WO2019013137A1 - 癌の治療組成物 - Google Patents

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WO2019013137A1
WO2019013137A1 PCT/JP2018/025774 JP2018025774W WO2019013137A1 WO 2019013137 A1 WO2019013137 A1 WO 2019013137A1 JP 2018025774 W JP2018025774 W JP 2018025774W WO 2019013137 A1 WO2019013137 A1 WO 2019013137A1
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cancer
metastasis
protease
virus
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PCT/JP2018/025774
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French (fr)
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雄也 田中
幸仁 荒木
塩谷　彰浩
泰次 上田
豊隆 森
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株式会社Ｉｄファーマ
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    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the treatment of cancer, in particular via the reduction effect of cancer at a site far from the administered cancer (eg cancer transplanted on the other side of the body) and the lymphatic system leading to cancer tumors.
  • the present invention relates to a therapeutic composition for cancer which has an effect of suppressing the metastasis (lymph node metastasis) of
  • metastasis In advanced stage cancer, so-called metastasis, in which cancer cells settle from the primary site, colonize organ tissues, and grow is seen. Not only cancer types, but metastasis is one of the most important factors that determine the prognosis of cancer, and the development of a technology to prevent this in advance or to detect it early and to suppress the spread of growth at the metastasis site It is an urgent issue to improve the prognosis of
  • HNSCC head and neck squamous cell carcinoma
  • HNSCC Head and neck squamous cell carcinoma
  • the standard treatment option for HNSCC is surgery and / or radiation therapy, with or without chemotherapy.
  • the 5-year survival rates for HNSCC patients have not improved significantly over the past few decades.
  • HNSCC has a high rate of lymph node metastasis (LNM) with lymphoid metastasis even in early T phase, and it is well known that LNM control is one of the most important prognostic factors in HNSCC treatment (2).
  • LNM lymph node metastasis
  • CT computed tomography
  • MRI magnetic resonance imaging
  • ultrasound ultrasound
  • PET current imaging techniques, including positron emission tomography
  • Sentinel lymph node navigation surgery is highly useful for head and neck surgeons to avoid unnecessary neck dissection and to reduce the postoperative recurrence rate in late lymph nodes in cN0 cases of HNSCC
  • SNNS using real-time near-infrared imaging with indocyanine green (ICG) is common, but the main drawback is the rapid migration of ICG through the lymphatics, and the detection of downstream lymph nodes with a diagnostic time window
  • ICG-phytate colloid mixture can extend the diagnostic time window, prevent downstream lymph node detection and improve detection accuracy of true sentinel lymph nodes (SLN) (8) .
  • the problem to be solved by the present invention is to control cancer which becomes difficult to cure as the stage becomes high.
  • metastasis in which cancer cells settle from the primary site, colonize organ tissues, and grow is seen.
  • Metastasis is one of the most important factors that determine the prognosis of cancer, not limited to cancer types, and unlike primary lesions, complete surgical removal in terms of the number and size of metastases is very important. Difficult. Therefore, if it is possible to control metastasis, it will greatly contribute to the improvement of prognosis.
  • the metastasis to be solved by the present invention includes multiple metastasis from the primary site to the lymph node and distant metastasis from the primary site to other organs and organs such as lung, bone, liver and abdominal cavity. Treatment is mainly by surgical lymph node dissection, and the latter is mainly by chemotherapy, but both are often out of control and have become important prognostic factors.
  • the cancer-suppressing composition of the present invention is a technique for transferring to the sentinel lymph node, which is directly connected among the regional lymph nodes, when it is administered in the primary site, and controlling lymph node metastasis.
  • the antitumor effect can be obtained against distant metastasis by inducing antitumor immunity.
  • oncolytic Sendai virus By administering oncolytic Sendai virus to the primary lesion, it causes tumor lysis, induces anti-tumor immunity, induces anti-tumor effect on distant metastasis, and reduces distant metastasis.
  • Lymph node metastasis is considered to occur multiple times through lymph nodes (sentinel lymph node, SLN) directly connected to the primary site, and suppression of sentinel lymph node metastasis suppresses secondary and subsequent lymph node metastasis It leads to. In most cases, if there is lymph node metastasis, it is often resected along with the primary lesion (lymph node dissection).
  • the present invention is a recombinant Sendai virus vector (rSeV) called BioKnife (registered trademark) having an antitumor effect on sentinel lymph node (SLN) metastasis.
  • BioKnife (registered trademark) is transferred from the primary site to SLN, and expression of the gene causes accumulation of a virus-derived fusion protein on cancer cells, and the protein is a specific protease for cancer cells. Is activated to induce cell fusion with adjacent cancer cells. This revealed that it showed suppression of SLN metastasis.
  • This invention suggests that gene therapy of HNSCC primary tumor by BioKnife (R) simultaneously becomes SLN target therapy and may be suppressed by low invasiveness instead of preventive selective neck dissection of clinical N0 cases. doing.
  • the prognosis of head and neck squamous cell carcinoma is also greatly influenced by distant metastasis to other than lymph nodes. It is expected that the prognosis will be improved if distant metastasis is suppressed or distant metastasis is treated.
  • the therapeutic composition for cancer used for lysing metastatic cancer at the uPA expression stage according to the present invention to achieve the above object comprises a complex comprising Sendai virus genomic RNA, said complex being administered intratumorally
  • the genomic RNA is mutated or deleted in the nucleic acid encoding the M protein to promote metastasis from the tumor to the lymph node and suppression of the growth of distant metastasis cancer and degeneration of the lymph node metastasis.
  • RNA encoding a modified F protein the sequence of the cleavage site of said protein being substituted by a sequence that is cleaved by a protease that does not cleave wild-type F protein, and Sendai virus wild-type F protein And the complex is activated by urokinase (uPA) at the uPA expression stage.
  • uPA urokinase
  • the complex has the ability to replicate the genomic RNA in cells into which the complex has been introduced, and the production of viral particles is significantly reduced or lost in the host (infected cell) environment.
  • the protease it is a configuration having the ability to introduce the RNA into cells in contact with cells into which the complex has been introduced.
  • the protease is a protease that is specifically expressed in cancer.
  • protease is an extracellular matrix degrading enzyme.
  • protease is a matrix metalloproteinase or plasminogen activator.
  • the therapeutic composition is configured to suppress metastasis of a tumor to a sentinel lymph node by intratumoral administration. Furthermore, the therapeutic composition is also configured to elicit anti-tumor immunity by administering it into a tumor.
  • anti-tumor immunity By lysing the primary tumor and releasing the cancer-associated antigen, anti-tumor immunity is elicited to regress distant metastasis.
  • the present invention alters protease-dependent tropism and infiltrates surrounding cells only in the presence of a specific protease, and by intratumoral administration, suppresses metastasis of tumor to lymph nodes and growth of distant metastatic cancer, and lymph
  • a cell fusion type vector capable of promoting degeneration of node metastasis.
  • Paramyxoviridae viruses including Sendai virus, have two proteins in their envelope.
  • the F (fusion) protein causes membrane fusion of the virus and its host cell to release the nucleocapsid into the cytoplasm.
  • HN (hemagglutinin-neuraminidase) protein has neuraminase activity with hemagglutination ability and plays a role in binding to host receptors.
  • the F and HN proteins also called spike proteins, are exposed on the envelope surface of the virus.
  • M (matrix) protein lines the envelope and imparts rigidity to virus particles. The features of this vector are that it can be efficiently transfected into a wide range of cells and animal tissues, and achieves high expression levels compared to existing vectors.
  • the F protein (F0) does not exhibit cell fusion activity as it is, and is only able to exhibit its fusion activity by being cleaved by host-derived protease to be degraded into F1 and F2. Therefore, the growth of viruses with wild-type F protein is restricted to tissues such as airway mucoepithelium that express trypsin-like proteases that can cleave this protein. In the case of paramyxovirus, various studies have been made on the modification of tropism or fusion ability of infection by modification of F.
  • virus is also obtained from cells etc. into which F gene-deficient SeV (Li, H.O. et al. (2000) J. Virol. 74, 6564-6569; WO 00/70055; WO 00/70070) which has no replication ability has been introduced.
  • F gene-deficient SeV Li, H.O. et al. (2000) J. Virol. 74, 6564-6569; WO 00/70055; WO 00/70070
  • the release of virus like particles (VLPs) has been observed. There is a concern that such secondary emission particles may induce an infection or an immune response outside the targeted tissue.
  • the present inventors have found that paramyxoviruses that lack the M gene form syncytia by causing fusion of infected cells and cells in contact with the infected cells, although no particle formation occurs, resulting in cell fusion type It has been found to infect (WO 00/09700). These M-defective viruses are replicated in transduced cells and transmitted to adjacent cells in the presence of trypsin. However, this phenomenon is a phenomenon that occurs only under conditions where F is cleaved and activated, and in the case of a virus having a wild-type F protein, virus transmission does not occur in the absence of a trypsin-like protease. The present inventors believe that if the tropism of the F protein is altered in this M-defective virus, a novel vector can be developed which can spread the infection only in a specific tissue without producing secondary release particles.
  • the present inventors believe that if the tropism of the F protein is altered in this M-defective virus, a novel vector can
  • M-defective viruses lack the M gene necessary for particle formation, and thus usually do not release or extremely suppress viral particles.
  • a conventional reconstitution method Korean, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579 used for the production of a recombinant virus having replication ability, it is possible to prepare RNP of M-deficient virus Yes, but infectious virus particles can not be produced (WO 00/09700).
  • the M-deleted vector As an actual cancer drug, it is extremely useful if the M-deleted virus can be prepared as an infectious virus particle. Therefore, the present inventors developed a new production method for preparing M-deleted virus as virus particles.
  • the present inventors first considered the use of temperature-sensitive mutations of viral genes as one solution for constructing a vector in which VLP release was suppressed.
  • Several mutant viruses that grow at low temperatures but can not grow at high temperatures have been reported.
  • the present inventors produce virus at low temperature (eg, 32 ° C.), especially when using mutant proteins that suppress virion formation at high temperatures, particularly those having mutations in M protein, such as gene therapy, etc.
  • VLP formation could be suppressed by performing at a higher temperature (for example, 37 ° C.).
  • M protein and HN protein F gene deficient recombinant Sendai virus which encodes mutant M and HN proteins with a total of six temperature sensitive mutations, three each.
  • VLP release of this virus was examined and found to be about 1/10 or less compared to wild-type virus. Furthermore, as a result of analyzing the localization of M protein in cells introduced with Sendai virus vector in which VLP release is suppressed by immunostaining using anti-M antibody, M on the cell surface found in cells introduced with wild type virus Protein aggregation was significantly reduced in the case of the VLP release-suppressed virus, and the image of M protein concentration was extremely reduced particularly at high temperatures (38 ° C.).
  • M protein and HN protein in cells infected with this SeV containing a temperature sensitive mutant M gene was examined in detail by confocal laser microscopy, and even at low temperature (32 ° C.), the M protein on the cell surface was The localization was significantly reduced and was observed in the form of microtubules. Furthermore, at high temperature (37 ° C.), M protein was localized near the centrosome of microtubules (ie, near the Golgi body).
  • the interaction with microtubules is important for the function of M protein, for example, by developing gene mutations and drugs that inhibit intracellular migration of M protein from the Golgi apparatus along microtubules. It is judged that it is possible to cause the failure of subcellular localization of M protein and consequently to achieve the reduction of secondary emission particles. That is, the present inventors have found that by preparing a viral vector having a mutation that causes a defect in the localization of M protein, it is possible to obtain a recombinant viral vector in which the particle formation ability is reduced or eliminated.
  • the present inventors attempted to construct a virus completely lacking cell surface aggregation of M protein in cells into which the virus had been introduced, by deleting the M gene from the virus.
  • the present inventors constructed helper cells capable of inducibly expressing wild type M protein available for production of M gene deleted virus. By using these cells, it was the first successful recovery of virus particles in which RNP of F-modified M gene-deleted virus is enveloped in an envelope containing wild-type M protein.
  • virus particles can be produced at a concentration of 1 ⁇ 10 8 PFU / ml or more, and it has become possible to provide for the first time a recombinant virus that can withstand practical use including clinical use.
  • the virus production system of the present invention enables the production of a highly safe, high-titer gene therapy vector that can exclude the contamination of other viruses.
  • an F-modified M-deleted paramyxovirus suitable for practical use was provided.
  • the present inventors examined the actual antitumor effect in vivo using infectious virus particles constructed as described above.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • the virus was limited to the injection site even after several days, whereas the vector of the present invention showed strong penetrability to the cancer tissue, and the spread of the vector was observed throughout the cancer.
  • the suppressive effect on the growth of cancer was clear as compared to the control where virus was not administered or wild type virus was administered.
  • the present inventors succeeded in preparing a virus particle (F non-cleavable virus) in which the F protein on the virus surface is not cleaved by controlling the addition of protease at the time of virus particle production.
  • this virus is not infectious as it is, it can be specifically infected by treating it with a protease that cleaves F protein on the surface of the virus or adding it to cells under the conditions where the protease is present. did it.
  • Such latently infectious virus vectors have made it possible to specifically infect the cancer cells producing specific proteases.
  • the invention provides a vector that spreads infection only in the presence of a protease that is expressed in a particular tissue, such as cancer.
  • the vector of the present invention does not produce virus-like particles significantly and transfers the vector to adjacent surrounding cells by cell fusion.
  • the vector of the present invention which acquires infectivity with a protease whose activity is enhanced in cancer has a strong inhibitory action on tumor growth, and gene therapy for cancer using this vector is considered extremely effective.
  • the present invention relates to a cell fusion-type vector in which protease-dependent tropism is altered, more specifically, a therapeutic composition for cancer used for lysis of metastatic cancer at the [1] uPA expression stage is the genomic RNA of Sendai virus
  • the genomic RNA is a complex comprising the following: intratumoral administration promotes the suppression of metastasis from a tumor to lymph nodes and the growth of distant metastases, and the degeneration of lymph node metastases;
  • a nucleic acid encoding M protein is mutated or deleted, and is a modified F protein in which the sequence of the cleavage site of the protein is cleaved by a protease that does not cleave wild type F protein.
  • a therapeutic composition for cancer activated by definitive urokinase [2]
  • the complex has the ability to replicate the genomic RNA in cells into which the complex has been introduced, and the production of virus particles is significantly reduced or lost in the host (infected cell) environment.
  • a therapeutic composition for cancer having the ability to introduce the RNA into cells in contact with cells into which the complex has been introduced, depending on the presence of the protease.
  • the therapeutic composition for cancer wherein the protease is a protease specifically expressed in cancer
  • the therapeutic composition for cancer wherein the protease is an extracellular matrix degrading enzyme
  • a therapeutic composition for cancer wherein the protease is a matrix metalloproteinase or a plasminogen activator.
  • the composition for treating cancer which suppresses metastasis from a tumor to a sentinel lymph node by intratumoral administration.
  • the therapeutic composition relates to a therapeutic composition for cancer which elicits antitumor immunity by administering it into a tumor.
  • Sendai virus is a virus included in paramyxovirus which refers to a virus belonging to Paramyxoviridae (Paramyxoviridae) or a derivative thereof.
  • the paramyxovirus is one of a group of viruses having non-segmented negative strand RNA in the genome, and the Paramyxoviridae subfamily (Paramyxovirinae) (paramyxovirus genus (also called Respirovirus genus), Rubravirus genus, and And Pneumovirinae (including Pneumovirus and Metapneumovirus genera).
  • the Sendai virus in the present invention may be derived from natural strains, wild strains, mutant strains, laboratory passage strains, artificially constructed strains, and the like.
  • recombinant protein and recombinant virus refer to protein and virus produced through recombinant polynucleotide, respectively.
  • a recombinant polynucleotide refers to a polynucleotide that is not bound as in natural conditions.
  • the recombinant polynucleotide includes a polynucleotide in which polynucleotide chains are rearranged or synthesized by human hands.
  • Recombinant polynucleotides can be produced by known genetic recombination methods by combining polynucleotide synthesis, nuclease treatment, ligase treatment and the like.
  • the recombinant protein can be produced by expressing a recombinant polynucleotide encoding the protein.
  • a recombinant virus can be produced by expressing a polynucleotide encoding a viral genome constructed by genetic engineering and reconstructing the virus.
  • gene refers to genetic material and includes nucleic acids such as RNA and DNA.
  • the nucleic acid encoding a protein in the present invention is referred to as the gene of said protein.
  • the gene may not encode a protein, for example, the gene may encode a functional RNA such as a ribozyme or an antisense RNA.
  • the gene may be a naturally derived or artificially designed sequence.
  • "DNA" includes single-stranded DNA and double-stranded DNA.
  • to encode a protein means to include an ORF encoding the amino acid sequence of the protein in a sense or antisense so that the polynucleotide can express the protein under appropriate conditions.
  • the present invention provides a cell fusion vector having replication ability, in which the protease dependent tropism is altered.
  • the vector of the present invention specifically refers to the following complex.
  • a therapeutic composition for cancer used for lysing metastatic cancer at the uPA expression stage comprising a complex comprising a Sendai RNA genomic RNA, said genomic RNA comprising a mutation or deletion of a nucleic acid encoding an M protein And contains genomic RNA encoding a modified F protein, the sequence of the cleavage site of said protein being cleaved by a protease that does not cleave wild type F protein, and the wild type of Sendai virus It further comprises an F protein and the complex is activated by urokinase (uPA) at the uPA expression stage.
  • uPA urokinase
  • This complex is also called a vector in the present invention because it has the function of replicating genomic RNA and introducing it into adjacent cells.
  • a vector refers to a carrier for introducing nucleic acid into cells.
  • the above complex is specifically a complex comprising the genomic RNA of the paramyxovirus and a viral protein that binds thereto.
  • the complex of the present invention may be, for example, a complex consisting of paramyxovirus genomic RNA and a viral protein, ie, ribonucleoprotein (RNP). RNP can be introduced into cells, eg, in combination with a desired transfection reagent.
  • RNP is specifically a complex comprising genomic RNA of paramyxovirus, N protein, P protein and L protein.
  • a cistron that encodes a viral protein is transcribed from genomic RNA by the function of the viral protein, and the genome itself is replicated to form a daughter RNP.
  • the replication of genomic RNA can be confirmed by detecting an increase in the copy number of the RNA by RT-PCR or northern hybridization or the like.
  • the complex is more preferably a virus particle of paramyxovirus.
  • Viral particles refer to microparticles containing nucleic acid which are released from cells by the action of viral proteins.
  • the shape of the virus particle may vary depending on the type of virus, such as globular and rod-like, but is sufficiently smaller than cells, and the size is usually about 10 nm to 800 nm.
  • the virus particle of paramyxovirus has a structure in which the RNP containing genomic RNA and virus protein is contained in a lipid membrane derived from a cell membrane (referred to as an envelope).
  • Viral particles may or may not be infectious. For example, it may be a virus particle which is not infectious as it is but which is potentially infectious so as to acquire infectivity by a specific treatment.
  • paramyxovirus genomic RNA RNP is formed with paramyxovirus virus protein, the gene in the genome is expressed by the protein, and the nucleic acid is replicated to form daughter RNP.
  • paramyxovirus is a virus having a single-stranded negative strand RNA in its genome, such RNA encodes a loaded gene as antisense.
  • the genome of paramyxovirus has a configuration in which viral genes are arranged as antisense between the 3 'leader region and the 5' trailer region.
  • a transcription termination sequence (E sequence) -intermediate sequence (I sequence) -transcription initiation sequence (S sequence) is present between the ORFs of each gene, whereby the RNAs encoding the ORF of each gene serve as separate cistrons. Transcribed.
  • the genomic RNA contained in the vector of the present invention is N (nucleocapsid), P (phospho), and L (viral protein required for the expression of the gene group encoded by the RNA and autonomous replication of the RNA itself). Large) is encoded in antisense. Furthermore, the RNA antisensely encodes F (Fusion) protein, which is a protein that causes cell membrane fusion necessary for propagation of the RNA to adjacent cells. Preferably, the genomic RNA further encodes HN (hemagglutinin-neuraminidase) (or H) protein in an antisense manner. However, in certain cells, HN protein is not necessary for infection, and infection is established only with F protein. In addition, proteins other than HN that can bind to cells can be combined with the F protein to infect the vector. Therefore, it is possible to construct the vector of the present invention even using genomic RNA which does not encode the HN gene.
  • each gene in each virus belonging to Paramyxoviridae is generally described as follows.
  • the N gene is sometimes referred to as "NP".
  • Mobile virus genus NP P / C / V M F H-L is M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, and M55565 for NP gene.
  • viral genes encoded by other viruses for example, CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; PDV, X75417; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; and Tupaia, AF079780, for the P gene, CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV, D86172; MV, k01711; NDV, AF064091; -1, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D8617 ; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; and
  • HPIV-3 AB012132; HPIV-4A, M3403; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, k01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; -5, S76876 can be illustrated.
  • a plurality of strains are known for each virus, and there are genes consisting of sequences other than those exemplified above due to differences in strains.
  • the ORFs of these viral proteins are placed in antisense in genomic RNA via the above EIS sequence.
  • the ORF closest to 3 'in genomic RNA requires only the S sequence between the 3' leader region and the ORF, and the E and I sequences are not required.
  • the ORF closest to 5 'in genomic RNA requires only E sequences between the 5' trailer region and the ORF, and I and S sequences are not necessary.
  • the two ORFs can also be transcribed as the same cistron using, for example, a sequence such as IRES. In such a case, no EIS sequence is required between these two ORFs.
  • RNA genome is followed by a 3 'leader region, followed by six ORFs encoding N, P, M, F, HN, and L proteins in an antisense fashion. , followeded by the 5 'trailer region at the other end.
  • the arrangement of the viral gene is not limited to this, but preferably, like the wild-type virus, N, P, (M,) F, following the 3 'leader region It is preferable that the ORFs encoding HN and L proteins be sequentially arranged, followed by arrangement of the 5 'trailer region.
  • the number of viral genes is not six, but even in such cases, each viral gene can be arranged in the same manner as wild-type as described above, or can be changed as appropriate.
  • the M protein ORF will be described later, in one embodiment of the vector of the present invention, this ORF is absent or encodes a mutant M protein.
  • the cleavage site of the genome-encoded F protein is modified to a sequence that is cleaved by a protease that does not cleave wild-type F protein.
  • the genomic RNA of the invention can encode one or more foreign genes. As a foreign gene, a desired gene to be expressed in a target cell can be used.
  • the position of introduction of the foreign gene can be inserted, for example, at a desired site of the protein non-coding region of the genome, for example, between the 3 'leader region and the viral protein ORF closest to 3', between each viral protein ORF, And / or may be inserted between the 5 'closest viral protein ORF and the 5' trailer region.
  • the M gene In genomes where the M gene is deleted, it can be inserted into the deleted region.
  • An EIS sequence is constructed between the inserted foreign gene and the viral ORF.
  • foreign genes may be inserted through the IRES.
  • any viral gene contained in the vector is modified from the wild-type gene, for example, in order to reduce the immunogenicity by viral proteins or to enhance the transcription efficiency or replication efficiency of RNA. Good.
  • HN protein which is one of the structural proteins, has both activities of hemagglutinin (hemagglutinin) and neuraminidase activity, which are hemagglutinins, but if, for example, the former activity can be weakened, blood It will be possible to improve the stability of the virus in it, and it is also possible to modulate its infectivity, for example by modifying the activity of the latter.
  • the membrane fusion ability and / or the particle formation ability can also be regulated by modifying the domain other than the cleavage site as well as the F protein.
  • F protein which can be an antigen molecule on the cell surface, an antigen-presenting epitope of HN protein and the like can be analyzed, and this can be used to prepare a virus vector in which the antigen presenting ability of these proteins is weakened.
  • the complex of the present invention is a substantially homogeneous complex.
  • substantially homogeneous complex means that the complex is separated from paramyxovirus RNP or virus particles that are not complexes of the present invention. That is, the substantially homogeneous complex of the present invention does not contain other paramyxovirus RNPs having particle forming ability or virus particles of the virus.
  • the ability to form particles refers to a vector that releases infectious virus particles and / or non-infectious virus particles (referred to as virus-like particles) in cells infected with the virus vector (this is called secondary release). Say ability.
  • a virus RNP containing in its genome a gene encoding wild type F protein or an F protein having a fusion activity equivalent thereto is also a virus containing this genome It also contains no particles.
  • the F protein encoded by the above-mentioned genomic RNA is substituted for the sequence of the cleavage site of the protein with a sequence that is cleaved by another protease.
  • Paramyxovirus F protein (F0) does not exhibit cell membrane fusion activity as it is, but becomes active by cleavage of the extracellular domain (or extra viral particle domain) of the F0 fragment.
  • the two F protein fragments generated by cleavage are called F2 at the N-terminal side and F1 at the C-terminal side, and they are linked by a disulfide bond.
  • Cleavage of the F protein means thus cleaving the F protein on the membrane in the domain outside the membrane to generate a fragment capable of obtaining cell fusion ability.
  • the sequence of the cleavage site refers to the amino acid sequence necessary for cleavage by the protease or the essential residues therein.
  • Cleavage sites for Paramyxovirus F proteins are known and they are cleaved by trypsin-like proteases such as furin in cells.
  • Furin is universally present in the Golgi apparatus of most cells.
  • the recognition motif of furin is Arg-X-Lys / Arg-Arg (RXK / RR) (the two amino acids separated by "/" represent either).
  • Highly pathogenic, human PIV3 (RTKR), SV5 (RRRR), Mumps virus (RHKR), NDV (virulent strain) virulent strain (RQR / KR), Measles virus (RHKR), RS virus (RKRR) etc. are cleaved It has the sequence of these motifs at the site.
  • the virulent strain F is sensitive to the proteases present in all cells, and multistage proliferation with cleavage of F in any organ renders the infection fatal.
  • Sendai virus PQSR
  • Human PIV1 PQSR
  • NDV avirulent strain attenuated strains
  • the cleavage site identifies the cleavage site of the F protein of the virus grown in cells, tissues, or individuals in which the paramyxovirus can grow, or the F protein which is expressed and recovered in such cells or individuals. It can confirm by doing.
  • F protein can be artificially cleaved and identified by treating F protein expressed on the cell surface with a protease such as trypsin which cleaves the cleavage site of this protein.
  • the F protein is a sequence in which the amino acid sequence of the F protein cleavage site is modified to be cleaved by another protease.
  • the native cleavage sequence of the F protein is modified by substitution, deletion and / or insertion of one or more amino acids and reassembled into a sequence that can be cleaved by other proteases. Modification of the amino acid sequence can be performed by known site-directed mutagenesis.
  • the modified F protein may maintain the property of being cleaved by a protease (such as trypsin) that cleaves a wild-type F protein.
  • a vector encoding such a modified F protein is expanded in protease dependent tropism as compared to a wild type F protein.
  • the sequence cleaved by another protease may be a sequence cleaved by a desired protease, for example, a sequence cleaved by a protease expressed in a desired tissue or cell desired to be targeted for vector introduction. Yes (WO 01/20989).
  • a vector using an F protein gene having a sequence that is cleaved by a protease that is active in the target tissue the vector is specifically amplified in surrounding cells in the environment where this protease activity exists. The excellent property of transmitting can be realized.
  • a cleavage sequence of a protease that is specifically expressed or activated in a certain tissue it is possible to construct a vector that specifically infiltrates only in that tissue.
  • a cleavage sequence of a protease that is specifically expressed or activated in a certain condition for example, a certain disease
  • construction of a vector that specifically infiltrates only in that condition for example, only within a specific disease area
  • the protease may be present intracellularly or extracellularly, for example, protease secreted extracellularly, membrane-type protease expressed on the membrane surface, etc. are preferred.
  • protease cleavage sequences in the present invention are cleavage sequences of proteases whose activity is enhanced in cancer.
  • a protease whose activity is enhanced in cancer refers to a protease whose activity is enhanced in a certain cancer tissue or cancer cell relative to a normal tissue or normal cell corresponding to the cancer.
  • the enhancement of activity may be enhancement of the expression level of the protease and / or enhancement of the activity itself.
  • the expression level of the protease can be determined by Northern hybridization using the gene fragment of the protease as a probe, RT-PCR using a primer that specifically amplifies the protease gene, or Western blot, ELISA, or immunization using an antibody against the protease. It can be measured by sedimentation or the like. Also, the activity of the protease can be known by a degradation assay using a substrate of the protease. Many in vivo proteases are known whose activity is regulated by various inhibitors. The level of protease activity can also be measured by measuring the expression levels of these inhibitors.
  • ECM extracellular matrix
  • a matrix composed of proteins such as collagen and proteoglycan is formed in the intercellular space.
  • collagen, fibronectin, laminin, tenascin, elastin, proteoglycan and the like are known as components of the extracellular matrix.
  • These ECMs have functions such as regulating functions such as cell adhesion, development or migration, and binding soluble factors to regulate their distribution and activity.
  • Infiltration of ECM by ECM degrading enzyme is deeply involved in cancer metastasis, and in fact, many inhibitors of ECM degrading enzyme have been reported to inhibit metastasis or basement membrane invasion.
  • ECM degrading enzymes are classified into aspartic protease, cysteine protease, serine protease and metalloprotease according to the type of catalytic residue in the active center.
  • serine protease and metalloprotease play central roles in ECM degradation in vivo.
  • Serine proteases are widely distributed in microorganisms, animals, plants, etc., and in higher animals, digestion of food, blood coagulation, fibrinolysis, immunocomplement reaction, cell proliferation, cell proliferation, development, differentiation, senescence, cancer metastasis, etc.
  • the activity of serine protease is generally regulated by a serine protease inhibitor (serpin) present in plasma and tissues, and this quantitative or qualitative abnormality causes inflammation and the like.
  • serpin serine protease inhibitor
  • ECM-degrading serine proteases include cathepsin G, elastase, plasmin, plasminogen activator, tumor trypsin, chymotrypsin-like neutral proteinase, thrombin and the like. Plasmin is produced by limited degradation of plasminogen present in an inactive state in vivo. This limited degradation is controlled by plasminogen activator (PA) and its inhibitor plasminogen activator inhibitor (PAI). PA includes tissue type PA (tPA) related to blood coagulation and urokinase type PA (uPA) related to ECM degradation. When these two PAs bind to PAI, their actions are inhibited.
  • PA plasminogen activator
  • PAI inhibitor plasminogen activator inhibitor
  • PA includes tissue type PA (tPA) related to blood coagulation and urokinase type PA (uPA) related to ECM degradation. When these two PAs bind to PAI, their actions are inhibited.
  • uPA can act in the state of binding to uPA receptor (uPAR) on the cell surface.
  • Plasmin degrades fibronectin, tenascin, laminin, etc., but collagen can not be degraded directly. However, collagen is degraded indirectly by cleaving and activating part of the collagenolytic enzyme precursor. They are often highly active in cancer cells and are well correlated with metastatic potential.
  • Butenas uses 54 kinds of fluorescent substrates to present highly specific sequences for tPA (Butenas, S. et al. (1997) Biochemistry 36, 2123-2131), and the degradation activity for tPA with high FPR and VPR Indicated. Therefore, these sequences are particularly preferably used.
  • MMP activity in tissues is regulated in the process of production of latent enzyme, activation of latent enzyme, and inhibition by active enzyme inhibitors, and development ovulation, fertilization, adhesion to the endometrium. It is involved in various physiological phenomena such as floor and wound healing. Impaired regulation of MMP activity contributes to various pathologies such as cancer cell invasion / metastasis, arthritis, gingivitis, arteriosclerosis, tumors, and fibrosis. For example, it is known that gelatinases (MMP-2, -9) that degrade basement membrane components are important for cancer metastasis. MMP-2 is activated by cleavage of pro-MMP-2 by MT1-MMP.
  • uPA first produces plasmin from plasminogen to activate proMMP-3, and active MMP-3 has a pathway for activating proMMP-9, which is a cancer pathway.
  • proteases include, for example, MMP-2, MMP-9, uPA, MMP-3, and MT1-MMP, particularly MMP-2, MMP-9, and uPA.
  • the protease cleavage sequence When the protease cleavage sequence is incorporated into the F protein, it is preferable to insert the protease cleavage sequence of interest into the cleavage site of the F protein and to degenerate the cleavage site by the Trypsin-like protease that is originally present. For this purpose, the amino acid sequence around the cleavage site by the original Trypsin-like protease may be replaced with the target protease cleavage sequence (recognition sequence).
  • the modified F protein is a protein that is cleaved by a target protease when expressed in cells and maintains the cell membrane fusion action of the F protein.
  • the amino acid near the N-terminus of the F1 fragment generated by cleavage of the F protein is considered to have an important function in cell membrane fusion. Therefore, it is preferable to design a cleavage sequence so that the N-terminus of the F1 fragment after cleavage is identical to the N-terminus of the F1 fragment of wild-type F protein, as long as the cleavage is not inhibited.
  • design should be made so that minimal amino acids are added to the N-terminus of the cleaved F1 fragment compared to wild-type F1. desirable.
  • N-terminal after cleavage 5 amino acids or less, preferably 4 amino acids or less, more preferably 3 amino acids or less (for example, 1, 2 or 3 amino acids) are added compared to wild type F1.
  • Met-Thr-Ser SEQ ID NO: 1
  • Conservative substitution refers to substitution between amino acids where the chemical properties of the side chains of the amino acids are similar. Specifically, substitution to Ile or Val for Met, substitution for Ser or Ala for Thr, and substitution for Ala, Asn, or Thr for Ser can be mentioned. Substitution of an amino acid at each position may be performed independently.
  • An assay system using a plasmid vector can be used to efficiently identify a modified F protein that exerts a fusion ability in the presence of a specific protease. That is, a plasmid vector expressing the modified F protein is transfected into cells, and cultured in the presence of a protease to detect syncytia formation. The modified F protein encoded by the plasmid that forms syncytia is judged to be cleavable by the protease to exhibit fusion ability.
  • MMP may be added to the culture system.
  • a vector encoding a modified F protein can introduce genomic RNA contained in the vector into cells in contact with cells into which the vector has been introduced, depending on the presence of a protease that cleaves the modified F protein. Due to the action of the cleaved F protein, contacting cells cause cell fusion, and RNP diffuses into the fused cells. That is, the vector of the present invention does not form virus particles, but can transmit the vector to a localized region in order to infiltrate the cells in such contact.
  • the protease may be expressed intracellularly or extracellularly, or may be exogenously added.
  • the modified F protein provided by the present invention has the ability to exhibit cell fusion ability depending on a specific protease.
  • This protein can be used to create viral vectors that produce cell fusion or specifically infect in the presence of the protease, or drug / gene delivery vectors such as liposomes.
  • the modified F protein provided by the present invention and the nucleic acid encoding the same can be used for the development of a variety of protease-dependent vectors other than the vector of the present invention.
  • the present invention also provides a paramyxovirus vector comprising a modified F protein whose cell fusion ability has been enhanced by deletion of the cytoplasmic domain.
  • This modified F protein has an amino acid in part of the cytoplasmic domain deleted such that it has 0-28, more preferably 1-27, more preferably 4-27 amino acids in the cytoplasmic domain. It is a protein.
  • the cytoplasmic domain is a domain on the cytoplasmic side of a membrane protein, and in the case of F protein, it is a C-terminal side region of a transmembrane (TM) region (see FIG. 42).
  • an F protein having 6 to 20, more preferably 10 to 16, and more preferably 13 to 15 amino acids as a cytoplasmic domain exhibits a cell fusion ability significantly higher than that of a wild-type F protein. Therefore, if a paramyxovirus vector containing an F protein modified to have a cytoplasmic domain of about 14 amino acids is prepared, it is possible to obtain a vector having higher cell fusion ability than that using a wild-type F protein.
  • this deletion F protein is 10 or more amino acids at the C-terminal of wild-type F protein, more preferably 15 or more amino acids, more preferably 20 or more amino acids, more preferably 25 or more amino acids More preferably, 28 amino acids or more are deleted.
  • the cytoplasmic domain-deleted F protein lacks about 28 amino acids at the C-terminus of wild-type F protein.
  • Paramyxovirus vectors containing in their genome genes encoding these cytoplasmic domain-deleted F proteins have higher cell fusion ability than conventional vectors, and thus can infiltrate into surrounding cells more strongly.
  • the present invention relates to a fusion protein of two spike proteins possessed by paramyxovirus.
  • Paramyxoviruses have a protein that is thought to function as a cell fusion (referred to as F protein) and a protein that is considered to function in adhesion to cells (such as HN or H).
  • F protein a protein that is thought to function as a cell fusion
  • HN a protein that is considered to function in adhesion to cells
  • the fusion protein contains F protein at the N-terminal side of the fusion protein and HN (or H) protein at the C-terminal side.
  • HN (or H) protein at the C-terminal side.
  • the full-length proteins may be fused together, but a protein in which part or all of the cytoplasmic domain of the F protein is deleted may be fused to the HN (or H) protein.
  • the length from the downstream of the TM region of F protein to HN (or H) protein is 5 residues or more, more preferably 10 residues or more, more preferably 14 residues or more, more preferably 20 residues or more I assume.
  • a linker peptide of an appropriate length to the C-terminus of F protein part can be used to regulate the length preferable.
  • a protein fused to a cytoplasmic domain-deleted F protein having a cytoplasmic domain of a 14 residue F protein and HN or H) protein via any linker peptide can be suitably used.
  • the length of the linker peptide can be, for example, about 50 residues.
  • the gene (M gene) encoding M (matrix) protein is mutated or deleted.
  • the cleavage site of the F protein is modified to a sequence that is cleaved by other proteases, and the M gene is further mutated or deleted to suppress the ability to form particles, thereby preventing release of virus particles.
  • a completely new vector has been developed that allows the vector to be infiltrated only in cell populations that express the protease.
  • Mutation of the M gene is a mutation that abolishes or significantly reduces particle formation activity in the host environment. Such a mutation can be identified by reducing the cell surface aggregation of the protein in cells expressing this M protein.
  • a mutant M protein in which aggregation on the cell surface is significantly reduced compared to a wild-type M protein is considered to have a significantly reduced ability to form particles.
  • the reduction of the particle formation ability of the virus is, for example, reduced to statistical significance (for example, a 5% or less level of significance level).
  • Statistical tests can be performed by, for example, Student's t test or Mann-Whitney U test.
  • the virus vector having a mutated M gene preferably has a particle forming ability in the environment inside the host of 1/5 or less, more preferably 1/10 or less, more preferably 1/30 or less, more preferably 1/50 or less, more preferably Is reduced to 1/100 or less, more preferably 1/300 or less, more preferably 1/500 or less.
  • the vector of the present invention has substantially lost the ability to produce viral particles in the host environment.
  • substantially lost means that the production of viral particles in the host environment is not detected.
  • virus particles are at most 103 / ml, preferably at most 102 / ml, more preferably at most 101 / ml.
  • the internal environment of the host refers to the environment in which the wild type of the paramyxovirus from which the vector of interest is derived normally proliferates in nature, or an environment that provides equivalent virus growth.
  • the host environment may be, for example, the optimal growth conditions of the virus. If it is a paramyxovirus whose host is a mammal, it means an environment in which the mammal is in vivo or equivalent.
  • the temperature is about 37-38 ° C. (eg, 37 ° C.) corresponding to that of the mammalian body.
  • the culture environment under normal cell culture conditions specifically, in a medium containing or not containing serum (pH 6.5 to 7.5) at 37 ° C., 5% CO 2 in a wet environment, may be mentioned.
  • the temperature-sensitive mutation of the M gene is not particularly limited.
  • G69 refers to the 69th amino acid Gly of M protein
  • T116 refers to the 116th amino acid Thr of M protein
  • A183 refers to the 183rd amino acid Ala of M protein.
  • the amino acid mutation may be substitution with another desired amino acid, but preferably substitution with an amino acid having a different side chain chemical property.
  • the amino acids are basic amino acids (eg, lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid), non-charged polar amino acids (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar amino acids Classification into groups such as (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched amino acids (eg threonine, valine, isoleucine) and aromatic amino acids (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine)
  • substitution of an amino acid with an amino acid other than the amino acid of a group to which the amino acid belongs can be mentioned
  • basic amino acids may be substituted with acidic or neutral amino acids
  • polar amino acids may be substituted with nonpolar amino acids
  • substitution with an amino acid smaller than the average molecular weight conversely substitution of an amino acid with a larger amino acid if the amino acid is smaller than the average molecular weight, and the like can be mentioned, but not limited thereto.
  • M proteins of other paramyxoviruses containing mutations selected from the group consisting of G69E, T116A, and A183S in Sendai virus M protein or mutations at positions homologous thereto can be used.
  • G69E is a mutation in which the 69th amino acid Gly of M protein is substituted by Glu
  • a mutation in T116A is a mutation in which the 116th amino acid Thr of M protein is substituted with Ala
  • A183S is a mutation with M protein of 183
  • the mutation in which the second amino acid Ala is substituted for Ser That is, homologous sites of G69, T116 and A183 of Sendai virus M protein or other viral M protein can be replaced with Glu (E), Ala (A) and Ser (S), respectively. It is preferable to have these mutations in combination, and in particular, it is more preferable to retain all of the above three mutations.
  • the introduction of a mutation into the M gene can be carried out according to known mutagenesis methods. For example, it is possible to introduce using a mutated oligonucleotide of interest as described in the examples.
  • the vector of the present invention lacks the M gene.
  • the deletion of the M gene means that the function of the M gene is lost, and includes the case of having the M gene having a functionally deficient mutation and the case of deleting the M gene.
  • a deletion-type mutation of M gene can be produced, for example, by deleting the protein coding sequence of M gene or inserting another sequence. For example, a stop codon can be designed in the middle of the M protein coding sequence (WO 00/09700).
  • the vector of the present invention is most preferably completely deleted the M protein coding sequence.
  • the vector in which the M protein ORF has been deleted, unlike the vector encoding the conditional mutant M protein, has lost the ability to form viral particles under any conditions.
  • the reverse side synthetic DNA sequence selects any two or more nucleotides from the 5 'side (preferably 4 bases not including sequences derived from NotI recognition sites such as GCG and GCC, more preferably ACTT), and the 3' side thereof
  • the NotI recognition site gcggccgc is added to the, and the oligo DNA of the insert fragment for adjusting the length is further added to the 3 'side thereof.
  • the length of this oligo DNA is designed such that the length of the NotI fragment of the final PCR amplification product containing EIS sequence is a multiple of 6 (so-called "rule of six"; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72: 891-899, 1998; Calain, P.
  • the complementary strand sequence of Sendai virus S sequence on the oligo DNA 3 'side of the insert fragment preferably 5'-CTTTCACCCT-3' (SEQ ID NO: 8)
  • the length is selected so that the last base of the complementary strand equivalent to about 25 bases is G or C, and the sequence is added to the 3 'end of the reverse side synthetic DNA.
  • PCR can use the usual method which uses Taq polymerase or other DNA polymerases.
  • the amplified target fragment is digested with NotI and then inserted into the NotI site of plasmid vector pBluescript.
  • the nucleotide sequence of the obtained PCR product is confirmed by a sequencer, and a plasmid with the correct sequence is selected.
  • the insert fragment is excised with NotI from this plasmid and cloned into the NotI site of a plasmid containing genomic cDNA.
  • recombinant Sendai virus cDNA can be obtained by direct insertion into the NotI site without using a plasmid vector.
  • recombinant Sendai virus genomic cDNA can be constructed according to the method described in the literature (Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, MK et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997).
  • an 18 bp spacer sequence (5 '-(G) -CGGCGCCAGATCTCCACG-3') (SEQ ID NO: 10) having a NotI restriction site was compared with the leader sequence of the cloned Sendai virus genomic cDNA (pSeV (+)) and N A plasmid pSeV18 + b (+) is inserted which is inserted between the protein and the ORF and contains a self-cleavable lipozyme site derived from the antigenic strand of Hepatitis delta virus (Hasan, MK et al., 1997, J. Mol. General Virology 78: 2813-2820).
  • the cDNA encoding the genomic RNA is digested with a restriction enzyme to recover a fragment containing the M gene and cloned into an appropriate plasmid.
  • Mutation of M gene or construction of M gene deletion site is performed on this plasmid. Mutagenesis can be performed according to the method described in Kit using, for example, QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA).
  • QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA).
  • all or part of the ORF of the M gene can be deleted and appropriately ligated with an appropriate spacer sequence.
  • Mutations can be introduced in the same manner, for example, into the F and / or HN genes.
  • the vector of the present invention can be reconstituted by transcribing DNA encoding genomic RNA in the presence of the above-mentioned viral proteins.
  • the present invention provides DNA encoding viral genomic RNA of the vector of the present invention for the production of the vector of the present invention.
  • the invention also relates to the use of DNA encoding the genomic RNA of said vector for application in the production of a vector according to the invention. Reconstitution of the virus from genomic cDNA of minus-strand RNA virus can be carried out using known methods WO 97/16539; WO 97/16538; Durbin, AP et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan Med., SP et al., 1995, Proc. Natl. Acad.
  • RNA virus including the parainfluenza, vesicular stomatitis virus, rabies virus, measles virus, linda pest virus, Sendai virus and the like or RNP to be a virus component.
  • the vector of the present invention can be reconstituted.
  • a specific procedure comprises: (a) transcribing cDNA encoding the paramyxovirus genomic RNA (negative strand RNA) or its complementary strand (positive strand) in cells expressing N, P and L proteins, (B) Recovering a complex containing the genomic RNA from the cell or its culture supernatant.
  • the transcribed genomic RNA is replicated in the presence of N, L and P proteins to form RNP complexes.
  • step (a) in the presence of a protease that cleaves the modified F protein encoded by the genome, the formed RNP is transmitted to cells in contact with the cells, and the infection spreads and the vector is amplified.
  • the vector of the present invention can be produced in the form of RNP even in the absence of functional M protein.
  • the vector of the present invention is a treatment for cancer, and is particularly useful for suppressing metastasis of tumor to lymph node and suppressing growth of distant metastasis cancer, and promoting degeneration of lymph node metastasis.
  • FIG. 1 shows the results of the cytotoxic effect of BioKnife on HSC-3-M3 in vitro.
  • HSC-3-M3 was incubated with BioKnife (MOI 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10) and the cell number was determined 96 hours after treatment.
  • mice were used to confirm the establishment of a sentinel lymph node micrometastasis model.
  • Human high-frequency metastatic tongue squamous cell carcinoma cell HSC-3-M3 was orthotopically treated with human highly-metastatic tongue squamous cell carcinoma cell HSC-3-M3, ie, 1e5 cells were inoculated at the left side of the tongue Two weeks later, the frequency of HSC-3-M3 transfer to SLN was evaluated.
  • Sections (5 ⁇ m thick) were sliced using a microtome and stained with hematoxylin-eosin (HE). Metastasis rate was assessed by counting the number of animals with positive metastatic individuals (animals with at least one metastatic positive lymph node). As a result, 60% of SLN metastasis model mice detected SLN metastasis 2 weeks after HSC-3-M3 inoculation (data not shown). The present results are consistent with the result that 90% of mice 3 weeks after HSC-3-M3 inoculation had metastasis to cervical lymph nodes by Matsui et al. (20).
  • rSeV / ⁇ M-GFP was administered at 1e6 CIU / 20 ⁇ l to the vector administration group, and 20 ⁇ l of PBS was administered to the primary tumor of the control group.
  • animals were sacrificed and tongues and SLNs were dissected and evaluated by immunohistochemical staining and quantitative real time polymerase chain reaction (RT-PCR) as described below.
  • RT-PCR real time polymerase chain reaction
  • Tissue samples were fragmented into small pieces ( ⁇ 25 mg) and soaked in RNAlater® solution (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) and RNA isolated using RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA).
  • the primers used were SeV forward SeV-forward 5'-AGAGAACAAGACTAAGGCTACC-3 'and SeV reverse 5'-ACCTTGACAATCCTGATGTGG-3', and GFP was GFP forward 5'-CGTCCAGGAGCGCACCATCTTC-3 'and reverse 5'-GGTCTTTGCTCAGGGCGGACT-3' was used.
  • RNA levels of related molecules were measured by quantitative RT-PCR using the One Step SYBR PrimeScript RT-PCR kit (Takara Bio, Shiga, Japan) in Thermal Cycler Dice Real-Time System II (Takara Bio, Shiga, Japan) .
  • RT-PCR of tongue and SLN excised 7 days after GFP-labeled rSeV administration significantly increased the relative mRNA expression of GFP and SeV in rSeV / ⁇ M-GFP group compared to tongue and SLN of control group (P ⁇ 0.05, FIGS. 3B and 3C), the migration of the SeV vector to SLN could be confirmed (FIG. 3B).
  • Transfer to the sentinel sentinel lymph node in cancer is the main route of cancer metastasis, but conversely, it can also be used for administration routes of therapeutic agents such as therapeutic agents, proteins, viruses and cells.
  • therapeutic agents such as therapeutic agents, proteins, viruses and cells.
  • the movement of this vector is also expected to be the same route.
  • mice ⁇ Reduction of distant metastasis in mouse-derived squamous cell carcinoma cell-bearing mice>
  • the mouse buccal squamous cell carcinoma cell line, SCCVII is suspended in 1 ⁇ l of 20 ⁇ l of PBS and administered to the buccal floor of a mouse of the same strain as the cancer cells (C3H / HeN).
  • the bioknife is injected at the inoculation site at 24, 48, 72, 96 hours after tumor inoculation.
  • the same cells are suspended in 1 ⁇ l of 20 ⁇ l of PBS and inoculated subcutaneously into the left trunk as a pseudo remote metastasis. Tumor volume is then calculated by tumor size. (FIG. 6A)
  • the therapeutic composition by using the therapeutic composition, it is possible to prevent metastasis to SLN or control already metastasized metastasis to the N0 stage primary tumor with N0 stage or regional lymph node metastasis. This prevents further multiple lymph node metastasis, leading to an improved prognosis.
  • lymph node metastasis is suppressed by neoadjuvant bioknife administration, if surgical excision of the primary lesion is performed, lymph node dissection becomes unnecessary, leading to a reduction in the burden on patients and operators.
  • the tumor inhibitory effect will be extended also to distant metastases such as bone metastasis and lung metastasis.
  • Quantitative measurement of rSeV / ⁇ M-GFP migration to metastatic sentinel lymph nodes shows that the fluorescence intensity of rSeV / ⁇ M-GFP group is higher than that of control group in both tongue and SLN It was revealed to be significantly higher (p ⁇ 0.01, p ⁇ 0.05).
  • RT-PCR quantitative RT-PCR
  • dissected tongue and sentinel lymph node 7 days after rSeV / ⁇ M-GFP administration with control group of tongue and SLN
  • RT-PCR on dissected tongue and sentinel lymph nodes 7 days after rSeV / ⁇ M-GFP administration significantly increases SeV relative mRNA expression in rSeV / ⁇ M-GFP group compared to tongue and SLN control group It showed that (p ⁇ 0.05).

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Abstract

【課題】　投与した癌から遠く離れた部位（例えば体の反対側に移植した癌）にある癌の縮小効果、および、癌腫瘍につながるリンパ系を介しての転移（リンパ節転移）を抑制する効果を有する癌の治療組成物を提供する。 【解決手段】　転移癌の溶解に用いられる癌の治療組成物であって、センダイウイルスのゲノムＲＮＡを含む複合体からなり、前記ゲノムＲＮＡは、Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ、改変Ｆ蛋白質であって該蛋白質の開裂部位の配列が野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを含むとともに、センダイウイルスの野生型Ｆ蛋白質をさらに含み、前記複合体は、腫瘍内投与により、腫瘍からのリンパ節への転移および遠隔転移癌の成長の抑制、リンパ節転移巣の縮退を促進する構成である。

Description

癌の治療組成物
　本発明は、癌の治療組成物に関し、特に、投与した癌から遠く離れた部位（例えば体の反対側に移植した癌）にある癌の縮小効果、および、癌腫瘍につながるリンパ系を介しての転移（リンパ節転移）を抑制する効果を有する癌の治療組成物に関する。
　ステージが進んだ癌では癌細胞が原発巣から游走し、臓器組織に定着し、成長するいわゆる転移がみられる。癌種に限らず、転移は癌の予後を決める最も重要な要素の一つであり、これを未然に防止する、あるいは早期に発見し転移部位での増殖拡大を抑制する技術の開発は、患者の予後を高めるための喫緊の課題となっている。
　例えば、頸部リンパ節への癌転移は、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）における最も重要な予後因子の１つである。しかし、治療前情報に基づいてリンパ節転移が無いとされる臨床的Ｎ０（ｃＮ０）症例における治療法の選択、すなわち選択的に頸部リンパ節を郭清するか、注意深く経過観察するかの選択は議論の余地の多い問題である。
　頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）は世界で７番目に多いがんであり、毎年６８万人を超える患者に影響を及ぼす（１）。ＨＮＳＣＣの標準治療選択肢は、化学療法の有無にかかわらず、手術および／または放射線療法である。しかしながら、がん治療の進歩にもかかわらず、ＨＮＳＣＣ患者の５年生存率は過去数十年にわたり有意に改善していない。ＨＮＳＣＣは早期Ｔ期においてもリンパ系転移を伴うリンパ節転移（ＬＮＭ）率が高く、ＬＮＭの制御はＨＮＳＣＣ治療における最も重要な予後因子の１つであることはよく知られている（２）。しかし、cN0症例では、現時点でも予防的頸部郭清術を選択すべきか、また経過観察とするかの判断は難しく、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波検査、または陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を含む現在のイメージング技術は、潜在的頸部リンパ節転移を検出するのに十分な信頼性がない（３）。
　センチネルリンパ節ナビゲーション手術（ＳＮＮＳ）は、ＳＮＮＳが、頭頸部外科医にとって、不要な頸部郭清術を回避し、ＨＮＳＣＣのcＮ０症例における後発リンパ節における術後再発率を減少させるのに非常に有用であることが最近報告されている（４－７）。インドシアニングリーン（ＩＣＧ）によるリアルタイムの近赤外イメージングを使用するＳＮＮＳが一般的だが、主な欠点は、リンパ管を通したＩＣＧの移動が急速であり、診断時間ウィンドウとともに下流リンパ節の検出に制限があることである。我々は最近、ＩＣＧ－ｐｈｙｔａｔｅコロイド混合物の新規技術により、診断時間ウィンドウを延長し、下流のリンパ節検出を防止し、真のセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）の検出精度を改善できることを報告した（８）。このような状況において、ＨＮＳＣＣの原発病変に対する低侵襲性臓器温存手術として、経口的顕微鏡下レーザー手術（ＴＬＭ）（９）、経口的ロボット手術（ＴＯＲＳ）（１０）、または経口的内視鏡下咽喉頭部分切除術（ＴＯＶＳ）（１１－１５）等が世界的に普及してきている。これらの経口的腔外科的処置とＳＬＮの微小転移を標的とする新規の低侵襲治療との組合せは、最小限の低侵襲性術式の選択を可能とし、それによって、術後の再発率を低減し、ＨＮＳＣＣ患者の生存率を改善することになる。
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　本発明が解決しようとする課題は、高ステージになるに従って治癒が難しくなる癌を制御することである。ステージが進んだ癌では癌細胞が原発巣から游走し、臓器組織に定着し、成長するいわゆる転移がみられる。癌種に限らず、転移は癌の予後を決める最も重要な要素の一つであり、原発巣と異なり、転移巣の数の多さや大きさの点から外科的に完全に切除することは非常に困難である。従って、転移を制御できれば、予後の改善に大きく貢献することになる。
　本発明が解決しようとする課題となる転移は、原発巣からリンパ節への多発転移と、原発巣から肺や骨、肝臓や腹腔など他臓器・器官へ転移する遠隔転移があり、前者は、外科的なリンパ節郭清術による治療が主体であり、後者は化学療法が主体となるが、どちらも制御しきれない場合が多く、重要な予後因子となっている。本発明となる癌抑制組成物は、原発巣内に投与すると、所属リンパ節のうち特に直接つながっているセンチネルリンパ節に移行し、リンパ節転移を制御する技術である。また同様に原発巣の抑制効果を狙い原発巣内に投与すると、抗腫瘍免疫誘導することにより、遠隔転移に対する抗腫瘍効果が得られる。原発巣に腫瘍溶解性センダイウイルスを投与することにより、腫瘍溶解を引き起こし、抗腫瘍免疫を誘導、遠隔転移巣に対する抗腫瘍効果を誘導し、遠隔転移巣を縮退させる技術である。
　リンパ節転移は原発巣に直結するリンパ節（センチネルリンパ節、SLN）を通って多次的に起こるとされており、センチネルリンパ節転移を抑制することが二次以降のリンパ節転移を抑制することにつながる。多くの場合リンパ節転移がある場合は、原発巣とともに切除する（リンパ節郭清）ことが多い。本発明は、センチネルリンパ節（ＳＬＮ）転移に対する抗腫瘍効果をもつバイオナイフ（登録商標）と呼ばれる組換えセンダイウイルスベクター（ｒＳｅＶ）である。我々の発明では、バイオナイフ（登録商標）が原発巣よりＳＬＮに移行し、その遺伝子の発現により、がん細胞上にウイルス由来の融合蛋白質の蓄積が起こり、その蛋白質は癌細胞の特異的プロテアーゼにより活性化され隣接する癌細胞との細胞融合を誘発する。これによりＳＬＮ転移巣の抑制を示すことを明らかにした。この発明は、バイオナイフ（登録商標）によるＨＮＳＣＣ原発巣の遺伝子治療が同時にＳＬＮ標的療法となり、臨床的Ｎ０症例の予防的選択的頸部郭清に代わる低浸襲的に抑制できる可能性を示唆している。
　頭頸部扁平上皮癌の予後はさらにリンパ節以外への遠隔転移によっても大きく左右される。遠隔転移の抑制あるいは、遠隔転移巣治療がなされれば予後改善が期待される。
　腫瘍溶解性センダイウイルスベクターを原発巣に投与することにより、がん細胞の転移と同様に原発巣からセンチネルリンパ節に移動し、抗腫瘍効果が発揮される。
　上記の目的を達成するために本発明に係るｕＰＡ発現ステージにおける転移癌の溶解に用いられる癌の治療組成物は、センダイウイルスのゲノムＲＮＡを含む複合体からなり、前記複合体は、腫瘍内投与により、腫瘍からのリンパ節への転移および遠隔転移癌の成長の抑制、リンパ節転移巣の縮退を促進するため、前記ゲノムＲＮＡは、Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ、改変Ｆ蛋白質であって該蛋白質の開裂部位の配列が野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを含むとともに、センダイウイルスの野生型Ｆ蛋白質をさらに含み、前記複合体は、ｕＰＡ発現ステージにおけるウロキナーゼ（ｕＰＡ）によって活性化する構成である。
　また、前記複合体は、複合体が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有しており、宿主内（感染細胞内）環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しているとともに、前記プロテアーゼの存在に依存して、該複合体が導入された細胞と接触する細胞に、該ＲＮＡを導入する能力を有する構成である。
　また、前記プロテアーゼは、癌で特異的に発現するプロテアーゼである構成である。
　また、前記プロテアーゼは、細胞外マトリクス分解酵素である構成である。
　また、前記プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼまたはプラスミノーゲンアクチベーターである構成である。
　また、前記治療組成物は、腫瘍内投与により、腫瘍からのセンチネルリンパ節への転移を抑制する構成である。
　更に、前記治療組成物は、腫瘍内へ投与することによって、抗腫瘍免疫を惹起させる構成でもある。
　センチネルリンパ節に移動し、がん細胞特異的に転移巣を死滅させる。
　原発巣を溶解させ、癌関連抗原を放出させることにより、抗腫瘍免疫を惹起し遠隔転移巣を退縮させる。
　本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変され、特定のプロテアーゼ存在下でのみ周囲の細胞に浸潤するとともに、腫瘍内投与により、腫瘍からのリンパ節への転移および遠隔転移癌の成長の抑制、リンパ節転移巣の縮退を促進することを可能とした細胞融合型ベクターを提供する。
　センダイウイルスを含むパラミクソウイルス科ウイルスは、そのエンベロープに２つの蛋白を有している。Ｆ（ｆｕｓｉｏｎ）蛋白質はウイルスとその宿主である細胞とを膜融合をさせ、ヌクレオカプシドを細胞質へ放出させる。ＨＮ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）蛋白質は赤血球凝集能とのノイラミナーゼ活性をもち、宿主レセプターへ結合する役割を果たす。Ｆ蛋白質およびＨＮ蛋白質はスパイク蛋白質とも呼ばれ、ウイルスのエンベロープ表面に露出している。またＭ（ｍａｔｒｉｘ）蛋白質はエンベロープを裏打ちし、ウイルス粒子に強固さを付与している。このベクターの特徴は広範な細胞と動物組織に高効率で遺伝子導入可能で、かつ既存のベクターと比較し、高い発現量を実現していることである。
　Ｆ蛋白質（Ｆ０）はそのままでは細胞融合活性を示さず、宿主由来のプロテアーゼにより開裂してＦ１とＦ２に分解されることによってはじめてその融合活性を示すようになる。従って、野生型のＦ蛋白質を持つウイルスの増殖は、この蛋白質を開裂できるｔｒｙｐｓｉｎ様のプロテアーゼを発現する気道粘膜上皮などの組織に制限されてしまう。パラミクソウイルスではＦの改変による感染のトロピズムもしくは融合能の改変についての様々な研究がなされている。ＳｅＶでは、α－キモトリプシンでのみ開裂するＦを持つ変異体がトリプシン感受性を失い、そのトロピズムがＦの開裂配列特異的に変わることが示されている（Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３（Ｐｔ　６），１５７５－１５７９）。Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ、Ｍｅａｓｌｅｓ　ｖｉｒｕｓでは、Ｆの開裂配列を改変し、そのシンシチウム形成能がトリプシン依存的に変わることを示している（Ｌｉ，Ｚ．ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，３７８９－３７９５；Ｍａｉｓｎｅｒ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，４４１－４４９）。
　このように、Ｆの開裂配列を改変することにより、あるプロテアーゼを発現する特定の組織等にベクターを感染および増殖させることが可能となると考えられる。しかし、パラミクソウイルスベクターが持つ問題点の１つに、標的細胞へのベクター導入後に起こる細胞からのウイルスの２次放出がある。複製型ウイルスを感染させた細胞ではビリオンが形成され娘ウイルスが放出されるため、標的組織以外にもウイルス粒子が拡散する。上述のように野生型Ｆ蛋白質を持つウイルス粒子はトリプシン様酵素の非存在下では感染性を示さないものの、ウイルス粒子自身は細胞から放出される。生体内投与においては、血中に拡散したウイルスが全身に到達することも懸念される。さらに、複製能を持たないＦ遺伝子欠損ＳｅＶ（Ｌｉ，Ｈ．Ｏ．ｅｔ　ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，６５６４－６５６９；ＷＯ００／７００５５；ＷＯ００／７００７０）を導入した細胞等からもウイルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ　ｌｉｋｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）の放出が観察されている。このような２次放出粒子は、標的とする組織以外への感染や免疫反応を誘発することが懸念される。
　本発明者らは、ウイルスエンベロープ遺伝子の中で、Ｍ遺伝子を欠損するパラミクソウイルスは、粒子形成が起こらないが感染細胞とそれに接した細胞が融合することによってシンシチウムを形成し、細胞融合型の感染をすることを見出している（ＷＯ００／０９７００）。これらのＭ欠損型ウイルスは、導入細胞において複製され、トリプシン存在下で隣接する細胞に伝達される。しかしながら、この現象はＦが開裂して活性化する条件においてのみ起こる現象であり、野生型Ｆ蛋白質を持つウイルスではｔｒｙｐｓｉｎ様のプロテアーゼがない状態ではウイルスの伝達は起きない。本発明者らは、このＭ欠損型ウイルスにおいてＦ蛋白質のトロピズムを改変すれば、２次放出粒子を産生せず、特定の組織でのみ感染を広げられる新規なベクターを開発できるのではないかと考えた。
　Ｍ欠損型ウイルスは粒子形成に必要なＭ遺伝子を欠損しているため、通常ウイルス粒子は放出しないか極度に抑制されている。複製能を持つ組み換えウイルスの産生に用いる通常の再構成法（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．、１９９６，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１：５６９－５７９）を用いた場合、Ｍ欠損型ウイルスのＲＮＰを調製することはできるが感染性ウイルス粒子は製造できない（ＷＯ００／０９７００）。実際の癌治療薬としてＭ欠失型ベクターを利用するためには、Ｍ欠失型ウイルスを感染性ウイルス粒子として調製できれば極めて有用である。そこで本発明者らは、Ｍ欠失型ウイルスをウイルス粒子として調製するための新たな製造方法の開発を行った。
　本発明者らはまず、ＶＬＰ放出が抑制されたベクターを構築するための一つの解決法として、ウイルス遺伝子の温度感受性変異の利用を考えた。低温で生育するが高温では増殖できない幾つかの変異型ウイルスが報告されている。本発明者らは、特に高温でのビリオン形成が抑制されるような変異蛋白質、特にＭ蛋白に変異を有するものを利用すれば、低温で（例えば３２℃）ウイルス生産を行い、遺伝子治療等の実応用時はそれよりは高温（例えば３７℃）で行うことにより、ＶＬＰ形成を抑制できる可能性があると考えた。この目的のために、本発明者らはＭ蛋白質およびＨＮ蛋白質で報告されている、それぞれ３つ、計６つの温度感受性変異を持つ変異ＭおよびＨＮ蛋白質をコードするＦ遺伝子欠損型の組み換えセンダイウイルスベクターを構築した。このウイルスのＶＬＰ放出を調べたところ、野生型ウイルスに比べ約１／１０またはそれ以下であることが判明した。さらに、ＶＬＰ放出が抑制されたセンダイウイルスベクターを導入した細胞におけるＭ蛋白質の局在を、抗Ｍ抗体を利用した免疫染色により解析した結果、野生型ウイルスを導入した細胞では見られる細胞表面のＭ蛋白質の凝集が、ＶＬＰ放出抑制型ウイルスの場合は有意に減少しており、特に高温（３８℃）においてＭ蛋白の濃縮像が極端に減少していた。温度感受性変異Ｍ遺伝子を含むこのＳｅＶを感染させた細胞におけるＭ蛋白質およびＨＮ蛋白質の細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡により詳しく調べたところ、低温（３２℃）においても細胞表面でのＭ蛋白の局在は有意に低下しており、微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）の形態に近い形で観察された。さらに、高温（３７℃）ではＭ蛋白は微小管の中心体付近（すなわちゴルジ体付近）に局在して存在していた。
　微小管脱重合剤を添加すると、温度感受性Ｍ遺伝子を持つＳｅＶのみならず、野生型M遺伝子を持つＳｅＶにおいても、Ｍ蛋白質の局在構造が破壊されたことから、Ｍ蛋白質は実際に微小管に沿って局在して機能している可能性が高いと判断された。以上の知見から、温度感受性変異導入ウイルスで二次放出粒子が減少しているのは、粒子形成の中心的な役割を担っていると考えられているＭ蛋白の細胞内局在の不全であると断定された。従って、Ｍ蛋白質の正常な細胞内局在を妨げることにより、ＶＬＰの形成を効果的に抑制することができると考えられる。また、Ｍ蛋白質の機能には微小管との相互作用が重要であり、例えばＭ蛋白質がゴルジ体から微小管に沿って細胞内移動することを阻害するような遺伝子変異や薬剤を開発することにより、Ｍ蛋白の細胞内局在の不具合を生じさせ、結果的に二次放出粒子の減少を達成することが可能と判断される。すなわち本発明者らは、Ｍ蛋白質の局在に欠陥を生じさせるような変異を有するウイルスベクターを調製することによって、粒子形成能が低下または消失した組み換えウイルスベクターを得ることができることを見出した。
　また本発明者らは、Ｍ遺伝子をウイルスから欠失させることによって、ウイルスを導入した細胞におけるＭ蛋白質の細胞表面の凝集が完全に欠如したウイルスの構築を試みた。この目的のために、本発明者らはＭ遺伝子欠失型ウイルスの生産に利用可能な野生型Ｍ蛋白質を誘導的に発現させることができるヘルパー細胞を構築した。この細胞を利用することにより、野生型Ｍ蛋白質を含むエンベロープに、Ｆ改変型のＭ遺伝子欠損ウイルスのRNPが包まれたウイルス粒子を回収することに初めて成功した。本発明の方法により１×１０８ＰＦＵ／ｍｌ以上の濃度でウイルス粒子を製造することが可能となり、臨床を含む実用に耐える組み換えウイルスを初めて提供することが可能となった。また本発明のウイルス製造系は、他のウイルスの混入を否定できる安全性の高い高タイターの遺伝子治療用ベクターの生産を可能にする。Ｍ発現細胞を利用してＭ蛋白質をトランスに供給する、本発明のＭ欠失型ＳｅＶ生産システムにおいて初めて、実用に適したＦ改変型Ｍ欠失型のパラミクソウイルスが提供された。
　本発明者らは、上記のように構築した感染性ウイルス粒子を用いて、実際の抗腫瘍効果をｉｎ　ｖｉｖｏにおいて検証した。癌細胞を移植したマウスに対して、この癌で活性が亢進するマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）で活性化されるＭ欠失型ウイルスを投与したところ、細胞融合型の感染を通して癌組織内にウイルスが広がることが確認された。野生型ウイルスを投与した癌では、数日後でもウイルスは注入部位に限定されていたのに対し、本発明のベクターでは癌組織に対して強い浸透力を示し、癌全体にベクターの広がりが認められた。ウイルス未投与または野生型ウイルスを投与した対照に比べ、癌の増殖に対する抑制効果は明白であった。これまでにもレトロウイルスにおいてＭＭＰ発現細胞を標的とするベクターが作製されているが、本発明とは認識配列のデザインが全く異なっている。また、これらの報告は癌組織への特異的な感染、則ちターゲッティングのみを目的としたものであり、癌組織で特異的に（細胞間で）感染が広がり治療効果を発揮するベクターである。
　さらに本発明者らは、ウイルス粒子産生時にプロテアーゼの添加を制御することにより、ウイルス表面のＦ蛋白質が開裂されていないウイルス粒子（Ｆ非開裂型ウイルス）を調製することに成功した。このウイルスは、そのままでは感染性を持たないが、ウイルス表面のＦ蛋白質を開裂するプロテアーゼで処理するか、あるいは該プロテアーゼ存在条件下で細胞に添加することにより、特異的に感染能を示すことができた。このような潜在感染型ウイルスベクターにより、特定のプロテアーゼを産生する癌細胞に特異的にベクターを感染させることが可能となった。
　このように本発明は、癌などの特定の組織で発現するプロテアーゼ存在下でのみ感染を広げるベクターを提供する。本発明のベクターはウイルス様粒子を有意に産生せず、細胞融合により隣接する周囲の細胞にベクターを伝達する。特に癌で活性が亢進するプロテアーゼで感染性を獲得する本発明のベクターは、腫瘍増殖に対する強い抑制作用を持っており、このベクターを用いた癌の遺伝子治療は極めて有効と考えられる。
　すなわち本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変された細胞融合型ベクターに関し、より具体的には
〔１〕ｕＰＡ発現ステージにおける転移癌の溶解に用いられる癌の治療組成物が、センダイウイルスのゲノムＲＮＡを含む複合体からなり、前記複合体は、腫瘍内投与により、腫瘍からのリンパ節への転移および遠隔転移癌の成長の抑制、リンパ節転移巣の縮退を促進するため、前記ゲノムＲＮＡは、Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ、改変Ｆ蛋白質であって該蛋白質の開裂部位の配列が野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを含むとともに、センダイウイルスの野生型Ｆ蛋白質をさらに含み、前記複合体は、ｕＰＡ発現ステージにおけるウロキナーゼ（ｕＰＡ）によって活性化する癌の治療組成物、
〔２〕前記複合体は、複合体が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有しており、宿主内（感染細胞内）環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しているとともに、前記プロテアーゼの存在に依存して、該複合体が導入された細胞と接触する細胞に、該ＲＮＡを導入する能力を有する癌の治療組成物、
〔３〕前記プロテアーゼは、癌で特異的に発現するプロテアーゼである癌の治療組成物、
〔４〕前記プロテアーゼは、細胞外マトリクス分解酵素である癌の治療組成物、
〔５〕前記プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼまたはプラスミノーゲンアクチベーターである癌の治療組成物、
〔６〕前記治療組成物は、腫瘍内投与により、腫瘍からのセンチネルリンパ節への転移を抑制する癌の治療用組成物、
〔７〕前記治療組成物は、腫瘍内へ投与することによって、抗腫瘍免疫を惹起させる癌の治療組成物、に関する。
　本発明においてセンダイウイルスとは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスまたはその誘導体を指すパラミクソウイルスに包含されるウイルスである。パラミクソウイルスは、非分節型ネガティブ鎖RNAをゲノムに持つウイルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（パラミクソウイルス属（レスピロウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）を含む。
　本発明におけるセンダイウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
　また、本発明において、組み換え蛋白質および組み換えウイルスとは、それぞれ組み換えポリヌクレオチドを介して生成した蛋白質およびウイルスを言う。組み換えポリヌクレオチドとは、自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖がつなぎ替えられたり、あるいは合成されたポリヌクレオチドなどが含まれる。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換え蛋白質は、蛋白質をコードする組み換えポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成することができる。
　本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、ＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸が含まれる。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするＯＲＦをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。
　本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変された複製能を有する細胞融合型ベクターを提供する。
　本発明のベクターは、具体的には以下の複合体を言う。
　ｕＰＡ発現ステージにおける転移癌の溶解に用いられる癌の治療組成物であって、センダイウイルスのゲノムＲＮＡを含む複合体からなり、前記ゲノムＲＮＡは、Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ、改変Ｆ蛋白質であって該蛋白質の開裂部位の配列が野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを含むとともに、センダイウイルスの野生型Ｆ蛋白質をさらに含み、前記複合体は、ｕＰＡ発現ステージにおけるウロキナーゼ（ｕＰＡ）によって活性化する。この複合体は、腫瘍内投与により、腫瘍からのリンパ節への転移および遠隔転移癌の成長の抑制、リンパ節転移巣の縮退を促進する。
　この複合体は、ゲノムＲＮＡを複製しそれを隣接細胞に導入する働きを有することから、本発明においてベクターとも呼ぶ。ベクターとは、核酸を細胞に導入する担体を言う。上記複合体は、具体的には該パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡとこれに結合するウイルス蛋白質を含む複合体である。本発明の複合体は、例えばパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡとウイルス蛋白質からなる複合体、すなわちリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）であってよい。ＲＮＰは、例えば所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて細胞に導入することができる。このようなＲＮＰは、具体的にはパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡ、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質を含む複合体である。ＲＮＰは細胞内に導入されると、ウイルス蛋白質の働きによりゲノムＲＮＡからウイルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、ゲノム自身が複製され娘ＲＮＰが形成される。ゲノムＲＮＡの複製は、該ＲＮＡのコピー数の増加をＲＴ－ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーション等により検出することにより確認することができる。
　また上記複合体は、より好ましくはパラミクソウイルスのウイルス粒子である。ウイルス粒子とは、ウイルス蛋白質の働きにより細胞から放出される、核酸を含む微小粒子を言う。ウイルス粒子の形状はウイルスの種類により球状、棍棒状など様々であってよいが、細胞より十分に小さく、その大きさは通常１０ｎｍ～８００ｎｍ程度である。パラミクソウイルスのウイルス粒子は、ゲノムＲＮＡとウイルス蛋白質を含む上記ＲＮＰが細胞膜由来の脂質膜（エンベロープという）に含まれた構造をしている。ウイルス粒子は、感染性を示すものでも示さないものでもよい。例えば、そのままでは感染性を示さないが、特定の処理により感染性を獲得するような潜在的に感染性を有するウイルス粒子であってもよい。
　またパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡとは、パラミクソウイルスのウイルス蛋白質と共にＲＮＰを形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、該核酸が複製して娘ＲＮＰが形成される機能を持つＲＮＡを言う。パラミクソウイルスは一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスであるので、このようなＲＮＡは搭載遺伝子をアンチセンスとしてコードしている。一般にパラミクソウイルスのゲノムは、３’リーダー領域と５’トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のＯＲＦの間には、転写終結配列（Ｅ配列）－介在配列（Ｉ配列）－転写開始配列（Ｓ配列）が存在し、これにより各遺伝子のＯＲＦをコードするＲＮＡが別々のシストロンとして転写される。
　本発明のベクターに含まれるゲノムＲＮＡは、該ＲＮＡにコードされる遺伝子群の発現およびＲＮＡ自身の自律的な複製に必要なウイルス蛋白質であるＮ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、およびＬ（ラージ）をアンチセンスにコードしている。また該ＲＮＡは、隣接細胞への該ＲＮＡの伝播に必要な細胞膜融合を起こす蛋白質であるＦ（フュージョン）蛋白質をアンチセンスにコードしている。好ましくは、ゲノムＲＮＡはさらにＨＮ（ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ）（またはＨ）蛋白質をアンチセンスにコードしている。但し、ある種の細胞では感染にＨＮ蛋白質は必要なく、Ｆ蛋白質のみで感染が成立する。また、細胞に結合し得るＨＮ以外の蛋白質をＦ蛋白質と組み合わせてベクターを感染させることができる。従って、ＨＮ遺伝子をコードしないゲノムＲＮＡを用いても、本発明のベクターを構築することは可能である。
　例えばパラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、Ｎ遺伝子は“ＮＰ”と表記されることもある。
　　レスピロウイルス属　　ＮＰ　　Ｐ／Ｃ／Ｖ　　Ｍ　　Ｆ　　ＨＮ　－　　　Ｌ
　　ルブラウイルス属　　　ＮＰ　　Ｐ／Ｖ　　　Ｍ　　Ｆ　　ＨＮ　（ＳＨ）　Ｌ
　　モービリウイルス属　　ＮＰ　　Ｐ／Ｃ／Ｖ　　Ｍ　　Ｆ　　Ｈ　　－　　　Ｌ
　例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のレスピロウイルス（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、Ｎ遺伝子については、ＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｘ７５９６１；ＨＰＩＶ－１，Ｄ０１０７０；ＨＰＩＶ－２，Ｍ５５３２０；ＨＰＩＶ－３，Ｄ１００２５；Ｍａｐｕｅｒａ，Ｘ８５１２８；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７２；ＭＶ，ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ０６４０９１；ＰＤＰＲ，Ｘ７４４４３；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｘ０００８７；ＳＶ５，Ｍ８１４４２；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｐ遺伝子については、ＣＤＶ，Ｘ５１８６９；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ－１，Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ－３，Ｘ０４７２１；ＨＰＩＶ－４ａ，Ｍ５５９７５；ＨＰＩＶ－４ｂ，Ｍ５５９７６；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７３；ＭＶ，Ｍ８９９２０；ＮＤＶ，Ｍ２０３０２；ＰＤＶ，Ｘ７５９６０；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｍ３０２０２；ＳＶ５，ＡＦ０５２７５５；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｃ遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ－１．Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ－３，Ｄ０００４７；ＭＶ，ＡＢ０１６１６２；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，ＡＢ００５７９６；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｍ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ１２６６９；ＤＭＶ　Ｚ３００８７；ＨＰＩＶ－１，Ｓ３８０６７；ＨＰＩＶ－２，Ｍ６２７３４；ＨＰＩＶ－３，Ｄ００１３０；ＨＰＩＶ－４ａ，Ｄ１０２４１；ＨＰＩＶ－４ｂ，Ｄ１０２４２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７１；ＭＶ，ＡＢ０１２９４８；ＮＤＶ，ＡＦ０８９８１９；ＰＤＰＲ，Ｚ４７９７７；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｍ３４０１８；ＳｅＶ，Ｕ３１９５６；およびＳＶ５，Ｍ３２２４８、Ｆ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ２１８４９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０４；ＨＰＮ－１．Ｍ２２３４７；ＨＰＩＶ－２，Ｍ６０１８２；ＨＰＩＶ－３．Ｘ０５３０３，ＨＰＩＶ－４ａ，Ｄ４９８２１；ＨＰＩＶ－４ｂ，Ｄ４９８２２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１６９；ＭＶ，ＡＢ００３１７８；ＮＤＶ，ＡＦ０４８７６３；ＰＤＰＲ，Ｚ３７０１７；ＰＤＶ，ＡＪ２２４７０６；ＲＰＶ，Ｍ２１５１４；ＳｅＶ，Ｄ１７３３４；およびＳＶ５，ＡＢ０２１９６２、ＨＮ（ＨまたはＧ）遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ１１２１８９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０５；ＨＰＩＶ－１，Ｕ７０９４９８；ＨＰＩＶ－２．Ｄ０００８６５；ＨＰＩＶ－３，ＡＢ０１２１３２；ＨＰＩＶ－４Ａ，Ｍ３４０３；ＨＰＩＶ－４Ｂ，ＡＢ００６９５４；Ｍｕｍｐｓ，Ｘ９９０４０；ＭＶ，ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ２０４８７２；ＰＤＰＲ，Ｚ８１３５８；ＰＤＶ，Ｚ３６９７９；ＲＰＶ，ＡＦ１３２９３４；ＳｅＶ，Ｕ０６４３３；およびＳＶ－５，Ｓ７６８７６が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
　これらのウイルス蛋白質のＯＲＦは、ゲノムＲＮＡにおいて上記のＥ－Ｉ－Ｓ配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムＲＮＡにおいて最も３’に近いＯＲＦは、３’リーダー領域と該ＯＲＦとの間にＳ配列のみが必要であり、ＥおよびＩ配列は必要ない。またゲノムＲＮＡにおいて最も５’に近いＯＲＦは、５’トレイラー領域と該ＯＲＦとの間にＥ配列のみが必要であり、ＩおよびＳ配列は必要ない。また２つのＯＲＦは、例えばＩＲＥＳ等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら２つのＯＲＦの間にはＥ－Ｉ－Ｓ配列は必要ない。野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なＲＮＡゲノムは、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をアンチセンスにコードする６つのＯＲＦが順に並んでおり、それに続いて５’トレイラー領域を他端に有する。本発明のゲノムＲＮＡにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウイルスと同様に、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、（Ｍ、）Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をコードするＯＲＦが順に並び、それに続いて５’トレイラー領域が配置されることが好ましい。ある種のパラミクソウイルスにおいては、ウイルス遺伝子は６つではないが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とするか、あるいは適宜変更することができる。
　Ｍ蛋白質のＯＲＦについては後述するが、本発明のベクターの１つの態様においては、このＯＲＦは存在しないか、あるいは変異Ｍ蛋白質をコードしている。また本発明のベクターの１つの態様においては、ゲノムにコードされるＦ蛋白質の開裂部位は、野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に改変されている。本発明のゲノムＲＮＡは、１つまたはそれ以上の外来遺伝子をコードすることができる。外来遺伝子としては、標的とする細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子の導入位置は、例えばゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位に挿入することができ、例えば３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間、各ウイルス蛋白質ＯＲＦの間、および／または５’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦと５’トレイラー領域の間に挿入することができる。Ｍ遺伝子を欠失するゲノムでは、その欠失領域に挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が６の倍数となるように挿入することが望ましい。挿入した外来遺伝子とウイルスＯＲＦとの間には、Ｅ－Ｉ－Ｓ配列が構成されるようにする。あるいは、ＩＲＥＳを介して外来遺伝子を挿入してもよい。
　また本発明のベクターは、例えばウイルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意のウイルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えばパラミクソウイルスベクターにおいては、複製因子であるＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、Ｆ蛋白質も、開裂部位以外のドメインも改変することにより、膜融合能および/または粒子形成能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質やＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウイルスベクターを作製することもできる。
　また好ましい態様において、本発明の複合体は実質的に均一な複合体である。実質的に均一な複合体とは、該複合体が、本発明の複合体ではないパラミクソウイルスのＲＮＰまたはウイルス粒子から分離されていることを言う。すなわち実質的に均一な本発明の複合体は、粒子形成能を有する他のパラミクソウイルスＲＮＰも該ウイルスのウイルス粒子も含んでいない。ここで粒子形成能とは、ウイルスベクターを感染させた細胞において、感染性ウイルス粒子および/または非感染性ウイルス粒子（これをウイルス様粒子という）を放出（これを２次放出という）するベクターの能力を言う。また、Ｆ蛋白質の開裂部位が改変された本発明の複合体においては、野生型Ｆ蛋白質またはこれと同等の融合活性を有するＦ蛋白質をコードする遺伝子をゲノムに含むウイルスＲＮＰも該ゲノムを含むウイルス粒子も含んでいない。
　本発明の一態様においては、上記ゲノムＲＮＡにコードされるＦ蛋白質は、該蛋白質の開裂部位の配列が、他のプロテアーゼによって開裂される配列に置換されている。パラミクソウイルスのＦ蛋白質（Ｆ０）は、そのままでは細胞膜融合活性を示さないが、F0断片の細胞外ドメイン（またはウイルス粒子外ドメイン）が開裂することによってその融合活性を示すようになる。開裂により生じた２つのＦ蛋白質断片はＮ末側がＦ２、およびＣ末側がＦ１と呼ばれ両者はジスルフィド結合により結合している。Ｆ蛋白質を開裂するとは、このように膜上のＦ蛋白質を膜の外側のドメインにおいて切断し、細胞融合能を獲得させるような断片を生じさせることを言う。開裂部位の配列とは、プロテアーゼによる開裂のために必要なアミノ酸配列またはその中の本質的な残基を言う。パラミクソウイルスのＦ蛋白質の開裂部位は知られており、それらは細胞内のｆｕｒｉｎ等のトリプシン様プロテアーゼにより切断される。
　ｆｕｒｉｎは、ほとんどの細胞のゴルジ体に普遍的に存在する。ｆｕｒｉｎの認識モチーフは、Ａｒｇ－Ｘ－Ｌｙｓ／Ａｒｇ－Ａｒｇ（ＲＸＫ／ＲＲ）（“／”で区切られた２つのアミノ酸はどちらかであることを表す）である。病原性の高い、Ｈｕｍａｎ　ＰＩＶ３（ＲＴＫＲ）、ＳＶ５（ＲＲＲＲ）、Ｍｕｍｐｓ　ｖｉｒｕｓ（ＲＨＫＲ）、ＮＤＶ（ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎ）強毒株（ＲＱＲ／ＫＲ）、Ｍｅａｓｌｅｓ　ｖｉｒｕｓ（ＲＨＫＲ）、ＲＳ　ｖｉｒｕｓ（ＲＫＲＲ）などは開裂部位にこれらのモチーフの配列を持っている。強毒株のＦは、すべての細胞に存在するプロテアーゼに感受性をもち、どの臓器でもＦの開裂を伴って多段階増殖するため、感染が致命的になってしまう。一方、病原性の低い、Ｓｅｎｄａｉ　ｖｉｒｕｓ（ＰＱＳＲ）、ＨｕｍａｎＰＩＶ１（ＰＱＳＲ）、ＮＤＶ（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎ）弱毒株（ｋ／ＲＱＧ／ＳＲ）ではこのモチーフに当てはまらず、セリンプロテアーゼ認識配列であるＡｒｇのみ持っている。
　また開裂部位は、当該パラミクソウイルスが増殖可能な細胞、組織、または個体等で増殖させたウイルスのＦ蛋白質、あるいは該細胞または個体等でＦ蛋白質を発現させ回収したＦ蛋白質の開裂部位を同定することにより確認することができる。また、細胞表面に発現するＦ蛋白質を、この蛋白質の開裂部位を開裂するトリプシン等のプロテアーゼで処理することにより、人為的にＦ蛋白質を開裂させ同定することもできる。本発明の一態様においてＦ蛋白質は、Ｆ蛋白質開裂部位のアミノ酸配列が改変され、他のプロテアーゼにより開裂されるような配列となっている。このためには、Ｆ蛋白質の生来の開裂配列を、１またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入により改変し、他のプロテアーゼにより開裂されるような配列に再構築する。アミノ酸配列の改変は、公知の部位特異的変異導入法により行うことができる。なお、改変Ｆ蛋白質は、野生型Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼ（トリプシン等）により開裂される性質が維持されていてもよい。このような改変Ｆ蛋白質をコードするベクターは、プロテアーゼ依存性トロピズムが野生型Ｆ蛋白質に比べて拡大される。
　他のプロテアーゼにより開裂される配列としては、所望のプロテアーゼにより開裂される配列であってよく、例えばベクター導入の標的としたい所望の組織または細胞で発現されるプロテアーゼにより開裂される配列を用いることができる（ＷＯ０１／２０９８９）。このように標的組織で活性があるプロテアーゼで開裂される配列を持つＦ蛋白質遺伝子を用いてベクターを設計することにより、このプロテアーゼ活性が存在する環境下で特異的に周囲の細胞にベクターを増幅し伝達するという優れた性質を実現させることができる。例えば、ある組織で特異的に発現または活性化されるプロテアーゼの切断配列を利用すれば、該組織内でのみ特異的に浸潤するベクターを構築することができる。また、ある状態、例えばある疾患で特異的に発現または活性化するプロテアーゼの切断配列を利用すれば、その状態でのみ（例えば特定の疾患領域内でのみ）特異的に浸潤するベクターを構築することができる。プロテアーゼは細胞内または細胞外に存在するものであってよく、例えば細胞外に分泌されるプロテアーゼや、膜表面に発現する膜型プロテアーゼなどが好適である。また、Ｆ蛋白質が細胞内において翻訳され、細胞表面に分泌されるまでの輸送経路上に存在する所望のプロテアーゼであってよい。
　本発明において特に好ましいプロテアーゼ開裂配列は、癌で活性が亢進するプロテアーゼの切断配列である。このような配列を利用してベクターを構築することにより、癌特異的に感染を広げるベクターを構築することが可能となり、癌治療用の遺伝子送達ベクターとして極めて有用となる。癌で活性が亢進するプロテアーゼとは、ある癌組織または癌細胞において、その癌に対応する正常組織または正常細胞と比べ活性が亢進しているプロテアーゼを言う。ここで活性の亢進は、プロテアーゼの発現レベルの亢進および／または活性自体の亢進であってよい。プロテアーゼの発現レベルは、該プロテアーゼの遺伝子断片をプローブにしたノーザンハイブリダイゼーション、該プロテアーゼ遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲ、あるいは該プロテアーゼに対する抗体を用いたウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降などにより測定することができる。またプロテアーゼの活性は、該プロテアーゼの基質を用いた分解アッセイにより知ることができる。生体内プロテアーゼは、種々の阻害因子により活性が調節されているものが数多く知られている。プロテアーゼの活性レベルは、これらの阻害因子の発現レベルを測定することによっても測定することができる。
　例えば細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）分解酵素の活性は、特に転移性の癌において活性が亢進している。動物においては、細胞間の隙間に、コラーゲンやプロテオグリカンなどの蛋白からなるマトリックスが形成されている。細胞外マトリックスの成分としては、具体的には、コラーゲン・フィブロネクチン・ラミニン・テネイシン・エラスチン・プロテオグリカンなどが知られている。これらのＥＣＭは、細胞の接着、進展、または移動等の機能を調節したり、可溶性因子を結合してその分布や活性を調節する機能等を有している。癌転移にはＥＣＭ分解酵素によるＥＣＭの浸潤が深く関わっており、実際ＥＣＭ分解酵素の阻害剤による転移または基底膜浸潤の阻害が多数報告されている。ＥＣＭ分解酵素による切断の認識配列を開裂部位に持つ改変Ｆ蛋白質をコードするベクターを設計することにより、癌特異的に感染および浸潤するベクターを構築することができる。
　ＥＣＭ分解酵素は、活性中心にある触媒残基の種類によってアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼに分類される。
　中でも生体内でのＥＣＭ分解には中性プロテアーゼのセリンプロテアーゼとメタロプロテアーゼが中心的な役割を果たしている。セリンプロテアーゼは、微生物、動物、植物等に広く分布し、高等動物においては、食物の消化、血液の凝固、線溶、免疫補体反応、細胞増殖、発生、分化、老化、癌転移などきわめて多くの生体反応に関与している。また、セリンプロテアーゼの活性は、一般に血漿や組織内に存在するセリンプロテアーゼインヒビター（ｓｅｒｐｉｎ）によって調節されており、この量的あるいは質的異常は炎症などの原因となる。
　ＥＣＭ分解性セリンプロテアーゼとしては、カテプシンＧ、エラスターゼ、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍トリプシン、キモトリプシン様中性プロテイナーゼ、トロンビンなどが挙げられる。プラスミンは、生体内で不活性な状態で存在するプラスミノーゲンが限定分解されて生じる。この限定分解をプラスミノーゲンアクチベーター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ；ＰＡ）とそのインヒビターであるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＡＩ）が制御している。ＰＡには、血液凝固に関係する組織型ＰＡ（ｔＰＡ）と、ＥＣＭ分解に関係するウロキナーゼ型ＰＡ（ｕＰＡ）とがある。これらの２つのＰＡは、ＰＡＩと結合するとその作用が阻害される。ｕＰＡは細胞表面のｕＰＡレセプター（ｕＰＡＲ）と結合した状態で作用することができる。プラスミンはフィブロネクチン、テネイシン、ラミニンなどを分解するが、コラーゲンは直接分解することができない。しかし、コラーゲン分解酵素の前駆体の一部を切断して活性化することにより、間接的にコラーゲンを分解する。これらが癌細胞においてしばしば活性が亢進しており、転移能ともよく相関している。
　ｕＰＡ，ｔＰＡの切断配列についての研究も多くなされている（Ｒｉｊｋｅｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，２９２０－２９２５；Ｗａｌｌｅｎ，Ｐ．ｅｔ　ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　７１９，３１８－３２８；Ｔａｔｅ，ｋ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６，３３８－３４３）。一般に用いられているｓｕｂｓｔｒａｔｅ配列はＶＧＲ（Ｄｏｏｉｊｅｗａａｒｄ，Ｇ．，ａｎｄ　ＫＬＵＦＴ，Ｃ．（１９８３）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５６，１１５－１２０）と、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓ－２２８８（Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ）（Ｍａｔｓｕｏ，Ｏ．ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３３，１０３１－１０３７）である。Ｂｕｔｅｎａｓは５４種類の蛍光基質を用いて、ｔＰＡに対する特異性の高い配列を提示し（Ｂｕｔｅｎａｓ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６，２１２３－２１３１）、ＦＰＲ，ＶＰＲが高いｔＰＡに対する分解活性を示した。従って、これらの配列は特に好適に用いられる。
　通常、組織内のＭＭＰ活性は、潜在型酵素の産生、その潜在型酵素の活性化、および活性型酵素のインヒビターによる阻害の過程で調節されており、発生排卵、受精、子宮内膜への着床、および創傷治癒などの様々な生理現象に関与している。ＭＭＰ活性の調節の障害は、癌細胞の浸潤・転移、関節炎、歯肉炎、動脈硬化、腫瘍、線維症などの様々な病態に寄与する。例えば、癌の転移には基底膜成分を分解するゼラチナーゼ（ＭＭＰ－２、－９）が重要であることが知られている。ＭＭＰ－２は、ＭＴ１－ＭＭＰによるｐｒｏ－ＭＭＰ－２の切断により活性化される。またＭＭＰ－９の活性化には、ｕＰＡによりまずプラスミノーゲンからプラスミンがつくられ、ｐｒｏＭＭＰ－３を活性化し、ａｃｔｉｖｅ　ＭＭＰ－３がｐｒｏＭＭＰ－９を活性化する経路が存在し、この経路は癌の転移に関与している。本発明のベクターを癌標的ベクターとして開発するためには、Ｆ蛋白質の開裂部位にこれらの癌転移に関与するプロテアーゼで切断される配列を導入することが特に有用である。このようなプロテアーゼとしては、例えばＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ｕＰＡ、ＭＭＰ－３、およびＭＴ１－ＭＭＰが挙げられ、特にＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、およびｕＰＡが挙げられる。
　プロテアーゼ切断配列をＦ蛋白質に組み込む場合は、Ｆ蛋白質の開裂部位に目的のプロテアーゼ切断配列を挿入し、もともとあるＴｒｙｐｓｉｎ様プロテアーゼによる切断部位をデジェネレートさせることが好ましい。このためにはもともとのＴｒｙｐｓｉｎ様プロテアーゼによる切断部位周辺のアミノ酸配列を、目的のプロテアーゼ切断配列（認識配列）に置換すればよい。改変Ｆ蛋白質は、細胞で発現したときに目的のプロテアーゼで切断され、かつＦ蛋白質の細胞膜融合作用を維持されている蛋白質である。F蛋白質が開裂して生じるＦ１断片のＮ末端付近のアミノ酸は、細胞膜融合に重要な機能を有していると考えられる。従って、切断が阻害されない限り、切断後のＦ１断片のＮ末端が、野生型Ｆ蛋白質のＦ１断片のＮ末端と同一となるように切断配列を設計することが好ましい。また効率的な切断反応を起こすために切断部位にリンカーを挿入する場合には、切断後のＦ１断片のＮ末端に、野生型Ｆ１と比べ最小限のアミノ酸が付加されるように設計することが望ましい。例えば、切断後のN末端には、野生型Ｆ１に比べ５アミノ酸以内、好ましくは４アミノ酸以内、より好ましくは３アミノ酸以内（例えば１、２、または３アミノ酸）が付加されるようにする。例えば本発明において、改変Ｆ蛋白質のＦ１断片のＮ末端にＭｅｔ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ（配列番号：１）を付加しても、ＭＭＰによる切断反応および切断後の細胞膜融合反応が障害されないことが判明した。従って、切断後のＦ１のＮ末端にＭｅｔ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒまたはその保存的置換配列、あるいはそれらの部分配列からなるアミノ酸が付加されるように開裂配列を設計することは好ましい。保存的置換とは、アミノ酸の側鎖の化学的性質が類似したアミノ酸間での置換を言う。具体的には、Ｍｅｔに関してはＩｌｅまたはＶａｌへの置換、Ｔｈｒに関してはＳｅｒまたはＡｌａへの置換、Ｓｅｒに関してはＡｌａ、Ａｓｎ、またはＴｈｒへの置換が挙げられる。各位置のアミノ酸の置換は独立に行ってよい。
　特定のプロテアーゼ存在下で融合能を発揮する改変Ｆ蛋白質を効率良く同定するために、プラスミドベクターを用いたアッセイ系を利用することができる。すなわち、改変Ｆ蛋白質を発現するプラスミドベクターを細胞にトランスフェクションし、プロテアーゼ存在下で培養してシンシチウム形成を検出する。シンシチウムを形成させるプラスミドにコードされる改変Ｆ蛋白質は、プロテアーゼにより開裂し融合能を示すと判断される。例えばＭＭＰにより開裂するＦ蛋白質をアッセイするには、ＭＭＰを発現するＨＴ１０８０細胞を用いることができる。あるいは、培養系にＭＭＰを添加してもよい。本発明において開発されたこのアッセイ系を用いれば、融合能を持った改変Ｆ蛋白質を容易に取得することが可能である。
　改変Ｆ蛋白質をコードするベクターは、該改変Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼの存在に依存して、該ベクターが導入された細胞と接触する細胞に、ベクターに含まれるゲノムＲＮＡを導入することができる。開裂したＦ蛋白質の働きにより、接触する細胞同士が細胞融合を起こし、融合した細胞にＲＮＰが拡散する。すなわち、本発明のベクターは、ウイルス粒子は形成しないが、このように接触する細胞にベクターが浸潤するために、限局した領域にベクターを伝達することができる。プロテアーゼは、細胞内または細胞外に発現するものであってもよく、あるいは外来的に添加されたものであってもよい。
　本発明により提供される改変Ｆ蛋白質は、特定のプロテアーゼに依存的に細胞融合能を示す能力を有する。この蛋白質を利用して、そのプロテアーゼ存在下でのみ細胞融合を生じさせる或いは特異的に感染するウイルスベクター、あるいはリポソームなどの薬剤・遺伝子送達ベクターを作り出すことができる。本発明により提供される改変Ｆ蛋白質およびこれをコードする核酸は、本発明のベクター以外にも、プロテアーゼに依存する種々のベクターの開発に利用することができる。
　また本発明は、細胞質ドメインの欠失により細胞融合能が高められた改変Ｆ蛋白質を含むパラミクソウイルスベクターを提供する。この改変Ｆ蛋白質は、細胞質ドメインに0個～28個、より好ましくは1～27個、より好ましくは4～27個のアミノ酸を有するように、細胞質ドメインの一部のアミノ酸を欠失させたF蛋白質である。細胞質ドメインとは、膜蛋白質の細胞質側のドメインであり、F蛋白質においては膜貫通（TM）領域のC末側領域である（図４２参照）。例えば、細胞質ドメインとして6～20個、より好ましくは10～16個、より好ましくは13～15個のアミノ酸を有するF蛋白質は、野生型F蛋白質に比べ有意に高い細胞融合能を示す。従って、約14アミノ酸の細胞質ドメインを有するように改変されたF蛋白質を含むパラミクソウイルスベクターを調製すれば、野生型F蛋白質を用いるよりも高い細胞融合能を持つベクターを得ることができる。好ましくは、この欠失F蛋白質は、野生型F蛋白質のC末端の10アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは15アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは20アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは25アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは28アミノ酸またはそれ以上を欠失している。最も好ましい態様では、細胞質ドメイン欠失型のF蛋白質は野生型F蛋白質のC末端の約28アミノ酸を欠失している。これらの細胞質ドメイン欠失型のF蛋白質をコードする遺伝子をゲノムに含むパラミクソウイルスベクターは、通常のベクターに比べ細胞融合能が高いことから、周囲の細胞へより強く浸潤することができる。このF蛋白質の開裂部位を本明細書に記載したように改変すれば、特定のプロテアーゼの存在下でのみ、高い浸潤力を発揮するベクターを得ることができる。
　さらに本発明は、パラミクソウイルスが持つ2種のスパイク蛋白質の融合蛋白質に関する。パラミクソウイルスには細胞融合を機能すると考えられる蛋白質（これをF蛋白質と呼ばれる）と、細胞への接着に機能すると考えられる蛋白質（HNまたはHなどと呼ばれる）を有している。本明細書において、前者をF蛋白質、後者をHN蛋白質と総称する。この２つの蛋白質を融合蛋白質として発現させると、別々に発現させる場合に比べ非常に強い融合能を発揮することができる。この融合蛋白質は、互いの細胞質ドメインの部分で両者の蛋白質が結合されている。具体的には、融合蛋白質のN末端側にF蛋白質を、C末端側にHN（またはH）蛋白質を含んでいる。両者の蛋白質を融合させる場合、全長蛋白質同士を融合させてもよいが、F蛋白質の細胞質ドメインの一部または全部を欠失させた蛋白質をHN（またはH）蛋白質に融合させてもよい。この場合、F蛋白質のTM領域の下流からHN（またはH）蛋白質までの長さを5残基以上、より好ましくは10残基以上、より好ましくは14残基以上、より好ましくは20残基以上とする。例えば、F蛋白質の細胞質ドメインを欠失させた蛋白質をHN（またはH）蛋白質に融合させる場合、F蛋白質部分のC末に適当な長さのリンカーペプチドを付加して長さを調節することは好ましい。具体的には、14残基のF蛋白質の細胞質ドメインを持つ細胞質ドメイン欠失型のF蛋白質に、任意のリンカーペプチドを介してHNまたはH）蛋白質に融合させた蛋白質を好適に用いることができる。リンカーペプチドの長さは、例えば約50残基とすることができる。
　本発明の一態様において提供されるベクターに含まれるRNAゲノムにおいては、M（マトリックス）蛋白質をコードする遺伝子（M遺伝子）が変異または欠損している。本発明において、F蛋白質の開裂部位を他のプロテアーゼで切断される配列に改変し、さらにM遺伝子を変異または欠失させて粒子形成能を抑制することによって、ウイルス粒子を放出せず、特定のプロテアーゼを発現する細胞集団内でのみベクターを浸潤させる全く新しい性質を持ったベクターが開発された。M遺伝子の変異は、宿主内環境における粒子形成活性を消失または有意に低下させる変異である。このような変異は、このM蛋白質を発現する細胞において、該蛋白質の細胞表面の凝集が低下することにより同定することができる。
　本発明により、２次放出粒子、即ちVLP放出の抑制を目的とした改変を行う場合、M蛋白を欠失させることが最も効果的であることが実証された。このことは、ビリオン形成におけるM蛋白の役割に関するセンダイウイルス（SeV）や他のマイナス鎖RNAウイルスにおける報告によっても支持される。例えば、vesicular stomatitis virus（VSV）ではM蛋白の強発現のみでウイルス様粒子（VLP:virus like particle）の発芽が観察されており（Justice,P.A.et al.,J.Virol.69;3156-3160（1995））、またParainfluenza virusの場合もM蛋白のみの強発現でVLPが生じることが報告されている（Coronel,E.C.et al.,J.Virol.73;7035-7038（1999））。このようなM蛋白単独でのVLP形成に関しては、全てのマイナス鎖RNAウイルスで観察されているわけではないが、M蛋白がビリオン形成のcoreになっていることは、マイナス鎖RNAウイルスで共通していると認識することができる（Garoff,H.et al.,Microbiol.Mol.Biol.Rev.62;1171-1190（1998））。
　野生型M蛋白質に比べ、細胞表面における凝集が有意に低下する変異M蛋白質は、粒子形成能が有意に低下していると判断される。ウイルスの粒子形成能の低下は、例えば統計学的に有意（例えば有意水準5%またはそれ以下の%値）に低下している。統計学的な検定は、例えばスチューデントのt検定またはマンホイットニーU検定などにより行うことができる。変異M遺伝子を持つウイルスベクターは、宿主内環境における粒子形成能が好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/30以下、より好ましくは1/50以下、より好ましくは1/100以下、より好ましくは1/300以下、より好ましくは1/500以下に低下している。本発明のベクターは、最も好ましくは宿主内環境におけるウイルス粒子の産生能が実質的に喪失している。実質的に喪失するとは、宿主内環境におけるウイルス粒子の産生が検出されないことを言う。このような場合、ウイルス粒子は103/ml以下、好ましくは102/ml以下、より好ましくは101/ml以下である。
　宿主内環境とは、対象とするベクターが由来するパラミクソウイルスの野生型が自然界において通常増殖する宿主内の環境またはそれと同等のウイルス増殖をもたらす環境を言う。宿主内環境は例えば該ウイルスの至適増殖条件であってよい。哺乳動物を宿主とするパラミクソウイルスであれば、哺乳動物生体内あるいはそれと同等の環境を言う。その温度は、哺乳動物体内に相当する約37～38℃（例えば37℃）である。インビトロであれば、通常の細胞培養条件、具体的には血清含有または非含有培地中（pH6.5～7.5）、37℃、5%CO2、湿環境下の培養環境が挙げられる。
　M遺伝子の温度感受性変異としては特に限定されるものではないが、例えばセンダイウイルスのM蛋白質のG69、T116、およびA183からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは任意に選択される２つ、さらに好ましくは３つすべてのアミノ酸部位、あるいは他の（-）鎖RNAウイルスM蛋白質のそれらと相同な部位に変異を含むものを好適に用いることができる。ここでG69とはM蛋白質の69番目のアミノ酸Gly、T116とはM蛋白質の116番目のアミノ酸Thr、A183とはM蛋白質の183番目のアミノ酸Alaを指す。
　アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などのグループに分類することができるが、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれは、酸性または中性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、20種の天然のアミノ酸の平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量より小さいアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それより大きいアミノ酸への置換などが挙げられるが、それに限定されない。例えばセンダイウイルスM蛋白質におけるG69E、T116A、およびA183Sからなる群より選択される変異あるいはそれらと相同な位置に変異を含む他のパラミクソウイルスのM蛋白質を用いることができる。ここでG69Eとは、M蛋白質の69番目のアミノ酸GlyがGluに置換された変異、T116Aとは、M蛋白質の116番目のアミノ酸ThrがAlaに置換された変異、A183Sとは、M蛋白質の183番目のアミノ酸AlaがSerに置換された変異を言う。すなわち、センダイウイルスM蛋白質のG69、T116、およびA183あるいは他のウイルスM蛋白質の相同部位を、それぞれGlu（E）、Ala（A）、およびSer（S）へ置換することができる。これらの変異は組み合わせて有していることが好ましく、特に上記３変異の全てを保持していることがより好ましい。M遺伝子への変異の導入は、公知の変異導入方法に従って実施することができる。例えば実施例に記載のように目的の変異を入れたオリゴヌクレオチドを用いて導入することが可能である。
　本発明のベクターは、さらに好ましい態様においてはM遺伝子を欠損している。M遺伝子の欠損とは、M遺伝子の機能が失われていることを言い、機能欠失型の変異を有するM遺伝子を持つ場合およびM遺伝子を欠失する場合を含む。M遺伝子の機能欠失型変異は、例えばM遺伝子の蛋白質コード配列を欠失させたり、他の配列を挿入することにより作製することができる。例えば、M蛋白質コード配列の途中に停止コドンを設計することができる（WO00/09700）。本発明のベクターは、最も好ましくはM蛋白質のコード配列を完全に欠失している。M蛋白質のORFを欠失したベクターは、条件的変異M蛋白質をコードするベクターとは違い、任意の条件においてウイルス粒子を形成する能力を失っている。
　リバース側合成DNA配列は5’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどのNotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴDNAを付加する。このオリゴDNAの長さは、E-I-S配列を含む最終的なPCR増幅産物のNotI断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「6のルール（rule of six）」；Kolakofski,D.et al.,J.Virol.72:891-899,1998;Calain,P.and Roux,L.,J.Virol.67:4822-4830,1993;Calain,P.and Roux,L.,J.Virol.67:4822-4830,1993）。このプライマーにE-I-S配列を付加する場合には、挿入断片ののオリゴDNA3'側にセンダイウイルスのS配列の相補鎖配列、好ましくは5’-CTTTCACCCT-3'（配列番号：８）、I配列の相補鎖配列、好ましくは5’-AAG-3'、E配列の相補鎖配列、好ましくは5’-TTTTTCTTACTACGG-3'（配列番号：９）、さらにその3’側に所望のcDNA配列の終始コドンから逆に数えて約25塩基相当の相補鎖の最後の塩基がGまたはCになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成DNAの3’の末端とする。
　PCRは、Taqポリメラーゼまたはその他のDNAポリメラーゼを用いる通常の方法を用いることができる。増幅した目的断片はNotIで消化した後、プラスミドベクターpBluescriptのNotI部位に挿入する。得られたPCR産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をNotIで切り出し、ゲノムcDNAを含むプラスミドのNotI部位にクローニングする。またプラスミドベクターを介さずにNotI部位に直接挿入し、組み換えセンダイウイルスcDNAを得ることも可能である。
　例えば、組み換えセンダイウイルスゲノムcDNAであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Yu,D.et al.,Genes Cells 2:457-466,1997;Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997）。例えば、NotI制限部位を有する18bpのスペーサー配列（5’-（G）-CGGCCGCAGATCTTCACG-3’）（配列番号：１０）を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムcDNA（pSeV（+））のリーダー配列とN蛋白質のORFとの間に挿入し、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand）由来の自己開裂リポザイム部位を含むプラスミドpSeV18+b（+）を得る（Hasan,M.K.et al.,1997,J.General Virology 78:2813-2820）。
　さらに、例えばM遺伝子を欠損させたり、あるいは温度感受性変異を導入する場合、ゲノムRNAをコードするcDNAを制限酵素で消化して、M遺伝子を含むフラグメントを回収し、適当なプラスミドにクローニングする。M遺伝子の変異またはM遺伝子欠損部位の構築はこのプラスミド上で行う。変異導入には、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene,La Jolla,CA）などを利用してKitに記載の方法に従って実施することができる。M遺伝子の欠損または欠失のためには、例えばPCR-ライゲーション方法の組み合わせで行い、M遺伝子のORF全部または一部を欠失させ、適宜適当なスペーサー配列で連結することができる。M遺伝子の変異体または欠失体が得られたら、これを含むフラグメントを回収し、もとの全長ゲノムcDNAのM遺伝子と置換することにより、M遺伝子に変異を持つウイルスゲノムcDNAを調製することができる。同様の方法で、例えばFおよび/またはHN遺伝子等に変異を導入することができる。
　ゲノムRNAをコードするDNAを、上記のウイルス蛋白質存在下で細胞内で転写させることにより、本発明のベクターを再構成することができる。本発明は、本発明のベクターの製造のための、本発明のベクターのウイルスゲノムRNAをコードするDNAを提供する。また本発明は、本発明のベクターの製造に適用するための、該ベクターのゲノムRNAをコードするDNAの使用に関する。マイナス鎖RNAウイルスのゲノムcDNAからのウイルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができるWO97/16539;WO97/16538;Durbin,A.P.et al.,1997,Virology 235:323-332;Whelan,S.P.et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8388-8392;Schnell.M.J.et al.,1994,EMBO J.13:4195-4203;Radecke,F.et al.,1995,EMBO J.14:5773-5784;Lawson,N.D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4477-4481;Garcin,D.et al.,1995,EMBO J.14:6087-6094;Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569-579;Baron,M.D.and Barrett,T.,1997,J.Virol.71:1265-1271;Bridgen,A.and Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:15400-15404）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖RNAウイルスまたはウイルス成分となるRNPをDNAから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のベクターを再構成させることができる。
　具体的な手順は、（ａ）上記パラミクソウイルスゲノムRNA（ネガティブ鎖RNA）またはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするcDNAを、N、P、およびL蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）該細胞またはその培養上清から該ゲノムRNAを含む複合体を回収する工程、により製造することができる。転写されたゲノムRNAはN、L、およびP蛋白質の存在下で複製されRNP複合体を形成する。工程（ａ）を、該ゲノムがコードする改変Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼの存在下で実施することにより、形成されたRNPが該細胞に接触する細胞へ伝達され、感染が広がりベクターが増幅する。この方法により、機能的なM蛋白質が存在しなくても、RNPの形態で本発明のベクターを製造することができる。
　特に本発明のベクターは癌の治療であって、特に腫瘍からのリンパ節への転移および遠隔転移癌の成長の抑制、リンパ節転移巣の縮退を促進することに対して有用である。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。また、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
　＜ヒト高度転移性舌扁平上皮癌細胞のインビトロにおけるバイオナイフ(BioKnife)に対する細胞障害性の確認＞ヒト高頻度転移性舌扁平上皮癌細胞、HSC-3-M3細胞に対するBioKnifeのインビトロ細胞傷害効果を評価するために、WST-8アッセイを実施した。図１に、インビトロでHSC-3-M3に対するBioKnifeの細胞傷害効果についての結果を示した。 HSC-3-M3をBioKnife（MOI 0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10）でインキュベートし、処理後96時間で細胞数を測定した。 BioKnifeは用量依存的に細胞死を誘導したが、BioKnifeの対照ウイルスとして用いたrSeV /ΔM-GFPは、BioKnifeよりも細胞毒性効果が有意に少なかった。我々は以前に、HSC-3-M3細胞系がuPAアッセイを用いてインビトロで高いuPA活性を有することを以前に報告している（19）。
　(ア) 5～8週齢の胸腺欠損BALB/c nu/nuマウスを20～25グラムの体重で用いて動物実験を行った。すべての動物処置は、メデトミジン（1.0mg/kg、腹腔内）および塩酸ケタミン（75mg/kg、腹腔内）の腹腔内（ip）注射またはイソフルランによる吸入麻酔による全身麻酔下で実施した。
　＜SLNへの転移確認＞
　ベクター投与前に、無胸腺nu/nuマウスを用いセンチネルリンパ節微小転移モデルの成立を確認した。ヒト高頻度転移性舌扁平上皮癌細胞HSC-3-M3をヒト高度転移性舌扁平上皮癌細胞HSC-3-M3を同所性、即ち、舌左側部縁部に1e5個の細胞を接種し、その2週間後に、HSC-3-M3がSLNに転移する頻度を評価した。SLN微小転移巣を確認するために、マウス（n=5）を屠殺し、SLNを解剖し、組織を10％ホルマリンで固定し、パラフィンブロックに包埋した。切片（厚さ5μm）をミクロトームを用いてスライスし、ヘマトキシリン - エオシン（HE）で染色した。転移率は、陽性転移個体（少なくとも1つの転移陽性リンパ節を有する動物）を有する動物の数を数えることによって評価した。その結果、HSC-3-M3接種2週間後、SLN転移モデルマウスの60％がSLN転移を検出した（データ未表示）。今回の結果は、HSC-3-M3接種の3週間後のマウスの90％がMatsuiらによって頸部リンパ節への転移が認められたという結果と一致した（20）。
　＜転移巣へのSeVベクターの移動＞
　：SLN微小転移巣への移動実験では、マウスを対照（n=5）およびrSeV/ΔM-GFP（n=5）の2つのグループに振り分けた。癌細胞接種後14日目に、ベクター投与群にはrSeV/ΔM-GFPを1e6CIU/20μl、対照群には、20μLのPBSを腫瘍原発巣内に投与を行った。 21日目に、動物を屠殺し、舌およびSLNを解剖し、以下に記載するように免疫組織化学的染色および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって評価した。
　免疫組織化学的染色：rSeVがSLNに移行し、その中のレポーター遺伝子のGFPを発現することを確認するために、GFP搭載rSeV腫瘍内注射の7日後に舌およびSLNを摘出し、凍結切片を作製した。抗GFP抗体のIHC染色を行ったところ、rSeVのSLNへの移動がGFPシグナルの蛍光イメージングによって明確に目に見えることを示した。対照群の舌とSLNは、rSeV /ΔM-GFP群に比べてGFPシグナルがほとんどないことが示された（図２A）。一方、図２Bは、SLNの周辺領域が、rSeV /ΔM-GFP群のSLNにおける中央領域よりも強いGFP発現を示す傾向があることを明示した。 ImageJによるGFP発現の定量的画像解析は、rSeV /ΔM-GFP群の蛍光強度が舌およびSLNの両方において対照群のそれより有意に高いことも明らかにした（p <0.05、図３A）。
　SeVおよびGFPの定量的RT-PCR：定量的RT-PCRによるSLNにおけるrSeVおよびGFPの導入遺伝子の発現を確認するために、PBS注射コントロールおよびrSeV /ΔM-GFP注射動物（各群でn = 5）の摘出した舌およびSLNを下記のように調製した。組織試料を小片（<25mg）に断片化し、RNAlater（登録商標）溶液（Applied Biosystems、Tokyo、Japan）に浸漬した後、 RNeasy Mini Kit（Qiagen、Valencia、CA）を用いてRNAを単離した。用いたプライマーはSeVは、SeVフォワード5'-AGAGAACAAGACTAAGGCTACC-3 'とSeVリバース5'-ACCTTGACAATCCTGATGTGG-3'を用い、GFPは、GFPフォワード5'-CGTCCAGGAGCGCACCATCTTC-3 'およびリバース5'-GGTCTTTGCTCAGGGCGGACT-3'を用いた。関連する分子のmRNAレベルは、Thermal Cycler DiceリアルタイムシステムII（Takara Bio、Shiga、Japan）においてOne Step SYBR PrimeScript RT-PCRキット（Takara Bio、Shiga、Japan）を用いて定量的RT-PCRによって測定した。結果、GFP標識rSeV投与7日後に摘出した舌およびSLNのRT-PCRでは、rSeV /ΔM-GFP群では、対照群の舌およびSLNと比較してGFPおよびSeVの相対的mRNA発現が有意に増加しており（p <0.05、図３Bおよび３C）、SLNへのSeVベクターの移動が確認できた（図３B）。癌における転移性センチネルリンパ節への移動リンパ管は、癌転移の主要経路であるが、逆に、治療薬、タンパク質、ウイルス、細胞などの治療薬の投与経路にも使用することができる。今回のベクターの移動も同経路と予想される。
　＜ヌードマウス舌がんモデルにおけるセンチネルリンパ節転移巣に対するバイオナイフの感染の証明＞
　ヒト高度転移性舌扁平上皮癌細胞HSC-3-M3を同所性癌にバイオナイフを３回投与しその７日後、舌およびSLNを摘出し、組織学的検査およびRT-PCRを実施した。抗SeV抗体のIHCにより、rSeV /ΔMおよびBioKnifeの腫瘍細胞への移動が、光学顕微鏡像によりはっきりと可視化された（図４Aの茶色の領域）。rSeV /ΔM-GFP群またはBioKnife投与群において、ベクター投与7日後に切除した舌およびセンチネルリンパ節は、対照群の舌、SLNと比較して、RT-PCRにおいて、GFPの相対的mRNA発現が有意に増加していた（p <0.05 、図４B）。これらの結果は、rSeV /ΔM-GFPおよびBioKnifeが、腫瘍内注射後にリンパ管を通ってSLNに移動し、癌細胞に選択的に感染することができることを示している。
　＜ヌードマウス舌がんモデルにおけるセンチネルリンパ節転移巣に対する抗腫瘍効果＞
　　前項のヒト高度転移性舌扁平上皮癌細胞HSC-3-M3を用いた同所性癌モデルにバイオナイフまたはrSeV /ΔM-GFPを３回投与し、その最終ベクター投与の７日後に摘出した舌およびSLNを HE染色し、顕微鏡で観察した。 rSeV /ΔM-GFPおよびBioKnife投与群では、転移陽性（動物あたり少なくとも1つの陽性リンパ節転移）および転移陽性リンパ節の数は対照群よりも有意に低かった。対照群で83.3％、rSeV /ΔM群で83.3％であったのに対し、BioKnife群では30.0％であった;図５A、対照群では42.9％、rSeV /ΔM群では27.8％ BioKnife群では11.6％であった[p <0.01];図５B）。舌腫瘍の大きさは、BioKnife群と対照群またはrSeV /ΔM群で有意に異なっていた（図５C）。しかし、我々は、腫瘍接種2週間後にSLNの60％に転移が発見されたことを確認した（データは示さず）。これは、BioKnifeがSLN中の腫瘍細胞を根絶したことが明らかであることを示している。 BioKnifeは、HNSCCの動物モデルにおけるリンパ節転移に対する有意な抗腫瘍効果を示した。
　＜マウス由来扁平上皮癌細胞担がんマウスにおける遠隔転移抑制＞
　マウス口腔底扁平上皮癌細胞株、SCCVIIを1e5個20μlのPBSに懸濁し、癌細胞と同系統のマウス（C３H／HeN）の口腔底に投与する。腫瘍接種後、２４、４８、７２、９６時間後にバイオナイフを接種箇所に注射する。最初の腫瘍接種の４日後に同一の細胞を1e5個２０μlのPBSに懸濁し、擬似遠隔転移巣として左胴部皮下に接種する。その後腫瘍径により腫瘍体積を計算する。（図６A）
　遠隔転移巣の退縮。原発巣に４回のバイオナイフを投与することにより、腫瘍の溶解が促進される。対象として投与した、PBSやM欠失SeVベクターの効果と比較して原発巣の成長抑制は腫瘍の成長速度が速いため有意差を示さなかったものの（図６Ｂ）、腫瘍溶解による抗腫瘍免疫の誘導により擬似遠隔転移巣の成長を有意に抑制した（図６Ｃ）。
　本発明により、Ｎ０期あるいは所属リンパ節転移のあるＮ１期の原発巣に対し、治療用組成物を用いれば、ＳＬＮへの転移を防ぎあるいは既に転移した転移巣を制御できる。これにより更なる多次リンパ節転移を防ぎ、予後の改善につながる。また、ネオアジュバント的なバイオナイフ投与によりリンパ節転移を抑制した後に、原発巣の外科的切除を行うことになればリンパ節郭清が不要となり、患者、術者への負担軽減につながる。
　本発明によりM期の原発巣に対す治療用組成物を用いた場合、骨転移、肺転移等の遠隔転移巣に対しても腫瘍抑制効果が波及することが期待される。
高度転移性のヒト舌扁平上皮癌細胞株HSC-3-M3に対するBioKnifeの細胞傷害性　HSC-3-M3細胞にGFP（rSeV /ΔM-GFP）または、BioKnife-GFPを感染させ、細胞生存をWST-8アッセイを用いて評価した。 MOI＝０におけるrSeV /ΔM-GFPの細胞傷害効果は0％とみなし、細胞傷害効果のパーセントを計算した。平均値の平均±標準誤差（SEM）、 統計的有意性は、p <0.05。 ヒト高度転移性舌扁平上皮癌細胞における転移性センチネルリンパ節へのrSeV /ΔM-GFPの移動（A）抗GFP抗体の免疫組織化学染色（IHC）は、SLNへのSeV移動が、GFPシグナルの蛍光イメージングによって明確に目に見えることを示した。 対照群の舌およびSLNは、rSeV /ΔM-GFP群のものに比べてGFP発現がほとんどない。 白いバーは20μmを表す。（B）抗GFP抗体の共焦点蛍光顕微鏡画像。SLNの末梢領域は、rSeV /ΔM-GFP群のSLNにおける中央領域よりも強いGFP発現を示す傾向がある。 白いバー＝200μm。 転移性センチネルリンパ節へのrSeV /ΔM-GFP移動の定量的測定（A）ImageJによる定量的GFP発現は、rSeV /ΔM-GFP群の蛍光強度が、舌およびSLNの両方において対照群のそれより有意に高いことを明らかにした（p <0.01、p <0.05）。定量的RT-PCRによる舌及び転移リンパ節におけるベクターの検出（B、C） rSeV /ΔM-GFP投与7日後の解剖された舌およびセンチネルリンパ節に対するRT-PCRは、舌およびSLNの対照群と比較して、rSeV /ΔM-GFP群で相対的なmRNA発現が有意に増加したことを示した （p <0.05）。rSeV /ΔM-GFP投与7日後の解剖された舌およびセンチネルリンパ節に対するRT-PCRは、舌およびSLNの対照群と比較して、SeVの相対mRNA発現がrSeV /ΔM-GFP群において有意に増加したことを示した （p <0.05）。 rSeV /ΔM-GFPの組織病理学的検査および定量的RT-PCRおよび転移性センチネルリンパ節へのBioKnife移動（A）同所性舌癌異種移植モデルにおいて、抗SeV抗体のIHCは、腫瘍細胞へのrSeV /ΔM-GFPおよびBioKnifeの移動が、光学顕微鏡画像（茶色の領域）によって明瞭に見えることを示した。 （B）ベクター投与の7日後に解剖された舌およびセンチネルリンパ節上のRT-PCRは、rSeV /ΔM-GFP群またはBioKnife群において、舌およびSLNの両方の対照群と比較してGFPの相対的mRNA発現が有意に増加したことを示した p <0.05）。 転移性センチネルリンパ節におけるBioKnifeの抗腫瘍効果　HE染色したSLNを顕微鏡で観察したところ、rSeV /ΔM-GFP群およびBioKnife群では、各群の陽性転移（動物1頭あたり少なくとも1つの陽性リンパ節転移）の動物数は、対照群では83.3％、rSeV /ΔM-GFP群では83.3％であったのに対して、BioKnife群では30.0％であった（p <0.05）。（B）HE染色したSLNを顕微鏡で観察したところ、各群の転移陽性リンパ節は対照群（コントロール群42.9％対rSeV /ΔM-GFP群27.8％対11.6％）よりもrSeV /ΔM-GFPおよびBioKnife群で有意に低かった（p <0.01）。 （C）舌腫瘍の大きさは対照、SeV /ΔM群とBioKnife群で有意に異なっていた。しかし、我々は、腫瘍接種2週間後にSLNの60％に転移が発見されたことを確認した（データは示さず）。これは、BioKnifeがSLNの腫瘍細胞を根絶したことが明らかであることを示している。 マウス由来扁平上皮癌擬似転移マウスモデルにおける擬似遠隔転移巣に対するBioKnifeの抗腫瘍効果。(A)プロトコールを示す。（B）および（C）原発巣に４回のバイオナイフを投与することにより、対照として投与したPBSやM欠失SeVベクターの効果と比較して、原発巣の成長抑制は腫瘍の成長速度が速いため有意差を示さなかったものの、腫瘍溶解による抗腫瘍免疫の誘導により擬似遠隔転移巣の成長を有意に抑制した。

Claims (9)

  1. 　転移癌の溶解に用いられる癌の治療組成物であって、センダイウイルスのゲノムＲＮＡを含む複合体からなり、
    　前記ゲノムＲＮＡは、Ｍ蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ、改変Ｆ蛋白質であって該蛋白質の開裂部位の配列が野生型Ｆ蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムＲＮＡを含むとともに、センダイウイルスの野生型Ｆ蛋白質をさらに含み、
    　前記複合体は、腫瘍内投与により、腫瘍からのリンパ節への転移および遠隔転移癌の成長の抑制、リンパ節転移巣の縮退を促進することを特徴とする癌の治療組成物。
  2. 　前記複合体は、複合体が導入された細胞内で該ゲノムＲＮＡを複製する能力を有しており、宿主内（感染細胞内）環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しているとともに、前記プロテアーゼの存在に依存して、該複合体が導入された細胞と接触する細胞に、該ＲＮＡを導入する能力を有することを特徴とする請求項１記載の癌の治療組成物。
  3. 　前記プロテアーゼは、癌で特異的に発現するプロテアーゼであることを特徴とする請求項１または請求項２記載の癌の治療組成物。
  4. 　前記プロテアーゼは、細胞外マトリクス分解酵素であることを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れかに記載の癌の治療組成物。
  5. 　前記プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはプラスミノーゲンアクチベーター、特にウロキナーゼ（ｕＰＡ）であることを特徴とする請求項１乃至請求項４の何れかに記載の癌の治療組成物。
  6. 　前記治療組成物は、腫瘍内投与により、腫瘍からのセンチネルリンパ節への転移を抑制する請求項１乃至請求項５の何れかに記載の癌の治療用組成物。
  7. 　前記治療組成物は、腫瘍内投与により、センチネルリンパ節へ転移した腫瘍即ち、リンパ節転移巣の成長を抑制し、リンパ節転移巣の治療にも効果的である請求項１乃至請求項５の何れかに記載の癌の治療用組成物。
  8. 　前記治療組成物は、腫瘍内へ投与することによって、抗腫瘍免疫を惹起させ、遠隔転移巣の成長抑制、治療に効果的であることを特徴とする請求項１乃至請求項６の何れかに記載の癌の治療組成物。
  9. 　前記転移癌が、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）発現ステージにある請求項１乃至請求項８の何れかに記載の癌の治療組成物。
     

     
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