CN110178016B - 用于测量荧光寿命的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
根据本发明实施例的荧光寿命测量装置包括：照射光产生单元，其用于产生照射光；荧光光子检测单元，其用于收集在用照射光照射包括荧光分子的样品时产生的荧光光子；转换单元，其用于将收集到的荧光光子转换为第一时钟信号，以及将未经过样品的照射光转换为第二时钟信号；第一模块，其用于根据转换单元分析收集到的荧光光子的荧光寿命；控制单元，其用于根据第一模块指定样品的关注范围(ROI)；以及第二模块，其用于分析对应于ROI的荧光光子的荧光寿命。
Description
技术领域
本发明涉及用于测量荧光寿命的荧光寿命测量装置和方法，更具体地涉及能够检测样品的电性能、热性能和化学性质的荧光寿命测量装置和方法。
背景技术
显微镜分为第一代光学显微镜、第二代电子显微镜和第三代扫描探针显微镜，并且广泛应用于医学科学、分子生物学、新药开发和材料工程。
第一代光学显微镜(宽场显微镜)是使用太阳光或卤素灯作为光源的显微镜，根据光学透镜系统透镜用光圈调节放大率，通过聚光透镜(×15)、物镜(×20/40/100)和投影镜观察样品，使得在高达1500的放大率下进行分析，并且没有针孔(pinhole)。
第二代电子显微镜使用电子束代替光学显微镜的光束，并使用电子透镜代替光学透镜，通过聚光透镜、物镜和投影镜放大并观察聚焦在样本荧光表面上的物体，并且根据其目的分为扫描电子显微镜、透射电子显微镜和反射电子显微镜。电子显微镜可以清楚地观察到光学显微镜(其分辨率受光的波长和短至
的电子束波长的限制)无法分析的病毒和微生物。最近，电子显微镜已被广泛应用于诸如医学、生物学和工程等领域，因为它们可以将图像放大数百万倍，以观察晶体内的原子排列(间隔为
至
)。
第三代扫描探针显微镜可以测量高达原子直径的十分之一，并且是纳米技术开发所必需的先进测量仪器。扫描探针显微镜可以在真空中使用，并且可以识别样品的物理性能和电性能。
同时，最近，荧光寿命显微镜已成为研究的核心。荧光寿命显微镜是一种能够最准确地测量荧光共振能量转移(FRET)的仪器(FLIM-FRET)。FRET是当两种磷光体位于10nm或更小的距离时能量从一种磷光体转移到另一种磷光体而没有光的发射或吸收的现象。由于FRET可以观察到在几纳米或更小的范围内发生并因此用传统的光学显微镜无法看到的现象，因此在诸如细胞膜、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白质-蛋白质相互作用领域等许多生命科学领域中需求越来越大。
发明内容
【技术问题】
根据本发明的实施例，提供了一种允许多荧光分析并且具有快速的测量速度的荧光寿命测量装置和方法。
【技术方案】
根据本发明实施例的荧光寿命测量装置包括：发射光产生单元，其构造成产生发射光；荧光光子检测单元，其构造成收集(collect)通过用所述发射光照射包括荧光分子的样品而产生的荧光光子；转换单元，其构造成将收集到的荧光光子转换为第一时钟信号，并将未经过所述样品的发射光转换为第二时钟信号；第一模块，其构造成根据所述转换单元分析所述收集到的荧光光子的荧光寿命；控制单元，其构造成根据所述第一模块指定所述样品的关注范围(ROI)；以及第二模块，其构造成分析对应于所述ROI的荧光光子的荧光寿命。
所述第一模块可以包括模拟平均时延(AMD)测量单元，所述模拟平均时延测量单元构造成使用所述第一时钟信号的平均时间与所述第二时钟信号的平均时间之间的差来计算所述荧光寿命。
所述第二模块可以包括时间相关单光子计数(TCSPC)测量单元，所述时间相关单光子计数测量单元构造成累积一个荧光光子的时间数据以计算所述荧光寿命。
根据本发明实施例的荧光寿命测量方法可以包括：光产生步骤，在所述光产生步骤中，产生照射光；第一照射步骤，在所述第一照射步骤中，用所述照射光照射样品；模拟平均时延(AMD)测量步骤，在所述模拟平均时延测量步骤中，计算荧光光子检测单元所收集的荧光光子的荧光寿命；控制步骤，在所述控制步骤中，根据所述AMD测量步骤的结果指定所述样品的关注范围(ROI)；以及时间相关单光子计数(TCSPC)测量步骤，在所述时间相关单光子计数测量步骤中，计算对应于所述ROI的荧光光子的荧光寿命。
在控制步骤之后，荧光寿命测量方法还可以包括：调节步骤，在所述调节步骤中，将所述照射光的强度降低到单个光子水平；以及第二照射步骤，在所述第二照射步骤中，重新收集通过用调节后的照射光重新照射所述ROI而产生的荧光光子，其中，所述TCSPC测量步骤可以包括计算在所述第二照射步骤中检测到的荧光光子的荧光寿命。
【本发明的有益效果】
根据本发明的实施例，可以更快地计算样品的荧光寿命。
附图说明
图1是根据本发明实施例的荧光寿命测量装置的框图。
图2是根据本发明实施例的荧光寿命测量方法的流程图。
图3是根据本发明另一实施例的荧光寿命测量方法的流程图。
具体实施方式
通过参考下面结合附图详细描述的实施例，本公开的优点和特征以及实现该优点和特征的方法将变得显而易见。然而，本公开可以以不同的形式实施，并且不应该被解释为限于本文阐述的实施例。相反，提供这些实施例是为了使本公开彻底和完整，并且向本领域技术人员充分传达本发明的范围。因此，本公开的范围仅由所附权利要求限定。
除非另外限定，否则本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。另外，术语(诸如在常用词典中定义的术语)不应以理想化或过于正式的意义来解释，除非本文明确地如此限定。
在下文中，将参考附图描述根据本发明实施例的荧光寿命测量装置10。
图1是根据本发明实施例的荧光寿命测量装置10的框图。参考图1，照射光产生单元100产生能够激发样品S的照射光。照射光以空间平行的方式通过准直器120以脉冲形式相对于时间入射。
入射的照射光经过短通滤波器(SPF)130，然后从二向色滤光器320反射并经过物镜310入射到样品S上。入射照射光从样品S产生荧光光子。
所产生的荧光光子经过物镜310被共焦扫描仪200收集，然后经过二向色滤光器320。
因此，当移除照射光时，荧光光子经过低通滤波器(LPF)，然后通过准直器120聚焦并入射在转换单元400上。
接下来，通过转换单元400将荧光光子转换为第一时钟信号，并且通过数字转换器放大第一时钟信号。放大的第一时钟信号被传输到第一模块500。
第一模块500基于第一时钟信号计算荧光光子的荧光寿命。由第一模块500计算出的荧光寿命被传输到控制单元600，并且控制单元600根据由第一模块计算出的荧光寿命指定样品S的关注范围(ROI)。
接下来，第二模块700分别分析对应于ROI的荧光光子，然后计算荧光寿命。
照射光产生单元100具有被构造成产生照射光以照射包括荧光分子的样品S的结构，并且包括照射光源110。
照射光的脉冲宽度为100psec或更小，并且照射光的波长范围为300nm至700nm。根据本发明实施例的照射光源110包括半导体激光器。
此外，半导体激光器可以包括脉冲宽度为300ps或更小的电脉冲信号发生器、构造成产生稳定触发信号的脉冲时钟单元以及波长为400nm的半导体脉冲激光头。
照射光产生单元100还可包括SPF 130和用于收集照射光的准直器120。
共焦扫描仪200允许三维(3D)成像，并且因此可以以3D方式测量样品S的与时间或光的波长对应的变化。
根据本发明的实施例的共焦扫描仪200包括水平扫描单元和竖直扫描单元。水平扫描单元可以包括检流计镜，并且可以使用检流计镜以非常高的速度执行二维(2D)扫描。竖直扫描单元包括电机驱动装置或压电驱动装置(PZT)。电机驱动装置或压电驱动装置都可以通过开环系统或闭环系统进行调节。
荧光光子检测单元300是收集通过照射样品S而产生的多个荧光光子的模块。荧光光子检测单元300可以包括荧光光子收集透镜310和二向色滤光器320，二向色滤光器320用于防止将在下面描述的转换单元400接收照射光。
荧光光子收集透镜310是收集从样品S产生的大量荧光光子的透镜。荧光光子收集透镜310可以用作物镜310。
二向色滤光器320是根据波长选择性地使入射的照射光通过的滤光器。根据本发明实施例的二向色滤光器320具有反射与照射光对应的波段并使与荧光光子对应的波段通过的特性。然而，可以根据需要调节二向色滤光器320的通过波段或反射波段。
转换单元400是将已经通过二向色滤光器320的荧光光子放大并转换为时钟信号的模块。转换单元400包括光电检测器、放大器和数字转换器。
根据本发明实施例的光电检测器和放大器可以包括光电倍增管(PMT)、雪崩光电二极管(APD)和/或LPF以及放大器。
光电检测器将收集的荧光光子转换为第一时钟信号，使时钟信号与照射光源110同步，然后将时钟信号转换为第二时钟信号。第二时钟信号是基于与照射光源110同步的时钟信号计算出的信号，并且该信号是通过转换从照射光源110发射而不经过样品S的光来获得的。时钟信号被传输到LPF。
LPF是一种使低频通过并暂时放大时钟信号的滤波器。根据本发明实施例的LPF包括电子高斯低通滤波器(GLPF)。
GLPF去除高频部分，以便于时钟信号的数据处理。GLPF是对称实现的，从而没有振铃。GLPF降低时钟信号的带宽，以对应于数字转换器的带宽。
考虑到具有小脉冲宽度的照射光，数字转换器执行用于信号恢复的高频采样。具体地，数字转换器用作AMD测量单元的一部分，其收集时钟信号并基于收集到的时钟信号计算荧光寿命。
第一模块500是用于求出收集到的荧光光子的荧光寿命的模块，并且包括信号收集单元和AMD测量单元。
信号收集单元收集通过转换单元400的转换而获得的第一时钟信号，并收集与照射光源110同步的第二时钟信号。
根据本发明实施例的信号收集单元可以包括电子数据采集(DAQ)板，并且DAQ板可以包括用于收集第一时钟信号的第一通道和用于收集第二时钟信号的第二通道。
AMD测量单元使用第一时钟信号的平均时间和第二时钟信号的平均时间之间的差来计算荧光寿命。计算如下面的等式1所示：
[等式1]
这里，ie(t)是测得的时间荧光光子信号，并且iirf(t)是测量系统的脉冲响应函数(IRF)。<Te>和<Te o>被定义为荧光光子信号的平均时延和IRF的平均时延。为了使用AMD方法获取荧光光子的绝对荧光寿命，应该精确限定和完美匹配等式1中的时间函数ie(t)和iirf(t)的初始时间点(或t＝0的点)。在实验中，ie(t)和iirf(t)通过电子DAQ板测量，并且可以通过来自照射光源110的触发信号获取函数的零点。AMD测量单元具有高测量速度和高寿命精度。另外，由于基于测得的荧光寿命的空间分布来构造图像，因此可以大大减少指定样品S的ROI所需的时间。
控制单元600从第一模块500接收样品S的荧光寿命，将通过划分目标获得的每个区域所对应的荧光寿命与参考值进行比较，并提取ROI和ROI中包括的荧光光子。参考值可以被预先指定并由用户改变。另外，ROI可以包括至少一个区域。此外，ROI是由一条闭合曲线指定的一个区域。同时，除不需要测量荧光寿命的部分之外的剩余部分可以是ROI。
指定ROI，并且将与ROI对应的荧光光子信息传输到第二模块700。第二模块700仅测量对应于ROI的荧光光子的荧光寿命。这里，第二模块700是用于分析对应于ROI的荧光光子的荧光寿命的模块，并且包括时间相关单光子计数(TCSPC)测量单元。
因此，当稍后测量荧光寿命时，仅测量对应于ROI的荧光光子的荧光寿命，而不是测量整个样品S的荧光寿命。因此，可以缩短荧光分析所需的时间。
详细地，TCSPC测量单元通过创建频率分布表来获得荧光寿命，因此应该测量至少100个光子，以获得单个光子的荧光寿命。因此，最终确定单个荧光光子的荧光寿命的时间是10微秒或更长。通常，显微镜图像由超过一百万个像素组成，因此获取整个单个FLIM图像需要10秒以上。
此外，当需要获取3D图像时，需要花费更多的时间。例如，当获取100个2D图像并且期望获取一个3D图像时，测量时间超过15分钟，这是大量的时间。
相反，根据本发明实施例的TCSPC测量单元仅测量与控制单元600所指定的ROI对应的样品S就足够了，因此测量时间显著小于获得整个样品S的3D图像所需的时间。
同时，为了使第二模块700分析荧光光子的荧光寿命，控制单元600可以调节照射光。例如，控制单元600将照射光脉冲之间的时间间隔调节为比荧光光子的荧光寿命长。当照射光脉冲之间的时间间隔类似于荧光寿命时，两个相邻荧光光子的波形相对于时间彼此重叠，使得不能获得准确的值。因此，为了使第二模块700执行准确分析，控制单元600可以将照射光的脉冲周期调节为荧光寿命τ的五倍或更多，并且可以调节照射光的强度。
TCSPC测量单元通过相对于单个光子的数十MHz的高光子检测率来计算第一时钟信号和第二时钟信号之间的时间差数据，累积时间差数据，并计算荧光寿命。无论由单个光子引起的响应脉冲的形状宽度沿时间轴有多长，都可以精确地测量单个光子的到达时间。当仅感测到单个光子时，可以通过检测测得的单光子响应的上升沿的到达时间来测量单个光子的到达时间。
同时，收集到大量荧光光子时获得的荧光波形变得与具有指数衰减形状的荧光的概率分布函数相同。在这种情况下，当在t＝0时利用具有非常短的脉冲宽度的照射光进行照射时，使用下面的等式2计算由于照射而产生的荧光光子密度IF(t)：
[等式2]
IF(t)＝I0e-t/τu(t)
这里，I0是初始值，τ是荧光寿命，当t<0时函数u(t)表示为零，而当t≥0时函数u(t)表示为一。也就是说，荧光寿命是指荧光光子的发射概率与初始值相比减少1/e所花费的时间。在显微镜应用中使用的大多数荧光材料的荧光寿命范围为0.1ns至5ns。
到目前为止已经描述了根据本发明实施例的荧光寿命测量装置10的构造。下面将描述根据本发明实施例的荧光寿命测量方法20。荧光寿命测量方法包括由图1所示的荧光寿命测量装置10处理的步骤。因此，将省略与上述内容重复的内容，并且省略的内容也可以应用于根据本发明实施例的荧光寿命测量方法20。
图2是根据本发明实施例的荧光寿命测量方法20的流程图。
参考图2，步骤21是第二时钟信号测量步骤，其中使用荧光寿命测量装置10产生照射光，并且针对不经过样品S的照射光测量第二时钟信号的平均时间。
步骤22是光产生步骤，其中为荧光寿命测量装置10准备包括荧光分子的样品S，并产生照射光以照射样品S。
步骤23是第一照射步骤，其中用照射光照射样品S。在这种情况下，通过荧光光子收集单元检测从样品S产生的荧光光子。另外，收集到的荧光光子被放大，然后转换成第一时钟信号。
步骤24是模拟平均时延(AMD)测量步骤，其中通过第一模块500(AMD)使用第一时钟信号的平均时间和第二时钟信号的平均时间之间的差来计算荧光寿命。在这种情况下，可以通过在非常短的时间内的简单计算来测量样品S的特定范围的荧光寿命。
步骤25是控制步骤，其中控制单元600根据第一模块500(AMD)的结果指定样品S的ROI。作为实例，可以根据第一模块500的结果来确定ROI的指定。
作为另一实例，可以通过第一模块500的结果与预先存储的参考值之间的比较来确定ROI的指定。ROI可以是由一条闭合曲线指定的一个区域，或者可以是除一条闭合曲线之外的剩余部分。
如上所述，指定的ROI将由第二模块700(时间相关单光子计数；TCSPC)测量。另一方面，样品的除ROI之外的剩余区域不由第二模块700测量。因此，可以将所需的测量时间减少样品S的除ROI之外的剩余区域的测量时间。
步骤26是TCSPC测量步骤，其中通过对单个光子进行数百至数千次计数而由第二模块(TCSPC)创建频率分布表，然后测量对应于ROI的荧光光子的荧光寿命。
下面将描述根据本发明另一实施例的荧光寿命测量方法30。根据本发明另一实施例的荧光寿命测量方法30包括由图1所示的荧光寿命测量装置10处理的步骤。相应地，将省略与上述那些内容重复的内容，并且省略的内容也可以应用于根据本发明另一实施例的荧光寿命测量方法30。
图3是根据本发明另一实施例的荧光寿命测量方法30的流程图。
参考图3，步骤31是第二时钟信号测量步骤，其中使用荧光寿命测量装置10产生照射光，并且针对不经过样品S的照射光测量第二时钟信号的平均时间。
步骤32是光产生步骤，其中为荧光寿命测量装置10准备包括荧光分子的样品S，并产生照射光以照射样品S。
步骤33是第一照射步骤，其中用照射光照射样品S。在这种情况下，通过荧光光子收集单元收集从样品S产生的荧光光子。另外，收集到的荧光光子被放大，然后转换成第一时钟信号。
步骤34是模拟平均时延(AMD)测量步骤，其中通过第一模块500(AMD)使用第一时钟信号的平均时间和第二时钟信号的平均时间之间的差来计算荧光寿命。在这种情况下，可以通过在非常短的时间内的简单计算来测量样品S的特定范围的荧光寿命。
步骤35是控制步骤，其中控制单元600根据第一模块500(AMD)的结果指定样品S的关注范围(ROI)。作为实例，可以根据第一模块500的结果来确定ROI的指定。作为另一实例，可以通过第一模块500的结果与预先存储的参考值之间的比较来确定ROI的指定。ROI可以是由一条闭合曲线指定的一个区域，或者可以是除一条闭合曲线之外的剩余部分。
步骤36是调节步骤，其中控制单元600将照射光的强度调节并降低到单个光子水平。在这种情况下，当通过第二模块700测量荧光寿命时，可以通过测量每个脉冲一个光子来绘制直方图。
步骤37是第二照射步骤，其中用具有调节后的光强度的照射光重新照射ROI。再次从被重新照射的样品S产生荧光光子，并且重新收集所产生的荧光光子。
步骤38是TCSPC测量步骤，其中通过对单个光子进行数百至数千次计数而由第二模块(TCSPC)重新创建频率分布表，然后测量对应于ROI的荧光光子的荧光寿命。
Claims (3)
1.一种荧光寿命测量装置，包括：
照射光产生单元，其构造成产生照射光；
荧光光子检测单元，其构造成收集通过用所述照射光照射包括荧光分子的样品而产生的荧光光子；
转换单元，其构造成将收集到的荧光光子转换为第一时钟信号，并将未经过所述样品的照射光转换为第二时钟信号；
第一模块，其构造成根据所述转换单元分析所述收集到的荧光光子的荧光寿命，所述第一模块包括模拟平均时延(AMD)测量单元，所述模拟平均时延测量单元构造成使用所述第一时钟信号的平均时间与所述第二时钟信号的平均时间之间的差来计算所述荧光寿命；
控制单元，其构造成根据所述第一模块所分析的荧光寿命来指定所述样品的关注范围(ROI)，并且所述控制单元将所述照射光的脉冲周期调节为所述荧光寿命的五倍或更多；以及
第二模块，其构造成分析对应于所述ROI的荧光光子的荧光寿命，所述第二模块包括时间相关单光子计数(TCSPC)测量单元，所述时间相关单光子计数测量单元构造成累积一个荧光光子的时间数据以计算所述荧光寿命。
2.一种荧光寿命测量方法，包括：
光产生步骤，在所述光产生步骤中，产生照射光；
第一照射步骤，在所述第一照射步骤中，用所述照射光照射样品；
模拟平均时延(AMD)测量步骤，在所述模拟平均时延测量步骤中，计算荧光光子检测单元所收集的荧光光子的荧光寿命；
控制步骤，在所述控制步骤中，根据所述AMD测量步骤中所计算的荧光寿命来指定所述样品的关注范围(ROI)；
将所述照射光的脉冲周期调节为所述荧光寿命的五倍或更多的步骤；以及
时间相关单光子计数(TCSPC)测量步骤，在所述时间相关单光子计数测量步骤中，计算对应于所述ROI的荧光光子的荧光寿命。
3.根据权利要求2所述的荧光寿命测量方法，在所述控制步骤之后还包括：
调节步骤，在所述调节步骤中，将所述照射光的强度降低到单个光子水平；以及
第二照射步骤，在所述第二照射步骤中，重新收集通过用调节后的照射光重新照射所述ROI而产生的荧光光子，
其中，所述TCSPC测量步骤包括计算在所述第二照射步骤中检测到的荧光光子的荧光寿命。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| FLIM data analysis of NADH and Tryptophan autofluorescence in prostate cancer cells;Meghan J. O’Melia et al.;《Proc. of SPIE》;20160314;第9712卷;97122E-1至97122E-6 * |
| High-speed confocal fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) with the analog mean delay (AMD) method;Youngjae Won et al.;《OPTICS EXPRESS》;20110207;第19卷(第4期);3396-3405 * |
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