WO2018096196A1 - Compuestos acilados para el tratamiento de patologías oculares - Google Patents

Compuestos acilados para el tratamiento de patologías oculares Download PDF

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WO2018096196A1
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resveratrol
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glucopyranoside
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PCT/ES2017/070760
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Juan Carlos MORALES SÁNCHEZ
Pablo PEÑALVER PUENTE
Francisco Javier DÍAZ CORRALES
María Lourdes VALDÉS SÁNCHEZ
Ana Belén GARCÍA DELGADO
Adoración MONTERO SÁNCHEZ
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • the present invention relates to the therapeutic use of piceid derivatives added in ocular pathologies, in particular in degeneration of the retina. Therefore, the present invention can be encompassed within the pharmaceutical field.
  • RP TECHNIQUE Retinitis pigmentosa
  • AMD age-related macular degeneration
  • Patent application WO2007020673A1 describes compounds derived from glycosylated hydroxystilbenes that could be useful for the treatment of some eye diseases.
  • Piceido derivatives (3-glucosylresveratrol) added have been proposed for the treatment of diseases of intestinal inflammation (ES2362065A1) and as antibiotics (Selma MV et al., J. Agrie. Food. Chem. 2012, 60 (30), 7367-74 ).
  • the present invention provides compounds useful for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of eye diseases.
  • the examples show how some derivatives derived from Resveratrol induces the protection of photoreceptors in two animal models of retinal degeneration.
  • the present invention relates to the use of compounds of general formula (I)
  • Ri is a (C 1 -C 22 ) alkyl group or a (C7-C 22 ) alkenyl group. preferably R 1 is a (C 1 -C 22 ) alkyl group;
  • R 1 is a (C 2 -C 20 ) alkyl group, more preferably it is a (C 3 -C 17 ) alkyl group.
  • alkyl refers, in the present invention, to aliphatic, linear or branched chains, having 1 to 22 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, n-hexyl, etc.
  • the alkyl group has between 2 and 20 carbon atoms, and more preferably it has between 3 and 17 carbon atoms.
  • alkenyl refers, in the present invention, to unsaturated, linear or branched aliphatic chains, having 2 to 22 carbon atoms, and having between one and six unsaturations, depending on the number of carbons, by For example, not limited to vinyl, allyl, oleyl, linoleyl, linolenyl, eicosapentaenoyl, docosahexaenoyl, etc.
  • the compounds of the invention can be selected from:
  • trans-resveratrol-3-0 (6'-0-octadecanoyl) -pD-glucopyranoside (4) and any combination thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated for administration in a variety of ways known in the state of the art. Examples of preparations include any solid composition (tablets, pills, capsules, granules, etc.) or liquid (solutions, suspensions or emulsions) for oral, topical or parenteral administration.
  • the composition of the present invention can also be in the form of sustained release formulations of drugs or any other conventional release system, so it can be contained, but not limited to, in nanoparticles, liposomes or nanospheres, in a polymeric material, in a polymeric material. Biodegradable or non-biodegradable implant or in biodegradable microparticles, such as biodegradable microspheres.
  • compositions and / or its formulations may be administered to an animal, including a mammal and, therefore, to man, in a variety of ways, including, but not limited to, intraperitoneal, intravenous, intradermal, intraspinal, intrastromal, intraarticular, intrasynovial, intrathecal, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, intracranial, subcutaneous, intraorbital (sub-retinal, intravitreal), intracapsular, topical, using transdermal patches, percutaneous, nasal spray, surgical implant, internal surgical paint or infusion pump.
  • the composition of the invention is formulated for ophthalmic administration.
  • formulated for ophthalmic administration refers to a formulation that allows the composition of the invention to be administered ocularly, for example, but not limited to, topically or infraocularly, without such administration negatively affecting the properties, for example optical and / or physiological, of the eye.
  • composition of the invention formulated for ophthalmic administration are, but not limited to, said composition associated with water, salts, a polymeric or semi-solid liquid carrier, a phosphate buffer or any other ophthalmically acceptable liquid carrier of known in the state of the art.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a controlled release system of the compounds of the invention, more preferably they comprise cyclodextrins and even more preferably 2-hydroxypropyl beta cyclodextrin.
  • another aspect of the present invention relates to an ophthalmological composition
  • an ophthalmological composition comprising at least one compound of formula (I) as described above together with a controlled release system, in particular a cyclodextrin, and more specifically with 2- hydroxypropyl beta cyclodextrin.
  • the present invention relates to a method of treatment and / or prevention of ocular pathology in a mammal, preferably a human, comprising the administration of a therapeutically effective amount of a composition of general formula (I) as described above. .
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as, for example, the age, weight, sex or tolerance of the individual to whom the composition of the invention is to be administered.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the composition (I), calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of the composition, age, condition and history of the patient, the severity of the disorder or disorder, and the route and frequency of administration.
  • the ocular pathologies of the present invention can be selected from:
  • Hereditary degenerative pathologies of the retina encompassed pigmentary retinosis and all those pathologies within the group of retinal dystrophies where they are included, for example, but not limited to: autosomal dominant pigmentary retinosis, autosomal recessive pigmentary retinosis, X-linked pigment retinosis, sporadic pigmentary retinosis, pigmentary retinosis associated with other syndromes, Cokayne syndrome, cone dystrophies, degeneration of cones and canes, congenital Leber amaurosis, retinitis punctata albescens, choroideremia, choroid and retinal atrophy, choroidal dystrophy, generalized choroidal dystrophy Wagner vitreoretinal degeneration, autosomal dominant vitreoretinocoroidopathy, fundus albipunctatus, Stargardt's disease, Best viletiform macular dystrophy, Usher's syndrome, Bardet-Biedl's syndrome, fenestrated macular
  • Degenerative inflammatory pathologies of the retina and optic nerve of infectious, immune, vascular, traumatic, post-surgical or teratogenic origin such as: ocular toxoplasmosis, cryptococcosis, lupus, Behcet's disease, diabetic retinopathy, ischemic optic neuropathy, optic neuritis, retinal detachment, vitrectomy, internal limiting membrane stripping, surgery, retinoblastoma, etc.
  • Ocular pathologies that increase intra-ocular pressure and that occur with degeneration of retinal ganglion cells and optic nerve atrophy such as: open or closed angle glaucoma.
  • Neurological pathologies that are accompanied by degenerative lesions of the retinal or optic nerve such as: amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Graefe syndrome, Hallgren's syndrome, Hallen Vorden Spatz's syndrome, ataxia Autosomal dominant cerebellar and retinal pigmentary degeneration.
  • telomeres telomeres due to cellular aging or oxidative stress.
  • eye pathologies are selected from retinitis pigmentosa and age-related macular degeneration.
  • FIG. 1 Cell viability in neuroblastoma SH-SY5Y after damage with H 2 0 2 and treatment with the different compounds 1-4.
  • FIG. 2 Cellular viability in RAW macrophages after inflammation produced with LPS and treatment with the various compounds 1-2.
  • FIG. 3 Concentration of TNF-alpha in culture medium after LPS inflammation in RAW macrophages and treatment with compound 2 and the RES control.
  • FIG. 4 NO concentration in culture medium after LPS inflammation in RAW macrophages and treatment with compound 2 and the RES control.
  • FIG. 5 Concentration of IL6 in culture medium after LPS inflammation in RAW macrophages and treatment with compound 2 and the RES control.
  • FIG. 6 AChE activity with respect to the control of compound 2 and the RES control.
  • FIG. 7 Fundus of normal C57 / bl6 mouse (WT) (A), of untreated rd10 mouse (B) and injected with 5 mM of compound 2 (C) at 15 days after administration of the sub-retinal compounds . The absence of pigment in the fundus of the mouse treated with compound 2 is observed.
  • FIG. 8 Normal c57 / bl6 mouse electroretinogram (WT), untreated rd10 mouse, 5% DMSO vehicle, 5 mM resveratrol (RES) and 5 mM compound 2, 15 days after sub-retinal injection.
  • the amplitude of the waves a and b was preserved in the treated group with compound 2 in a greater proportion than in untreated rd10 mice or treated with RES or with 5% DMSO vehicle.
  • FIG. 9 Amplitude of wave b in untreated rd10 mice, treated with 5% DMSO vehicle, with 5 mM RES and with 5 mM of compound 2, 15 days after sub-retinal injections. Each bar represents the average of wave b in 6 mice for each group ⁇ the standard error of the mean. The amplitude of the b wave was significantly increased in the mice treated with compound 2 in the dark-adapted ERG with the flash intensities of 0.2, 1, 3 and 10 cd xs / m 2 . Statistical analysis was performed by one-way ANOVA with post hoc DMS test * p ⁇ 0.05;#p ⁇ 0.01.
  • FIG. 10 Immunofluorescence of normal c57 / bl6 mouse (WT) (A, G, M), untreated rd10 mouse (B, H, N), or vehicle treated rd10 mice (C, I, O), with 5 mM RES ( D, J, P) and with 5 mM of compound 2 (F, L, R) 15 days after sub-retinal injections. Sections of the retina were immuno-stained with anti-rhodopsin antibodies (red) to mark the rods and anti-opsin (green) to mark the cones. The nuclei were stained with DAPI.
  • FIG. 11 Fundus and retinal autofluorescence in normal mice (WT control), untreated mice (Kl control) and mice treated with drops
  • FIG. 12 Retinal thickness quantified through OCT in normal mice (WT control), mice and mice treated with drops
  • FIG. 13 Evaluation of c-wave amplitude in normal mice (WT control), mice and mice treated with eye drops
  • the amplitude of the c wave was measured by ERG (A) and then the amplitude of the b (B) wave was quantified, as well as the c / b (C) wave ratio was estimated.
  • FIG. 14 Optomotor test showing the visual acuity curve in normal mice (WT control), control mice) and mice treated with
  • the normality of the data was confirmed by a Kolmogorov-Smirnov test at all spatial frequencies except 0.031 and 0.061.
  • two-way ANOVA was performed related to the different frequencies and the groups (P ⁇ 0.001) and post hoc LSD test. * P ⁇ 0.05 Kl control vs Kl RES or ** P ⁇ 0.001 Kl control vs Kl 2.
  • the SH-SY5Y neuroblastoma line was cultured in petri dishes pre-treated with collagen (100 ⁇ / ⁇ ) with F12 medium supplemented with penicillin / streptomycin and 10% of inactivated fetal bovine serum.
  • Cell viability tests with neurons were done in 96-well plates pre-treated with collagen by sowing 20,000 cells / well in a volume of 100 ⁇ and incubating the cells 24 hours before the compounds were added.
  • the compounds to be tested were dissolved in DMSO and added at three different concentrations (1, 10 and 100 ⁇ ) to determine their toxicity. The final percentage of DMSO in each well was adjusted to 1%.
  • Cell viability was evaluated 24h after the addition of the compounds by the MTT assay, according to the manufacturer's procedure. The mean values and standard deviations were calculated from at least 8 different measurements of several independent experiments.
  • Neuroprotection tests Neurons were cultured and seeded in the same manner as for the cell viability assay.
  • the compounds to be tested were dissolved in DMSO and added at three different concentrations (1, 10 and 100 ⁇ ) and after a 10 minute incubation hydrogen peroxide (100 ⁇ ) was added to the medium. The final percentage of DMSO in each well was adjusted to 1%.
  • Cell viability was evaluated 24h after the addition of the compounds by the MTT assay, according to the manufacturer's procedure. The mean values and standard deviations were calculated from at least 8 different measurements of several independent experiments. Neural recovery was calculated by normalizing the results of the neuronal viability experiments after the addition of our compounds and H 2 0 2 to that of the positive control of each experiment (neurons + H 2 0 2 ).
  • RAW 264.7 macrophages were cultured in P75 with DMEm high glucose supplemented with Penicillin / Streptomycin and 10% inactivated fetal bovine serum.
  • Cell viability assays with RAW macrophages were done in 96-well plates by seeding 25,000 cells / well in a volume of 100uL and incubating the cells for 4h before adding the compounds.
  • the compounds to be tested were dissolved in DMSO and added at three different concentrations (1, 10 and 100 ⁇ M) to determine their toxicity. The final percentage of DMSO in each well was adjusted to 1%.
  • Cell viability was evaluated 24h after the addition of the compounds by the MTT assay, according to the manufacturer's procedure. The mean values and standard deviations were calculated from at least 8 different measurements of several independent experiments.
  • NO levels in 24-hour supernatants were measured indirectly by determining the concentration of nitrite in the medium using Gr ⁇ ess's reagent (Anderson et al., Gut. 2013; 62: 1131-1141). A minimum of two independent experiments and three replicates per experiment were performed for each measured value. Values are expressed as the mean ⁇ standard deviation. In the previous test, the levels of various inflammation parameters (TNF- ⁇ , NO and IL-6) were measured by ELISA after treatment with RES or with compound 2 (Fig. 3, 4 and 5).
  • Example 4 Evaluation of the neuroprotective capacity of several silylated compounds in a zebrafish larva-induced neurodeaeneration model (PTZ).
  • the objective of this test was to analyze the protective effect of compound 2 and the resveratrol control (RES) in a neurotoxin model induced by the pentylentetrazole neurotoxin (PTZ).
  • RES resveratrol control
  • PTZ pentylentetrazole neurotoxin
  • the zebrafish larva Diagonal rerio was used to study the effect of the compounds on acetylcholinesterase activity (AChE) in 5-day post-fertilization larvae (dpf).
  • AChE is an enzyme that degrades through its hydrolytic activity the neurotransmitter acetylcholine in choline and an acetate group. It is found mainly in the neuromuscular junctions and in the cholinergic nervous system, where its activity serves to terminate the synaptic transmission (Behra eta al, Nat Neurosa. 2002 Feb; 5 (2): 111-8.).
  • Acetylcholine is a neurotransmitter involved in motion control and an important modulator of cognitive functions such as learning and memory (Hasselmo et al, Neuropsychopharmacology. 2011 Jan; 36 (1): 52-73). Therefore, adequate levels of acetylcholinesterase reflect a healthy neuronal state.
  • Zebrafish embryos were seeded in 50 mL of dilution water (AD) in a Petr ⁇ plate and grown to 5 dpf (larval state). To carry out the test, only those larvae that did not present any external anomaly were used. Then, by using a Pasteur pipette, the larvae were transferred to a 24-well microplate, so that each well contained five larvae, making ten replicates per condition. First, the pretreatment of the 5 dpf larvae was performed.
  • AD dilution water
  • the larvae were incubated in a volume of 2 mL of AD for the two groups Control (Control and Control + PTZ), of physostigmine 20 ⁇ (Phys, from the English term Physostigmine) which is a commercial AChE enzyme inhibitor for the Phys group, and of the test compounds at a concentration of 10 ⁇ at 26 ⁇ 1 ° C for 1 hour. Subsequently, a replacement of the medium was performed and the larvae were incubated with the compounds in combination with 5 mM PTZ for 6 hours at 26 ⁇ 1 ° C. After this incubation time, all the larvae were examined and it was determined that the general condition of the larvae was completely normal, without any visible anomaly or abnormal behavior.
  • the larvae were processed for the analysis of AChE activity. Determination of AChE levels. Once the experimental period was over, the larvae were processed for the determination of AChE according to the technical study protocol (Measurement of acetylcholinesterase activity (AChE) in cell cultures and zebrafish larvae). The larvae were mechanically homogenized and the samples were centrifuged to obtain the supernatant, which were used to determine AChE enzyme levels based on the treatments administered. Additionally, the determination of the total protein of each experimental group was carried out according to the technical study protocol (Protein quantification by BCA, as a normalization process). Finally, the AChE levels determined in the control group were taken as a reference measure, considering them as 100%. Compound 2 significantly prevents the decrease in AChE activity induced by PTZ in 5dpf larvae, showing a clear neuroprotective effect and that is superior to that observed for RES (see Fig. 6).
  • Example 5 Toxicity test in zebrafish.
  • Incubation of 20 zebrafish embryos was performed for each concentration of compound to be tested (1 to 4).
  • the concentrations used of each compound are 0.1 ⁇ , 1 ⁇ , 10 ⁇ , 100 ⁇ and 1 mM.
  • the incubation time ranges from 0 to 96 hours post fertilization (hpf).
  • a negative control of 1% DMSO and a positive control of ⁇ , ⁇ -diethylaminobenzaldehyde (DEAB) are included.
  • the LC50 is calculated (lethal dose for 50% of the animals).
  • the zebrafish embryo toxicity test was carried out for compound 2 and resveratrol control (RES) and both showed an acceptable toxicity (LC50 ⁇ 140 ⁇ M) and (LC50 ⁇ 1000 ⁇ M), respectively.
  • RES resveratrol control
  • the rd 10 mouse is a model of retinitis pigmentosa due to a mutation in the Pde6b gene that leads to the degeneration of photoreceptors that begins on postnatal day 15-16 (P15-16) and is completed within a month ( P30).
  • degeneration begins in the rods and then continues with cones and finally the retinal pigment epithelium (RPE).
  • RPE retinal pigment epithelium Degeneration in this model occurs as a result of the loss of Pde6b function, which eventually leads to a continuous entry of Ca ++ in the rods with an important production of oxygen free radicals (ROS), macrophage infiltration and activation. of pro apoptotic proteins.
  • ROS oxygen free radicals
  • a loss of nuclei in the outer nuclear layer of the retina is evidenced, as well as the loss of specific markers of rods (rodopsin) and cones (opsin).
  • the electroretinogram (ERG) which measures the electrical response of the retina to visual stimuli, is markedly affected in rd10 mice with progressive loss of the amplitude of the a and b waves of the ERG.
  • the fundus that evaluates the macroscopic morphology of the fundus shows changes a month after age in rd10 mice with accumulation of dark pigments in the periphery due to degeneration of RPE.
  • mice Homozygous rd10 mice were injected into the sub-retinal space at P13 (two to three days before the onset of degeneration) with 1 ⁇ _ of vehicle (5% DMSO in PE3S) or the resveratrol RES (5 mM) compounds, and the compound 2 (5 mM). Then, 15 days after being injected, the fundus, ERG and histological changes in the untreated mice, treated with the vehicle or with the RES and 2 compounds were evaluated. The evaluation of the fundus showed a lower amount of pigment accumulation in the retinas of mice treated with compound 2 compared to untreated mice (Fig. 7).
  • the ERG in the treated mice was also evaluated 15 days after the injections.
  • the amplitude of the a and b waves were quantified in the ERGs, and the statistical analysis was performed using Two-way ANOVA and post hoc DMS. A value of p ⁇ 0.05 was considered significant.
  • the b-wave amplitude in the ERG of dark-adapted mice (flash intensities of 0.2, 1, 3 and 10 x cd s / m 2) underwent a significant increase in the group of mice treated with compound 2 in comparison with controls (Fig. 8 and 9).
  • the immunofluorescence study was carried out to observe the presence of stick markers (rhodopsin) and cones (opsin) (Fig. 10).
  • the number of photoreceptor nuclei present in the outer nuclear layer (ONL), as well as the immuno-staining of rhodopsin was much higher in rd10 mice treated with compound 2 than in those treated with RES and in controls.
  • P / p / 37 A2.6P / f mice are a useful model to assess the degeneration of RPE.
  • This model is characterized by an increase in the thickness of the Bruch membrane and accumulation of esterified cholesterol between said membrane and the RPE produced by default in the splicing of mRNA of relevant genes of the visual cycle such as RPE65 and RDH12.
  • the accumulation of toxic products derived from retinol leads to an increase in ROS, macrophage infiltration and primary degeneration of RPE.
  • RPE degeneration occurs late at approximately 8 months of age.
  • the phenotypic characteristics of this model can be exacerbated by exposure to a low light of intense light and are mainly characterized by accumulation of pseudo-drusenoid lesions and areas of atrophy observed in the Fundus, in addition to presenting loss of visual acuity and contrast perception, there is a decrease in the amplitude of the c-wave of the ERG and decrease in the thickness of the retina.
  • ep / + (Kl) heterozygous mice which were treated topically with 20 ⁇ _ of the directly applied compounds studied on the corneal surface daily (LV) for 2 and a half months.
  • the compounds used were RES and compound 2, which were diluted in a solution of 13% hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (CYCLE) to obtain a final concentration of 2 mM of each compound.
  • CYCLE hydroxypropyl-beta-cyclodextrin
  • the Kl mutant mice were exposed to a 5,000 lux light source for 3 hours.
  • Normal mice (WT) and Kl without receiving any treatment were also exposed to intense light as a test control.
  • the fundus of the animals was evaluated, in addition to visual acuity through the optomotor test, retinal thickness by optical coherence tomography (OCT) and amplitude of the c-wave by ERG.
  • OCT optical coherence tomography
  • the fundus classified as abnormal were those where the presence of autofluorescent pseudo-drusenoid lesions was observed (Fig. 11; arrows) or with areas of focal atrophy (Fig. 11; arrowheads).
  • the percentage of abnormal fundus in the WT mice exposed to light was 20% and in the untreated Kl (control Kl) it was 90%. While this percentage was reduced to 30% in mice treated with compound 2 (Kl 2) and only 60% in both mice treated with CYCLE (Kl CYCLE) and RES (Kl RES) (Table 1) .
  • a Stratus OCT Zeiss
  • a scanner set to 6 lines of 3.45 mm each arranged radially. 6 measurements were made in each eye and then the retinal map was made (Fig. 12) with the thickness of the retina quantified from the ganglion cell layer to the RPE.
  • the thickness of the retina was significantly greater in the groups treated with RES and compound 2 when compared with the Kl control group (Fig. 12; C), these results show that treatment with SIRT1 activators prevented the production of atrophy of the retina in Kl mice after exposure to an intense light source.
  • SIRT1 activators prevented the production of atrophy of the retina in Kl mice after exposure to an intense light source.
  • the c wave is defined as a positive slow wave that appears after the b wave and serves to measure the functional integrity of the RPE.
  • the amplitude of this wave can be affected by the integrity of the photoreceptors, for its best assessment it is convenient to normalize the results with the amplitude of the b wave, therefore the quantification of the proportion of the c-wave amplitude between the amplitude of wave b (wave rate c / b) (Fig. 13).
  • the c / b wave ratio was significantly higher in the group treated with compound 2 suggesting that the functional integrity of the RPE in this group was maintained.
  • the optomotor test was performed, which consists of the evaluation of the optokinetic visual monitoring reflex that is stimulated by the rotational movement of different horizontal black and white serrated bars.
  • the response to this visual stimulus is manifested by a cervical follow-up movement in the same direction as the rotation of the bars. Cervical movement is recorded with a camera and the spatial frequency of the bars varies randomly as does the direction of rotation of the bars.
  • the optomotor test was evaluated at 6 different spatial frequencies (0.031, 0.061, 0.092, 0.103, 0.194 and 0.272 cycles / degree) and the spatial vision was measured by the number of positive responses.

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Abstract

La presente invención se refiere al uso terapéutico de compuestos derivados piceido acilados en patologías oculares, en particular retinitis pigmentosa y en degeneración macular asociada a la edad, entre otras.

Description

COMPUESTOS ACILADOS PARA EL TRATAMIENTO DE PATOLOGÍAS
OCULARES
La presente invención se refiere al uso terapéutico de derivados piceido adiados en patologías oculares, en particular en degeneración de la retina. Por tanto, la presente invención se puede englobar dentro del campo farmacéutico.
ESTADO DE LA TÉCNICA La retinosis pigmentaria (RP) y la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) son una causa de ceguera en la población adulta debida a la degeneración de fotorreceptores y del epitelio pigmentario de la retina (EPR). La RP es una enfermedad rara, pero la prevalencia de la DMAE es bastante alta estimándose en un 8-16% de la población entre 50 y 64 años. A pesar de su alta prevalencia la variedad seca de la DMAE no tiene tratamiento al igual que la RP.
En la solicitud de patente WO2007020673A1 se describen compuestos derivados de hidroxiestilbenos glucosilados que podrían ser útiles para el tratamiento de algunas enfermedades oculares. Derivados piceido (3-glucosilresveratrol) adiados se han propuesto para el tratamiento de enfermedades de inflamación intestinal (ES2362065A1) y como antibióticos (Selma MV et al., J. Agrie. Food. Chem. 2012, 60(30), 7367-74).
Sin embargo, en la actualidad no existen tratamientos efectivos que puedan evitar o enlentecer el proceso degenerativo de los fotorreceptores o del EPR en la DMAE seca ni en la RP. Por lo tanto, sería conveniente la búsqueda de nuevas moléculas útiles para el tratamiento o la prevención de estas y otras enfermedades oculares que cursen con degeneradón de la retina. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona compuestos útiles para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevendón de enfermedades oculares. Para ello, en los ejemplos se demuestra cómo algunos derivados adiados de resveratrol inducen la protección de los fotorreceptores en dos modelos animales de degeneración retiniana.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de compuestos de fórmula general (I)
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(I)
o cualquiera de sus isómeros, o cualquiera de sus sales, preferiblemente cualquier sal farmacéuticamente aceptable, ésteres, tautómeros, polimorfos, hidratos farmacéuticamente aceptables, o profármacos, derivados, solvatos o análogos, o cualquiera de sus combinaciones,
donde:
Ri es un grupo alquilo (C1-C22) o un grupo alquenilo (C7-C22). preferiblemente R1 es un grupo alquilo (C1-C22);
para la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de patologías oculares.
En una realización preferida, R1 es un grupo alquilo (C2-C20), más preferiblemente es un grupo alquilo (C3-C17).
El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 22 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n- propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 2 y 20 átomos de carbono, y más preferiblemente tiene entre 3 y 17 átomos de carbono.
El término "alquenilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas alifáticas insaturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 2 a 22 átomos de carbono, y que poseen entre una y seis insaturaciones, dependiendo del número de carbonos, por ejemplo, sin limitarse a vinilo, alilo, oleilo, linoleilo, linolenilo, eicosapentaenoilo, docosahexaenoilo, etc.
En una realización preferida, los compuestos de la invención se pueden seleccionar de entre:
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trans-resveratrol-3-0-(6'-0-butanoil)-p-D-glucopiranósido (1),
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trans-resveratrol-3-0(6'-0-octadecanoil)-p-D-glucopiranósido (4) y cualquiera de sus combinaciones. La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, pildoras, cápsulas, granulos, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, tópica o parenteral. La composición de la presente invención también puede estar en forma de formulaciones de liberación sostenida de drogas o de cualquier otro sistema convencional de liberación, así puede estar contenida, aunque sin limitarnos, en nanopartículas, liposomas o nanoesferas, en un material polimérico, en un implante biodegradable o no biodegradable o en micropartículas biodegradables, como por ejemplo, microesferas biodegradables.
Tal composición y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, intraperítoneal, intravenosa, intradérmica, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarteríal, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital (sub-retinal, intravítrea), intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna o bomba de infusión.
En una realización aún más preferida, la composición de la invención se encuentra formulada para su administración oftálmica. La expresión "formulada para su administración oftálmica" se refiere a una formulación que permita que la composición de la invención pueda ser administrada ocularmente, por ejemplo, aunque sin limitarnos, de manera tópica o de manera infraocular, sin que dicha administración afecte negativamente a las propiedades, por ejemplo ópticas y/o fisiológicas, del ojo.
Ejemplos de la composición de la invención formulada para su administración oftálmica son, aunque sin limitarnos, dicha composición asociada a agua, a sales, a un vehículo líquido polimérico o semi-sólido, a un tampón fosfato o a cualquier otro vehículo líquido oftálmicamente aceptable de los conocidos en el estado de la técnica.
En una realización preferida, la composición fármaceutica de la invención comprende un sistema de liberación controlada de los compuestos de la invención, más preferiblemente comprenden ciclodextrinas y aún más preferiblemente 2-hidroxipropil beta ciclodextrina.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición oftalmológica que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) según se han descrito anteriormente junto con un sistema de liberación controlada, en particular una ciclodextrina, y más concretamente con 2-hidroxipropil beta ciclodextrina.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de patología oculares en un mamífero, preferiblemente un humano, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de fórmula general (I) según descrita anteriormente.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia del individuo al que le va a ser administrada la composición de la invención. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la composición (I), calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de la composición, la edad, estado y antecedentes del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
Las patologías oculares de la presente invención se pueden seleccionar de:
1. Patologías hereditarias degenerativas de la retina englobadas la retinosis pigmentaria y todas aquellas patologías dentro del grupo de distrofias retinianas donde se incluyen, por ejemplo, pero sin limitarse: retinosis pigmentaria autosómica dominante, retinosis pigmentaria autosómica recesiva, retinosis pigmentaria ligada al cromosoma X, retinosis pigmentaria esporádica, retinosis pigmentaria asociada a otros síndromes, síndrome de Cokayne, distrofias de conos, degeneración de conos y bastones, amaurosis congénita de Leber, retinitis punctata albescens, coroideremia, atrofia girata de coroides y retina, distrofia coroidea generalizada, retinosquisis juvenil, degeneración vitreo-retiniana de Wagner, vitreorretinocoroidopatia autosómica dominante, fundus albipunctatus, enfermedad de Stargardt, distrofia macular viletiforme de Best, síndrome de Usher, síndrome de Bardet-Biedl, distrofia macular fenestrada, distrofia macular pseudoinflamatoria de Sorsby, drusas dominantes, entre otras distrofias retinianas que cursen con degeneración de fotorreceptores y/o EPR. 2. Degeneración macular asociada a la edad exudativa (húmeda o neovascular) y/o no exudativa (seca o atrófica) temprana y/o tardía; así como también otras enfermedades maculares tales como: membrana epirretiniana, agujero macular y edema macular, etc.
3. Patologías inflamatorias degenerativas de la retina y del nervio óptico de origen infeccioso, inmune, vascular, traumático, post-quirúrgico o teratogénico como: toxoplasmosis ocular, criptococosis, lupus, enfermedad de Behcet, retinopatía diabética, neuropatía óptica isquémica, neuritis óptica, desprendimiento de la retina, vitrectomía, pelado de membrana limitante interna, cirugía, retinoblastoma, etc.
4. Patologías oculares que incrementen la presión intra-ocular y que cursen con degeneración de las células ganglionares de la retina y atrofia del nervio óptico como: glaucoma de ángulo abierto o cerrado.
5. Patologías neurológicas que se acompañen de lesiones degenerativas de la retiniana o del nervio óptico tales como: esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Graefe, síndrome de Hallgren, síndrome de Hallen Vorden Spatz, ataxia cerebelosa autosómica dominante y degeneración pigmentaria de la retina.
6. Otras patologías oculares que cursen con inflamación de la córnea, coroides, cuerpo ciliar de cualquier etiología como: uveítis, esclerítis, queratoconjuntivitis, cirugía de trasplante de córnea, cirugía de cataratas.
7. Otras patologías oculares o neurodegenerativas que cursen con infiltración de microglias o acortamiento de los telómeros debidos al envejecimiento celular o estrés oxidativo. En una realización preferida las patologías oculares se seleccionan entre retinitis pigmentosa y degeneración macular asociada a la edad.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Viabilidad celular en neuroblastoma SH-SY5Y tras daño con H202 y tratamiento con los distintos compuestos 1-4. Los controles son -H2Q2 = disolución 1% DMSO; +Η2θ2= H202 en 1% DMSO; RES 10 uM + H202= resveratrol 10 uM en H2<¾ en 1% DMSO.
FIG. 2. Viabilidad celular en macrófagos RAW tras inflamación producida con LPS y tratamiento con los distintos compuestos 1-2. Los controles son -LPS = disolución 1% DMSO; +LPS= disolución de 1% DMSO con LPS; RES 10 μΜ+LPS = resveratrol 10 μΜ en disolución 1% DMSO con LPS.
FIG. 3 Concentración de TNF-alfa en medio de cultivo tras inflamación por LPS en macrófagos RAW y tratamiento con compuesto 2 y el control RES. Los controles son LPS sólo= disolución 1% DMSO con LPS; DMSO sólo= disolución 1% DMSO.
FIG. 4 Concentración de NO en medio de cultivo tras inflamación por LPS en macrófagos RAW y tratamiento con compuesto 2 y el control RES. Los controles son LPS sólo= disolución 1% DMSO con LPS; DMSO sólo= disolución 1% DMSO.
FIG. 5 Concentración de IL6 en medio de cultivo tras inflamación por LPS en macrófagos RAW y tratamiento con compuesto 2 y el control RES. Los controles son LPS sólo= disolución 1% DMSO con LPS; DMSO sólo= disolución 1% DMSO. FIG. 6 Actividad AChE respecto al control del compuesto 2 y el control RES.
FIG. 7 Fundus de ratón C57/bl6 normal (WT) (A), de ratón rd10 no tratado (B) e inyectado con 5 mM del compuesto 2 (C) a los 15 días después de realizar la administración de los compuestos vía sub-retiniana. Se observa la ausencia de pigmento en el fundus del ratón tratado con el compuesto 2.
FIG. 8 Electrorretinograma de ratón c57/bl6 normal (WT), ratón rd10 no tratado, vehículo 5% DMSO, 5 mM resveratrol (RES) y 5 mM compuesto 2, 15 días después de la inyección sub-retinal. La amplitud de las ondas a y b se preservó en el grupo tratado con el compuesto 2 en una mayor proporción que en los ratones rd10 sin tratar o tratados con RES o con vehículo 5% DMSO.
FIG. 9 Amplitud de la onda b en ratones rd10 no tratados, tratados con vehículo 5% DMSO, con 5 mM RES y con 5 mM del compuesto 2, 15 días después de realizar las inyecciones sub-retinianas. Cada barra representa el promedio de la onda b en 6 ratones por cada grupo ± el error estándar de la media. La amplitud de la onda b significativamente se incrementó en los ratones tratados con el compuesto 2 en el ERG adaptado a la oscuridad con las intensidades de flash de 0,2, 1, 3 y 10 cd x s/m2. El análisis estadístico fue realizado por ANOVA de una vía con post hoc DMS test *p< 0,05; #p< 0,01.
FIG. 10 Inmunofluorescencia de ratón c57/bl6 normal (WT) (A, G, M), ratón rd10 no tratado (B, H, N), o ratones rd10 tratados con vehículo (C, I, O), con RES 5 mM (D, J, P) y con 5 mM del compuesto 2 (F, L, R) 15 días después de realizadas las inyecciones sub-retinianas. Las secciones de la retina fueron inmuno-teñidas con anticuerpos anti-rodopsina (rojo) para marcar los bastones y anti-opsina (verde) para marcar los conos. Los núcleos fueron teñidos con DAPI. En todos los grupos tratados con activadores de SIRT1 se observó más mareaje de rodopsina y opsina que en grupo no tratado, pero la señal de este inmuno-mareaje fue más intensa en el grupo tratado con el compuesto 2. Igualmente, el grosor de la capa nuclear externa (ONL) fue mayor que en el grupo tratado con RES.
FIG. 11 Fundus y autofluorescencia de la retina en ratones normales (WT control), ratones sin tratar (Kl control) y ratones tratados con gotas
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oculares administradas diariamente por 2 meses y medio conteniendo 2 mM resveratrol (Kl RES) ó 2 mM del compuesto 2 diluidos en un vehículo de 13% hidroxipropil-beta-ciclodextrina en PBS (Kl 2) ó solamente con el vehículo de 13% hidroxipropil-beta-ciclodextrina en PBS (Kl CICLO). Como controles se utilizaron tanto ratones WT como Kl los cuales no recibieron ningún tratamiento (WT control y Kl control). Todos los grupos fueron sometidos a 5.000 lux por 3 h y las evaluaciones se realizaron a los 15 días después de inducir el daño lumínico, durante este periodo de 2 semanas se siguieron administrando las gotas oculares. En los grupos Kl control, Kl CICLO y Kl RES se observaron áreas con lesiones blanco-amarillentas puntiformes autofluorescentes (flechas) las cuales se ven claramente en la amplificación de la imagen en la fila inferior. Además, en estos ratones se observaron áreas de atrofia focal (puntas de flechas). Los fundus con este tipo de características fueron considerados anormales. En la mayoría de los fundus de los grupos WT control y Kl 2 no se observaron este tipo de lesiones y fueron catalogados como fundus normales.
FIG. 12 Grosor de la retina cuantificado a través de OCT en ratones normales (WT control), ratones y ratones tratados con gotas
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oculares administradas diariamente por 2 meses y medio conteniendo 2 mM resveratrol (Kl RES) ó 2 mM del compuesto 2 diluidos en un vehículo de 13% hidroxipropil-beta-ciclodextrina en PBS (Kl 2) ó solamente con el vehículo de 13% hidroxipropil-beta-ciclodextrina en PBS (Kl CICLO). Como controles se utilizaron tanto ratones WT como Kl los cuales no recibieron ningún tratamiento (WT control y Kl control). Todos los grupos fueron sometidos a 5.000 lux por 3 h y las evaluaciones se realizaron a los 15 días después de inducir el daño lumínico, durante este periodo de 2 semanas se siguieron administrando las gotas oculares. Los mapas retiñíanos (A) muestran el grosor de la retina en 9 áreas concéntricas a 1, 2,22 y 3,45 mm y representado por una escala colorimétrica (B). Los datos se cuantificaron y se muestran en (C). Las barras representan promedios de grosor retiniano medido en pm +/- el error estándar (WT control n=5, resto de los grupos n=10). La normalidad de los datos fue confirmada por test de Kolmogorov-Smirnov (P=0,98), para determinar diferencias en las medias de los grupos se realizó ANOVA de una vía (P<0,001) y post hoc test de LSD. *P<0,001 Kl control vs Kl RES o Kl control vs Kl 2.
FIG. 13 Evaluación de la amplitud de la onda c en ratones normales (WT control), ratones y ratones tratados con gotas oculares
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administradas diariamente por 2 meses y medio conteniendo 2 mM resveratrol (Kl RES) ó 2 mM compuesto 2 diluidos en un vehículo de 13% hidroxipropil-beta- ciclodextrina en PBS (Kl 2) ó solamente con el vehículo de 13% hidroxipropil-beta- ciclodextrina en PBS (Kl CICLO). Como controles se utilizaron tanto ratones WT como Kl los cuales no recibieron ningún tratamiento (WT control y Kl control). Todos los grupos fueron sometidos a 5.000 lux por 3 h y las evaluaciones se realizaron a los 15 días después de inducir el daño lumínico, durante este periodo de 2 semanas se siguieron administrando las gotas oculares. La amplitud de la onda c fue medida por ERG (A) y luego se cuantifico tanto la amplitud de la onda b (B), así como también se estimó la ratio de onda c/b (C). Las barras representan promedios de la ratio onda c/b +/- el error estándar (WT control n=5, resto de los grupos n=10). La normalidad de los datos fue confirmada por test de Kolmogorov-Smirnov (P=0,43), para determinar diferencias en las medias de los grupos se realizó ANOVA de una vía (P<0,05) y post hoc test de LSD. *P<0,01 Kl control vs Kl 2.
FIG. 14 Test optomotor mostrando la curva de agudeza visual en ratones normales (WT control), ratones control) y ratones tratados con
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gotas oculares administradas diariamente por 2 meses y medio conteniendo 2 mM resveratrol (Kl RES) ó 2 mM compuesto 2 diluidos en un vehículo de 13% hidroxipropil-beta-ciclodextrína en PBS (Kl 2) ó solamente con el vehículo de 13% hidroxipropil-beta-ciclodextrina en PE3S (Kl CICLO). Como controles se utilizaron tanto ratones WT como Kl los cuales no recibieron ningún tratamiento (WT control y Kl control). Todos los grupos fueron sometidos a 5.000 lux por 3 h y las evaluaciones se realizaron a los 15 días después de inducir el daño lumínico, durante este período de 2 semanas se siguieron administrando las gotas oculares. Los datos del test optomotor se cuantificaron y se muestran en la gráfica. Cada punto representa promedios del número de respuestas positivas +/- el error estándar (WT control n=5, resto de los grupos n=10). La normalidad de los datos fue confirmada por test de Kolmogorov- Smirnov en todas las frecuencias espaciales a excepción de 0,031 y 0,061. Para determinar diferencias en las medias de los grupos se realizó ANOVA de dos vías relacionado tanto las diferentes frecuencias y los grupos (P<0,001) y post hoc test de LSD. *P<0,05 Kl control vs Kl RES o **P<0,001 Kl control vs Kl 2.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1. Ensayos in vitro de neuroprotección
Se cultivó la línea de neuroblastoma SH-SY5Y en placas petri pre-tratadas con colágeno (100 μς/ΓηΙ) con medio F12 suplementado con penicilina/estreptomicina y un 10 % de suero bovino fetal inactivado. Los ensayos de viabilidad celular con neuronas se hicieron en placas de 96 pocilios pre-tratadas con colágeno sembrando 20.000 células/pocilio en un volumen de 100 μΙ_ e incubando las células 24h antes de la adición de los compuestos. Los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO y se añadieron a tres concentraciones distintas (1 , 10 y 100 μΜ) para determinar la toxicidad de los mismos. El porcentaje final de DMSO en cada pocilio se ajustó al 1%. La viabilidad celular se evaluó 24h después de la adición de los compuestos mediante el ensayo de MTT, de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Los valores medios y las desviaciones estándares se calcularon a partir de al menos 8 medidas distintas de varios experimentos independientes.
Ensayos de neuroprotección. Las neuronas se cultivaron y sembraron de igual manera que para el ensayo de viabilidad celular. Los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO y se añadieron a tres concentraciones distintas (1 , 10 y 100 μΜ) y tras una incubación de 10 minutos se añadió peróxido de hidrógeno (100 μΜ) al medio. El porcentaje final de DMSO en cada pocilio se ajustó al 1%. La viabilidad celular se evaluó 24h después de la adición de los compuestos mediante el ensayo de MTT, de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Los valores medios y las desviaciones estándares se calcularon a partir de al menos 8 medidas distintas de varios experimentos independientes. La recuperación neuronal se calculó normalizando los resultados de los experimentos de viabilidad neuronal tras la adición de nuestros compuestos y de H202 a la del control positivo de cada experimento (neuronas + H202).
Se observa que el control de RES 10 μΜ recupera hasta un 50% de viabilidad celular (indicado por la flecha en la Fig. 1). En cambio, los derivados piceido adiados (1 , 2, 3 y 4) recuperan entre un 70 y 200% de viabilidad a concentraciones entre 1 y 10 μΜ. Todos ellos a 100 μΜ parecen mostrar toxicidad.
Ejemplo 2. Ensayos in vitro de inflamación
Los macrófagos RAW 264.7 fueron cultivados en P75 con DMEm high glucose suplementado con Penicilina/Estreptomicina y un 10 % de suero bovino fetal inactivado. Los ensayos de viabilidad celular con macrófagos RAW se hicieron en placas de 96 pocilios sembrando 25.000 células/pocilio en un volumen de 100uL e incubando las células durante 4h antes de añadir los compuestos. Los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO y se añadieron a tres concentraciones distintas (1 , 10 y 100 uM) para determinar la toxicidad de los mismos. El porcentaje final de DMSO en cada pocilio se ajustó al 1%. La viabilidad celular se evaluó 24h después de la adición de los compuestos mediante el ensayo de MTT, de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Los valores medios y las desviaciones estándares se calcularon a partir de al menos 8 medidas distintas de varios experimentos independientes.
Ensayo de mitigación del daño ocasionado por adición de LPS. Los macrófagos RAW 264,7 se cultivaron de acuerdo al procedimiento arriba descrito. Los compuestos a ensayar se disolvieron en DMSO y se añadieron a tres concentraciones distintas (1 , 10 y 100 uM) y tras una incubación de 10 minutos se añadió LPS (100 ng/mL) al medio. El porcentaje final de DMSO en cada pocilio se ajustó al 1%. La viabilidad celular se evaluó 24h después de la adición de los compuestos mediante el ensayo de MTT, de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Los valores medios y las desviaciones estándares se calcularon a partir de al menos 8 medidas distintas de varios experimentos independientes.
Se observa que el control de RES 10 μΜ recupera hasta un 82% de viabilidad celular (indicado por la flecha en la Fig. 2). El compuesto 2 recupera entre un 80 y 140% de viabilidad a concentraciones entre 1 y 100 μΜ. Ejemplo 3. Medidas de parámetros de inflamación (citoauinas) en ensayo con LPS.
Para determinar la producción de citoquinas se sembraron 5 χ 105 macrófagos RAW 264,7 en placas de 24 pocilios (0,5 mi por pocilio). Se añadieron entonces los compuestos a ensayar (10 μΜ) y se estimuló o no a los macrófagos mediante adición de LPS (1 μο/ιτιΙ) al medio de cultivo. Pasadas 24 horas se midieron los niveles de IL-6 y TNF-α en los sobrenadantes mediante ELISA usando los anticuerpos de captura y biotinilados de BD PharMingen y PrepoTech (Gonzalez-Rey et al., Gut. 2009; 58:929- 939; Sánchez et al., Stem Cells. 2011; 29:251-262). Los niveles de NO en los sobrenadantes a 24 horas se midieron de manera indirecta mediante la determinación de la concentración de nitrito en el medio usando el reactivo de Gríess (Anderson et al., Gut. 2013; 62:1131-1141). Se realizaron un mínimo de dos experimentos independientes y tres réplicas por experimento para cada valor medido. Los valores se expresan como la media ± desviación estándar. En el ensayo anterior se midieron los niveles de varios parámetros de inflamación (TNF-α, NO e IL-6) mediante ELISA después del tratamiento con RES o con el compuesto 2 (Fig. 3, 4 y 5).
Se observa que el control de RES 10 μΜ disminuye considerablemente los parámetros inflamatorios (TNF-α, NO e IL-6) (indicado por la barra en negrita). El compuesto 2 disminuye TNF-α y NO aún más que RES y de manera similar IL-6.
Ejemplo 4. Evaluación de la capacidad neuroprotectora de varios compuestos sililados en un modelo de neurodeaeneración en larva de pez cebra inducido por pentilentetrazol (PTZ).
El objetivo de este ensayo fue analizar el efecto protector del compuesto 2 y del control resveratrol (RES) en un modelo de neurotoxicidad inducida por la neurotoxina pentilentetrazol (PTZ). Como modelo experimental se utilizó la larva de pez cebra (Danio rerio) estudiando el efecto de los compuestos sobre la actividad acetilcolinesterasa (AChE) en larvas de 5 días post-fertilización (dpf).
Los estudios del sistema nervioso central (SNC) en el pez cebra (Kimmel et al., Dev Dyn. 1995 Jul;203(3):253-310.), muestran que a las 24 horas de desarrollo el embrión ya tiene el cerebro segmentado y algunas estructuras como el tubo neural, la notocorda y las somitas (músculo y precursores de los huesos). A los 5 días post- fertilización (5 dpf), el animal tiene los órganos sensoriales formados como los ojos y los otolitos. Además, el corazón, el hígado, los ríñones y el páncreas, así como los sistemas circulatorio, digestivo y nervioso son completamente funcionales. A este tiempo, el animal es capaz de responder a estímulos visuales, olfatorios y mecánicos y comienza la búsqueda de alimento.
La AChE es una enzima que degrada a través de su actividad hidrolítica el neurotransmisor acetilcolina en colina y un grupo acetato. Se encuentra principalmente en las uniones neuromusculares y en el sistema nervioso colinérgico, donde su actividad sirve para terminar la transmisión sináptica (Behra eta al, Nat Neurosa. 2002 Feb; 5(2): 111-8.). La acetilcolina es un neurotransmisor implicado en el control del movimiento y un importante modulador de las funciones cognitivas tales como el aprendizaje y la memoria (Hasselmo et al, Neuropsychopharmacology. 2011 Jan; 36(1): 52-73). Por lo tanto, los niveles adecuados de la acetilcolinesterasa reflejan un estado neuronal saludable.
Los embriones de pez cebra fueron sembrados en 50 mL de agua de dilución (AD) en una placa Petrí y crecidos hasta 5 dpf (estado larvario). Para la realización del ensayo, fueron utilizadas únicamente aquellas larvas que no presentaron ningún tipo de anomalía externa. Seguidamente, mediante el uso de una pipeta Pasteur, se transfirieron las larvas a una microplaca de 24 pocilios, de modo que cada pocilio contuviera cinco larvas realizándose diez réplicas por condición. En primer lugar, se realizó el pretratamiento de las larvas de 5 dpf. Para ello, las larvas fueron incubadas en un volumen de 2 mL de AD para los dos grupos Control (Control y Control + PTZ), de fisostigmina 20 μΜ (Phys, del término en inglés Physostigmine) que es un inhibidor comercial de la enzima AChE para el grupo Phys, y de los compuestos de ensayo a concentración 10 μΜ a 26±1 °C durante 1 hora. Posteriormente, se realizó un recambio del medio y se incubaron las larvas con los compuestos en combinación con con PTZ 5 mM durante 6 horas a 26±1 °C. Transcurrido este tiempo de incubación, se examinaron todas las larvas y se determinó que el estado general de las larvas era totalmente normal, sin ningún tipo de anomalía visible o comportamiento anómalo. Finalmente, las larvas fueron procesadas para el análisis de la actividad AChE. Determinación de los niveles de AChE. Una vez finalizado el período experimental, se llevó a cabo el procesamiento de las larvas para la determinación de AChE según el protocolo técnico de estudio (Medida de la actividad acetilcolinesterasa (AChE) en cultivos celulares y larvas de pez cebra). Las larvas fueron homogenizadas mecánicamente y las muestras se centrifugaron para la obtención del sobrenadante, los cuales fueron utilizados para la determinación de los niveles de la enzima AChE en función de los tratamientos administrados. Adicionalmente, se llevó a cabo la determinación de proteína total de cada grupo experimental según el protocolo técnico de estudio (Cuantifícación de proteína por BCA, como proceso de normalización). Finalmente, se tomaron como medida de referencia los niveles de AChE determinados en el grupo control, considerándolos como el 100%. El compuesto 2 previene de manera significativa la disminución de la actividad AChE inducida por el PTZ en las larvas 5dpf, mostrando un claro efecto neuroprotector y que es superior al observado para RES (ver Fig. 6).
Ejemplo 5.- Ensayo de toxicidad en pez cebra.
Se realizó la incubación de 20 embriones de pez cebra para cada concentración de compuesto a ensayar (1 a 4). Las concentraciones usadas de cada compuesto son de 0,1 μΜ, 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ y 1 mM. El tiempo de incubación va desde las 0 a las 96 horas post fertilización (hpf). Se incluyen un control negativo de 1% DMSO y un control positivo de Ν,Ν-dietilaminobenzaldehido (DEAB). Pasado el tiempo de incubación se calcula la LC50 (dosis letal para el 50% de los animales). El ensayo de toxicidad en embrión de pez cebra se llevó a cabo para el compuesto 2 y el control resveratrol (RES) y ambos mostraron una toxicidad aceptable (LC50 <140 uM) y (LC50 <1000 uM), respectivamente.
Ejemplo 6. Ensayos en ratones rd10 modelo de degeneración de retina.
El ratón rd 10 es un modelo de retinosis pigmentaria debido a una mutación en el gen Pde6b que conlleva a la degeneración de los fotorreceptores que se inicia al día postnatal 15-16 (P15-16) y se completa en el lapso de un mes (P30). En este modelo la degeneración comienza en los bastones y luego continúa con conos y finalmente el epitelio pigmentario de la retina (RPE). La degeneración en este modelo ocurre como consecuencia de la perdida de la función de Pde6b, lo que finalmente conduce a una entrada continua de Ca++ en los bastones con una importante producción de radicales libres de oxigeno (ROS), infiltración de macrófagos y activación de proteínas pro- apoptóticas. A nivel histológico se evidencia una pérdida de núcleos en la capa nuclear externa de la retina (capa donde se encuentran los núcleos de los fotorreceptores) y además por la pérdida de los marcadores específicos de bastones (rodopsina) y conos (opsina). El electrorretinograma (ERG) que mide la respuesta eléctrica de la retina ante estímulos visuales, se ve marcadamente afectada en los ratones rd10 con pérdida progresiva de la amplitud de las ondas a y b del ERG. Finalmente, el fundus que evalúa la morfología macroscópica del fondo del ojo muestra cambios al mes de edad en los ratones rd10 con acumulación de pigmentos oscuros en la periferia debido a la degeneración del RPE. Para evaluar el efecto protector en la retina de nuestros compuestos utilizamos primero el modelo rd10. Ratones homocigotos rd10 fueron inyectados en el espacio sub-retiniano a P13 (dos a tres días antes de que se inicie la degeneración) con 1 μΙ_ de vehículo (5% DMSO en PE3S) o los compuestos resveratrol RES (5 mM), y el compuesto 2 (5 mM). Luego a los 15 días de haber sido inyectados se evaluó el fundus, ERG y cambios histológicos en los ratones no tratados, tratados con el vehículo o con los compuestos RES y 2. La evaluación del fundus mostró una menor cantidad de acumulación de pigmento en las retinas de ratones tratados con el compuesto 2 en comparación con los ratones no tratados (Fig. 7). El ERG en los ratones tratados fue igualmente evaluado 15 días después de realizar las inyecciones. La amplitud de las ondas a y b se cuantificaron en los ERGs, y el análisis estadístico se realizó mediante Two-way ANOVA y post hoc DMS. Un valor de p <0,05 fue considerado significativo. La amplitud de onda b en el ERG de ratones adaptados a la oscuridad (intensidades de flash de 0,2, 1 , 3 y 10 x cd s / m 2) sufrió un aumento significativo en el grupo de ratones tratados con el compuesto 2 en comparación con los controles (Fig. 8 y 9). Finalmente se realizó el estudio de inmunofluorescencia para observar la presencia de marcadores de bastones (rodopsina) y de conos (opsina) (Fig. 10). El número de núcleos de fotorreceptores presentes en la capa nuclear externa (ONL), al igual que la inmuno-tinción de rodopsina fue mucho mayor en los ratones rd10 tratados con el compuesto 2 que en los tratados con RES y que en los controles.
Ejemplo 7.- Ensayos en ratones Pmf31 (modelo de degeneración del RPE)
Los ratones P/p/37A2,6P/f son un modelo útil para valorar la degeneración del RPE. Este modelo se caracteriza por un incremento en el grosor de la membrana de Bruch y acumulación de colesterol esteríficado entre dicha membrana y el RPE producido por defecto en el empalme del ARNm de genes relevantes del ciclo visual como RPE65 y RDH12. La acumulación de productos tóxicos derivados del retinol conlleva a un aumento de ROS, infiltración de macrófagos y degeneración primaría del RPE. La degeneración del RPE se presenta en forma tardía aproximadamente a los 8 meses de edad. Las características fenotípicas de este modelo pueden ser exacerbadas por la exposición a una funeste de luz intensa y se caracterizan principalmente por acumulo de lesiones pseudo-drusenoides y áreas de atrofia que se observan en el fundus, además presentan perdida de la agudeza visual y de la percepción de contraste, existe disminución en la amplitud de la onda c del ERG y disminución del grosor de la retina. Para evaluar el efecto protector de la administración en gotas oculares de nuestros compuestos utilizamos ratones heterocigotos P/p£3fA2,ep/+ (Kl) de 6 meses de edad, los cuales fueron tratados tópicamente con 20 μΙ_ de los compuestos estudiados aplicados directamente sobre la superficie corneal diariamente (L-V) durante 2 meses y medio. Los compuestos utilizados fueron RES y el compuesto 2, los cuales se diluyeron en una solución de 13% hidroxipropil-beta-ciclodextrina (CICLO) para obtener una concentración final de 2 mM de cada compuesto. Después de los 2 meses y medio de aplicación de las gotas oculares con CICLO, RES o el compuesto 2 los ratones mutantes Kl fueron expuestos a una fuente de luz de 5.000 lux durante 3 horas. Ratones normales (WT) y Kl sin recibir ningún tratamiento también fueron expuestos a la luz intensa como control de la prueba. Posteriormente el fundus de los animales fue evaluado, además de la agudeza visual a través del test optomotor, grosor de la retina por tomografía de coherencia óptica (OCT) y amplitud de la onda c por ERG. Evaluación del fundus:
Para la cuantificación de las características macroscópicas del fundus se utilizaron dos categorías: fundus anormal y normal. Los fundus catalogados como anormales fueron aquellos donde se observó la presencia de lesiones pseudo-drusenoides autofluorescentes (Fig. 11 ; flechas) o con áreas de atrofia focal (Fig. 11; puntas de flecha). El porcentaje de fundus anormales en los ratones WT expuestos a la luz (WT control) fue 20% y en los Kl no tratados (Kl control) fue 90%. Mientras que este porcentaje se redujo a un 30% en los ratones tratados con el compuesto 2 (Kl 2) y tan solo en un 60% tanto en los ratones tratados con CICLO (Kl CICLO) como RES (Kl RES) (Tabla 1). Al realizar el análisis estadístico para cada variable dicotómica pudimos observar que existe una relación estadísticamente significativa entre la presencia de fundus normales y los ratones tratados con el compuesto 2 al compararlos con el grupo Kl control (Chi-cuadrado = 7,5; P < 0,01 ; Test exacto de Fisher P < 0,05) y con una probabilidad 7 veces mayor de obtener un fundus normal en el grupo tratado con el compuesto 2 que en el Kl control (RR normal= 7; IC95%= 1 ,044-46,949). Estos valores fueron similares a los observados al comparar el WT control y Kl control (Chi-cuadrado = 7,35; P < 0,01; Test exacto de Fisher P < 0,05) y con una probabilidad 8 veces mayor de obtener un fundus normal en el grupo WT control que en el Kl control (RR normal= 8; IC95%= 1,184-54,043). Tanto en el grupo tratado con CICLO como RES no se observaron ninguna asociación estadísticamente significativa al comparar cada uno con el grupo Kl control. La conclusión de este experimento es que el tratamiento con el compuesto 2 evitó la formación de lesiones pseudo-drusenoides autofluorescentes y áreas de atrofia focal en el ratón Ρφί3'\*Λί6Ρ'* .
Tabla 1. Cuantificación del número de fundus anormales y normales en ratones WT y F/p/S/^'^ÍKI) sin tratamiento o tratados con 13% CICLO, RES y el compuesto 2.
Figure imgf000019_0001
Grosor de la retina:
Para evaluar el grosor de la retina in vivo se utilizó un OCT Stratus (Zeiss) con un escáner ajustado a 6 líneas de 3,45 mm cada una dispuestas en forma radial. Se realizaron 6 medidas en cada ojo y luego se procedió a realizar el mapa retiniano (Fig. 12) con el grosor de la retina cuantificado desde la capa de células ganglionares hasta el RPE. El grosor de la retina fue significativamente mayor en los grupos tratados con RES y el compuesto 2 cuando se comparan con el grupo Kl control (Fig. 12; C), estos resultados muestran que el tratamiento con los activadores de SIRT1 evitaron la producción de atrofia de la retina en los ratones Kl después de la exposición a una fuente de luz intensa. Evaluación de la función del RPE:
Para evaluar la integridad funcional del RPE se midió la amplitud de la onda c en el ERG. La onda c se define como una onda lenta positiva que aparece después de la onda b y sirve para medir la integridad funcional del RPE. Como la amplitud de esta onda se puede ver afectada por la integridad de los fotorreceptores, para su mejor valoración es conveniente normalizar los resultados con la amplitud de la onda b, por ello se realizó la cuantificación de la proporción de la amplitud onda c entre la amplitud de la onda b (ratio onda c/b) (Fig. 13). La ratio onda c/b fue significativamente mayor en el grupo tratado con el compuesto 2 lo que sugiere que se mantuvo la integridad funcional del RPE en este grupo.
Agudeza visual:
Finalmente, para valorar la agudeza visual se realizó el test optomotor el cual consiste en la evaluación del reflejo optocinético de seguimiento visual que se estimula por el movimiento rotatorio de diferentes barras horizontales seriadas negras y blancas. La respuesta a dicho estimulo visual se manifiesta por un movimiento de seguimiento cervical en el mismo sentido de la rotación de las barras. El movimiento cervical se registra con una cámara y la frecuencia espacial de las barras varía aleatoriamente al igual que la dirección del giro de las barras. El test optomotor fue evaluado a 6 diferentes frecuencias espaciales (0,031, 0,061 , 0,092, 0,103, 0,194 y 0,272 ciclos/grado) y la visión espacial fue medida por el número de respuestas positivas. En el grupo tratado con el compuesto 2 el número de respuestas positivas fue significativamente mayor que en los grupos Kl control en la mayoría de las frecuencias estudiadas (0,092, 0,103, 0,194 y 0,272 ciclos/grado) y Kl RES solo fue significativo a 0,194 ciclos/grado (Fig. 14).
En conclusión, en los experimentos descritos en los ejemplos 6 y 7 hemos demostrado que el activador de SIRT1 (compuesto 2) tiene un efecto protector en la retina de los ratones rd10 y Ρ/ρ/3/Λ2,6Ρ/+. Este efecto retino-protector sugiere que esta molécula pudiera ser potencialmente útil para el tratamiento de RP y otras patologías degenerativas de la retina y el EPR donde se produzcan ROS, inflamación y apoptosis como en la DMAE.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de un compuesto de fórmula general (I)
Figure imgf000021_0001
o cualquiera de sus isómeros, de sus sales, ésteres, tautómeros, polimorfos, o hidratos farmacéuticamente aceptables,
donde:
R1 es un grupo alquilo (C1-C22) o un grupo alquenilo (C2-C22),
para la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de patologías oculares.
2. Uso según la reivindicación 1 , donde R1 es un grupo alquilo (C2-C20).
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde los compuestos se seleccionan de entre: trans-resveratrol-3-0(6'-0-butanoil)-p-D-glucopiranósido, trans-resveratrol-3-0-(6'-Ooctanoil)-p-D-glucopiranósido, trans-resveratrol-3-0-(6'- 0-nexadecanoil)-p-D-glucopiranósido, trans-resveratrol-3-0-(6'-0-octadecanoil)-p- D-glucopiranósido y cualquiera de sus combinaciones.
4. Uso según la reivindicación 3, donde el compuesto es trans-resveratrol-3-0-(6'-0- octanoil)-p-D-glucopiranósido.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde las patologías oculares son patologías hereditarias degenerativas de la retina seleccionada entre la retinosis pigmentaria y las patologías englobadas dentro del grupo de distrofias retinianas seleccionada de entre retinosis pigmentaria autosómica dominante, retinosis pigmentaria autosómica recesiva, retinosis pigmentaria ligada al cromosoma X, retinosis pigmentaria esporádica, retinosis pigmentaria asociada a otros síndromes, síndrome de Cokayne, distrofias de conos, degeneración de conos y bastones, amaurosis congénita de Leber, retinitis punctata albescens, coroideremia, atrofia girata de coroides y retina, distrofia coroidea generalizada, retinosquisis juvenil, degeneración vitreo-retiniana de Wagner, vitreorretinocoroidopatia autosómica dominante, fundus albipunctatus, enfermedad de Stargardt, distrofia macular viletiforme de Best, síndrome de Usher, síndrome de Bardet-Biedl, distrofia macular fenestrada, distrofia macular pseudoinflamatoria de Sorsby y drusas dominantes.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde las patologías oculares son degeneración macular asociada a la edad.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde las patologías oculares son patologías inflamatorias degenerativas de la retina y del nervio óptico.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde las patologías oculares son patologías oculares que incrementen la presión intra-ocular y que cursen con degeneración de las células ganglionares de la retina y atrofia del nervio óptico seleccionadas entre glaucoma de ángulo abierto y cerrado.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde las patologías oculares son patologías neurológicas que se acompañen de lesiones degenerativas de la retiniana o del nervio óptico seleccionadas entre esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Graefe, síndrome de Hallgren, síndrome de Hallen Vorden Spatz y ataxia cerebelosa autosómica dominante y degeneración pigmentaria de la retina.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la composición farmacéutica además comprende un sistema de liberación controlada.
1 1. Uso según la reivindicación 10, donde sistema de liberación controlada es una ciclodextrína.
12. Uso según la reivindicación 1 1 , donde la ciclodextrína es 2-hidroxipropil β- ciclodextrína.
13. Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (I):
Figure imgf000023_0001
(i)
o cualquiera de sus isómeros, de sus sales, ésteres, tautómeros, polimorfos o hidratos farmacéuticamente aceptables,
donde: Ri es un grupo alquilo (C1-C22) o un grupo alquenilo (C2-C22);
y una ciclodextrina.
14. Composición según la reivindicación 13, donde el compuesto de fórmula (I) se selecciona de entre trans-resveratrol-3-0-(6'-0-butanoil)-p-D-glucopiranósido, trans-resveratrol-3-0-(6'-0-octanoil)-p-D-glucopiranósido, trans-resveratrol-3-0-(6'- 0-hexadecanoil)-p-D-glucopiranósido, trans-resveratrol-3-0-(6'-0-octadecanoil)-p- D-glucopiranósido y cualquiera de sus combinaciones.
15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, donde la ciclodextrina es 2-hidroxipropil β-ciclodextrina.
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