JP7138934B2 - 網膜神経保護作用を有するアペリン受容体アゴニストを含有する医薬組成物 - Google Patents
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Description
現在、臨床応用されている医薬品の多くがGタンパク質共役受容体を標的にしていることから、アペリン-APJシステムに対するアペリン類似化合物やアペリンと構造を異にするアゴニスト若しくはアンタゴニストは、新規な治療薬の開発に繋がる可能性が高く盛んに研究が行われている。
なお、本明細書においてアペリン受容体アゴニストとは、アペリンと同様の作用を発揮する物質であるアペリン様薬剤と同意義で用いられており、アペリン受容体(APJ)を介してアペリンと同様の作用を発揮する物質をいう。
本発明の医薬組成物は、ヒトやヒト以外の動物の末梢血管系に投与され、医薬組成物の有効成分のアペリン受容体アゴニストを、体循環を経て眼動脈経由で網膜に到達させることで糖尿病網膜症における網膜神経細胞死を抑制し、網膜神経細胞の保護を図る。
R2およびR1における選択肢からメチル基を削除しているのは、R2またはR1を小さな脂肪族炭化水素に置換すると、アペリン受容体アゴニストとしての活性が低下する傾向にあるからである。また、R3を大きな脂肪族炭化水素に置換する場合においても、アペリン受容体アゴニストとしての活性が低下する傾向にあるため、R3の置換基を水素原子またはメチル基に限定するものである。
同様の観点から、一般式(II)がアペリン受容体(APJ)の完全アゴニストとして機能するためには、R1がイソプロピル基、シクロヘキシル基、又は、ターシャリーブチル基、R3が水素原子、又は、メチル基である場合が好ましい。
化合物1は、一般式(I)において、R1にシクロヘキシル基、R2に水素、R3にメチル基、R4に水素、R5にフェニル基を導入した化合物である。
化合物2は、一般式(I)において、R1にイソプロピル基、R2に水素、R3にメチル基、R4に水素、R5にベンゾニトリルを導入した化合物である。
化合物3は、一般式(I)において、R1にイソプロピル基、R2に水素、R3にメチル基、R4に水素、R5に(4-トリフルオロメトキシ)フェニル基を導入した化合物である。
化合物4は、一般式(I)において、R1にターシャリーブチル基、R2に水素、R3にメチル基、R4に水素、R5にフェニル基を導入した化合物である。
化合物5は、一般式(I)において、R1にイソプロピル基、R2に水素、R3にメチル基、R4に水素、R5に(4-トリフルオロメチル)フェニル基を導入した化合物である。
化合物6は、一般式(I)において、R1にシクロヘキシル基、R2に水素、R3にメチル基、R4に水素、R5に3-クロロフェニル基を導入した化合物である。
化合物7は、一般式(I)において、R1にシクロヘキシル基、R2に水素、R3にメチル基、R4に水素、R5に2,6-ジクロロフェニル基を導入した化合物である。
化合物8は、一般式(I)において、R1にイソプロピル基、R2に水素、R3にメチル基、R4に水素、R5に3-ピリジル基を導入した化合物である。
化合物9は、一般式(I)において、R1にシクロヘキシル基、R2に水素、R3にメチル基、R4に水素、R5に1-メチルイミダゾール-2-イルを導入した化合物である。
C57BL/6N系を遺伝子背景にもつ糖尿病モデルマウスであるAkitaマウスおよび野生型(WT)マウスは、日本SLC株式会社から購入した。アペリン遺伝子欠損(KO)マウスは、武田薬品工業株式会社から入手した。アペリンKOマウスとAkitaマウスを掛け合わせて、アペリンKO-Akitaマウスを作製した。実験には、全て雄性マウスを用いた。マウスは透明ケージ(24×17×12 cm)で飼育し、室温は22±1℃、照明時間は1日12時間とする飼育条件下で、餌と水を自由に摂取させた。高脂肪食としてQuick fat(日本クレア株式会社)を、通常飼料としてMF(オリエンタル酵母工業株式会社)を使用した。実験動物の飼育、実験等はすべて「日本薬理学会指針」に従って計画し、実施した。
12時間以上暗順応させたマウスを暗室内で抱水クロラール(500mg/kg)の腹腔内投与により麻酔後、ベノキシール点眼液0.4%(オキシブプロカイン塩酸塩4mg/mL;参天製薬株式会社)により角膜表面を麻酔し、ミドリンP点眼液(トロピカミド5mg/mL、フェニレフリン塩酸塩5mg/mL;参天製薬株式会社)により散瞳させた。網膜電位の変化を記録するため、マウスの角膜上にコンタクトレンズ型関電極(Mayo)を装着し、マウス口内に不関電極を挿入した。アース(接地電極)をマウス尾部に装着し、白色LED光源を備えた半球ドーム(小動物用全視野光刺激装置;Mayo)内にマウスを静置した。網膜神経節細胞由来の電気信号(暗順応閾値反応;STR)を惹起させるため、1ミリ秒間、1.0×10-3(cd・s/m2)の強さの光をマウスに当てた。5秒間隔で8回測定し、得られた結果を平均した。この条件でみられる代表的な網膜電図を図1に示す。また、視細胞由来の電気信号(a-wave)および網膜内顆粒層に細胞体が存在する介在神経細胞等由来の電気信号(b-wave)を惹起させるため、0.3ミリ秒間、3.0(cd・s/m2)の強さの光をマウスに当てた。30秒間隔で4回光を当て、得られた結果を平均した。この条件でみられる代表的な網膜電図を図2に示す。測定結果の記録および加算平均処理は、PowerLabデータ収集・解析システム(AD Instruments)を用いて行った。STRは、網膜電図における基準値から最大値までを測定し、その振幅を数値化した。a-waveは、網膜電図における基準値からトラフ値までを、b-waveは、トラフ値から最大値までを測定し、その振幅を数値化した。
マウスを麻酔し、開腹および開胸後、左心室から生理食塩水を灌流し脱血した。続いて、4%パラホルムアルデヒド(PFA)により灌流固定を行い、眼球を摘出した。摘出した眼球を4℃にて24時間4%PFA中で浸漬固定した。眼球を超純水により洗浄し、4℃にて24時間Zinc Fixative Solution(BD Pharmingen)中で浸漬固定した。眼球をパラフィン包埋後、5μmの厚さに薄切し、スライドグラス上にて一晩乾燥させた。眼球切片をキシレンで脱パラフィン後、エタノール及び水道水により親水化し、0.05% Tween-20を含むTris-EDTA buffer(pH8.0)中でマイクロウェーブ照射により抗原を賦活化し(沸騰後500Wで10分間煮沸し20分間放冷×2回)、blocking buffer(0.5% Triton-X100及び0.5% skim milkを含むTris-buffered saline(TBS))で室温にて30分間blockingを行った。マウス抗Brn-3a抗体(Santa Cruz Biotech.;sc-8429)をblocking bufferで50倍希釈し、4℃で一晩、眼球切片と反応させた。0.1% Triton-X100を含むTBSで洗浄後、ビオチン標識anti-mouse IgG抗体(Dako;E0433)をblocking bufferで500倍希釈し、室温で1時間、眼球切片と反応させた。洗浄後、FITC標識streptavidin(BD biosciences;554060)をblocking bufferで500倍希釈し、室温で1時間、眼球切片と反応させた。洗浄後、眼球切片をカバーグラスと封入材Fluoromount G(Southern Biotechnology Inc.)を用いて封入し、蛍光顕微鏡AZ100(Nikon)にて観察した。代表的な染色画像を図3に示す。図3は眼球パラフィン切片を抗Brn-3a抗体で染色した代表的な画像を示す。
アペリン受容体アゴニストであるML233(Tocris Bioscience)をdimethyl sulfoxide(DMSO)に5mg/mLの濃度で溶解した。25μLマイクロシリンジ(伊藤製作所)を用いて、ML233(5mg/kg)を1週間に3回、1日おきに1回腹腔内投与した。対照群には、ジメチルスルホキシド(DMSO)を同スケジュールにて腹腔内に投与した。
統計解析は、two-way ANOVAを行い、pot hoc testとして、Bonferroni‘s testを行った。この検定により、p<0.05の場合に有意差ありとした。
5週齢のAkitaマウスおよびWTマウスに高脂肪食または通常飼料を4週間摂取させ、経時的に網膜電図を記録した。図4(A)は5週齢のAkitaマウスおよびWTマウスに高脂肪食(HFD)または通常飼料(Normal)を4週間摂取させた場合の網膜電図の推移を示す。1週間ごとに網膜神経節細胞由来の電気信号(STR)を記録し、振幅を測定した (n=4)。**p<0.01を表す。その結果、Akitaマウスにおいて高脂肪食摂取3週後から網膜神経節細胞由来の電気信号の減弱化がみられた。図4(B)は、通常飼料(Normal)または高脂肪食(HFD)を 4 週間摂取させたマウスの網膜切片におけるBrn-3a(網膜神経節細胞マーカー)陽性細胞数を示す。陽性細胞数のカウントはn=4でおこなった。結果は、平均値±標準誤差で示した。図中において、**p<0.01、††p<0.01を表す。高脂肪食を4週間摂取させたAkitaマウスの網膜における、網膜神経節細胞マーカーであるBrn-3aの陽性細胞数の減少がみられた。
実施例1において用いたマウスに替えて、本実施例では8週齢の雄性マウス(C57BL/6N)を実験に用いた。マウス以外の条件は、実施例1と同様に実験を行った。
ML233の溶解および投与量は、実施例1と同様に行った。NMDA(SIGMA Aldrich)の硝子体内投与は、33G針を装着した5μLシリンジ(伊藤製作所)を用いて実体顕微鏡下で行った。NMDAを滅菌生理食塩水(Saline)で10mMになるように溶解し、この溶液をマウスの硝子体内に1μL(10nmol)投与した。対側眼には、Salineを投与した。硝子体内投与は、ML233またはDMSOの腹腔内投与1時間後に行った。
本実施例では、一次抗体としてマウス抗calretinin抗体(Millipore;MAB1568)を用いた以外は実施例1と同様に行った。代表的な染色像を図10に示す。図10は、眼球パラフィン切片を抗calretinin抗体で染色した代表的な画像を示す。
網膜において、NMDA型グルタミン酸受容体に特異的に結合するNMDAに感受性の高い神経細胞として、網膜神経節細胞およびアマクリン細胞が知られている。また、網膜神経節細胞層におけるcalretinin陽性細胞は網膜神経節細胞であること、また、内顆粒層におけるcalretinin陽性細胞はアマクリン細胞であることが知られている。NMDA硝子体内投与24時間後の網膜におけるcalretinin陽性細胞数について検討行った結果、NMDA投与24時間後の網膜では、網膜神経節細胞層および内顆粒層におけるcalretinin陽性細胞数の著明な減少がみられた。この減少は、NMDA硝子体内投与1時間前にML233を腹腔内投与することにより有意に抑制された。図11は、NMDA硝子体投与による網膜神経節細胞死およびアマクリン細胞死に対するML233投与の影響を表す。図11(A)ML233(5mg/kg)またはDMSOをマウスの腹腔内に投与し、1時間後、NMDA(10nmol)またはsalineを硝子体内投与した際の、24時間後のマウスの網膜切片における網膜神経節細胞層のcalretinin陽性細胞数。図11(B)内顆粒層のcalretinin陽性細胞数を表す(n=3)。結果は、平均値±標準誤差で示した。図中、*p<0.05、**p<0.01を表す。
実施例2と同様に8週齢の雄性マウス(C57BL/6N)を実験に用いた。マウス以外の条件は、実施例1と同様に実験を行った。
ML233の溶解および投与量は、実施例1と同様に実施した。MNUは、1.5mg/mLになるように滅菌水で溶解し、30mg/kgで単回腹腔内投与した。ML233は、MNU腹腔内投与24時間前、1時間前およびMNU投与後24時間毎に腹腔内投与した。
実施例1と同様にして行った。
TdT-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL)染色について説明する。
アポトーシス細胞を検出するTUNEL染色は、Apoptosis in situ Detection Kit(Wako)を用いて、添付文書に記載されている方法に従って実施した。眼球パラフィン切片作製の工程は、実施例1と同様に行った。
統計解析は、Student‘s t-testにより行った。この検定により、p<0.05の場合に有意差ありとした。
MNU腹腔内投与による視細胞死について検討するため、MNU投与24時間後に網膜電図を解析した。図12にはMNU腹腔内投与による視細胞死の誘導を示す。図12(A)無処置またはMNU(30 mg/kg)腹腔内投与24時間後のマウスに3.0 cd・s/m2の光を照射し、得られた網膜電図を示す。図12(B)無処置またはMNU(30 mg/kg)腹腔内投与24時間後のマウスの網膜切片をTUNEL染色し、アポトーシス細胞を検出した。濃茶色に染色されているものが陽性細胞を示す。その結果、図12(A)に示すように、MNU投与前と比較して、MNU投与24時間後の網膜では、視細胞由来の反応であるa-waveの明らかな低下が認められ、それに伴い視細胞からの信号を受け取って反応する神経細胞等の信号であるb-waveの低下も認められた。また、図12(B)に示すように、MNU投与24時間後の網膜において、視細胞の細胞体が存在する外顆粒層において、アポトーシス細胞が検出された。
Claims (6)
- 前記一般式(I)で表される化合物において、R1がイソプロピル基、シクロヘキシル基、又は、ターシャリーブチル基、R2及びR4が水素原子、R3が水素原子、又は、メチル基、であることを特徴とする請求項1の糖尿病網膜症治療用医薬組成物。
- 前記一般式(II)で表される化合物において、R1がイソプロピル基、シクロヘキシル基、又は、ターシャリーブチル基、R3が水素原子、又は、メチル基、であることを特徴とする請求項2の糖尿病網膜症治療用医薬組成物。
- ヒトを含む動物の末梢血管系に投与され、体循環を経て眼動脈経由で網膜に到達させるように用いられることを特徴とする請求項1~5の何れかの糖尿病網膜症治療用医薬組成物。
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日本薬理学会年会要旨集 WCP2018 (The 18th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology),2018年,PO2-1-17,https://www.jstage.jst.go.jp/article/jpssuppl/WCP2018/0/WCP2018_PO2-1-17/_pdf/-char/ja |
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