WO2018084749A1 - Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения - Google Patents

Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения Download PDF

Info

Publication number
WO2018084749A1
WO2018084749A1 PCT/RU2017/000809 RU2017000809W WO2018084749A1 WO 2018084749 A1 WO2018084749 A1 WO 2018084749A1 RU 2017000809 W RU2017000809 W RU 2017000809W WO 2018084749 A1 WO2018084749 A1 WO 2018084749A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
inhibitor
glycol
cells
oep
atp
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/000809
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Юрий Григорьевич ШТЫРЛИН
Альфия Габдулахатовна ИКСАНОВА
Юрий Владимирович БАДЕЕВ
Константин Валерьевич БАЛАКИН
Original Assignee
Акционерное Общество "Татхимфармпрепараты"
Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акционерное Общество "Татхимфармпрепараты", Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" filed Critical Акционерное Общество "Татхимфармпрепараты"
Priority to JP2019545237A priority Critical patent/JP6861424B2/ja
Priority to EA201900246A priority patent/EA034579B1/ru
Priority to CN201780067634.0A priority patent/CN109890375B/zh
Priority to EP17867579.9A priority patent/EP3536315B1/en
Publication of WO2018084749A1 publication Critical patent/WO2018084749A1/ru
Priority to US16/399,472 priority patent/US10987429B2/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/25—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids with polyoxyalkylated alcohols, e.g. esters of polyethylene glycol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A61K31/77—Polymers containing oxygen of oxiranes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/26—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds
    • C08G65/2603—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds the other compounds containing oxygen
    • C08G65/2606—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds the other compounds containing oxygen containing hydroxyl groups
    • C08G65/2609—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds the other compounds containing oxygen containing hydroxyl groups containing aliphatic hydroxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/26—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds
    • C08G65/2696—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds characterised by the process or apparatus used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G2650/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G2650/28—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule characterised by the polymer type
    • C08G2650/30—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule characterised by the polymer type branched

Definitions

  • the invention relates to the field of development of physiologically active substances, namely, to a group of chiral conjugates (optically active hybrid molecules) of oligoester polyol nature (OEP), which are inhibitors of ATP-dependent reverse cell transporters, abbreviated as ABC transporters (from the English ATP-binding cassette transporters).
  • OEP oligoester polyol nature
  • ABC transporters from the English ATP-binding cassette transporters.
  • the invention can be used in the field of biology, pharmacology, pharmaceuticals, medicine, agriculture and ecology to significantly enhance the effectiveness of physiologically active substances, including drugs - antitumor, cardiovascular, anti-allergic, anti-inflammatory and others, by suppressing multiple mechanisms drug resistance of cells under the action of the claimed inhibitors of ABC transporters.
  • the ABC transporter family includes P-gp glycoprotein (P-glycoprotein), multi-drug resistance proteins of the MRP family (multidrug resistance-associated protein) and breast cancer resistance protein BCRP (breast cancer resistance protein).
  • P-glycoprotein P-glycoprotein
  • MRP multi-drug resistance-associated protein
  • BCRP breast cancer resistance protein
  • substrates of ABC transporters are [3]: analgesics (asimadolin, fentanyl, morphine, pentazocine); antibiotics (ampicillin, azithromycin, cefoperazone, ceftriaxone, clarithromycin, doxycycline, erythromycin, gramicidin A, gramicidin D, grepafloxacin, itraconazole, ketoconazole, levofloxacin, rifampicin, sparflincin, others); antiviral drugs (delavirdine, lopinavir, lamivudine, nelfinavir, zidovudine); antiarrhythmic drugs (amiodarone, digoxin, lidocaine, propafenone, quinidine, verapamil); antineoplastic drugs (5-fluorouracil, actinomycin D, bisanthrene, chlorambucil, colchicine, cisplatin, cytar
  • a wide range of compounds are known from the prior art, including drugs approved for use that can inhibit ABC transporters. So, a large-scale research work was carried out to create inhibitors of ABC transporters as drugs that increase the sensitivity of cancer cells to the action of antitumor drugs [3].
  • atorvastatin, amlodipine, cyclosporin A, disulfiram, nifedipine, verapamil, preparations GF 120918, LY475776 were active and studied as P-gp inhibitors.
  • Azithromycin, cyclosporin A, furosemide, glibenclamide, probenecid, MK-571 were studied as MRP2 inhibitors.
  • Cyclosporin A, dipyridamole, elacridar, fumitremorgin C, novobiocin, ortataxel, reserpine, ritonavir, taraquidar, GF 120918, VX-710, XR-9576 were studied as BCRP inhibitors.
  • the aim of the claimed technical solution is to obtain an inhibitor of reverse ABC transporters of oligoester polyol nature cells (OEP inhibitor), consisting of polyoxypropylene glycol with a molecular weight of from 300 to 500 Da and polyoxypropylenehexol with a molecular weight of from 1000 to 1 00 Da.
  • OEP inhibitor an inhibitor of reverse ABC transporters of oligoester polyol nature cells
  • the claimed technical solution in relation to the method is implemented at a time, in one reactor, in one step, using available reagents, taken in proportions that provide the target conjugate with an equimolar ratio of optically active compound 4 and compound 5.
  • the starting reagents 1 and 2 are loaded into the polymerization reactor, an alkaline catalyst is added, stirring is turned on, and the reaction mixture is kept in a nitrogen atmosphere at a temperature of 90-100 ° C for 30 minutes until a homogeneous mass is obtained. Then, the calculated amount of compound 3 is supplied at a speed that ensures the pressure in the reactor-polymerizer is not higher than 0.39 MPa (4 kgf / cm), and at a temperature not exceeding 115 ° C. After this, the reaction mass is held at a temperature not exceeding 115 ° C for 1-1.5 hours until the pressure drop stops.
  • the ratio of reagents 1, 2 and M (OH) x is calculated so that as a result of their reaction with propylene oxide an equimolar mixture of compounds 4 and 5 is obtained.
  • the amount of compound 3 is calculated so that the resulting equimolar mixture of compounds 4 and 5 has a hydroxyl number in the range of 215-240 mg KOH / g
  • bifunctional oxygen-containing compound 2 propylene glycol, dipropylene glycol, tripropylene glycol, tetrapropylene glycol, pentapropylene glycol, hexapropylene glycol, heptapropylene glycol, or water, or a mixture thereof can be used.
  • alkali or alkaline earth metal hydroxides react with an oxygen-containing compound or sorbitol, water is released, which should also be taken into account when calculating the equimolar ratio of the resulting target products 4 and 5.
  • the optimal molecular weight is 1200 Da, while it also exhibits efficacy in the range from 1000 to 1500 Da.
  • the optimal molecular weight is 400 Da, while in the range from 300 to 500 Da, it also has efficiency. Going beyond the indicated ranges of molecular weights is also possible, but is accompanied by a certain decrease in the activity of the obtained ABC transporter inhibitor.
  • the inhibitor of ABC transporters can be obtained by an alternative method, which is not given by the applicant due to his fame as such, and consists in separate preparation of compounds 4 and 5 by reacting, respectively, compounds 1 and 2 with propylene oxide 3 under conditions of alkaline catalysis, with their further mechanical mixing in equimolar amounts.
  • FIG. 1 - A graph of the temperature dependence of the viscosity of an EIA inhibitor.
  • FIG. 2 HPLC-MS spectrum of an EIA inhibitor.
  • FIG. 3 Concentrations of half-maximum growth inhibition (SS 5 about and 1C 5 about, ⁇ m) of compounds for conditionally normal and human tumor cells.
  • FIG. 4 - The content of the OEP inhibitor in the analyzed cell lysates according to HPLC-MS.
  • FIG. 5 Polarization of fluorescence of DPHT (1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene) in a cell suspension after the addition of effectors: an OEP inhibitor, a composition of doxorubicin and an OEP inhibitor, cholesterol and Triton X-100.
  • A MCF cells -7;
  • B cells with MDF MCF-7 / Vin.
  • the density of the suspension is 2 10 6 cells / ml, temperature 25 ° C, in the following concentrations: OEP inhibitor - 8.7, 87 and 870 ⁇ g / ml, doxorubicin - 1 ⁇ M, cholesterol - 100 ⁇ g / ml, Triton X-100 - 0.05%.
  • FIG. 6 Histogram of transepithelial transport of doxorubicin in polarized CaCO-2 cells. Abbreviations: apical-basolateral transport (A-B), basolateral-apical transport (B-A).
  • FIG. 7 Photograph of the results of immunoblotting of the original and genetically modified MCF-7 cells after treatment with doxorubicin, an EIA inhibitor, or a combination thereof for 48 hours.
  • FIG. 8 Effect of effectors on the ATPase activity of human P-glycoprotein of isolated Sf9 cell membranes (0.2 mg / ml protein).
  • Control basic membrane activity in the presence of 5 mM ATP and 0.1 mM vinblastine.
  • FIG. 9 - ATP content in lysates of MCF-7 (A) and MCF-7 / Vin (B) cells treated with an OEP inhibitor (87, 430, 2175 ⁇ g / ml), doxorubicin (10 ⁇ M) and their composition (OEP inhibitor 87 ⁇ g / ml + DOX 10 ⁇ M).
  • Example 1 A method of obtaining an EIA inhibitor from the starting sorbitol-water system.
  • the obtained OEP inhibitor is neutralized with a 50% aqueous solution of phosphoric acid to a pH of 6.5-7.5, water is removed in vacuo at a temperature of 80-90 ° C and filtered with montmorillonite through belting. After all operations, 270 g of a slightly yellowish product are obtained. Viscosity 645 mPa * s, density 1.038 g / cm 3 (20 ° C). The hydroxyl number is 220 mg KOH / g (GOST 25261-82 p. 3.1).
  • Example 2 Obtaining an OEP inhibitor from the starting sorbitol-propylene glycol system.
  • the temperature is raised to 115 ° C and 274 g (4.73 mol) of propylene oxide are fed portionwise at a rate that ensures a pressure in the polymerization reactor of not higher than 0.39 mPa (4 kgf / cm 2 ) and a temperature of not higher than 115 ° C.
  • the reaction mass is maintained at a temperature not exceeding 120 ° C for 1-1.5 hours until the pressure drop stops.
  • the obtained OEP inhibitor is neutralized with a 50% aqueous solution of phosphoric acid to a pH of 6.5-7.5, water is removed in vacuo at a bath temperature of 80-90 ° C and filtered with montmorillonite through belting. After all operations, 285 g of a slightly yellowish product are obtained. Viscosity 618 MPa * s, density 1.035 g / cm 3 (20 ° C). The hydroxyl number is 231 mg KOH / g (GOST 25261-82 p. 3.1).
  • Example 3 Obtaining an OEP inhibitor from the starting system sorbitol-dipropylene glycol.
  • the reaction was carried out according to the method described in example 2.
  • the number of starting substances sorbitol - 27.3 g (0.15 mol), KOH - 0.6 g (0.011 mol), dipropylene glycol - 18.5 g (0.14 mol) .
  • the amount of propylene oxide is 255 g (4.4 mol).
  • 308 g of a slightly yellowish product are obtained.
  • the hydroxyl number is 227 mg KOH / g (GOST 25261-82 p. 3.1).
  • Example 4 Obtaining an OEP inhibitor from the starting system sorbitol-tripropylene glycol.
  • the reaction was carried out according to the method described in example 2.
  • the number of starting substances sorbitol - 27.3 g (0.15 mol), KOH - 0.61 g (0.011 mol), tripropylene glycol - 26.7 g (0.14 mol) .
  • the amount of propylene oxide is 246 g (4.24 mol).
  • 280 g of a slightly yellowish product are obtained.
  • the hydroxyl number is 229 mg KOH / g (GOST 25261-82 p. 3.1).
  • Example 5 Obtaining an OEP inhibitor from the starting sorbitol-tetrapropylene glycol system.
  • the reaction was carried out according to the method described in example 2.
  • the number of starting substances sorbitol - 27.29 g (0.15 mol), KOH - 0.6 g (0.011 mol), tetrapropylene glycol - 34.75 g (0.14 mol) .
  • the amount of propylene oxide is 246 g (4.24 mol).
  • the hydroxyl number is 233 mg KOH / g (GOST 25261-82 p. 3.1).
  • Penta-, hexa- and heptapropylene glycols were obtained by reacting propylene glycol with propylene oxide under conditions of alkaline catalysis. For each of the samples, a hydroxyl number was determined.
  • Example 6 Obtaining an OEP inhibitor from the starting system sorbitol-pentapropylene glycol.
  • the reaction was carried out according to the method described in example 2.
  • the number of starting substances sorbitol - 27.3 g (0.15 mol), KOH - 0.61 g (0.011 mol), pentapropylene glycol - 42.8 g (0.14 mol) .
  • the amount of propylene oxide is 230 g (3.95 mol).
  • the hydroxyl number is 231 mg KOH / g (GOST 25261-82 p. 3.1).
  • Example 7 Obtaining an EIA inhibitor from the starting system sorbitol-hexapropylene glycol.
  • the reaction was carried out according to the method described in example 2.
  • the number of starting substances sorbitol - 27.31 g (0.15 mol), KOH - 0.6 g (0.011 mol), hexapropylene glycol - 50.87 g (0.14 mol) .
  • 283 g of a slightly yellowish product are obtained.
  • the hydroxyl number is 225 mg KOH / g (GOST 25261-82 p. 3.1).
  • Example 8 Obtaining an EIA inhibitor from the sorbitol-heptapropylene glycol starting system.
  • the reaction was carried out according to the method described in example 2.
  • the number of starting substances sorbitol - 27.3 g (0.15 mol), KOH - 0.61 g (0.011 mol), heptapropylene glycol - 58.9 g (0.14 mol) .
  • the amount of propylene oxide is 214 g (3.83 mol).
  • After neutralization and filtration, 283 g of a slightly yellowish product are obtained.
  • the hydroxyl number is 224 mg KOH / g (GOST 25261-82 p. 3.1).
  • the obtained EIA inhibitor is a colorless or slightly yellowish liquid with a viscosity at room temperature of 575-715 MPa * s (Fig. 1 shows the temperature dependence of the EIA inhibitor viscosity), with a density in the range of 1.01-1.05 g / cm 3 (20 ° C).
  • the hydroxyl number is 215-240 mg KOH / g, the pH of a 10% solution (ethanol / water - 70/30) is 5.5-7.5.
  • An OEP inhibitor is characterized by many m / z peaks in the range of both small (400-1200 Da) and heavier masses (1500-2000 Da) (Fig. 2), which reflects the presence of a statistical set of polycondensation reaction products.
  • the analysis was performed using an Agilent ZORBAX Extend-C18 chromatographic column (column size 1 x 150 mm, particle size 3.5 ⁇ m) with an Extend Guard pre-column (1 x 17 mm, particle size 5 ⁇ m) on an Agilent 1260 Binary System chromatograph (vacuum degasser G1379B, binary gradient pump G1312B, column thermostat G1316A, automatic sampler G1367E, thermostat for automatic sampler G1330 V).
  • the detector is an AB Sciex 5600 high-resolution quadrupole-time-of-flight mass spectrometer with a DuoSpray ionization source.
  • Mobile phase solvent A - 10 mm solution of ammonium formate in a mixture of water, methanol (90: 10%); solvent B - 0.1% formic acid in acetonitrile.
  • solvent A solvent A - 10 mm solution of ammonium formate in a mixture of water, methanol (90: 10%)
  • solvent B 0.1% formic acid in acetonitrile.
  • the most intense peaks of the EIA inhibitor were used for its quantitative analysis in biological matrices.
  • the technical result of the claimed technical solution is a method for producing chiral conjugates (optically active hybrid molecules) of oligoester polyol nature, which are inhibitors of ATP-dependent reverse cell transporters (EIA inhibitors), to significantly enhance the effectiveness of physiologically active substances from the number of antitumor, cardiac vascular, anti-allergic, anti-inflammatory and other medicinal compounds.
  • EIA inhibitors ATP-dependent reverse cell transporters
  • EGTA (from the English ethylene 1uso1-b1z (2-attuetu1eSheg) ⁇ ' ⁇ ei * aaseis acid) - ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) - ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ '- tetraacetic acid
  • MDR - multidrug resistance MTT (from the English 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) - tetrazolium dye 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2.5 diphenyl tetrazolium bromide
  • Doxorubicin (DOX) hydrochloride ouabain octahydrate, 98% pentaethylene glycol, ⁇ -mercaptoethanol, tetraacetic acid ethylene glycol (EGTA), beryllium sulfate tetrahydrate, sodium fluoride, ammonium molybdate were purchased from Sigma-Aldrich. Bromophenol blue, sodium deoxycholate, Tris hydrochloride (tris- (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride), ammonium persulfate (APS), sodium dodecyl sulfate (SDS) were purchased from Amresco (USA).
  • MTT 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) from Life technologies (USA).
  • L-glutamine, Dulbecco's solution, not containing Ca 2+ and Mg 2+ ions , trypsin-EDTA solution, Hanks solution without phenol red, a-MEM and DMEM media were purchased from PanEco (US).
  • DFGT 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene
  • dithiothreitol (1,4-bis (sulfanyl) butane-2,3-diol)
  • ascorbic acid cholesterol
  • Triton® X-100 vinblastine sulfate
  • ATP disodium salt hydrate HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazineethanesulfonic acid) from Acros Organics.
  • HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazineethanesulfonic acid) from Acros Organics.
  • Helicon purchased sodium lauryl sulfate (SDS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
  • Cells MCF-7, MCF-7 Vin, HSF, CaCo-2, HCT-15, HCT-116, OVCAR-4, PC-3, A-498, NCI-H322M, M-14, SNB-19, SF- 539 (Table 1) were cultured in a-MEM medium supplemented with 10% fetal calf serum, L-glutamine and 1% penicillin-streptomycin in an atmosphere of 5% C0 2 at 37 ° C until a monolayer was formed.
  • a monolayer of cells is trypsinized, followed by inactivation of trypsin by the addition of serum a-MEM medium.
  • Cell counting produced in a Neubayer chamber by the exclusion of trypan blue. Cells are subcultured 2 times a week in a ratio of 1: 6.
  • Example 9 In vitro study of the cytotoxic effect of an EIA inhibitor.
  • the culture medium with the test substances was removed from the plate using a vacuum aspirator, culture medium and MTT reagent 5 mg / ml were added, incubated in a C0 2 incubator for 3-4 hours. After the incubation time, the culture medium with MTT reagent was removed with a vacuum aspirator, 100 ⁇ l of DMSO was added and incubated for 5-10 minutes. The appearing violet staining was detected on a Tesap plate reader at 555 nm (reference wavelength - 650 nm). Dose-effect and the concentration of half-maximal inhibition of cell growth (IC50) was determined. The results are presented in table 2 in FIG. 3.
  • Example 10 Evaluation of the effect of an OEP inhibitor on the microviscosity of plasma membranes of MCF-7 and MCF-7 / Vin cells
  • microviscosity a measure of the mobility of lipids in a bilayer, which plays an important role in the permeability of the membrane and the functioning of membrane proteins.
  • a fluorescence method based on the use of a lipophilic diphenylhexatriene indicator (DPHT) is used to assess the microviscosity of the plasmalemma, the fluorescence of which depends on the fluidity of the cell membrane.
  • a cell suspension with a density of 2 ⁇ 10 6 cells / ml was incubated with DPGT at a final concentration of 1 ⁇ M for 30 minutes. Then, aliquots (10 ⁇ l each) of the solutions of the EED inhibitor were introduced into the cell suspension using a multichannel dispenser to a final concentration of 8.7; 87 and 870 ⁇ g / ml, as well as doxorubicin at a concentration of 1 ⁇ M and its composition with an OEP inhibitor (DOX 1 ⁇ M + OEP inhibitor 8.7 ⁇ g / ml; DOX 1 ⁇ M + OEP inhibitor 87 ⁇ g / ml).
  • DOX 1 ⁇ M + OEP inhibitor 8.7 ⁇ g / ml DOX 1 ⁇ M + OEP inhibitor 87 ⁇ g / ml
  • the obtained data indicate that the OEP inhibitor at concentrations of 8.7, 87, and 870 ⁇ g / ml, as well as doxorubicin, as well as its composition with the OEP inhibitor, did not significantly change the polarization of DPGT fluorescence in MCF-7 cell suspensions and MCF-7 / Vin. Since the polarization of fluorescence is proportional the viscosity of the fluorophore microenvironment [4], from which it can be concluded that the investigated OEP inhibitor did not affect the microviscosity of the plasma membranes of the studied cells.
  • Cholesterol having a higher viscosity than plasmalemma phospholipids, significantly increased the polarization of fluorescence of DPGT and the microviscosity of the membrane.
  • Triton X-100 being a strong detergent, gradually dissolves the plasmalemma, as evidenced by a significant decrease in the polarization of fluorescence DPGT.
  • the investigated OEP inhibitor did not have a significant effect on the microviscosity of the cytoplasmic membranes of mammalian cells, which indicates its inertness with respect to the lipid bilayer of the cytoplasmic membranes of tumor cells.
  • Example 11 Evaluation of the accumulation of an EIA inhibitor in resistant tumor cells.
  • MCF-7 / RES cells were scattered into 6-well plates in an amount of 50,000 cells per well of the plate and cultured at 37 ° C and 5% C0 2 for 24 hours. Aliquots of the inhibitor were added to the cells, with final concentrations of 8.7, 87, and 870 ⁇ g / ml and cultured for 96 hours at 37 ° C and 5% C0 2 . Control samples were added with appropriate volumes of deionized water. After the incubation time, the medium containing the EIA inhibitor was selected with an aspirator. Cells were separated from the surface of the plate by suspension with Hanks solution and transferred into 15 ml washing tubes at least 5 times (400 g, 4 minutes).
  • HPLC-MS analysis of the intracellular accumulation of an OED inhibitor showed the presence of femto and picomolar amounts of polymer in cell lysates that were cultured with an OED inhibitor (inhibitor concentrations: 8.7, 87 and 870 ⁇ g / ml, cultivation time 96 hours). It is noteworthy that with an increase in the concentration of the OEP inhibitor in the culture medium from 8.7 to 870 ⁇ g / ml, an increase in the intracellular content is not observed.
  • Example 12 Evaluation of the effect of an OEP inhibitor on the transepithelial transport of doxorubicin through the plasma membrane of CaCO-2 cells
  • the reverse P-gp transporter In polarized CaCo-2 cells, the reverse P-gp transporter is located on the apical side of the cytoplasmic membrane and performs reverse transport (BA-A) of a large number of substrates, including doxorubicin.
  • BA-A reverse transport
  • Caco-2 cells were plated on Millicell 96 two-cell plates in an amount of 10,000 cells / well and incubated for 21 days at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • the integrity of the monolayer was checked by measuring the electrical resistance (TEER) using a Millicell-ERS instrument, with a TEER of at least 3 kOhm / well, the experiment was started.
  • TEER electrical resistance
  • CaCO-2 cells export doxorubicin from the basolateral to the apical part of the membrane (BA).
  • An OEP inhibitor acting on P-gp located on the apical part of the membrane, inhibits the reverse transport of doxorubicin, increasing its content in the direction AB: at a concentration of 8.7 ⁇ g / ml 1.9 times, at a concentration of 87 ⁇ g / ml 3.5 times and at a concentration of 870 ⁇ g / ml 3.8 times.
  • the experimental data are represented by the average of three independent experiments ⁇ standard deviation. For statistical processing, the Student criterion was used for multiple comparisons with the introduction of the Bonferroni correction, P ⁇ 0.05. In view of the above, it seems possible to conclude that the ATP-dependent inhibitor of reverse ABC transporters is highly effective.
  • An OEP inhibitor is able to eliminate the active glycosylated isoform of 190 kDa ABCB1, while the accumulation of inactive high mannose isoform of 175 kDa transporter in cells is observed.
  • Cells MCF-7, MCF-7-ABCCl-DsRed (with overexpression of MRP-1), MCF-7-ABCC2-BFP (with overexpression of MRP-2), MCF-7-ABCB 1 -GFP (with overexpression of P-gp) at a concentration of 3x10 4 cells / cm 2 were cultured in complete nutrient medium DMEM with the addition of or doxorubicin to a final concentration of 3 ⁇ m; or an OEP inhibitor to a final concentration of 261 ⁇ g / ml; or a doxorubicin-EIA inhibitor composition to a final concentration of 3 ⁇ M: 261 ⁇ g / ml for 48 hours at 37 ° C. in an atmosphere of 5% C0 2 .
  • An adapted and modified ABCAM protocol was used to study proteins by immunoblotting (Western Blot)
  • Monoclonal antibodies to ABCB1 (Cat. JVs sc-13131, Santa Cruz) were used at a 1: 200 dilution.
  • Anti-mouse antibodies conjugated to HRP - (Cat. J Ys ab6728, Abeam) at a dilution of 1: 10000 were used as secondary antibodies.
  • Monoclonal antibodies to ⁇ -actin (Cat. Ne mAbcam 8226, Abeam) were used at a 1: 2000 dilution. The results of the analysis were visualized on a ChemiDoc XRS + system (Bio-Rad) instrument.
  • Protein ABCB1 is represented by 2 isoforms, with a molecular weight of 190 kDa and 175 kDa (Fig. 7, upper and lower gangs). Moreover, the 190 kDa isoform is a glycosylated active form of the protein, and 175 kDa gangs is a highly mannose inactive protein [7].
  • MCF-7 control cells contain an equivalent amount of active and inactive proteins. Exposure to doxorubicin increases the amount of the active form of the protein, while an OEP inhibitor eliminates the active form of ABCB1 almost completely. In this case, an inactive form of the transporter is accumulated in the cells. Cells exposed to the combined preparation express both active and high mannose forms of the protein.
  • Example 14 The effect of an OED inhibitor on the ATPase activity of membranes with overexpression of ABCB1
  • ATPase activity of membrane P-glycoprotein was studied using a commercial preparation of isolated insect cell membranes Spodoptera frugiperda (Sf line overexpressing human recombinant P-glycoprotein according to procedure [8]. ATP hydrolysis during catalytic activity of P-glycoprotein is accompanied by the formation of inorganic phosphate ), detected by spectrophotometric reaction. It was shown that the OEP inhibitor inhibits ATPase activity with a direct concentration dependence - with an increase in concentration, the inhibitory effect increases.
  • the tested OEP inhibitor at a concentration of 8.7-870 ⁇ g / ml was incubated with recombinant membranes, overexpressing P-glycoprotein and substrates in 1.5 ml microtubes in triplicates.
  • the optical density of the reaction product was measured at 880 nm, which is proportional to the activity of the reverse transporter and the ATPase activity of the enzyme.
  • a non-specific inhibitor of enzyme activity beryllium fluoride
  • the OEP inhibitor significantly inhibits the ATPase activity of P-glycoprotein.
  • the inhibitory activity of the EIA inhibitor decreases slightly with an increase in its concentration from 8.7 to 87 ⁇ g / ml, but it increases significantly at a concentration of 870 ⁇ g / ml.
  • amphiphilic block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide inhibit the ATPase activity of P-glycoprotein due to incorporation into the lipid membrane and changes in the micro viscosity of the transporter’s lipid microenvironment [9] - [11].
  • the investigated OEP inhibitor does not significantly change the microviscosity of cell membranes; therefore, its mechanism of action does not exclude the possibility of a direct inhibitory effect on P-glycoprotein. In view of the above, it is possible to conclude that the OEP inhibitor significantly inhibits the activity of the ATP-dependent reverse ABC transporter P-gp.
  • Example 15 The effect of an OEP inhibitor on the level of ATP in MCF-7, MCF-7 / Vin cells
  • a cell suspension (MCF-7 or MCF-7 / Vin) with a density of 2 ⁇ 10 6 cells / ml was incubated for 2 hours at 25 ° C with an OES carrier (final concentrations of 87, 430 and 2175 ⁇ g / ml) or doxorubicin (final concentration of 10 ⁇ M ), or a composition of doxorubicin with an EIA inhibitor at concentrations of 10 ⁇ M and 87 ⁇ g / ml.
  • the cells were besieged by centrifugation (300g, 4 minutes) and washed in a buffer solution that activates the production of ATP in the cells.
  • the composition of the buffer NaCl (122 mm), ANCO3 (25 mm), glucose (10 mm), KC1 (3 mm), MgS0 4 (1.2 mm), K 2 HPO 4 (0.4 mm), CaCl 2 ( 1.4 mM) and HEPES (10 mM).
  • the resulting cell pellet was lysed for 5 minutes in chilled lysis buffer with vigorous stirring.
  • the composition of the lysis buffer Tris-HCL (0.05 M), EDTA (2 mm), TritonXlOO (1%), NaF (10 mm). Cell lysates were immediately frozen and stored until analysis at -74 ° C.
  • ATP content in cell lysates was determined using chemiluminescent method in a reaction involving luciferase, D-luciferin and ATP using the highly sensitive ATP reagent manufactured by Lumtek.
  • Example 16 The toxicity parameters of the EIA inhibitor in vivo
  • Intragastric administration was carried out in animals deprived of food (for a period of at least 8 hours), with free access to water. The volume of administration was calculated individually for each animal, based on body weight recorded immediately before the introduction of the substance. Access to food was resumed one hour after administration.
  • an OEP inhibitor when administered intragastrically, refers to non-toxic substances in terms of toxicity and, when administered intravenously, to low-toxic substances.
  • Pluronic L-61 which is part of the preparation SP1049C, which is at the 3rd stage of clinical trials, has higher toxicity [13]. So, LD50 Pluronic L-61 with the intravenous route of administration to mice corresponds to 800 mg / kg.
  • an OEP inhibitor is obtained by a method including preparation of a start system, hydroxypropylation of a start system in the presence of an alkaline catalyst, neutralization of the obtained product, purification to obtain the desired OEP inhibitor, characterized in that the ratio of sorbitol : alkali metal or alkaline earth metal hydroxide: bifunctional oxygen-containing compound in the starting system is calculated the same so that as a result of their reaction with propylene oxide, an equimolar mixture of polyoxypropylene glycol and polyoxypropylenehexol is obtained.
  • the claimed technical solution meets the criterion of "inventive step" for inventions, because the obtained inhibitor of ATP-dependent reverse cell transporters and the method for its preparation provide the opportunity to solve previously unsolvable problems, namely, with a significant increase in therapeutic efficacy, significantly increase safety, and at the same time significantly reduce the cost of the finished dosage form.
  • the claimed technical solution meets the criterion of "industrial applicability" to the invention, as it can be used in production at specialized enterprises, using well-known materials, equipment and technologies.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)
  • Epoxy Compounds (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к химии лекарственных соединений, а именно к группе хиральных конъюгатов (оптически активных гибридных молекул) олигоэфирполиольной природы, являющихся ингибиторами АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток (ОЭП-ингибитор). ОЭП-ингибитор представляет собой конъюгат с эквимольным соотношением оптически активного полиоксипропиленгексола и полиоксипропиленгликоля. Заявленный способ, по которому получается конъюгат, обеспечивает возможность получения препарата, увеличивающего эффективность действия лекарственных средств посредством ингибирования механизмов множественной лекарственной устойчивости клеток. Полученный препарат может быть использован в области биологии, фармакологии, фармацевтики, медицины, сельского хозяйства. ОЭП-ингибитор получают оксипропилированием смеси сорбита и бифункционального кислородсодержащего соединения в присутствии гидроокиси щелочного или щелочноземельного металла. Бифункциональное кислородсодержащее соединение может быть водой, пропиленгликолем, дипропиленгликолем, трипропиленгликолем, тетрапропиленгликолем, пентапропиленгликолем, гексапропиленгликолем, гептапропиленгликолем или их смесью. Ингибитор представляет собой коньюгат полиоксипропиленгликоля с молекулярной массой от 300 до 500 Да и полиоксипропиленгексола с молекулярной массой от 1000 до 1500 Да в эквимольном соотношении, с гидроксильным числом в пределах 215-240 мг КОН/г.

Description

Ингибитор АТФ-зависи ых обратных транспортеров
клеток и способ его получения
Изобретение относится к области разработки физиологически активных веществ, а именно, к группе хиральных конъюгатов (оптически активных гибридных молекул) олигоэфирполиольной природы (ОЭП), являющихся ингибиторами АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток, сокращенно называемых ABC-транспортерами (от англ. ATP-binding cassette transporters). Изобретение может быть использовано в области биологии, фармакологии, фармацевтики, медицины, сельском хозяйстве и экологии для существенного усиления эффективности действия физиологически активных веществ, в том числе лекарственных средств - противоопухолевых, сердечно-сосудистых, противоаллергических, противовоспалительных и других, за счет подавления механизмов множественной лекарственной устойчивости клеток под действием заявленных ингибиторов АВС-транспортеров.
Одной из наиболее актуальных проблем современной фармакотерапии является множественная лекарственная устойчивость патологических клеток - врожденная или приобретенная невосприимчивость клеток к лекарственным препаратам, различающимся по механизму действия и структуре. Одним из основных механизмов возникновения лекарственной устойчивости патологических клеток является способность к обратному захвату и выбросу проникающих в клетку молекул ксенобиотиков АТФ-зависимыми насосами семейства АВС-транспортеров [1].
В семейство АВС-транспортеров входят гликопротеин P-gp (P-glycoprotein), белки множественной лекарственной устойчивости семейства MRP (multidrug resistance- associated protein) и белок устойчивости рака молочной железы BCRP (breast cancer resistance protein). Активность указанных АВС-транспортеров, экспрессия которых существенно возрастает при возникновении патологических процессов в клетке, приводит к значительному снижению эффективности фармакотерапии. Подобные эффекты детально показаны и исследованы на примере большинства лекарственных средств для химиотерапии опухолей [2], в том числе таргетных, но и при многих других патологиях ABC-транспортеры существенно снижают эффективность лекарств. АВС-транспортеры обладают широкой субстратной специфичностью, осуществляя обратный захват и выброс из клетки многих лекарств из различных терапевтических групп.
В качестве примеров, не носящих исчерпывающий характер, субстратами АВС- транспортеров являются [3]: анальгетики (асимадолин, фентанил, морфин, пентазоцин); антибиотики (ампициллин, азитромицин, цефоперазон, цефтриаксон, кларитромицин, доксициклин, эритромицин, грамицидин А, грамицидин D, грепафлоксацин, итраконазол, кетоконазол, левофлоксацин, рифампицин, спарфлоксацин, тетрациклин, валиномицин и другие); противовирусные препараты (делавирдин, лопинавир, ламивудин, нелфинавир, зидовудин); антиаритмические препараты (амиодарон, дигоксин, лидокаин, пропафенон, хинидин, верапамил); противоопухолевые препараты (5-фторурацил, актиномицин D, бисантрен, хлорамбуцил, колхицин, цисплатин, цитарабин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, гефитиниб, иринотекан, метотрексат, митомицин С, митоксантрон, паклитаксел, тамоксифен, тенипозид, топотекан, винбластин, винкристин и другие); антигистаминные препараты (циметидин, фексофенадин, ранитидин, терфенадин); гиполипидемические препараты (ловастатин, симвастатин, правастатин, розувастатин); блокаторы кальциевых каналов (азидопин, бепридил, дилтиазем, фелодипин, нифедипин, низолдипин, нитрендипин, тиапамил, верапамил); анти-ВИЧ препараты (ампренавир, индинавир, лопинавир, нелфинавир, саквинавир, ритонавир); иммуносуппрессоры (циклоспорин А, сиролимус, такролимус), антидепрессанты (хлорпромазин, фенотиазин) и многие другие лекарственные соединения природного, синтетического или полусинтетического происхождения.
Таким образом, создание эффективных и безопасных ингибиторов АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток является перспективным подходом к увеличению эффективности действия широкого ряда физиологически активных веществ, в том числе лекарственных средств. Создание подобных препаратов позволило бы значительно уменьшить терапевтическую дозу активных веществ, и как следствие, их побочные эффекты, и тем самым совершить качественный скачок в фармакологии и медицине.
Из исследованного уровня техники известен широкий ряд соединений, в том числе разрешенных к применению лекарственных препаратов, способных ингибировать АВС- транспортеры. Так, была проведена масштабная исследовательская работа по созданию ингибиторов ABC-транспортеров в качестве препаратов, увеличивающих чувствительность раковых клеток к действию противоопухолевых препаратов [3]. В частности, в качестве ингибиторов P-gp проявили активность и исследовались для комбинированной противоопухолевой химиотерапии аторвастатин, амлодипин, циклоспорин А, дисульфирам, нифедипин, верапамил, препараты GF 120918, LY475776, LY335979, MS-209, OC144-093, pluronic L61, PSC-833, R101933, S9788, VX-710, XR-9576, V-104. В качестве ингибиторов MRP2 исследовались азитромицин, циклоспорин А, фуросемид, глибенкламид, пробенецид, МК-571. В качестве ингибиторов BCRP исследовались циклоспорин А, дипиридамол, элакридар, фумитреморгин С, новобиоцин, ортатаксел, резерпин, ритонавир, тариквидар, GF 120918, VX-710, XR-9576.
Как известно из уровня техники, различают три поколения ингибиторов АВС- транспортеров:
Поколение 1: циклоспорин А, верапамил (примеры). Эти соединения являются эффективными ингибиторами обратного транспорта, но сами обладают высокой токсичностью. Их применение с химиотерапевтическими препаратами не привело к существенным клиническим результатам.
Поколение 2: PSC-833 и VX-710 (примеры). Эти соединения также являются эффективными ингибиторами обратного транспорта. Однако их применение с химиотерапевтическими препаратами также не привело к существенным клиническим результатам; кроме того, наблюдались существенные побочные эффекты терапии, связанные с лекарство-лекарственными взаимодействиями.
Поколение 3: GF120918, LY335979, R101933 и XR9576 (примеры). Эти соединения являются еще более эффективными ингибиторами обратного транспорта на in vitro моделях, чем ингибиторы поколений 1 и 2. Однако их применение с химиотерапевтическими препаратами также не привело к существенным клиническим результатам по причинам низкой безопасности (наличия нежелательных побочных эффектов) и недостаточной терапевтической эффективности.
В целом современное состояние исследований в этой области характеризуется локальными успехами на уровне in vitro, однако переход к in vivo, а тем более к клиническим исследованиям, как правило, не приносит желаемого эффекта, в основном, в силу наличия нежелательных побочных эффектов композиций, неоптимальной фармакокинетики, а также недостаточной эффективности ингибирующего действия [3]. При этом во всех современных исследованиях отмечается перспективность дальнейших поисков в этом направлении.
Исходя из указанного, становится очевидным, что для полноценной реализации перспектив данного подхода требуются более активные и безопасные ингибиторы АВС- транспортеров.
Аналогов или прототипов у заявленного технического решения по совпадающим признакам на дату предоставления заявочных материалов не выявлено, однако заявителем выявлено большое количество средств для решения поставленной задачи по назначению. В заявленном техническом решении применен творческий подход, который позволяет одновременно значительно увеличить терапевтическую эффективность, повысить безопасность, а также существенно снизить стоимость активной фармацевтической субстанции, повысить технологичность производственного процесса получения субстанции. При этом заявленное техническое решение обеспечивает возможность выхода на международный рынок с продуктом, ранее не известным в мире.
Целью заявленного технического решения является получение ингибитора обратных АВС-транспортеров клеток олигоэфирполиольной природы (ОЭП-ингибитор), состоящего из полиоксипропиленгликоля с молекулярной массой от 300 до 500 Да и полиоксипропиленгексола с молекулярной массой от 1000 до 1 00 Да.
Цели заявленного технического решения достигаются путем осуществления следующего химического процесса по схеме:
Figure imgf000006_0001
где:
1 - сорбит ((2S,3i?,4i?,5J?)-reKcaH-l,2,3,4,5,6-reKcofl);
2 - бифункциональное кислородсодержащее соединение, в котором R = -О-; [- ОСН2СН(СН3)]к-0-, к=1-7;
3 - ОКИСЬ пропилена;
Μ(ΟΗ)χ, - гидроокись металла, где М - щелочной или щелочноземельный металл, х=1 или 2;
п=2-6, преимущественно п=4;
т=5-9, преимущественно ш=7. Таким образом, заявленное техническое решение в отношении способа реализуется единовременно, в одном реакторе, в один этап, с применением доступных реагентов, взятых в пропорциях, обеспечивающих получение целевого конъюгата с эквимольным соотношением оптически активного соединения 4 и соединения 5.
Процесс в целом реализуется в соответствии с представленной выше схемой, в соответствии с приведенным далее описанием.
В реактор-полимеризатор загружают исходные реагенты 1 и 2, добавляют щелочной катализатор, включают перемешивание и в атмосфере азота выдерживают реакционную смесь при температуре 90-100 °С в течение 30 минут до получения гомогенной массы. Затем подается расчетное количество соединения 3 со скоростью, обеспечивающей давление в реакторе-полимеризаторе не выше 0,39 мПа (4 кгс/см ), и при температуре не вьппе 115 °С. После этого проводится вьщержка реакционной массы при температуре не вьппе 115 °С в течение 1-1,5 часов до остановки падения давления.
При этом соотношение реагентов 1, 2 и М(ОН)х рассчитывается таким образом, чтобы в результате их реакции с окисью пропилена получилась эквимольная смесь соединений 4 и 5. Соединение 4 с п=4 и соединение 5 с т=7 представляют собой основные олигомерные компоненты, образующиеся в описанной реакции анионной олигомеризации. Количество соединения 3 рассчитывается таким образом, чтобы полученная эквимольная смесь соединений 4 и 5 обладала гидроксильным числом в пределах 215-240 мг КОН/г.
В качестве бифункционального кислородсодержащего соединения 2 могут выступать пропиленгликоль, дипропиленгликоль, трипропиленгликоль, тетрапропиленгликоль, пентапропиленгликоль, гексапропиленгликоль, гептапропиленгликоль, или вода, или их смесь. При взаимодействии гидроокиси щелочного или щелочноземельного металла с кислородсодержащим соединением или сорбитом выделяется вода, которая также должна учитываться при расчете эквимольного соотношения образующихся целевых продуктов 4 и 5.
Для соединения 4 оптимальной молекулярной массой является 1200 Да, при этом оно проявляет эффективность также в диапазоне от 1000 до 1500 Да. Для соединения 5 оптимальной молекулярной массой является 400 Да, при этом в диапазоне от 300 до 500 Да оно также обладают эффективностью. Выход за указанные диапазоны молекулярных масс также возможен, но сопровождается некоторым снижением активности получаемого ингибитора АВС-транспортеров.
Ингибитор АВС-транспортеров может быть получен альтернативным способом, который не приводится заявителем в силу его известности как такового, и заключается в раздельном получении соединений 4 и 5 путем взаимодействия соответственно соединений 1 и 2 с окисью пропилена 3 в условиях щелочного катализа, с дальнейшим их механическим смешением в эквимольных количествах.
Изобретение проиллюстрировано следующими материалами:
Фиг. 1 - График зависимости вязкости ОЭП-ингибитора от температуры.
Фиг. 2 - ВЭЖХ-МС спектр ОЭП-ингибитора.
Фиг. 3 - Концентрации полумаксимального ингибирования роста (СС5о и 1С5о, мкМ) соединений для условно-нормальных и опухолевых клеток человека.
Фиг. 4 - Содержание ОЭП-ингибитора в анализируемых клеточных лизатах по данным ВЭЖХ-МС.
Фиг. 5 - Поляризация флуоресценции ДФГТ (1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен) в клеточной суспензии после добавления эффекторов: ОЭП-ингибитора, композиции доксорубицина и ОЭП-ингибитора, холестерола и Тритон Х- 100. (А) клетки MCF-7; (В) клетки с МЛУ MCF-7/Vin. Плотность суспензии 2 106 клеток/мл, температура 25 °С, в следующих концентрациях: ОЭП-ингибитор - 8,7, 87 и 870 мкг/мл, доксорубицин - 1 мкМ, холестерол - 100 мкг/мл, Triton Х- 100 - 0,05%.
Фиг. 6 - Гистограмма трансэпителиального транспорта доксорубицина в поляризованных СаСо-2 клетках. Сокращения: апикально-базолатеральный транспорт (А- В), базолатерально-апикальный транспорт (В-А).
Фиг. 7 - Фотография результатов иммуноблоттинга исходных и генно- модифицированных клеток MCF-7, после обработки доксорубицином, ОЭП-ингибитором или их комбинацией в течение 48 часов.
Фиг. 8 - Влияние эффекторов на АТФ-азную активность Р-гликопротеина человека изолированных мембран клеток Sf9 (0,2 мг/мл по белку). Контроль: базовая активность мембран в присутствии 5 мМ АТФ и 0,1 мМ винбластина.
Фиг. 9 - Содержание АТФ в лизатах клеток MCF-7 (А) и MCF-7/Vin (В), обработанных ОЭП-ингибитором (87, 430, 2175 мкг/мл), доксорубицином (10 мкМ) и их композицией (ОЭП-ингибитор 87 мкг/мл + DOX 10 мкМ).
Далее заявителем представлены примеры способов получения ОЭП-ингибитора. Пример 1. Способ получения ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит-вода.
В стальной реактор-полимеризатор, снабженный механической мешалкой, холодильником, термопарой, трубкой для ввода окиси, загружают 27,3 г (0,15 моль) сорбита и добавляют 0,6 г (0,01 моль) гидроксида калия в 2,51 г (0,139 моль) воды. Реактор трижды продувают азотом. Включают перемешивание и в атмосфере азота вьщерживают при температуре 90-100 °С в течение 30 минут до получения гомогенной массы. Поднимают температуру до 115 °С и порционно подают 270 г (4,65 моль) окиси пропилена со скоростью, обеспечивающей давление в реакторе-полимеризаторе не выше 0,39 мПа (4 кгс/см2) и температуру не выше 115 °С. После подачи расчетного количества окиси пропилена вьщерживают реакционную массу при температуре не выше 120 °С в течение 1-1,5 часов до остановки падения давления.
Полученный ОЭП-ингибитор нейтрализуют 50% водным раствором ортофосфорной кислоты до рН 6,5-7,5, удаляют воду в вакууме при температуре 80-90 °С и отфильтровывают с монтмориллонитом через бельтинг. После всех операций получают 270 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 645 мПа*с, плотность 1,038 г/см3 (20 °С). Гидроксильное число - 220 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п. 3.1).
Пример 2. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит- пропиленгликоль.
В стальной реактор-полимеризатор, снабженный механической мешалкой, холодильником, термопарой и трубкой для ввода окиси, загружают 28,7 г (0,157 моль) сорбита и добавляют 0,63 г (0,01 моль) гидроксида калия в 10,98 г (0,145 моль) пропиленгликоля. Реактор трижды продувают азотом. Включают перемешивание и в атмосфере азота вьщерживают при температуре 90-100 °С в течение 30 минут до получения гомогенной массы. Поднимают температуру до 115 °С и порционно подают 274 г (4,73 моль) окиси пропилена со скоростью, обеспечивающей давление в реакторе- полимеризаторе не выше 0,39 мПа (4 кгс/см2) и температуру не выше 115 °С. После подачи расчетного количества окиси пропилена вьщерживают реакционную массу при температуре не выше 120 °С в течение 1-1,5 часов до остановки падения давления.
Полученный ОЭП-ингибитор нейтрализуют 50% водным раствором ортофосфорной кислоты до рН 6,5-7,5, удаляют воду в вакууме при температуре бани 80- 90 °С и отфильтровывают с монтмориллонитом через бельтинг. После всех операций получают 285 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 618 мПа*с, плотность 1,035 г/см3 (20 °С). Гидроксильное число - 231 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п. 3.1).
Пример 3. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит- дипропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,3 г (0,15 моль), КОН - 0,6 г (0,011 моль), дипропиленгликоль - 18,5 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 255 г (4,4. моль). После нейтрализации и фильтрования получают 308 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 623 мПа*с, плотность 1,036 г/см3 (20 °С). Гидроксильное число - 227 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п. 3.1).
Пример 4. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит- трипропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,3 г (0,15 моль), КОН - 0,61 г (0,011 моль), трипропиленгликоль - 26,7 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 246 г (4,24 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 280 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 629 мПа*с, плотность 1,036 г/см3 (20 °С). Гидроксильное число - 229 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п. 3.1).
Пример 5. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит- тетрапропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,29 г (0,15 моль), КОН - 0,6 г (0,011 моль), тетрапропиленгликоль - 34,75 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 246 г (4,24 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 285 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 620 мПа*с, плотность 1,034 г/см3 (20 °С). Гидроксильное число - 233 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п. 3.1).
Пента-, гекса- и гептапропиленгликоли были получены при взаимодействии пропиленгликоля с окисью пропилена в условиях щелочного катализа. Для каждого из образцов определялось гидроксильное число.
Пример 6. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит- пентапропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,3 г (0,15 моль), КОН - 0,61 г (0,011 моль), пентапропиленгликоль - 42,8 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 230 г (3,95 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 285 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 627 мПа*с, плотность 1,033 г/см3 (20 °С). Гидроксильное число - 231 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п. 3.1).
Пример 7. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит- гексапропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,31 г (0,15 моль), КОН - 0,6 г (0,011 моль), гексапропиленгликоль - 50,87 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 222 г (3,83 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 283 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 615 мПа*с, плотность 1,037 г/см3 (20 °С). Гидроксильное число - 225 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п. 3.1).
Пример 8. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит- гептапропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,3 г (0,15 моль), КОН - 0,61 г (0,011 моль), гептапропиленгликоль - 58,9 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 214 г (3,83 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 283 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 623 мПа*с, плотность 1,036 г/см3 (20 °С). Гидроксильное число - 224 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п.3.1).
Полученный ОЭП-ингибитор представляет собой бесцветную или слегка желтоватую жидкость с вязкостью при комнатной температуре 575-715 МПа*с (на Фиг. 1 представлена зависимость вязкости ОЭП-ингибитора от температуры), с плотностью в пределах 1,01- 1,05 г/см3 (20 °С). Гидроксильное число - 215-240 мг КОН/г, рН 10% раствора (этанол/вода - 70/30) составляет 5,5-7,5.
ОЭП-ингибитор характеризуется множеством m/z пиков в диапазоне как небольших (400-1200 Да), так и более тяжелых масс (1500-2000 Да) (Фиг. 2), что отражает наличие статистического набора продуктов реакции поликонденсации. Анализ проводился с использованием хроматографической колонки Agilent ZORBAX Extend-C18 (размер колонки 1 x 150 мм, размер частиц 3,5 мкм) с предколонкой Extend Guard (1 x 17 мм, размер частиц 5 мкм) на хроматографе Agilent 1260 Binary System (вакуумный дегазатор G1379B, бинарный градиентный насос G1312B, колоночный термостат G1316A, автоматический пробоотборник G1367E, термостат для автоматического пробоотборника G1330 В). Детектор - квадрупольно-времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения АВ Sciex 5600 с источником ионизации DuoSpray. Подвижная фаза: растворитель А - 10 мМ раствор формиата аммония в смеси вода метанол (90 : 10 %); растворитель В - 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле. Наиболее интенсивные пики ОЭП-ингибитора использовались для его количественного анализа в биологических матрицах.
Техническим результатом заявленного технического решения является способ получения хиральных конъюгатов (оптически активных гибридных молекул) олигоэфирполиольной природы, являющихся ингибиторами АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток (ОЭП-ингибиторами), для существенного усиления эффективности действия физиологически активных веществ из числа противоопухолевых, сердечно- сосудистых, противоаллергических, противовоспалительных и других лекарственных соединений.
Далее заявителем представлены обозначения и сокращения, которые использованы для реализации заявленного технического решения
ABC (от англ. ATP binding cassette)— АТФ-зависимый транспортер
APS - ammonium persulfate, персульфат аммония
АТР (от англ. adenosine triphosphate)— аденозин-3 -фосфат, АТФ
С - цитозин
DOX - доксорубицин
EGTA (от англ. ethylene 1усо1-Ь1з(2-аттоету1еШег)^^^'^ еи*аасеис acid) - этиленгликоль бис(2-аминоэтиловый эфир) -Ν,Ν,Ν',Ν'- тетрауксусной кислоты
FAM (от англ. 6-carboxyfluorescein)— 6- карбоксифлуоресцеин
G - гуанин
HRP (от англ. horseradish peroxidase) - пероксидаза хрена
LC-MS - жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией
m/z - соотношение массы к заряду
P-gp - Р-гликопротеин
рН - водородный показатель
Pi (от англ. inorganic phosphate) - неорганический фосфат
Т - тимин
υ/μί - единиц в микролитре
Vin - винбластин
А2бо - значение длины волны в ангстремах при 260 нм
А - аденин
ДМСО - диметилсульфоксид
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДФГТ - дифенилгексатриен
ЛС - лекарственное средство
ЛФ - лекарственная форма
Мкг - микрограмм
Мл - миллилитр
МЛУ - множественная лекарственная устойчивость MTT (от англ. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) - тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид
Об/мин - оборотов в минуту
ОЭП - олигоэфирполиол
РНК - рибонуклеиновая кислота
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
Материалы и методы
Хи ические реагенты и материалы
Доксорубицин (DOX) гидрохлорид, уабаин октагидрат, пентаэтиленгликоль 98%, β-меркаптоэтанол, этиленгликоль тетрауксусной кислоты (EGTA), бериллия сульфат тетрагидрат, натрия фторид, аммония молибдат были приобретены в Sigma-Aldrich (США). Бромфеноловый синий, деоксихолат натрия, Трис-гидрохлорид (трис- (оксиметил)аминометан гидрохлорид), аммоний персульфат (APS), натрия додецилсульфат (SDS) приобретены в компании Amresco (США). МТТ 3-(4,5- Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) от Life technologies (США). L- глутамин, раствор Дульбекко, не содержащий ионы Са2+ и Mg2+ , раствор трипсина-ЭДТА, раствор Хэнкса без фенолового красного, среды а-МЕМ и DMEM приобретены в компании ПанЭко (Россия). 1,6-Дифенил-1,3,5-гексатриен (ДФГТ), дитиотреитол (1,4- бис(сульфанил)бутан-2,3-диол), аскорбиновая кислота, холестерол, Triton® Х- 100, винбластина сульфат, АТФ динатриевая соль гидрат, HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-l- piperazineethanesulfonic acid) от компании Acros Organics. В компании Helicon были приобретены лаурилсульфат натрия (SDS) и этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
Условия культивирования клеток:
Клетки MCF-7, MCF-7 Vin, HSF, СаСо-2, НСТ-15, НСТ-116, OVCAR-4, РС-3, А- 498, NCI-H322M, М- 14, SNB-19, SF-539 (табл.1) культивируют в среде а-МЕМ с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5%-го С02 при 37 °С до образования монослоя. Для получения клеточной суспензии монослой клеток трипсинизируют с последующей инактивацией трипсина добавлением среды а-МЕМ с сывороткой. Подсчёт клеток производится в камере Неубайера методом исключения трипанового синего. Клетки пересевают 2 раза в неделю в отношении 1:6.
Таблица 1
Перечень используемых клеточных линий
Figure imgf000014_0001
Пример 9. Исследование цитотоксического эффекта ОЭП-ингибитора in vitro.
Исследовали влияние ОЭП-ингибитора на пролиферативный потенциал опухолевых и условно-нормальных клеток человека при 72 часовой инкубации с использованием МТТ-теста. В лунки 96-ти луночного планшета вносили 1000 клеток в 90 мкл культуральной среды и инкубировали 24 часа в С02 инкубаторе для адгезии клеток к субстрату. Далее вносили аликвоты приготовленных растворов исследуемых соединений (ОЭП-ингибитор) в объеме 10 мкл/лунку. Исследование проводили в трипликатах. В контрольные лунки планшета вместо анализируемых соединений вносили аналогичные объемы mQ. После внесения исследуемых веществ клетки культивировали в С02 инкубаторе в стандартных условиях в течение 72 часов. Далее культуральную среду с исследуемыми веществами удаляли из планшета с помощью вакуумного аспиратора, добавляли питательную среду и МТТ-реагент 5 мг/мл, инкубировали в С02 инкубаторе 3- 4 часа. По истечении времени инкубации культуральную среду с МТТ-реагентом удаляли вакуумным аспиратором, вносили по 100 мкл ДМСО и инкубировали 5-10 минут. Появившееся фиолетовое окрашивание детектировали на планшетном ридере Тесап при 555 нм (референтная длина волны - 650 нм). Строили графики зависимости доза-эффект и определяли концентрацию полумаксимального ингибирования роста клеток (IC50) Результаты представлены в таблице 2 на Фиг. 3.
Таким образом, детальный анализ таблицы позволяет сделать однозначно трактуемые выводы о том, что для большей части исследованных клеток 1С50 ОЭП- ингибитор превышает 1,5 мг/мл, что свидетельствует о полной безопасности заявленного коньюгата. При этом можно констатировать специфичность ОЭП-ингибитора к клеткам глиобластомы SNB-19 и глиосаркомы SF-539 (IC50 составляет 0,46 ± 0,12 мг/мл и 0,46 ± 0,12 мг/мл, соответственно), что свидетельствует о его некотором, хотя и незначительном собственном противоопухолевом действии на указанные виды клеток.
Пример 10. Оценка влияния ОЭП-ингибитора на микровязкость плазматических мембран клеток MCF-7 и MCF-7/Vin
Ключевой физико-химической характеристикой клеточных мембран, влияющей на их физиологическую активность, является микровязкость - мера подвижности липидов в бислое, которая играет важную роль в проницаемости мембраны и функционировании мембранных белков. Для оценки микровязкости плазмалеммы применяют флуоресцентный метод, основанный на использовании липофильного индикатора дифенилгексатриена (ДФГТ), флуоресценция которого зависит от текучести клеточной мембраны.
Клеточную суспензию плотностью 2 <106 клеток/мл инкубировали с ДФГТ в конечной концентрации 1 мкМ в течение 30 мин. Далее в суспензию клеток с помощью многоканального дозатора вносили аликвоты (по 10 мкл) растворов ОЭП-ингибитора до конечной концентрации 8,7; 87 и 870 мкг/мл, а также доксорубицин в концентрации 1 мкМ и его композиции с ОЭП-ингибитором (DOX 1 мкМ + ОЭП-ингибитор 8,7 мкг/мл; DOX 1 мкМ + ОЭП-ингибитор 87 мкг/мл). В качестве положительных контролей, значимо изменяющих микровязкость плазматических мембран клеток, тестировали холестерол в конечной концентрации 100 мкг/мл, а также липофильный детергент Triton Х- 100 в концентрации 0,05%. Непосредственно после внесения аликвот проб детектировали поляризацию флуоресценции ДФГТ в течение 1 часа с интервалом 10 минут.
Результаты влияния ОЭП-ингибитора на микровязкость плазматических мембран клеток MCF-7 и MCF-7/Vin представлены на Фиг. 5.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ОЭП-ингибитор в концентрациях 8,7, 87 и 870 мкг/мл, а также доксорубицин, как и его композиции ОЭП- ингибитором, значимо не изменял поляризацию флуоресценции ДФГТ в суспензиях клеток MCF-7 и MCF-7/Vin. Поскольку поляризация флуоресценции пропорциональна вязкости микроокружения флуорофора [4], из чего можно заключить, что исследуемый ОЭП-ингибитор не влиял на микровязкость плазматических мембран исследуемых клеток. Холестерол, обладая большей вязкостью, чем фосфолипиды плазмалеммы, значительно увеличивал поляризацию флуоресценции ДФГТ и микровязкость мембраны. Triton Х- 100, являясь сильным детергентом, постепенно растворяет плазмалемму, о чем свидетельствует значительное уменьшение поляризации флуоресценции ДФГТ. Исследуемый ОЭП-ингибитор не оказал значимого эффекта на микровязкость цитоплазматических мембран клеток млекопитающих, что свидетельствует об его инертности в отношении липидного бислоя цитоплазматических мембран опухолевых клеток.
Пример 11. Оценка накопления ОЭП-ингибитора в резистентных опухолевых клетках.
Известно, что некоторые гидрофобные блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида обладают способностью проникать через барьер плазматической мембраны клеток, накапливаться в цитоплазме и оказывать эффекты на внутриклеточные органеллы и ферменты. В частности, показано, что плуроник Р85 обладает свойством изменять микровязкость мембран митохондрий и разобщать окислительное фосфорилирование [5], [6]. В связи с этим, представляло интерес определить степень внутриклеточного накопления тестируемого ОЭП-ингибитора. Идентификацию и количественное определение содержания ингибитора в лизатах клеток осуществляли с использованием жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектроскопией (ВЭЖХ-МС).
Клетки MCF-7/RES рассеивали в 6- луночные планшеты в количестве 50 000 клеток в лунку планшета и культивировали при 37 °С и 5% С02 в течение 24-х часов. К клеткам добавляли аликвоты ингибитора, конечные концентрации которого составляли 8,7, 87 и 870 мкг/мл и культивировали в течение 96 часов при 37 °С и 5% С02. К контрольным пробам вносили соответствующие объемы деионизированной воды. По истечении времени инкубации среду, содержащую ОЭП-ингибитор, отбирали аспиратором. Клетки отделяли от поверхности планшета при помощи суспендирования раствором Хенкса и переносили в 15 мл пробирки для отмывки не менее 5 раз (400 g, 4 минуты). К осадку клеток вносили 150 мкл деионизированной воды, содержащей внутренний стандарт - пентаэтиленгликоль концентрацией 10"5 М. Клетки лизировали двумя циклами замораживания и оттаивания (4 мин при -75 °С, с инкубацией на водяной бане при 37 °С в течение 2 мин) с последующей обработкой ультразвуком 4 мин. Аликвоты лизатов отбирали для последующего определения количества белка в пробах с использованием набора Pierce™ BCA Protein Assay Kit производства «Life Technologies)). К клеточным лизатам вносили 700 мкл охлажденного метанола, инкубировали в течение 15 минут при - 20 °С с последующим центрифугированием при 17400 g и 0 °С в течение 20 минут. Супернатант переносили в чистые пробирки и высушивали под вакуумом на лиофильной сушке. Непосредственно перед анализом высушенные клеточные лизаты растворяли в 200 мкл смеси метанол/вода 1:1 с добавлением 0,1% муравьиной кислоты. Все ВЭЖХ-МС эксперименты осуществляли с использованием хроматографической системы на хроматографе Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc., USA), сопряженном с масс- спектрометром AB Sciex 5600 (AB Sciex, USA).
Результаты оценки накопления ОЭП-ингибитора в резистентных опухолевых клетках представлены в Таблице 3 на Фиг. 4.
ВЭЖХ-МС анализ внутриклеточного накопления ОЭП-ингибитора показал наличие фемто- и пикомолярных количеств полимера в лизатах клеток, которые культивировались с ОЭП-ингибитором (концентрации ингибитора: 8,7, 87 и 870 мкг/мл, время культивирования 96 часов). Примечательно, что с увеличением концентрации ОЭП- ингибитора в культуральной среде с 8,7 до 870 мкг/мл увеличение внутриклеточного содержания не прослеживается. Отсутствие концентрационных зависимостей и низкое содержание ОЭП-ингибитора в лизатах позволяет заключить, что обнаруженные следы ОЭП-ингибитора связаны с его неспецифической адсорбцией на плазматической мембране и не обусловлены его проникновением в цитоплазму клеток, в силу указанного представляется возможным сделать вывод о высокой безопасности заявленного конъюгата.
Пример 12. Оценка влияния ОЭП-ингибитора на трансэпителиальный транспорт доксорубицина через плазматическую мембрану клеток СаСо-2
В поляризованных клетках СаСо-2 обратный транспортер P-gp располагается на апикальной стороне цитоплазматической мембраны и осуществляет обратный транспорт (В- А) большого количества субстратов, включая доксорубицин.
Клетки Сасо-2 рассаживали в планшеты с двухкомпонентными ячейками Millicell 96 в количестве 10000 кл/лунку и инкубировали в течение 21 дня при 37 °С и 5% С02. Целостность монослоя проверяли путем измерения электрического сопротивления (TEER) с помощью прибора Millicell-ERS, при значении TEER не менее 3 КОм/лунку начинали эксперимент. Для определения скорости транспорта доксорубицина из апикальной (А) в базолатеральную (В) область [А-В] добавляли по 90 мкл доксорубицина либо доксорубицина и ОЭП-ингибитора (0,087-870 мкг/мл) в 3 лунки с фильтрами и по 250 мкл буфера HBSS в акцепторные лунки нижней плашки. Для определения скорости транспорта из базолатеральной (В) области в апикальную (А) [В-А] добавляли по 90 мкл Буфера HBSS с 1% ДМСО в 3 лунки с фильтрами и по 250 мкл доксорубицина либо доксорубицина и ОЭП-ингибитора (0,087 - 870 мкг/мл) в нижние лунки плашки. Инкубировали собранную Millicell 96 СаСо-2 систему в течение 2 ч при 37 °С на шейкере с перемешиванием при 300 об/мин. Затем отбирали 70 мкл аликвоты из каждой части вставки и подвергали ВЭЖХ-МС анализу с использованием системы QTRAP 5500 (Applied Biosystems) с хроматографом Agilent Infinity 1290 (Agilent Technologies).
Результаты оценки влияния ОЭП-ингибитора на трансэпителиальный транспорт доксорубицина представлены на Фиг. 6 в виде скорости проницаемости доксорубицина через плазматическую мембрану клеток СаСо-2.
Как видно, клетки СаСо-2 экспортируют доксорубицин с базолатеральной на апикальную часть мембраны (В-А). ОЭП-ингибитор, воздействуя на P-gp, располагающийся на апикальной части мембраны, ингибирует обратный транспорт доксорубицина, увеличивая его содержание в направлении А-В: в концентрации 8,7 мкг/мл в 1,9 раз, в концентрации 87 мкг/мл в 3,5 раза и в концентрации 870 мкг/мл в 3,8 раза. Данные эксперимента представлены средним значением трех независимых опытов ± стандартное отклонение. Для статистической обработки использовался критерий Стьюдента для множественных сравнений с введением поправки Бонферрони, Р<0,05. В силу указанного представляется возможным сделать вывод о высокой эффективности АТФ-зависимого ингибитора обратных АВС-транспортеров.
Пример 13 Влияние ОЭП-ингибитора на экспрессию P-gp (АВСВ1)
ОЭП-ингибитор способен элиминировать активную гликозилированную изоформу 190 кДа АВСВ1, при этом наблюдается накопление в клетках неактивной высокоманнозной изоформы 175 кДа транспортера.
Клетки MCF-7, MCF-7-ABCCl-DsRed (с гиперэкспрессией MRP-1), MCF-7- ABCC2-BFP (с гиперэкспрессией MRP-2), MCF-7-ABCB 1 -GFP (с гиперэкспрессией P-gp) в концентрации 3x104 клеток/см2 культивировали в полной питательной среде DMEM с добавлением или доксорубицина до конечной концентрации 3 мкМ; или ОЭП-ингибитора до конечной концентрации 261 мкг/мл; или композиции доксорубицина- ОЭП-ингибитор до конечной концентрации 3 мкМ: 261 мкг/мл в течение 48 часов при 37 °С в атмосфере 5% С02. Для исследования белков методом иммуноблоттинга (Western Blot) применялся адаптированный и модифицированный протокол АВСАМ
(http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/wb-beginner.pdf). Моноклональные антитела к ABCB1 (Кат. jVs sc-13131, Santa Cruz) были использованы при разведении 1:200. В качестве вторичных использовали антимышиные антитела, конъюгированные с HRP - (Кат. jYs ab6728, Abeam) в разведении 1:10000. Моноклональные антитела к β-актину (Кат. Ne mAbcam 8226, Abeam) были использованы при разведении 1 :2000. Результаты проведенного анализа визуализировали на приборе ChemiDoc XRS+ system (Bio-Rad).
Результаты влияния ОЭП-ингибитора на экспрессию P-gp (АВСВ1) представлены на Фиг. 7.
Белок АВСВ1 представлен 2 изоформами, с молекулярным весом в 190 кДа и 175 кДа (Фиг. 7, верхний и нижние банды). При этом изоформа 190 кДа представляет собой гликозилированную активную форму белка, а 175 кДа банд представляет высокоманнозный неактивный белок [7]. Результаты свидетельствуют о том, что контрольные клетки MCF-7 содержат эквивалентное количество активного и неактивного белков. Воздействие с доксорубицином увеличивает количество активной формы белка, в то время как ОЭП-ингибитор практически полностью элиминирует активную форму АВСВ1. При этом наблюдается накопление в клетках неактивной формы транспортера. Клетки, подвергшиеся воздействию комбинированного препарата, экспрессируют как активную, так и высокоманнозную формы белка. Экспрессия неактивной формы доказывает, что ОЭП-ингибитор смог частично обратить доксорубицин-опосредованную активацию транспортеров. Аналогичную картину мы наблюдаем в клетках, гиперэкспрессирующих гены АВСС1 и АВСС2. В силу указанного возможно сделать вывод о том, что ОЭП-ингибитор способен подавлять активность АТФ-зависимых ингибиторов обратных АВС-транспортеров.
Пример 14. Влияние ОЭП-ингибитора на АТФ-азную активность мембран с гиперэкспрессией АВСВ1
АТФ-азную активность мембранного Р-гликопротеина исследовали с использованием коммерческого препарата изолированных мембран клеток насекомых Spodoptera frugiperda (линия Sf гиперэкспрессирующих человеческий рекомбинантный Р-гликопротеин, согласно методике [8]. Гидролиз АТФ в процессе каталитической активности Р-гликопротеина сопровождается образованием неорганического фосфата (Pi), детектируемого посредством спектрофотометрической реакции. Показано, что ОЭП- ингибитор ингибирует АТФ-азную активность с прямой концентрационной зависимостью - с увеличением концентрации ингибирующий эффект увеличивается.
Тестируемый ОЭП-ингибитор в концентрации 8,7-870 мкг/мл инкубировали с рекомбинантными мембранами, гиперэкспрессирующими Р-гликопротеин и субстратами в 1,5 мл микропробирках в трипликатах. Измеряли оптическую плотность продукта реакции при 880 нм, пропорциональную активности обратного транспортера, и АТФ- азной активности фермента. В качестве контролен применяли неспецифический ингибитор активности ферментов - фторид бериллия.
Полученные значения АТФ-азной активности Р-гликопротеина человека изолированных мембран клеток Sf9 в присутствие контрольных ингибиторов и исследуемых соединений представлены в виде гистограммы на Фиг. 8.
Установлено, что ОЭП-ингибитор значительно ингибирует АТФ-азную активность Р-гликопротеина. Ингибирующая активность ОЭП-ингибитора незначительно уменьшается с увеличением его концентрации с 8,7 до 87 мкг/мл, однако сильно увеличивается при концентрации 870 мкг/мл. В литературных источниках превалирует мнение, что амфифильные блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида ингибируют АТФ-азную активность Р-гликопротеина вследствие встраивания в липидную мембрану и изменения микровязкости липидного микроокружения транспортера [9]-[11]. Исследуемый ОЭП-ингибитор значимо не изменяет микровязкость клеточных мембран, следовательно, механизм его действия не исключает возможности прямого ингибирующего влияния на Р-гликопротеин. В силу указанного возможно сделать вывод о том, что ОЭП-ингибитор значимо подавляет активность АТФ-зависимого обратного АВС- транспортера P-gp.
Пример 15. Влияние ОЭП-ингибитора на уровень АТФ в клетках MCF-7, MCF-7/Vin
Клеточную суспензию (MCF-7 или MCF-7/Vin) плотностью 2x 106 клеток/мл инкубировали 2 часа при 25°С с ОЭП-носителем (конечные концентрации 87, 430 и 2175 мкг/мл) или доксорубицином (конечная концентрация 10 мкМ), или композицией доксорубицина с ОЭП-ингибитором в концентрациях 10 мкМ и 87 мкг/мл. Далее клетки осаждали центрифугированием (300g, 4 минуты) и промывали в буферном растворе, активирующем выработку АТФ в клетках. Состав буфера: NaCl (122 мМ), аНСОз (25 мМ), глюкоза (10 мМ), КС1 (3 мМ), MgS04 (1,2 мМ), К2НР04 (0,4 мМ), СаС12 (1,4 мМ) и HEPES (10 мМ). Полученный клеточный осадок лизировали в течение 5 минут в охлажденном лизирующем буфере при интенсивном перемешивании. Состав лизирующего буфера: Tris-HCL (0,05 М), EDTA (2 мМ), TritonXlOO (1%), NaF (10 мМ). Лизаты клеток немедленно замораживали и хранили до проведения анализа при -74 °С. Непосредственно перед анализом клеточные лизаты размораживали и центрифугировали от клеточного дебриса 7 минут при 20000g, супернатант отбирали для последующего анализа содержания АТФ. Содержание АТФ в клеточных лизатах определяли с помощью хемилюминесцентного метода в реакции с участием люциферазы, D-люциферина и АТФ с использованием высокочувствительного АТФ-реагента производства "Люмтек". Интенсивность хемилюминесценции в реакции окисления люциферина, пропорциональную концентрации АТФ в пробе, определяли с помощью планшетного ридера Infinite 200 PRO (TEC AN).
Результаты влияния ОЭП-ингибитора на уровень АТФ в клетках MCF-7, MCF- 7/Vin представлены на Фиг. 9.
Установлено, что ОЭП-ингибитора при 2-часовом воздействии даже в высокой концентрации не вызывает уменьшения содержания АТФ в клетках MCF-7 и MCF-7/Vin. Из литературы известно, что гидрофобные блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида вызывают уменьшение содержания АТФ в клетках млекопитающих в культуре в результате проникновения в цитоплазму и воздействия на функциональное состояние мембран митохондрий. В частности, показано, что плуроник Р85 изменяет микровязкость мембран митохондрий и разобщает окислительное фосфорилирование [12], [6]. Сопоставляя полученные данные с литературными, можно заключить, что исследуемый ОЭП-ингибитор вследствие особенностей структуры не проникает в цитозоль клеток и не воздействует на функции митохондрий. Совместное применение доксорубицина с ОЭП-ингибитором (ОЭП-ингибитор 87 мкг/мл + DOX 10 мкМ) также не оказало ингибирующего действия на биосинтез АТФ в клетках MCF-7 и MCF-7/Vin. В силу указанного возможно сделать вывод о том, что АТФ-зависимый ингибитор обратных ABC-транспортеров не влияет на процесс биосинтеза АТФ в опухолевых клетках.
Пример 16. Параметры токсичности ОЭП-ингибитора in vivo
Исследование острой токсичности ОЭП-ингибитора проводили на мышах линии CD-I (6-8 недель), крысах линии Sprague Dawley (6-8 недель) и кроликах породы Советская шиншилла (2-2,5 кг) обоего пола при внутривенном и внутрижелудочном способах введения.
Внутрижелудочное введение осуществляли животным, лишенным корма (на промежуток времени не менее 8 часов), со свободным доступом к воде. Объем введения рассчитывали индивидуально для каждого животного, основываясь на массе тела, зарегистрированной непосредственно перед введением вещества. Доступ к корму возобновляли через час после введения.
Параметры острой токсичности (ЛД5о) ОЭП-ингибитора при разных путях введения указаны в таблице 4. Таблица 4
ЛД50 ОЭП-ингибитора при разных путях введения
Figure imgf000022_0001
* per os - внутрижелудочное введение
в/в - внутривенное введение
Согласно полученным результатам, ОЭП-ингибитор при введении внутрижелудочно по степени токсичности относится к нетоксичным веществам, при внутривенном введении - к малотоксичным веществам. При этом известно, что наиболее активный Плуроник L-61, входящий в состав препарата SP1049C, находящегося на 3 стадии клинических исследований, обладает более высокой токсичностью [13]. Так, ЛД50 Плуроника L-61 при внутривенном способе введения мышам соответствует 800 мг/кг. В силу указанного возможно сделать вывод о том, что АТФ-зависимый ингибитор обратных ABC-транспортеров по классу токсичности может быть отнесен к классу малотоксичных и нетоксичных соединений, более безопасных в сравнении с Плуроником L-61.
Приведенные выше заявителем сведения позволяют сделать выводы о том, что заявленный ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток значительно увеличивает поглощение лекарственных средств живыми клетками и тканями. При этом ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток характеризуется высокой безопасностью и эффективностью.
Таким образом, в результате экспериментов достигнута поставленная цель - получен новый ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток. Техническим результатом заявленного технического решения является то, что в результате проведенных исследований получен ОЭП-ингибитор способом, включающим приготовление стартовой системы, оксипропилирование стартовой системы в присутствии щелочного катализатора, нейтрализацию полученного продукта, очистку с получением искомого ОЭП-ингибитора, характеризующимся тем, что соотношение сорбит : гидроокись щелочного или щелочноземельного металла : бифункциональное кислородсодержащее соединение в стартовой системе рассчитывается таким образом, чтобы в результате их реакции с окисью пропилена получалась эквимольная смесь полиоксипропиленгликоля и полиоксипропиленгексола.
Заявленный ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток:
- обладает низкой цитотоксичностью в отношении культур клеток человека по сравнению с большинством описанных в литературе ингибиторов АВС-транспортеров;
- не влияет на микровязкость цитоплазматических мембран опухолевых клеток линии MCF-7 и клеток MCF-7/RES с приобретенной лекарственной устойчивостью;
- не проникает через цитоплазматическую мембрану внутрь опухолевых клеток MCF-7;
- в диапазоне концентраций 8,7-870 мкг/мл вызывает специфическое ингибирование P-gp-опосредованного обратного транспорта доксорубицина, увеличивая его концентрации в акцепторных лунках в 1,9-3,8 раз соответственно;
- способен элиминировать активную гликозилированную изоформу 190 кДа АВСВ1, при этом наблюдается накопление в клетках неактивной высокоманнозной изоформы 175 кДа транспортера;
- ингибирует АТФ-азную активность изолированных мембран клеток Sf9 с гиперэкспрессией Р-гликопротеина человека;
- не изменяет внутриклеточный уровень АТФ;
- при введении внутрижелудочно по степени токсичности относится к нетоксичным веществам, при внутривенном введении - к малотоксичным веществам;
- характеризуется простотой получения, дешевизной исходного сырья, производство может быть осуществлено на существующих предприятиях химической отрасли промышленности.
- обеспечивает возможность выхода на международный рынок с продуктом, ранее не известньм в мире. В списке приведенной литературы представлены некоторые публикации, описывающие состояние области техники, к которой относится заявленное техническое решение.
При этом следует обратить внимание на то, что основываясь на заявленном техническом решении, представляется возможным проводить различного рода модификации и/или изменения, не выходя за объём патентных притязаний.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, по совокупности признаков, приведенных в независимом пункте формулы изобретения, т.к. указанная совокупность признаков не выявлена из исследованного заявителем уровня техники.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, т.к. полученный ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения обеспечивают возможность решения неразрешимых ранее проблем, а именно, при значительном увеличении терапевтической эффективности значительно повысить безопасность, а также при этом существенно снизить стоимость готовой лекарственной формы.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как может быть использовано в производстве на специализированных предприятиях, с использованием известных материалов, оборудования и технологий.
Список использованных источников
1 Choi Y.H., ABC transporters in multidrug resistance and pharmacokinetics, and strategies for drug development / Y.H. Choi, A.M. Yu //Curr. Pharm. Des. 20 (2014), P. 793- 807
2. Tiwari A.K. Revisiting the ABCs of multidrug resistance in cancer chemotherapy/ A.K. Tiwari, K. Sodani, C.L. Dai, C.R. Ashby Jr., Z.S. Chen // Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (201 1), P. 570-594
3. Chen Z., Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family in multidrug resistance: A review of the past decade./ Z. Chen, T. Shi, L. Zhang, P. Zhu, M. Deng, C. Huang, T. Hu et al. // Cancer Letters, 370 (2016), P.153-164
4. Кантор, Ч. Биофизическая химия. Том 2. Методы исследования структуры и функции биополимеров / Ч. Кантор, П. Шиммел, - Москва: МИР, 1985.
5. Batrakova, E.V. Mechanism of sensitization of MDR cancer cells by Pluronic block copolymers: Selective energy depletion / E.V. Batrakova, S. Li, W.F. Elmquist et al. // Br J Cancer. -2001. -V. 85, N. 12.-P. 1987-1997.
6. Kabanov A.V. An essential relationship between ATP depletion and chemosensitizing activity of Pluronic block copolymers / A.V. Kabanov, E.V. Batrakova, V.Y. Alakhov // J Control Release. 2003. - V. 91, N. 1-2. - P. 7583.
7. Gautherot, J. Effects of Cellular, Chemical, and Pharmacological Chaperones on the Rescue of a Trafficking-defective Mutant of the ATP-binding Cassette Transporter Proteins ABCB1/ABCB4 / J. Gautherot, A-M. Durand-Schneider, D. Delautier, J-L. Delaunay, A. Rada, J. Gabillet, C. Housset, M. Maurice, T. AiDt-Slimane // HEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. - 2012. - Vol. 287. - JV° 7. - P.5070-5078.
8. Takahashi, K. Purification and ATPase Activity of Human ABCA1 / K. Takahashi, Y. Kimura, N. Kioka, M. Matsuo, K. Ueda // The Journal of biological chemistry. - 2006. - Vol. 281, JVe l6. P. 10760-10768.
9. Batrakova, E.V. Effect of pluronic P85 on ATPase activity of drug efflux transporters / E.V. Batrakova, S. Li, Y. Li, V.Y. Alakhov, A.V. Kabanov // Pharm Res. - 2004. - V. 21, N. 12. - P. 2226-2233.
10. Regev, R Membrane fluidization by ether, other anesthetics, and certain agents abolishes P-glycoprotein ATPase activity and modulates efflux from multidrug-resistant cells / R. Regev, Y.G. Assaraf, G.D. Eytan // Eur J Biochem. - 1999. - Vol. 259. - P. 18-24
1 1. Womack, M.D. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes / M.D. Womack, D.A. Kendall, R.C. MacDonald // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. - 1983. - Vol. 733. -К» 2. - P. 210-215. 12. Batrakova, E.V. Mechanism of pluronic effect on P-glycoprotein efflux system in blood-brain barrier: contributions of energy depletion and membrane fluidization / E.V. Batrakova, S. Li, S.V. Vinogradov et al. // J Pharmacol Exp Ther. - 2001. - Vol. 299. -Jfe 2. - P. 483-493.
13. SP1049C [Электронный ресурс]. - 2016. - Режим доступа: http://www.supratek.com/pipeline/products

Claims

Формула изобретения
1. Ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток, относящийся к группе хиральных конъюгатов (оптически активных гибридных молекул) олигоэфирполиольной природы, представляющий собой смесь полиоксип опиленгексола формулы 4
Figure imgf000027_0001
где п=2-6, преимущественно п=4,
и полиоксипропиленгликоля формулы 5
Figure imgf000027_0002
s
где т=5-9, преимущественно т=7.
2. Способ получения ингибитора АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток по п. 1, заключающийся в приготовлении смеси сорбита ((2£,ЗЛ,4/?,5./?)-гексан- 1,2,3, 4,5, 6-гексола) и бифункционального кислородсодержащего соединения H-R-H, где R=-0-; [- ОСН2СН(СНз)]к-0-, а к=1-7, с дальнейшим взаимодействием этой смеси с окисью пропилена в присутствии гидроокиси щелочного или щелочноземельного металла, дальнейшей нейтрализацией полученного продукта кислотой, последующей очисткой полученного продукта, с получением целевого ингибитора АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток по п. 1, при этом образующийся ингибитор по п. 1 имеет гидроксильное число 21 -240 мг КОН/г, соединение 4 имеет молекулярную массу 1000- 1500 Да, соединение 5 имеет молекулярную массу от 300 до 500 Да, а мольное соотношение соединений 4 и 5 составляет 0,9-1,1.
3. Ингибитор по п. 1, характеризующийся тем, что соединение 4 имеет предпочтительную молекулярную массу 1200 Да, а соединение 5 имеет предпочтительную молекулярную массу 400 Да.
4. Ингибитор по п. 1, характеризующийся тем, что предпочтительное мольное соотношение соединений 4 и 5 составляет 1 :1.
PCT/RU2017/000809 2016-11-02 2017-10-31 Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения WO2018084749A1 (ru)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019545237A JP6861424B2 (ja) 2016-11-02 2017-10-31 細胞のａｔｐ依存性逆輸送体の阻害剤およびそれを得る方法
EA201900246A EA034579B1 (ru) 2016-11-02 2017-10-31 Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения
CN201780067634.0A CN109890375B (zh) 2016-11-02 2017-10-31 细胞的atp-依赖性反向转运蛋白抑制剂及其生产方法
EP17867579.9A EP3536315B1 (en) 2016-11-02 2017-10-31 Inhibitor of atp-dependent reverse transporters of cells and method for producing same
US16/399,472 US10987429B2 (en) 2016-11-02 2019-04-30 Inhibitor of ATP-dependent cellular reverse transporters and method for producing same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016143074A RU2641304C1 (ru) 2016-11-02 2016-11-02 Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения
RU2016143074 2016-11-02

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/399,472 Continuation US10987429B2 (en) 2016-11-02 2019-04-30 Inhibitor of ATP-dependent cellular reverse transporters and method for producing same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018084749A1 true WO2018084749A1 (ru) 2018-05-11

Family

ID=62075563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/000809 WO2018084749A1 (ru) 2016-11-02 2017-10-31 Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10987429B2 (ru)
EP (1) EP3536315B1 (ru)
JP (1) JP6861424B2 (ru)
CN (1) CN109890375B (ru)
EA (1) EA034579B1 (ru)
RU (1) RU2641304C1 (ru)
WO (1) WO2018084749A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2680834C1 (ru) * 2018-05-23 2019-02-28 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) Противоопухолевая композиция доксорубицина с ингибитором АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток
IL302230A (en) * 2020-10-19 2023-06-01 Oxiteno S A Ind?Stria E Com?Rcio Agrochemical preparations and their use for improved absorption of water and fertilizers and for pest control

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003027054A1 (en) * 2001-09-24 2003-04-03 Perstorp Specialty Chemicals Ab Process for alkoxylation of di, tri and polyalcohols

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101497559A (zh) * 2008-12-30 2009-08-05 浙江皇马科技股份有限公司 山梨醇和甘油混合醇聚氧丙烯醚的制备方法
RO127401B1 (ro) * 2010-10-06 2013-04-30 Oltchim S.A. Procedeu de obţinere a polieter poliolilor pe bază de sorbită
CN101974149B (zh) * 2010-10-21 2012-07-25 句容宁武新材料发展有限公司 一种聚醚多元醇的制备方法
CN102585201B (zh) * 2011-12-30 2014-04-02 高春青 一种用餐厨废弃物制备硬泡聚氨酯用多元醇的方法
RU2501570C1 (ru) * 2012-05-11 2013-12-20 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУВПО КФУ) Трехфункциональные блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида для доставки активных веществ в живые клетки
RU127401U1 (ru) * 2012-10-16 2013-04-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кузбасский государственный технический университет имени Т.Ф. Горбачева" (КузГТУ) Проходческий комбайн
MX337785B (es) * 2013-02-22 2016-03-18 Bayer Materialscience Ag Procedimiento de preparacion de polioles de polieter.
US10295528B2 (en) * 2014-04-08 2019-05-21 Kyoto University Method of screening ATP11C or CDC50A inhibitor
CN104610060A (zh) * 2015-02-05 2015-05-13 南京工业大学 一种高羟值植物油多元醇及其制备方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003027054A1 (en) * 2001-09-24 2003-04-03 Perstorp Specialty Chemicals Ab Process for alkoxylation of di, tri and polyalcohols

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IKSANOVA A.G.: "Novaia sistema dostavki biologicheski aktivnykh veshchestv na osnove oligoefirpoliola. 03.01.04-Biokhimiia. Avtoreferat. Dissertatsiia na soiskanie uchenoi stepeni kandidata biologicheskikh nauk. Federalnoe gosudarstvennoe avtonomnoe obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego professionalnogo obrazovaniia", KAZAN, 2012, XP009518403 *
SOLODOV V.A .: "Poliefiry mnogoatomnykh spirtov i razrabotka deemulgiruiushchikh sostavov na ikh osnove. 02.00.13-Neftekhimiia. Avtoreferat.Dissertatsiia na soiskanie uchenoi stepeni kandidata tekhnicheskikh nauk. Kazanskii gosudarstvennyi tekhnologicheskii universitet", KAZAN, 2007, XP9515303 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6861424B2 (ja) 2021-04-21
CN109890375B (zh) 2022-03-22
US20190255184A1 (en) 2019-08-22
EA034579B1 (ru) 2020-02-21
JP2020503370A (ja) 2020-01-30
RU2641304C1 (ru) 2018-01-17
EA201900246A1 (ru) 2019-07-31
CN109890375A (zh) 2019-06-14
EP3536315A4 (en) 2019-11-20
EP3536315B1 (en) 2021-03-31
EP3536315A1 (en) 2019-09-11
US10987429B2 (en) 2021-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mustafa et al. Conjugation of sinapic acid analogues with 5-Fluorouracil: Synthesis, preliminary cytotoxicity, and release study
Lu et al. Targeted delivery of doxorubicin by folic acid-decorated dual functional nanocarrier
Marinelli et al. Carvacrol prodrugs as novel antimicrobial agents
Zimmermann et al. N-substituted prodrugs of mebendazole provide improved aqueous solubility and oral bioavailability in mice and dogs
JP5363983B2 (ja) エーテル結合およびカルバメート結合を介する四置換ｎｄｇａ誘導体ならびにそれらの合成および薬学的使用
US10987429B2 (en) Inhibitor of ATP-dependent cellular reverse transporters and method for producing same
MX2007014843A (es) Induccion apoptotica selectiva en celulas cancerigenas que incluyen activacion apoptotica de procaspasa-3.
Fraix et al. Cationic lipophosphoramidates with two disulfide motifs: synthesis, behaviour in reductive media and gene transfection activity
WO2013127361A1 (en) Alkyne-, azide- and triazole-containing flavonoids as modulators for multidrug resistance in cancers
Abu-Fayyad et al. Synthesis, characterization, and in-vitro antitumor activity of the polyethylene glycol (350 and 1000) succinate derivatives of the tocopherol and tocotrienol isomers of Vitamin E
Gu et al. Synthesis and biological evaluation of novel bifendate derivatives bearing 6, 7-dihydro-dibenzo [c, e] azepine scaffold as potent P-glycoprotein inhibitors
EP3350182A1 (en) Novel piperazine and piperidine derivatives, their synthesis and use thereof in inhibiting vdac oligomerization, apoptosis and mitochondria dysfunction
Dei et al. Design and synthesis of new potent N, N-bis (arylalkyl) piperazine derivatives as multidrug resistance (MDR) reversing agents
US20160152644A1 (en) Methods for the preparation of hiv attachment inhibitor piperazine prodrug compound
Mundra et al. Formulation and characterization of polyester/polycarbonate nanoparticles for delivery of a novel microtubule destabilizing agent
Hirsch et al. Bioconjugates to specifically render inhibitors water-soluble
Abu-Fayyad et al. Synthesis, physiochemical characterization, and in vitro antitumor activity of the amide and pH cleavable hydrazone conjugates of γ-tocotrienol isomer of vitamin E with methoxy-poly (ethylene) glycol
US10322187B2 (en) Reduced toxicity molecular conjugates of anti-fungal agents
US20240033360A1 (en) Cisplatin analogue with potent anti-cancer effects and synthesis thereof
Chary et al. Enhancing breast cancer treatment: Comprehensive study of gefitinib-loaded poloxamer 407/TPGS mixed micelles through design, development, in-silico modelling, In-Vitro testing, and Ex-Vivo characterization
Wang et al. Synthesis of pochoxime prodrugs as potent HSP90 inhibitors
EP3046542B1 (en) Synergistic liposomal formulation for the treatment of cancer
Pont et al. Development of potent tripodal G-quadruplex DNA binders and their efficient delivery to cancer cells by aptamer functionalised liposomes
Scherz et al. Design, synthesis and cytotoxic activity of water-soluble quinones with dibromo-p-benzoquinone cores and amino oligo (ethylene glycol) side chains against MCF-7 breast cancer cells
RU2501570C1 (ru) Трехфункциональные блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида для доставки активных веществ в живые клетки

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17867579

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019545237

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017867579

Country of ref document: EP

Effective date: 20190603