied Biosystems 7500 Fast) were the same as in Table 14 of Example 3.
  • the probes were double labeled as shown in Table 32 below.
  • the reaction conditions were the same as those in Table 16 of Example 3 and the composition of the reaction buffer was the same as that of Table 24 of Example 5-1.
  • the reaction solutions except for the specific primers of Table 31 were the same And qPCR was performed by adding each allele-specific primer.
  • fluorescence signals detected in each tube were merged to analyze the difference in the cycle (Ct) values reaching the threshold fluorescence value calculated and calculated on the AB 7500 software (v2.0.6). It is judged that the longer the Ct value in the amplification by the mismatched primer is, the better the gene mutation specificity or the allele specificity.
  • Taq DNA polymerase including the E507K / R536K / R587I / R660V mutant of the present invention had excellent mismatch renal selectivity in some cases as compared with the Taq polymerase including the E507K / R536K / R660V mutation . Therefore, Taq DNA polymerase including the E507K / R536K / R587I / R660V mutation of the present invention is also expected to be useful for medical diagnosis of diseases and research of recombinant DNA.
  • the optimum concentration of KCl was determined by adjusting the concentration of KCl in the PCR reaction buffer in order to find a high cation concentration in which the amplification efficiency by the match is not decreased while maximally delaying the mismatch amplification .
  • Taq polymerase containing each of the "E507K / R536K", “E507K / R660V” and “E507K / R536K / R660V” mutations obtained in Example 2 was used and the Taq polymerase containing the E507K mutation and the KCl concentration limit Respectively.
  • the template containing SNP used rs1408799, the genotype of the template was TT, and the rs1408799 primer shown in Table 2 was used as a primer.
  • the qPCR conditions (Applied Biosystems 7500 Fast) were performed under the conditions of Table 14, the double labeled probes were 1408799-FAM in Table 15, the reaction conditions were in Table 33, and the composition of the reaction buffer is shown in Table 34.
  • reaction buffer 50 mM Tris-Cl (pH 8.8) 2.5 mM MgCl2 x mM KCl 2.5 mM (NH4) 2SO4 0.1% Tween 20 0.01% BSA
  • KCl concentration limit was lowest in E507K / R536K / R660V Taq polymerase, and lower in E507K / R536K and E507K / R660V than E507K. Additional experiments were performed using E507K / R536K / R660V Taq polymerase to determine the KCl concentration in the titrated line.
  • the rs1408799-T specific primer shown in Table 13 was used as the primer, and 35 cycles were performed under the conditions shown in Table 14 for the qPCR conditions (Applied Biosystems 7500 Fast).
  • the reaction buffer composition of the control group is as shown in Table 36.
  • the reaction buffer composition of the experimental group was fixed at a constant concentration of (NH 4) 2 SO 4 to 2.5 mM and various concentrations of KCl were changed as shown in Table 34.
  • Control buffer 50 mM Tris-Cl (pH 8.8) 1M Betaine 2.5 mM MgCl2 50 mM KCl 2.5 mM (NH4) 2SO4 0.1% Tween 20 0.01% BSA
  • the concentration of (NH4) 2SO4 was varied to determine the optimum (NH4) 2SO4 concentration after fixing the KCl concentration in the reaction buffer to 75 mM constantly based on the results of Example 4 above.
  • the rs1408799-T specific primers shown in Table 13 were used as the primers and the 35 cycles were performed under the conditions shown in Table 14 under the conditions of qPCR (Applied Biosystems 7500 Fast).
  • the reaction conditions are shown in Table 35 and the composition of the control reaction buffer is shown in Table 36 Respectively.
  • the KCl concentration in the reaction buffer was fixed to 75 mM constantly, and the concentration of (NH4) 2SO4 was set to about 5 mM (2.5 mM, 5 mM and 10 mM, respectively) .
  • the rs1408799 primer shown in Table 13 was used as the primer, the 1408799-FAM in Table 15 as the double-labeled probe, and the reaction conditions are shown in Table 37 below.
  • the optimum concentration was confirmed by adding TMAC to the reaction buffer. Based on the results of Examples 6 and 7, the concentration of KCl in the reaction buffer was fixed to 75 mM, the concentration of (NH4) 2SO4 was fixed to 5 mM, and the concentration of TMAC was varied to various concentrations, .
  • E507K / R536K or E507K / R536K / R660V Taq polymerase was used.
  • the template containing SNP was rs1408799, the genotype of the template was TT, and the rs1408799 primer shown in Table 13 was used as a primer.
  • the qPCR conditions (Applied Biosystems 7500 Fast) were performed under the conditions of Table 14, the double labeled probes were 1408799-FAM in Table 15, and the reaction conditions are shown in Table 37.
  • the concentration of TMAC was 60 mM for the E507K / R536K Taq polymerase and 25 mM for the E507K / R536K / R660V Taq polymerase, In the case of the present invention.
  • the optimum concentrations of KCl, (NH4) 2SO4 and TMAC in the reaction buffer were determined using E507K / R536K / R660V Taq polymerase based on the results confirmed in Example 8 above.
  • the concentration of TMAC was fixed to 25 mM
  • the concentration of (NH4) 2SO4 was fixed to 2.5 mM
  • the concentration of KCl was changed to 20, 40, 60 and 80 mM, respectively.
  • the rs1015362 and rs4911414 primers shown in Table 13 were used.
  • the qPCR conditions (Applied Biosystems 7500 Fast) were set forth in Table 14
  • the double labeled probes are shown in Table 15 as 1408799-FAM, and the reaction conditions are shown in Table 37.
  • the optimal KCl concentration in the reaction buffer was 60 mM
  • the (NH4) 2SO4 concentration was 2.5 mM
  • the TMAC concentration was 25 mM.
  • 75 mM KCl, 5 mM (NH4) 2SO4 and 60 mM TMAC were most effective for the E507K / R536K / R660V polymerase
  • 60 mM KCl, 2.5 mM (NH4) 2SO4 and 25 mM TMAC were most effective for the E507K / R536K / R660V polymerase .
  • the DNA polymerase having increased gene mutation specificity of the present invention has a higher mismatch-to-match elongation selectivity as compared with the conventional Taq polymerase, thereby enabling reliable gene mutation-specific amplification without any substrate modification.
  • the kit comprising the PCR buffer composition and / or the DNA polymerase having increased gene mutation specificity of the present invention can effectively detect gene mutation or SNP, and thus can be usefully used for medical diagnosis of diseases and research on recombinant DNA have.

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Abstract

본 발명은 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소 및 이의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 특정 아미노산 위치에서 돌연변이가 유발되어 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소, 상기 중합효소를 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하며, 또한 상기 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법, 상기 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 PCR 키트를 제공한다. 나아가, 본 발명은 상기 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성을 증가시키기 위한 PCR 버퍼 조성물, 상기 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트, 및 상기 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공한다.

Description

유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소 및 이의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물
본 발명은 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소 및 이의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 특정 아미노산 위치에서 돌연변이가 유발되어 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소, 상기 중합효소를 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하며, 또한 상기 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법, 상기 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 PCR 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성을 증가시키기 위한 PCR 버퍼 조성물, 상기 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트, 및 상기 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공한다.
첫 번째 인간 유전체 서열이 밝혀진 이래로, 연구자들은 단일염기 돌연변이 (단일염기다형성, SNPs)와 같은 개체 간의 유전적 차이를 발견하는데 집중해왔다. 유전체에서 단일염기 변이는 매우 다양한 질환에 대한 서로 다른 약물 내성 또는 질병소질과 연관되어 있다는 것이 점점 더 분명해지고 있기 때문에 관심의 대상이 된다. 추후 의학적으로 관련이 있는 뉴클레오타이드 변이에 대한 지식은 개인의 유전적 공급에 대한 치료법을 적용할 수 있고, 비효과적이거나 부작용을 일으킬 수 있는 약물 치료를 방지할 수 있다. 뉴클레오타이드 변이의 시간 및 비용 효율적인 식별을 가능하게 하는 기술의 개발은 약리유전학에서의 추가적인 진보를 가져올 것이다.
SNPs는 인간 유전체에서 주요 유전적 변이를 차지하며 개체 간의 차이의 90% 이상을 유발한다. 이러한 유전적 변이와 돌연변이와 같은 다른 핵산 변이를 검출하기 위해, 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산의 변이체를 동정하는 것은 분석하고자 하는 핵산 샘플을 적합한 혼성화 조건에서 서열 변이체에 대해 특이적인 혼성화 프라이머와 혼성화함으로써 이루어질 수 있다.
그러나, 이러한 혼성화 방법은, 특히, 어세이의 필수적인 민감도 측면에서 임상학적 요구를 만족시키지 못한다는 것을 발견하였다. 따라서, PCR은 분자생물학 및 SNP 및 다른 대립 유전자 서열 변이체와 같은 돌연변이 검출을 위한 진단 검사 방법에서 폭넓게 사용되어 왔으며, 여기서 변이체의 존재를 고려하여 검사하고자 하는 표적 핵산은 혼성화 전에 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하였다. 그러한 어세이를 위한 혼성화 프로브로서, 일반적으로 단일가닥 올리고뉴클레오타이드가 사용된다. 상기 어세이의 변형된 구현예는 형광 혼성화 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 일반적으로, SNP 및 다른 서열 변이의 측정 방법을 자동화하고자 노력하였다 (Gut, Hum. Mutat. 17, 475-492 (2001)).
당해 기술분야에 공지된 서열 변이 특이적 혼성화의 대안은 소위 유전자 변이 특이적 증폭에 의해 제공된다. 이러한 검출 방법에서, 이미 증폭하는 동안, 변이 특이적 증폭 프라이머가 사용되고, 이는 통상적으로 프라이머의 3'-말단에 소위 차별적 말단 뉴클레오타이드 잔기를 가지며, 잔기는 단지 검출하고자 하는 표적 핵산의 하나의 특이적 변이에만 상보적이다. 이 방법에서, 뉴클레오타이드 변이체는 PCR 증폭 후에 DNA 산물의 존재 또는 부재에 의해 측정된다. 유전자 변이 특이적 증폭의 원리는 유전자 변이 특이적 증폭 프라이머 말단에서 표준(canonical) 또는 비표준 프라이머-주형 복합체의 형성을 기반으로 한다. 정확하게 쌍을 이루는 3' 프라이머 말단에서, DNA 중합효소에 의한 증폭이 일어나는 반면, 미스매치된 프라이머 말단에서는 연장이 억제된다.
예를 들어, U.S. Pat. No. 5,595,890는 유전자 변이 특이적 증폭을 위한 방법 및 이의 적용, 예를 들어 k-ras 종양 유전자에서 임상적으로 연관된 점돌연변이 (point mutation)의 검출을 위한 적용을 개시하고 있다. 또한, U.S. Pat. No. 5,521,301은 ABO 혈액형 시스템의 유전형 분석을 위한 대립 유전자-특이적 증폭 방법을 개시하고 있다. 대조적으로, U.S. Pat. No. 5,639,611은 겸상 적혈구 빈혈의 원인이되는 점돌연변이의 검출과 관련된 대립 유전자-특이적 증폭의 사용을 개시하고 있다. 그러나, 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭은 선택성이 낮다는 문제가 있으며, 이는 더욱 복잡하고 시간 및 비용 집약적인 최적화 단계를 필요로 한다.
서열 변이, 다형성 및 주로 점돌연변이를 검출하기 위한 상기와 같은 방법은, 특히, 검출하고자 하는 서열 변이가 동일한 핵산 분절 (또는 동일한 유전자)의 우세한 변이와 비교하여 부족한 경우 대립 유전자-특이적 증폭(또는 유전자 변이 특이적 증폭)을 필요로 한다.
예를 들어, 유전자 변이 특이적 증폭에 의해 산재성 종양 세포가 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 체액에서 검출되게 되는 경우, 이러한 상황이 발생한다 (U.S. Pat. No. 5,496,699). 이를 위해, DNA는 첫 번째로 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 체액으로부터 분리되고, DNA는 부족한 산재성 종양 세포와 과량의 비증식성 세포로 구성된다. 따라서, k-ras 유전자에서 종양 DNA에 중요한 돌연변이는 과량의 야생형 DNA 존재 하에 몇 개의 복제본으로부터 검출되어야 한다.
종래 기술에 개시된 유전자 변이 특이적 증폭에 대한 모든 방법은, 3'-말단 차별적 올리고뉴클레오타이드 잔기가 사용되어야 한다는 단점이 있다. 또한, 3'-차별적 뉴클레오타이드 잔기의 사용에도 불구하고, 표적 핵산이 검출하고자 하는 서열 변이체와 정확하게 일치하지 않더라도, 적합한 DNA 중합효소의 존재 하에 프라이머 연장이 낮은 수준으로 발생한다는 단점을 갖는다. 특히, 특정 서열 변이체가 다른 서열 변이체를 포함하는 과량의 백그라운드 핵산으로 검출되게 되는 경우, 위양성 결과를 초래하게 된다. 이러한 PCR 기반 방법이 갖는 단점의 주된 이유는 미스매치되는 염기를 충분히 구별하기 위한 방법에 사용되는 중합효소의 부적합성이다. 따라서, PCR로 돌연변이의 유무에 대한 명확한 정보를 직접적으로 얻는 것은 아직까지 가능하지 않다. 현재까지, 추가의 시간 및 비용 집약적 정제와 분석 방법이 돌연변이의 명확한 진단을 위해 요구되었다. 그러므로, 유전자 변이 특이적 또는 대립 유전자-특이적 PCR 증폭의 선택성을 향상시킬 수 있는 신규한 방법은 PCR에 의한 직접적인 유전자 변이 또는 SNP 분석의 신뢰성 및 강력함에 큰 영향을 미칠 것이다.
이에 따라, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소 및 상기 DNA 중합효소가 제 기능을 발휘할 수 있도록 다양한 물질이 혼합된 최적의 반응 버퍼에 대한 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 유전자 변이 특이적 PCR 증폭의 선택성을 향상시킬 수 있는 신규한 DNA 중합효소 및 이의 활성을 증가시키기 위한 반응 버퍼를 개발하기 위해 노력한 결과, Taq 중합효소의 특정 위치의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하는 경우 유전자 변이 특이성이 현저하게 증가하고, PCR 버퍼 조성물의 성분 중 KCl, (NH4)2SO4 및/또는 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)의 농도를 조절하는 경우 상기 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성이 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 유전자 변이 또는 SNP가 포함된 표적서열에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 검출하기 위한 DNA 중합효소를 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 DNA 중합효소 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 DNA 중합효소를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 유전자 변이 또는 SNP 검출용 조성물을 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 PCR 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소로서,
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기의 치환; 및
(b) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기의 치환,
(ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 660번째 아미노산 잔기의 치환,
(iii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환, 또는
(iv) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째, 587번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환;을 포함하는 DNA 중합효소를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 507번째 아미노산 잔기의 치환은 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되는 것이고, 상기 536번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되는 것이며, 상기 587번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 이소류신(I)으로 치환되는 것이고, 상기 660번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 DNA 중합효소는 매치된 프라이머와 미스매치된 프라이머를 구별하고, 상기 매치된 프라이머와 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단에 비표준 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 DNA 중합효소는 매치된 프라이머를 포함하는 표적서열의 증폭이 미스매치된 프라이머를 포함하는 표적서열의 증폭보다 낮은 Ct값 (높은 증폭 효율)의 향상을 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 배양물 및 이의 배양상청액으로부터 DNA 중합효소를 분리하는 단계;를 포함하는 DNA 중합효소 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 DNA 중합효소를
a) 하나 이상의 주형;
b) 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다; 및
c) 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 접촉시키는 것을 포함하고,
상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되고, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단으로부터 7개까지의 염기 위치에 비표준(non-canonical) 뉴클레오타이드를 포함하는, 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 방법은 이중가닥 특이적 염료를 이용한 용융 온도(melting point) 분석을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 방법은 실시간 PCR, 표준 PCR 후 아가로스 겔에서의 분석, 실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭, 테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR 또는 등온 증폭에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 유전자 변이 또는 SNP 검출용 조성물을 포함하는 PCR 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 캐스트 PCR(Competitive allele-specific TaqMan PCR), 드랍렛 디지털 PCR(Droplet digital PCR) 또는 매스 어레이(MassARRAY)에 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단으로부터 7개까지의 염기 위치에 비표준(non-canonical) 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는
a) 하나 이상의 버퍼;
b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약;
c) 중합효소 차단 항체;
d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및
e) 하나 이상의 주형; 을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 25 내지 100 mM의 KCl; 및 1 내지 15 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 KCl의 농도는 60 내지 90 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 2 내지 8 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 KCl의 농도는 70 내지 80 mM이고, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 4 내지 6 mM일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 PCR 버퍼 조성물에 5 내지 80 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 추가로 포함하는, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 KCl의 농도는 40 내지 90 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 1 내지 7 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)의 농도는 15 내지 70 mM이고, 상기 KCl의 농도는 50 내지 80 mM이며, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 1.5 내지 6 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 PCR 버퍼 조성물은 Tris·Cl 및 MgCl2를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 PCR 버퍼 조성물을 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소로서, 다음의 아미노산 치환을 포함하는 DNA 중합효소를 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기의 치환; 및
(b) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기의 치환,
(ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 660번째 아미노산 잔기의 치환,
(iii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환, 또는
(iv) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째, 587번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 507번째 아미노산 잔기의 치환은 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되는 것이고, 상기 536번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되는 것이며, 상기 587번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 이소류신(I)으로 치환되는 것이고, 상기 660번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 a) 뉴클레오사이드 트리포스페이트; b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약; c) 중합효소 차단 항체; d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및 e) 하나 이상의 주형; 을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 PCR 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소는 종래의 Taq 중합효소와 비교하여 더 높은 미스매치 대비 매치 신장 선택성을 가지므로, 어떠한 기질 변형없이도 신뢰성 있는 유전자 변이 특이적 증폭을 가능하게 한다. 본 발명은 또한, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소가 제 기능을 효과적으로 발휘할 수 있는 최적의 PCR 버퍼 조성물을 제공하며, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소와 함께 사용하여 상기 DNA 중합효소의 활성을 현저하게 향상시킴으로써 신뢰성 있는 유전자 변이-특이적 증폭을 가능하게 한다. 아울러, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 키트는 유전자 변이 또는 SNP를 효과적으로 검출할 수 있으므로, 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 R536K, R660V 및 R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정을 나타낸 것으로, (a)는 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이고, (b)는 단편 PCR에서 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며, (c)는 오버랩 PCR로 전장을 증폭하여 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 1(c)의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 3은 E507K, E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정 중 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 3의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 5는 구강 상피세포를 채취하여 PCR 주형을 제조하는 과정을 도식화한 것이다.
도 6a 내지 6d는 본 발명의 E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여, rs1408799에 대해 AS-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 대조군으로는 E507K 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
도 7a 내지 7d는 본 발명의 E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V 변이를 가지는 Taq 중합효소를 사용하여, rs1015362에 대해 AS-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 대조군으로는 E507K 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
도 8a 내지 8d는 본 발명의 E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V 변이를 가지는 Taq 중합효소를 사용하여, rs4911414에 대해 AS-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 대조군으로는 E507K 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
도 9는 E507K/R536K/R587I/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정을 나타낸 것으로, (a)는 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이고, (b)는 단편 PCR에서 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 10d는 E507K/R536K/R587I/R660V 중합효소를 사용하여, KRAS 유전자에서 Q61H의 SNP를 포함하는 주형에 대해 AS-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 도 10a와 10b는 24mer 길이의 프라이머를 사용한 결과이고, 도 10c와 10d는 18mer 길이의 프라이머를 사용한 결과이며, 대조군으로는 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
도 11은 E507K/R536K/R587I/R660V 중합효소를 사용하여, KRAS 유전자에서 G13D의 SNP를 포함하는 주형에 대해 AS-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 대조군으로는 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
도 12는 E507K/R536K/R587I/R660V 중합효소를 사용하여, KRAS 유전자에서 G12S의 SNP를 포함하는 주형에 대해 AS-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 대조군으로는 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
도 13은 E507K/R536K/R587I/R660V 중합효소를 사용하여, EGFR 유전자에서 L585R의 SNP를 포함하는 주형에 대해 AS-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 대조군으로는 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
도 14a 내지 14d는 본 발명의 E507K, E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여, 반응 버퍼의 KCl 농도 변화에 따른 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 확인한 그래프이다.
도 15는 반응 버퍼에서 최적의 KCl 농도를 확인하기 위해 (NH4)2SO4 농도를 일정하게 고정하고 KCl 농도를 다양하게 변화시켜 증폭을 수행한 다음 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 반응 버퍼에서 최적의 (NH4)2SO4 농도를 확인하기 위해 KCl 농도를 일정하게 고정하고 (NH4)2SO4 농도를 다양하게 변화시켜 증폭을 수행한 다음 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 반응 버퍼의 (NH4)2SO4 농도 변화에 따른 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 확인한 그래프이다.
도 18a 및 18b는 반응 버퍼에서 KCl과 (NH4)2SO4 농도를 일정하게 고정한 후 TMAC 농도 변화에 따른 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 확인한 그래프이다.
도 19a 및 19b는 반응 버퍼에서 TMAC과 (NH4)2SO4 농도를 일정하게 고정한 후 KCl 농도 변화에 따른 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래 기술에 개시된 유전자 변이-특이적 증폭 방법의 단점을 개선시키기 위해, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소 및 상기 DNA 중합효소가 제 기능을 발휘할 수 있도록 다양한 물질이 혼합된 최적의 반응 버퍼에 대한 개발이 지속적으로 요구되고 있으며, 이러한 방법의 개발은 PCR에 의한 직접적인 유전자 변이 또는 SNP 분석의 신뢰성 및 강력함에 큰 영향을 미칠 것이다. 본 발명자들은 유전자 변이-특이적 PCR 증폭의 선택성을 향상시킬 수 있는 신규한 DNA 중합효소 및 이의 활성을 증가시키기 위한 반응 버퍼를 개발하기 위해 노력한 결과, Taq 중합효소의 특정 위치의 아미노산 잔기에 돌연변이를 유발하는 경우 유전자 변이 특이성이 현저하게 증가하고, PCR 버퍼 조성물의 성분 중 KCl, (NH4)2SO4 및/또는 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)의 농도를 조절하는 경우 상기 유전자 변이적 증폭 효율이 증가된 DNA 중합효소의 활성이 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소는 종래의 Taq 중합효소와 비교하여 더 높은 미스매치 대비 매치 신장 선택성을 가지므로, 어떠한 기질 변형없이도 신뢰성 있는 유전자 변이 특이적 증폭을 가능하게 한다. 본 발명은 또한, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소가 제 기능을 효과적으로 발휘할 수 있는 최적의 PCR 버퍼 조성물을 제공하며, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소와 함께 사용하여 상기 DNA 중합효소의 활성을 현저하게 향상시킴으로써 신뢰성 있는 유전자 변이-특이적 증폭을 가능하게 한다. 아울러, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 키트는 유전자 변이 또는 SNP를 효과적으로 검출할 수 있으므로, 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있다.
이하, 본원에 사용되는 용어를 설명한다.
"아미노산" 은 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질에 혼입될 수 있는 임의의 단량체 단위를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산" 은 하기 20 개의 천연 또는 유전적으로 인코딩된 알파-아미노산을 포함한다: 알라닌 (Ala 또는 A), 아르기닌 (Arg 또는 R), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Gln 또는 Q), 글루탐산 (Glu 또는 E), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 라이신 (Lys 또는 K), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 프롤린 (Pro 또는 P), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 트립토판 (Trp 또는 W), 티로신 (Tyr 또는 Y), 및 발린 (Val 또는 V).
아미노산은 전형적으로 유기산이며, 이는 치환되거나 치환되지 않은 아미노기, 치환되거나 치환되지 않은 카르복시기, 및 하나 이상의 측사슬(side chain) 또는 기(group), 또는 이들 기의 임의의 유사체를 포함한다. 예시적인 측사슬은, 예를 들어, 티올, 셀레노, 술포닐, 알킬, 아릴, 아실, 케토, 아지도, 히드록실, 히드라진, 시아노, 할로, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포시핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 또는 이들 기의 임의의 조합을 포함한다.
다른 예시적인 아미노산은 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는다: 광활성화 가능한 가교제를 포함하는 아미노산, 금속 결합 아미노산, 스핀-라벨링된 아미노산, 형광 아미노산, 금속-함유 아미노산, 신규 관능기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 광케이지화된 및/또는 광이성질체화 가능한 아미노산, 방사성 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화 아미노산, 다른 카르보히드레이트 변형된 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자 치환된 아미노산, 화학분해성 및/또는 광분해성 아미노산, 탄소-링크된 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산.
본 발명의 DNA 중합효소에서, 용어 "돌연변이체"는 상응하는 자연 발생 또는 변형되지 않은 DNA 중합효소에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 의미한다.
용어 "열안정성 중합효소" (열에 안정한 효소를 지칭함)는 열 저항성이 있으며, 후속 폴리뉴클레오타이드 신장 반응을 달성하기에 충분한 활성을 보유하고 이중가닥 핵산의 변성을 달성하기 위해 요구되는 시간 동안 승온으로 처리될 때 비가역적으로 변성 (불활성화) 되지 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이, PCR 과 같은 반응을 사이클링하는 온도에 사용되기에 적합하다. 본원에서 비가역성 변성은 영구하고 효소 활성의 완전한 손실을 지칭한다. 열안정성 중합효소에 대해, 효소 활성은 주형 핵산 가닥에 대해 상보적인 폴리뉴클레오타이드 신장 생성물을 형성하기 위한 적절한 방식으로 뉴클레오타이드의 조합을 촉매작용하는 것을 지칭한다. 호열성 박테리아 유래 열안정성 DNA 중합효소는 예를 들어 하기를 포함한다: 써모토가 마리티마, 써무스 아쿠아티쿠스, 써무스써모필루스, 써무스 플라부스, 써모드 필리포르미스, 써무스 종 Sps17, 써무스 종 Z05, 써무스 칼도필루스, 바실러스 칼도테낙스, 써모토가 네오폴리타나, 및 써모시포 아프리카누스 유래 DNA 중합효소.
용어 "열활성" 은 RT-PCR 및/또는 PCR 반응에서 역전사 또는 어닐링/신장 단계에 통상적으로 사용되는 온도 (즉, 45-80 ℃)에서 촉매 특성을 유지하는 효소를 지칭한다. 열안정성 효소는 핵산 변성에 요구되는 상승된 온도로 처리될 때 비가역적으로 불활성화되거나 변성되지 않는 것이다. 열활성 효소는 열안정성일 수 있거나 열안정성일 수 없다. 열활성 DNA 중합효소는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 호열성 종 또는 중온성 종으로부터 의존적인 DNA 또는 RNA 일 수 있다.
용어 "숙주 세포" 는 세포 배양액에서 배양할 때 고등 식물 또는 동물로부터 둘 모두의 단일-세포성 원핵생물 및 진핵생물 유기체 (예를 들어, 박테리아, 효모, 및 방선균) 및 단일 세포를 지칭한다.
용어 "벡터(vector)"란 복제 가능하고 유전자 같은 외래 DNA를 수용 세포로 전달할 수 있는 DNA 분자로서 플라스미드, 파지, 인조 염색체 등이 있다. 본원에서 "플라스미드", "벡터" 또는 "플라스미드 벡터"는 동일한 의미로 사용될 수 있다.
용어 "뉴클레오타이드(nucleotide)"는 단일가닥(single strand) 또는 이중가닥(double strand) 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleic acid; DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(ribonucleic acid; RNA)이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함할 수 있다.
용어 "핵산"은 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA 또는 RNA 중합체, 또는 이의 유사체에 상응할 수 있는 중합체를 지칭한다. 핵산은, 예를 들어, 염색체 또는 염색체 분절, 벡터 (예를 들어, 발현 벡터), 발현 카세트, 네이키드 DNA 또는 RNA 중합체, 중합효소 사슬 반응 (PCR) 의 생성물, 올리고뉴클레오타이드, 탐침, 및 프라이머일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 핵산은 예를 들어, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 삼중-가닥일 수 있으나 임의의 특정 길이에 한정되지 않는다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시되는 임의의 서열 외에도 상보 서열을 포함하거나 이를 코딩한다.
용어 "프라이머" 는 폴리뉴클레오타이드 신장이 개시되는 조건 하에 놓일 때 주형-방향으로 핵산 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 프라이머는 또한 de novo RNA 합성 및 시험관내 전사-관련 공정의 개시제로서 포함되는, 다양한 기타 올리고뉴클레오타이드-중재 합성 공정에서 사용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로는, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 올리고데옥시리보뉴클레오타이드)이다. 프라이머의 적절한 길이는 전형적으로는 6 내지 40 개의 뉴클레오타이드 범위, 보다 전형적으로는 15 내지 35 개의 뉴클레오타이드 범위에서 의도되는 사용에 따라 달라진다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 혼성화 착물을 형성하기 위해 보다 저온의 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영하는데 요구되지 않으나, 프라이머가 신장되기 위한 주형과 혼성화되기 위해 충분히 상보적이어야만 한다. 특정 구현예에서, 용어 "프라이머 쌍"은 증폭되는 핵산 서열의 5'-말단에 상보적으로 혼성화되는 5'-센스 프라이머를 포함하고, 증폭되는 서열의 3' 말단에 혼성화되는 3'-안티센스 프라이머를 포함하는 프라이머의 세트를 의미한다. 프라이머는, 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 표지를 혼입함으로써 표지될 수 있다. 예를 들어, 유용한 표지는 하기를 포함한다: 32P, 형광 염료, 전자-덴스 시약, 효소 (ELISA 분석에서 통상적으로 사용됨), 비오틴, 또는 합텐 및 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용될 수 있는 단백질.
용어 "5'-핵산가수분해효소(nuclease) 프로브"는 핵산 검출을 표적화하기 위해 5'-핵산가수분해효소 반응에서 사용되는 하나 이상의 발광 표지 부분을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 예를 들어, 5'-핵산가수분해효소 프로브는 오직 단일 발광 부분 (예를 들어, 형광 염료, 등)을 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는, 프로브가 선택 조건 하에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자가-상보적 영역을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는, 2개 이상의 표지 부분을 포함하고, 2개 중 하나의 표지가 올리고뉴클레오타이드로부터 분리되거나 분해된 후 방사 강도가 증가하여 방출된다. 특정 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는 2개의 상이한 형광 염료, 예를 들어 5'-말단 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 표지된다. 몇몇 구현예에서, 5'-뉴클레아제 탐침은, 말단 위에 더하여, 또는 말단 위치 이외의 하나 이상의 위치에서 표지된다. 프로브가 원래대로인 경우, 전형적으로, 리포터 염료로부터 형광 방출이 부분 이상 소광되도록 2 개의 형광물질 사이에서 에너지 이동이 발생한다. 중합효소 사슬 반응의 신장 단계동안, 예를 들어 주형 핵산에 결합되는 5'-핵산가수분해효소 프로브가 리포터 염료의 형광 발광이 더 이상 소광되지 않도록 하는 활성을 갖는 예를 들어, Taq 중합효소 또는 다른 중합효소의 5' 내지 3'-핵산가수분해효소 활성에 의해 분해된다. 몇몇 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브가 둘 이상의 상이한 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 표지될 수 있다.
용어 "FRET" 또는 "형광 공명 에너지 이동" 또는 "포에스터 공명 에너지 이동" 은 둘 이상의 발색단, 공여체 발색단 및 수용체 발색단 (소광제로서 지칭됨) 사이의 에너지의 이동을 지칭한다. 공여체는 전형적으로는, 공여체가 적합한 파장의 빛이 방사됨으로써 여기될 때 에너지를 수용체에 이동시킨다. 수용체는 전형적으로는 상이한 파장으로 방사되는 빛의 형태로 이동된 에너지를 재방사한다. 수용체가 "암" 소광제인 경우, 이는 빛 이외의 형태로 이동된 에너지를 분산시킨다. 특정 형광물질이 공여체 또는 수용체로서 작용하는지 여부는 FRET 쌍의 다른 멤버의 특성에 의존적이다. 통상적으로 사용되는 공여체-수용체 쌍은 FAM-TAMRA 쌍을 포함한다. 통상적으로 사용되는 소광제는 DABCYL 및 TAMRA 이다. 통상적으로 사용되는 암 소광제는 하기를 포함한다: BlackHole Quenchers쪠 (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black쪠 (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), 및 BlackBerry쪠 Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).
핵산 염기, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 또는 뉴클레오타이드를 지칭할 때 용어 "통상적인" 또는 "천연"은, 기술되는 폴리뉴클레오타이드에서 천연 발생하는 것을 지칭한다 (즉, DNA 에 대해 이들은 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP임). 또한, dITP, 및 7-데아자-dGTP 는 dGTP 대신 빈번히 이용되며 서열화와 같은 시험관내 DNA 합성 반응에서 dATP 대신 이용될 수 있다.
핵산 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오타이드를 지칭할 때 용어 "통상적이지 않은" 또는 "변형된" 은, 특정 폴리뉴클레오타이드에서 천연적으로 발생하는 통상적인 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오타이드의 변형, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 특정한 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 통상적인 dNTP 와 비교하여 리보오스 당의 2' 위치에서 변형된다. 따라서, RNA 에 대해 자연 발생 뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드 (즉, ATP, GTP, CTP, UTP, 집합적 rNTP)이더라도, 뉴클레오타이드가 당의 2' 위치에서 히드록실기를 갖기 때문에, 이는 비교하여 dNTP가 부재하고, 본원에 사용되는 바와 같이, 리보뉴클레오타이드는 DNA 중합효소에 대한 기질로서 통상적이지 않은 뉴클레오타이드다. 본원에 사용되는 바와 같이, 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 핵산 서열화에 대한 종결자로서 사용되는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 종결자 화합물은 2',3'-디데옥시 구조를 갖는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트로서 지칭된다. 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 ddATP, ddTTP, ddCTP 및 ddGTP 는 ddNTP 로서 집합적으로 지칭된다. 종결자 화합물의 추가의 예는 리보뉴클레오타이드의 2'-PO4 유사체를 포함한다. 다른 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 dNTP ([[α]-S]dNTP), 5'-[α]-보라노-dNTP, [α]-메틸-포스포네이트 dNTP, 및 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (rNTP) 를 포함한다. 통상적이지 않은 염기는 방사성 동위원소, 예컨대 32P, 33P, 또는 35S; 형광 표지; 화학발광의 표지; 생물발광의 표지; 합텐 표지 예컨대 비오틴; 또는 효소 표지 예컨대 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 표지될 수 있다. 형광 표지는, 음성으로 하전된 염료, 예컨대 플루오세인 패밀리의 염료, 또는 중성으로 하전된 염료, 예컨대 로다민 패밀리의 염료, 또는 양성으로 하전된 염료, 예컨대 시아닌 패밀리의 염료를 포함할 수 있다. 플루오세인 패밀리의 염료는, 예를 들어, FAM, HEX, TET, JOE, NAN 및 ZOE를 포함한다. 로다민 패밀리의 염료는 Texas Red, ROX, R110, R6G, 및 TAMRA를 포함한다. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red 및 TAMRA로 라벨링된 다양한 염료 또는 뉴클레오타이드는 Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), 또는 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) 에 의해 시판된다. 시아닌 패밀리의 염료는 Cy2, Cy3, Cy5, 및 Cy7 을 포함하고, GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)에 의해 시판된다.
용어 "미스매치 구별"은, 핵산에 대해 하나 이상의 뉴클레오타이드를 부착함으로써 (예를 들어, 공유적으로), 주형-의존적 방식으로, 핵산 (예를 들어, 프라이머 또는 다른 올리고뉴클레오타이드)을 연장할 때 미스매치-함유 서열로부터 완전히 상보적인 서열을 구별하기 위한, 생체촉매 (예를 들어, 효소, 예컨대 중합효소, 리가아제 등)의 능력을 지칭한다. 용어 "미스매치 구별"은, 연장되는 핵산 (예를 들어, 프라이머 또는 다른 올리고뉴클레오타이드)이 핵산이 혼성화되는 주형에 비해 3'-말단 핵산에서 미스매치를 갖는, 미스매치-함유 (대략 상보적) 서열부터 완전히 상보적인 서열을 구별하기 위한 생체촉매의 능력을 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 연장되는 핵산은 완전히 상보적인 서열에 대해 3'-말단에서 미스매치를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 연장되는 핵산은, 완전히 상보적인 서열에 대해 말단에서 두번째 (N-1) 3'-위치 및/또는 N-2 위치에서 미스매치를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소로서,
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기의 치환; 및
(b) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기의 치환,
(ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 660번째 아미노산 잔기의 치환,
(iii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환, 또는
(iv) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째, 587번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환;을 포함하는 DNA 중합효소에 관한 것이다.
상기 "Taq 중합효소"는 고온성 세균인 써모스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)의 이름을 따서 명명된 내열성 DNA 중합효소로 상기 세균으로부터 최초로 분리되었다. 써모스 아쿠아티쿠스는 온천 및 열수 분출공에 서식하는 세균으로, Taq 중합효소는 PCR 과정에서 요구되는 단백질 변성 조건 (고온)을 견딜 수 있는 효소로 확인되었다. Taq 중합효소의 최적 활성온도는 75-80 ℃이고, 92.5 ℃에서 2시간 이상, 95 ℃에서 40분, 97.5 ℃에서 9분의 반감기를 가지며, 72 ℃에서 10초 이내에 1000개의 염기쌍 DNA를 복제할 수 있다. 이는 3'→5' 핵산말단가수분해효소(exonuclease) 교정 활성이 결여되어 있으며, 9,000개의 뉴클레오타이드 중 약 1개에서 오류율이 측정된다. 예를 들어 내열성 Taq를 사용하면 고온(60 ℃ 이상)에서 PCR을 실행할 수 있다. Taq 중합효소에 대하여 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열이 기준 서열로 사용된다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 507번째 아미노산 잔기의 치환은 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되는 것이고, 상기 536번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되는 것이며, 상기 587번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 이소류신(I)으로 치환되는 것이고, 상기 660번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환되는 것일 수 있다.
본 발명에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K" (서열번호 2)로 명명하였고; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R536K" (서열번호 6)로 명명하였으며; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 660번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R660V" (서열번호 7)로 명명하였고; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R536K/R660V" (서열번호 8)로 명명하였으며; 마지막으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되며, 587번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 이소류신(I)으로 치환되고, 660번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R536K/R587I/R660V" (서열번호 37)로 명명하였다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 DNA 중합효소는 매치된 프라이머와 미스매치된 프라이머를 구별하고, 상기 매치된 프라이머와 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단에 비표준 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되도록 충분히 상보적이어야 하지만 표적서열의 정확한 서열을 반영하지 않은 혼성 올리고뉴클레오타이드이다.
상기 "표준 뉴클레오타이드 (canonical nucleotide)" 또는 "상보적 뉴클레오타이드"는 표준 왓슨-크릭 염기쌍, A-U, A-T 및 G-C를 의미한다.
상기 "비표준 뉴클레오타이드(non-canonical nucleotide)" 또는 "비상보적 뉴클레오타이드"는 왓슨-크릭 염기쌍 외에 A-C, A-G, G-U, G-T, T-C, T-U, A-A, G-G, T-T, U-U, C-C, C-U를 의미한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 DNA 중합효소는 매치된 프라이머를 포함하는 표적서열의 증폭이 미스매치된 프라이머를 포함하는 표적서열의 증폭보다 낮은 Ct값을 나타낼 수 있다.
예를 들어, DNA 중합효소는 프라이머에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 공유적으로 결합시킴으로써 표적서열 의존적인 방식으로 미스매치된 프라이머 보다 더 큰 효율성으로 매치된 프라이머를 신장할 수 있다. 여기서 더 큰 효율성은 예를 들어 RT-PCR에서 미스매치된 프라이머보다 매치된 프라이머에 대해 낮은 Ct값이 관찰될 수 있다. 매치된 프라이머와 미스매치된 프라이머의 Ct값 차이는 10 이상, 바람직하게는 10 내지 20 이거나 미스매치된 프라이머에 의한 앰플리콘의 합성이 없을 수 있다.
예를 들어 첫 번째 반응에서 매치된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머, 동일한 실험 세팅으로 두 번째 반응에서 미스매치된 정방향 프라이머와 매치된 역방향 프라이머를 사용하여 표준 PCR로 형성된 생성물이 두 번째 반응보다 첫 번째 반응에 대해 더 크다는 것을 의미한다.
Ct(Threshold crossing cycle) 값은 로그 눈금상 사이클 수에 대한 형광을 플롯팅하는 것에 의존하는 정량적 PCR로 DNA 정량화 방법을 나타낸다. DNA 기반 형광 검출에 대한 한계값은 최소한 백그라운드보다 약간 높게 설정된다. 형광이 한계값을 초과하는 사이클 수를 Ct 또는, MIQE 가이드라인에 따라 Cq(quantification cycle)이라고 한다. 주어진 반응에 대한 Ct 값은 형광 방출이 고정된 한계값을 교차하는 사이클 수로 정의된다. 예를 들어, SYBR Green I 및 형광 프로브는 주형 DNA 정량화에 대한 실시간 PCR에 사용될 수 있다. 샘플로부터의 형광은 PCR 동안 매 사이클마다 수집되고, 사이클 수에 대해 플롯팅된다. 출발 주형 농도는 형광 신호가 최초로 나타나는 사간에 반비례한다. 신호는 주형의 농도가 높을수록 더 일찍 나타난다 (낮은 사이클 수에서 나타남).
본 발명은 또한 전술한 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열 및 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산을 이용하여 다양한 벡터가 제조될 수 있다. 숙주세포와 호환되는 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 제어 서열을 포함하는 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 발현 벡터일 수 있고, 본 발명의 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 및 번역을 조절하는 핵산 영역을 포함한다. 조절서열은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결되는 코딩서열의 발현에 요구되는 DNA 서열을 말한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 제어 서열은 프로모터, 임의의 작동 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 또한, 벡터는 전사되는 mRNA의 반감기를 증강시키기 위해 "Positive Retroregulatory Element(PRE)"를 포함할 수 있다. 전사 및 번역 조절 핵산 영역은 일반적으로 중합효소를 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포에 대해 적절할 것이다. 다양한 유형의 적절한 발현 벡터, 및 적합한 조절 서열은, 다양한 숙주 세포에 대해 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열은 예를 들어, 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성화 서열을 포함할 수 있다. 전형적인 구현예에서, 조절 서열은 프로모터 및 전사 개시 및 종결 서열을 포함한다. 벡터 또한 전형적으로는 외래 DNA 의 삽입을 위한 수 개의 제한 부위를 함유하는 폴리링커 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, "융합 플래그" 는 정제를 촉진하기 위해 사용되고, 필요에 따라, 태그/플래그가 후속 제거된다 (예를 들어, "His-Tag"). 그러나, "가열-단계" 가 사용되는 중온성 숙주 (예를 들어, E. coli) 로부터 열활성 및/또는 열안정성 단백질을 정제할 때 이들은 일반적으로 불필요하다. DNA 코딩 복제 서열, 조절 서열, 표현형 선택 유전자를 함유하는 적합한 벡터의 구축, 및 관심 돌연변이체 중합효소가 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조된다. 단리된 플라스미드, 바이러스 벡터, 및 DNA 단편이 분해되고 절단되어, 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 원하는 벡터를 생성하기 위해 특정 순서로 함께 라이게이션된다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위해 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 선택 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주 세포에 대해 다양하할 것이다. 적합한 선택 유전자는 암피실린 및/또는 테트라사이클린 저항성에 대한 유전자 코딩을 포함할 수 있고, 이는 이들 항생제의 존재 하에 이들 벡터를 배양하는 세포를 형질전환시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 본 발명의 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열은 세포에 단독으로 또는 벡터와 조합되어 도입된다. 도입 또는 이의 등가적인 표현은 핵산이 후속 통합, 증폭 및/또는 발현에 적합한 방식으로 세포로 들어가는 것을 의미한다. 도입 방법은 예를 들어 CaPO4 침전, 리포좀 융합, LIPOFECTIN®, 전기영동, 바이러스 감염 등을 포함한다.
원핵생물은 본 발명의 초기 클로닝 단계에 대해 숙주 세포로서 사용된다. 다량의 DNA 를 신속하게 제조하기 위해, 부위-지향 돌연변이생성에 사용되는 단일-가닥 DNA 주형을 제조하기 위해, 많은 돌연변이체를 동시에 스크리닝하기 위해, 생성되는 돌연변이체의 DNA 서열화를 위해, 이들이 특히 유용하다. 적합한 원핵세포의 숙주 세포는 E. coli K12 균주 94 (ATCC No. 31,446), E. coli 균주 W3110 (ATCC No. 27,325), E. coli K12 균주 DG116 (ATCC No. 53,606), E. coli X1776 (ATCC No. 31,537), 및 E. coli B; E. coli 의 많은 다른 균주, 예컨대 HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, 및 기타 다른 종들을 포함하고, 바실리 예컨대 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 다른 엔테로박테리아 세아, 예컨대 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세산스 (Serratia marcesans), 및 다양한 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.) 을 포함하는 원핵생물 속이 호스트로서 사용될 수 있다. 전형적으로 E. coli 의 형질전환에 사용되는 플라스미드는 pBR322, pUCI8, pUCI9, pUCIl8, pUC119 및 Bluescript M13 을 포함한다. 그러나 많은 다른 적합한 벡터가 또한 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 배양물 및 이의 배양상청액으로부터 DNA 중합효소를 분리하는 단계;를 포함하는 DNA 중합효소 제조방법을 제공한다.
본 발명의 DNA 중합효소는 DNA 중합효소의 발현을 유도하거나 야기하는 적절한 조건 하에서, DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터로 형질전환되는 숙주 세포를 배양함으로써 제조된다. 단백질 발현에 적합한 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 람다 pL 프로모터-함유 플라스미드 벡터로부터 중합효소의 제조에 적합한 숙주 세포는 E. coli 균주 DG116 (ATCC No. 53606)을 포함한다. 발현에 따라, 중합효소는 수확되고 분리될 수 있다.
일단 정제되면, 본 발명의 DNA 중합효소의 미스매치 구별이 검정될 수 있다. 예를 들어, 미스매치 구별 활성은, 프라이머의 3-말단에서 단일 염기 미스매치를 갖는 표적의 증폭에 대해 프라이머로 완벽히 매치되는 표적 서열의 증폭을 비교함으로써 측정된다. 증폭은, 예를 들어, TaqManTM 프로브의 사용에 의해 실시간 검출될 수 있다. 2개의 표적 서열 사이를 구분하기 위한 중합효소의 능력은 2 개 반응의 Ct를 비교함으로써 추정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 중합효소를
a) 하나 이상의 주형;
b) 뉴클레오사이드 트리포스페이트; 및
c) 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단으로부터 7개까지의 염기 위치에 비표준(non-canonical) 뉴클레오타이드를 포함하는, 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법을 제공한다.
상기 "SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)"는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G 또는 C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 말한다.
본 발명의 생체 외(in vitro) 유전자 변이 또는 SNP 검출 방법에서, 표적서열은 테스트 샘플에 존재할 수 있으며, DNA, cDNA 또는 RNA, 바람직하게는 유전체 DNA를 포함한다. 테스트 샘플은 박테리아, 박테리아 배양물 또는 세포 배양물로부터 제조된 세포 용해물일 수 있다. 또한, 테스트 샘플은 동물, 바람직하게는 척추 동물, 보다 바람직하게는 인간 대상체에 포함된 것일 수 있다. 표적서열은 유전체 DNA, 바람직하게는 개체의 유전체 DNA, 보다 바람직하게는 박테리아 또는 척추 동물, 가장 바람직하게는 인간 대상체의 유전체 DNA에 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 SNP 검출 방법은 SYBR Green I과 같은 이중 가닥 특이적 염료를 이용하여 용융 온도 분석을 포함할 수 있다.
용융 온도 곡선 분석은, 온보드 소프트웨어 (SDS 2.1)를 포함하는 ABI 5700/7000 (96 웰 포맷) 또는 ABI 7900 (384 웰 포맷) 장치와 같은 실시간 PCR 장치에서 수행될 수 있다. 대안적으로는, 용융 온도 곡선 분석은 종결점 분석으로서 수행될 수 있다.
"이중 가닥 DNA에 결합하는 염료" 또는 "이중 가닥 특이적 염료"는 결합되지 않은 상태보다 이중 가닥 DNA에 결합하였을 때 높은 형광을 가지는 경우 사용될 수 있다. 이러한 염료의 예로는, SOYTO-9, SOYTO-13, SOYTO-16, SOYTO-60, SOYTO-64, SYTO-82, 브롬화 에티듐(EtBr), SYTOX Orange, TO-PRO-1, SYBR Green I, TO-PRO-3 또는 EvaGreen이 있다. EtBr 및 EvaGreen (Quiagen)을 제외한 이들 염료는 실시간 응용에 시험되어 왔다.
본 발명의 생체 외(in vitro) 유전자 변이 또는 SNP 검출 방법은 실시간 PCR, 표준 PCR 후 아가로스 겔에서의 분석, 실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭, 테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR 또는 등온 증폭에 의해 수행될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 SNP 검출 방법은 시퀀싱, 미니-시퀀싱, 대립유전자 특이적 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화(dynamic allele-specifichybridization; DASH), PCR 연장 분석(예로, 단일 염기 연장(single base extension; SBE), PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예로, Sequenom의 MassARRAY 시스템), Bio-Plex 시스템(BioRad) 등을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 "표준 PCR"은 통상의 기술자에게 알려진 DNA 또는 cDNA를 단일 또는 수 개의 복제를 증폭시키는 기술이다. 거의 대부분의 PCR은 Taq 중합효소 또는 Klen Taq와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 사용한다. DNA 중합 효소는 주형으로 단일 가닥 DNA를 사용하고, 올리고뉴클레오타드 (프라이머)를 사용함으로써 뉴클레오타이드로부터 새로운 DNA 가닥을 효소적으로 조립한다. PCR에 의해 생성 된 앰플리콘은 예를 들어, 아가로오스 겔에서 분석될 수 있다.
상기 "실시간 PCR"은 PCR을 할 때 실시간으로 그 과정을 모니터할 수 있다. 따라서, 데이터는 PCR이 종료되는 시점이 아니라, PCR 과정 전반에 걸쳐 수집된다. 실시간 PCR에서, 반응은 고정된 사이클 수 후에 축적된 표적 양보다는 증폭이 처음으로 검출될 때의 사이클 동안의 시점을 특징으로 한다. 주로 염료 기반 검출 및 프로브 기반 검출의 두 가지 방법이 정량적 PCR을 수행하는데 사용된다.
상기 "대립 유전자-특이적 증폭(Allele Specific Amplification, ASA)"은 PCR 프라이머를 단일 뉴클레오타이드 잔기가 다른 주형들을 구별할 수 있도록 고안한 증폭 기술이다.
상기 "실시간 PCR을 통한 대립 유전자-특이적 증폭 또는 유전자 변이 특이적 증폭"은 매우 효율적인 방법으로 유전자 변이 또는 SNP를 검출한다. 유전자 변이 또는 SNP를 검출하기 위한 다른 대부분의 방법과는 달리, 표적 유전자 물질의 예비 증폭이 필요하지 않다. ASA는 매치 및 미스매치된 프라이머/표적서열 복합체의 구별을 바탕으로 단일 반응에서 증폭 및 검출을 결합한다. 반응동안 증폭된 DNA의 증가는 이중 가닥 DNA에 결합하는 것에 따라 발광하는 SYBR Green I과 같은 염료에 의해 야기되는 형광 신호의 증가로 실시간 모니터될 수 있다. 실시간 PCR을 통한 대립 유전자-특이적 증폭 또는 유전자 변이 특이적 증폭은 미스매치된 경우에 대한 형광 신호의 지연 또는 부재가 나타난다. 유전자 변이 또는 SNP 검출에서, 이는유전자 변이 또는 SNP 존재 유무에 대한 정보를 제공한다.
상기 "테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR"은 단일 튜브 PCR 반응에서 대조 단편과 함께 야생형 및 돌연변이 대립 유전자를 모두 증폭한다. 비 대립 유전자 특이적 대조 앰플리콘은 돌연변이 영역 측면의 2개의 공통적인 (바깥쪽) 프라이머에 의해 증폭된다. 2개의 대립 유전자 특이적 (안쪽) 프라이머는 공통 프라이머와 반대 방향으로 설계되며, 공통 프라이머와 함께 야생형 및 돌연변이 앰플리콘 둘 다를 동시에 증폭시킬 수 있다. 결과적으로, 2개의 대립 유전자-특이적 앰플리콘은 돌연변이가 공통 (바깥쪽) 프라이머에 대해 비대칭으로 위치하기 때문에 다른 길이를 가지며 표준 겔 전기영동으로 쉽게 분리할 수 있다. 상기 대조 앰플리콘은 증폭 실패뿐만 아니라 위음성에 대한 내부 대조를 제공하며 2개의 대립 유전자-특이적 앰플리콘 중 적어도 하나는 테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR에 항상 존재한다.
상기 "등온 증폭"은 써모사이클러에 의존하지 않고, 바람직하게는 증폭하는 동안 온도가 변화할 필요없이 핵산의 증폭이 더 낮은 온도에서 이루어짐을 의미한다. 등온 증폭에서 사용되는 온도는 실온 (22-24 ℃) 내지 약 65 ℃ 사이, 또는 약 60-65 ℃, 45-50 ℃, 37-42 ℃ 또는 22-24 ℃의 상온일 수 있다. 등온 증폭 결과의 생성물은 겔 전기 영동, ELISA, ELOSA (Enzyme linked oligosorbent assay), 실시간 PCR, ECL (개선된 화학 발광), RNA, DNA 및 단백질 또는 탁도를 분석하는 칩 기반의 모세관 전기 영동 기기인 bioanalyzer로 검출될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 E507K/R536K, E507K/R660V, 또는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여 SNP (rs1408799, rs1015362 및/또는 rs4911414)를 포함하는 주형에 대해 미스매치된 프라이머를 연장하기 위한 능력이 감소되었는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 6 내지 8에 나타난 바와 같이 E507K Taq 중합효소에 비해 E507K/R536K, E507K/R660V, 또는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소의 경우 미스매치된 프라이머에 의한 증폭이 지연되는 것을 확인할 수 있으며, 그 효과는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소에서 가장 현저하게 나타났다.
이를 통해, 상기 3종의 DNA 중합효소는 종래의 Taq 중합효소(E507K)와 비교하여 더 높은 미스매치 신장 선택성을 가짐을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 DNA 중합효소는 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 E507K/R536K/R/R660V Taq 중합효소를 사용하여, KRAS 유전자에서 Q61H, G13D 또는 G12S의 SNP를 포함하는 주형, 그리고 EGFR 유전자에서 L858R의 SNP를 포함하는 주형에 대해 미스매치된 프라이머를 연장하기 위한 능력이 감소되었는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 10a 내지 10d, 11, 12 및 13에 나타난 바와 같이 E507K/R536K/R587I/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소는 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소에 비해 우수한 미스매치 신장 선택성을 가짐을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 E507K/R536K/R587I/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소 또한 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 조성물 및 이를 포함하는 PCR 키트에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 일반 PCR(1 세대 PCR), 실시간 PCR(2 세대 PCR), 디지털 PCR(3세대 PCR) 또는 매스 어레이(MassARRAY)에 적용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 PCR 키트에 있어서, 상기 디지털 PCR은 캐스트 PCR(Competitive allele-specific TaqMan PCR) 또는 드랍렛 디지털 PCR(Droplet digital PCR; ddPCR)일 수 있고, 보다 구체적으로 대립유전자 특이적 캐스트 PCR 또는 대립유전자 특이적 드랍렛 디지털 PCR일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 "캐스트 PCR"은 다량의 정상적인 야생형 gDNA를 함유하는 샘플에서 희귀 돌연변이를 검출하고 수량화하는 방법으로, 야생형 대립유전자로부터의 비-특이적 증폭을 억제하기 위해 대립유전자-특이적 TaqMan® qPCR을 대립유전자-특이적 MGB 차단제와 조합하여 전통적인 대립유전자-특이적 PCR보다 우수한 특이성을 생성할 수 있다.
상기 "드랍렛 디지털 PCR"은 20 ㎕의 PCR 반응을 2 만개의 드랍렛으로 쪼개어 증폭시킨 후, 표적 DNA를 계수하는 시스템으로, 드랍렛에서의 표적 DNA의 증폭 여부에 따라 양성 드랍렛 (1)과 음성 드랍렛 (0)으로 디지털 신호처럼 받아들여 계수하고, 프아송 분포를 통해 표적 DNA의 카피수를 계산해 최종적으로 샘플 ㎕ 당 카피수로 결과값을 확인할 수 있고, 희귀 돌연변이 검출, 극소량의 유전자 증폭, 돌연변이 유형을 동시에 확인하고자 하는 경우 등에 사용될 수 있다.
상기 "매스 어레이"는 MALDI-TOF 질량 분석법(MALDI-TOF mass spectrometer)을 이용하여 유전형질분석(genotyping) 등 다양한 유전체 연구에 적용가능한 멀티플렉싱 분석방법으로, 적은 비용으로 다수의 샘플과 타겟을 빠르게 분석하고자 하는 경우 또는 특정 표적에 대해서만 맞춤형(customized) 분석을 하고자 하는 경우 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 PCR 키트는 통상의 기술자에게 프라이머 신장 과정에 사용되는 것을 인지되는 임의의 시약 또는 다른 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단으로부터 7개까지의 염기 위치에 비표준(non-canonical) 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 PCR 키트는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 PCR 키트는 또한 a) 하나 이상의 버퍼; b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약; c) 중합효소 차단 항체; d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및 e) 하나 이상의 주형; 을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 25 내지 100 mM의 KCl; 및 1 내지 15 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물에 관한 것이다.
PCR에 사용되는 중합효소들은 제 기능을 발휘하기 위해 다양한 물질이 혼합된 최적의 반응 버퍼를 사용해야 한다. 반응 버퍼에는 일반적으로 pH 안정화를 위한 요소, 보조인자(cofactor)로서의 금속 이온, 중합효소의 변성을 막기 위한 안정화 요소가 포함되어 있다.
상기 KCl은 효소 안정화에 필요한 요소로서 프라이머가 표적 DNA에 결합(pairing)하는 것을 도와주는 역할을 한다. 본 발명에서는 미스매치에 의한 증폭을 최대로 지연시키면서 매치에 의한 증폭 효율이 감소하지 않는 상태의 높은 양이온 농도를 확인하기 위해 반응 버퍼 내 KCl의 농도를 조절하여 최적의 농도를 도출하였다.
E507K, E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 각각 사용하여 반응 버퍼의 KCl 농도 변화에 따른 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 확인한 결과, 도 14a 내지 14d에 나타난 바와 같이, E507K/R536K/R660V Taq 중합효소는 반응 버퍼에 KCl이 포함되어 있지 않아도 미스매치에 의한 증폭 지연 효과가 우수하였고, E507K/R536K와 E507K/R660V의 경우에는 50mM, 대조군인 E507K의 경우에는 100mM에서 미스매치에 의한 증폭 지연 효과가 우수하였다. 결과적으로, KCl 농도 한계치는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소가 가장 낮고, E507K/R536K와 E507K/R660V의 경우에는 E507K 보다 낮음을 확인할 수 있었다.
추가로, 적정선의 KCl 농도를 도출하기 위해 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하고, 반응 버퍼에서 (NH4)2SO4의 농도를 일정하게 고정한 상태에서 KCl의 농도를 다양하게 변화시켜 증폭을 수행하였다. 증폭 산물을 전기영동으로 확인한 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 적정선의 KCl 농도는 75 mM임을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물의 KCl 농도는 25 내지 100 mM, 바람직하게는 60 내지 90 mM, 더욱 바람직하게는 70 내지 80 mM일 수 있으며, 가장 바람직하게는 75 mM일 수 있다.
KCl이 25 mM 미만으로 포함되는 경우, 일반적인 표적 증폭에는 영향이 없으나, 매치된 프라이머에 의한 증폭과 미스매치된 프라이머에 의한 증폭의 차이가 감소할 수 있고, 100 mM을 초과하여 포함되는 경우, 일반적인 표적 증폭의 효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있다.
PCR 버퍼 조성물에 있어서, 상기 (NH4)2SO4는 효소 활성에 필요한 보조인자로서 Tris와 함께 중합효소의 활성을 높이기 위해 사용된다. 본 발명의 일실시예에서는 상기에서 도출된 결과를 바탕으로, 반응 버퍼 내 KCl의 농도를 75mM로 일정하게 고정하고, (NH4)2SO4의 농도를 2.5 mM 내지 25 mM로 다양하게 변화시킴으로써 적정선의 (NH4)2SO4 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이 2.5 내지 15 mM의 (NH4)2SO4 농도에서 증폭 산물이 확인되었고, 적정선의 (NH4)2SO4 농도는 5 mM임을 확인할 수 있었다.
추가로, (NH4)2SO4의 5 mM 농도 부근(각각 2.5 mM, 5mM 및 10 mM) AS-qPCR을 수행한 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 10 mM에서 Ct 값의 차이가 가장 컸으나, 매치에 의한 증폭에서 Ct가 다소 지연되고 피크가 눕는 현상이 나타남을 확인하고 적정한 (NH4)2SO4의 농도를 5 mM로 결정하였다.
따라서, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물의 (NH4)2SO4 농도는 1 내지 15 mM, 바람직하게는 2.5 내지 8 mM, 더욱 바람직하게는 4 내지 6 mM일 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 mM일 수 있다.
(NH4)2SO4가 1 mM 미만으로 포함되는 경우, 일반적인 표적 증폭에는 영향이 없으나, 매치된 프라이머에 의한 증폭과 미스매치된 프라이머에 의한 증폭의 차이가 감소할 수 있고, 15 mM을 초과하여 포함되는 경우, 일반적인 표적 증폭의 효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명의 최적화된 PCR 버퍼 조성물은 70 내지 80 mM의 KCl 및 4 내지 6 mM의 (NH4)2SO4를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 것일 수 있다.
본 발명의 PCR 버퍼 조성물은 또한 5 내지 80 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 추가로 포함할 수 있다.
TMAC는 일반적으로 미스매치에 의한 증폭을 감소시키거나 혼성화 반응의 충실성(stringency)을 향상시키는데 사용된다. 본 발명의 일실시예에서는 상기에서 도출된 결과를 바탕으로, 반응 버퍼 내 KCl의 농도를 75mM, (NH4)2SO4의 농도를 5 mM로 일정하게 고정하고 TMAC의 농도를 0 내지 80 mM로 다양하게 변화시킴으로써 적정선의 TMAC 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 18a 및 18b에 나타난 바와 같이 E507K/R536K Taq 중합효소는 70 mM, E507K/R536K/R660V Taq 중합효소는 25 mM의 TMAC이 적정선인 것으로 확인되었다. 추가로 TMAC 농도를 25 mM, (NH4)2SO4 농도를 2.5 mM로 일정하게 고정한 후 KCl의 농도를 20, 40, 60 및 80 mM로 각각 변화시켜 증폭을 수행한 결과, 도 19a 및 19b에 나타난 바와 같이 SNP rs1015362 및 rs4911414에 대해 적정선의 KCl 농도는 60 mM인 것으로 확인되었다.
TMAC가 80 mM을 초과하여 포함되는 경우 증폭 효율이 감소하므로 상기 범위 내의 농도로 TMAC를 포함하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물은 5 내지 80 mM의 TMAC를 포함하는 경우, KCl의 농도는 40 내지 90 mM, 바람직하게는 50 내지 80 mM일 수 있고, (NH4)2SO4의 농도는 1 내지 7 mM, 바람직하게는 1.5 내지 6 mM일 수 있다.
TMAC를 포함하는 경우, 본 발명의 최적화된 PCR 버퍼 조성물은 15 내지 70 mM의 TMAC, 50 내지 80 mM의 KCl, 1.5 내지 6 mM의 (NH4)2SO4를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 것일 수 있다.
본 발명의 PCR 버퍼 조성물은 Tris·Cl 및 MgCl2를 추가로 포함할 수 있으며, 추가적으로 Tween 20 및 소혈청알부민(BSA)을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 PCR 버퍼 조성물을 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트를 제공한다.
본 발명의 PCR 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소로서, 다음의 아미노산 치환을 포함하는 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기의 치환; 및
(b) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기의 치환,
(ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 660번째 아미노산 잔기의 치환,
(iii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환, 또는
(iv) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째, 587번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 507번째 아미노산 잔기의 치환은 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되는 것이고, 상기 536번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되는 것이며, 상기 587번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 이소류신(I)으로 치환되는 것이고, 상기 660번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환되는 것일 수 있다.
본 발명의 PCR 키트에 포함되는 DNA 중합효소에 대한 추가의 설명은 전술한 것과 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 PCR 버퍼 조성물을 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트의 기타 구성은 전술한 것과 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또한, 전술한 유전자 변이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물을 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 PCR 버퍼 조성물의 구성을 제외하면, 본 발명의 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법과 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
Taq 중합효소의 돌연변이유발
1-1. 단편 PCR
본 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K"라 함), 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R660V"라 함) 및 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환되고 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K/R660V"라 함)를 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 표 1에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 1(a)에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F1 내지 F5)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 2와 같다.
Figure PCTKR2018006246-appb-T000001
10X pfu 버퍼 (솔젠트) 2.5 ul
dNTP (각 10 mM) 1 ul
F 프라이머 (10 pmol/ul) 1 ul
R 프라이머 (10 pmol/ul) 1 ul
증류수 18 ul
pUC19-Taq (10 ng/ul) 1 ul
Pfu 중합효소 0.5 ul
30 사이클 (Ta=60℃) 25 ul
PCR 산물을 전기영동 상에서 확인해본 결과, 도 1(b)에 나타난 바와 같이 각 단편에 대한 밴드가 확인되어 목적하는 단편이 증폭되었음을 확인하였다.
1-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 1-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 3 및 4와 같다.
R660V 또는 R536K
10X pfu 버퍼 (솔젠트) 5 ul
5X 인핸서 (솔젠트) 10 ul
dNTP (각 10 mM) 1 ul
Eco-F 프라이머 (10 pmol/ul) 2 ul
Xba-R 프라이머 (10 pmol/ul) 2 ul
증류수 27 ul
단편 1 (또는 단편 3) 1 ul
단편 2 (또는 단편 4) 1 ul
Pfu 중합효소 1 ul
40 사이클 (Ta=62℃) 50 ul
R536K/R660V
10X pfu 버퍼 (솔젠트) 5 ul
5X 인핸서 (솔젠트) 10 ul
dNTP (각 10 mM) 1 ul
Eco-F 프라이머 (10 pmol/ul) 2 ul
Xba-R 프라이머 (10 pmol/ul) 2 ul
증류수 26 ul
단편 2 1 ul
단편 3 1 ul
단편 5 1 ul
Pfu 중합효소 1 ul
40 사이클 (Ta=62℃) 50 ul
그 결과, 도 1(c)에 나타난 바와 같이 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소가 증폭되었음을 확인하였다.1-3. 라이게이션
pUC19을 하기 표 5의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고 정제된 DNA를 표 6의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
10X CutSmart 버퍼 (NEB) 2.5 ul
pUC19 (500 ng/ul) 21.5 ul
EcoRI-HF (NEB) 0.5 ul
Xba I (NEB) 0.5 ul
25 ul
10X SAP 버퍼 (로슈) 2 ul
정제된 DNA 17 ul
SAP (로슈) 1 ul
20 ul
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 1-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 7의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 2).
10X CutSmart 버퍼 (NEB) 2 ul
정제된 PCR 산물 17 ul
EcoRI-HF (NEB) 0.5 ul
XbaI (NEB) 0.5 ul
20 ul
표 8의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 원하는 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V")를 수득하였다.
벡터 단독 벡터+인서트
10X 연결효소 버퍼 (솔젠트) 1 ul 1 ul
벡터 1 ul 1 ul
인서트 - 3 ul
증류수 7 ul 4 ul
T4 DNA 연결효소 (솔젠트) 1 ul 1 ul
10 ul 10 ul
[실시예 2]
E507K 변이의 도입
2-1. 단편 PCR
상기 실시예 1에서 제조된 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소 활성을 테스트해 본 결과 활성이 떨어지는 것을 확인하고(데이터 미도시), R536K, R660V, R536K/R660V 각각에 추가로 E507K 변이(서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기를 글루탐산에서 리신으로 치환)를 도입하였으며, 대조군으로 사용하기 위해 야생형 Taq DNA 중합효소(WT)에도 E507K 변이를 도입하였다. E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소의 제조방법은 실시예 1과 동일하다.
표 9에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 3에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F6 내지 F7)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 10과 같다.
프라이머 서열 (5’-3’)
Eco-F GG GGTACC TCA TCA CCC CGG (서열번호 17)
E507K-R CTT GCC GGT CTT TTT CGT CTT GCC GAT (서열번호 23)
E507K-F ATC GGC AAG ACG AAA AAG ACC GGC AAG (서열번호 24)
Xba-R GC TCTAGA CTA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA (서열번호 22)
10X pfu 버퍼 (솔젠트) 2.5 ul
dNTP (각 10 mM) 1 ul
F 프라이머 (10 pmol/ul) 1 ul
R 프라이머 (10 pmol/ul) 1 ul
증류수 18 ul
주형 플라스미드 (10 ng/ul) 1 ul
Pfu 중합효소 0.5 ul
30 사이클 (Ta=60℃) 25 ul
* 주형 플라스미드 : pUC19-Taq (WT), pUC19-Taq (R536K), pUC19-Taq (R660V), pUC19-Taq (R536K/R660V)2-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 2-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 11과 같다.
10X pfu 버퍼 (솔젠트) 5 ul
5X 인핸서 (솔젠트) 10 ul
dNTP (각 10 mM) 1 ul
Eco-F 프라이머 (10 pmol/ul) 2 ul
Xba-R 프라이머 (10 pmol/ul) 2 ul
증류수 27 ul
단편 6 1 ul
단편 7 1 ul
Pfu 중합효소 1 ul
40 사이클 (Ta=62℃) 50 ul
2-3. 라이게이션pUC19을 표 5의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고, 정제된 DNA를 표 6의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 2-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 7의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 4).
표 8의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α 또는 DH10β에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("E507K/R536K", "E507K/R660V" 및 "E507K/R536K/R660V")를 수득하였다.
[실시예 3]
본 발명의 DNA 중합효소를 이용한 qPCR 수행
상기 실시예 2에서 수득한 "E507K/R536K", "E507K/R660V" 및 "E507K/R536K/R660V" 변이를 각각 포함하는 Taq 중합효소를 사용하여 SNP를 포함하는 주형에 대해 미스매치된 프라이머를 연장하기 위한 능력이 감소되었는지 여부를 확인하였다. 대조군으로는 E507K 변이를 포함하는 "E507K" Taq 중합효소를 사용하였다.
본 실시예에서 사용한 SNP를 포함하는 주형은 rs1408799, rs1015362 및 rs4911414이며, 각 주형의 유전자형과 이들 각각에 대한 특이적 프라이머(IDT, 미국)의 서열 정보는 하기 표 12 및 13에 나타낸 바와 같다.
주형의 유전자형
rs1408799 TT
rs1015362 CC
rs4911414 GG
프라이머 이름 서열 (5’ - 3’)
rs1408799 정방햑 CCAGTGTTAGGTTATTTCTAACTTG (서열번호 25)
역방향_T GCTCGGAGCACATGGTCAA (서열번호 26)
역방향_C GCTCGGAGCACATGGTCAG (서열번호 27)
rs1015362 정방향 TGAAGAGCAGGAAAGTTCTTCA (서열번호 28)
역방향_C ACTGTGTGTCTGAAACAGTG (서열번호 29)
역방향_T ACTGTGTGTCTGAAACAGTA (서열번호 30)
rs4911414 정방향_G GTAAGTCTTTGCTGAGAAATTCATTG (서열번호 31)
정방향_T GTAAGTCTTTGCTGAGAAATTCATTT (서열번호 32)
역방향 AGTATCCAGGGTTAATGTGAAAG (서열번호 33)
qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 하기 표 14과 같다.
95℃ 5분
95℃ 20초 50 사이클
60℃ 30초
72℃ 30초
72℃ 3분
프로브는 하기 표 15와 같이 이중으로 표지하였다.
프로프 이름 서열 (5’ - 3’) 5’ 형광단(Fluorophore) 3’ 소광물질(quencher)
1408799-FAM AGATATTTGTAAGGTATTCTGGCCT(서열번호 34) FAM Black Hole Quencher 1
1015362-HEX TGCTGAACAAATAGTCCCGACCAG(서열번호 35) HEX Black Hole Quencher 1
4911141-Texas Red TTTCTCTAGTTGCCTTTAAGATTT(서열번호 36) Texas Red Black Hole Quencher 2
Noble bio로부터 구입한 구강 상피세포 채취 키트를 이용하여 구강 상피세포를 채취한 다음 500 ㎕의 용해액(lysis solution)에 용해시켜 12,000Хg로 3분동안 원심분리하였다. 상층액은 새로운 튜브로 옮겨 실험시 1 ㎕씩 사용하였다(도 5).반응 조건은 표 16, 반응 버퍼의 조성은 표 17과 같다.
5X 반응버퍼 4 ul
5M 베타인 2 ul
dNTP (각 10 mM) 0.5 ul
정방향 프라이머 (2 uM) 1 ul
역방향 프라이머 (2 uM) 1 ul
뉴클레아제 무첨가 증류수 8 ul
채취된 주형 1 ul
Taq 중합효소 (2 U/ul) 0.5 ul
이중 표지된 프로브 (4 uM) 2 ul
20 ul
반응 버퍼 (1X)
50 mM Tris·Cl (pH 8.8)
2.5 mM MgCl2
50 mM KCl
5 mM (NH4)2SO4
0.1 % Tween 20
0.01 % BSA
상기 표 13의 특이적인 프라이머를 제외한 나머지 반응액은 동일하게 하여 2개의 튜브에 준비하고, 각 대립 유전자 특이적 프라이머를 첨가하여 qPCR을 수행하였다. 이때 각 튜브에서 검출되는 형광신호를 병합하여 AB 7500 소프트웨어 (v2.0.6) 상에서 계산되어 도출되는 한계(threshold) 형광값에 도달하는 사이클 (Ct) 값의 차이를 분석하였다. 미스매치된 프라이머에 의한 증폭에서의 Ct값이 지연될수록, 즉 유전자 변이 특이성 또는 대립 유전자 특이성이 좋은 것으로 판단한다.rs1408799, rs1015362 및 rs4911414에 대한 AS-qPCR 결과, 도 6 내지 8에 나타난 바와 같이 대조군인 E507K에 비해 E507K/R536K, E507K/R660V, 또는 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Tap 중합효소의 경우 미스매치된 프라이머에 의한 증폭이 지연되는 것을 확인할 수 있으며, 그 효과는 E507K/R536K/R660V의 돌연변이에서 가장 현저하게 나타났다.
본 발명의 E507K/R536K, E507K/R660V, 또는 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Tap DNA 중합효소는 E507K 변이를 포함하는 Taq 중합효소와 비교하여 우수한 미스매치 신장 선택성을 가짐을 확인하였다. 따라서, 상기 3종의 Taq DNA 중합효소는 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
[실시예 4]
R587I 변이의 도입
4-1. 단편 PCR
실시예 2에서 제조된 "E507K/R536K/R660V" 변이가 도입된 Taq 클론에 R587I 변이(서열번호 1의 아미노산 서열에서 587번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 이소류신으로 치환)를 추가로 도입하기 위해 하기 표 18에 기재된 프라이머를 이용하여 도 9(a)에 나타난 바와 같이 2개의 단편을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 19와 같다.
프라이머 서열 (5’-3’)
Kpn-F TCC ACC CCG AGG GGT ACC TCA TCA CCC CGG CCT GGC (서열번호 39)
R587I-R CCC AAG CGG GGT GAT GAC GGG GAT GTT (서열번호 40)
R587I-F AAC ATC CCC GTC ATC ACC CCG CTT GGG (서열번호 41)
Xba-R CTG CAG GTC GAC TCT AGA CTA TCA CTC CTT GGC GGA G(서열번호 42)
10X pfu 버퍼 (솔젠트) 5 ul
dNTP (각 10 mM) 2 ul
F 프라이머 (10 pmol/ul) 2 ul
R 프라이머 (10 pmol/ul) 2 ul
증류수 36 ul
Taq 플라스미드 (E507K, R536K, R660V) (10 ng/ul) 2 ul
Pfu 중합효소 1 ul
35 사이클 (Ta=60℃) 50 ul
PCR 산물을 전기영동 상에서 확인해본 결과, 도 9(b)에 나타난 바와 같이 각 단편에 대한 밴드가 확인되어 목적하는 단편이 증폭되었음을 확인하였다.4-2. 인퓨젼 클로닝(In-fusion cloning)
Taq 플라스미드 벡터(E507K/R536K/R660V)는 표 20의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 KpnI/XbaI로 분해한 다음 정제하여(용출: 25 ul) 분해된 선형의 벡터로 준비하였다. 그런 다음 표 21의 조건으로 인퓨젼 클로닝 반응을 37℃에서 15분 동안 수행한 후 E. coli DH5α 또는 DH10β에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 R587I 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("E507K/R536K/R587I/R660V")를 수득하였다.
10X CutSmart 벡터 (NEB) 2.5 ul
Taq 플라스미드 (E507K/R536K/R660V) (200 ng/ul) 21.5 ul
Kpn I-HF (NEB) 0.5 ul
Xba I (NEB) 0.5 ul
25 ul
5X EZ-퓨젼 믹스 (엔지노믹스) 2 ul
Kpn I, Xba I로 분해된 벡터 (50 ng/ul) 1 ul
F1 단편 (83 ng/ul) 1 ul
F2 단편 (50 ng/ul) 1 ul
증류수 5 ul
10 ul
[실시예 5] "E507K/R536K/R587I/R660V" Taq 중합효소를 이용한 qPCR 수행
5-1. KRAS 유전자의 Q61H 변이 구분
상기 실시예 4에서 수득한 "E507K/R536K/R587I/R660V" 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하여 KRAS 유전자에서 Q61H의 SNP를 포함하는 주형에 대해 미스매치된 프라이머를 연장하기 위한 능력이 감소되었는지 여부를 확인하였다. 대조군으로는 "E507K/R536K/R660V" 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
상기 SNP를 포함하는 주형은 HepG2 간암 세포주로부터 수득한 gDNA (104 copies, 33ng/rxn)이며, 통상적인 DNA 추출방법을 통해 수득하였다. 검출 표적 부위가 모두 NCBI 레퍼런스 서열(NG_007524.1)과 일치하는 것을 확인하고 야생형(WT)으로 사용하였다.
상기 주형에 대한 특이적 프라이머의 서열 정보는 하기 표 22에 나타낸 바와 같다.
프라이머 이름 서열 (5' - 3') Tm(℃)
KRAS Q61H 정방향_Q(24 mer) GAT ATT CTC GAC ACA GCA GGT CAA (서열번호 43) 64.2
정방향_H(24mer) GAT ATT CTC GAC ACA GCA GGT CAC (서열번호 44) 64.4
역방향 ACA AAG AAA GCC CTC CCC AG (서열번호 45) 64.2
qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 상기 실시예 3의 표 14와 동일하다.프로브는 하기 표 23과 같이 표지하였다.
프로브 이름 서열 (5' - 3') Tm (℃)
Q61H FAM TGC AAT GAG GGA CCA GTA CAT GAG G(서열번호 46) 67.6
반응 조건은 상기 실시예 3의 표 16과 동일하고, 반응 버퍼의 조성은 하기 표 24와 같다.
반응 버퍼 (1X)
50 mM Tris·Cl (pH 8.8)
2.5 mM MgCl2
60 mM KCl
2.5 mM (NH4)2SO4
25 mM TMAC
0.1 % Tween 20
0.01 % BSA
상기 표 22의 특이적인 프라이머를 제외한 나머지 반응액은 동일하게 하여 2개의 튜브에 준비하고, 각 대립 유전자 특이적 프라이머를 첨가하여 qPCR을 수행하였다. 이때 각 튜브에서 검출되는 형광신호를 병합하여 AB 7500 소프트웨어 (v2.0.6) 상에서 계산되어 도출되는 한계(threshold) 형광값에 도달하는 사이클 (Ct) 값의 차이를 분석하였다. 미스매치된 프라이머에 의한 증폭에서의 Ct값이 지연될수록, 즉 유전자 변이 특이성 또는 대립 유전자 특이성이 좋은 것으로 판단한다.AS-qPCR 결과, 도 10(a) 및 (b)에 나타난 바와 같이 대조군인 E507K/R536K/R660V에 비해 E507K/R536K/R587I/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소는 ΔCt가 5까지 증가하여 미스매치된 프라이머에 의한 증폭이 지연되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 추가로, 상기 표 22의 24mer 길이의 프라이머를 18mer로 짧게 제작한 하기 표 25의 프라이머를 사용하여 다시 한번 상기 실험을 반복하여 실시하였다. 하기 표 26의 반응 버퍼 조성을 사용한 것을 제외하면 모든 조건은 상기 24mer 길이의 프라이머를 사용한 실험과 동일하다.
프라이머 이름 서열 (5' - 3') Tm(℃)
KRAS Q61H 정방향_Q(18 mer) CTC GAC ACA GCA GGT CAA(서열번호 47) 61.4
정방향_H(18mer) CTC GAC ACA GCA GGT CAC(서열번호 48) 61.8
역방향 ACA AAG AAA GCC CTC CCC AG(서열번호 49) 64.2
반응 버퍼 (1X)
50 mM Tris·Cl (pH 8.8)
2.5 mM MgCl2
15 mM (NH4)2SO4
0.1 % Tween 20
0.01 % BSA
그 결과, 도 10(c) 및 10(d)에 나타난 바와 같이 대조군인 E507K/R536K/R660V에 비해 E507K/R536K/R587I/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소는 미스매치된 프라이머에 의한 증폭이 지연되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, R587I가 도입된 중합효소의 ΔCt가 더 극명하게 증가하였다.5-2. KRAS 유전자의 G13D 변이 구분
상기 실시예 4에서 수득한 "E507K/R536K/R587I/R660V" 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하여 KRAS 유전자에서 G13D의 SNP를 포함하는 주형에 대해 미스매치된 프라이머를 연장하기 위한 능력이 감소되었는지 여부를 확인하였다. 대조군으로는 "E507K/R536K/R660V" 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
상기 SNP를 포함하는 주형은 HepG2 간암 세포주로부터 수득한 gDNA (104 copies, 33ng/rxn)이며, 통상적인 DNA 추출방법을 통해 수득하였다. 검출 표적 부위가 모두 NCBI 레퍼런스 서열(NG_007524.1)과 일치하는 것을 확인하고 야생형(WT)으로 사용하였다.
상기 주형에 대한 특이적 프라이머의 서열 정보는 하기 표 27에 나타낸 바와 같다.
프라이머 이름 서열 (5' - 3') Tm (℃)
KRAS G13D 정방향 ATA AGG CCT GCT GAA AAT GAC (서열번호 50) 61
역방향_G (17mer) GGC ACT CTT GCC TAC GC(서열번호 51) 62.4
역방향_D (17mer) GGC ACT CTT GCC TAC GT(서열번호 52) 61.2
qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 상기 실시예 3의 표 14와 동일하다.프로브는 하기 표 28과 같이 표지하였다.
프로브 이름 서열 (5' - 3') Tm (℃)
G1213_R FAM AGC TCC AAC TAC CAC AAG TTT ATA TTC AGT (서열번호 53) 66.2
반응 조건은 상기 실시예 3의 표 16과 동일하고, 반응 버퍼의 조성은 상기 실시예 5-1의 표 24와 동일하다.상기 표 27의 특이적인 프라이머를 제외한 나머지 반응액은 동일하게 하여 2개의 튜브에 준비하고, 각 대립 유전자 특이적 프라이머를 첨가하여 qPCR을 수행하였다. 이때 각 튜브에서 검출되는 형광신호를 병합하여 AB 7500 소프트웨어 (v2.0.6) 상에서 계산되어 도출되는 한계(threshold) 형광값에 도달하는 사이클 (Ct) 값의 차이를 분석하였다. 미스매치된 프라이머에 의한 증폭에서의 Ct값이 지연될수록, 즉 유전자 변이 특이성 또는 대립 유전자 특이성이 좋은 것으로 판단한다.
AS-qPCR 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 대조군인 E507K/R536K/R660V에 비해 E507K/R536K/R587I/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소는 미스매치된 프라이머에 의한 증폭이 지연되는 것을 확인할 수 있었다.
5-3. KRAS 유전자의 G12S 변이 구분
상기 실시예 4에서 수득한 "E507K/R536K/R587I/R660V" 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하여 KRAS 유전자에서 G13S의 SNP를 포함하는 주형에 대해 미스매치된 프라이머를 연장하기 위한 능력이 감소되었는지 여부를 확인하였다. 대조군으로는 "E507K/R536K/R660V" 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
상기 SNP를 포함하는 주형은 HepG2 간암 세포주로부터 수득한 gDNA (104 copies, 33ng/rxn)이며, 통상적인 DNA 추출방법을 통해 수득하였다. 검출 표적 부위가 모두 NCBI 레퍼런스 서열(NG_007524.1)과 일치하는 것을 확인하고 야생형(WT)으로 사용하였다.
상기 주형에 대한 특이적 프라이머의 서열 정보는 하기 표 29에 나타낸 바와 같다.
프라이머 이름 서열 (5' - 3') Tm (℃)
KRAS G12S 정방향_G (23mer) TAA ACT TGT GGT AGT TGG AGC TG(서열번호 54) 62.6
정방향_S (23mer) TAA ACT TGT GGT AGT TGG AGC TA (서열번호 55) 61.6
역방향 CAT ATT CGT CCA CAA AAT GAT TCT GAA T (서열번호 56) 63
qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 상기 실시예 3의 표 14와 동일하다.프로브는 하기 표 30과 같이 표지하였다.
프로브 이름 서열 (5' - 3') Tm (℃)
G1213_F FAM AGC TGT ATC GTC AAG GCA CTC TTG C (서열번호 57) 68.2
반응 조건은 상기 실시예 3의 표 16과 동일하고, 반응 버퍼의 조성은 상기 실시예 5-1의 표 24와 동일하다.상기 표 29의 특이적인 프라이머를 제외한 나머지 반응액은 동일하게 하여 2개의 튜브에 준비하고, 각 대립 유전자 특이적 프라이머를 첨가하여 qPCR을 수행하였다. 이때 각 튜브에서 검출되는 형광신호를 병합하여 AB 7500 소프트웨어 (v2.0.6) 상에서 계산되어 도출되는 한계(threshold) 형광값에 도달하는 사이클 (Ct) 값의 차이를 분석하였다. 미스매치된 프라이머에 의한 증폭에서의 Ct값이 지연될수록, 즉 유전자 변이 특이성 또는 대립 유전자 특이성이 좋은 것으로 판단한다.
AS-qPCR 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 대조군인 E507K/R536K/R660V에 비해 E507K/R536K/R587I/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소는 미스매치된 프라이머에 의한 증폭이 지연되는 것을 확인할 수 있었다.
5-4. EGFR 유전자의 L858R 변이 구분
상기 실시예 4에서 수득한 "E507K/R536K/R587I/R660V" 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하여 EGFR 유전자에서 L858R의 SNP를 포함하는 주형에 대해 미스매치된 프라이머를 연장하기 위한 능력이 감소되었는지 여부를 확인하였다. 대조군으로는 "E507K/R536K/R660V" 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였다.
상기 SNP를 포함하는 주형은 HepG2 간암 세포주로부터 수득한 gDNA (104 copies, 33ng/rxn)이며, 통상적인 DNA 추출방법을 통해 수득하였다. 검출 표적 부위가 모두 NCBI 레퍼런스 서열(NG_007726.3)과 일치하는 것을 확인하고 야생형(WT)으로 사용하였다.
상기 주형에 대한 특이적 프라이머의 서열 정보는 하기 표 31에 나타낸 바와 같다.
프라이머 이름 서열 (5' - 3') Tm (℃)
EGFR L858R 정방향 ACC TGG CAG CCA GGA ACG TA(서열번호 58) 67.8
역방향_L GCA CCC AGC AGT TTG GCC A(서열번호 59) 68.2
역방향_R GCA CCC AGC AGT TTG GCC C(서열번호 60) 67.7
qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 상기 실시예 3의 표 14와 동일하다.프로브는 하기 표 32와 같이 이중으로 표지하였다.
프로브 이름 서열 (5' - 3') Tm (℃)
L858R FAM_R CAG CAT GTC AAG ATC ACA GAT TTT GGG C(서열번호 61) 67.8
반응 조건은 상기 실시예 3의 표 16과 동일하고, 반응 버퍼의 조성은 상기 실시예 5-1의 표 24와 동일하다.상기 표 31의 특이적인 프라이머를 제외한 나머지 반응액은 동일하게 하여 2개의 튜브에 준비하고, 각 대립 유전자 특이적 프라이머를 첨가하여 qPCR을 수행하였다. 이때 각 튜브에서 검출되는 형광신호를 병합하여 AB 7500 소프트웨어 (v2.0.6) 상에서 계산되어 도출되는 한계(threshold) 형광값에 도달하는 사이클 (Ct) 값의 차이를 분석하였다. 미스매치된 프라이머에 의한 증폭에서의 Ct값이 지연될수록, 즉 유전자 변이 특이성 또는 대립 유전자 특이성이 좋은 것으로 판단한다.
AS-qPCR 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 대조군인 E507K/R536K/R660V에 비해 E507K/R536K/R587I/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소는 미스매치된 프라이머에 의한 증폭이 지연되는 것을 확인할 수 있었다.
이상과 같이, 본 발명의 E507K/R536K/R587I/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소는 일부의 경우 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소에 비해 우수한 미스매치 신장 선택성을 가짐을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 E507K/R536K/R587I/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소 또한 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
[실시예 6]
반응 버퍼의 KCl 농도 최적화
본 실시예에서는 미스매치에 의한 증폭을 최대로 지연시키면서 매치에 의한 증폭 효율이 감소하지 않는 상태의 높은 양이온 농도를 찾기 위해, PCR 반응 버퍼 내에서 KCl의 농도를 조절하여 최적의 KCl 농도를 확인하였다.
실시예 2에서 수득한 "E507K/R536K", "E507K/R660V" 및 "E507K/R536K/R660V" 변이를 각각 포함하는 Taq 중합효소를 사용하였고, E507K 변이를 포함하는 Taq 중합효소와 KCl 농도 한계치를 비교하였다.
SNP를 포함하는 주형은 rs1408799를 사용하였고, 주형의 유전자형은 TT이며, 프라이머는 표 2에 기재된 rs1408799 프라이머를 사용하였다. qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 표 14의 조건으로 수행하였고, 이중 표지된 프로브는 표 15의 1408799-FAM, 반응 조건은 표 33, 반응 버퍼의 조성은 표 34와 같다.
5X 반응 버퍼 4 ul
dNTP (각 10 mM) 0.5 ul
정방향 프라이머 (2 uM) 1 ul
역방향 프라이머 (2 uM) 1 ul
뉴클레아제 무첨가 증류수 10 ul
채취된 주형 (TT) 1 ul
Taq 중합효소 (2 U/ul) 0.5 ul
이중 표지된 프로브 (4 uM) 2 ul
20 ul
반응 버퍼 (1X)
50 mM Tris·Cl (pH 8.8)
2.5 mM MgCl2
x mM KCl
2.5 mM (NH4)2SO4
0.1 % Tween 20
0.01 % BSA
그 결과, 도 14a 내지 14d에 나타난 바와 같이 KCl 농도 한계치는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소가 가장 낮고, E507K/R536K와 E507K/R660V의 경우에는 E507K 보다 낮음을 확인하였다.상기 결과를 바탕으로, 적정선의 KCl 농도를 결정하기 위해 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여 추가 실험을 실시하였다. 프라이머는 표 13에 기재된 rs1408799-T 특이적 프라이머를 사용하였고, qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 표 14의 조건으로 35 사이클을 수행하였으며, 반응 조건은 표 35와 같다.
5X 반응 버퍼 4 ul
dNTP (각 10 mM) 0.5 ul
정방향 프라이머 (2 uM) 1 ul
역방향 프라이머 (2 uM) 1 ul
뉴클레아제 무첨가 증류수 12 ul
채취된 주형 (TT) 1 ul
E507K/R536K/R660V (2 U/ul) 0.5 ul
20 ul
대조군의 반응 버퍼 조성은 표 36과 같으며, 실험군의 반응 버퍼 조성은 표 34와 같이 (NH4)2SO4의 농도를 2.5 mM로 일정하게 고정하고 KCl의 농도를 다양하게 변화시켰다.
대조군 버퍼 (1X)
50 mM Tris·Cl (pH 8.8)
1M 베타인
2.5 mM MgCl2
50 mM KCl
2.5 mM (NH4)2SO4
0.1 % Tween 20
0.01 % BSA
상기의 조건으로 증폭을 수행한 후 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 미스매치에 의한 증폭을 최대로 지연시키면서 매치에 의한 증폭 효율이 감소하지 않는 상태의 적정한 KCl의 농도는 75 mM임을 확인하였다.
[실시예 7]
반응 버퍼의 (NH4)2SO4 농도 최적화
본 실시예에서는 상기 실시예 4의 결과를 바탕으로, 반응 버퍼 내 KCl 농도를 75 mM로 일정하게 고정한 후, (NH4)2SO4의 농도를 다양하게 변화시켜 최적의 (NH4)2SO4 농도를 확인하였다. 프라이머는 표 13에 기재된 rs1408799-T 특이적 프라이머를 사용하였고, qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 표 14의 조건으로 35 사이클을 수행하였으며, 반응 조건은 표 35, 대조군 반응 버퍼의 조성은 표 36과 같다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이 적정한 (NH4)2SO4의 농도는 5 mM임을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로, 반응 버퍼 내 KCl 농도를 75 mM로 일정하게 고정한 후 (NH4)2SO4의 농도를 5 mM 부근(각각 2.5 mM, 5 mM 및 10 mM)으로 설정하고 미스매치에 의한 증폭 지연 효과를 추가 확인하였다.
프라이머는 표 13에 기재된 rs1408799 프라이머를 사용하였고, 이중 표지된 프로브는 표 15의 1408799-FAM, 반응 조건은 하기 표 37과 같다.
5X 반응 버퍼 4 ul
dNTP (각 10 mM) 0.5 ul
정방향 프라이머 (2 uM) 1 ul
역방향 프라이머 (2 uM) 1 ul
뉴클레아제 무첨가 증류수 10 ul
채취된 주형 (TT) 1 ul
E507K/R536K/R660V (2 U/ul) 0.5 ul
이중 표지된 프로브 (4 uM) 2 ul
20 ul
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이 (NH4)2SO4의 농도가 10 mM일 때 Ct 값의 차이가 가장 컸으나, 매치에 의한 증폭에서 Ct가 다소 지연되고 피크가 눕는 현상이 나타남을 확인하고 적정한 (NH4)2SO4의 농도를 5 mM로 결정하였다.실시예 6 및 7의 결과를 종합하면, 최적의 반응 버퍼의 조성은 50 mM Tris·Cl, 2.5mM MgCl2, 75 mM KCl, 5 mM (NH4)2SO4, 0.1% Tween 20 및 0.01% BSA를 포함하는 것임을 확인하였다.
[실시예 8]
반응 버퍼의 TMAC 추가 및 농도 최적화
본 실시예에서는 반응 버퍼에 TMAC을 추가하여 최적의 농도를 확인하였다. 상기 실시예 6 및 7의 결과를 바탕으로, 반응 버퍼 내 KCl의 농도는 75 mM, (NH4)2SO4의 농도는 5 mM로 일정하게 고정한 후 TMAC을 다양한 농도로 변화시켜 적정선의 TMAC 농도를 도출하였다.
E507K/R536K 또는 E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하였고, SNP를 포함하는 주형은 rs1408799를 사용하였으며, 주형의 유전자형은 TT이고, 프라이머는 표 13에 기재된 rs1408799 프라이머를 사용하였다. qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 표 14의 조건으로 수행하였고, 이중 표지된 프로브는 표 15의 1408799-FAM, 반응 조건은 표 37과 같다.
실험 결과, 도 18a 및 18b에 나타난 바와 같이 E507K/R536K Taq 중합효소는 60 mM, E507K/R536K/R660V Taq 중합효소는 25 mM의 TMAC 농도가 적정선인 것으로 확인되었으며, TMAC의 농도가 너무 높으면 증폭 효율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 9]
반응 버퍼의 KCl, (NH4)2SO4 및 TMAC 농도 최적화
본 실시예에서는 상기 실시예 8에서 확인된 결과를 바탕으로, E507K/R536K/R660V Taq 중합효소를 사용하여 반응 버퍼 내 최적의 KCl, (NH4)2SO4 및 TMAC 농도를 확인하였다.
구체적으로, TMAC의 농도는 25 mM, (NH4)2SO4의 농도는 2.5 mM로 일정하게 고정한 다음 KCl의 농도를 20, 40, 60 및 80 mM로 각각 변화시켰다. rs1015362 및 rs4911414의 2개의 SNP에 대해 실험을 수행하였고, 주형의 유전자형은 표 12에 기재된 바와 같고, 프라이머는 표 13에 기재된 rs1015362 및 rs4911414 프라이머를 사용하였으며, qPCR 조건(Applied Biosystems 7500 Fast)은 표 14의 조건으로 수행하였고, 이중 표지된 프로브는 표 15의 1408799-FAM, 반응 조건은 표 37과 같다.
실험 결과, 도 19a 및 19b에 나타난 바와 같이 2개의 SNP에 대해 60 mM 농도의 KCl이 적정선이고, 80 mM에서는 증폭 효율이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.
이상의 결과를 통해, 반응 버퍼 내 최적의 KCl 농도는 60 mM, (NH4)2SO4 농도는 2.5 mM, TMAC 농도는 25 mM임을 확인하였고, 보다 세부적으로 E507K/R536K 중합효소의 경우 75 mM KCl, 5 mM (NH4)2SO4 및 60 mM의 TMAC를 사용하는 것이 가장 효과적이며, E507K/R536K/R660V 중합효소의 경우 60 mM KCl, 2.5 mM (NH4)2SO4 및 25 mM의 TMAC을 사용하는 것이 가장 효과적임을 확인하였다.
본 발명의 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소는 종래의 Taq 중합효소와 비교하여 더 높은 미스매치 대비 매치 신장 선택성을 가지므로, 어떠한 기질 변형없이도 신뢰성 있는 유전자 변이 특이적 증폭을 가능하게 한다. 본 발명은 또한, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소가 제 기능을 효과적으로 발휘할 수 있는 최적의 PCR 버퍼 조성물을 제공하며, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소와 함께 사용하여 상기 DNA 중합효소의 활성을 현저하게 향상시킴으로써 신뢰성 있는 유전자 변이-특이적 증폭을 가능하게 한다. 아울러, 본 발명의 PCR 버퍼 조성물 및/또는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 포함하는 키트는 유전자 변이 또는 SNP를 효과적으로 검출할 수 있으므로, 질병의 의학적 진단 및 재조합 DNA 연구에 유용하게 활용될 수 있다.

Claims (32)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소로서,
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기의 치환; 및
    (b) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기의 치환,
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 660번째 아미노산 잔기의 치환,
    (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환, 또는
    (iv) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째, 587번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환;
    을 포함하는 DNA 중합효소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 507번째 아미노산 잔기의 치환은 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되는 것이고, 상기 536번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되는 것이며, 상기 587번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 이소류신(I)으로 치환되는 것이고, 상기 660번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환되는 것을 특징으로 하는 DNA 중합효소.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 매치된 프라이머와 미스매치된 프라이머를 구별하고, 상기 매치된 프라이머와 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단에 비표준 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 중합효소.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 매치된 프라이머를 포함하는 표적서열의 증폭이 미스매치된 프라이머를 포함하는 표적서열의 증폭보다 낮은 Ct값을 나타내는 것을 특징으로 하는 DNA 중합효소.
  5. 제2항의 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열.
  6. 제5항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  7. 제6항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  8. 제1항 또는 제2항의 DNA 중합효소를
    a) 하나 이상의 주형;
    b) 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다; 및
    c) 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 접촉시키는 것을 포함하고,
    상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되고, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단으로부터 7개까지의 염기 위치에 비표준(non-canonical) 뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법은 이중가닥 특이적 염료를 이용한 용융 온도 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 방법은 실시간 PCR, 표준 PCR 후 아가로스 겔에서의 분석, 실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭, 테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR 또는 등온 증폭에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항의 DNA 중합효소를 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 조성물.
  12. 제11항의 조성물을 포함하는 PCR 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 PCR 키트는 캐스트 PCR(Competitive allele-specific TaqMan PCR), 드랍렛 디지털 PCR(Droplet digital PCR) 또는 매스 어레이(MassARRAY)에 사용되는 것을 특징으로 하는 PCR 키트.
  14. 제12항에 있어서, 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단으로부터 7개까지의 염기 위치에 비표준(non-canonical) 뉴클레오타이드를 포함하는 PCR 키트.
  15. 제12항에 있어서, 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 키트.
  16. 제12항에 있어서,
    a) 하나 이상의 버퍼;
    b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약;
    c) 중합효소 차단 항체;
    d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및
    e) 하나 이상의 주형; 을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 키트.
  17. 25 내지 100 mM의 KCl; 및
    1 내지 15 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인, 유전자 변이적 증폭 효율이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 KCl의 농도는 60 내지 90 mM인 것을 특징으로 하는 유전자 변이적 증폭 효율이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 2.5 내지 8 mM인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 상기 KCl의 농도는 70 내지 80 mM이고, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 4 내지 6 mM 인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 5 내지 80 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 KCl의 농도는 40 내지 90 mM인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 1 내지 7 mM인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  24. 제21항에 있어서, 상기 TMAC의 농도는 15 내지 70 mM이고, 상기 KCl의 농도는 50 내지 80 mM이며, 상기 (NH4)2SO4의 농도는 1.5 내지 6 mM인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  25. 제17항에 있어서, 상기 PCR 버퍼 조성물은 Tris·Cl 및 MgCl2를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소의 활성 증가용 PCR 버퍼 조성물.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항의 PCR 버퍼 조성물을 포함하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트.
  27. 제26항에서, 상기 PCR 키트는 다음의 DNA 중합효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트:
    서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소로서,
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기의 치환; 및
    (b) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기의 치환,
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 660번째 아미노산 잔기의 치환,
    (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환, 또는
    (iv) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째, 587번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 DNA 중합효소.
  28. 제27항에 있어서, 상기 507번째 아미노산 잔기의 치환은 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되는 것이고, 상기 536번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되는 것이며, 상기 587번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 이소류신(I)으로 치환되는 것이고, 상기 660번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환되는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트.
  29. 제26항에 있어서,
    a) 뉴클레오사이드 트리포스페이트;
    b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약;
    c) 중합효소 차단 항체;
    d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및
    e) 하나 이상의 주형; 을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 또는 SNP 검출용 PCR 키트.
  30. 제26항의 PCR 키트를 이용하여 하나 이상의 주형에서 하나 이상의 유전자 변이 또는 SNP를 생체 외(in vitro)에서 검출하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 PCR 키트는 다음의 DNA 중합효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Taq 중합효소를 갖는 DNA 중합효소로서,
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기의 치환; 및
    (b) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기의 치환,
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 660번째 아미노산 잔기의 치환,
    (iii) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환, 또는
    (iv) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째, 587번째 및 660번째 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 DNA 중합효소.
  32. 제31항에 있어서, 상기 507번째 아미노산 잔기의 치환은 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되는 것이고, 상기 536번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되는 것이며, 상기 587번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 이소류신(I)으로 치환되는 것이고, 상기 660번째 아미노산 잔기의 치환은 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
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