WO2018070478A1 - 糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法 - Google Patents

糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法 Download PDF

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glycol
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一利 小高
和敏 関口
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日産化学工業株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a saccharification reaction solution, a saccharifying enzyme composition, a method for producing sugar, and a method for producing ethanol.
  • Such a method includes a hydrothermal treatment step of treating a raw material with pressurized hot water, a mechanical pulverization treatment step of mechanically pulverizing the hydrothermal treated product, and a saccharification treatment step of saccharifying the mechanically pulverized product with an enzyme. including.
  • a method has a problem that the reaction rate when saccharifying with an enzyme is slow, and the concentration of the resulting saccharified solution is not sufficient.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a saccharification reaction solution, a saccharification enzyme composition, a saccharide production method, and an ethanol production method capable of improving the saccharification reaction efficiency by an enzyme in a simple process.
  • the purpose is to provide.
  • a first aspect of the present invention that achieves the above object is a saccharification reaction solution for saccharifying at least one of cellulose and hemicellulose, wherein at least one of the cellulose and hemicellulose, a saccharifying enzyme, silica, or a silica-containing substance, At least one compound selected from the group consisting of a polyhydric alcohol compound represented by the following general formula (1) and a derivative thereof, and an acetylene glycol represented by the following general formula (2) and an alkylene oxide adduct thereof ( A) and a saccharification reaction liquid characterized by containing.
  • a polyhydric alcohol compound represented by the following general formula (1) and a derivative thereof and an acetylene glycol represented by the following general formula (2) and an alkylene oxide adduct thereof ( A) and a saccharification reaction liquid characterized by containing.
  • R 1 in General Formula (1) represents a linear alkyl group having 1 to 9 carbon atoms
  • R 2 and R 3 each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, an acyl group, an acetyl group, an amide group, an amino group, Group, allyl group, aryl group, aldehyde group, linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, carbon number 1 Represents an alkoxy group of 6 or less, carbamoyl group, carboxyl group, cyano group, sulfo group, sulfonyl group, tosyl group, nitro group, hydroxyl group, phenyl group, benzyl group, phosphoryl group or mercapto group, It may have a substituent.
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, an acyl group, an acetyl group, an amide group, an allyl group, an aryl group, an aldehyde group, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and 1 or more carbon atoms.
  • the repeating unit n satisfies 1 or more and 500 or less. ]
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 in General Formula (2) are each independently a saturated or unsaturated linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms in the main chain. Or an alkenyl group, wherein the alkyl group or alkenyl group may further have a substituent.
  • a 1 and A 2 are each independently a linear or branched alkylene oxide group having 2 to 4 carbon atoms in the main chain (provided that the oxygen atom at one end of the alkylene oxide group is bonded to a hydrogen atom, The carbon atom at one end is bonded to an oxygen atom), and the added mole numbers m and n of the alkylene oxide unit satisfy 0 to 50 in total. ]
  • the second aspect of the present invention that achieves the above object is the saccharification reaction solution according to the first aspect, wherein the silica-containing substance is diatomaceous earth or silica sand.
  • the mass ratio of the silica or the compound (A) in the silica or the silica-containing material (compound (A) / silica) is 0.0001 or more, 1 It exists in the saccharification reaction liquid of the 1st or 2nd aspect characterized by being the following. *
  • the polyhydric alcohol compound is selected from the group consisting of dihydric alcohols, trihydric alcohols and tetrahydric alcohol monomers, dimers, trigomers and oligomers, and polyalkylene glycols.
  • the saccharification reaction solution according to any one of the first to third aspects is characterized by containing at least one selected from the group consisting of *
  • the fifth aspect of the present invention for achieving the above object is characterized in that the derivative of the polyhydric alcohol compound contains at least one selected from the group consisting of polyhydric alcohol ethers and polyalkylene glycol ethers.
  • the saccharification reaction solution according to any one of the first to fourth aspects.
  • a seventh aspect of the present invention that achieves the above object is a saccharifying enzyme composition that saccharifies at least one of cellulose and hemicellulose, and is represented by saccharifying enzyme, silica or silica-containing substance, and the following general formula (1): Containing at least one compound (A) selected from the group consisting of an acetylene glycol represented by the following general formula (2) and an alkylene oxide adduct thereof:
  • the saccharifying enzyme composition is characterized in that a mass ratio (compound (A) / silica) of silica and the compound (A) in the silica-containing substance is 0.0001 or more and 1 or less.
  • R 1 in General Formula (1) represents a linear alkyl group having 1 to 9 carbon atoms
  • R 2 and R 3 each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, an acyl group, an acetyl group, an amide group, an amino group, Group, allyl group, aryl group, aldehyde group, linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, carbon number 1 Represents an alkoxy group of 6 or less, carbamoyl group, carboxyl group, cyano group, sulfo group, sulfonyl group, tosyl group, nitro group, hydroxyl group, phenyl group, benzyl group, phosphoryl group or mercapto group, It may have a substituent.
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, an acyl group, an acetyl group, an amide group, an allyl group, an aryl group, an aldehyde group, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and 1 or more carbon atoms.
  • the repeating unit n satisfies 1 or more and 500 or less. ]
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 in General Formula (2) are each independently a saturated or unsaturated linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms in the main chain. Or an alkenyl group, wherein the alkyl group or alkenyl group may further have a substituent.
  • a 1 and A 2 are each independently a linear or branched alkylene oxide group having 2 to 4 carbon atoms in the main chain (provided that the oxygen atom at one end of the alkylene oxide group is bonded to a hydrogen atom, The carbon atom at one end is bonded to an oxygen atom), and the added mole numbers m and n of the alkylene oxide unit satisfy 0 to 50 in total. ]
  • the eighth aspect of the present invention that achieves the above object is the saccharifying enzyme composition according to the seventh aspect, wherein the silica-containing substance is diatomaceous earth or silica sand.
  • the polyhydric alcohol compound is selected from the group consisting of dihydric alcohols, trihydric alcohols and tetrahydric alcohol monomers, dimers, trigomers and oligomers, and polyalkylene glycols.
  • the saccharifying enzyme composition according to the seventh or eighth aspect is characterized by containing at least one selected from the group consisting of
  • a tenth aspect of the present invention that achieves the above object is characterized in that the derivative of the polyhydric alcohol compound contains at least one selected from the group consisting of polyhydric alcohol ethers and polyalkylene glycol ethers.
  • the saccharifying enzyme composition according to any one of the seventh to ninth aspects.
  • a twelfth aspect of the present invention that achieves the above object is a method for producing a saccharide by using a saccharification reaction solution for saccharifying at least one of cellulose and hemicellulose, wherein the saccharide is produced by at least one of the cellulose and the hemicellulose.
  • a sugar production method is characterized in that a sugar is produced using a saccharification reaction solution containing at least one compound (A) selected from the group consisting of: *
  • R 1 in General Formula (1) represents a linear alkyl group having 1 to 9 carbon atoms
  • R 2 and R 3 each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, an acyl group, an acetyl group, an amide group, an amino group, Group, allyl group, aryl group, aldehyde group, linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, carbon number 1 Represents an alkoxy group of 6 or less, carbamoyl group, carboxyl group, cyano group, sulfo group, sulfonyl group, tosyl group, nitro group, hydroxyl group, phenyl group, benzyl group, phosphoryl group or mercapto group, It may have a substituent.
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, an acyl group, an acetyl group, an amide group, an allyl group, an aryl group, an aldehyde group, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and 1 or more carbon atoms.
  • the repeating unit n satisfies 1 or more and 500 or less. ]
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 in General Formula (2) are each independently a saturated or unsaturated linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms in the main chain. Or an alkenyl group, wherein the alkyl group or alkenyl group may further have a substituent.
  • a 1 and A 2 are each independently a linear or branched alkylene oxide group having 2 to 4 carbon atoms in the main chain (provided that the oxygen atom at one end of the alkylene oxide group is bonded to a hydrogen atom, The carbon atom at one end is bonded to an oxygen atom), and the added mole numbers m and n of the alkylene oxide unit satisfy 0 to 50 in total. ]
  • the thirteenth aspect of the present invention that achieves the above object is the sugar production method according to the twelfth aspect, wherein the silica-containing substance is diatomaceous earth or silica sand.
  • the mass ratio of the silica or the compound (A) in the silica or the silica-containing substance (compound (A) / silica) is 0.0001 or more, 1
  • the sugar production method according to the twelfth or thirteenth aspect is characterized by the following. *
  • the polyhydric alcohol compound is selected from the group consisting of dihydric alcohols, trihydric alcohols and tetrahydric alcohol monomers, dimers, trigomers and oligomers, and polyalkylene glycols.
  • the method for producing a saccharide according to any one of the twelfth to fourteenth aspects is characterized by containing at least one selected from the group consisting of: *
  • the sixteenth aspect of the present invention for achieving the above object is characterized in that the derivative of the polyhydric alcohol compound contains at least one selected from the group consisting of polyhydric alcohol ethers and polyalkylene glycol ethers.
  • the method for producing a sugar according to any one of the twelfth to fifteenth aspects.
  • ethanol fermentation using a fermentation microorganism is performed using the sugar obtained by the production method according to any one of the twelfth aspect to the seventeenth aspect.
  • the method for producing ethanol is performed using the sugar obtained by the production method according to any one of the twelfth aspect to the seventeenth aspect.
  • the nineteenth aspect of the present invention that achieves the above object is the production of ethanol according to the eighteenth aspect, wherein a fermentation microorganism is added to the step of producing sugar, and the production of sugar and ethanol fermentation are simultaneously performed. Is in the way. *
  • the twentieth aspect of the present invention that achieves the above object is the method for producing ethanol according to the eighteenth aspect or the nineteenth aspect, wherein the fermenting microorganism is yeast, mold, or bacteria.
  • the fermenting microorganism may be one of the genus Saccharomyces, the genus Zymomonas, the genus Pichia, the genus Candida, the genus Zymobacter,
  • the ethanol production method according to the twentieth aspect which is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium, the genus Kluyveromyces, or the genus Escherichia.
  • the ethanol fermentation according to any one of the eighteenth to twenty-first aspects is performed, wherein ethanol fermentation is performed at 15 ° C. or higher and 35 ° C. or lower. Is in the way.
  • a saccharification reaction solution a saccharification enzyme composition, a saccharide production method and an ethanol production method capable of improving the saccharification reaction efficiency by an enzyme in a simple process.
  • 6 is a graph showing measurement results of the effect of improving the saccharification reaction efficiency by adding tripropylene glycol in Examples 3, 7, and 8 and Comparative Examples 1 to 3, 6, and 10 to 14.
  • 6 is a graph showing measurement results of the effect of improving the efficiency of saccharification reaction by the tripropylene glycol concentration in Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1, 4 to 9, and 12.
  • 6 is a graph showing the measurement results of the effect of improving the saccharification reaction efficiency by the addition of the polyhydric alcohol compounds of Examples 9 to 20 and Comparative Examples 1 and 12, derivatives of polyhydric alcohol compounds, or alkylene oxide adducts of acetylene glycol.
  • 6 is a graph showing the measurement results of the effect of improving the saccharification reaction efficiency by the addition of PPG1000 in Example 21 and Comparative Examples 15-17.
  • 6 is a graph showing the measurement results of the effect of improving the efficiency of saccharification reaction by adding PPG1000 in Examples 22 to 28 and Comparative Examples 18 to 26. Improvement effect of saccharification reaction efficiency by addition of ethylene oxide adduct of PPG1000 or 2,4,7,9-tetramethyl-5-decyne-4,7-diol of Examples 29, 30 and Comparative Examples 1,27-29 It is the graph which showed the measurement result.
  • 6 is a graph showing measurement results of the effect of improving ethanol fermentation efficiency by PPG1000 in Example 31 and Comparative Examples 30 to 32.
  • At least one of cellulose and hemicellulose is used as a raw material for producing a sugar such as glucose.
  • Such cellulose or hemicellulose is contained, for example, in cellulosic biomass such as agricultural, forestry and fishery resources such as broad-leaved trees and conifers, or waste of the agricultural, forestry and fishery resources. More specifically, raw materials such as bagasse, rice straw, corn stover, oil palm empty fruit bunch, wood fiber, wood chip, veneer scrap, wood flour, pulp, waste paper, cotton, sea squirt, acetic acid bacteria, etc. . These raw materials are not particularly limited as long as they are derived from cellulosic biomass, and one kind may be used alone or two or more kinds may be mixed and used. *
  • cellulose or hemicellulose contained in eucalyptus wood flour (broadleaf tree), cedar wood flour (coniferous tree), bagasse, rice straw, corn stover, oil palm empty fruit bunch, cotton and the like is preferable. In these cases, the reason is not clear, but it is easy to defibrate and sugar can be obtained in a relatively high yield. *
  • cellulose refers to a polymer in which glucose is polymerized by ⁇ -1,4 glucoside bonds.
  • Hemicellulose is a polymer obtained by polymerizing glucose, xylose, mannose, galactose and the like by a glucoside bond, and refers to a water-insoluble polysaccharide other than cellulose.
  • cellulose may contain cellooligosaccharides, cellobiose and the like, which are partially decomposed products, and may be crystalline or non-crystalline. Further, it may be a carboxymethylated, aldehyded or esterified derivative.
  • cellulose or hemicellulose is not particularly limited as long as it is derived from biomass, and may be derived from plants, fungi, bacteria, or the like. *
  • Such cellulase means an enzyme that decomposes cellulose or hemicellulose into a sugar such as glucose.
  • the microorganism that produces such a saccharifying enzyme is not particularly limited.
  • Genus, irpex, phanerochaet, penicillium, schizophyllum, sporotrichum, tramet derma tramet examples include bacteria.
  • bacteria such as Clostridium, Pseudomonas, Cellulomonas, Ruminococcus, Bacillus, and the like;
  • Sulfolobus Examples include actinomycetes such as bacteria, Streptomyces, Thermoactinomyces, Thermomonospora, and the like.
  • These saccharifying enzymes may be artificially modified.
  • these saccharifying enzymes may be used individually by 1 type, or may mix and use 2 or more types. *
  • saccharifying enzymes derived from the genus Aspergillus and saccharifying enzymes derived from the genus Trichoderma are particularly preferable. This is because these saccharifying enzymes are highly active against crystalline cellulose.
  • the cellulase may be a series of enzymes.
  • Such enzyme groups include endoglucanase (EC 3.2.1.74), cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), ⁇ -glucosidase (EC 23.2.4.1, EC 3.2). 1.21) and the like.
  • the cellulases described above are generally those having optimal enzyme activity in the range of pH 3 to pH 6, but are called alkaline cellulases having optimal enzyme activity in the range of pH 6 to pH 10. May be.
  • many of the above cellulases have optimal enzyme activity in the reaction temperature range of 25 ° C. or higher and 50 ° C. or lower, but have optimal enzyme activity in the range of 70 ° C. or higher and 100 ° C. or lower. What is called thermostable cellulase may be used. *
  • silica, diatomaceous earth, or silica sand can be used as the silica or silica-containing substance.
  • Silica-containing materials, diatomaceous earth and silica sand are natural products mainly composed of silica.
  • Silica is a general term for compounds containing at least silicon dioxide, and generally a silanol group is present on a part of the surface.
  • This silica may be spherical or non-spherical in particle shape, the particle structure may be solid or porous, the crystallinity may be amorphous or crystalline, and any state of powder, suspension or dispersion May be used.
  • a part of the silica surface may be modified with another functional group other than the silanol group.
  • a silica layer may be present by reacting the surface of a compound other than silica with a silane coupling agent, silicon alkoxide, or silicate ions.
  • a silane coupling agent silicon alkoxide
  • silicate ions silicon alkoxide
  • application of colloidal silica, diatomaceous earth, and silica sand is particularly preferable.
  • colloidal silica has an average primary particle size of 1 nm or more and 400 nm or less, preferably 5 nm or more and 350 nm or less, and is used by being present in a saccharification reaction solution.
  • Colloidal silica is used as a dispersion liquid dispersed in a dispersion medium such as water, methanol, ethanol, acetone, methyl ethyl ketone, and ethylene glycol.
  • the dispersion liquid is called a colloidal liquid, a sol, or the like.
  • a dispersion medium may be selected as long as the enzyme activity is not inhibited, but application of a dispersion medium such as water or ethanol is preferred.
  • colloidal silica As a method for producing colloidal silica, there are a water glass method using water glass as a raw material, an alkoxide method using metal alkoxide as a raw material, and a gas phase method using silicon chloride compound as a raw material. Although colloidal silica obtained by any manufacturing method may be used, application of colloidal silica obtained by the water glass method is preferred. *
  • R 1 represents a linear alkyl group having 1 to 9 carbon atoms
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, an acyl group, an acetyl group, an amide.
  • Group amino group, allyl group, aryl group, aldehyde group, linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, Represents an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, carbamoyl group, carboxyl group, cyano group, sulfo group, sulfonyl group, tosyl group, nitro group, hydroxyl group, phenyl group, benzyl group, phosphoryl group or mercapto group, The group may further have a substituent.
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, an acyl group, an acetyl group, an amide group, an allyl group, an aryl group, an aldehyde group, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and 1 or more carbon atoms.
  • the repeating unit n satisfies 1 or more and 500 or less.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group for R 1 is preferably 1 or more and 6 or less, more preferably 1 or more and 4 or less.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group, alkylene group, alkenyl group and alkoxy group of R 2 and R 3 is preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group, alkylene group, and alkenyl group of R 4 and R 5 is preferably 1 or more and 4 or less, and more preferably 1 or more and 3 or less.
  • the repeating unit n is preferably 1 or more and 300 or less, more preferably 1 or more and 100 or less.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 in the following general formula (2) of the present invention are each independently a saturated or unsaturated linear or branched chain having 1 to 10 carbon atoms in the main chain.
  • the alkyl group or alkenyl group in the formula (1) may have a substituent.
  • a 1 and A 2 are each independently a linear or branched alkylene oxide group having 2 to 4 carbon atoms in the main chain (provided that the oxygen atom at one end of the alkylene oxide group is bonded to a hydrogen atom, The carbon atom at one end is bonded to an oxygen atom), and the added mole numbers m and n of the alkylene oxide unit satisfy 0 to 50 in total.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group or alkenyl group of R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 is preferably 1 or more and 8 or less, and more preferably 1 or more and 6 or less.
  • the number of carbon atoms of the alkylene oxide groups of A 1 and A 2 is 2 or 3 preferred.
  • the added moles m and n of the alkylene oxide unit are preferably 0 or more and 40 or less in total, and more preferably 10 or more and 30 or less.
  • ethylene glycol other name; 1,2-ethanediol
  • diethylene glycol triethylene glycol
  • tetraethylene glycol propylene Glycol (also known as 1,2-propanediol), dipropylene glycol, tripropylene glycol
  • trimethylene glycol also known as 1,3-propanediol
  • 1,2-butanediol 1,3-butanediol
  • 1, 4-butanediol 2,3-butanediol
  • 1,2-pentanediol 1,5-pentanediol
  • 2,4-pentanediol hexylene glycol (also known as 2-methylpentane-2,4-diol) 1,2-hexanediol, 1,6-hexanediol 1,2-heptanediol, 1,7-heptaned
  • Trivalent alcohol Trivalent alcohol
  • pentaerythritol also known as 2,2-bis (hydroxymethyl) -1,3-propanediol
  • ditrimethylolpropane also known as 2,2′-oxybis (methylene) bis (2-ethyl-1,3) -Propanediol)
  • L-threitol also known as L-1,2,3,4-butanetetraol
  • polyethylene glycol linear or branched polypropylene glycol, polybutylene glycol
  • Polytetramethylene ether glycol polyoxyethylene polyoxypropylene glycol
  • polyalkylene glycols such as polyoxyethylene polyoxypropylene polyoxyethylene glycol random copolymers, alternating copolymers and block copolymers
  • polyoxyethylene glyceryl ether polyoxypropylene glyceryl ether
  • polyoxyethylene polyoxy Propylene glyceryl ether polyoxyethylene polyoxypropylene trimethylo
  • the monomer of the above-mentioned polyhydric alcohol, a dimer, a trigomer, etc. may be sufficient.
  • ethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, tripropylene glycol, 1,3-butanediol, glycerol, pentaerythritol, polyethylene glycol, and polypropylene glycol are preferable.
  • the derivative of the polyhydric alcohol compound represented by the general formula (1) is not particularly limited.
  • the acetylene glycol compound represented by the general formula (2) is not particularly limited, and examples thereof include 2-butyne-1,4-diol, 2,5-dimethyl-3-hexyne-2,5-diol, 3, 6-dimethyl-4-octyne-3,6-diol, 2,3,6,7-tetramethyl-4-octyne-3,6-diol, 4,7-dimethyl-5-decyne-4,7-diol 2,4,7,9-tetramethyl-5-decyne-4,7-diol, 2,5,8,11-tetramethyl-6-dodecyne-5,8-diol, and the like. *
  • the alkylene oxide adduct of the acetylene glycol compound of the general formula (2) is not particularly limited.
  • acetylene glycol compound and its alkylene oxide adduct Commercially available products of the acetylene glycol compound and its alkylene oxide adduct include, for example, Surfynol series, Olphine series manufactured by Nissin Chemical Industry Co., Ltd., and acetylenol series manufactured by Kawaken Fine Chemical Co., Ltd. *
  • the compounds (A) represented by the general formulas (1) and (2) may be used alone or in combination with a plurality of compounds. *
  • the saccharification reaction solution of the present invention is a saccharification enzyme composition, a saccharification enzyme, silica or a silica-containing substance, and a polyhydric alcohol compound represented by the general formula (1) and a derivative thereof, using at least one of cellulose and hemicellulose as a raw material. And at least one compound (A) selected from the group consisting of an acetylene glycol represented by the general formula (2) and an alkylene oxide adduct thereof.
  • silica or a silica-containing substance and the compound (A) in the saccharification reaction solution from the viewpoint of enjoying the effect of improving the saccharification reaction efficiency (also simply referred to as reaction efficiency). *
  • the concentration of silica in the silica or the silica-containing substance is 0.001% by mass or more and 40% by mass or less, preferably 0.005% by mass or more and 10% by mass or less. If the concentration of silica or silica in the silica-containing material is lower than this range, the reaction efficiency is unfavorably lowered. On the other hand, if it is higher than this range, not only the dispersibility is deteriorated, but also economically unsuitable. *
  • the mass ratio of saccharification enzyme to silica or silica in the silica-containing substance is 0.0002 or more and 300 or less, preferably 0.002 or more and 30 or less. . When the mass ratio of both is out of this range, the improvement in reaction efficiency is not significant.
  • the concentration of the compound (A) is 0.00001% by mass or more and 10% by mass or less, preferably 0.0001% by mass or more and 1% by mass or less.
  • concentration of the compound (A) is lower than this range, the reaction efficiency is lowered, which is not preferable.
  • concentration is higher than this range, not only the dispersibility is deteriorated but also economically unsuitable.
  • the mass ratio of the silica and the compound (A) in the silica or the silica-containing substance (compound (A) / silica) is 0.0001 or more and 1 or less, preferably 0.001 or more. 0.1 or less. When the mass ratio of both is out of this range, the improvement in reaction efficiency is not significant.
  • the pH of the saccharification reaction solution is 3 or more and 11 or less, preferably 3 or more and 6 or less.
  • silica or silica-containing material is aggregated and the reaction efficiency of the saccharifying enzyme is lowered.
  • the pH is higher than 11, silica or the silica-containing material is easily dissolved.
  • pH adjuster of a saccharification reaction solution mineral acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid and nitric acid; carboxylic acids such as acetic acid and oxalic acid; hydroxy acids such as citric acid, tartaric acid and malic acid; hydroxide salts such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; Ammonia, urea, etc. are mentioned. If it is a range which does not inhibit the effect of this invention, there will be no use restriction in particular in the kind and density
  • the reaction temperature is preferably 5 ° C. or higher and 100 ° C. or lower, preferably 20 ° C. or higher and 55 ° C. or lower. It is preferable to set the reaction temperature according to the optimum temperature of the saccharifying enzyme. In general, if the reaction temperature is lower than 5 ° C, the efficiency of the saccharification reaction is remarkably reduced, and if it is higher than 100 ° C, the saccharifying enzyme may be inactivated, such being undesirable. *
  • the raw material for saccharification reaction may be obtained by chemically destroying the structure of lignin, cellulose and hemicellulose by physical pulverization with a cutter mill or the like, and acid or alkali treatment.
  • silica or silica-containing substance and compound (A) may be added to the reaction solution in which the saccharifying enzyme is dispersed, and the silica or silica-containing substance and compound (A) are dispersed.
  • a saccharifying enzyme may be added to the reaction solution.
  • Silica or silica-containing substance and compound (A) may be added simultaneously or separately, and the order of addition is not limited as long as the saccharification reaction efficiency does not decrease.
  • the compound (A) may be added in a powder state or in a solution state.
  • other additives such as a pH adjuster, can be added in arbitrary orders. *
  • the saccharification reaction solution of the present invention is a saccharifying enzyme composition, saccharifying enzyme, silica, and a polyhydric alcohol compound represented by the general formula (1), using at least one of cellulose and hemicellulose as a raw material. It can be obtained by containing the derivative and at least one compound (A) selected from the group consisting of acetylene glycol represented by the general formula (2) and an alkylene oxide adduct thereof.
  • the mechanism is not clear in this saccharification reaction solution, saccharification of cellulose or hemicellulose can be further promoted by using silica or a silica-containing substance and compound (A) in combination.
  • the saccharification reaction solution of the present invention is excellent in cost because the amount of saccharifying enzyme used can be reduced by the combined use of silica or a silica-containing substance and the compound (A).
  • ethanol by subjecting the sugar obtained in the present invention to ethanol fermentation by a fermentation microorganism that performs ethanol fermentation. After obtaining sugar, fermenting microorganisms that perform ethanol fermentation may be added, and ethanol fermentation may be performed to obtain ethanol, or fermentation microorganisms that perform ethanol fermentation may be added to the step of obtaining sugar using the saccharification reaction solution. Alternatively, ethanol may be obtained by simultaneously producing sugar and ethanol fermentation. *
  • Examples of the fermenting microorganism of the present invention include yeast, mold and bacteria. Among these, yeast or bacteria is particularly preferable. Moreover, these fermentation microorganisms may be used individually by 1 type, or may be used in mixture of 2 or more types. Examples of fermenting microorganisms used include, for example, the genus Saccharomyces, the genus Zymomonas, the genus Pichia, the genus Candida, the genus Zymobacter, the genus Corynebacterium, Examples include microorganisms belonging to the genus Kiesyveromyces, the genus Escherichia, and the like. *
  • the preferable fermentation temperature when performing ethanol fermentation is 15 ° C. or more and 35 ° C. or less, and more preferably 28 ° C. or more and 32 ° C. or less.
  • the preferable fermentation temperature when performing ethanol fermentation is 15 ° C. or more and 35 ° C. or less, and more preferably 28 ° C. or more and 32 ° C. or less.
  • the fermentation temperature is lower than 15 ° C, the activity of the fermentation microorganisms becomes inactive, and thus the efficiency of ethanol fermentation is remarkably reduced.
  • it is higher than 35 ° C the fermentation microorganisms may die, which is not preferable. *
  • the method for producing ethanol by a fermentation microorganism that performs ethanol fermentation of the present invention uses a combination of silica or a silica-containing substance and compound (A) to efficiently produce sugar by a saccharifying enzyme even at a preferable fermentation temperature when ethanol fermentation is performed. Therefore, ethanol fermentation using the resulting sugar can also be performed efficiently.
  • the reaction temperature for obtaining sugar is higher than the fermentation temperature for obtaining ethanol, it is necessary to cool the reaction solution before the ethanol fermentation step, resulting in waste of energy. According to the method of the present invention, Since the reaction temperature for obtaining sugar and the fermentation temperature for obtaining ethanol can be set within the same temperature range, energy waste can be avoided, which is efficient.
  • a cellulase aqueous solution was prepared by the following procedure. A predetermined amount of mixed cellulase powder was added to deionized water and dissolved while rotating at room temperature for 30 minutes with a rotor at room temperature to obtain a cellulase aqueous solution.
  • Cellulases that are saccharifying enzymes include cellulases (manufactured by Sigma Aldrich) and Aspergillus niger (manufactured by Trichoderma reesei; T. reesei) having optimal enzyme activity in the range of pH 3 or more and pH 6 or less.
  • a saccharifying enzyme aqueous solution was prepared by the following procedure. In deionized water, 1M acetate buffer (pH 5.0) so that the final pH is adjusted to 0.05M, and 1-2. The cellulase aqueous solution obtained in (1) was added and mixed while rotating at 100 rpm for 30 minutes with a rotor at room temperature to obtain saccharifying enzyme aqueous solutions having the saccharifying enzyme concentrations (cellulase concentration in this example) shown in Table 1 below. It was. These aqueous saccharifying enzyme solutions were designated as Comparative Sample 1 to Comparative Sample 3. The saccharifying enzyme concentration of each comparative sample was calculated using the Bradford method (CBB method) and converted to the protein concentration of BSA (trade name: protein standard substance, manufactured by Sigma Aldrich). The specific procedure for calculating the saccharifying enzyme concentration is as follows.
  • a protein assay CBB solution (concentrated 5 times) (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) diluted 5 times with deionized water is added to a disposable cell having a cell length of 10 mm. 0.05 mL of 3 was added, and the mixture was sealed to give a mixed solution. This mixed solution was mixed uniformly by repeating upside down. Thereafter, the mixture was allowed to stand for 30 minutes, and the absorbance at a wavelength of 595 nm was measured using a spectrophotometer UV-3150 (manufactured by Shimadzu Corporation). A sample having a known BSA protein concentration was prepared, and the absorbance was similarly measured to prepare a calibration curve.
  • the saccharifying enzyme concentration was calculated from the obtained calibration curve.
  • 0.27 g of protein was contained in 1 g of cellulase powder derived from Trichoderma reesei.
  • 0.06 g of protein was contained in 1 g of cellulase derived from Aspergillus niger.
  • a saccharifying enzyme composition was prepared by the following procedure. In deionized water, 1M acetate buffer (pH 5.0) is finally adjusted to 0.05M as pH adjustment, and solid, spherical colloidal silica (average primary particle diameter: manufactured by water glass method as silica) 35 nm) is dispersed in water, an acidic silica sol (pH 2.1, silica concentration 40 mass%), tripropylene glycol as compound (A), and 1-2. The cellulase aqueous solution obtained in (1) was added and mixed at room temperature while rotating at 100 rpm with a rotor for 30 minutes.
  • the saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example), silica concentration and compound (A ) Each saccharifying enzyme composition was obtained. These saccharifying enzyme compositions were designated as Sample 1 to Sample 8. The concentration of each component of Sample 1 to Sample 8 shown in Table 2 below is the concentration in the saccharifying enzyme composition.
  • a saccharifying enzyme composition was prepared in the same manner as in Samples 1 to 8, except that a polyhydric alcohol compound, a derivative of a polyhydric alcohol compound, or an alkylene oxide adduct of acetylene glycol was used as the compound (A). did.
  • These saccharifying enzyme compositions were designated as Sample 9 to Sample 20 shown in Table 2 below.
  • the concentration of each component of Sample 9 to Sample 20 shown in Table 2 below is the concentration in the saccharifying enzyme composition. *
  • A: Tripropylene glycol B: Ethylene glycol C: Polyethylene glycol (average molecular weight 200) D: Propylene glycol E: Dipropylene glycol F: Polypropylene glycol (average molecular weight 250) G: Polypropylene glycol (average molecular weight 700) H: Polypropylene glycol (average molecular weight 1000) I: Propylene glycol monomethyl ether J: 1,3-butanediol K: Glycerol L: Ethylene oxide adduct of 2,4,7,9-tetramethyl-5-decyne-4,7-diol (number of moles of ethylene oxide added) m + n 10) (Shinfin Chemical Co., Ltd., Surfinol 465) M: 2,4,7,9-tetramethyl-5-decyne-4,7-diol ethylene oxide adduct (methylene
  • silica-containing saccharifying enzyme aqueous solution A silica-containing saccharifying enzyme aqueous solution was prepared by the following procedure. In deionized water, 1M acetate buffer (pH 5.0) is finally adjusted to 0.05M as pH adjustment, and solid, spherical colloidal silica (average primary particle size particle) produced by the water glass method as silica. A silica silica sol (pH 2.1, silica concentration 40% by mass) dispersed in water, and 1-2.
  • the cellulase aqueous solution obtained in the above was added, mixed at room temperature while rotating at 100 rpm for 30 minutes with a rotor, and mixed with the saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example) shown in Table 4 below, and silica containing silica concentration A saccharifying enzyme aqueous solution was obtained.
  • These silica-containing saccharifying enzyme aqueous solutions were used as Comparative Sample 12 to Comparative Sample 14.
  • the concentration of each constituent component of Comparative Sample 12 to Comparative Sample 14 shown in Table 4 below is the concentration in the silica-containing saccharifying enzyme aqueous solution.
  • microcrystalline cellulose powder (crystal type: I type, trade name: Avicel PH-101, manufactured by Sigma Aldrich) was 0. After adding .05 g (equivalent to 5 mg / mL), the cap was sealed. *
  • Example 1 Regarding the saccharification reaction solution obtained from the saccharification enzyme composition of Sample 1 (hereinafter referred to as the saccharification reaction solution of Example 1) using the enzyme method (GOD method), 1-8. The amount of glucose produced 2 days after the enzymatic reaction was calculated.
  • a 3.0 mL coloring reagent solution was added to a disposable cell having a cell length of 10 mm, then 0.02 mL of the above filtrate was added, and the mixture was sealed to obtain a mixed solution. Next, this mixed solution was mixed evenly by repeating upside down. Then, it stood for 15 minutes at 24 degreeC, and the light absorbency of wavelength 505nm was measured using the spectrophotometer, and it was set as Es. Next, 3.0 mL of the coloring reagent is added to a disposable cell having a cell length of 10 mm, 0.02 mL of glucose standard solution II (500 mg / dL) is added, and the mixture is turned upside down and mixed uniformly.
  • Example 2 to Example 20 For each saccharification reaction solution obtained from the saccharification enzyme compositions of Sample 2 to Sample 20 (hereinafter referred to as saccharification reaction solutions of Example 2 to Example 20) in the same manner as in Example 1, 1-8. The amount of glucose produced 2 days after the enzymatic reaction was calculated, and the results are shown in Table 5 below.
  • FIG. 1 is a graph showing the measurement results of the effect of improving the saccharification reaction efficiency by adding tripropylene glycol in Examples 3, 7, and 8 and Comparative Examples 1 to 3, 6, and 10 to 14.
  • the saccharification reaction liquids of Comparative Examples 1 to 3 and the saccharification reaction liquids of Comparative Examples 12 to 14 were compared, the saccharification reaction liquids of Comparative Examples 12 to 14 in which silica was added to the cellulase aqueous solution were compared.
  • the amount of glucose produced was increased, and the saccharification reaction efficiency was improved.
  • Example 4 in which silica and tripropylene glycol were added to the cellulase aqueous solution were carried out.
  • the amount of glucose produced was increased, and further improvement in saccharification reaction efficiency was observed.
  • the saccharification reaction liquids of Comparative Examples 1 to 3 and the saccharification reaction liquids of Comparative Example 6, Comparative Example 10, and Comparative Example 11 are compared, the saccharification reaction efficiency is improved even when tripropylene glycol is added to the cellulase aqueous solution. I didn't. Accordingly, it was confirmed that the saccharification reaction efficiency was improved by using silica and tripropylene glycol together in the saccharification reaction of cellulose.
  • Example 7 and Example 8 a reduction of about 30% of the amount used can be expected, and the amount of cellulase used in the saccharification reaction can be further reduced by about 10% compared to the case where silica is added to the cellulase aqueous solution. it is conceivable that. *
  • FIG. 2 is a graph showing measurement results of the effect of improving the saccharification reaction efficiency by the tripropylene glycol concentration in Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1, 4 to 9, and 12.
  • the mass ratio of silica and tripropylene glycol tripropylene glycol / silica
  • the saccharification reaction efficiency is greatly improved, and the combined effect of both is confirmed. I was able to. Therefore, it was suggested from this result that the amount of glucose produced depends particularly on the amount of tripropylene glycol added.
  • saccharification enzyme cellulase
  • the compound (A) other than tripropylene glycol that is, a polyhydric alcohol compound, a derivative of a polyhydric alcohol compound, or acetylene glycol
  • the compound (A) other than tripropylene glycol that is, a polyhydric alcohol compound, a derivative of a polyhydric alcohol compound, or acetylene glycol
  • FIG. 3 shows the measurement results of the effect of improving the saccharification reaction efficiency by the addition of the polyhydric alcohol compounds of Examples 9 to 20 and Comparative Examples 1 and 12, derivatives of polyhydric alcohol compounds, or alkylene oxide adducts of acetylene glycol. It is a graph. As shown in FIG. 3, when the saccharification reaction solutions of Examples 9 to 20 and the saccharification reaction solutions of Comparative Examples 1 and 12 were compared, silica, polyhydric alcohol compound and polyhydric alcohol compound were added to the cellulase aqueous solution. In Examples 9 to 20 to which a derivative or an alkylene oxide adduct of acetylene glycol was added, an effect of improving the saccharification reaction efficiency was observed.
  • a saccharifying enzyme composition was prepared by the following procedure. 1M acetic acid buffer (pH 5.0) as final pH adjustment in deionized water, and solid and spherical colloidal silica (average primary particle size: 85 nm) produced by the water glass method as silica. ) In an aqueous silica dispersion (pH 9.3, silica concentration 40% by mass), polypropylene glycol (average molecular weight 1000) (hereinafter referred to as PPG1000) as compound (A), and 2-1.
  • PPG1000 average molecular weight 1000
  • the cellulase aqueous solution obtained in the above was added and mixed at room temperature while rotating at 100 rpm with a rotor for 30 minutes, and the saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example), silica concentration and PPG1000 concentration shown in Table 7 below were mixed.
  • a saccharifying enzyme composition was obtained.
  • This saccharifying enzyme composition was used as Sample 21.
  • concentration of each structural component of the sample 21 shown in following Table 7 is a density
  • a saccharifying enzyme composition was prepared by the following procedure. Add 1M acetate buffer (pH 5.0) and the above-mentioned cellulase aqueous solution to deionized exchange water so that the final pH is 0.05M, and mix at room temperature with a rotor at 100rpm for 30 minutes. Thus, a saccharifying enzyme aqueous solution having a saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example) shown in Table 7 below was obtained. This aqueous saccharifying enzyme solution was used as Comparative Sample 15.
  • silica-containing saccharifying enzyme aqueous solution A silica-containing saccharifying enzyme aqueous solution was prepared by the following procedure. 1M acetic acid buffer (pH 5.0) as final pH adjustment in deionized water, and solid and spherical colloidal silica (average primary particle size: 85 nm) produced by the water glass method as silica. ) In an aqueous silica dispersed in water (pH 9.3, silica concentration 40 mass%), and 2-1.
  • the cellulase aqueous solution obtained in the above was added, mixed at room temperature while rotating at 100 rpm with a rotor for 30 minutes, and mixed with the saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example) shown in Table 7 below, and silica containing silica concentration A saccharifying enzyme aqueous solution was obtained.
  • This silica-containing saccharifying enzyme aqueous solution was used as Comparative Sample 17.
  • concentration of each structural component of the comparative sample 17 shown in following Table 7 is a density
  • Example 21 (2-8. Calculation of glucose production)
  • the saccharification reaction solution obtained from the saccharification enzyme composition of Sample 21 was 2-7.
  • the amount of glucose produced 3 days after the enzymatic reaction was calculated, and the results are shown in Table 8 below.
  • Comparative Examples 15 to 17 In the same manner as in Example 1, a saccharification reaction solution obtained from the saccharification enzyme aqueous solution of Comparative Sample 15, the PPG1000-containing saccharification enzyme aqueous solution of Comparative Sample 16, and the silica-containing saccharification enzyme aqueous solution of Comparative Sample 17 (hereinafter, Comparative Examples 15 to 17 saccharification reaction solution) 2-7. The amount of glucose produced 3 days after the enzymatic reaction was calculated, and the results are shown in Table 8 below.
  • FIG. 4 is a graph showing the measurement results of the effect of improving the saccharification reaction efficiency by the addition of PPG1000 in Example 21 and Comparative Examples 15 to 17.
  • the saccharification reaction solution of Comparative Example 15 the saccharification reaction solution of Comparative Example 16 in which PPG1000 is added to the cellulase aqueous solution
  • the saccharification reaction solution of Comparative Example 17 in which silica is added to the cellulase aqueous solution the aqueous solution of cellulase.
  • Example 21 Comparing the saccharification reaction solution of Example 21 to which silica and PPG1000 were added, the amount of glucose produced in Example 21 in which silica and PPG1000 were added to the cellulase aqueous solution was increased, and the saccharification reaction efficiency was improved. It was observed. Therefore, it was confirmed that the efficiency of the saccharification reaction was improved by using silica and PPG1000 together even if a commercially available cellulase was used. *
  • a cellulase aqueous solution was prepared by the following procedure. A predetermined amount of mixed cellulase powder was added to deionized water and dissolved while rotating at room temperature for 30 minutes with a rotor at room temperature to obtain a cellulase aqueous solution.
  • Cellulases that are saccharifying enzymes include cellulases (manufactured by Sigma Aldrich) and Aspergillus niger (manufactured by Trichoderma reesei; T. reesei) having optimal enzyme activity in the range of pH 3 or more and pH 6 or less.
  • a saccharifying enzyme composition was prepared by the following procedure. 1M acetic acid buffer (pH 5.0) so that the final pH is adjusted to 0.05M in deionized water, and diatomaceous earth (Oplite P-1200, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90 mass) %, Average secondary particle size: 15 ⁇ m), as compound (A) 2-2. The same PPG1000, and 3-2.
  • the cellulase aqueous solution obtained in the above was added, mixed at room temperature while rotating at 100 rpm for 30 minutes with a rotor, and mixed with the saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example), diatomaceous earth concentration and PPG1000 concentration shown in Table 9 below.
  • a saccharifying enzyme composition was obtained. This saccharifying enzyme composition was used as Sample 22.
  • concentration of each structural component of the sample 22 shown in following Table 9 is a density
  • a saccharifying enzyme composition was prepared in the same manner as in Sample 22, except that diatomaceous earth having a different average secondary particle size was used. These saccharifying enzyme compositions were designated as Sample 23 to Sample 28 shown in Table 9 below. The concentration of each component of Sample 23 to Sample 28 shown in Table 9 below is the concentration in the saccharifying enzyme composition.
  • N Oplite P-1200, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 15 ⁇ m
  • O Silica # 100F, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 19 ⁇ m
  • P Silica # 300S, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 19 ⁇ m
  • Q Silica # 600S, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 30 ⁇ m
  • R Silica # 600H, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 38 ⁇ m
  • S Silica Queen L, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 25 ⁇ m
  • a saccharifying enzyme composition was prepared by the following procedure. 1M acetate buffer (pH 5.0) so that the final pH is 0.05M in deionized water, and 3-2. The aqueous cellulase solution obtained in the above was added and mixed at room temperature while rotating at 100 rpm for 30 minutes with a rotor to obtain a saccharifying enzyme aqueous solution having a saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example) shown in Table 10 below. . This aqueous saccharifying enzyme solution was used as Comparative Sample 18.
  • PPG1000-containing saccharifying enzyme aqueous solution A PPG1000-containing saccharifying enzyme aqueous solution using PPG1000 as the compound (A) was prepared by the following procedure.
  • a diatomaceous earth-containing saccharifying enzyme aqueous solution was prepared by the following procedure. 1M acetic acid buffer (pH 5.0) so that the final pH is adjusted to 0.05M in deionized water, and diatomaceous earth (Oplite P-1200, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90 mass) %, Average secondary particle size: 15 ⁇ m), and 3-2.
  • the cellulase aqueous solution obtained in the above was added, mixed at room temperature while rotating at 100 rpm for 30 minutes with a rotor, and mixed with saccharifying enzyme concentrations (cellulase concentration in this example) shown in Table 10 below, and diatomaceous earth containing diatomaceous earth concentrations
  • a saccharifying enzyme aqueous solution was obtained.
  • This diatomaceous earth-containing saccharifying enzyme aqueous solution was used as Comparative Sample 20.
  • concentration of each structural component of the comparative sample 20 shown in following Table 10 is a density
  • diatomaceous earth-containing saccharifying enzyme aqueous solutions were respectively prepared in the same manner as in Comparative Sample 20, except that diatomaceous earth having a different average secondary particle size was used.
  • These saccharifying enzyme compositions were used as Comparative Sample 21 to Comparative Sample 26 shown in Table 10 below.
  • the concentrations of the constituent components of Comparative Sample 21 to Comparative Sample 26 shown in Table 10 below are concentrations in the diatomaceous earth-containing saccharifying enzyme aqueous solution.
  • N Oplite P-1200, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 15 ⁇ m
  • O Silica # 100F, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 19 ⁇ m
  • P Silica # 300S, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 19 ⁇ m
  • Q Silica # 600S, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 30 ⁇ m
  • R Silica # 600H, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 38 ⁇ m
  • S Silica Queen L, manufactured by Chuo Silica Co., Ltd., silica content: 90% by mass, average secondary particle size: 25 ⁇ m
  • microcrystalline cellulose powder (crystal type: I type, trade name: Avicel PH-101, manufactured by Sigma Aldrich) was 0. After adding .50 g (equivalent to 50 mg / mL), the cap was sealed. *
  • the saccharifying enzyme composition of Samples 21 to 28 was used except that the saccharifying enzyme aqueous solution of Comparative Sample 18, the PPG 1000-containing saccharifying enzyme aqueous solution of Comparative Sample 19 and the diatomaceous earth-containing saccharifying enzyme aqueous solution of Comparative Sample 20 to Comparative Sample 26 were used.
  • the saccharification reaction liquid of each comparative sample was obtained in the same manner as the above. *
  • Example 22 to Example 28 In the same manner as in Example 1, saccharification reaction liquids obtained from the saccharification enzyme compositions of Sample 22 to Sample 28 (hereinafter referred to as saccharification reaction liquids of Example 22 to Example 28) 3-8. The amount of glucose produced 3 days after the enzymatic reaction was calculated, and the results are shown in Table 11 below.
  • FIG. 5 is a graph showing the measurement results of the effect of improving the saccharification reaction efficiency by the addition of PPG1000 in Examples 22 to 28 and Comparative Examples 18 to 26.
  • the saccharification reaction solution of Comparative Example 18 the saccharification reaction solution of Comparative Example 19 in which PPG1000 was added to the cellulase aqueous solution
  • the saccharification reaction solutions of Comparative Examples 20 to 26 in which diatomaceous earth was added to the cellulase aqueous solution.
  • a cellulase aqueous solution was prepared by the following procedure. A predetermined amount of mixed cellulase powder was added to deionized water and dissolved while rotating at room temperature for 30 minutes with a rotor at room temperature to obtain a cellulase aqueous solution.
  • Cellulases that are saccharifying enzymes include cellulases (manufactured by Sigma Aldrich) and Aspergillus niger (manufactured by Trichoderma reesei; T. reesei) having optimal enzyme activity in the range of pH 3 or more and pH 6 or less.
  • a saccharifying enzyme composition was prepared by the following procedure. 1M acetic acid buffer solution (pH 5.0) so that the final pH is adjusted to 0.05M in deionized water, and silica sand (No. 5, manufactured by Toyo Materan Co., Ltd., silica content: 95% by mass) , Average primary particle diameter: 310 ⁇ m), as compound (A) 2-2. PPG1000, and 4-2.
  • the cellulase aqueous solution obtained in the above was added and mixed at room temperature while rotating at 100 rpm with a rotor for 30 minutes, and the saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example), silica sand concentration and PPG 1000 concentration shown in Table 13 below were mixed.
  • a saccharifying enzyme composition was obtained. This saccharifying enzyme composition was used as sample 29.
  • concentration of each structural component of the sample 29 shown in following Table 13 is a density
  • silica sand-containing saccharifying enzyme aqueous solution A quartz sand-containing saccharifying enzyme aqueous solution was prepared by the following procedure. 1M acetic acid buffer (pH 5.0) so that the final pH is 0.05M in deionized water, and silica-containing material is silica sand (5, manufactured by Toyo Materan Co., Ltd., silica content: 95% by mass Average primary particle size: 310 ⁇ m), and 4-2.
  • the cellulase aqueous solution obtained in the above was added and mixed while rotating at 100 rpm with a rotor for 30 minutes at room temperature, and the saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example) shown in Table 13 below, and containing silica sand with a silica sand concentration A saccharifying enzyme aqueous solution was obtained.
  • This silica sand-containing saccharifying enzyme aqueous solution was used as Comparative Sample 29.
  • concentration of each structural component of the comparative sample 29 shown in the following Table 13 is a density
  • U and V of the compound (A) in Table 13 are as shown below.
  • U Polypropylene glycol (average molecular weight 1000)
  • Example 29 (4-8. Calculation of glucose production) (Example 29, Example 30) About the saccharification reaction liquid obtained from the saccharification enzyme compositions of Sample 29 and Sample 30 (hereinafter referred to as saccharification reaction liquids of Examples 29 and 30) in the same manner as in Example 1, 4-7. The amount of glucose produced 2 days after the enzymatic reaction was calculated, and the results are shown in Table 14 below.
  • Comparative Examples 27 to 29 In the same manner as in Example 1, the saccharification reaction solution obtained from the aqueous solution of saccharifying enzyme containing compound (A) of Comparative Sample 27 and Comparative Sample 28 and the aqueous solution of saccharifying enzyme containing silicate sand of Comparative Sample 29 (hereinafter referred to as Comparative Examples 27 to 29). About saccharification reaction solution) 4-7. The amount of glucose produced 2 days after the enzyme reaction was calculated, and the results are shown in Table 14 below.
  • FIG. 6 shows a saccharification reaction by adding an ethylene oxide adduct of PPG1000 or 2,4,7,9-tetramethyl-5-decyne-4,7-diol of Examples 29 and 30 and Comparative Examples 1 and 27 to 29. It is the graph which showed the measurement result of the improvement effect of efficiency.
  • the saccharification reaction solution of Comparative Example 1 was compared with the cellulase aqueous solution to which PPG1000 or 2,4,7,9-tetramethyl-5-decyne-4,7-diol ethylene oxide adduct was added.
  • yeast aqueous solution A yeast aqueous solution was prepared by the following procedure. 0.2 g of yeast powder was added to 40 g of deionized water previously adjusted to 35 ° C. and dissolved while stirring for 20 minutes using a magnetic stirrer while maintaining the temperature at 35 ° C. A yeast aqueous solution of yeast powder 0.2 g / deionized water 40 g) was obtained.
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) YP2 (manufactured by Sigma Aldrich) belonging to the genus Saccharomyces (Saccharomyces) was used.
  • 5-2. Aqueous ethanol fermentation aqueous solution was prepared by the following procedure. In deionized water, sulfuric acid is finally adjusted to a pH of about 5 as pH adjustment, and urea is finally adjusted to 0.21 mg / mL as a nitrogen source.
  • the ethanol enzyme composition was prepared by the following procedure. Solid and spherically produced in deionized water with sulfuric acid so that the final pH is around 5 as a pH adjustment, urea as a nitrogen source and finally 0.21 mg / mL, and a silica-containing material produced by the water glass method. Alkaline silica sol (pH 9.5, silica concentration 40% by mass) in which colloidal silica (average primary particle size: 85 nm) is dispersed in water, as compound (A) 2-2. Similar to PPG1000, 1-2. Cellulase aqueous solution obtained in 5-1.
  • the yeast aqueous solution obtained in (1) was added, mixed at room temperature with a magnetic stirrer while rotating for 10 minutes, and the saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example), silica concentration, PPG1000 concentration shown in Table 15 below, And the ethanol fermentation composition of yeast concentration was obtained.
  • This ethanol fermentation composition was designated as Sample 31.
  • concentration of each structural component of the sample 31 shown in following Table 15 is a density
  • PPG1000-containing ethanol fermentation aqueous solution A PPG1000-containing ethanol fermentation aqueous solution was prepared by the following procedure. In deionized water, sulfuric acid is finally adjusted to a pH of about 5 as pH adjustment, urea is adjusted to a final 0.21 mg / mL as a nitrogen source, and PPG1000 is used as the compound (A), 1-2. Cellulase aqueous solution obtained in 5-1. The yeast aqueous solution obtained in the above step was added and mixed at room temperature with a magnetic stirrer while rotating for 10 minutes to obtain a PPG1000-containing ethanol fermentation aqueous solution having the saccharifying enzyme concentration, PPG1000 concentration, and yeast concentration shown in Table 15 below. It was.
  • silica-containing ethanol fermentation aqueous solution was prepared by the following procedure. Solid and spherical colloids produced by the water glass method in deionized water with sulfuric acid so that the final pH is adjusted to around pH 5, urea as the nitrogen source and finally 0.21 mg / mL, silica. Alkaline silica sol (pH 9.5, silica concentration 40% by mass) in which silica (average primary particle size particle size 85 nm) is dispersed in water, 1-2. Cellulase aqueous solution obtained in 5-1.
  • the yeast aqueous solution obtained in the above was added, mixed at room temperature while rotating at 100 rpm for 30 minutes with a rotor, and mixed with the saccharifying enzyme concentration (cellulase concentration in this example), silica concentration, and yeast concentration shown in Table 15 below.
  • a silica-containing ethanol fermentation aqueous solution was obtained.
  • This silica-containing ethanol fermentation aqueous solution was used as Comparative Sample 32.
  • concentration of each structural component of the comparative sample 32 shown in the following Table 15 is a density
  • sample 31 10 mL is placed in a 13.5 mL glass bottle and stirred with a 4 mm ⁇ and 10 mm stirrer, and microcrystalline cellulose powder (crystal type: I type, trade name: Avicel PH-101, manufactured by Sigma Aldrich) is 0.
  • microcrystalline cellulose powder crystal type: I type, trade name: Avicel PH-101, manufactured by Sigma Aldrich
  • Example 31 (5-8. Calculation of ethanol production) (Example 31) Using gas chromatography (GC), the saccharification reaction and the ethanol fermentation liquid obtained from the ethanol fermentation composition of sample 31 (hereinafter referred to as the saccharification reaction and ethanol fermentation liquid of Example 31) and ethanol after ethanol fermentation The amount produced was calculated.
  • GC gas chromatography
  • Example 31 In a 2 mL microtube, 0.5 mL of a sample of the saccharification reaction and ethanol fermentation liquid of Example 31 was collected, and the enzyme and yeast were inactivated at 105 ° C. for 15 minutes. Next, in order to remove unreacted cellulose, silica-containing substances and yeast, the mixture is centrifuged at 15,000 G for 30 minutes with a high-speed cooling centrifuge SRX-201 (manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.), and then the supernatant The liquid was collected. For the determination of the amount of ethanol produced, the gas chromatograph GC-2014s (manufactured by Shimadzu Corporation) was used to measure the amount of ethanol produced (mg / mL). The measurement result of the amount of ethanol produced (mg / mL) is shown in Table 16 below. . *
  • each saccharification reaction and each ethanol fermentation liquid obtained from the ethanol fermentation aqueous solution of Comparative Sample 30, the PPG1000-containing ethanol fermentation aqueous solution of Comparative Sample 31, and the silica-containing substance-containing ethanol fermentation aqueous solution of Comparative Sample 32 (Hereinafter referred to as saccharification reaction and ethanol fermentation liquid of Comparative Examples 30 to 32) 5-7.
  • saccharification reaction and the amount of ethanol produced after 2 days of ethanol fermentation were calculated, and the results are shown in Table 16 below.
  • FIG. 7 is a graph showing measurement results of the effect of improving ethanol fermentation efficiency by adding PPG1000 in Example 31 and Comparative Examples 30 to 32.
  • the saccharification reaction and the ethanol fermentation liquid of Comparative Example 30 and Comparative Example 32 were compared, the amount of ethanol produced was increased in Comparative Example 32 in which silica was added to the cellulase aqueous solution and the yeast aqueous solution. Improvement in ethanol production efficiency was observed.
  • the saccharification reaction and the ethanol fermentation liquid of Example 31 and Comparative Example 32 are compared, the amount of ethanol produced is increased in Example 31 in which silica and PPG 1000 are added to the cellulase aqueous solution and the yeast aqueous solution.
  • the present invention can be used in an industrial field to which a saccharification technique for producing a sugar such as glucose from cellulose-based biomass containing cellulose or hemicellulose is applied, for example, production of cellulose-based bioethanol.

Abstract

セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液であって、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）で表される多価アルコール化合物及びその誘導体、及び下記一般式（２）で表されるアセチレングリコール及びそのアルキレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有する。なお、化学式中の記号の定義は明細書中に記載の通りである。

Description

糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法
　本発明は、糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法に関する。
　従来、セルロース又はヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスを原料に、エタノールを製造するセルロース系バイオエタノールが知られている。　
　セルロース又はヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスからグルコースといった糖を生成する方法（糖化技術）としては、セルロース系バイオマスに硫酸を加えて加水分解する方法が知られているが、反応器の腐食や廃液処理の問題がある。また、例えば、カーボンやゼオライト等にスルホ基を担持させた固体酸触媒を用いてセルロース系バイオマスを糖化する方法も提案されているが、固体同士の反応であるが故に、反応速度が極めて遅い上、未反応残渣と固体酸触媒との分離が困難という問題がある。更に、上述のどの方法も加水分解の制御が難しく、反応が進行し過ぎた結果、糖自体が分解し、糖の収率が低下してしまう問題もある。　
　一方、酵素を用いて糖化を行う方法も知られている（特許文献１参照）。かかる方法は、原料を加圧熱水で処理する熱水処理工程、その熱水処理物を機械的粉砕処理する機械的粉砕処理工程、及びその機械的粉砕物を酵素で糖化処理する糖化処理工程を含む。しかしながら、かかる方法では、酵素で糖化する際の反応速度が遅く、得られる糖化液の濃度が十分とはいえないという問題があった。　
　そこで、酵素をシリカ系メソ多孔体に担持させて用いることにより、酵素を溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることができ、酵素反応をより効率的に進めるという方法が提案されている（特許文献２参照）。しかしながら、かかる方法では、酵素を担体に吸着固定化する工程が必要であるという問題があり、また、固定化された酵素は、固定化されていないものと比較して、反応効率が４０％～５０％程度に低下する虞があるという問題がある。更に、固体同士の反応であるが故に、未反応残渣と酵素が固定された担体との分離が困難という問題もある。　
　また、シリカゾルと酵素を混合し、シリカゲルとした後、粉末化した固定化酵素も知られている（特許文献３，４参照）。このような固定化酵素でも酵素の回収はできるものの、反応効率自体は低いものであった。他にも、０．５μｍ～１００μｍのシリカ粉末と酵素を混合してセルロースを含む植物繊維を加水分解する方法も知られているが、シリカ粉末を混合した効果が明確ではなく、未反応残渣と懸濁したシリカ粉末との分離が困難という問題がある（特許文献５参照）。　
　更に、酵素とポリエチレングリコール又はその誘導体等を含んだ糖化反応促進剤を用いてセルロース系バイオマスを糖化する方法も提案されている（特許文献６参照）。しかしながら、この糖化反応促進剤は、得られる糖化液の濃度が十分とはいえないという問題があった。
特開２００６－１３６２６３号公報 特開２００９－１２５００６号公報 特公昭６３－２５９５号公報 特公昭６３－２１４７５号公報 特開平１０－６６５９４号公報 特公昭５８－５８０７８号公報
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便な工程で酵素による糖化反応効率を向上させることが可能な糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成する本発明の第１の態様は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液であって、前記セルロース及び前記ヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）で表される多価アルコール化合物及びその誘導体、及び下記一般式（２）で表されるアセチレングリコール及びそのアルキレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有することを特徴とする糖化反応液にある。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　［一般式（１）中のＲ１は炭素数１以上９以下の直鎖アルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アミノ基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、炭素数１以上６以下のアルコキシ基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、フェニル基、ベンジル基、ホスホリル基又はメルカプト基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、フェニル基、ベンジル基又はホスホリル基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。また繰り返し単位ｎは１以上５００以下を満たす。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　［一般式（２）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、主鎖の炭素数が１以上１０以下の飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を表し、前記アルキル基又はアルケニル基は更に置換基を有していてもよい。またＡ１及びＡ２は各々独立して、主鎖の炭素数が２以上４以下の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキサイド基（ただしアルキレンオキサイド基の片末端の酸素原子は水素原子に結合し、片末端の炭素原子は酸素原子に結合するものとする）を表し、アルキレンオキサイド単位の付加モル数ｍ及びｎは総和で０以上５０以下を満たす。］
　上記目的を達成する本発明の第２の態様は、前記シリカ含有物質が、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする第１の態様の糖化反応液にある。　
　上記目的を達成する本発明の第３の態様は、前記シリカ又は前記シリカ含有物質中のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．０００１以上、１以下であることを特徴とする第１又は第２の態様の糖化反応液にある。　
　上記目的を達成する本発明の第４の態様は、前記多価アルコール化合物は、２価アルコール、３価アルコール及び４価アルコールのモノマー、ジオマー、トリゴマー及びオリゴマー、並びにポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第１の態様乃至第３の態様のいずれか一つの態様の糖化反応液にある。　
　上記目的を達成する本発明の第５の態様は、前記多価アルコール化合物の誘導体は、多価アルコールエーテル類及びポリアルキレングリコールエーテル類からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第１の態様乃至第４の態様のいずれか一つの態様の糖化反応液にある。　
　上記目的を達成する本発明の第６の態様は、前記化合物（Ａ）は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、グリセロール、ペンタエリトリトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール１－モノメチルエーテル、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝３０）からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第１の態様乃至第５の態様のいずれか一つの態様の糖化反応液にある。　
　上記目的を達成する本発明の第７の態様は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化酵素組成物であって、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）で表される多価アルコール化合物及びその誘導体、及び下記一般式（２）で表されるアセチレングリコール及びそのアルキレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有し、前記シリカ又は前記シリカ含有物質中のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．０００１以上、１以下であることを特徴とする糖化酵素組成物にある。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　［一般式（１）中のＲ１は炭素数１以上９以下の直鎖アルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アミノ基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、炭素数１以上６以下のアルコキシ基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、フェニル基、ベンジル基、ホスホリル基又はメルカプト基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、フェニル基、ベンジル基又はホスホリル基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。また繰り返し単位ｎは１以上５００以下を満たす。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　［一般式（２）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、主鎖の炭素数が１以上１０以下の飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を表し、前記アルキル基又はアルケニル基は更に置換基を有していてもよい。またＡ１及びＡ２は各々独立して、主鎖の炭素数が２以上４以下の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキサイド基（ただしアルキレンオキサイド基の片末端の酸素原子は水素原子に結合し、片末端の炭素原子は酸素原子に結合するものとする）を表し、アルキレンオキサイド単位の付加モル数ｍ及びｎは総和で０以上５０以下を満たす。］
　上記目的を達成する本発明の第８の態様は、前記シリカ含有物質が、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする第７の態様の糖化酵素組成物にある。　
　上記目的を達成する本発明の第９の態様は、前記多価アルコール化合物は、２価アルコール、３価アルコール及び４価アルコールのモノマー、ジオマー、トリゴマー及びオリゴマー、並びにポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第７又は第８の態様の糖化酵素組成物にある。
　上記目的を達成する本発明の第１０の態様は、前記多価アルコール化合物の誘導体は、多価アルコールエーテル類及びポリアルキレングリコールエーテル類からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第７の態様乃至第９の態様のいずれか一つの態様の糖化酵素組成物にある。
　上記目的を達成する本発明の第１１の態様は、前記化合物（Ａ）は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、グリセロール、ペンタエリトリトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール１－モノメチルエーテル、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝３０）からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第７の態様乃至第１０の態様のいずれか一つの態様の糖化酵素組成物にある。　
　上記目的を達成する本発明の第１２の態様は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液を用いて糖を製造する糖の製造方法であって、前記セルロース及び前記ヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）で表される多価アルコール化合物及びその誘導体、及び下記一般式（２）で表されるアセチレングリコール及びそのアルキレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有する糖化反応液を用いて糖を製造することを特徴とする糖の製造方法にある。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　［一般式（１）中のＲ１は炭素数１以上９以下の直鎖アルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アミノ基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、炭素数１以上６以下のアルコキシ基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、フェニル基、ベンジル基、ホスホリル基又はメルカプト基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、フェニル基、ベンジル基又はホスホリル基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。また繰り返し単位ｎは１以上５００以下を満たす。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　［一般式（２）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、主鎖の炭素数が１以上１０以下の飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を表し、前記アルキル基又はアルケニル基は更に置換基を有していてもよい。またＡ１及びＡ２は各々独立して、主鎖の炭素数が２以上４以下の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキサイド基（ただしアルキレンオキサイド基の片末端の酸素原子は水素原子に結合し、片末端の炭素原子は酸素原子に結合するものとする）を表し、アルキレンオキサイド単位の付加モル数ｍ及びｎは総和で０以上５０以下を満たす。］
　上記目的を達成する本発明の第１３の態様は、前記シリカ含有物質が、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする第１２の態様の糖の製造方法にある。
　上記目的を達成する本発明の第１４の態様は、前記シリカ又は前記シリカ含有物質中のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．０００１以上、１以下であることを特徴とする第１２又は第１３の態様の糖の製造方法にある。　
　上記目的を達成する本発明の第１５の態様は、前記多価アルコール化合物は、２価アルコール、３価アルコール及び４価アルコールのモノマー、ジオマー、トリゴマー及びオリゴマー、並びにポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第１２の態様乃至第１４の態様のいずれか一つの態様の糖の製造方法にある。　
　上記目的を達成する本発明の第１６の態様は、前記多価アルコール化合物の誘導体は、多価アルコールエーテル類及びポリアルキレングリコールエーテル類からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第１２の態様乃至第１５の態様のいずれか一つの態様の糖の製造方法にある。　
　上記目的を達成する本発明の第１７の態様は、前記化合物（Ａ）は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、グリセロール、ペンタエリトリトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール１－モノメチルエーテル、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝３０）からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第１２の態様乃至第１６の態様のいずれか一つの態様の糖の製造方法にある。　
　上記目的を達成する本発明の第１８の態様は、第１２の態様乃至第１７の態様のいずれか一つの態様の製造方法により得られた糖を用いて、発酵微生物によるエタノール発酵を行い、エタノールを製造することを特徴とするエタノールの製造方法にある。　
　上記目的を達成する本発明の第１９の態様は、糖を製造する工程に発酵微生物を添加して、糖の製造とエタノール発酵とを同時に行うことを特徴とする第１８の態様のエタノールの製造方法にある。　
　上記目的を達成する本発明の第２０の態様は、前記発酵微生物は、酵母、カビ又は細菌であることを特徴とする第１８の態様又は第１９の態様のエタノールの製造方法にある。　
　上記目的を達成する本発明の第２１の態様は、前記発酵微生物は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属又はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物であることを特徴とする第２０の態様のエタノールの製造方法にある。　
　上記目的を達成する本発明の第２２の態様は、エタノール発酵を１５℃以上、３５℃以下で行うことを特徴とする第１８の態様乃至第２１の態様のいずれか一つの態様のエタノールの製造方法にある。
　本発明によれば、簡便な工程で酵素による糖化反応効率を向上させることが可能な糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法を提供することができる。
実施例３，７，８及び比較例１～３，６，１０～１４のトリプロピレングリコールの添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。 実施例１～６及び比較例１，４～９，１２のトリプロピレングリコール濃度による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。 実施例９～２０及び比較例１，１２の多価アルコール化合物、多価アルコール化合物の誘導体又はアセチレングリコールのアルキレンオキサイド付加物の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。 実施例２１及び比較例１５～１７のＰＰＧ１０００の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。 実施例２２～２８及び比較例１８～２６のＰＰＧ１０００の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。 実施例２９，３０及び比較例１，２７～２９のＰＰＧ１０００又は２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。 実施例３１及び比較例３０～３２のＰＰＧ１０００によるエタノール発酵効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。
　本発明においては、グルコースといった糖を生成するための原料として、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方が用いられる。　
　かかるセルロース又はヘミセルロースは、例えば、広葉樹、針葉樹等の農林水産物資源、又は当該農林水産物資源の廃棄物といったセルロース系バイオマスに含有されている。より具体的には、バガス、稲ワラ、コーンストーバー、アブラヤシ空果房、木材繊維、木材チップ、単板くず、木粉、パルプ類、古紙類、綿、ホヤ、酢酸菌等の原料が挙げられる。また、これらの原料は、セルロース系バイオマス由来のものであれば特に限定されず、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。　
　これらの中でも、ユーカリ木粉（広葉樹）、スギ木粉（針葉樹）、バガス、稲ワラ、コーンストーバー、アブラヤシ空果房、綿等に含有されるセルロース又はヘミセルロースであることが好ましい。これらの場合、理由は定かではないが、解繊しやすく、比較的高収率で糖を得ることができる。　
　ここで、セルロースとは、グルコースがβ－１，４グルコシド結合により重合した重合体をいう。ヘミセルロースとは、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース等がグルコシド結合により重合した重合体で、セルロース以外の水不溶性の多糖類をいう。　
　また、セルロースは、その部分分解物であるセロオリゴ糖、セロビオース等を含んでいてもよく、結晶性であっても非結晶性であってもよい。また、カルボキシメチル化、アルデヒド化又はエステル化した誘導体であってもよい。なお、セルロース又はヘミセルロースは、上述した通り、バイオマス由来のものであれば特に限定されず、植物由来、真菌由来、細菌由来等であってもよい。　
　本発明の糖化酵素としては、セルラーゼを主体としたものが用いられる。かかるセルラーゼは、セルロース又はヘミセルロースをグルコース等の糖にまで分解する酵素を意味している。　
　かかる糖化酵素を生産する微生物としては、特に限定されないが、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属菌、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属菌、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属菌、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属菌、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属菌、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属菌、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属菌、トレメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属菌、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌等が挙げられる。これらの他にも、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属菌、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌等の細菌；スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属菌、サーモアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属菌、サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属菌等の放線菌が挙げられる。なお、これらの糖化酵素は、人工的に改変されていてもよい。また、これらの糖化酵素は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。　
　これらの中でも、特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来の糖化酵素及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属由来の糖化酵素が好ましい。これらの糖化酵素は、結晶性セルロースに対して活性が高いからである。　
　また、セルラーゼは、一連の酵素群であってもよい。かかる酵素群としては、エンドグルカナーゼ（ＥＣ　３．２．１．７４）、セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ　３．２．１．９１）、β－グルコシダーゼ（ＥＣ　２３．２．４．１，ＥＣ　３．２．１．２１）等が挙げられる。本発明は、異なった微生物由来のセルラーゼを混合して用いることが好ましい。この場合、それらの相乗効果により、セルロース又はヘミセルロースの糖化をより促進させることができる。　
　上述のセルラーゼは、多くはｐＨ３以上、ｐＨ６以下の範囲で至適な酵素活性を有するものが一般的であるが、ｐＨ６～ｐＨ１０の範囲で至適な酵素活性を有するアルカリセルラーゼと呼ばれるものであってもよい。また、上述のセルラーゼは、多くは反応温度２５℃以上、５０℃以下の範囲で至適な酵素活性を有するものが多いが、７０℃以上、１００℃以下の範囲で至適な酵素活性を有する耐熱性セルラーゼと呼ばれるものであってもよい。　
　本発明でシリカ又はシリカ含有物質として、シリカ、珪藻土又は珪砂を用いることができる。シリカ含有物質である珪藻土及び珪砂は、シリカが主成分の天然物である。シリカは少なくとも二酸化ケイ素を含有する化合物の総称であり、表面の一部にシラノール基が存在しているのが一般的である。このシリカは、粒子形状が球状でも非球状でもよく、粒子構造が中実構造でも多孔質構造でもよく、結晶性が非晶質でも結晶質でもよく、粉末状、懸濁液、分散液どの状態で使用してもよい。シリカ表面の一部がシラノール基以外の別の官能基で修飾されていてもよい。また、シランカップリング剤やシリコンアルコキシド、又はケイ酸イオン等でシリカ以外の化合物の表面に反応させてシリカの層が存在する形でもよい。その中でも特にコロイダルシリカ、珪藻土及び珪砂の適用が好ましい。　
　本発明で、コロイダルシリカは、平均一次粒子径が１ｎｍ以上、４００ｎｍ以下、好ましくは、５ｎｍ以上、３５０ｎｍ以下であり、糖化反応液中に存在させて用いられる。平均一次粒子径は、窒素吸着法（ＢＥＴ法）により測定される比表面積Ｓ（ｍ２／ｇ）から換算式（Ｄ（ｎｍ）＝２７２０／Ｓ）により算出されたものである。なお、コロイダルシリカは、水、メタノール、エタノール、アセトン、メチルエチルケトン、エチレングリコール等の分散媒に分散させた分散液として用いられ、分散液は、コロイド液、ゾル等と呼ばれる。本発明では、酵素の活性を阻害しない範囲で、分散媒を選択してよいが、水、エタノール等の分散媒の適用が好ましい。　
　コロイダルシリカの製造方法として、水ガラスを原料とする水ガラス法、金属アルコキシドを原料とするアルコキシド法、塩化ケイ素化合物を原料とする気相法等がある。どの製造法で得られたコロイダルシリカを用いてもよいが、水ガラス法により得られたコロイダルシリカの適用が好ましい。　
　本発明の下記一般式（１）中のＲ１は炭素数１以上９以下の直鎖アルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アミノ基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、炭素数１以上６以下のアルコキシ基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、フェニル基、ベンジル基、ホスホリル基又はメルカプト基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、フェニル基、ベンジル基又はホスホリル基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。また繰り返し単位ｎは１以上５００以下を満たす。Ｒ１のアルキル基の炭素数は１以上６以下が好ましく、更に好ましくは１以上４以下である。Ｒ２及びＲ３のアルキル基、アルキレン基、アルケニル基及びアルコキシ基の炭素数は１以上４以下が好ましく、更に好ましくは１以上３以下である。Ｒ４及びＲ５のアルキル基、アルキレン基、アルケニル基の炭素数は１以上４以下が好ましく、更に好ましくは１以上３以下である。この繰り返し単位ｎは１以上３００以下が好ましく、更に好ましくは１以上１００以下である。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　本発明の下記一般式（２）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、主鎖の炭素数が１以上１０以下の飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を表し、前記アルキル基又はアルケニル基は更に置換基を有していてもよい。またＡ１及びＡ２は各々独立して、主鎖の炭素数が２以上４以下の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキサイド基（ただしアルキレンオキサイド基の片末端の酸素原子は水素原子に結合し、片末端の炭素原子は酸素原子に結合するものとする）を表し、アルキレンオキサイド単位の付加モル数ｍ及びｎは総和で０以上５０以下を満たす。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のアルキル基又はアルケニル基の炭素数は１以上８以下が好ましく、更に好ましくは１以上６以下である。Ａ１及びＡ２のアルキレンオキサイド基の炭素数は２又は３が好ましい。アルキレンオキサイド単位の付加モル数ｍ及びｎは総和で０以上４０以下が好ましく、更に好ましくは１０以上３０以下である。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　一般式（１）で表される多価アルコール化合物としては、特に限定されないが、具体的には、エチレングリコール（別称；１，２－エタンジオール）、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、プロピレングリコール（別称；１，２－プロパンジオール）、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、トリメチレングリコール（別称；１，３－プロパンジオール）、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、１，２－ペンタンジオール、１，５－ペンタンジオール、２，４－ペンタンジオール、へキシレングリコール（別称；２－メチルペンタン－２，４－ジオール）、１，２－ヘキサンジオール、１，６－ヘキサンジオール、１，２－ヘプタンジオール、１，７－ヘプタンジオール、１，２－オクタンジオール、１，８－オクタンジオール、１，２－ノナンジオール、１，９－ノナンジオール、３－メトキシ－１，２－プロパンジオール、３－（２－エチルヘキシルオキシ）－１，２－プロパンジオール、３－アミノ－１，２－プロパンジオール、３－メチルアミノ－１，２－プロパンジオール、３－（ジメチルアミノ）－１，２－プロパンジオール、３－（ジエチルアミノ）－１，２－プロパンジオール、３－アリルオキシ－１，２－プロパンジオール、α－クロロヒドリン（別称；３－クロロ－１，２－プロパンジオール）、３－フェノキシ－１，２－プロパンジオール、３－メルカプト－１，２－プロパンジオール、２－メチル－１，３－プロパンジオール、ネオペンチルグリコール（別称；２，２－ジメチル－１，３－プロパンジオール）、２－メチル－２－プロピル－１，３－プロパンジオール、２－エチル－２－メチル－１，３－プロパンジオール、２－ブチル－２－エチル－１，３－プロパンジオール、２，２ージイソブチル－１，３－プロパンジオール、２，２ージイソペンチル－１，３－プロパンジオール、２－（２，２ージエトキシエチル）－１，３－プロパンジオール、２－メチレン－１，３－プロパンジオール、セリノール（別称；２－アミノ－１，３－プロパンジオール）、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、２－アミノ－２－エチル－１，３－プロパンジオール、ジブロモネオペンチルグリコール（別称；２，２ービス（ブロモメチル）－１，３－プロパンジオール）、ブロノポール（別称；２－ブロモ－２－ニトロ－１，３－プロパンジオール）、２－メチル－２－ニトロ－１，３－プロパンジオール、２－フェニル－１，３－プロパンジオール、２－ベンジルオキシ－１，３－プロパンジオール、３－メチル－１，３－ブタンジオール、４－ベンジルオキシ－１，３－ブタンジオール、２，２，３，３－テトラフルオロ－１，４－ブタンジオール、ピナコール（別称；２，３－ジメチル－２，３－ブタンジオール）、ＤＬ－１，４－ジクロロ－２，３－ブタンジオール、１，４－ジメルカプト－２，３－ブタンジオール、ヘキサフルオロ－２，３－ビス（トリフルオロメチル）－２，３－ブタンジオール、２，２，４－トリメチル－１，３－ペンタンジオール、３－メチル－１，５－ペンタンジオール、２，４－ジエチル－１，５－ペンタンジオール、２，４－ジメチル－２，４－ペンタンジオール、２－エチル－１，３－ヘキサンジオール、２，５－ジメチル－２，５－ヘキサンジオール等の２価アルコール；グリセロール、ジグリセロール、１，２，３－ブタントリオール、１，２，４－ブタントリオール、１，２，５－ペンタントリオール、１，２，６－ヘキサントリオール、１，２，７－ヘプタントリオール、１，２，８－オクタントリオール、１，２，９－ノナントリオール、ペンタグリセロール（別称；２－ヒドロキシメチル－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、トリメチロールプロパン（別称；２－エチル－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール）、トリス塩基（別称；２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール）、２－（ブロモメチル）－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール、２－（ヒドロキシメチル）－２－ニトロ－１，３－プロパンジオール等の３価アルコール；ペンタエリトリトール（別称；２，２ービス（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール）、ジトリメチロールプロパン（別称；２，２’－オキシビス（メチレン）ビス（２－エチル－１，３－プロパンジオール））、Ｌ－トレイトール（別称；Ｌ－１，２，３，４－ブタンテトラオール）等の４価以上のアルコール；ポリエチレングリコール、直鎖又は分岐鎖のポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリテトラメチレンエーテルグリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレンポリオキシエチレングリコールのランダム共重合体、交互共重合体及びブロック共重合体等のポリアルキレングリコール類；ポリオキシエチレングリセリルエーテル、ポリオキシプロピレングリセリルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリセリルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレントリメチロールプロパン、ポリオキシテトラメチレンポリオキシエチレングリコール又はポリオキシテトラメチレンポリオキシプロピレングリコールのランダム共重合体、交互共重合体及びブロック共重合体、ポリグリセロール等が挙げられる。また、上述の多価アルコールのモノマー、ジオマー、トリゴマー等であってもよい。これらの中では、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、グリセロール、ペンタエリトリトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールが好ましい。　
　一般式（１）で表される多価アルコール化合物の誘導体としては、特に限定されないが、例えば、エチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノプロピルエーテル、エチレングリコールモノイソプロピルエーテル、トリエチレングリコールモノイソプロピルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、トリエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノイソブチルエーテル、エチレングリコールモノ－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル（別称；プロピレングリコール１－モノメチルエーテル）、ジプロピレングリコールモノメチルエーテル、トリプロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、プロピレングリコール１－モノブチルエーテル、１，３－プロパンジオールモノメチルエーテル、１，２－ブタンジオール１－モノメチルエーテル、１，４－ブタンジオールモノメチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、ジエチレングリコールジブチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、ジプロピレングリコールジメチルエーテル、１，５－ペンタンジオールジメチルエーテル、１，６－ヘキサンジオールジメチルエーテル等の多価アルコールアルキルエーテル類（多価アルコールエーテル類）；ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールモノアセタート、エチレングリコールモノアリルエーテル、ジエチレングリコールアミン（別称；エチレングリコールモノ（２－アミノエチル）エーテル）、エチレングリコールモノ［２－（ジエチルアミノ）エチル］エーテル、エチレングリコールモノベンジルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセタート、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセタート、ジエチレングリコールモノフェニルエーテル、ジエチレングリコールモノ（２－プロピン－１－イル）エーテル、トリエチレングリコールモノクロロヒドリン、トリエチレングリコールモノ（２－プロピニル）エーテル、トリエチレングリコールモノベンジルエーテル、プロピレングリコール１－モノメチルエーテル２－アセタート、プロピレングリコール２－モノフェニルエーテル、エチレングリコールジアセタート、ジエチレングリコールジアセタート、トリエチレングリコールジアセタート、エチレングリコールジクロロアセタート、エチレングリコールジトシラート、ジエチレングリコールジトシラート、エチレングリコールジブチラート、エチレングリコールジフェニルエーテル、エチレングリコールジベンジルエーテル、エチレングリコールジベンゾアート、ジエチレングリコールジベンゾアート、プロピレングリコールジアセタート、トリメチレングリコ－ルジトシラート（別称；１，３－プロパンジオールジトシラート）、ネオペンチルグリコールジトシラート（別称；２，２－ジメチル－１，３－プロパンジオールジトシラート）、１，４－ブタンジオールジアセタート、ブスルファン（別称；１，４－ブタンジオールジメタンスルホナート）、１，４－ブタンジオールビス（３－アミノプロピル）エーテル、１，４－ブタンジオールビス（チオグリコラート）、１，５－ペンタンジオールジアセタート、２，５－ヘキサンジオールジアセタート、１，８－オクタンジオールジアセタート、１，９－ノナンジオールジアセタート等のグリコールエーテル類；ポリオキシプロピレンブチルエーテル等のポリアルキレングリコールアルキルエーテル類；ポリエチレングリコールアリルエーテル、ポリエチレングリコールビス（３－アミノプロピル）エーテル等のポリアルキレングリコールエーテル類等が挙げられる。これらの中では、プロピレングリコール１－モノメチルエーテルが好ましい。　
　一般式（２）で表されるアセチレングリコール化合物としては、特に限定されないが、例えば、２－ブチン－１，４－ジオール、２，５－ジメチル－３－ヘキシン－２，５－ジオール、３，６－ジメチル－４－オクチン－３，６－ジオール、２，３，６，７－テトラメチル－４－オクチン－３，６－ジオール、４，７－ジメチル－５－デシン－４，７－ジオール、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオール、２，５，８，１１－テトラメチル－６－ドデシン－５，８－ジオール等が挙げられる。　
　また、一般式（２）のアセチレングリコール化合物のアルキレンオキサイド付加物としては、特に限定されないが、例えば、３，６－ジメチル－４－オクチル－３，６－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝４）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１．３）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝３．５）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝３０）、２，５，８，１１－テトラメチル－６－ドデシン－５，８－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝６）等のアセチレングリコールのエチレンオキサイド誘導体を挙げることができる。これらの中では、特に２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝３０）等が好ましい。　
　アセチレングリコール化合物及びそのアルキレンオキサイド付加物の市販品としては、例えば、日信化学工業株式会社製のサーフィノールシリーズ、オルフィンシリーズ、川研ファインケミカル株式会社製のアセチレノールシリーズ等が挙げられる。　
　一般式（１）及び（２）で表される化合物（Ａ）は、単独で使用してもよいし、複数の化合物を併用してもよい。　
　本発明の糖化反応液は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を原料に、糖化酵素組成物である、糖化酵素、シリカ又はシリカ含有物質及び一般式（１）で表される多価アルコール化合物及びその誘導体、及び一般式（２）で表されるアセチレングリコール及びそのアルキレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）を含有するものである。詳細は後述するが、糖化反応効率（単に反応効率ともいう）の向上効果を享受する観点から、糖化反応液において、シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）を併用させることが好ましい。　
　ここで、糖化反応液において、糖化酵素の濃度は、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ；ウシ血清由来アルブミン）のタンパク質濃度に換算して、０．００１質量％以上、３．０質量％以下、好ましくは、０．００１質量％以上、１．０質量％以下である。糖化酵素の濃度がこの範囲より低いと反応効率が低下して好ましくなく、一方、これより高いと糖化酵素が溶液に溶解しにくくなるだけでなく、経済的に不適である。　
　また、糖化反応液において、シリカ又はシリカ含有物質中のシリカの濃度は、０．００１質量％以上、４０質量％以下、好ましくは、０．００５質量％以上、１０質量％以下である。シリカ又はシリカ含有物質中のシリカの濃度がこの範囲より低いと反応効率が低下して好ましくなく、一方、これより高いと分散性が悪化するだけでなく、経済的に不適である。　
　また、糖化反応液において、糖化酵素とシリカ又はシリカ含有物質中のシリカとの質量比率（糖化酵素／シリカ）は、０．０００２以上、３００以下、好ましくは、０．００２以上、３０以下である。両者の質量比率がこの範囲を外れると反応効率の向上が顕著ではなくなる。　
　また、糖化反応液において、化合物（Ａ）の濃度は、０．００００１質量％以上、１０質量％以下、好ましくは、０．０００１質量％以上、１質量％以下である。化合物（Ａ）の濃度がこの範囲より低いと反応効率が低下して好ましくなく、一方、これより高いと分散性が悪化するだけでなく、経済的に不適である。　
　また、糖化反応液において、シリカ又はシリカ含有物質中のシリカと化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）は、０．０００１以上、１以下、好ましくは、０．００１以上、０．１以下である。両者の質量比率がこの範囲を外れると反応効率の向上が顕著ではなくなる。　
　また、糖化反応液のｐＨは、３以上、１１以下、好ましくは、３以上、６以下である。ｐＨが３より低いと、シリカ又はシリカ含有物質の凝集が生じて糖化酵素の反応効率が低下し、一方、ｐＨが１１より高いと、シリカ又はシリカ含有物質が溶解しやすくなるため、好ましくない。　
　糖化反応液のｐＨ調整剤として、硫酸、塩酸、硝酸といった鉱酸；酢酸、シュウ酸といったカルボン酸；クエン酸、酒石酸、リンゴ酸といったヒドロキシ酸；水酸化ナトリウムや水酸化カリウムといった水酸化物塩；アンモニア、尿素等が挙げられる。本発明の効果を阻害しない範囲であれば、特にその種類や濃度に使用制限はない。また、これらのｐＨ調整剤は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。更に緩衝作用を有する緩衝液の状態で使用してもよい。　
　また、本発明の糖化反応液は、反応温度を、５℃以上、１００℃以下、好ましくは、２０℃以上、５５℃以下とするのが好ましい。糖化酵素の至適温度に合わせて反応温度を設定することが好ましい。一般的に、反応温度が５℃より低いと糖化反応の効率が著しく低下し、１００℃より高いと糖化酵素が失活する虞があり、好ましくない。　
　なお、セルロース又はヘミセルロースを含有するセルロース系バイオマスの前処理は、公知の範囲により行えばよい。一般には、カッターミル等による物理的な粉砕、及び酸又はアルカリ処理によってリグニンとセルロース及びヘミセルロースとの構造を化学的に破壊することにより、糖化反応用原料とすればよい。　
　糖化反応液を作製する際に、糖化酵素が分散している反応液にシリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）を添加してもよく、シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）が分散している反応液に糖化酵素を添加してもよい。シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）を同時に添加してもよいし、別々に添加してもよく、糖化反応効率が低下しなければ添加順序は問わない。その際、化合物（Ａ）を粉末状態で添加してもよいし、溶液状態で添加してもよい。また、本発明の効果を阻害しない範囲であれば、ｐＨ調整剤等のその他の添加剤は任意の順序で添加することができる。　
　以上で説明した通り、本発明の糖化反応液は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を原料に、糖化酵素組成物である、糖化酵素、シリカ及び一般式（１）で表される多価アルコール化合物及びその誘導体、及び一般式（２）で表されるアセチレングリコール及びそのアルキレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）を含有することで得られる。この糖化反応液において、メカニズムは明らかでないが、シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）を併用させることで、セルロース又はヘミセルロースの糖化をより促進させることができる。　
　また、本発明の糖化反応液は、シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）の併用により、糖化酵素の使用量を減少させることができるので、コスト性にも優れている。　
　本発明で得られた糖を使用して、エタノール発酵を行う発酵微生物によりエタノール発酵させてエタノールを得ることもできる。糖を得た後に、エタノール発酵を行う発酵微生物を添加し、エタノール発酵させてエタノールを得てもよいし、前記糖化反応液を用いて糖を得る工程にエタノール発酵を行う発酵微生物を添加して、糖の製造とエタノール発酵とを同時に行い、エタノールを得てもよい。　
　本発明の発酵微生物は、酵母、カビ、細菌等が挙げられる。これらの中でも特に、酵母又は細菌であることが好ましい。また、これらの発酵微生物は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。用いられる発酵微生物としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属等に属する微生物が挙げられる。　
　エタノール発酵を行う際の好ましい発酵温度は１５℃以上、３５℃以下であり、２８℃以上、３２℃以下とするのがより好ましい。一般的に、発酵温度が１５℃より低いと発酵微生物の活動が活発でなくなるためエタノール発酵の効率が著しく低下し、また、３５℃より高いと発酵微生物が死滅する虞があり、好ましくない。　
　また、本発明のエタノール発酵を行う発酵微生物によるエタノールの製造方法は、シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）の併用により、エタノール発酵を行う際の好ましい発酵温度でも効率的に糖化酵素により糖を得ることができるため、得られる糖を利用したエタノール発酵も効率的に行うことが出来る。一般的には、糖を得る反応温度がエタノールを得る発酵温度よりも高いため、エタノール発酵工程の前に反応液を冷却する必要があり、エネルギーの浪費が生じるが、本発明の方法によれば、糖を得る反応温度とエタノールを得る発酵温度を同じ温度範囲とすることができ、エネルギーの浪費を避けることが出来るため、効率的である。
　以下、実施例に基づいて更に詳述するが、本発明はこの実施例により何ら限定されるものではない。　
　［１．シリカ又はシリカ含有物質としてシリカを用いた糖の製造］
　（１－１．平均一次粒子径）
　シリカの平均一次粒子径は、以下の測定装置を用いて測定した。
　　窒素吸着法測定装置：Ｍｏｎｏｓｏｒｂ　ＭＳ－１６（カンタクローム・インスツルメンツ・ジャパン合同会社製）
　（１－２．セルラーゼ水溶液）
　以下の手順で、セルラーゼ水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中に、所定量の混合セルラーゼの粉末を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら溶解してセルラーゼ水溶液を得た。なお、糖化酵素であるセルラーゼとしては、ｐＨ３以上、ｐＨ６以下の範囲で至適な酵素活性を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ；Ｔ．　ｒｅｅｓｅｉ）属由来のセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ；Ａ．　ｎｉｇｅｒ）属由来のセルラーゼ（ＭＰ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を７：３（ｗ／ｗ）の割合で混合した混合セルラーゼを用いた。　
　（１－３．糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、糖化酵素水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、及び１－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表１に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）の糖化酵素水溶液をそれぞれ得た。これらの糖化酵素水溶液を、比較サンプル１～比較サンプル３とした。各比較サンプルの糖化酵素濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＣＢＢ法）を用い、ＢＳＡ（商品名：タンパク質標準物質、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）のタンパク質濃度に換算して算出した。糖化酵素濃度算出の具体的な手順は以下の通りである。　
　セル長１０ｍｍのディスポーザブルセルに、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（５倍濃縮）（ナカライテスク株式会社製）を脱イオン交換水で５倍に希釈したものを２．５ｍＬ添加し、次いで、各比較サンプル１～３を０．０５ｍＬ添加し、密栓して混合溶液とした。この混合溶液を、上下反転を繰り返し均一に混合した。その後、３０分間静定し、分光光度計ＵＶ－３１５０（株式会社島津製作所製）を用い、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。既知のＢＳＡのタンパク質濃度の試料を作製し、同様に吸光度を測定して検量線を作成した。得られた検量線から糖化酵素濃度を算出した。なお、トリコデルマ・リーゼイ属由来のセルラーゼの粉末１ｇ中には０．２７ｇのタンパク質が含有していた。また、アスペルギルス・ニガー属由来のセルラーゼの粉末１ｇ中には０．０６ｇのタンパク質が含有していた。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　（１－４．糖化酵素組成物）
　以下の手順で、糖化酵素組成物を作製した。
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカとして水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：３５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．１、シリカ濃度４０質量％）、化合物（Ａ）としてトリプロピレングリコール、及び１－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表２に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、シリカ濃度及び化合物（Ａ）濃度の糖化酵素組成物をそれぞれ得た。これらの糖化酵素組成物を、サンプル１～サンプル８とした。なお、下記表２に示したサンプル１～サンプル８の各構成成分の濃度は、糖化酵素組成物中の濃度である。　
　また、化合物（Ａ）として多価アルコール化合物、多価アルコール化合物の誘導体又はアセチレングリコールのアルキレンオキサイド付加物を用いたこと以外は、サンプル１～サンプル８と同様にして、糖化酵素組成物をそれぞれ作製した。これらの糖化酵素組成物を、下記表２に示したサンプル９～サンプル２０とした。なお、下記表２に示したサンプル９～サンプル２０の各構成成分の濃度は、糖化酵素組成物中の濃度である。　
　なお、下記表２における化合物（Ａ）の種類Ａ～Ｍは、以下に示した通りである。
　　Ａ：トリプロピレングリコール
　　Ｂ：エチレングリコール
　　Ｃ：ポリエチレングリコール（平均分子量２００）
　　Ｄ：プロピレングリコール
　　Ｅ：ジプロピレングリコール
　　Ｆ：ポリプロピレングリコール（平均分子量２５０）
　　Ｇ：ポリプロピレングリコール（平均分子量７００）
　　Ｈ：ポリプロピレングリコール（平均分子量１０００）
　　Ｉ：プロピレングリコールモノメチルエーテル
　　Ｊ：１，３－ブタンジオール
　　Ｋ：グリセリン
　　Ｌ：２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）
　　　　（日信化学工業株式会社製、サーフィノール４６５）
　　Ｍ：２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝３０）
　　　　（日信化学工業株式会社製、サーフィノール４８５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　（１－５．トリプロピレングリコール含有糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、化合物（Ａ）としてトリプロピレングリコールを用いたトリプロピレングリコール含有糖化酵素水溶液を作製した。　
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、トリプロピレングリコール、及び１－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表３に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及びトリプロピレングリコール濃度のトリプロピレングリコール含有糖化酵素水溶液をそれぞれ得た。これらのトリプロピレングリコール含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル４～比較サンプル１１とした。なお、下記表３に示した比較サンプル４～比較サンプル１１の各構成成分の濃度は、トリプロピレングリコール含有糖化酵素水溶液中の濃度である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　（１－６．シリカ含有糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、シリカ含有糖化酵素水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカとして水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径粒子径：３５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．１、シリカ濃度４０質量％）、及び１－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表４に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及びシリカ濃度のシリカ含有糖化酵素水溶液をそれぞれ得た。これらのシリカ含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル１２～比較サンプル１４とした。なお、下記表４に示した比較サンプル１２～比較サンプル１４の各構成成分の濃度は、シリカ含有糖化酵素水溶液中の濃度である。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　（１－７．糖化反応液）
　サンプル１～サンプル２０の糖化酵素組成物に、微結晶セルロース粉末を添加し、分散させて各サンプルを用いた糖化反応液とした。具体的な手順は以下の通りである。　
　まず、１３．５ｍＬのガラス瓶に各サンプルを１０ｍＬ入れ、４ｍｍφ×１０ｍｍのスターラーで撹拌した状態で、微結晶セルロース粉末（結晶型：Ｉ型、商品名：Ａｖｉｃｅｌ　ＰＨ－１０１、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）を０．０５ｇ（５ｍｇ／ｍＬ相当）添加した後に密栓した。　
　また、比較サンプル１～比較サンプル３の糖化酵素水溶液、比較サンプル４～比較サンプル１１のトリプロピレングリコール含有糖化酵素水溶液、及び比較サンプル１２～比較サンプル１４のシリカ含有糖化酵素水溶液を用いたこと以外は、サンプル１～サンプル２０の糖化酵素組成物と同様にして、各比較サンプルの糖化反応液を得た。　
　（１－８．糖の製造）
　上述の各サンプル及び各比較サンプルを用いた糖化反応液を、２５℃の恒温槽中で、撹拌下で２日間酵素反応させた。この酵素反応により、糖（グルコース）を得た。　
　（１－９．グルコース生成量の算出）
　（実施例１）
　酵素法（ＧＯＤ法）を用いて、サンプル１の糖化酵素組成物から得られた糖化反応液（以下、実施例１の糖化反応液という）について、１－８．の酵素反応２日後のグルコース生成量を算出した。　
　２ｍＬマイクロチューブに、サンプル１の糖化反応液の試料を０．５ｍＬ採取し、１０５℃、１５分で酵素を失活させた。次に、未反応のセルロース、シリカを除去するため、絶対孔径０．１μｍのフィルターが付いた２ｍＬのマイクロチューブに試料を移し、高速冷却遠心分離機ＳＲＸ－２０１（株式会社トミー精工製）で１０，０００Ｇ、５分の条件で遠心分離し、その後、ろ液を回収した。酵素法には、グルコースＣＩＩ－テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を使用した。分光光度計ＵＶ－３１５０（株式会社島津製作所製）を用いて波長５０５ｎｍの吸光度（セル長１０ｍｍ）を測定した。具体的な手順は以下の通りである。　
　セル長１０ｍｍのディスポーザブルセルに発色試液を３．０ｍＬ添加し、次いで、上記のろ液を０．０２ｍＬ添加し、密栓して混合溶液とした。次に、この混合溶液を、上下反転を繰り返し均一に混合した。その後、２４℃で１５分間静定し、波長５０５ｎｍの吸光度を、分光光度計を用いて測定し、Ｅｓとした。次に、セル長１０ｍｍのディスポーザブルセルに発色試液を３．０ｍＬ添加し、次いで、ブドウ糖標準液ＩＩ（５００ｍｇ／ｄＬ）を０．０２ｍＬ添加し、上下反転を繰り返し均一に混合した後、２４℃で１５分間静定し、波長５０５ｎｍの吸光度を、分光光度計を用いて測定し、Ｅｓｔｄとした。ここでは、発色試液３．０ｍＬの吸光度を対照として、実施例１の糖化反応液の吸光度Ｅｓ、及びブドウ糖標準液ＩＩの吸光度Ｅｓｔｄを測定した。　
　次に、実施例１の糖化反応液のグルコース生成量（ｍｇ／ｍＬ）を、下記式（３）から求めた。その結果を下記表５に示した。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
　（実施例２～実施例２０）
　実施例１と同様にして、サンプル２～サンプル２０の糖化酵素組成物から得られた各糖化反応液（以下、実施例２～実施例２０の糖化反応液という）について、１－８．の酵素反応２日後のグルコース生成量を算出し、その結果を下記表５に示した。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　（比較例１～比較例１４）
　実施例１と同様にして、比較サンプル１～比較サンプル３の糖化酵素水溶液、比較サンプル４～比較サンプル１１のトリプロピレングリコール含有糖化酵素水溶液、及び比較サンプル１２～比較サンプル１４のシリカ含有糖化酵素水溶液から得られた各糖化反応液（以下、比較例１～比較例１４の糖化反応液という）について、１－８．の酵素反応２日後のグルコース生成量を算出し、その結果を下記表６に示した。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　（１－１０．糖化反応効率）
　上記表５及び上記表６のグルコース生成量に基づき、各糖化反応液の糖化反応効率について検討した。まず、実施例３、実施例７、実施例８、比較例１～比較例３、比較例６、及び比較例１０～比較例１４におけるグルコース生成量から、トリプロピレングリコールの添加による糖化反応効率の向上効果について検討した。　
　図１は、実施例３，７，８及び比較例１～３，６，１０～１４のトリプロピレングリコールの添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。図１に示した通り、比較例１～比較例３の糖化反応液と、比較例１２～比較例１４の糖化反応液を比較すると、セルラーゼ水溶液にシリカを添加した比較例１２～比較例１４の方がグルコース生成量が増加しており、糖化反応効率の向上が見られた。また、比較例１２～比較例１４の糖化反応液と、実施例３、実施例７、実施例８の糖化反応液を比較すると、セルラーゼ水溶液にシリカ及びトリプロピレングリコールを添加した実施例４、実施例７、実施例８の方がグルコース生成量が増加しており、更なる糖化反応効率の向上が見られた。一方、比較例１～比較例３の糖化反応液と、比較例６、比較例１０、比較例１１の糖化反応液を比較すると、セルラーゼ水溶液にトリプロピレングリコールを添加しても糖化反応効率の向上はしなかった。従って、セルロースの糖化反応において、シリカとトリプロピレングリコールを併用することによって、糖化反応効率が向上することが確認できた。　
　また、この結果より、比較例１～比較例３の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液にシリカを添加した比較例１２～比較例１４の糖化反応液において、セルラーゼの使用量を比較すると、比較例１２～比較例１４では、２０％程度の使用量を削減することができる。一方、比較例１～比較例３の糖化反応液と、シリカ及びトリプロピレングリコールを添加した実施例３、実施例７、実施例８の糖化反応液において、セルラーゼの使用量を比較すると、実施例３、実施例７、実施例８では、３０％程度の使用量の削減が期待でき、セルラーゼ水溶液にシリカを添加した場合より、糖化反応におけるセルラーゼの使用量を更に１０％程度削減することができると考えられる。　
　次に、実施例１～実施例６、比較例１、比較例４～比較例９、比較例１２におけるグルコースの生成量から、トリプロピレングリコールの添加量（トリプロピレングリコール濃度）による糖化反応効率の向上効果について検討した。
　図２は、実施例１～６及び比較例１，４～９，１２のトリプロピレングリコール濃度による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。図２に示した通り、シリカとトリプロピレングリコールの質量比率（トリプロピレングリコール／シリカ）が概ね０．０００１～１の範囲において、糖化反応効率が大幅に向上し、両者の併用効果を確認することができた。従って、この結果より、グルコース生成量は、特にトリプロピレングリコールの添加量に依存することが示唆された。なお、糖化酵素（セルラーゼ）にトリプロピレングリコールだけを組み合わせても、糖化反応効率の向上効果は見られなかった。　
　また、実施例９～実施例２０、比較例１及び比較例１２におけるグルコースの生成量から、トリプロピレングリコール以外の化合物（Ａ）である多価アルコール化合物、多価アルコール化合物の誘導体又はアセチレングリコールのアルキレンオキサイド付加物の添加による糖化反応効率の向上効果について検討した。
　図３は、実施例９～２０及び比較例１，１２の多価アルコール化合物、多価アルコール化合物の誘導体又はアセチレングリコールのアルキレンオキサイド付加物の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。図３に示した通り、実施例９～実施例２０の糖化反応液と、比較例１及び比較例１２の糖化反応液を比較すると、セルラーゼ水溶液にシリカ及び多価アルコール化合物、多価アルコール化合物の誘導体又はアセチレングリコールのアルキレンオキサイド付加物を添加した実施例９～実施例２０に糖化反応効率の向上効果が見られた。従って、セルロースの糖化反応において、シリカと化合物（Ａ）として多価アルコール化合物、多価アルコール化合物の誘導体又はアセチレングリコールのアルキレンオキサイド付加物を併用することによって、糖化反応効率が向上することが確認できた。　
　［２．市販のセルラーゼを用いた糖の製造］
　（２－１．セルラーゼ水溶液）
　Ｔ．　ｒｅｅｓｅｉ属由来のセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）及びＡ．　ｎｉｇｅｒ属由来のセルラーゼ（ＭＰ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を７：３（ｗ／ｗ）の割合で混合した混合セルラーゼから、市販のセルラーゼ（製品名：Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）　ＣＴｅｃ２、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ製）に変更した以外は、１－２．と同様にしてセルラーゼ水溶液を作製した。　
　（２－２．糖化酵素組成物）
　以下の手順で、糖化酵素組成物を作製した。
　脱イオン交換水中にｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカとして水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：８５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．３、シリカ濃度４０質量％）、化合物（Ａ）としてポリプロピレングリコール（平均分子量１０００）（以下、ＰＰＧ１０００という）、及び２－１．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表７に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、シリカ濃度及びＰＰＧ１０００濃度の糖化酵素組成物を得た。この糖化酵素組成物をサンプル２１とした。なお、下記表７に示したサンプル２１の各構成成分の濃度は、糖化酵素組成物中の濃度である。　
　（２－３．糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、糖化酵素組成物を作製した。
　脱イオン交換水中にｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、及び上述のセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表７に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）の糖化酵素水溶液を得た。この糖化酵素水溶液を比較サンプル１５とした。　
　（２－４．ポリプロピレングリコール含有糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、化合物（Ａ）として２－２．と同様のＰＰＧ１０００を用いたＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液を作製した。　
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、ＰＰＧ１０００、及び２－１．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表７に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及びＰＰＧ１０００濃度のＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液を得た。このＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル１６とした。なお、下記表７に示した比較サンプル１６の各構成成分の濃度は、ＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液中の濃度である。　
　（２－５．シリカ含有糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、シリカ含有糖化酵素水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中にｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカとして水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：８５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．３、シリカ濃度４０質量％）、及び２－１．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表７に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及びシリカ濃度のシリカ含有糖化酵素水溶液を得た。このシリカ含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル１７とした。なお、下記表７に示した比較サンプル１７の各構成成分の濃度は、シリカ含有糖化酵素水溶液中の濃度である。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　（２－６．糖化反応液）
　サンプル２１の糖化酵素組成物に、微結晶セルロース粉末を添加し、分散させて糖化反応液とした。具体的な手順は以下の通りである。　
　まず、１３．５ｍＬのガラス瓶に各サンプルを１０ｍＬ入れ、４ｍｍφ×１０ｍｍのスターラーで撹拌した状態で、微結晶セルロース粉末（結晶型：Ｉ型、商品名：Ａｖｉｃｅｌ　ＰＨ－１０１、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）を１．００ｇ（１００ｍｇ／ｍＬ相当）添加した後に密栓した。　
　また、比較サンプル１５の糖化酵素水溶液、比較サンプル１６のＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液、及び比較サンプル１７のシリカ含有糖化酵素水溶液を用いたこと以外は、サンプル２１の糖化酵素組成物と同様にして、各比較サンプルの糖化反応液を得た。　
　（２－７．糖の製造）
　上述の各サンプル及び各比較サンプルを用いた糖化反応液を、５０℃の恒温槽中で、撹拌下で３日間酵素反応させた。この酵素反応により、糖（グルコース）を得た。　
　（２－８．グルコース生成量の算出）
　（実施例２１）
　実施例１と同様にして、サンプル２１の糖化酵素組成物から得られた糖化反応液（以下、実施例２１の糖化反応液という）について、２－７．の酵素反応３日後のグルコース生成量を算出し、その結果を下記表８に示した。　
　（比較例１５～１７）
　実施例１と同様にして、比較サンプル１５の糖化酵素水溶液、比較サンプル１６のＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液、及び比較サンプル１７のシリカ含有糖化酵素水溶液から得られた糖化反応液（以下、比較例１５～１７の糖化反応液という）について、２－７．の酵素反応３日後のグルコース生成量を算出し、その結果を下記表８に示した。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　（２－８．糖化反応効率）
　上記表８のグルコース生成量に基づき、各糖化反応液の糖化反応効率について検討した。まず、実施例２１、及び比較例１５～比較例１７におけるグルコース生成量から、ＰＰＧ１０００の添加による糖化反応効率の向上効果について検討した。
　図４は、実施例２１及び比較例１５～比較例１７のＰＰＧ１０００の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。図４に示した通り、比較例１５の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液にＰＰＧ１０００を添加した比較例１６の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液にシリカを添加した比較例１７の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液にシリカ及びＰＰＧ１０００を添加した実施例２１の糖化反応液を比較すると、これらの中では、セルラーゼ水溶液にシリカ及びＰＰＧ１０００を添加した実施例２１がグルコース生成量が増加しており、糖化反応効率の向上が見られた。従って、市販のセルラーゼを用いてもシリカとＰＰＧ１０００を併用することによって、糖化反応効率が向上することが確認できた。　
　［３．シリカ又はシリカ含有物質として珪藻土を用いた糖の製造］
　（３－１．平均二次粒子径）
　珪藻土の平均二次粒子径は、以下の測定装置を用いて測定した。
　　レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置：ＬＡ－３００（株式会社堀場製作所製）
　（３－２．セルラーゼ水溶液）
　以下の手順で、セルラーゼ水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中に、所定量の混合セルラーゼの粉末を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら溶解してセルラーゼ水溶液を得た。なお、糖化酵素であるセルラーゼとしては、ｐＨ３以上、ｐＨ６以下の範囲で至適な酵素活性を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ；Ｔ．　ｒｅｅｓｅｉ）属由来のセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ；Ａ．　ｎｉｇｅｒ）属由来のセルラーゼ（ＭＰ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を７：３（ｗ／ｗ）の割合で混合した混合セルラーゼを用いた。　
　（３－３．糖化酵素組成物）
　以下の手順で、糖化酵素組成物を作製した。
　脱イオン交換水中にｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカ含有物質として珪藻土（オプライトＰ－１２００、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：１５μｍ）、化合物（Ａ）として２－２．と同様のＰＰＧ１０００、及び３－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表９に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、珪藻土濃度及びＰＰＧ１０００濃度の糖化酵素組成物を得た。この糖化酵素組成物をサンプル２２とした。なお、下記表９に示したサンプル２２の各構成成分の濃度は、糖化酵素組成物中の濃度である。　
　また、平均二次粒径が異なる珪藻土を用いたこと以外はサンプル２２と同様にして、糖化酵素組成物をそれぞれ作製した。これらの糖化酵素組成物を、下記表９に示したサンプル２３～サンプル２８とした。なお、下記表９に示したサンプル２３～サンプル２８の各構成成分の濃度は、糖化酵素組成物中の濃度である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　なお、上記表９における珪藻土の種類Ｎ～Ｓは、以下に示した通りである。
　　Ｎ：オプライトＰ－１２００、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：１５μｍ
　　Ｏ：シリカ＃１００Ｆ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：１９μｍ
　　Ｐ：シリカ＃３００Ｓ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：１９μｍ
　　Ｑ：シリカ＃６００Ｓ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：３０μｍ
　　Ｒ：シリカ＃６００Ｈ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：３８μｍ
　　Ｓ：シリカクイーンＬ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：２５μｍ
　（３－４．糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、糖化酵素組成物を作製した。
　脱イオン交換水中にｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、及び３－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表１０に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）の糖化酵素水溶液を得た。この糖化酵素水溶液を比較サンプル１８とした。　
　（３－５．ＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、化合物（Ａ）としてＰＰＧ１０００を用いたＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、ＰＰＧ１０００、及び３－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表１０に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及びＰＰＧ１０００濃度のＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液を得た。このＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル１９とした。なお、下記表１０に示した比較サンプル１９の各構成成分の濃度は、ＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液中の濃度である。　
　（３－６．珪藻土含有糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、珪藻土含有糖化酵素水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中にｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカ含有物質として珪藻土（オプライトＰ－１２００、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：１５μｍ）、及び３－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表１０に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及び珪藻土濃度の珪藻土含有糖化酵素水溶液を得た。この珪藻土含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル２０とした。なお、下記表１０に示した比較サンプル２０の各構成成分の濃度は、珪藻土含有糖化酵素水溶液中の濃度である。　
　また、平均二次粒径が異なる珪藻土を用いたこと以外は比較サンプル２０と同様にして、珪藻土含有糖化酵素水溶液をそれぞれ作製した。これらの糖化酵素組成物を、下記表１０に示した比較サンプル２１～比較サンプル２６とした。なお、下記表１０に示した比較サンプル２１～比較サンプル２６の各構成成分の濃度は、珪藻土含有糖化酵素水溶液中の濃度である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　なお、上記表１０における珪藻土の種類Ｎ～Ｓは、以下に示した通りである。
　　Ｎ：オプライトＰ－１２００、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：１５μｍ
　　Ｏ：シリカ＃１００Ｆ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：１９μｍ
　　Ｐ：シリカ＃３００Ｓ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：１９μｍ
　　Ｑ：シリカ＃６００Ｓ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：３０μｍ
　　Ｒ：シリカ＃６００Ｈ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：３８μｍ
　　Ｓ：シリカクイーンＬ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：２５μｍ
　（３－７．糖化反応液）
　サンプル２２～サンプル２８の糖化酵素組成物に、微結晶セルロース粉末を添加し、分散させて糖化反応液とした。具体的な手順は以下の通りである。　
　まず、１３．５ｍＬのガラス瓶に各サンプルを１０ｍＬ入れ、４ｍｍφ×１０ｍｍのスターラーで撹拌した状態で、微結晶セルロース粉末（結晶型：Ｉ型、商品名：Ａｖｉｃｅｌ　ＰＨ－１０１、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）を０．５０ｇ（５０ｍｇ／ｍＬ相当）添加した後に密栓した。　
　また、比較サンプル１８の糖化酵素水溶液、比較サンプル１９のＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液、及び比較サンプル２０～比較サンプル２６の珪藻土含有糖化酵素水溶液を用いたこと以外は、サンプル２１～サンプル２８の糖化酵素組成物と同様にして、各比較サンプルの糖化反応液を得た。　
　（３－８．糖の製造）
　上述の各サンプル及び各比較サンプルを用いた糖化反応液を、４０℃の恒温槽中で、撹拌下で３日間酵素反応させた。この酵素反応により、糖（グルコース）を得た。　
　（３－９．グルコース生成量の算出）
　（実施例２２～実施例２８）
　実施例１と同様にして、サンプル２２～サンプル２８の糖化酵素組成物から得られた糖化反応液（以下、実施例２２～実施例２８の糖化反応液という）について、３－８．の酵素反応３日後のグルコース生成量を算出し、その結果を下記表１１に示した。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　（比較例１８～２６）
　実施例１と同様にして、比較サンプル１８の糖化酵素水溶液、比較サンプル１９のＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液、及び比較サンプル２０～比較サンプル２６の珪藻土含有糖化酵素水溶液から得られた糖化反応液（以下、比較例１８～比較例２６の糖化反応液という）について、３－８．の酵素反応３日後のグルコース生成量を算出し、その結果を下記表１２に示した。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　（３－１０．糖化反応効率）
　上記表１１及び上記表１２のグルコース生成量に基づき、各糖化反応液の糖化反応効率について検討した。まず、実施例２２～実施例２８、及び比較例１８～比較例２６におけるグルコース生成量から、ＰＰＧ１０００の添加による糖化反応効率の向上効果について検討した。
　図５は、実施例２２～実施例２８、及び比較例１８～比較例２６のＰＰＧ１０００の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。図５に示した通り、比較例１８の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液にＰＰＧ１０００を添加した比較例１９の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液に珪藻土を添加した比較例２０～比較例２６の糖化反応液、セルラーゼ水溶液に珪藻土及びＰＰＧ１０００を添加した実施例２２～実施例２８の糖化反応液を比較すると、セルラーゼ水溶液に珪藻土及びＰＰＧ１０００を添加した実施例２２～実施例２８の方がグルコース生成量が増加しており、糖化反応効率の向上が見られた。従って、セルロースの糖化反応において、シリカ含有物質として珪藻土を用い、更にＰＰＧ１０００を併用することによって、糖化反応効率が向上することが確認できた。　
　［４．シリカ又はシリカ含有物質として珪砂を用いた糖の製造］
　（４－１．平均一次粒子径）
　珪砂の平均一次粒子径は、以下の測定装置を用いて測定した。測定の際には、観察倍率５０倍で粒子を１００個観察し、長軸の長さを算術平均した値を用いた。
　　金属顕微鏡：ＥＣＬＩＰＳＥ　ＭＥ６００Ｄ（株式会社ニコンインステック製）
　（４－２．セルラーゼ水溶液）
　以下の手順で、セルラーゼ水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中に、所定量の混合セルラーゼの粉末を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら溶解してセルラーゼ水溶液を得た。なお、糖化酵素であるセルラーゼとしては、ｐＨ３以上、ｐＨ６以下の範囲で至適な酵素活性を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ；Ｔ．　ｒｅｅｓｅｉ）属由来のセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ；Ａ．　ｎｉｇｅｒ）属由来のセルラーゼ（ＭＰ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を７：３（ｗ／ｗ）の割合で混合した混合セルラーゼを用いた。　
　（４－３．糖化酵素組成物）
　以下の手順で、糖化酵素組成物を作製した。
　脱イオン交換水中にｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカ含有物質として珪砂（５号、株式会社トーヨーマテラン製、シリカ含有率：９５質量％、平均一次粒子径：３１０μｍ）、化合物（Ａ）として２－２．と同様のＰＰＧ１０００、及び４－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表１３に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、珪砂濃度及びＰＰＧ１０００濃度の糖化酵素組成物を得た。この糖化酵素組成物をサンプル２９とした。なお、下記表１３に示したサンプル２９の各構成成分の濃度は、糖化酵素組成物中の濃度である。　
　また、化合物（Ａ）として２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）を用いたこと以外は、サンプル２９と同様にして、糖化酵素組成物を作製した。この糖化酵素組成物を、下記表１３に示したサンプル３０とした。なお、下記表１３に示したサンプル３０の各構成成分の濃度は、糖化酵素組成物中の濃度である。　
　（４－４．化合物（Ａ）含有糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、化合物（Ａ）としてＰＰＧ１０００を用いたＰＰＧ１０００含有糖化酵素水溶液を作製した。　
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、ＰＰＧ１０００、及び４－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表１３に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及びＰＰＧ１０００濃度の化合物（Ａ）含有糖化酵素水溶液を得た。この化合物（Ａ）含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル２７とした。なお、下記表１３に示した比較サンプル２７の各構成成分の濃度は、化合物（Ａ）含有糖化酵素水溶液中の濃度である。　
　また、化合物（Ａ）として２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）を用いたこと以外は、比較サンプル２７と同様にして、化合物（Ａ）含有糖化酵素水溶液を作製した。この化合物（Ａ）含有糖化酵素水溶液を、下記表１３に示した比較サンプル２８とした。なお、下記表１３に示した比較サンプル２８の各構成成分の濃度は、化合物（Ａ）含有糖化酵素水溶液中の濃度である。　
　（４－５．珪砂含有糖化酵素水溶液）
　以下の手順で、珪砂含有糖化酵素水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中にｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカ含有物質として珪砂（５号、トーヨーマテラン株式会社製、シリカ含有率：９５質量％、平均一次粒子径：３１０μｍ）、及び４－２．で得られたセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表１３に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及び珪砂濃度の珪砂含有糖化酵素水溶液を得た。この珪砂含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル２９とした。なお、下記表１３に示した比較サンプル２９の各構成成分の濃度は、珪砂含有糖化酵素水溶液中の濃度である。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　なお、上記表１３における化合物（Ａ）の種類Ｕ及びＶは、以下に示した通りである。
　　Ｕ：ポリプロピレングリコール（平均分子量１０００）
　　Ｖ：２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）
　　　　（日信化学工業株式会社製サーフィノール４６５）
　（４－６．糖化反応液）
　サンプル２９，３０の糖化酵素組成物、比較サンプル２７，２８の化合物（Ａ）含有糖化酵素水溶液及び比較サンプル２９の珪砂含有糖化酵素水溶液を用いたこと以外は、サンプル１～サンプル１８の糖化酵素組成物と同様にして、サンプル２９，サンプル３０及び比較サンプル２７～比較サンプル２９の糖化反応液を得た。　
　（４－７．糖の製造）
　実施例１と同様にして、上述の各サンプル及び各比較サンプルを用いた糖化反応液を、２５℃の恒温槽中で、撹拌下で２日間酵素反応させた。この酵素反応により、糖（グルコース）を得た。　
　（４－８．グルコース生成量の算出）
　（実施例２９，実施例３０）
　実施例１と同様にして、サンプル２９及びサンプル３０の糖化酵素組成物から得られた糖化反応液（以下、実施例２９，３０の糖化反応液という）について、４－７．の酵素反応２日後のグルコース生成量を算出し、これらの結果を下記表１４に示した。　
　（比較例２７～２９）
　実施例１と同様にして、比較サンプル２７及び比較サンプル２８の化合物（Ａ）含有糖化酵素水溶液及び比較サンプル２９の珪砂含有糖化酵素水溶液から得られた糖化反応液（以下、比較例２７～２９の糖化反応液という）について、４－７．酵素反応２日後のグルコース生成量を算出し、これらの結果を下記表１４に示した。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　（４－９．糖化反応効率）
　上記表１４のグルコース生成量に基づき、各糖化反応液の糖化反応効率について検討した。まず、実施例２９、実施例３０、及び比較例１、比較例２７～比較例２９におけるグルコース生成量から、ＰＰＧ１０００又は２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物の添加による糖化反応効率の向上効果について検討した。
　図６は、実施例２９，３０及び比較例１，２７～２９のＰＰＧ１０００又は２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。図６に示した通り、比較例１の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液にＰＰＧ１０００又は２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物を添加した比較例２７、比較例２８の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液に珪砂を添加した比較例２９の糖化反応液、セルラーゼ水溶液に珪砂及びＰＰＧ１０００、又は珪砂及び２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物を添加した実施例２９、実施例３０の糖化反応液を比較すると、これらの中では、セルラーゼ水溶液に珪砂及びＰＰＧ１０００又は珪砂及び２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物を添加した実施例２９、実施例３０がグルコース生成量が増加しており、糖化反応効率の向上が見られた。従って、セルロースの糖化反応において、シリカ含有物質として珪砂を用い、更にＰＰＧ１０００又は２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物を併用することによって、糖化反応効率が向上することが確認できた。　
　［５．糖を用いたエタノールの製造］
　（５－１．酵母水溶液）
　以下の手順で、酵母水溶液を作製した。
　予め３５℃に調整した脱イオン交換水４０ｇ中に酵母の粉末０．２ｇを添加し、３５℃に保持したままマグネティックスターラーを用いて、２０分間撹拌させながら溶解して０．５質量％（＝酵母粉末０．２ｇ／脱イオン交換水４０ｇ）の酵母水溶液を得た。なお、酵母としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＹＰ２（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）を用いた。　
　（５－２．エタノール発酵水溶液）
　以下の手順で、エタノール発酵水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的にｐＨ５前後になるよう硫酸、窒素源として最終的に０．２１ｍｇ／ｍＬとなるよう尿素、１－２．で得られたセルラーゼ水溶液及び５－１．で得られた酵母水溶液を添加し、室温下、マグネティックスターラーで、１０分間回転させながら混合して、下記表１５に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及び酵母濃度のエタノール発酵水溶液を得た。このエタノール発酵水溶液を比較サンプル３０とした。　
　（５－３．エタノール発酵組成物）
　以下の手順で、エタノール酵素組成物を作製した。
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的にｐＨ５前後になるよう硫酸、窒素源として最終的に０．２１ｍｇ／ｍＬとなるよう尿素、シリカ含有物質として水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：８５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．５、シリカ濃度４０質量％）、化合物（Ａ）として２－２．と同様のＰＰＧ１０００、１－２．で得られたセルラーゼ水溶液及び５－１．で得られた酵母水溶液を添加し、室温下、マグネティックスターラーで、１０分間回転させながら混合して、下記表１５に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、シリカ濃度、ＰＰＧ１０００濃度、及び酵母濃度のエタノール発酵組成物を得た。このエタノール発酵組成物をサンプル３１とした。なお、下記表１５に示したサンプル３１の各構成成分の濃度は、エタノール発酵組成物中の濃度である。　
　（５－４．ＰＰＧ１０００含有エタノール発酵水溶液）
　以下の手順で、ＰＰＧ１０００含有エタノール発酵水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的にｐＨ５前後になるよう硫酸、窒素源として最終的に０．２１ｍｇ／ｍＬとなるよう尿素、化合物（Ａ）としてＰＰＧ１０００、１－２．で得られたセルラーゼ水溶液及び５－１．で得られた酵母水溶液を添加し、室温下、マグネティックスターラーで、１０分間回転させながら混合して、下記表１５に示した糖化酵素濃度、ＰＰＧ１０００濃度、及び酵母濃度のＰＰＧ１０００含有エタノール発酵水溶液を得た。このＰＰＧ１０００含有エタノール発酵水溶液を比較サンプル３１とした。なお、下記表１５に示した比較サンプル３１の各構成成分の濃度は、ＰＰＧ１０００含有エタノール発酵水溶液中の濃度である。　
　（５－５．シリカ含有エタノール発酵水溶液）
　以下の手順で、シリカ含有エタノール発酵水溶液を作製した。
　脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的にｐＨ５前後になるよう硫酸、窒素源として最終的に０．２１ｍｇ／ｍＬとなるよう尿素、シリカとして水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径粒子径８５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．５、シリカ濃度４０質量％）、１－２．で得られたセルラーゼ水溶液及び５－１．で得られた酵母水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表１５に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、シリカ濃度、及び酵母濃度のシリカ含有エタノール発酵水溶液を得た。このシリカ含有エタノール発酵水溶液を、比較サンプル３２とした。なお、下記表１５に示した比較サンプル３２の各構成成分の濃度は、シリカ含有エタノール発酵水溶液中の濃度である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　（５－６．糖化反応及びエタノール発酵液）
　サンプル３１のエタノール発酵組成物に、微結晶セルロース粉末を添加し、分散させてサンプル３１を用いた糖化反応及びエタノール発酵液とした。具体的な手順は以下の通りである。　
　まず、１３．５ｍＬのガラス瓶にサンプル３１を１０ｍＬ入れ、４ｍｍφで１０ｍｍのスターラーで撹拌した状態で、微結晶セルロース粉末（結晶型：Ｉ型、商品名：Ａｖｉｃｅｌ　ＰＨ－１０１、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ製）を０．２０ｇ（２０ｍｇ／ｍＬ相当）添加した後に、絶対孔径０．２２μｍの疎水性ＰＴＥＦ製メンブレンフィルターを付けたシリコン栓で栓をした。　
　また、比較サンプル３０のエタノール発酵水溶液、比較サンプル３１のＰＰＧ１０００含有エタノール発酵水溶液、及び比較サンプル３２のシリカ含有物質含有エタノール発酵水溶液を用いたこと以外は、サンプル３１のエタノール発酵組成物と同様にして、各比較サンプルの糖化反応及びエタノール発酵液を得た。　
　（５－７．エタノールの製造）
　上述の各サンプル及び各比較サンプルを用いた糖化反応及びエタノール発酵液を、３１℃の恒温槽中で、撹拌下で２日間それぞれ酵素反応及びエタノール発酵を同時にさせた。この酵素反応により得られた糖（グルコース）を用いてエタノール発酵させ、エタノールを得た。　
　（５－８．エタノール生成量の算出）
　（実施例３１）
　ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）を用いて、サンプル３１のエタノール発酵組成物から得られた糖化反応及びエタノール発酵液（以下、実施例３１の糖化反応及びエタノール発酵液という）の酵素反応及びエタノール発酵後のエタノール生成量を算出した。　
　２ｍＬマイクロチューブに、実施例３１の糖化反応及びエタノール発酵液の試料を０．５ｍＬ採取し、１０５℃、１５分で酵素及び酵母を失活させた。次に、未反応のセルロース、シリカ含有物質及び酵母を除去するため、高速冷却遠心分離機ＳＲＸ－２０１（株式会社トミー精工製）で１５，０００Ｇ、３０分の条件で遠心分離し、その後、上澄み液を回収した。エタノール生成量の定量には、ガスクロマトグラフＧＣ－２０１４ｓ（株式会社島津製作所製）を用いて１点検量線法で測定し、エタノール生成量（ｍｇ／ｍＬ）の測定結果を下記表１６に示した。　
　具体的な分析条件は以下の通りである。
　　＜分析条件＞
　　　カラム：ポーラパックＱ、長さ１ｍ、内径３．２ｍｍ（ジーエルサイエンス株式会社製）
　　　検出器：ＦＩＤ
　　　カラム温度：１５０℃
　　　流量：４０ｍＬ／ｍｉｎ
　　　サンプル量：２μＬ
　　　検量線用標品：エタノール１０ｍｇ／ｍＬ水溶液
　（比較例３０～比較例３２）
　実施例３１と同様にして、比較サンプル３０のエタノール発酵水溶液、比較サンプル３１のＰＰＧ１０００含有エタノール発酵水溶液、及び比較サンプル３２のシリカ含有物質含有エタノール発酵水溶液から得られた各糖化反応及び各エタノール発酵液（以下、比較例３０～比較例３２の糖化反応及びエタノール発酵液という）について、５－７．の糖化反応及びエタノール発酵２日後のエタノール生成量を算出し、その結果を下記表１６に示した。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　（５－９．エタノール発酵効率）
　上記表１６のエタノール生成量に基づき、各糖化反応及びエタノール発酵液のエタノール発酵効率について検討した。実施例３１及び比較例３０～比較例３２におけるエタノール生成量から、ＰＰＧ１０００の添加による糖化反応効率の向上効果について検討した。
　図７は、実施例３１及び比較例３０～３２のＰＰＧ１０００の添加によるエタノール発酵効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。図７に示した通り、比較例３０、比較例３２の糖化反応及びエタノール発酵液を比較すると、セルラーゼ水溶液及び酵母水溶液にシリカを添加した比較例３２の方がエタノール生成量は増加しており、エタノール生成効率の向上が見られた。また、実施例３１及び比較例３２の糖化反応及びエタノール発酵液を比較すると、セルラーゼ水溶液及び酵母水溶液にシリカ及びＰＰＧ１０００を添加した実施例３１の方がエタノール生成量が増加しており、更なるエタノール生成効率の向上が見られた。一方、比較例３０、比較例３１の糖化反応及びエタノール発酵液を比較すると、セルラーゼ水溶液及び酵母水溶液にＰＰＧ１０００を添加してもエタノール生成効率の向上はしなかった。従って、セルロースの糖化反応及びエタノール発酵において、シリカ含有物質とＰＰＧ１０００を併用することによって、エタノール生成効率が向上することが確認できた。
　本発明は、セルロース又はヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスからグルコースといった糖を生成する糖化技術が適用される産業分野、例えば、セルロース系バイオエタノールの製造等で利用することができる。

Claims (22)

  1. 　セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液であって、前記セルロース及び前記ヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）で表される多価アルコール化合物及びその誘導体、及び下記一般式（２）で表されるアセチレングリコール及びそのアルキレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有することを特徴とする糖化反応液。　　
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［一般式（１）中のＲ１は炭素数１以上９以下の直鎖アルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アミノ基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、炭素数１以上６以下のアルコキシ基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、フェニル基、ベンジル基、ホスホリル基又はメルカプト基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、フェニル基、ベンジル基又はホスホリル基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。また繰り返し単位ｎは１以上５００以下を満たす。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［一般式（２）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、主鎖の炭素数が１以上１０以下の飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を表し、前記アルキル基又はアルケニル基は更に置換基を有していてもよい。またＡ１及びＡ２は各々独立して、主鎖の炭素数が２以上４以下の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキサイド基（ただしアルキレンオキサイド基の片末端の酸素原子は水素原子に結合し、片末端の炭素原子は酸素原子に結合するものとする）を表し、アルキレンオキサイド単位の付加モル数ｍ及びｎは総和で０以上５０以下を満たす。］
  2. 　前記シリカ含有物質は、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする請求項１に記載の糖化反応液。
  3. 　前記シリカ又は前記シリカ含有物質中のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．０００１以上、１以下であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の糖化反応液。
  4. 　前記多価アルコール化合物は、２価アルコール、３価アルコール及び４価アルコールのモノマー、ジオマー及びトリゴマー、並びにポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の糖化反応液。
  5. 　前記多価アルコール化合物の誘導体は、多価アルコールエーテル類及びポリアルキレングリコールエーテル類からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の糖化反応液。
  6. 　前記化合物（Ａ）は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、グリセロール、ペンタエリトリトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール１－モノメチルエーテル、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝３０）からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載の糖化反応液。
  7. 　セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化酵素組成物であって、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）で表される多価アルコール化合物及びその誘導体、及び下記一般式（２）で表されるアセチレングリコール及びそのアルキレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有し、前記シリカ又は前記シリカ含有物質中のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．０００１以上、１以下であることを特徴とする糖化酵素組成物。　　
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［一般式（１）中のＲ１は炭素数１以上９以下の直鎖アルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アミノ基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、炭素数１以上６以下のアルコキシ基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、フェニル基、ベンジル基、ホスホリル基又はメルカプト基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、フェニル基、ベンジル基又はホスホリル基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。また繰り返し単位ｎは１以上５００以下を満たす。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［一般式（２）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、主鎖の炭素数が１以上１０以下の飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を表し、前記アルキル基又はアルケニル基は更に置換基を有していてもよい。またＡ１及びＡ２は各々独立して、主鎖の炭素数が２以上４以下の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキサイド基（ただしアルキレンオキサイド基の片末端の酸素原子は水素原子に結合し、片末端の炭素原子は酸素原子に結合するものとする）を表し、アルキレンオキサイド単位の付加モル数ｍ及びｎは総和で０以上５０以下を満たす。］
  8. 　前記シリカ含有物質は、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする請求項７に記載の糖化酵素組成物。
  9. 　前記多価アルコール化合物は、２価アルコール、３価アルコール及び４価アルコールのモノマー、ジオマー及びトリゴマー、並びにポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の糖化酵素組成物。
  10. 　前記多価アルコール化合物の誘導体は、多価アルコールエーテル類及びポリアルキレングリコールエーテル類からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項７乃至請求項９のいずれか一項に記載の糖化酵素組成物。
  11. 　前記化合物（Ａ）は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、グリセロール、ペンタエリトリトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール１－モノメチルエーテル、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝３０）からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項７乃至請求項１０のいずれか一項に記載の糖化酵素組成物。
  12. 　セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液を用いて糖を製造する糖の製造方法であって、前記セルロース及び前記ヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）で表される多価アルコール化合物及びその誘導体、及び下記一般式（２）で表されるアセチレングリコール及びそのアルキレンオキサイド付加物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有する糖化反応液を用いて糖を製造することを特徴とする糖の製造方法。　　
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［一般式（１）中のＲ１は炭素数１以上９以下の直鎖アルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アミノ基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、炭素数１以上６以下のアルコキシ基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、フェニル基、ベンジル基、ホスホリル基又はメルカプト基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、アシル基、アセチル基、アミド基、アリル基、アリール基、アルデヒド基、炭素数１以上６以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１以上６以下のアルキレン基、炭素数１以上６以下のアルケニル基、カルバモイル基、カルボキシル基、シアノ基、スルホ基、スルホニル基、トシル基、フェニル基、ベンジル基又はホスホリル基を表し、これらの基は更に置換基を有していてもよい。また繰り返し単位ｎは１以上５００以下を満たす。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［一般式（２）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、主鎖の炭素数が１以上１０以下の飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を表し、前記アルキル基又はアルケニル基は更に置換基を有していてもよい。またＡ１及びＡ２は各々独立して、主鎖の炭素数が２以上４以下の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキサイド基（ただしアルキレンオキサイド基の片末端の酸素原子は水素原子に結合し、片末端の炭素原子は酸素原子に結合するものとする）を表し、アルキレンオキサイド単位の付加モル数ｍ及びｎは総和で０以上５０以下を満たす。］
  13. 　前記シリカ含有物質は、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする請求項１２に記載の糖の製造方法。
  14. 　前記シリカ又は前記シリカ含有物質中のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．０００１以上、１以下であることを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載の糖の製造方法。
  15. 　前記多価アルコール化合物は、２価アルコール、３価アルコール及び４価アルコールのモノマー、ジオマー及びトリゴマー、並びにポリアルキレングリコールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１２乃至請求項１４のいずれか一項に記載の糖の製造方法。
  16. 　前記多価アルコール化合物の誘導体は、多価アルコールエーテル類及びポリアルキレングリコールエーテル類からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１２乃至請求項１５のいずれか一項に記載の糖の製造方法。
  17. 　前記化合物（Ａ）は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、グリセロール、ペンタエリトリトール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール１－モノメチルエーテル、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝１０）、２，４，７，９－テトラメチル－５－デシン－４，７－ジオールのエチレンオキサイド付加物（エチレンオキサイド付加モル数ｍ＋ｎ＝３０）からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１２乃至請求項１６のいずれか一項に記載の糖の製造方法。
  18. 　請求項１２乃至請求項１７のいずれか一項に記載の糖の製造方法により得られた糖を用いて、発酵微生物によるエタノール発酵を行い、エタノールを製造することを特徴とするエタノールの製造方法。
  19. 　糖を製造する工程に発酵微生物を添加して、糖の製造とエタノール発酵とを同時に行うことを特徴とする請求項１８に記載のエタノールの製造方法。
  20. 　前記発酵微生物は、酵母、カビ又は細菌であることを特徴とする請求項１８又は請求項１９に記載のエタノールの製造方法。
  21. 　前記発酵微生物は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属又はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物であることを特徴とする請求項２０に記載のエタノールの製造方法。
  22. 　エタノール発酵を１５℃以上、３５℃以下で行うことを特徴とする請求項１８乃至請求項２１のいずれか一項に記載のエタノールの製造方法。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3947580A4 (en) * 2019-03-25 2022-12-14 CMC Materials, Inc. ADDITIVES TO IMPROVE PARTICLE DISPERSION FOR CMP SLURRY

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5858078B2 (ja) 1981-12-11 1983-12-23 工業技術院長 セルロ−スの糖化法
JPS632595B2 (ja) 1977-09-01 1988-01-19 Cpc International Inc
JPS6321475B2 (ja) 1983-11-02 1988-05-07 Kitsukooman Kk
JPH1066594A (ja) 1996-08-27 1998-03-10 Bio Star:Kk 植物繊維を用いたグルコースの製造方法
JPH11506934A (ja) * 1995-06-07 1999-06-22 アーケノール，インコーポレイテッド 強酸加水分解法
JP2006136263A (ja) 2004-11-12 2006-06-01 National Institute Of Advanced Industrial & Technology リグノセルロース系バイオマス処理方法
JP2006333749A (ja) * 2005-05-31 2006-12-14 National Institute Of Advanced Industrial & Technology エタノール製造方法、製造装置及びそれに用いるエタノール吸着材料
JP2009125006A (ja) 2007-11-24 2009-06-11 National Institute Of Advanced Industrial & Technology シリカ系メソ多孔体−セルロース、ヘミセルロースの加水分解酵素複合体
JP2009153448A (ja) * 2007-12-26 2009-07-16 National Institute Of Advanced Industrial & Technology シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体
JP2012075379A (ja) * 2010-09-30 2012-04-19 San Nopco Ltd 加水分解用助剤及びこれを用いた糖質の加水分解方法
JP2013215187A (ja) * 2012-03-15 2013-10-24 Kao Corp 糖の製造方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007144975A (ja) * 2005-10-26 2007-06-14 Ricoh Co Ltd インクジェット記録メディア及び記録方法
WO2010138347A1 (en) * 2009-05-26 2010-12-02 The Procter & Gamble Company Aqueous liquid composition for pre-treating soiled dishware
WO2011046816A1 (en) * 2009-10-12 2011-04-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods to improve monomeric sugar release from lignocellulosic biomass following alkaline pretreatment
CN101696427B (zh) 2009-11-03 2012-07-04 天津科技大学 用纤维物质生产燃料乙醇和2,3-丁二醇的方法
US20120261269A1 (en) * 2009-12-22 2012-10-18 Wataru Kagohashi Process for production of polysilicon and silicon tetrachloride
KR101448120B1 (ko) * 2012-12-12 2014-10-08 김남도 실리카 나노입자에 고정화된 정제되지 않은 셀룰라아제를 이용한 바이오매스의 당화율을 증진시키는 방법
US20160160252A1 (en) * 2013-07-24 2016-06-09 Edeniq, Inc. Polymers in biomass saccharification bioprocess
DK3178939T3 (da) * 2014-08-07 2020-03-23 Nissan Chemical Corp Forsukringsenzymsammensætning, forsukringsreaktionsopløsning, og fremgangsmåde til fremstilling af sukker
CN105624207A (zh) 2016-03-30 2016-06-01 辽宁石油化工大学 一种木质纤维素高温酶解发酵产乙醇的方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS632595B2 (ja) 1977-09-01 1988-01-19 Cpc International Inc
JPS5858078B2 (ja) 1981-12-11 1983-12-23 工業技術院長 セルロ−スの糖化法
JPS6321475B2 (ja) 1983-11-02 1988-05-07 Kitsukooman Kk
JPH11506934A (ja) * 1995-06-07 1999-06-22 アーケノール，インコーポレイテッド 強酸加水分解法
JPH1066594A (ja) 1996-08-27 1998-03-10 Bio Star:Kk 植物繊維を用いたグルコースの製造方法
JP2006136263A (ja) 2004-11-12 2006-06-01 National Institute Of Advanced Industrial & Technology リグノセルロース系バイオマス処理方法
JP2006333749A (ja) * 2005-05-31 2006-12-14 National Institute Of Advanced Industrial & Technology エタノール製造方法、製造装置及びそれに用いるエタノール吸着材料
JP2009125006A (ja) 2007-11-24 2009-06-11 National Institute Of Advanced Industrial & Technology シリカ系メソ多孔体−セルロース、ヘミセルロースの加水分解酵素複合体
JP2009153448A (ja) * 2007-12-26 2009-07-16 National Institute Of Advanced Industrial & Technology シリカ系メソ多孔体−澱粉の加水分解酵素複合体
JP2012075379A (ja) * 2010-09-30 2012-04-19 San Nopco Ltd 加水分解用助剤及びこれを用いた糖質の加水分解方法
JP2013215187A (ja) * 2012-03-15 2013-10-24 Kao Corp 糖の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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