WO2018110843A1 - 형광수명 측정장치 및 측정방법 - Google Patents

형광수명 측정장치 및 측정방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2018110843A1
WO2018110843A1 PCT/KR2017/013139 KR2017013139W WO2018110843A1 WO 2018110843 A1 WO2018110843 A1 WO 2018110843A1 KR 2017013139 W KR2017013139 W KR 2017013139W WO 2018110843 A1 WO2018110843 A1 WO 2018110843A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fluorescent
fluorescence lifetime
irradiation light
sample
module
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/013139
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이상윤
강민구
원영재
이승락
박병준
김병연
Original Assignee
(주) 인텍플러스
재단법인 오송첨단의료산업진흥재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주) 인텍플러스, 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단 filed Critical (주) 인텍플러스
Priority to EP17880705.3A priority Critical patent/EP3546925B1/en
Priority to US16/469,675 priority patent/US10753872B2/en
Priority to CN201780077817.0A priority patent/CN110178016B/zh
Publication of WO2018110843A1 publication Critical patent/WO2018110843A1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J1/00—Photometry, e.g. photographic exposure meter
    • G01J1/42—Photometry, e.g. photographic exposure meter using electric radiation detectors
    • G01J1/44—Electric circuits
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/08—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the direction of light
    • G02B26/10—Scanning systems
    • G02B26/105—Scanning systems with one or more pivoting mirrors or galvano-mirrors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J1/00—Photometry, e.g. photographic exposure meter
    • G01J1/42—Photometry, e.g. photographic exposure meter using electric radiation detectors
    • G01J1/44—Electric circuits
    • G01J2001/4446—Type of detector
    • G01J2001/4453—PMT
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J1/00—Photometry, e.g. photographic exposure meter
    • G01J1/42—Photometry, e.g. photographic exposure meter using electric radiation detectors
    • G01J1/44—Electric circuits
    • G01J2001/4446—Type of detector
    • G01J2001/446—Photodiode
    • G01J2001/4466—Avalanche
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/069—Supply of sources
    • G01N2201/0696—Pulsed
    • G01N2201/0697—Pulsed lasers

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence lifetime measuring apparatus and a measuring method for measuring the fluorescence lifetime, and more particularly to a measuring apparatus and a measuring method capable of detecting the electrical, thermal and chemical properties of the sample.
  • Microscopes are classified into first-generation optical microscopes, second-generation electron microscopes, and third-generation scanning probe microscopes, and are widely used in medicine, molecular biology, drug development, and materials engineering. do.
  • First-generation wide-field microscopes use sunlight or halogen lamps as light sources, and the focusing lens (x15) and the objective lens can be analyzed at a maximum magnification of 1500 by adjusting the magnification with an aperture according to the optical lens system.
  • objectivelens x20 / 40/100
  • a microscope that observes a sample through a projection lens and does not have a pinhole.
  • Second-generation electron microscopy uses electron beams instead of light from an optical microscope, and electron lenses instead of optical lenses, and includes a condenser lens, an object lens, and a projector lens.
  • a scanning electron microscope Through magnified observation of the object formed on the fluorescent surface of the specimen, it is classified into a scanning electron microscope, a transmission electron microscope, a reflection electron microscope according to the purpose.
  • the resolution of the electron microscope is limited by the wavelength of the light (wavelength) and the wavelength of the electron beam is short as 0.05 ⁇ can be seen clearly even viruses and microorganisms that could not be analyzed by the optical microscope.
  • electron microscopes can be used in a wide range of fields, such as medicine, biology, and engineering, because they can magnify images up to millions of times and can even observe the arrangement of atoms in crystals.
  • Atomic microscopes can measure up to tens of atomic diameters, making them the most advanced instrumentation for nanotechnology advances. Atomic microscopes can be used in vacuum and have the advantage of being able to determine the physical and electrical properties of a sample.
  • Fluorescence Life Microscopy is the most accurate instrument for measuring Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) (FLIM-FRET).
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • FLIM-FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • FRET is light when two phosphors are located at a distance of less than 10 nm. It is the phenomenon that energy is transferred from one phosphor to another without emitting or absorbing. Phenomenon that occurs on a scale of several nm or less and cannot be seen with conventional optical microscopes, can be identified by FRET, and the demand for many life sciences such as cell membranes, DNA, RNA, and protein-protein interactions is rapidly increasing.
  • the present invention provides a fluorescence lifetime measuring device and a method for enabling multiple fluorescence analysis and having a high measurement speed.
  • An apparatus for measuring fluorescence lifetime includes an irradiation light generator for generating irradiation light, a fluorescent photon detector for collecting fluorescent photons generated by irradiating a sample containing fluorescent molecules with the irradiation light, and collected fluorescent photons Is a first clock signal, a converter for converting irradiated light through the sample into a second clock signal, a first module for analyzing the fluorescence life of the fluorescent photon collected from the converter, the ROI of the sample from the first module And a second module for analyzing a fluorescence life of fluorescent photons corresponding to the ROI.
  • the first module may include an analog mean delay (AMD) measurement unit that calculates a fluorescence lifetime by using a difference between the average time of the first clock signal and the average time of the second clock signal.
  • AMD analog mean delay
  • the second module may include a time-correlated single photon counting (TCSPC) measurement unit that accumulates time data of a single fluorescent photon and calculates a fluorescence lifetime.
  • TCSPC time-correlated single photon counting
  • a method for measuring fluorescence lifetime includes a light generation step of generating irradiation light, a first irradiation step of collecting fluorescence photons generated by irradiating the irradiation light onto a sample, and a collection of fluorescence photons from the fluorescence photon detector.
  • TCSPC time correlated single photon counting
  • the control step further includes a control step of lowering the intensity of the irradiation light to a single photon level, and a second irradiation step of re-collecting the fluorescent photons generated by re-irradiating the adjusted irradiation light on the region of interest, wherein the TCSPC measurement step includes: The fluorescence life of the fluorescent photons detected from the irradiation step can be calculated.
  • FIG. 1 is a block diagram of an apparatus for measuring fluorescence lifetime according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart illustrating a method of measuring fluorescence lifetime according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating a method of measuring fluorescence lifetime according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a block diagram of a fluorescent lifetime measuring apparatus 10 according to an embodiment of the present invention.
  • the irradiation light generating unit 100 generates irradiation light capable of exciting the sample S.
  • the irradiated light is incident in parallel in space through the collimator 120 in the form of a pulse with respect to time.
  • the incident irradiation light passes through the SPF 130 (Short Pass Filter), is then reflected from the dichroic filter 320, and is incident to the sample S through the objective lens 310.
  • the incident irradiation light causes fluorescent photons to be generated from the sample S.
  • the generated fluorescent photons are collected by the confocal scanner 200 through the objective lens 310 and then passed through the dichroic filter 320.
  • the fluorescent photon from which the irradiated light is removed passes through the LPF (Loss Pass Filter) and is concentrated through the collimator 120 to be incident to the converter 400.
  • LPF Loss Pass Filter
  • the fluorescent photons are transferred to the first clock signal through the converter 400, and the first clock signal is amplified from the digitizer.
  • the amplified first clock signal is transmitted to the first module 500.
  • the first module 500 calculates the fluorescence lifetime of the fluorescent photon from the first clock signal.
  • the fluorescence lifetime value calculated by the first module 500 is transferred to the controller 600, and the controller 600 is a region of interest of the sample S from the fluorescence lifetime value calculated by the first module 500. ).
  • the second module 700 calculates the fluorescence lifetime by separately analyzing the fluorescent photons corresponding to the ROI.
  • the irradiation light generating unit 100 is a structure for generating irradiation light to be irradiated to the sample S containing fluorescent molecules, and includes an irradiation light source 110.
  • the irradiation light has a pulse width of 100 psec or less and has a wavelength in the range of 300 nm to 700 nm.
  • the irradiation light source 110 according to the embodiment of the present invention includes a semiconductor laser.
  • the semiconductor laser may include an electric pulse signal generator having a pulse width of 300 ps or less, a pulse clock unit for generating a stable trigger signal, and a semiconductor pulse laser head having a wavelength of 400 nm.
  • the irradiation light generator 100 may further include a collimator 120 and a SPF 130 (short pass filter) for collecting the irradiation light.
  • a change in time or wavelength of light with respect to the sample S may be measured in three dimensions.
  • the confocal scanner 200 includes a horizontal scan unit and a sig scan unit.
  • the horizontal scan unit includes a galvanometer mirror and can scan two-dimensionally at high speed using the galvanometer mirror.
  • the vertical scan part comprises motor driven means or piezoelectric-driven means (PZT). Both motor driven or piezoelectric driven means can be regulated by an open loop or closed loop system.
  • the fluorescent photon detector 300 is a module for collecting a plurality of fluorescent photons generated by irradiating the sample (S).
  • the fluorescent photon detector 300 includes a dichroic filter 320 to prevent the fluorescent photon collecting lens 310 and the irradiated light from being received by the converter 400.
  • the fluorescent photon collecting lens 310 is a lens for collecting a plurality of fluorescent photons generated from the sample (S).
  • the fluorescent photon collecting lens 310 may serve as the objective lens 310.
  • the dichroic filter 320 is an optical filter for selectively passing the incident irradiation light according to the wavelength.
  • the dichroic filter 320 according to an embodiment of the present invention has a characteristic of reflecting a wavelength band corresponding to the irradiation light and passing a wavelength band corresponding to the fluorescent photon. However, if necessary, the pass or reflection wavelength band of the dichroic filter 320 may be adjusted.
  • the converter 400 is a module that amplifies the fluorescent photons that have passed through the dichroic filter 320 and converts them into clock signals.
  • the converter 400 includes a photodetector, an amplifier, and a digitizer.
  • the photodetector and the amplifier according to the embodiment of the present invention may include a photo multiply tube (PMT), an avalanche photo diode (APD) and / or an LPF, an amplifier.
  • PMT photo multiply tube
  • APD avalanche photo diode
  • LPF low noise amplifier
  • the photodetector converts the collected fluorescent photons into a first clock signal, and synchronizes the irradiation light source 110 to a second clock signal.
  • the second clock signal is a signal in which the irradiation light source 110 calculated based on the clock signal synchronized with the irradiation light source 110 is converted without passing through the sample S.
  • the converted clock signal is transferred to the LPF.
  • LPF is a filter that passes low frequencies and amplifies clock signals in time.
  • LPF according to an embodiment of the present invention includes an electronic Gaussian low-pass filter (GLPF).
  • GLPF electronic Gaussian low-pass filter
  • GLPF eliminates the high frequency portion to facilitate data processing of the converted clock signal.
  • GLPF is symmetrical and free of ringing.
  • GLPF reduces the bandwidth of the clock signal to match the digitizer bandwidth.
  • the digitizer takes into account irradiated light having a small pulse width and performs high frequency sampling for signal recovery. Specifically, it functions as part of an AMD instrument that collects clock signals and calculates fluorescence lifetime based thereon.
  • the first module 500 is a module for obtaining a fluorescence lifetime of the collected fluorescent photons, and includes a signal collecting unit and an AMD measuring unit.
  • the signal collector collects the first clock signal converted by the converter 400 and the second clock signal synchronized to the irradiation light source 110.
  • the signal acquisition unit includes an electronic data acquisition (DAQ) board, and the DAQ board collects the first channel and the second clock signal to collect the first clock signal. It may include two channels.
  • DAQ electronic data acquisition
  • the AMD measurement unit calculates the fluorescence lifetime using the difference between the average time of the first clock signal and the average time of the second clock signal. This calculation is shown in Equation 1 below.
  • Is the measured temporal fluorescence photon signal Is the impulse response function (IRF) of the measurement system.
  • IRF impulse response function
  • ⁇ > And ⁇ > Is defined as the average delay of the fluorescence photon signal and the IRF, respectively.
  • the time function in Eq. Wow The initial time of t or the point where t is zero must be correctly defined and perfectly matched.
  • Wow Is measured by an electronic data acquisition (DAQ) board, and the zero point of each function is obtained by a trigger signal from the irradiation light source 110.
  • DAQ electronic data acquisition
  • AMD instruments have high measurement speeds and high lifetime accuracy.
  • the image is constructed based on the spatial distribution of the measured fluorescence lifetime, the time required for designating the region of interest of the sample S can be greatly reduced.
  • the controller 600 receives the fluorescence lifetime value of the sample S from the first module 500, and compares the fluorescence lifetime value and the reference value corresponding to each region where the object is divided and included in the ROI and the ROI. Extract the fluorescent photons.
  • the reference value may be predetermined and may be changed by the user.
  • the region of interest may include at least one region. Also, the region of interest may be one region specified by one closed curve. On the other hand, the region of interest may be other than the portion unnecessary for measuring the fluorescence lifetime.
  • the region of interest is designated, and fluorescent photon information corresponding to the region of interest is transmitted to the second module 700, and the second module 700 measures the fluorescence lifetime only for the fluorescent photons corresponding to the region of interest.
  • the second module 700 is a module for analyzing the fluorescence life of the fluorescent photon corresponding to the ROI, and includes a TCSPC (Time correlated single photon counting) measuring unit.
  • the fluorescence lifetime is measured only for the fluorescent photons corresponding to the region of interest instead of the fluorescence lifetime for the entire portion of the sample S. This can shorten the time required for fluorescence analysis.
  • the TCSPC measurement unit prepares a frequency distribution table to obtain fluorescence life, at least 100 photons should be measured for a single photon. Therefore, the time for finally determining the fluorescence lifetime for a single fluorescent photon is more than 10 microseconds.
  • microscope images typically consist of more than 1 million pixels, so it takes more than 10 seconds to acquire an entire FLIM image.
  • the measurement time is 15 minutes or more, which takes a lot of time.
  • the TCSPC measurement unit since the TCSPC measurement unit according to an embodiment of the present invention only needs to measure the sample S corresponding to the ROI specified by the controller 600, the TCSPC measurement unit needs more than the time required to obtain a three-dimensional image of the entire sample S. Significantly reduced.
  • the controller 600 may adjust the irradiation light. For example, the controller 600 adjusts the time interval between the irradiation light pulses longer than the fluorescence lifetime of the fluorescent photon. If the time interval between the irradiated light pulses is about the same as the fluorescence lifetime, the waveforms of two adjacent fluorescent photons overlap each other in time and thus cannot obtain an accurate value. Therefore, the control unit 600 may adjust the pulse period of the irradiation light to more than five times the fluorescence lifetime ⁇ for accurate analysis of the second module 700, and may adjust the intensity of the irradiation light.
  • the TCSPC measurement unit calculates time difference data between the first clock signal and the second clock signal through a high photon detection rate of several tens of MHz for a single photon, and calculates the fluorescence lifetime by accumulating the time difference data. Regardless of how long the shape of the response pulse by a single photon is in the time axis, the arrival time of a single photon can be precisely measured. If only a single photon is detected, the arrival time of the single photon can be measured by detecting the arrival time of the rising edge of the measured single photon response.
  • the fluorescence waveform obtained when numerous fluorescence photons are collected becomes equal to the probability distribution function of the fluorescence having an exponentially decaying shape.
  • the calculation of the fluorescent photon density, I F (t), produced accordingly is given by the following equation (2).
  • I 0 is an initial value
  • ⁇ means fluorescence lifetime
  • u (t) function represents 0 when t ⁇ 0 and 1-step function when t ⁇ 0. That is, the fluorescence lifetime means a time when the emission probability of the fluorescent photons decreases by 1 / e compared with the initial value.
  • the fluorescence lifetime of fluorescent materials utilized in microscopic applications ranges from 0.1 to 5ns.
  • the fluorescence lifetime measuring method is composed of steps processed in the fluorescence lifetime measuring apparatus 10 shown in FIG. Therefore, the description overlapping with the above-described content is omitted, and the omitted content is also applied to the fluorescence lifetime measuring method 20 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a flowchart of a fluorescence lifetime measuring method 20 according to an embodiment of the present invention.
  • Step 22 is a light generation step of preparing a sample (S) containing a fluorescent molecule in the fluorescent lifetime measuring apparatus 10, and generates irradiation light to irradiate the sample (S).
  • Step 23 is a first irradiation step of irradiating the sample S with irradiation light.
  • the fluorescent photon generated in the sample (S) through the fluorescent photon collector.
  • the collected fluorescent photons are amplified and converted into a first clock signal.
  • Step 24 is an AMD measurement step of calculating the fluorescence lifetime using the difference between the average time of the first clock signal and the average time of the second clock signal through the first module 500 (AMD).
  • the fluorescence life can be measured in a very short time for a certain range of samples (S) through a simple calculation.
  • control unit 600 specifies a range of interesting (ROI) of the sample S from a result value of the first module 500 (AMD).
  • ROI range of interesting
  • the designation of the ROI may be determined from the result value of the first module 500 itself.
  • the designation of the ROI may be determined by comparing a reference value stored in advance with a result value of the first module 500.
  • the ROI may be one region specified by one closed curve, or may be other portions except for one closed curve.
  • the designated region of interest is the measurement target of the second module 700 (TCSPC, Time correlated single photon counting).
  • TCSPC Time correlated single photon counting
  • the remaining area of the sample S excluding the ROI is not a measurement target of the second module 700. Therefore, the measurement time required by the measurement time of the remaining area of the sample S excluding the ROI can be reduced.
  • Step 26 counts a single photon hundreds to thousands or more times using a second module 700 (Time correlated single photon couting), prepares a frequency distribution table, and measures the fluorescence lifetime of the fluorescent photon corresponding to the region of interest. TCSPC measurement step.
  • the fluorescence lifetime measuring method 30 according to another embodiment of the present invention also includes steps processed in the fluorescence lifetime measuring apparatus 10 shown in FIG. Therefore, the description overlapping with the above-described content is omitted, and the omitted content is also applied to the fluorescence lifetime measurement method 30 according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a flowchart of a fluorescence lifetime measuring method 30 according to another embodiment of the present invention.
  • step 31 a second clock signal for generating the irradiation light with the fluorescence lifetime measuring apparatus 10 and measuring the average time of the second clock signal with respect to the irradiation light without passing through the sample S is performed. It is a measurement step.
  • Step 32 is a light generation step of preparing a sample (S) containing a fluorescent molecule in the fluorescent lifetime measuring apparatus 10, and generates irradiation light to irradiate the sample (S).
  • Step 33 is a first irradiation step of irradiating the sample S with irradiation light.
  • the fluorescent photon generated in the sample (S) is collected through the fluorescent photon collector.
  • the collected fluorescent photons are amplified and converted into a first clock signal.
  • Step 34 is an AMD measurement step of calculating the fluorescence lifetime using the difference between the average time of the first clock signal and the average time of the second clock signal through the first module 500 (AMD).
  • the fluorescence life can be measured in a very short time for a certain range of samples (S) through a simple calculation.
  • the control unit 600 designates a region of interest (ROI) of the sample S from a result value of the first module 500 (AMD).
  • ROI region of interest
  • the designation of the ROI may be determined from the result value of the first module 500 itself.
  • the designation of the ROI may be determined by comparing a reference value stored in advance with a result value of the first module 500.
  • the ROI may be one region specified by one closed curve, or may be other portions except for one closed curve.
  • step 36 the controller 600 adjusts the intensity of the irradiated light to a single photon level.
  • the controller 600 when measuring the fluorescence lifetime through the second module 700, it is possible to draw a histogram by measuring one photon per pulse.
  • Step 37 is a second irradiation step of irradiating the irradiation region of the light intensity is adjusted to the region of interest. Fluorescent photons are generated again from the re-irradiated sample S, and the generated fluorescent photons are recollected.
  • Step 38 counts hundreds to thousands or more times of the single photons recollected through the second module 700 (TCSPC, Time correlated single photon couting), prepares a frequency distribution table, and generates a fluorescence lifetime of the fluorescent photons corresponding to the region of interest. TCSPC measurement step to measure.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치는 조사광을 발생시키는 조사광 발생부, 상기 조사광으로 형광 분자를 포함하는 샘플을 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 형광 광자 검출부, 상기 수집된 형광 광자를 제1클럭 신호, 상기 샘플을 통하지 않은 조사광을 제2클럭 신호로 변환하는 변환부, 상기 변환부로부터 수집된 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제1모듈, 상기 제1모듈로부터 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하는 제어부, 상기 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제2모듈을 포함한다.

Description

형광수명 측정장치 및 측정방법
본 발명은 형광수명을 측정하기 위한 형광수명 측정장치 및 측정방법에 관한 것으로, 상세하게는 샘플의 전기적, 열적 및 화학적 특성을 검출할 수 있는 측정장치 및 측정방법에 관한 것이다.
현미경은 제1세대 광학 현미경(optical microscope), 제2세대 전자 현미경(electron microscope), 제3세대 원자 현미경(scanning probe microscope)으로 분류되고, 의학, 분자 생물학, 신약 개발, 재료공학 분야에 폭넓게 활용된다.
제1세대 광학 현미경(wide-field)은 태양광 또는 할로겐 램프를 광원으로 사용하며 광학렌즈의 계통에 따라 조리개(aperature)로 배율을 조절하여 최대 1500 배율로 분석하도록 집광 렌즈(x15), 대물 렌즈(objectivelens)(x20/40/100), 투시 렌즈(projector lens)를 통해 샘플을 관찰하며, 핀홀(pinhole)을 구비하지 않는 현미경이다.
제2세대 전자 현미경은 광학 현미경의 광선 대신에 전자 빔(electron beam)을, 광학 렌즈 대신에 전자 렌즈를 사용하며, 집광 렌즈(condenser lens), 대물 렌즈(object lens), 투시 렌즈(projector lens)를 통해 시편의 형광면 위에 맺어진 물체를 확대하여 관찰하며, 목적에 따라 주사 전자현미경, 투과 전자현미경, 반사 전자 현미경으로 구분된다. 전자 현미경은 광학 현미경의 분해능이 빛의 파장(wavelength)에 의하여 제한되며 전자 빔의 파장은 0.05Å 정도로 짧아 광학 현미경으로 분석할 수 없었던 바이러스, 미생물까지 선명하게 관찰할 수 있다. 최근 전자현미경은 수백만 배까지 상을 확대하여 결정 내의 원자 배열(1~2Å간격)까지 관찰할 수 있으므로 의학, 생물학, 공학 등 넓은 분야에 사용되고 있다.
제3세대 원자 현미경은 원자 지름의 수십분의 1까지 측정할 수 있어, 나노 기술 발전에 필요한 첨단 계측장비이다. 원자 현미경은 진공 중에서도 사용이 가능하며 샘플의 물리적, 전기적 성질을 알아낼 수 있는 장점이 있다.
한편, 최근에는 형광수명 현미경이 연구의 핵심으로 떠오르고 있다. 형광수명 현미경은 형광공명-에너지전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET)를 가장 정확하게 측정할 수 있는 장비(FLIM-FRET)이다.. FRET이란 두 개의 형광체가 10 nm 이하의 근접거리에 위치해 있을 때 빛의 방출이나 흡수 없이 하나의 형광체에서 다른 형광체로 에너지가 전이되는 현상이다. 수 nm 이하의 스케일에서 일어나 기존의 광학현미경으로 볼 수 없었던 현상들을 FRET으로 확인할 수 있게 되면서, 세포막, DNA, RNA, 단백질-단백질 상호작용 등 수많은 생명과학 분야에서 수요가 급증하고 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 다중 형광분석을 가능하게 하고 빠른 측정 속도를 갖는 형광수명 측정장치 및 측정방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치는 조사광을 발생시키는 조사광 발생부, 조사광으로 형광 분자를 포함하는 샘플을 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 형광 광자 검출부, 수집된 형광 광자를 제1클럭 신호, 샘플을 통하지 않은 조사광을 제2클럭 신호로 변환하는 변환부, 변환부로부터 수집된 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제1모듈, 제1모듈로부터 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하는 제어부, 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제2모듈을 포함한다.
제1모듈은, 제1클럭 신호의 평균 시간과 제2클럭 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산하는 AMD(Analog mean delay) 계측부를 포함할 수 있다.
제2모듈은, 단일 형광 광자의 시간 데이터를 누적하여 형광수명을 계산하는 TCSPC(Time-correlated single photon counting) 계측부를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법은 조사광을 발생시키는 광발생 단계, 조사광을 샘플에 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 제1조사 단계, 형광 광자 검출부로부터 수집된 형광 광자의 형광 수명을 계산하는 AMD(Analog mean delay) 계측 단계, AMD 계측 단계의 결과값으로부터 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)를 지정하는 제어 단계 및 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광 수명을 계산하는 TCSPC(Time correlated single photon counting) 계측 단계를 포함할 수 있다.
제어 단계 다음, 조사광의 세기를 단일 광자 수준으로 낮추는 조절 단계 및 조절된 조사광을 관심영역에 재조사하여 생성되는 형광 광자를 재수집하는 제2조사 단계를 더 포함하고, TCSPC 계측 단계는, 제2조사 단계로부터 검출된 형광 광자의 형광수명을 계산할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 보다 빠르게 샘플의 형광 수명 값을 계산할 수 있도록 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치의 블록도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법의 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정방법의 흐름도이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않은 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
이하에서, 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치(10)를 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치(10)의 블록도이다. 도 1을 참조하면, 조사광 발생부(100)는 샘플(S)을 여기시킬 수 있는 조사광을 발생시킨다. 조사광은 시간에 대하여 펄스 형태로 콜리메이터(120)(Collimator)를 통하여 공간상 평행하게 입사된다.
입사된 조사광은 SPF(130)(Short Pass Filter)를 통과한 다음, 다이크로익 필터(320)(Dichroic filter)로부터 반사되며 대물렌즈(310)를 통해 샘플(S)로 입사된다. 입사된 조사광은 샘플(S)로부터 형광 광자를 생성하도록 한다.
생성된 형광 광자는 대물렌즈(310)를 통해 공초점 스캐너(200)에 수집된 후 다이크로익 필터(320)를 통과한다.
따라서, 조사 광이 제거된 형광 광자는 LPF(Loss Pass Filter)를 통과한 후 콜리메이터(120)(Collimator)를 통해 집중되어 변환부(400)로 입사된다.
다음, 형광 광자는 변환부(400)를 통해 제1클럭 신호로 전이되고, 제1클럭 신호는 디지타이저(Digitizer)로부터 증폭된다. 증폭된 제1클럭 신호는 제1모듈(500)로 전달된다.
제1모듈(500)은 제1클럭 신호로부터 형광 광자의 형광수명을 계산한다. 제1모듈(500)에서 계산된 형광수명값은 제어부(600)로 전달되고, 제어부(600)는 제1모듈(500)에서 계산된 형광수명값으로부터 샘플(S)의 관심영역(Range of interesting)을 지정한다.
다음, 제2모듈(700)은 관심영역에 대응되는 형광 광자를 개별적으로 분석하여 형광 수명을 계산한다.
조사광 발생부(100)는 형광 분자를 포함하는 샘플(S)에 조사할 조사광을 발생시키는 구조로서, 조사광원(110)을 포함한다.
조사광은 100psec 이하의 펄스폭을 갖고, 300nm 내지 700nm 범위 내의 파장을 갖는다. 본 발명의 일 실시예에 따른 조사광원(110)은 반도체 레이저를 포함한다.
또한, 반도체 레이저는 300ps 이하의 펄스폭을 갖는 전기펄스 신호 발생기, 안정적 트리거 신호를 생성하는 펄스 클럭부, 400nm 파장의 반도체 펄스레이저 헤드를 포함할 수 있다.
조사광 발생부(100)는 조사광을 집광하기 위한 콜리메이터(120)(Collimator)와 SPF(130)(Short Pass Filter)를 더 포함할 수 있다.
공초점 스캐너(200)는 3차원 이미징을 가능하게 하므로, 샘플(S)에 대하여 빛의 시간 또는 파장에 따른 변화를 3차원으로 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 공초점 스캐너(200)는 수평 스캔부 및 스직 스캔부를 포함한다. 수평 스캔부는 갈바노미터 미러를 포함하며, 갈바노미터 미러를 이용해 초고속으로 2차원 스캔할 수 있다. 수직 스캔부는 모터 구동식 수단 또는 압전 구동식 수단(PZT, piezoelectric-driven means)을 포함한다. 모터 구동식 수단 또는 압전 구동식 수단은 모두 개방 루프 또는 폐쇄 루프 시스템에 의해 조절될 수 있다.
형광 광자 검출부(300)는 샘플(S)에 조사하여 생성되는 다수의 형광 광자를 수집하는 모듈이다. 형광 광자 검출부(300)는 형광 광자 수집렌즈(310)와 조사광이 후출하는 변환부(400)에 수광되는 것을 막기 위한 다이크로익 필터(320)를 포함한다.
형광 광자 수집렌즈(310)는 샘플(S)로부터 생성된 다수의 형광 광자를 수집하는 렌즈이다. 형광 광자 수집렌즈(310)는 대물렌즈(310)의 역할을 할 수도 있다.
다이크로익 필터(320)는 입사된 조사광을 파장에 따라 선택적으로 통과시키는 광 필터이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 다이크로익 필터(320)는 조사광에 대응되는 파장대역은 반사시키고 형광 광자에 대응되는 파장대역은 통과시키는 특성을 갖는다. 단, 필요에 따라 다이크로익 필터(320)의 통과 또는 반사 파장 대역은 조절될 수 있다.
변환부(400)는 다이크로익 필터(320)를 통과한 형광 광자를 증폭시켜 클럭 신호로 변환하는 모듈이다. 변환부(400)는 광검출기, 증폭기 및 디지타이저를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 광검출기 및 증폭기는 광증폭관(PMT, Photo multiply tube), APD(Avalanche Photo Diode) 및/또는 LPF, 엠프를 포함할 수 있다.
광검출기는 수집된 형광 광자를 제1클럭 신호로 변환하고, 조사광원(110)을 동기화하여 제2클럭 신호로 변환한다. 제2클럭 신호는 조사광원(110)에 동기화된 클럭 신호에 기초하여 계산된 조사광원(110)이 샘플(S)을 통과하지 않은채 변환된 신호이다. 변환된 클럭 신호는 LPF로 전달된다.
LPF는 낮은 주파수를 통과시키는 필터로, 클럭 신호를 시간적으로 증폭시킨다. 본 발명의 일 실시예에 따른 LPF는 전자적 가우시안 저역 필터(GLPF, Gaussian low-pass filter)를 포함한다.
GLPF는 변환된 클럭 신호의 데이터 처리를 용이하게 할 수 있도록 높은 주파수 부분을 제거한다. GLPF는 대칭적이고, 링잉현상이 없도록 구현된다. GLPF는 디지타이저 대역폭에 대응될 수 있도록 클럭 신호의 대역폭을 감소시킨다.
디지타이저는 작을 펄스 폭을 갖는 조사 광을 참작하여, 신호 복원을 위해 고주파수 샘플링을 한다. 상세하게는, 클럭 신호들을 수집하고 이를 기초로 형광 수명을 계산하는 AMD 계측부의 일부로서 기능한다.
제1모듈(500)은 수집된 형광 광자의 형광 수명을 구하는 모듈이며, 신호 수집부와 AMD 계측부를 포함한다.
신호 수집부는 변환부(400)에서 변환된 제1클럭 신호와 조사광원(110)에 동기화된 제2클럭 신호를 수집한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 신호 수집부는 전자 데이터 획득 보드(electronic data acquisition (DAQ) board)를 포함하며, DAQ 보드는 제1클럭 신호를 수집하는 제1채널과 제2클럭 신호를 수집하는 제2채널을 포함할 수 있다.
AMD 계측부는 제1클럭 신호의 평균 시간과 제2클럭 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산한다. 이러한 계산은 다음 수학식 1과 같다.
Figure PCTKR2017013139-appb-M000001
여기서,
Figure PCTKR2017013139-appb-I000001
는 측정된 시간적 형광 광자 신호이고,
Figure PCTKR2017013139-appb-I000002
는 측정 시스템의 임펄스 응답 함수(impulseresponse function, IRF)이다. <
Figure PCTKR2017013139-appb-I000003
>와 <
Figure PCTKR2017013139-appb-I000004
>는 각각 형광 광자 신호 및 IRF의 평균 지연으로 정의된다. AMD 방법을 이용해 형광 광자의 절대 형광수명을 추출하기 위해, 식(1)에서 시간함수
Figure PCTKR2017013139-appb-I000005
와
Figure PCTKR2017013139-appb-I000006
의 초기 시간 또는 t가 0인 지점은 정확하게 정의되어 완벽하게 일치되어야 한다. 실험에 있어서,
Figure PCTKR2017013139-appb-I000007
와
Figure PCTKR2017013139-appb-I000008
는 전자 데이터 획득 보드(electronic data acquisition (DAQ) board)에 의해 측정되고, 각 함수의 0 지점은 조사광원(110)으로부터의 트리거 신호에 의해 획득된다. AMD 계측부는 빠른 측정 속도와 높은 수명 정확도를 갖는다. 또한, 측정된 형광수명의 공간적 분포를 기반으로 이미지를 구성하므로, 샘플(S)의 관심 영역을 지정하는데 소요되는 시간을 대폭 감소시킬 수 있다.
제어부(600)는 제1모듈(500)로부터 샘플(S)의 형광 수명값을 수신하고, 대상이 분할된 각각의 영역에 해당하는 형광 수명값과 기준값을 대조하여 관심 영역 및 관심 영역에 포함된 형광 광자를 추출한다. 기준값은 미리 지정될 수 있고, 사용자에 의해 변경될 수 있다. 또한, 관심 영역은 적어도 하나 이상의 영역이 포함될 수 있다. 또한, 관심영역은 하나의 폐곡선에 의해 특정되는 하나의 영역일 수 있다. 반면, 형광 수명을 측정하는데 불필요한 부분을 제외한 나머지 부분이 관심영역이 될 수도 있다.
관심영역이 지정되고, 관심영역에 대응되는 형광 광자 정보가 제2모듈(700)에 전달되고, 제2모듈(700)은 관심영역에 대응되는 형광 광자에 대하여만 형광 수명을 측정한다. 여기서, 제2모듈(700)은 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광수명을 분석하는 모듈이며, TCSPC(Time correlated single photon counting) 계측부를 포함한다.
따라서 이후에 형광 수명이 측정될 때, 샘플(S) 전체 부분에 대하여 형광 수명이 측정되는 대신에 관심 영역에 대응되는 형광 광자에 대하여만 형광 수명이 측정된다. 이로써 형광 분석에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.
상세하게는, TCSPC 계측부는 도수분포표를 작성하여 형광수명을 얻어내므로 단일 광자에 대하여 최소 100개 정도의 광자가 계측되어야 한다. 따라서 단일 형광 광자에 대하여 형광 수명을 최종적으로 결정하기 위한 시간은 10마이크로초 이상이 된다. 일반적으로 현미경 이미지는 보통 100만 픽셀 이상으로 구성되므로 한 장의 FLIM 이미지 전체를 획득하는데 걸리는 시간은 10초 이상이 된다.
더욱이, 3차원 이미지를 얻고자 하는 경우 더 많은 시간을 소모하게 된다. 예를 들어, 100장의 2차원 이미지를 획득하여 하나의 3차원 이미지를 얻고자 하는경우, 측정시간은 15분 이상이 되어 많은 시간이 소요된다.
반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 TCSPC 계측부는 제어부(600)에서 지정한 관심영역에 대응되는 샘플(S)에 대하여만 계측하면 충분하므로 샘플(S) 전체에 대하여 3차원 이미지를 얻는데 필요한 시간보다 현저하게 감소된다.
한편, 제2모듈(700)의 형광 광자에 대한 형광 수명의 분석을 위해, 제어부(600)는 조사광을 조절할 수 있다. 예를 들어, 제어부(600)는 조사광 펄스 간의 시간 간격을 형광 광자의 형광 수명보다 길게 조절한다. 만약 조사광 펄스 간의 시간 간격이 형광수명과 비슷한 수준이 되면 시간상에서 인접한 두 형광 광자의 파형이 서로 중첩되어 정확한 값을 얻을 수 없게 된다. 따라서, 제어부(600)는 제2모듈(700)의 정확한 분석을 위하여 조사광의 펄스 주기를 형광수명 τ의 5배 이상으로 조절할 수 있으며, 조사광의 세기를 조절할 수도 있다.
TCSPC 계측부는 단일한 광자를 대상으로 수십 Mhz에 달하는 높은 광자 검출 속도를 통해 제1클럭 신호와 제2클럭 신호의 시간차 데이터를 산출하고, 시간차 데이터를 누적하여 형광수명을 계산한다. 단일 광자에 의한 응답 펄스의 모양이 시간축에서 얼마나 긴 폭을 지니는가와는 상관없이 단일 광자의 도착 시간은 정밀하게 측정될 수 있다. 단일 광자만이 감지된 경우, 측정된 단일 광자 응답의 상승 모서리(rising edge)의 도착 시간을 검출함으로써 단일 광자의 도착 시간을 잴 수 있다.
한편, 수많은 형광 광자가 수집된 경우 얻어지는 형광 파형은 지수함수적 감쇠 모양을 지닌 형광의 확률분포 함수와 동일해진다. 이 경우, 매우 짧은 펄스폭을 갖는 조사광의 조사가 t=0 시간에 이뤄질 때, 이에 따라 생성되는 형광 광자 밀도, IF(t)의 계산은 다음 수학식 2와 같다
Figure PCTKR2017013139-appb-M000002
이때 I0는 초기값이며, τ는 형광 수명을 의미하고, u(t) 함수는 t<0일때 0, t≥0일때 1인계단 함수를 나타낸다. 즉, 형광 수명은 형광 광자의 방출 확률이 초기값에 비해 1/e 만큼 감소하는 시간을 의미한다. 현미경 응용에서 활용되는 형광 물질의 형광 수명은 대부분 0.1에서 5ns 범위를 가진다.
지금까지 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정장치(10)의 구성에 대해서 설명하였다. 이후에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법(20)에 대하여 설명한다. 형광수명 측정방법은 도1에 도시된 형광수명 측정장치(10)에서 처리되는 단계들로 구성된다. 따라서 상기에 서술한 내용과 중복되는 내용은 생략하며, 생략된 내용들은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법(20)에도 적용된다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 형광수명 측정방법(20)의 흐름도이다.
도 2를 참조하면 21단계는, 형광수명 측정장치(10)로 조사광을 발생시켜 샘플(S)을 통과하지 않은 상태의 조사광에 대하여 제2클럭 신호의 평균 시간을 측정하는 제2클럭 신호 측정 단계이다.
22단계는 형광 분자를 포함하는 샘플(S)을 형광수명 측정장치(10)에 준비시키고, 샘플(S)에 조사할 조사광을 발생시키는 광발생 단계이다.
23단계는 조사광으로 샘플(S)을 조사하는 제1조사 단계이다. 이 때, 형광 광자 수집부를 통해 샘플(S)에서 생성되는 형광 광자를 검출한다. 또한, 수집된 형광 광자를 증폭시켜 제1클럭 신호로 변환한다.
24단계는 제1모듈(500)(AMD, Analog mean delay)을 통해 제1클럭 신호의 평균 시간과 제2클럭 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산하는 AMD 계측 단계이다. 이 경우, 간단한 계산을 통해 일정한 범위의 샘플(S)에 대하여 형광수명을 매우 짧은 시간에 측정할 수 있다.
25단계는 제어부(600)는 제1모듈(500)(AMD, Analog mean delay)의 결과값으로부터 샘플(S)의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하는 제어 단계이다. 일 예로, 관심영역의 지정은 제1모듈(500)의 결과값자체로부터 결정될 수 있다.
다른 예로, 관심영역의 지정은 사전에 저장된 기준값과 제1모듈(500)의 결과값의 비교를 통해 결정될 수 있다. 관심영역은 하나의 폐곡선에 의해 특정되는 하나의 영역일 수도 있고, 하나의 폐곡선을 제외한 나머지 부분일 수도 있다.
상술한 바와 같이, 지정되는 관심영역은 제2모듈(700)(TCSPC, Time correlated single photon counting)의 측정대상이 된다. 반면, 관심영역을 제외한 샘플(S)의 나머지 영역은 제2모듈(700)의 측정대상이 되지 않는다. 따라서, 관심영역을 제외한 샘플(S)의 나머지 영역의 측정시간만큼 소요되는 측정시간을 감소시킬 수 있다.
26단계는 제2모듈(700)((TCSPC, Time correlated single photon couting)을 통해 단일 광자를 수백에서 수천번 이상 계수한 다음 도수분포표를 작성하고, 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광 수명을 측정하는 TCSPC 계측 단계이다.
이후에서, 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정방법(30)에 대하여 설명한다. 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정방법(30) 또한 도1에 도시된 형광수명 측정장치(10)에서 처리되는 단계들로 구성된다. 따라서 상기에 서술한 내용과 중복되는 내용은 생략하며, 생략된 내용들은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정방법(30)에도 적용된다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 형광수명 측정방법(30)의 흐름도이다.
도 3을 참조하면, 31단계는 형광수명 측정장치(10)로 조사광을 발생시켜 샘플(S)을 통과하지 않은 상태의 조사광에 대하여 제2클럭 신호의 평균 시간을 측정하는 제2클럭 신호 측정 단계이다.
32단계는 형광 분자를 포함하는 샘플(S)을 형광수명 측정장치(10)에 준비시키고, 샘플(S)에 조사할 조사광을 발생시키는 광발생 단계이다.
33단계는 조사광으로 샘플(S)을 조사하는 제1조사 단계이다. 이 때, 형광 광자 수집부를 통해 샘플(S)에서 생성되는 형광 광자를 수집한다. 또한, 수집된 형광 광자를 증폭시켜 제1클럭 신호로 변환한다.
34단계는 제1모듈(500)(AMD, Analog mean delay)을 통해 제1클럭 신호의 평균 시간과 제2클럭 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산하는 AMD 계측 단계이다. 이 경우, 간단한 계산을 통해 일정한 범위의 샘플(S)에 대하여 형광수명을 매우 짧은 시간에 측정할 수 있다.
35단계는 제어부(600)는 제1모듈(500)(AMD, Analog mean delay)의 결과값으로부터 샘플(S)의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하는 제어 단계이다. 일 예로, 관심영역의 지정은 제1모듈(500)의 결과값자체로부터 결정될 수 있다. 다른 예로, 관심영역의 지정은 사전에 저장된 기준값과 제1모듈(500)의 결과값의 비교를 통해 결정될 수 있다. 관심영역은 하나의 폐곡선에 의해 특정되는 하나의 영역일 수도 있고, 하나의 폐곡선을 제외한 나머지 부분일 수도 있다.
36단계는 제어부(600)는 조사광의 세기를 단일 광자 수준으로 낮추도록 조절하는 조절 단계이다. 이 경우 제2모듈(700)을 통해 형광수명을 측정하게 될 때, 펄스 하나당 하나의 광자를 측정하여 히스토그램을 그릴 수 있다.
37단계는 광 세기가 조절된 조사광을 관심영역에 재조사하는 제2조사 단계이다. 재조사된 샘플(S)로부터 형광 광자가 다시 발생되고, 발생된 형광 광자를 재수집한다.
38단계는 제2모듈(700)(TCSPC, Time correlated single photon couting)을 통해 재수집된 단일 광자를 수백에서 수천번 이상 계수한 다음 도수분포표를 작성하고, 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광 수명을 측정하는 TCSPC 계측 단계이다.

Claims (5)

  1. 조사광을 발생시키는 조사광 발생부;
    상기 조사광으로 형광 분자를 포함하는 샘플을 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 형광 광자 검출부;
    상기 수집된 형광 광자를 제1클럭 신호, 상기 샘플을 통하지 않은 조사광을 제2클럭 신호로 변환하는 변환부;
    상기 변환부로부터 수집된 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제1모듈;
    상기 제1모듈로부터 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)을 지정하는 제어부;
    상기 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광수명을 분석하는 제2모듈을 포함하는 형광수명 측정장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1모듈은,
    상기 제1클럭 신호의 평균 시간과 제2클럭 신호의 평균 시간의 차이를 이용하여 형광수명을 계산하는 AMD(Analog mean delay) 계측부를 포함하는 형광수명 측정장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제2모듈은,
    상기 단일 형광 광자의 시간 데이터를 누적하여 형광수명을 계산하는 TCSPC(Time-correlated single photon counting) 계측부를 포함하는 형광수명 측정장치.
  4. 조사광을 발생시키는 광발생 단계;
    상기 조사광을 샘플에 조사하여 생성되는 형광 광자를 수집하는 제1조사 단계;
    상기 형광 광자 검출부로부터 수집된 형광 광자의 형광 수명을 계산하는 AMD(Analog mean delay) 계측 단계;
    상기 AMD 계측 단계의 결과값으로부터 샘플의 관심영역(ROI, Range of interesting)를 지정하는 제어 단계; 및
    상기 관심영역에 대응되는 형광 광자의 형광 수명을 계산하는 TCSPC(Time correlated single photon counting) 계측 단계를 포함하는 형광수명 측정방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 제어 단계 다음,
    상기 조사광의 세기를 단일 광자 수준으로 낮추는 조절 단계; 및
    상기 조절된 조사광을 상기 관심영역에 재조사하여 생성되는 형광 광자를 재수집하는 제2조사 단계를 더 포함하고,
    상기 TCSPC 계측 단계는, 상기 제2조사 단계로부터 검출된 형광 광자의 형광수명을 계산하는 형광수명 측정방법.
PCT/KR2017/013139 2016-12-16 2017-11-17 형광수명 측정장치 및 측정방법 WO2018110843A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17880705.3A EP3546925B1 (en) 2016-12-16 2017-11-17 Fluorescence lifetime measurement apparatus and measurement method
US16/469,675 US10753872B2 (en) 2016-12-16 2017-11-17 Apparatus and method for measuring fluorescence lifetime
CN201780077817.0A CN110178016B (zh) 2016-12-16 2017-11-17 用于测量荧光寿命的装置和方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0172862 2016-12-16
KR1020160172862A KR101835815B1 (ko) 2016-12-16 2016-12-16 형광수명 측정장치 및 측정방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018110843A1 true WO2018110843A1 (ko) 2018-06-21

Family

ID=61688836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/013139 WO2018110843A1 (ko) 2016-12-16 2017-11-17 형광수명 측정장치 및 측정방법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10753872B2 (ko)
EP (1) EP3546925B1 (ko)
KR (1) KR101835815B1 (ko)
CN (1) CN110178016B (ko)
WO (1) WO2018110843A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102239319B1 (ko) 2019-02-07 2021-04-09 국민대학교산학협력단 시분해 단일 광자 계수 장치
EP3702759A1 (en) * 2019-02-26 2020-09-02 Nokia Technologies Oy Method and apparatus for fluorescence lifetime measurement
CN112414984B (zh) * 2020-11-06 2023-04-25 中国计量大学 便携式奶粉蛋白质含量检测盒
EP4180798A1 (en) * 2021-11-10 2023-05-17 Abberior Instruments GmbH Methods and device for detecting single photons from a sample comprising at least one emitter

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005121602A (ja) * 2003-10-20 2005-05-12 Olympus Corp 蛍光寿命測定装置
JP2005300311A (ja) * 2004-04-09 2005-10-27 Olympus Corp 蛍光寿命測定装置
JP2008527311A (ja) * 2004-12-30 2008-07-24 アート アドヴァンスド リサーチ テクノロジーズ インコーポレイテッド 蛍光画像コントラストを改善するための方法
KR20120001533A (ko) * 2010-06-29 2012-01-04 광주과학기술원 형광수명 측정 장치 및 방법
KR20130123190A (ko) * 2012-05-02 2013-11-12 한국과학기술원 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001253193A1 (en) * 2000-04-04 2001-10-15 The Regents Of The University Of California Fluorescent lifetime assays for non-invasive quantification of analytes
GB2382648B (en) * 2001-12-11 2003-11-12 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd System and method for time correlated multi-photon counting measurements
EP2051062B1 (en) 2007-10-16 2011-02-16 Gwangju Institute of Science and Technology Apparatus for measuring fluorescence lifetime
EP2252871A2 (en) * 2008-02-01 2010-11-24 Cambridge Consultants Limited Device and method for measuring scattering of radiation
JP5626760B2 (ja) * 2010-03-31 2014-11-19 ソニー株式会社 蛍光像取得方法、蛍光像取得プログラム及び蛍光像取得装置
NZ607257A (en) * 2010-08-16 2015-02-27 Cognoptix Inc System and method for detecting amyloid proteins
US9612245B2 (en) * 2013-07-03 2017-04-04 University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth Multiple-pulse pumping for enhanced fluorescence detection and molecular imaging in cells and tissue
CA2979039A1 (en) * 2015-03-10 2016-09-15 Microbix Biosystems Inc. Methods, systems, and apparatus for sorting and processing analytes
US9920188B2 (en) * 2015-11-02 2018-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services PVCP phantoms and their use

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005121602A (ja) * 2003-10-20 2005-05-12 Olympus Corp 蛍光寿命測定装置
JP2005300311A (ja) * 2004-04-09 2005-10-27 Olympus Corp 蛍光寿命測定装置
JP2008527311A (ja) * 2004-12-30 2008-07-24 アート アドヴァンスド リサーチ テクノロジーズ インコーポレイテッド 蛍光画像コントラストを改善するための方法
KR20120001533A (ko) * 2010-06-29 2012-01-04 광주과학기술원 형광수명 측정 장치 및 방법
KR20130123190A (ko) * 2012-05-02 2013-11-12 한국과학기술원 투과 파장 가변 필터를 이용한 분광 형광 수명시간 이미징 현미경

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3546925A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3546925A4 (en) 2019-12-11
CN110178016B (zh) 2022-07-19
US20190383740A1 (en) 2019-12-19
EP3546925A1 (en) 2019-10-02
EP3546925B1 (en) 2022-11-09
CN110178016A (zh) 2019-08-27
KR101835815B1 (ko) 2018-03-07
US10753872B2 (en) 2020-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018110843A1 (ko) 형광수명 측정장치 및 측정방법
JP6691053B2 (ja) 無線周波数多重化を用いた並行フローサイトメーター
US5751839A (en) Apparatus and process for the detection and counting of rarely occurring mammalian cells
US6687000B1 (en) Photon-sorting spectroscopic microscope system
US20130126755A1 (en) Method and device for simultaneous multi-channel and multi-method acquisition of synchronized parameters in cross-system fluorescence lifetime applications
CN1912587A (zh) 时间分辨荧光光谱测量和成像方法及其装置
US8633432B2 (en) Reflective focusing and transmissive projection device
WO2018117434A1 (ko) 아날로그 평균지연 방법에서 수집한 신호로부터 가상의 형광분포 모델을 통해 최소자승오차를 계산하여 2개 이상의 형광수명 성분을 구하는 형광수명 측정장치 및 그 측정방법
CN108120702A (zh) 一种基于并行探测的超分辨荧光寿命成像方法和装置
US20110017915A1 (en) Drift scanner for rare cell detection
WO2018182125A1 (ko) 다중지수감소함수 형태의 실험데이터를 고속으로 분석하는 형광수명 측정장치 및 그 측정방법
JP3984132B2 (ja) 蛍光分光分析装置
Dumas et al. FRET efficiency measurement in a molecular tension probe with a low-cost frequency-domain fluorescence lifetime imaging microscope
JP2013117529A (ja) 試料を検査するための方法および機器
JP2004361087A (ja) 生体分子解析装置
CN110320193A (zh) 一种荧光测试设备、系统及方法
Hirmiz et al. Cross-talk reduction in a multiplexed synchroscan streak camera with simultaneous calibration
JP2004354345A (ja) 生体分子解析装置
JP2004354346A (ja) 測定装置
EP2111539A2 (en) Images acquisition system in 2d and reconstructed tomographically in 3d of single cell/particles in flow carrier (laminar and non).
WO2023033198A1 (ko) 형광수명 측정 장치 및 방법
CN117030579A (zh) 基于光纤的光操控动态细胞粘弹性测量方法
RU2569053C2 (ru) Сканирующий цитометр
JP2003254963A (ja) 生物分子の力学的測定装置
Howorth et al. Capabilities of photon-counting systems and possible applications in biomedicine

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17880705

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017880705

Country of ref document: EP

Effective date: 20190625