WO2018208137A9 - 빌리루빈 유도체 및 금속을 포함하는 입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 빌리루빈 유도체 및 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자. 이의 용도 및 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 다양한 금속과 배위결합을 형성하므로 MR 진단, CT 진단, 광-음향 진단, PET 진단, 또는 광학진단에 사용할 수 있다. 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 플래티넘 계열의 항암제와 결합, 빛/활성산소 자극에 의하여 분해됨으로써 내부에 봉입한 항암제를 외부로 방출시킬 수 있으며, 항염증 및 항암활성을 나타내므로 진단과 동시에 치료용도로도 사용가능한 테라노스틱스 개념의 물질이다. 또한 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 활성산소종과의 반응성이 있으므로 활성산소종의 종류 및 농도를 검출하기 위한 조성물, 센서, 키트, 조영제 또는 장치로서도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

빌리루빈 유도체 및 금속을 포함하는 입자
본 발명은 대한민국 과학기술정보통신부의 지원 하에서 과제번호 2018M3A9B5023527에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리 전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "바이오·의료기술개발사업", 연구과제명은 "종양 미세환경 표적 및 감응형 약물전달 플랫폼 기술 개발", 주관기관은 한국과학기술원, 연구기간은 2018.04.01-2020.12.31 이다.
본 특허출원은 2017년 5월 12일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2017-0059597호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 빌리루빈 유도체 및 금속을 포함하는 입자, 이의 용도 및 제조방법에 관한 것이다.
금속-유기 배위 착물(metal-organic coordination complexes)로 구성된 자연적으로 발생하는 빌딩 블록은 오랫동안 과학적 영감의 원천이 되어왔다. 예를 들어, 특정 금속과 유기 리간드의 배위는 금속단백질(metalloproteins), 광합성(Mg(II)-porphyrin), 산소 수송 (Cu(II)-heme) 및 부착 (Fe(III)-phenolics)과 같은 생물학적 기능의 수행에 있어 결정적인 역할을 한다. 이러한 금속-유기 착물은 바이오의학 분야뿐만 아니라 센서, 분리 공정 및 촉매 작용을 포함한 화학 영역에서도 잠재력을 보여준다. 그러나, 그 적용범위는 독성 문제와 많은 시간이 소요되는 제조 단계로 인해 대단히 제한적이었다.
빌리루빈(Bilirubin)은 우리 몸의 헴(heme) 대사의 최종 대사 산물로서, 자연적으로 발생하는 금속-유기 배위 물질이다. 본 발명자들은 빌리루빈을 금속-유기배위 물질로 사용하고자 하는 본 발명의 전략에 있어서 담즙 배출 경로에서 발생하는 병리학적 현상인 담석 형성으로부터 힌트를 얻었다. 담석은 비정상적인 담즙 대사로 인해 담즙산이 금속과 결합하여 담관에 형성된 결석(calculus)이다. 빌리루빈은 담즙산으로 배설되는데, 담석 중에서 흑색담석(black pigmented gallstone)은 상기 담즙산에서 빌리루빈과 구리 및/또는 빌리루빈과 칼슘으로 이루어진 복합체의 최종 산물로 알려져 있다. 빌리루빈은 내재적으로 홀전자(unpaired electrons or nonbonding electron pair)를 가진 풍부한 작용기를 가지고 있기 때문에, 외부 링커 없이도 양이온 금속 이온과 반응하여 금속-유기 배위 착물을 만들 수 있다. 그러나, 빌리루빈은 매우 소수성을 띄기 때문에 용매에 잘 용해되지 않으므로 이를 화학적으로 이용하기는 쉽지 않았다.
본 발명자들은 상기 빌리루빈의 소수성으로 인한 적용상의 문제를 해결하고 다양한 용도로 적용하고자 빌리루빈과 친수성 고분자의 복합체로 이루어진 빌리루빈 나노입자를 개발하고 대한민국 등록특허 제10-1681299호로 등록받은 바 있으며, 상기 특허는 본 특허명세서에 참조로서 삽입된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 빌리루빈 유도체 및 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 영상진단용 조영제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 암의 치료 및 진단용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 염증성 질환의 치료 또는 진단용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 빌리루빈 유도체 입자의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 검출용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 검출용 센서 장치를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 빌리루빈 유도체 입자를 이용하여 활성산소종을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 하기 1 내지 17의 발명을 제공한다.
1. 빌리루빈 유도체 및 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자.
2. 1에 있어서, 상기 빌리루빈 유도체 입자는 빌리루빈 유도체와 상기 금속이 배위결합을 통해 구성된 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
3. 1에 있어서, 상기 배위결합은 빌리루빈 유도체의 카르복실기, 락탐기, 또는 피롤 링과 상기 금속 사이에 형성하는 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
4. 1 내지 3에 있어서, 상기 금속은 Cu, Ga, Rb, Zr, Y, Tc, In, Ti, Gd, Mn, Fe, Au, Pt, Pd, Ag, Co, Mn, Zn, Gd, Mo, Ni, Fe, Cr, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra 및 란탄족 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속의 이온 또는 금속 화합물인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
5. 1 내지 3에 있어서, 상기 금속은 초상자성 산화철 나노입자(SPION: superparamagnetic iron oxide nanoparticle)또는 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
6. 5에 있어서, 상기 빌리루빈 유도체 입자는 금속이 중심부에 위치하고, 상기 빌리루빈 유도체가 상기 금속의 주변을 둘러싸는 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
7. 6에 있어서, 상기 금속은 단일 금속입자 또는 군집 금속입자의 형태인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
8. 1 내지 3에 있어서, 상기 금속은 플래티넘(Pt) 이온 또는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 및 헵타플라틴(heptaplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 플래티넘 계열 항암제인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
9. 1 내지 3에 있어서, 상기 금속은 64Cu, 68Ga, 82Rb, 89Zr, 90Y, 99mTc, 111In, 및 201TI로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
10. 1 내지 9에 있어서, 상기 빌리루빈 유도체는 빌리루빈에 친수성 분자가 컨쥬게이션된 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
11. 10에 있어서, 상기 친수성 분자는 덱스트란 (dextran), 카르보덱스트란(carbodextran), 폴리사카라이드(polysaccharide), 사이클로덱스트란 (cyclodextran), 풀루란 (pluronic), 셀룰로오즈(cellulose), 녹말(starch), 글리코겐(glycogen), 카르보하이드레이트 (carbohydrate), 단당류 (monosaccharide), 이당류(bisaccharide) 및 올리고당류 (oligosaccharide), 폴리포스파젠 (polyphosphagen), 폴리락타이드(polylactide), 폴리락티드-코-글리콜라이드 (poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리안하이드라이드 (polyanhydride), 폴리말릭산 (polymaleic acid) 및 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트 (polyalkylcyanoacrylate), 폴리하이드로옥시부틸레이트(polyhydroxybutylate), 폴리카르보네이트 (polycarbonate), 폴리오르소에스테르 (polyorthoester), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine), 폴리글리콜라이드 (polyglycolide), 폴리메틸메타아크릴레이트 (polymetacrylate), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 폴리(아크릴산염)(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)(poly[vinylester]), 폴리(비닐알콜)(poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌(polystryene), 폴리옥사이드(polyoxide), 폴리일렉트로라이트(polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌)(poly[1-nitropropylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트)(Poly[beta-hydroxyethylmethacrylate]), 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethyleneoxide), 폴리(에틸렌옥시드-b-프로필렌 옥사이드(Poly[ethylene oxide-bpropyleneoxide]), 폴리라이신(Polylysine), 및 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
12. 11에 있어서, 상기 친수성 분자는 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol, PEG)인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
13. 12에 있어서, 상기 PEG는 메톡시 PEG(methoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드(succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드(succinimide of PEG butanoic acid), 가지 달린 PEG-HNS(branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트(PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드(succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트(benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르(PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸(PEGoxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트(PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드(PEGaldehyde), PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르(PEG succinimidyl carboxymethyl ester) 및 PEG 숙시니미딜에스테르(PEG succinimidyl ester)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
14. 12에 있어서, 상기 PEG의 평균 분자량은 200 내지 20000 Da인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
15. 1 내지 14 중 어느 하나의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 조성물.
16. 15에 있어서, 상기 조성물은 영상진단용 조영제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 16에 있어서, 상기 영상진단용 조영제 조성물은 자기공명 진단용, CT 진단용, PET 진단용 또는 광학진단용인 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 15에 있어서, 상기 조성물은 암의 치료용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
19. 18에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 직장암, 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
20. 15에 있어서, 상기 조성물은 염증성 질환의 치료 및 진단용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
21. 다음의 단계를 포함하는 금속 및 빌리루빈 유도체를 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조방법:
(a) 빌리루빈을 친수성 분자와 컨쥬게이션하여 빌리루빈 유도체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 빌리루빈 유도체와 금속을 배위결합하여 금속이 봉입된 빌리루빈 유도체 입자를 제조하는 단계.
22. 21에 있어서, 상기 (b) 단계는 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조방법:
(b-1) 빌리루빈 유도체로 이루어진 입자를 제조하는 단계; 및
(b-2) 빌리루빈 유도체로 이루어진 입자에 금속을 봉입하는 단계.
23. 21에 있어서, 상기 (b) 단계는 빌리루빈 유도체로 이루어진 입자가 제조됨과 동시에 금속이 봉입되는 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조방법.
24. 15에 있어서, 상기 조성물은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 검출용인 것을 특징으로 하는 조성물.
25. 24에 있어서, 상기 조성물은 조영제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
26. 24에 있어서, 상기 활성산소종은 수퍼옥사이드(O2 -), 과산화수소(H2O2), 히드록시 라디칼(hydroxyl radical, OH), 일중항산소(1O2 singlet oxygen), 유기히드로퍼옥시드(ROOH), 알콕시라디칼 ( RO ). 퍼옥시라디칼 ( ROO ) 또는 오존(O3), 및 이산화질소(NO2) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
27. 1 내지 14 중 어느 하나의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 검출용 센서 장치.
28. 다음 단계를 포함하는 활성산소종 검출방법:
(a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 현탁액을 활성산소종을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시료를 접촉하기 전후의 현탁액의 변화를 대조군과 비교 분석하는 단계.
29. 28에 있어서, 상기 (b) 단계의 현탁액의 변화는 빌리루빈 유도체 입자의 침전 여부, 파장에 따른 흡광도, 현탁액의 투명도, 현탁액 내 금속이온의 농도, 및 MRI 영상 시그널의 강도로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 1 내지 14 중 어느 하나의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 영상진단방법.
31. 1 내지 14 중 어느 하나의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법.
32. 1 내지 14 중 어느 하나의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료 및 진단방법.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 빌리루빈 유도체 및 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자를 제공한다.
본 발명자들은 인체에서 구리(Cu)와 유기 리간드인 빌리루빈 사이에 형성된 착물인 담석에서 힌트를 얻어, 빌리루빈의 배위결합 특성을 다양한 용도에 활용할 수 있는 나노입자를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 빌리루빈에 친수성 분자를 도입하여 수용성 빌리루빈 유도체와 이들이 자기 조립되어 형성된 빌리루빈 유도체 입자를 제작하였으며, 이들의 다양한 금속에 대한 킬레이션 효과 및 영상진단용 조영제, 염증성 질환 및 암 질환의 치료제로서의 활용가능성을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 상기 금속과의 배위결합을 통해 금속 착물(metal complex)을 형성한다.
본 발명의 상기 금속 착물(metal complex)이란 1개 또는 그 이상의 금속 원자나 이온을 중심으로 몇 개의 다른 이온분자, 또는 원자단 등이 방향성을 갖고 입체적으로 배위하여 하나의 원자집단을 이루고 있는 것을 말한다. 여기서 중심이 되는 금속 원자 또는 이온에 배위하고 있는 이온분자, 또는 원자단을 리간드라 부른다. 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자에서 빌리루빈 유도체는 리간드가 되며, 빌리루빈 유도체와 결합하는 금속은 중심 금속 이온이 된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 배위결합은 금속 이온과 빌리루빈 유도체의 카르복실 그룹, 피롤 링 혹은 락탐 그룹 간에 형성된다.
상기 배위결합이 형성될 수 있는 빌리루빈 분자 내의 위치를 표현하면 아래의 화학식 1에서 점선으로 이루어진 원으로 표시된 부분이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018005515-appb-I000001
본 발명의 일 구현예에 따르면, 배위결합을 통해 본 발명의 빌리루빈 유도체와 결합됨으로써 포함되는 금속은 Cu, Ga, Rb, Zr, Y, Tc, In, Ti, Gd, Mn, Fe, Au, Pt, Pd, Ag, Co, Mn, Zn, Gd, Mo, Ni, Fe, Cr, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra 및 Eu, Tb 등의 란탄족 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속의 이온 또는 금속 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 유도체는 SPION(superparamagnetic iron oxide nanoparticle) 및 금 나노입자(AuNP, gold nanoparticle)를 포함하는 다양한 금속 입자와 결합한다.
하기의 실시예에서 확인된 바와 같이 본 발명의 빌리루빈 유도체는 SPION(superparamagnetic iron oxide nanoparticle)과 결합하여 나노입자를 형성하며(도 6a 내지 6c), 상기 SPION 결합 빌리루빈 유도체 입자는 기존의 임상적으로 사용되는 T2 강조 MR 조영제인 페리덱스(Feridex)에 비하여 우수한 완화도(relaxivity)를 나타내는 바 MRI 조영 증강을 위한 조영제로서 유용하게 사용될 수 있다(도 7).
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 활성산소를 소거할 수 있다. 하기 실시예에서 확인된 바와 같이 본 발명의 SPION을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자는 활성산소종(ROS, reactive oxygen species) 발생제인 차아염소산염(hypochlorite) 처리에 반응하여 응집되므로(도 8), 염증조직의 활성산소를 소거함으로써 염증을 치료하는데 사용될 수 있다.
따라서 본 발명의 상기 빌리루빈 유도체 입자는 염증질환 치료용 약학적 조성물로도 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 상기 빌리루빈 유도체 입자는 대한민국 등록특허 제10-1681299호에 개시된 바와 같이 빌리루빈 유도체 입자 자체의 항암 작용, 혈관신생 억제 작용으로 인하여 암 질환 또는 혈관신생 질환 치료용 약학적 조성물로도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 빌리루빈 유도체 입자는 금속이 중심부에 위치하고, 상기 빌리루빈 유도체가 상기 금속의 주변을 둘러싸는 형태로 형성된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자는 여러 개의 금속입자가 군집(cluster)을 형성한 군집 금속입자 형태와 각각의 금속 입자가 단일하게 분포된 단일 금속입자 형태, 두 개의 구별된 입자 형태로 제조될 수 있다.
하기 실시예에서 확인된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자가 상기 두 가지 형태로 제조될 수 있는지 확인하기 위해 PEG-빌리루빈 코팅 산화철 나노입자를 구성하기 위해 두 가지 방법을 모두 적용하였다. 그 결과 본 발명자들은 TEM 이미지에서 PEG-빌리루빈 껍질을 사용하여 두 가지 유형의 입자들이 성공적으로 제조된 것을 확인하였다(도 6c).
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자에 포함되는 상기 금속은 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 및 헵타플라틴(heptaplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 플래티넘 계열 항암제이다. 하기의 실시예에서 확인된 바와 같이 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 시스플라틴을 효과적으로 로딩할 수 있었다(도 15). 상기 시스플라틴과 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자 간의 예상 결합 형태는 도 16과 같다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 플래티넘 계열 항암제를 포함하는 빌리루빈 유도체 입자는 빛, 활성산소 또는 산성 pH 자극에 의해 로딩한 항암제를 주위로 방출할 수 있다(도 17a 및 도 17b)
따라서, 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 상술한 빌리루빈 유도체 자체의 항암/혈관신생 억제작용 뿐만 아니라 상기 플래티넘 계열 항암제의 로딩 및 방출 특성으로 인하여 암을 치료하기 위한 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, “빌리루빈 유도체”는 빌리루빈의 친수성 분자와 컨쥬게이션(conjugation, 결합)되어 형성하는 친수성 또는 양친매성의 화합물을 의미한다. 본 발명의 빌리루빈 유도체는 금속성분과 배위결합을 형성하여 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자를 형성한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 친수성 분자는 빌리루빈의 카르복실기에 컨쥬게이션되어 친수성 또는 양친매성 빌리루빈 유도체를 형성한다(Amphiphiles: Molecular Assembly and Applications (ACS Symposium Series) 1st Edition by Ramanathan Nagarajan 및 Various Self-Assembly Behaviors of Amphiphilic Molecules in Ionic Liquids By Bin Dong and Yanan Gao, DOI:10.5772/59095 참조). 상기 빌리루빈의 카르복실기는 친수성 분자의 아민기와 아민 컨쥬게이션(ex. EDC/NHS 반응) 또는 친수성 분자의 히드록시기와 에스테르화 반응을 통하여 컨쥬게이션 된다(Conjugated Chitosan as a Novel Platform for Oral Delivery of Paclitaxel, Lee et al., J. Med. Chem., 2008, 51 (20), p.6442-6449, DOI: 10.1021/jm800767c 참조). 친수성 분자가 컨쥬게이션된 형태의 빌리루빈은 양친매성 성질을 가지므로, 수용성 용매에 용해가 가능하여 화학적으로 취급하기에 유용할 뿐만 아니라 자발적으로 자기 조립되어 입자를 형성하기 때문에 소수성 및 친수성 제제 모두에 대해 적용이 가능하다. 본 발명의 실시예에서 본 발명자들은 친수성 화합물인 PEG(Poly Ethylene Glycol)를 사용하여 카르복실산염에 아미드 결합을 형성하는 단순한 반능을 통하여 본 발명에 따른 빌리루빈 유도체로서 페길화 빌리루빈(PEG-BR, PEG-빌리루빈, Pegylated bilirubin)을 제조하였다.
본 발명에서 사용 가능한 친수성 분자로는 예를 들면, 덱스트란 (dextran), 카르보덱스트란(carbodextran), 폴리사카라이드(polysaccharide), 사이클로덱스트란 (cyclodextran), 풀루란 (pluronic), 셀룰로오즈(cellulose), 녹말(starch), 글리코겐(glycogen), 카르보하이드레이트 (carbohydrate), 단당류 (monosaccharide), 이당류(bisaccharide) 및 올리고당류 (oligosaccharide), 폴리포스파젠 (polyphosphagen), 폴리락타이드(polylactide), 폴리락티드-코-글리콜라이드 (poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리안하이드라이드 (polyanhydride), 폴리말릭산 (polymaleic acid) 및 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트 (polyalkylcyanoacrylate), 폴리하이드로옥시부틸레이트(polyhydroxybutylate), 폴리카르보네이트 (polycarbonate), 폴리오르소에스테르 (polyorthoester), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine), 폴리글리콜라이드 (polyglycolide), 폴리메틸메타아크릴레이트 (polymetacrylate), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 폴리(아크릴산염)(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)(poly[vinylester]), 폴리(비닐알콜)(poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌(polystryene), 폴리옥사이드(polyoxide), 폴리일렉트로라이트(polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌)(poly[1-nitropropylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트)(Poly[beta-hydroxyethylmethacrylate]), 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethyleneoxide), 폴리(에틸렌옥시드-b-프로필렌 옥사이드(Poly[ethylene oxide-bpropyleneoxide]) 및 폴리라이신(Polylysine) 등을 들 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체이다. 상기 폴리에틸렌 글리콜 유도체는, 예를 들면, 메톡시 PEG(methoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드(succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드(succinimide of PEG butanoic acid), 가지 달린 PEG-HNS(branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트(PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드(succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트(benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르(PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸(PEGoxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트(PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드(PEGaldehyde), PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르(PEG succinimidyl carboxymethyl ester) 및 PEG 숙시니미딜에스테르(PEG succinimidyl ester) 등을 들 수 있다(PEGylated polymers for medicine: from conjugation to self-assembled systems, Jorlemon et al., Chem. Commun., 2010, 46, 1377-1393 참조).
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량은 200 내지 20000 Da 이다.
본 발명에서 사용 가능한 친수성 분자의 또 다른 예로는, 2개 이상(예컨대 2-50개)의 아미노산으로 이루어진 펩티드 등이 있다. 상기 아미노산에는 천연형 아미노산뿐만 아니라, 비천연 아미노산도 포함된다. 친수성 아미노산에는 글루타민, 아스파라긴산, 글루탐산, 트레오닌, 아스파라긴, 아르기닌, 세린 등이 있으며, 소수성 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판, 이소류신, 류신, 프롤린, 메티오닌, 발린, 알라닌 등이 있다. 비코드화된 친수성 아미노산은, 예를 들어, Cit 및 hCys 등이 있다. 당업자는 이러한 정보와 펩타이드 합성기술을 바탕으로 친수성의 펩티드를 용이하게 합성하여 빌리루빈 나노입자의 제조에 사용할 수 있다.
상기 친수성 분자의 범위에는, 위에서 언급한 화합물뿐만 아니라, 이들의 유도체도 포함된다. 보다 구체적으로 상기 친수성 분자들은 아민 그룹 또는 히드록실 그룹을 가지거나, 아민 그룹 또는 히드록실 그룹을 가지도록 변형된 것일 수 있다. 이 경우 본 발명의 빌리루빈의 카르복실기가 상기 친수성 분자의 아민 그룹과 아마이드 결합을 통하여, 또는 히드록실 그룹과 에스테르화 반응을 통하여 매우 쉽게 컨쥬게이션 될 수 있음은 본 발명과 관련된 당업자에게 자명하다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 영상진단용 조영제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 영상진단용 조영제는 자기공명(MR, magnetic resonance) 진단용, 컴퓨터단층촬영(CT, computed tomography) 진단용, PET(positron emission tomography) 진단용, 또는 광학진단용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 광학진단용도는 광-음향 진단 및 형광이미지를 이용한 진단방법(용도)를 포함한다. 상기 광-음향 진단은 빌리루빈 유도체에 시스플라틴 금속을 결합시킴으로써 본 발명의 실시예를 통하여 검증한 바 있으며, 상기 형광이미지는 Eu(III) 및 Tb(III) 등 란탄족(lanthanide) 금속이 가진 형광특성을 이용하는 것으로, 상기 금속들에 빌리루빈 유도체를 결합시킴으로써 란탄족 금속이 가지는 형광 파장대 혹은 그 세기 등을 조절하여 란탄족 금속이 방출하는 형광을 검출함으로써 영상화가 가능하다.
구체적으로, 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자들은 외부 링커의 사용 없이 다양한 금속이온을 빌리루빈 유도체 내로 도입하여 핵의학 이미징(64Cu, 68Ga, 82Rb, 89Zr, 90Y, 99mTc, 111In, 201TI), MR 이미징(Gd, Mn, Fe) 및 CT 이미징(Au)에 적용할 수 있다. 특히, 종래의 자기공명영상 또는 컴퓨터단층촬영에서 사용되는 조영제는 외부 링커와 금속을 복합체에 제공하여 리간드를 조작하였으나, 본 발명의 빌리루빈 유도체는 별도의 링커가 없이도 빠르고 효과적으로 상기 금속과 결합이 가능하다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 암의 치료 및 진단용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 직장암, 및 자궁경부암일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 항-혈관신생 활성을 나타내어 암의 예방 및 치료에 이용할 수 있다. 구체적으로 상술한 시스플라틴 등의 플래티넘 계열 항암제를 로딩하는 빌리루빈 유도체 입자가 체내로 투여되는 경우, EPR 효과에 의해 종양 조직에서 축적되며, 이때 외부에서 종양 조직으로 빛을 조사하면, 빌리루빈으로 이루어진 소수성층이 친수성의 광이성질체를 포함하는 친수성층으로 변환되고, 이에 의하여 나노입자가 와해(붕괴)됨으로써 나노입자에 포함되어 있던 항암약물이 종양 조직으로 방출되어 암의 치료가 가능하다. 동시에, 나노입자로부터 분해된 모노머가 알부민과 결합하게 되어 종양 조직에서 형광이 방출되고, 이를 이용하여 종양 조직의 이미징이 가능하다.
하기 실시예에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 상기 빌리루빈 유도체는 64Cu, SPION(Superparamagnetic iron oxide nanoparticle), 금 나노입자(GNP, Gold Nanoparticle), 및 Ni, Mn, Gd, Mg, Ca, Fe 등의 금속 이온들, 그리고 플래티넘 계열의 항암제와 배위 착물을 효과적으로 형성하므로 다양한 금속의 킬레이션이 가능하며 다양한 용도로의 적용이 가능하다(도 5a 및 5b).
한편, 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 종양조직에 선택적으로 축적되며, 외부에서 특정파장의 빛 조사시 고열을 발생시키는 광열효과를 일으키므로 암 질환의 치료에 사용될 수 있다.
하기 실시예와 같이, 본 발명자들은 시스플라틴-빌리루빈 유도체 입자를 종양 이종 이식 모델의 마우스에서 생체 내 광-음향 이미징에 처음 적용한 결과, 정맥 내 주사 후 점차적으로 광-음향 신호가 증가되었고(도 18) 808 nm의 빛에 노출 후 5분 이내에 종양의 표면 온도가 55 ~ 60 ℃까지 급격히 상승하는 것을 확인함으로써 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 광-음향 이미징(photo-acoustic imaging) 뿐만 아니라 광열치료(photo-thermal therapy, PTT)에도 활용가능함을 확인하였다(도 19).
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 염증성 질환의 치료 및 진단용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 염증성 질환의 진단 및 치료를 위한 ROS 민감성 물질로서 활용될 수 있다. 구체적으로, 비경구적으로 체내로 투여된 빌리루빈 유도체 입자는 EPR 효과에 의하여 염증 부위를 타겟팅 할 수 있다.
또한, 빌리루빈 유도체 입자는 염증 부위에서 비정상적 수준의 활성산소를 소거함으로써 항염 활성을 나타낼 수 있으므로 염증의 치료가 가능하다.
본 발명이 적용 가능한 염증성 질환은, 예를 들면, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 죽상경화증, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 금속이온과 배위결합할 수 있다. 금속 이온과 배위결합한 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 차아염소산 등의 활성산소종과 반응하면 입자가 붕괴되면서 금속 이온을 방출한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 망간 이온(Mn2 +)과 배위 결합한 빌리루빈 유도체 입자는 차아염소산 등 활성산소종과 반응하여 망간 이온을 방출한다. 따라서, 빌리루빈 유도체에 배위되어 있을 때와 방출되었을 때의 망간 이온의 자기공명영상에서의 T1 값이 변하게 되어 MRI 영상 이미지의 명암이 차이가 나는데 이를 통하여 활성산소종의 검출이 가능하다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 약제학적으로 허용되는 담체가 포함된다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 가능하며, 예컨대 정맥 내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하투여 또는 국부투여될 수 있다. 또한, 그밖에도 경구투여, 직장투여, 흡입투여, 경비투여 등이 가능하다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 금속 및 빌리루빈 유도체를 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조방법을 제공한다:
(a) 빌리루빈을 친수성 분자와 컨쥬게이션하여 빌리루빈 유도체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 빌리루빈 유도체와 금속을 배위결합하여 금속이 봉입된 빌리루빈 유도체 입자를 제조하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 다음 단계를 포함할 수 있다:
(b-1) 빌리루빈 유도체로 이루어진 입자를 제조하는 단계;
(b-2) 빌리루빈 유도체로 이루어진 입자에 금속을 봉입하는 단계;
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 빌리루빈 유도체로 이루어진 입자가 제조됨과 동시에 금속이 봉입될 수 있다.
상기 본 발명의 빌리루빈 유도체와 금속을 포함하는 입자의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
(a) 빌리루빈을 친수성 분자와 컨쥬게이션하여 빌리루빈 유도체를 제조하는 단계
빌리루빈을 친수성 분자와 컨쥬게이션하여 친수성 내지는 양친매성의 빌리루빈을 제조한다. 구체적으로는 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 또는 EDC/NHS를 이용해 빌리루빈의 카르복실 그룹을 활성화시키고, 아민 그룹(-NH2)을 가지는 친수성 분자와 아마이드 결합을 통한 컨쥬게이션을 유도한다. 상기 빌리루빈과 컨쥬게이션되는 친수성 분자는 상술한 친수성 분자들로서 아민 그룹을 가지거나, 아민 그룹을 가지도록 변형된 것이다.
또는 상기 빌리루빈의 카르복실기는 친수성 분자의 히드록실기와 에스테르와(esterification) 반응을 통하여 컨쥬게이션 된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 빌리루빈을 유기용매(예컨대 디메틸설폭사이드, DMSO)에 녹이고, 빌리루빈에 존재하는 카르복실 그룹을 활성화시켜 원하는 반응을 유도하기 위하여 EDC를 첨가하고 상온에서 약 10분 간 반응시킨다. 그 후, 말단에 아민기를 가지는 친수성 분자(예컨대 폴리에틸렌 글라이콜)를 첨가하고, 일정 시간 반응시켜 친수성 분자가 컨쥬게이션 된 빌리루빈 유도체를 합성한다. 마지막으로 카르복실 그룹과 아민 그룹간의 반응으로 생성된 아마이드 본드를 가지는 최종 빌리루빈 유도체를 실리카 컬럼을 통해 부산물로부터 순수하게 분리 및 추출한다.
(b) 상기 빌리루빈 유도체와 금속을 배위결합하여 금속이 봉입된 빌리루빈 유도체 입자를 제조하는 단계
본 단계는 상기 (a) 단계에서 추출한 양친매성 빌리루빈 유도체(예컨대 페길화된 빌리루빈)를 다양한 금속 입자 또는 금속 이온과 배위결합을 유도하여 실제적으로 이용가능한 나노입자 형태로 만드는 단계이다. 하기 구체적인 제조방법은 예시적인 것일 뿐 본 발명의 범위에 이에 한정되는 것은 아니다.
(b-1) 상기 빌리루빈 유도체로 빌리루빈 나노입자를 제조하는 단계
구체적으로 친수성 분자가 컨쥬게이션된 양친매성 빌리루빈 유도체를 클로로포름 또는 디메틸설폭사이드 등의 유기용매에 용해시키고, 이를 질소 가스 조건 하에 건조시켜 리피드 필름 층을 만든다. 그 후, 제작된 빌리루빈 유도체의 리피드 필름 층을 수용액으로 수화시키게 되면, 자가조립된 빌리루빈 나노입자를 수득할 수 있다.
(b-2) 상기 빌리루빈 유도체로 이루어진 입자에 금속입자 또는 금속 이온을 봉입하는 단계
상기 (b-1) 단계에서 얻어진 빌리루빈 나노입자 수용액에 다양한 금속 입자 또는 금속 이온 수용액들을 섞어 반응을 시키면 킬레이터(chelator) 혹은 링커(linker) 등 다른 첨가물 없이도 원하는 금속이 빌리루빈 유도체에 봉입되거나 혹은 착물을 형성하게 된다. 반응하지 않은 금속 이온 등은 크기 배제 칼럼 혹은 투석을 통해 제거하여 최종적으로 원하는 반응물을 얻을 수 있다.
본 발명의 빌리루빈 유도체 입자에 금속을 봉입하는 단계 (b-2)는 상기 빌리루빈 유도체로 빌리루빈 나노입자를 제조하는 단계 (b-1)과 동시에 이루어질 수 있다.
즉, 빌리루빈 유도체의 리피드 필름 층을 수용액에 수화시켜 빌리루빈 나노입자를 제조(단계 b-1)한 후에 금속 이온 수용액을 혼합하여 반응(단계 b-2)시키지 않고, 빌리루빈 유도체의 리피드 필름 층에 곧바로 금속 이온 수용액을 혼합하면서 수화시키면 단계 (b-1)-(b-2)를 차례대로 수행하는 것과 마찬가지로 빌리루빈 유도체 입자에 금속 이온이 봉입된다. 그러나, 단계 (b-1)-(b-2) 를 차례대로 수행하여 빌리루빈 나노입자 수용액을 만든 후, 금속이온 수용액을 섞어 주어 착물을 만드는 편이 금속이온의 봉입효율의 면에서 우수하다.
금속 나노입자(예컨대, 철 나노입자 및 금 나노입자 등)에 빌리루빈 유도체를 코팅하는 방법은 금속 이온을 봉입하는 방법과 조금 다른 과정을 거친다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 유도체는 금속이온을 단일층으로 코팅한 입자를 형성할 수 있다.
구체적으로, 철 나노입자에 빌리루빈 유도체를 단일 층으로 코팅하는 방법은 상기 (b)과정에서 얻어진 빌리루빈 나노입자 수용액에 철 나노입자(SPION)이 용해되어 있는 헥세인(hexane) 용액을 넣어주게 되면, 물층과 유기용매 층의 경계부가 형성되고, 그 경계부에 소니케이터를 이용하여 인위적인 압력을 가하여 일정시간 두 층을 섞어주면 리간드 교환(ligand exchange) 방법을 통해 철 나노입자(SPION)에 원래 코팅되어 있던 올레산(oleic acid) 층이 떨어져 나가고, 그 대신 빌리루빈 유도체(예컨대 페길화된 빌리루빈)의 카르복실 그룹이 철 나노입자(SPION)의 코어 부분과 킬레이션 반응을 통해 금속 나노입자를 코팅하게 된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 유도체는 금속 입자 군집을 코팅한 입자를 형성할 수 있다.
구체적으로 유기용매(예컨대 클로로포름)에 녹인 빌리루빈 유도체(예컨대 페길화 빌리루빈)와 메탄올에 녹인 SPION 입자를 같이 섞은 후, 질소 가스 조건 하에서 상기 유기용매를 건조시키면 리피드 필름층이 생성된다. 생성된 리피드 필름층을 수화시키면 군집형태의 SPION 나노입자가 생성된다.
순수한 SPION 나노입자는 상기 각각의 과정을 거친 후에 자석을 이용한 magnet isolation 방법을 통해 최종적인 반응물을 분리할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 금 나노입자에 빌리루빈 유도체를 코팅하는 방법은 상기 (a) 단계에서 수득한 빌리루빈 유도체를 유기용매가 아닌 물에 녹인 후, 금 나노입자가 녹아져 있는 수용액과 바로 일정시간 반응을 시켜서 얻을 수 있으며, SPION과 비슷한 원리로 원래 금 나노입자를 코팅하던 구연산(citrate)을 대신하여 빌리루빈 유도체가 나노입자 코어 부분을 둘러싸면서 코팅을 하게 된다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 검출용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 활성산소종이란, 보통으로 존재하는 기저상태의 삼중항산소(3O2)보다 반응성이 크고 활성이 풍부한 산소종을 말한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 활성산소종은 수퍼옥사이드(O2 -), 과산화수소(H2O2), 히드록시 라디칼(hydroxyl radical, OH), 일중항산소(1O2 singlet oxygen)을 포함한다. 또한, 상기 활성산소종은 유기히드로퍼옥시드(ROOH), 알콕시라디칼 (RO). 퍼옥시라디칼 ( ROO ) 또는 오존(O3), 및 이산화질소(NO2)를 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 검출용 센서 장치를 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 검출용 센서 장치는 특별히 제한되지 않으며, 후술하는 바와 같이 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자와 활성산소종의 접촉으로 인한 물리-화학적 변화를 감지할 수 있는 당업계에서 사용되는 어떠한 장치라도 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 활성산소종 검출방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 현탁액을 활성산소종을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료를 접촉하기 전후의 현탁액의 변화를 대조군과 비교 분석하는 단계.
본 발명의 상기 활성산소종 검출방법을 단계별로 설명한다.
(a) 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 현탁액을 활성산소종을 포함하는 시료와 접촉시키는 단계
상기 단계는 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 현탁액(suspension)과 활성산소종을 검출하고자 하는 시료와 접촉시켜 현탁액 속의 빌리루빈 유도체 입자와 활성산소종을 반응시키는 단계이다. 본 발명의 빌리루빈 유도체는 활성산소종과 반응성이 있다. 따라서, 상기 현탁액 속의 빌리루빈 유도체가 시료 내부의 활성산소종과 접촉하면 활성산소와의 반응으로 인해 금속입자의 쉘(shell)을 이루던 빌리루빈 유도체가 금속입자로부터 탈락된다. 이로 인해 소수성을 가지는 금속입자들이 서로 만나 응집물(aggregate) 또는 침전물(precipitate)을 형성한다.
본 명세서에서 시료는 인간 또는 동물의 뇨, 타액, 혈액(혈장, 혈청, 혈구), 조직(간, 췌장, 피부 등 병변부의 조직)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 또한 활성산소종을 발생시키는 화합물을 포함하는 용액 등 기타의 물질을 포함한다.
(b) 상기 시료를 접촉하기 전후의 현탁액의 변화를 대조군과 비교 분석하는 단계
상기 단계는 빌리루빈 유도체가 시료 내의 활성산소종과의 반응으로 인해 나타나는 현탁액의 변화를 대조군과 비교 분석하는 단계이다. 상기 대조군은 활성산소종의 종류 및 농도 별로 i) 미리 측정되거나, 또는 ii) 상기 (a) 단계와 동시에 측정되는 활성산소종의 종류 및 농도에 따른 현탁액의 변화를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 (b) 단계의 현탁액의 변화는 빌리루빈 유도체 입자의 침전 여부, 파장에 따른 흡광도, 현탁액의 투명도, 현탁액 내 금속이온의 농도, 및 MR 영상 시그널의 강도를 포함하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 방법은 상술한 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자, 이를 포함하는 조성물 또는 장치를 공통적으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 영상진단방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료 및 진단방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적 또는 진단적 유효량을 상기 조성물을 필요로 하는 대상체(개체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
조성물의 "치료적 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다. 조성물의 "진단적 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 진단 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 함량을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "대상체"는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비(baboon) 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 영상진단방법, 암의 치료방법, 및 염증성 질환의 치료 및 진단방법은 본 발명의 일 양태인 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 각 용도의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 이들 사이에 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 금속을 포함하는 친수성 빌리루빈 유도체 입자, 이의 용도 및 제조방법을 제공한다.
(ii) 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 다양한 금속과 배위결합을 형성하므로 MR 진단, CT 진단, 광-음향 진단, PET 진단, 또는 광학진단에 사용할 수 있다.
(iii) 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 상기 진단용도 뿐만 아니라 빌리루빈 자체의 항산화 활성, 항암 활성으로 인해 항염증 활성 및 항암활성을 나타내므로, 염증성 질환이나 암 질환을 치료하는 치료용도로도 동시에 사용할 수 있는 테라노스틱스(theranostics)의 개념이다.
(iv) 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 빛 또는 활성산소 자극에 의해 분해됨으로써 내부에 봉입한 약물을 외부로 방출시킬 수 있다.
또한 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 활성산소종과의 반응성이 있으므로 활성산소종의 종류 및 농도를 검출하기 위한 조성물, 센서, 키트, 조영제 또는 장치로서 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자를 이용한 응용 방법의 예를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자의 제조과정 및 PET 이미징에 사용하기 위한 방사성 동위원소 64Cu를 이용한 표지절차를 나타낸 도이다.
도 3은 방사성 표지 효율을 최적화하기 위한 반응 조건을 확인하기 위하여 pH 및 온도에 따른 표지 효율을 나타낸 도이다.
도 4는 64Cu-빌리루빈 입자를 정맥내 주사 후 1, 3, 및 6시간 후의 PC-3 종양(노란 화살표) 보유 마우스의 대표적인 micro-PET 이미지를 나타낸 도이다(axial image, 상단; coronal image, 하단).
도 5a은 PEG-빌리루빈과 금속이온의 반응시 비색계 측정을 나타낸 것으로, 특정 금속 이온과의 반응 전 (상단)과 반응 후 (하단)의 빌리루빈 입자의 현탁액 사진이다.
도 5b는 PEG-빌리루빈과 금속이온의 반응시 비색계 측정을 나타낸 것으로, 특정 금속 이온과의 반응 전후 의 빌리루빈 입자의 현탁액에 대한 UV/Vis 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 6a는 PEG-빌리루빈을 이용한 철 산화물 기반 MR 프로브의 제작을 나타낸 도면으로, 1) 좌측의 지질막(lipid fim) 방법은 군집을 형성한 산화철이 중심에 자리하고, PEG-빌리루빈 층이 그 주변을 둘러싸는 형태의, 본 발명의 금속이 봉입된 빌리루빈 유도체 입자를 생성하고, 2) 우측의 초음파 처리(sonication) 방법은 PEG-빌리루빈 층으로 코팅된 단일 산화철 나노 입자를 생성한다.
도 6b는 PEG-빌리루빈과 초상자성 산화철의 배위결합 원리를 나타내는 도이다.
도 6c은 PEG-빌리루빈 쉘(shell)을 갖는 군집을 이룬 산화철 나노입자와(왼쪽) 및 단일 분포된 산화철 나노입자(오른쪽)를 나타내는 대표적인 TEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 7은 PEG-빌리루빈으로 코팅된 SPION의 특징을 나타내는 것으로, 수용액 상에서 PEG-빌리루빈으로 코팅된 SPION의 T2 강조 MR 팬텀 이미지와철 농도의 함수로서의 T2 이완 속도를 나타낸 도이다.
도 8은 PEG-빌리루빈으로 코팅된 SPION의 특징을 나타내는 것으로, ROS 자극 전 후의 PEG-빌리루빈으로 코팅된 SPION의 TEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 9a는 PEG-빌리루빈으로 코팅된 SPION의 특징을 나타내는 것으로, PEG-빌리루빈으로 코팅된 SPION의 ROS 농도에 따른 ROS-반응성을 순차적인 MR 팬텀 이미지로 나타낸 도이다.
도 9b은 PEG-빌리루빈으로 코팅된 SPION의 특징을 나타내는 것으로, PEG-빌리루빈으로 코팅된 SPION의 ROS 농도에 따른 T2 이완 값 변화 그래프이다.
도 10은 대식세포 내의 Nox 2 유전자의 대식세포 내 발현 정도를 RT_qPCR로 측정하여 나타낸 도이다.
도 11a는 ROS 생성 조건 하에서 PEG-DSPE 코팅 SPION과 PEG-BR SPION 처리 그룹간의 대식세포 탐식 정도를 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 마우스의 복강에서 채취한 대식세포들 대상으로 PEG-DSPE 코팅 SPION과 PEG-BR SPION 처리 그룹간의 대식세포 탐식 정도를 MRI 팬텀 실험으로 비교하여 나타낸 도이다.
도 12는 PEG-BR이 코팅된 금 나노입자를 활성산소종과 반응시 PEG-BR 코팅이 벗겨지고 금 나노입자들끼리 응집되면서 근적외선 영역(NIR region)에서 강력한 광열효과(photothermal effect)가 발생함을 나타내는 도이다.
도 13은 PEG-BR이 코팅된 금 나노입자를 이용한 쥐의 CT 영상 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 시스플라틴이 로딩된 빌리루빈 입자의 음으로 염색된(negatively stained) TEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 15는 시스플라틴 킬레이션을 나타낸 것으로, 일반 빌리루빈 입자(BRNP) 및 시스플라틴과 반응시킨 빌리루빈 입자(BRNP+Cisplatin)의 현탁액 사진(좌측) 및 UV/Vis 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 16는 PEG-빌리루빈 입자와 시스플라틴의 추정 반응 메커니즘을 나타낸 도이다.
도 17a 및 도 17b는 시스플라틴이 봉입된 PEG-빌리루빈 입자에서 여러 조건(pH, ROS) 및 시간에 따른 시스플라틴 방출양상을 나타낸 도이다..
도 18은 누드 마우스의 이종 이식 종양에 주사 후 시간에 따른 인 비보 광음향 이미지(photoacoustic image) 및 이에 상응하는 종양에서 픽셀 값의 반-정량 분석(semi-quantitative analysis)을 나타낸 도이다.
도 19는 800 mW/cm2의 출력 강도로 근적외선(NIR) 레이저에 노출된 종양 이종 이식 마우스의 서로 다른 시간 간격에서의 적외선 열화상 이미지를 나타낸 도이다.
도 20 및 도 21은 누드 마우스의 이종 이식 종양에 시스플라틴이 봉입된 PEG-빌리루빈 입자를 주사한 후 빛을 이용하여 광열 치료를 진행하고 기간별로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 본 발명의 페길화된 빌리루빈이 코팅된 철 나노 입자 수용액의 활성 산소종의 농도에 따른 변화를 나타낸 도이다.
도 23는 본 발명의 페길화된 빌리루빈이 코팅된 철 나노 입자 수용액의 활성산소종으로서 NaOCl의 농도에 따른 변화를 나타낸 도이다.
도 24는 본 발명의 페길화된 빌리루빈이 코팅된 철 나노 입자 수용액의 활성산소종으로서 AAPH(2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride)의 농도에 따른 변화를 나타낸 도이다.
도 25는 본 발명의 페길화된 빌리루빈이 코팅된 철 나노 입자 수용액의 활성산소종으로서 과산화수소수의 농도에 따른 변화를 나타낸 도이다.
도 26은 본 발명의 페길화된 빌리루빈이 코팅된 금 나노 입자(PEG-BR GNP)의 수용액을 각 종류의 활성산소종(H2O2, NaOCl, AAPH)과 반응시키기 전후의 용액의 육안상 변화를 나타낸 도이다.
도 27은 본 발명의 페길화된 빌리루빈이 코팅된 금 나노 입자(PEG-bilirubin gold nanoparticle)의 수용액을 각 종류의 활성산소종(H2O2, NaOCl, AAPH)과 반응시키기 전후의 용액의 흡광도 변화를 나타낸 도이다.
도 28은 본 발명의 페길화된 빌리루빈에 대한 대조군으로서 PEG-thiol 이 코팅된 금 나노 입자(PEG-thiol gold nanoparticle)의 수용액을 각 종류의 활성산소종(H2O2, NaOCl, AAPH)과 반응시키기 전후의 용액의 흡광도 변화를 나타낸 도이다.
도 29는 망간 이온(Mn2 +)이 배위결합하여 만든 빌리루빈 유도체 입자의 모식도를 나타낸 도이다.
도 30은 MRI 이미징에 사용하기 위한 상자성 원소인 망간 이온(Mn2 +)이 배위 결합한 빌리루빈 유도체 나노입자의 제조과정을 나타낸 도이다. PEG-빌리루빈으로 나노 입자를 만든 후 망간 이온을 섞어주어 망간 이온이 배위 결합한 입자를 만든다.
도 31은 본 발명의 빌리루빈 유도체 및 금속을 포함하는 입자가 활성산소를검출또는 진단할 수 있음을 나타내는 모식도이다. 구체적으로 본 발명의 망간 이온이 배위 결합한 빌리루빈 유도체와 활성산소가 반응 하였을 때 소수성인 빌리루빈은 친수성인 빌리버딘으로 바뀌거나, 또는 빌리루빈의 분절(fragments)로 분해되면서 결합이 약해져 나노입자가 와해된다. 이에 따라 배위 결합하고 있던 망간 이온이 떨어져 나오면서 MRI 영상 이미지 증강이 된다.
도 32는 본 발명의 망간 이온이 배위 결합한 빌리루빈 유도체 입자가 활성산소 자극에 의하여 망간 이온을 방출하는 양상을 나타낸 도이다.
도 33은 망간 이온이 배위결합한 빌리루빈 유도체(PEG-BR) 나노입자에 활성산소 생성 물질로서 차아염소산(hypochlorite)을 처리하기 전 후의 TEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 34는 망간이 배위결합한 빌리루빈 나노입자에 활성산소(hypochlorite) 처리 전 후의 MRI T1 강조 영상을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 빌리루빈 유도체(PEG-BR) 입자의 제조
1-1. 빌리루빈 유도체(PEG-BR)의 제조
본 발명자들은 빌리루빈의 착체형성 효과를 이용한, 빌리루빈과 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체를 제조하기 위한 전 단계로서, 빌리루빈에 친수성 분자로서 폴리에틸렌글리콜을 컨쥬게이션한 빌리루빈 유도체를 제조하였다.
먼저 빌리루빈을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹이고, 빌리루빈에 존재하는 카르복실 그룹을 활성화시켜 원하는 반응을 유도하기 위하여 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)를 적당량 첨가하고 상온에서 약 10분 간 반응시켰다. 다음으로, 말단에 아민기를 가지는 폴리에틸렌글리콜을 첨가하고, 일정 시간 반응시켜 빌리루빈의 카르복실 그룹과, 폴리에틸렌글리콜의 아민 그룹이 아마이드 결합으로 컨쥬게이션 된 빌리루빈 유도체를 합성하였다. 마지막으로 상기 제조된 최종 빌리루빈 유도체를 실리카 컬럼을 통해 부산물로부터 순수하게 분리 및 추출하였다.
1-2. 빌리루빈 유도체(PEG-BR) 입자의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 폴리에틸렌글리콜이 컨쥬게이션 된 양친매성의 빌리루빈 유도체를 클로로포름 또는 디메틸설폭사이드 등의 유기용매에 용해시키고, 이를 질소 가스 조건 하에 건조시켜 리피드 필름 층을 제조하였다. 제작된 빌리루빈 유도체의 리피드 필름 층을 수용액으로 수화시켜 수용액 상에 용해되어 있는 자가조립된 빌리루빈 입자를 제조하였다.
실시예 2: 본 발명의 금속( 금속 이온 )을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조 1
2-1. 방사선 동위원소인 64Cu 이온을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조 및 인 비보 PET 영상화
본 발명의 빌리루빈 유도체 입자의 금속 이온의 봉입 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 빌리루빈 유도체 입자 수용액에 별도의 첨가물 없이 PET 영상진단에 사용되는 소량의 방사성 동위원소 64CuCl2 수용액을 혼합하였다. 그러자 반응이 매우 격렬하고 빠르게 일어나 약 30분 정도의 반응시간만으로 64Cu 이온이 로딩되었다(도 2).
또한 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자가 얼마나 많은 활성이 있는지 확인하기 위해 크기 배제 컬럼을 이용하여 빌리루빈에 내포되지 않는 자유 64Cu를 제거 한 후에 방사선 선량계로 정량화하였다. 한편, 64Cu chelation 중 다른 pH와 온도 조건 하에서, 반응 방법은 생리학적 환경(37 ℃, pH 7.4)과 거의 동일하게 최적화되었다(도 3).
상기 64Cu 이온과 본 발명의 빌리루빈 유도체와의 배위결합은 빌리루빈의 피롤 기, 락탐기, 카르복실기와 형성될 수 있으며, 이를 예시적으로 화학식으로 표현하면 아래 화학식 2와 같다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2018005515-appb-I000002
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 빌리루빈 유도체(PEG-BR) 입자에 64Cu 이온을 배위결합시킨 빌리루빈 유도체 입자를 종양을 가진 랫트에 주입하고, PET 영상으로 인 비보 성능을 예비적으로 확인하였다. 확인 결과, 64Cu-빌리루빈 입자는 시간 의존적으로 종양을 명확히 시각화하였으며, 주사 후 1 시간, 3 시간 및 6 시간에서 나타난 가장 높은 종양의 흡수율(tumor uptake)은 약 2.15, 2.81 및 3.75 % 주사 투여량(ID)/g 이었다(도 4).
2-2. 다양한 금속( Ni , Mn, Gd , Mg, Ca, Fe) 이온을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조
본 발명의 빌리루빈 유도체 입자의 다양한 금속 이온에 대한 봉입 효과(킬레이팅 효과)를 확인하기 위하여 6 종의 금속(Ni, Mn, Gd, Mg, Ca, Fe) 이온 사이의 배위 착물 형성 가능성을 확인하였다. 실험방법은 상기 2-1과 같이 실시예 1에서 제조한 빌리루빈 입자 수용액에 상기 각 금속이온을 포함하는 수용액을 넣고 혼합하였다. 일정한 반응시간이 지난 후, 모든 금속, 특히 전이 금속은 Mg과 Ca의 색상 변화와 비교할 때 분별이 가능한 정도의 색상 변화(Ni = Fe> Gd = Mn)를 나타내었다(도 5a). 또한, 흡광도 패턴은 일반적인 입자 용액과 비교하여, 각 금속에서, 심지어 마그네슘과 칼슘 그룹에서도 다양한 변화를 나타내었다(도 5b).
상기 결과에서와 같이 빌리루빈 입자 용액의 색상이 특정 금속 이온과 배위결합을 이룬 후 원래의 황색에서 변화되거나, 특정 흡광도 패턴이 변위되거나 변경되면, 이전의 생체의학 응용 분야를 넘어선 새로운 페길화 빌리루빈의 적용 가능성을 보여주는 것일 수 있다. 따라서 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자의 다양한 금속에 대한 금속-유기 배위착물 형성 능력은 금속 이온 감지 시스템을 포함한 다양한 응용이 가능함을 확인할 수 있다.
실시예 3: 본 발명의 금속(금속 나노입자)을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조 2
3-1. 단일 초상자성계 산화철 나노입자 ( superparamagnetic iron oxide nanoparticle, SPION )를 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조
초상자성계 산화철(SPION)에 본 발명의 빌리루빈 유도체를 코팅하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 빌리루빈 나노입자 수용액에 산화철 나노입자(SPION)가 용해되어 있는 헥세인(hexane) 용액을 첨가하여 물층과 헥세인 층이 나뉘어 경계부를 형성하였다. 그 경계부에 소니케이터를 이용하여 인위적인 압력을 가하여 일정시간 두 층을 섞어줌으로써 산화철 나노입자의 표면에 빌리루빈 유도체(PEG-BR)가 코팅된 형태의 입자를 제조하였다(도 6a). 상기 반응의 원리는 리간드 교환(ligand exchange) 원리로서, 철 나노입자(SPION)에 원래 코팅되어 있던 올레산(oleic acid) 층이 떨어져 나가고, 그 대신 상기 빌리루빈 유도체(PEG-BR)의 카르복실 그룹이 철 나노입자(SPION)의 코어 부분과 킬레이션 반응을 통해 금속 나노입자를 코팅하는 것이다(도 6b).
3-2. 군집된 형태의 초상자성계 산화철 나노입자 ( superparamagnetic iron oxide nanoparticle , SPION )를 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조
금속 입자 군집을 빌리루빈 유도체로 코팅한 형태의 입자를 제조하기 위하여, 상기 실시예 3-1과 같이 빌리루빈 유도체(PEG-BR)가 용해된 수용액에 유기용매에 용해된 금속입자를 첨가하는 대신, 유기용매(예컨대 클로로포름)에 녹인 빌리루빈 유도체(PEG-BR)에 메탄올에 녹인 SPION 입자를 혼합하였다. 그 후 질소 가스 조건 하에서 상기 유기용매를 건조시켜 리피드 필름층을 생성하였다. 마지막으로 생성된 리피드 필름층을 수화시켜 군집형태의 SPION 나노입자를 제조하였다. 순수한 SPION 나노입자는 상기 과정을 거친 후에 자석으로 분리하였고, 이를 통해 제조된 군집형태의 SPION 나노입자를 최종적인 반응물로 분리하였다.
본 발명자들은 TEM 이미지에서 PEG-빌리루빈 껍질을 사용하여 상기 실시예 3-1 및 3-2 두 가지 유형의 입자들이 성공적으로 제조된 것을 확인하였다(도 6c).
3-3. 금 나노입자를 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조
금 나노입자에 빌리루빈 유도체를 코팅하기 위하여, 상기 실시예 1-1에서 제조한 빌리루빈 유도체(PEG-BR)를 유기용매가 아닌 물에 녹인 후, 금 나노입자가 용해되어 있는 수용액과 곧바로 일정시간 반응을 시켜 제조하였다. 반응 원리는 상기 실시예 3-1에서의 SPION 코팅과 비슷한 원리로 금 나노입자를 코팅하던 구연산(citrate) 층을 대신하여 빌리루빈 유도체(PEG-BR)가 나노입자 코어 부분을 둘러싸면서 코팅을 하게 된다.
실시예 4: 본 발명의 금속(금속 나노입자)을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 ROS 반응성
4-1. SPION을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 MRI 팬텀 연구(MRI phantom study)
본 발명자들은 단일 분포 입자의 형태로 PEG-빌리루빈에 의해 코팅된 SPION의 특성을 연구하기 위하여 MRI 팬텀 연구(phantom study)를 진행하였다.
먼저 본 발명빌리루빈 유도체(PEG-빌리루빈) 코팅 SPION과, 임상적으로 승인 된 T2 강조 MR 증강제(T2-weighted MR agent)인 페리덱스(Feridex)의 팬텀 영상을 비교한 결과, 본 발명의 빌리루빈 유도체(PEG-빌리루빈) 코팅 SPION이 페리덱스 보다 우수한 완화도(relaxivity) 값을 나타내었다(도 7).
또한, 본 발명의 빌리루빈 유도체(PEG-빌리루빈) 코팅 SPION을 ROS 발생제인 차아염소산염(hypochlorite)으로 처리하자, 빌리루빈 고유의 ROS에 대한 반응성(ROS-responsiveness)에 의해, TEM 영상에서 PEG-빌리루빈으로 코팅된 SPION의 응집이 관찰되었다(도 8). 또한, 예상한 바대로, T2 MR 팬텀 연구에서도 PEG-빌리루빈에 의해 유지되는 친수성 손실로 인해, ROS 농도에 비례하는 T2 신호의 점진적인 감소에 의한 ROS-반응성이 간접적으로 입증되었다(도 9a 및 도 9b). 이와 같은 SPION 응집 반응은 SPION의 size를 점진적으로 증가시킬 수 있으므로 추후 magnetic hyperthermia라는 치료효과의 잠재적인 대상이 될 수 있다.
4-2. SPION을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 ROS 반응성에 대한 인 비트로 및 인 비보 시험
PEG-빌리루빈이 코팅된 철 나노입자가 In vitro 및 in vivo에서 ROS에 반응하여 작동 및 응집하는지 여부를 확인하기 위하여, 염증 조건에서 활성산소 및 대식작용을 통해 외부 병원체(pathogen)를 탐식한다고 잘 알려진 1차 대식세포 및 대식세포주를 이용하여 아래와 같은 실험을 진행하였다.
우선, 인위적인 염증 조건을 만들기 위해 LPS(lipopolysaccharide)를 대식세포 혹은 복강에 처리한 후, 그와 동시에 PEG-빌리루빈으로 코팅된 SPION과 대조군으로 이용된 PEG-DSPE(PEG-distearoylphosphatidylethanolamine)가 코팅된 SPION 입자를 각각 처리하여 그 탐식 양상을 광학 현미경 및 MR 팬텀 영상을 이용하여 관찰하였다.
각 조건에서 ROS가 똑같은 양으로 생성되는지 알아보기 위해 체내에서 ROS 발생원으로 알려진 Nox 2 유전자의 대식세포 내 발현 정도를 RT_qPCR을 통해 측정하였다. 그 결과 PEG-DSPE와 PEG-BR SPION 그룹간 상기 Nox2 유전자의 발현 정도가 거의 유사한 것으로 나타나, 정상 조건보다는 증가된 유사한 양의 ROS가 생성됨을 확인하였다(도 10).
또한, 동등한 양의 ROS 생성 조건에서 각각의 PEG-DSPE 코팅 SPION과 PEG-BR SPION 처리 그룹간의 탐식 정도를 광학현미경을 통해 관찰하였다. 관찰 결과, PEG-BR 코팅 SPION 처리군에서 대조군인 PEG-DSPE 코팅 SPION 처리군에 비해 더 높은 탐식정도를 나타내었다(도 11a, 탐식 정도의 증가로 더 짙은 색으로 관찰됨). 복강에서 대식세포들을 채취하여 얻은 MRI 세포 팬텀 연구에서도 동일한 양상을 나타내었다(도 11b).
상기 결과는 LPS 처리에 의해 스트레스가 증가된 대식세포에서 생성된 활성산소에 반응하여 PEG-BR 코팅 SPION에서 PEG-BR 코팅이 벗겨짐으로써 SPION 코어들이 응집되어 그에 따라 탐식이 증가되었거나, 탐식된 후에 활성산소에 의해 반응하여 세포 내에서도 서로 응집이 일어나서 상기와 같은 결과가 생겼을 것으로 생각된다. 그에 반해, 대조군인 PEG-DSPE 코팅 SPION은 활성산소와 어떠한 반응도 하지 않으므로 상대적으로 완전한 형태의 PEG-DSPE 코팅 SPION 나노입자 그 자체의 활성이 관찰된 것으로 생각된다.
4-3. 금 나노입자를 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 CT 팬텀 연구 및 ROS 반응성에 대한 인 비트로 및 인 비보 시험
금 나노입자(Gold nanoparticle)는 전임상(preclinical) 영역에서 CT 조영제로 널리 연구되고 있다. SPION과 같이, 구연산에 의해 코팅된 금 나노입자 표면은 배위 결합에 의해 페길화된 빌리루빈(PEG-BR)으로 대체될 수 있다. 본 발명에서 금 나노입자으로의 페길화 빌리루빈의 성공적 결합은, TEM 이미지와 CT 팬텀 이미지를 통해 확인하였고, 킬레이션 후 UV-Vis 파장 변화, 및 빌리루빈에 의해 코팅된 금 나노입자의 반응성 산소종-반응성(ROS-responsiveness)을 대조군인 페길화 티올(pegylated thiol)에 의해 코팅된 금 나노입자와 비교하여 관찰함으로써 확인하였다.
또한, PEG-BR이 코팅된 금 나노입자는 활성산소와 반응시 PEG-BR 코팅이 벗겨지고 이로 인해 리간드를를 소실한 금 나노입자들끼리 응집되며, 이로 인해 금 나노입자가 근적외선 영역(NIR region)에서 강력한 광열효과(photothermal effect)를 갖게 되는 흡광도 변화를 갖게 된다(도 12). 이는 PEG-BR이 코팅된 금 나노입자 기반의 조영제는 추후에 CT를 이용한 진단 뿐만 아니라, 종양에서 활성산소에 반응하여 광열효과에 의한 치료도 도모할 수 있는 툴로써 이용될 수 있는 가능성을 나타낸다.
또한, in vivo 상에서 페길화 빌리루빈이 코팅된 금 나노입자의 CT 영상을 쥐에서 확인해 본 결과, 장시간동안 안정적으로 순환(long circulation) 하면서 혈관 조영이 가능함을 확인하였고, 그와 더불어 간 및 비장등 주요 장기들의 영상화에 있어서도 우수한 결과를 나타내었다(도 13). 도 13의 CT 이미지는 본 발명의 PEG-BR gold NP를 500 mg/kg(10mg/마리, gold 기준)의 농도로 정맥주사 후 6시간 째 획득한 것이다. 굵은 화살표는 대동맥을 가리키며, 가는 화살표가 간의 경계를 가리킨다. 도 13의 CT 이미지로부터 본 발명의 PEG-BR gold NP는 in vivo 상에서 안정적으로 혈관을 타고 장기간 순환하면서 혈관조영이 가능함을 확인할 수 있고, 또한 간을 영상화함에 있어서도 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있다.
실시예 5: 본 발명의 금속(플래티넘 계열 항암제)을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조 3
본 발명의 빌리루빈 유도체 입자의 금속과 착물을 형성하는 킬레이트 효과 및 종양에 대한 치료 효능을 입증하기 위하여 종양에 대해 사용되는 가장 대표적인 금속 약물인 시스플라틴을 로딩한 나노입자를 제조하였다(도 14). 시스플라틴은 백금 금속 뼈대를 가지고 있으며 나노 운반체와 함께 사용되어져왔다.
페길화 빌리루빈(PEG-BR) 입자와 시스플라틴의 가수 분해 생성물을 반응시킨 결과, 용액 중에서 전례 없는 색 변화가 나타남과 함께 시스플라틴이 로딩되는 것을 확인하였다(도 15). 상기 페길화 빌리루빈과 시스플라틴의 결합 원리를 나타내는 모식도를 도 16에 나타내었다.
또한, 시스플라틴이 봉입된 빌리루빈 나노입자에서 여러 조건(pH, ROS) 및 시간에 따른 시스플라틴 방출 실험을 진행한 결과, 시스플라틴은 ROS에 반응하여서 가장 높은 방출율을 나타내었으며, 그 다음으로 세포 내 라이소좀의 환경과 비슷하다고 알려진 산성 조건(pH 5.5)에서 높은 방출율을 나타내었고, 생리적인 pH에서는 가장 낮은 방출율을 나타내었다(도 17a 및 도 17b).
상기 결과로부터 본 발명의 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자는 안정적으로 시스플라틴이라는 플래티넘 계열의 약제를 봉입하고 주변 미세 환경에 선택적으로 봉입한 약제를 방출할 수 있음을 간접적으로 확인할 수 있다.
실시예 6: 본 발명의 금속(플래티넘 계열 항암제)을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 광-음향 및 광열 활성
감소된 Soret band 피크를 희생시키면, 적외선 영역(IR region) (적색 편이)에서의 흡광도의 상승은 808 nm 의 빛에서 현저한 광열 활성을 유발한다. 빌리루빈 나노 입자 그 자체에 현저한 IR 광 감수성이 존재하기 때문에, 원래의 일반적인 IR 광원으로는 광열 활성을 이끌어 낼 수 없었다. 이러한 변화와 새롭게 획득된 광자 특성은 "플래티넘 블루스" 이론에 의해 설명될 수 있다. 이 이론에 따르면 시스플라틴의 가수 분해 생성물을 아마이드 리간드와 반응시켰을 때 얻을 수 있다.
페길화된 빌리루빈을 시스플라틴과 배위결합시킨 본 발명의 나노입자는 근적외선 영역(NIR region)에서 새로이 획득한 흡광도로 인해, 본 발명자들은 이러한 금속-배위착물을 광 음향 이미지 (photo-acoustic image)와 광열 치료(photo-thermal therapy, PTT)에 사용하였다. 광-음향 이미지와 광열치료는 특정 파장의 빛에서 동일한 원리를 공유한다.
종양 이종 이식 모델의 마우스에서 생체 내 광-음향 이미징에 적용시, 본 발명의 빌리루빈 유도체는 정맥 내 주사 후 점차적으로 광-음향 신호가 증가됨을 확인하였다(도 18). 따라서 같은 조건에서 광열 치료 가능성을 확인하였고, 808 nm의 빛에 노출 후 5분 이내에 종양의 표면 온도가 55 ~ 60 ℃까지 급격히 상승하는 것을 확인하였다(도 19). 결과적으로 실제 빛을 이용하여 광열 치료를 진행한 그룹에서 시간에 따라 유의미한 종양 볼륨 감소 효과가 관찰되었다(도 20 및 도 21).
실시예 7: 본 발명의 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 활성산소종에 대한 반응성
실시예 7-1. 철 나노입자를 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 활성산소종에 대한 반응성 확인(육안상 색상 변화)
본 발명의 빌리루빈 유도체 입자의 활성산소종에 대한 반응성 및 변화를 확인하기 위하여 활성산소종의 농도에 따른 본 발명의 페길화된 빌리루빈이 코팅된 철 나노 입자의 변화를 확인하였다.
먼저 페길화된 빌리루빈이 코팅된 철나노 입자를 포함하는 현탁액을 상술한 실시예와 같은 방법으로 제조한 다음, 현탁액에 NaOCl(100, 10, 1, 0.1, 0 mM)과 AAPH*(100, 10, 1, 0.1, 0 mM), 과산화수소수(100 mM)를 농도별로 첨가하고 그 결과를 육안과 광학현미경으로 관찰하였다. [*2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)] 또한, 음성대조군으로서 페길화된 DSPE**가 코팅된 철 나노입자를 사용하였다. [**1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE)]
결과는 도 22 내지 25로 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, NaOCl 100 mM 농도에서는 고 농도의 활성산소로 인해 철 나노 입자를 코팅하고 있던 페길화된 빌리루빈이 모두 탈락하여 남아있는 소수성의 철 나노 입자들끼리 서로 응집되어 가라 앉아버다. 이로 인해 오른쪽 두 튜브에서 보이는 철 나노 입자 수용액의 고유한 커피색도 소실되어 투명한 물 색깔을 나타내었다. 반면 중간 농도인 1 mM을 처리한 중간 튜브 그룹은 아주 소량만 응집되어 있으며(빨간 화살표), 오른쪽의 대조군 그룹(0 mM)에 비해 철 나노입자의 약한 응집으로 인해 더 짙어진 커피색을 나타내었다.
또한, 도 23 내지 25에 나타낸 바와 같이, 차아염소산(HOCl) >> AAPH >>>>> 과산화수소수의 순서로 활성산소와의 반응성이 다름을 각각 확인할 수 있었다. 또한, 음성 대조군으로 사용한 페길화된 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE)가 코팅된 철 나노입자는 세 종류의 활성산소와도 어떠한 반응도 하지 않음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 활성산소와 페길화된 빌리루빈이 코팅된 철 나노 입자의 반응은 매우 특이적임을 확인할 수 있다.
실시예 7-2. 금 나노입자를 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 활성산소종에 대한 반응성 확인(흡광도 변화)
본 발명의 빌리루빈 유도체 입자의 활성산소종에 대한 반응성을 정량적으로 확인하기 위하여 빌리루빈 유도체 입자와 활성산소종을 반응시키기 전 후의 흡광도을 측정하였다. 구체적으로 페길화된 빌리루빈이 코팅된 금 나노 입자를 각 종류의 활성산소종과 반응시키기 전후의 용액의 변화를 육안 및 흡광도를 측정하여 확인하였다.
결과는 도 26 내지 28에 나타내었다.
AAPH의 경우 페길화된 빌리루빈이 코팅된 금 나노 입자만이 특이적으로 반응하며, 음성 대조군으로 사용한 페길화된 thiol (PEG-SH)이 코팅된 금 나노 입자는 반응하지 않았다. 또한 차아염소산(HOCl)의 경우 페길화된 빌리루빈이 코팅된 금 나노 입자와 페길화된 thiol (PEG-SH) 이 코팅된 금 나노 입자 모두 반응하는 것으로 보여, 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자가 특이적으로 활성산소종(AAPH)에 더 높은 반응성을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과로부터 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 활성산소종의 종류 및 농도를 감별하는데 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8: 본 발명의 망간 이온 배위결합 빌리루빈 유도체 입자의 활성산소종에 대한 반응성
실시예 8-1. 망간 이온 배위 결합 빌리루빈 유도체 입자의 제조
본 발명의 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 활성산소종에 대한 반응성 및 변화를 추가적으로 확인하기 위하여 망간 이온(Mn2 +)을 배위결합하여 빌리루빈 유도체 입자를 제조하였다. 망간 이온이 배위 결합한 빌리루빈 유도체 나노입자의 모식도와 제조방법은 도 29 및 도 30에 나타내었다. 구체적으로 5) 상기 실시예 1에서 제조한 빌리루빈 유도체(PEG-BR) 입자 수용액을 강하게 섞어주면서 PEG-BR:MnCl2 의 몰비율이 1:1이 되도록 MnCl2 수용액을 시린지 펌프(syrynge pump)를 이용하여 점적하였다. 이후 37℃에서 48시간 동안 반응을 시켰다. 6) 반응이 끝난 후 투석 백(Float A-Lyzer, MW cutoff : 20K)를 이용하여 빌리루빈 나노입자와 결합하지 못한 망간 이온을 제거하였으며, 7) Amicon 10K를 이용하여 농축함으로써 망간 이온이 배위 결합한 빌리루빈 유도체 나노입자를 제조하였다. 8) 제조된 빌리루빈 유도체 나노입자에 결합한 망간 이온의 양을 측정하기 위하여 ICP-OES (Agilent ICP-OES 5110)를 사용하였다. 그 결과, 본 발명의 망간 이온이 배위결합한 빌리루빈 유도체 나노입자는 망간 이온이 22.67±2.20 mg/kg (PEG-BR 1 mM 기준) 결합되었음을 확인하였다.
실시예 8-2. 망간 이온 배위 결합 빌리루빈 유도체 입자의 활성산소종에 대한 반응성 확인(이온 농도, TEM 이미지 및 MR 영상)
상기 실시예 8-1에서 제조한 본 발명의 망간 이온 배위 결합 빌리루빈 유도체 입자의 활성산소와의 반응을 확인하기 위하여, 망간 이온 배위 결합 빌리루빈 유도체 입자에 차아염소산을 투입하고 시간의 따른 망간 이온의 방출량 및 MRI T1 강조영상을 얻었다. 도 31은 본 발명의 망간 이온이 배위 결합한 빌리루빈 유도체와 활성산소가 반응 하였을 때 소수성인 빌리루빈이 친수성인 빌리버딘으로 바뀌면서 결합이 약해져 나노입자가 와해되고, 이에 따라 배위 결합하고 있던 망간 이온이 떨어져 나오면서 활성산소를 MRI를 이용해 이미징을 할 수 있음을 설명한다.
구체적으로 망간 이온이 배위 결합한 빌리루빈 나노입자 1 ml를 투석 백(Float A-Lyzer, MW cutoff : 20K)에 넣고 99 ml의 증류수에 NaOCl 1 mM를 넣은 후 실온에서 흔들어주며 배위 결합 상태로부터 떨어져 나오는 망간 이온의 투석을 진행하였다. 정해진 시간 (0, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48 and 72 hr)에서 투석 백 안쪽에서 50 μl를 채취하였으며 각 분획에 포함된 망간의 양을 ICP-MS (Agilent ICP-MS 7700S)를 통해 확인하였다.
결과는 도 32에 나타내었다. 도 32에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 망간 이온이 배위 결합한 빌리루빈 유도체 입자는 활성산소 자극에 의하여 망간 이온을 방출하였다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 망간 이온이 배위결합한 빌리루빈 유도체(PEG-BR) 나노입자의 차아염소산(hypochlorite) 처리 전 후의 형태학적 변화를 투과전자현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 33에 나타내었다. 도 33에 나타낸 바와 같이 활성산소(차아염소산) 자극 전에는 망간 이온이 배위 결합한 빌리루빈 유도체 입자가 한 군데 모여 작은 구 모양을 띄고 있었으나, 자극 후에는 망간 이온과 빌리루빈의 결합이 변하면서 모여 있지 않고 분산된 모습을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 망간 이온이 배위결합한 빌리루빈 유도체(PEG-BR) 나노입자의 차아염소산(hypochlorite) 처리 전 후의 MR 영상 시그널의 강도 변화를 측정하였다. 측정 장비는 17-cm 보어 사이즈의 3-Tesla MRS 3000 스캐너(w/ a birdcage rat head coil, MR Solutions, Surrey, United Kingdom)를 사용하였고, 수평방향(Horizontal) T1 강조 영상의 측정 파라미터는 다음과 같았다:
Time of repetition (TR)/echo time (TE); 550 ms/11 ms, flip angle; 90°, field of view (FOV); 45 mm × 45 mm, slice thickness; 1.5 mm, matrix number; 256 × 128.
결과는 표 1 및 도 34에 나타내었다.
신호 대 잡음 비 (T/N contrast ratio) = (신호의 평균 크기) / {(잡음의 표준편차) * 100}
NaOCl 반응 전 10003/(110*100) = 90.9%
NaOCl 반응 후 19024/(110*100) = 172.9%
상기 표 1 및 도 34에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 망간 이온이 배위결합한 빌리루빈 유도체(PEG-BR) 나노입자는 활성산소(차아염소산) 처리 후 MRI T1 강조 영상의 밝기가 증강됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 빌리루빈 유도체 입자는 활성산소, 또는 이를 동반하는 염증 부위의 검출용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

Claims (15)

  1. 빌리루빈 유도체 및 금속을 포함하는 빌리루빈 유도체 입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 빌리루빈 유도체 입자는 빌리루빈 유도체와 상기 금속이 배위결합을 통해 구성된 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 배위결합은 빌리루빈 유도체의 카르복실기, 락탐기, 또는 피롤 링과 상기 금속 사이에 형성하는 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속은 Cu, Ga, Rb, Zr, Y, Tc, In, Ti, Gd, Mn, Fe, Au, Pt, Pd, Ag, Co, Mn, Zn, Gd, Mo, Ni, Fe, Cr, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra 및 란탄족 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속의 이온 또는 금속 화합물인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어는 한 항에 있어서, 상기 금속은 초상자성 산화철 나노입자(SPION: superparamagnetic iron oxide nanoparticle)또는 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속은 플래티넘(Pt) 이온 또는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 및 헵타플라틴(heptaplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 플래티넘 계열 항암제인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속은 64Cu, 68Ga, 82Rb, 89Zr, 90Y, 99mTc, 111In, 및 201TI로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 빌리루빈 유도체는 빌리루빈에 친수성 분자가 컨쥬게이션된 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 친수성 분자는 덱스트란 (dextran), 카르보덱스트란(carbodextran), 폴리사카라이드(polysaccharide), 사이클로덱스트란 (cyclodextran), 풀루란 (pluronic), 셀룰로오즈(cellulose), 녹말(starch), 글리코겐(glycogen), 카르보하이드레이트 (carbohydrate), 단당류 (monosaccharide), 이당류(bisaccharide) 및 올리고당류 (oligosaccharide), 폴리포스파젠 (polyphosphagen), 폴리락타이드(polylactide), 폴리락티드-코-글리콜라이드 (poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리안하이드라이드 (polyanhydride), 폴리말릭산 (polymaleic acid) 및 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트 (polyalkylcyanoacrylate), 폴리하이드로옥시부틸레이트(polyhydroxybutylate), 폴리카르보네이트 (polycarbonate), 폴리오르소에스테르 (polyorthoester), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine), 폴리글리콜라이드 (polyglycolide), 폴리메틸메타아크릴레이트 (polymetacrylate), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 폴리(아크릴산염)(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)(poly[vinylester]), 폴리(비닐알콜)(poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌(polystryene), 폴리옥사이드(polyoxide), 폴리일렉트로라이트(polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌)(poly[1-nitropropylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트)(Poly[beta-hydroxyethylmethacrylate]), 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethyleneoxide), 폴리(에틸렌옥시드-b-프로필렌 옥사이드(Poly[ethylene oxide-bpropyleneoxide]), 폴리라이신(Polylysine), 및 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 빌리루빈 유도체 입자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 빌리루빈 유도체 입자를 포함하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 영상진단용 조영제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 암의 치료용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 염증성 질환의 치료 및 진단용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 검출용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 다음의 단계를 포함하는 금속 및 빌리루빈 유도체를 포함하는 빌리루빈 유도체 입자의 제조방법:
    (a) 빌리루빈을 친수성 분자와 컨쥬게이션하여 빌리루빈 유도체를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 빌리루빈 유도체와 금속을 배위결합하여 금속이 봉입된 빌리루빈 유도체 입자를 제조하는 단계.
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