WO2018044105A1 - 항체 중쇄불변부위 이종이중체 (heterodimeric Fc)에 융합된 IL-21 (heterodimeric Fc-fused IL-21) 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

항체 중쇄불변부위 이종이중체 (heterodimeric Fc)에 융합된 IL-21 (heterodimeric Fc-fused IL-21) 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체(immunoglobulin)의 중쇄불변부위 쌍의 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하고, 상기 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단 중 하나 이상의 말단에 IL-21이 결합되어 있는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)에 있어서, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 이종이중체(heterodimer)의 형성이 촉진되도록 CH3 도메인이 변이된 것임을 특징으로 하는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein) 및 상기 이종이중체-융합단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 대한 것이다. 본 발명에 따른 항체 중쇄불변부위 이종이중체-융합단백질을 이용할 경우, 상기 이종이중체-융합단백질에 포함된 IL-21의 체내 반감기가 현저하게 증가될 수 있는 장점이 있다.

Description

항체 중쇄불변부위 이종이중체 (heterodimeric Fc)에 융합된 IL-21 (heterodimeric Fc-fused IL-21) 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
본 발명은 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍의 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하고, 상기 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단 중 하나 이상의 말단에 IL-21이 결합되어 있는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)에 있어서, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 이종이중체(heterodimer)의 형성이 촉진되도록 CH3 도메인이 변이된 것임을 특징으로 하는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein) 및 상기 이종이중체-융합단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 대한 것이다.
본 발명에 따른 항체 중쇄불변부위 이종이중체-융합단백질을 이용할 경우, 상기 이종이중체-융합단백질에 포함된 IL-21의 체내 반감기가 현저하게 증가될 수 있는 장점이 있다.
자연계에 존재하는 인간 항체(Immunoglobulin G (IgG), IgM, IgD, IgE, IgA)는 동일한 아미노산 서열을 가진 두 개의 중쇄와 동일한 서열을 가진 두 개의 경쇄가 조합(assembly)된 형태로 존재한다. 이때, 동일한 두 개의 중쇄 간의 동종이중화(homodimerization)는 항체의 불변영역(Constant Region)의 마지막 도메인(IgG, IgD, IgA의 경우 CH3 도메인, IgM의 경우 CH4 도메인, IgE의 경우 CH2 및 CH4 도메인)간의 비공유결합(non-covalent interaction) 및 힌지(hinge)영역 간의 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 유도된다.
항체 유래 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc) 기술은 앞선 자연발생적 항체(IgG, IgM, IgA, IgD, IgE)의 동종이중화에 큰 기여를 하는 불변영역의 마지막 도메인간의 특정 비공유결합을 통해 이종이중화가 선호되고 동종이중화가 비선호되거나 배척되는 결합을 가지도록 엔지니어링하여 이종이중체 형태의 중쇄불변부위를 만드는 기술이다. 더 자세하게는 유전자 조작을 통해 각기 다른 두 개의 항체 중쇄의 CH3 도메인에 돌연변이를 유도하여, 두 개의 중쇄가 자연발생적 항체와 구조가 매우 유사하고, 서열에 있어 최소한의 편차를 가지면서 이종이중체를 형성하도록 유도하는 것이다(미국등록특허 제7,695,936호; 대한민국 등록특허 제1,522,954호). 상기의 이종이중체 중쇄불변부위 기술은 이중항체를 만들기 위한 기반기술로서, 지금까지 알려진 이종이중체 형성을 유도하는 CH3 도메인 돌연변이체는 대부분 CH3 도메인 상호작용면에 항체의 구조 기반 rational design에 의한 비대칭적 돌연변이 쌍을 도입함으로써 제조되었다 (Spreter Von Kreudenstein et al., 2014). 선구자적 연구로는 제넨텍사의 놉-인투-홀(knob-into-hole) 기술이 있고(Ridgway et al., 1996), 자임웍스사의 ZW1 (Von Kreudenstein et al., 2013), 젠코어사의 HA-TF(Moore GL et al., 2011), EMD 세로노사의 SEEDbody(Davis JH et al., 2010)등 많은 다국적 제약회사에서 상기의 기반 기술을 개발 및 보고하였다. 그 중에서도 본 발명에서 사용한 EW/RVT 돌연변이체는 기존의 위와 같은 돌연변이체의 상호작용을 서열 및 구조적으로 분석하여, 새로운 돌연변이 전략인 CH3 도메인 상호작용면의 선택적인 정전기적 결합이 형성되게 하고 (K360ECH3A-Q347RCH3B), 기존의 정전기적 결합 대신 상호보완적인 소수성 결합을 형성하도록 (K409WCH3A-D399VCH3B/F405TCH3B)하여 이종이중체의 형성을 증진시킨 돌연변이체이다(Choi et al. 2013; 대한민국 특허등록 제10-1522954호).
상기의 EW/RVT 돌연변이체를 포함하여 현재까지 보고된 이종이중체 중쇄불변부위 돌연변이체(heterodimeric Fc variants)는 모두 인간 항체 동종형 중에서도 가장 많은 부분을 차지하는 IgG1을 기반으로 한 것이며, IgG1 이외의 다른 동종형(IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE)에 대한 돌연변이체는 보고된 바가 없다.
이는 미국 식약청(FDA)의 허가를 받아 시판되고 있는 치료용 항체의 대부분이 IgG1 동종형을 채택하고 있기 때문인데(Irani et al. 2015), 최근에는 항체-의존성 세포 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)이나 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cellular cytotoxicity, CDC)과 같은 항체 고유의 효과 기능(effector function)이 크게 필요하지 않은 면역조절 항체(immune-modulating antibody) 혹은 수용체 작용제(agonist) 융합 단백질의 경우, IgG1에 비해 이러한 효과 기능이 현저히 떨어지는 IgG2나 IgG4를 기반으로 한 치료용 단백질의 개발이 이루어지고 있는 실정이다.
한편, 생리활성 단백질은 대부분 그 크기가 작은 경우가 많아, 체내에서의 반감기가 짧다는 문제점이 존재한다. 이러한 단점을 해결하기 위하여, PEG를 접합시키거나, 항체 유래 Fc(crystallizable fragment) 영역을 융합시키는 등의 시도가 있어왔지만, 아직까지 효율적으로 생리활성 단백질의 활성이 오랜 시간 동안 충분히 유지되는 형태의 개발은 이루어지지 못하고 있는 실정이다. 특히, 자연계에서 단량체(monomer)로 작동하는 IL-21의 경우, 기존의 동종이중화를 형성하는 항체의 중쇄불변부위 영역을 이용해서는 단량체 형태를 그대로 형성시키기 어렵다. 하나의 IL-21은 하나의 IL-21 수용체 (IL21R) 및 하나의 γc-chain과 결합함으로써 활성을 가진다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 단량체(monomer)로 작동하는 IL-21을 그대로 모사하기 위하여 항체 유래의 중쇄불변부위 영역을 포함하는 이종이중체(heterodimer) 변이체를 구축하고, 이를 이용하여 IL-21을 상기 Fc 영역의 말단에 결합시킨 형태의 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein) 형태의 새로운 치료용 융합단백질을 개발하였다.
면역 세포치료제로 사용되는 세포 중 NK 세포는 선천면역세포 중 하나로 다양한 종류의 암세포를 살상가능하고 항원유무에 관계없이 암세포를 인식하기 때문에 최근 각광받고 있는 항암 면역세포치료제이다. NK 세포를 항암 면역포치료제로 사용하기 위해서는, 항암능이 증대된 다량의 자연살해 세포의 생산 및 생체 내에서 자연살해세포가 오랜 기간 생존하여 항암 효력을 발휘할 수 있는 환경의 조성이 필요하다. 이러한 이유로 NK 세포의 활성화 조절에 영향을 미치는 사이토카인(IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFNs) 들을 자연살해세포와 함께 생체 내에 투여함으로써 NK 세포의 생존능과 항암활성을 유도하는 시도가 전 세계적으로 진행되고 있다. 그러나 현재까지 환자에게 직접 투여할 수 있도록 임상에 시판 승인된 사이토카인은 IL-2가 유일한 실정이다. IL-2는 NK세포의 생존능과 활성을 증대시키며 비용도 상대적으로 저가이지만, 면역억제세포인 조절 T세포(Regulatory T cells)를 활성화 시켜 항암면역기능을 억제시키는 단점이 있다(Cesana et al., J Clin Oncol. 2006, Wei et al., Cancer Res. 2007). 따라서, 조절 T세포를 활성화 시키지 않고 NK세포를 활성화 시키는 사이토카인의 상용화가 절실한 실정이다.
이러한 관점에서 최근 IL-21이 항암면역 치료에서 각광을 받고 있다. IL-21은 IL-2와 유사하게 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 증식과 분화를 촉진하지만, 반대로 조절 T세포의 증식에는 영향을 미치지 않는 것으로 보고되어 항암면역 세포치료제와의 병용투여가 기대되고 있다(Al-Chami et al., Cytokine, 2016). IL-21이 NK 세포 관련하여 보고된 바는 1) IL-15과 함께 Fms-like tyrosine kinase-3(FLT3-L)가 존재할 때 사람 유래 CD34+ hematopoietic progenitor cells에서 유래한 NK 세포의 증식을 촉진한다는 결과(Parrish-Novak et al. Nature, 2000), 2) 영양 세포주로 사용하는 K562 세포에 membrane bound form IL-21을 발현시키면 NK 세포의 체외 확장을 촉진시키고 노화가 억제되는 결과(Lee DA et al. PlosOne, 2012), 3) Canine NK세포의 배양시 IL-2 plus IL-15에 의한 증식을 촉진하는 결과(Shin et al., Vet Immunol Immunopathol. 2015) 및 4) Human NK세포에서 STAT3를 활성화시켜 NKG2D 수용체의 발현을 촉진시키는 결과 (Zhu et al., Blood, 2014) 등이 있다.
따라서, 본 발명에서는 체내에서 오랜 기간 활성을 유지할 수 있는 Fc-결합 재조합 IL-21을 이종이중체 공법에 의하여 제조하였고, 제조한 Fc-IL21 단량체는 수용성 IL-21 또는 이량체 IL-21과 비교하여 우수한 NK세포 증식 촉진 기능을 보이며, 체내에서 적은 빈도의 투여로 수용성 IL-2나 이량체 IL-21에 비해 월등한 항종양 효과를 유도 가능하다는 것을 발견하였다. 본 발명의 Fc-IL21 단량체를 포함하는 이종이중체-융합단백질은 수용성 IL-21 또는 IL-2의 사용시 요구되는 빈번한 투여의 단점을 보완하고, 기존 공법에 의하여 제조된 이량체 IL-21에 비해 높은 생체 항암활성 능력을 보인다.
발명의 요약
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 단량체로 생리활성을 나타내는 사이토카인의 활성이 오랜 시간 동안 충분히 유지될 수 있는 새로운 형태의 이종이중체-융합단백질 (heterodimeric Fc-fused protein)을 제공하는 것이다.
특히, 본 발명에 따른 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)은 단량체로서 생리활성을 나타내는 IL-21을 자연계에 존재하는 형태 그대로 모사함으로써, 자연계에 존재하는 그대로의 활성을 유지할 수 있는 형태이다. 본 발명의 Fc-IL21 단량체는 수용성 IL-21 또는 이량체 IL-21과 비교하여 우수한 활성을 나타낸다.
또한, 본 발명은 상기 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)을 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 이용한 질병, 특히 암의 치료를 위한 조성물, 치료방법 및 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍의 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하고,
상기 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단 중 하나 이상의 말단에 IL-21이 결합되어 있는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)에 있어서,
상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 이종이중체(heterodimer)의 형성이 촉진되도록 CH3 도메인이 변이된 것임을 특징으로 하는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이종이중체-융합단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이종이중체-융합단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 질병, 특히 암의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이종이중체-융합단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 질병, 특히 암의 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
도 1은 중쇄불변부위에 융합할 재조합 인간 IL-21의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 2는 인간 IL-21을 야생형 IgG4 Fc에 융합한 Fc-IL21 이량체 형태를 나타낸 모식도이다.
도 3은 인간 IL-21을 IgG4를 기반으로 만들어진 EW/RVT 변이체에 융합한 Fc-IL21 단량체 형태를 나타낸 모식도이다.
도 4는 인간 항체 동종형별 이종이중체 형성을 위한 CH3 도메인 변이체의 제작을 위해 각 인간 항체 면역글로불린 G 동종형별 CH3 도메인의 서열(IgG1: 서열번호 4; IgG2: 서열번호 5; IgG3: 서열번호 6; IgG4: 서열번호 7)을 나열하여 비교하고, 잠재적 돌연변이 위치를 선정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 IgG4 CH3 도메인의 야생형 및 돌연변이가 도입된 이종이중체 중쇄불변부위 쌍의 서열 정보(IgG4 wild type: 서열번호 7; IgG4 EW: 서열번호 1; IgG4 RVT: 서열번호 2)를 나타낸 도면이다.
도 6은 Fc-IL21 이량체 및 Fc-IL21 단량체를 구축하기 위해 사용된 IL-21이 융합된 야생형 Fc 및 이종이중체 중쇄불변부위 쌍의 서열정보를 나타낸 도면이다.
도 7은 도 3의 융합단백질을 동물세포에서 발현 및 정제하기 위한 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 8은 도 2의 융합단백질을 동물세포에서 발현 및 정제하기 위한 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 9는 도 7 및 도 8의 동물세포 발현벡터를 HEK293F 세포에 공동형질 전환을 통해 일시적으로 발현 및 정제한 다음, 3μg의 단백질을 비환원성 조건과 환원성 조건의 SDS-PAGE 상에서 분리하고, Coomasie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태로 분석한 결과이다.
도 10(A)는 사람의 혈액으로부터 자연 살해세포를 체외 확장 시 Fc-IL21 단량체, Fc-IL21 이량체를 처리하여 배양한 실험결과로서 자연 살해세포의 성장곡선 및 확장능을 나타낸 것이며, 10(B)는 6명의 공여자로부터 반복하여 진행한 후 통계 처리한 결과이다.
도 11은 이종이식 인간 흑색종 암 모델을 구축한 후 NK 세포와 IL-2, Fc-IL21 단량체, Fc-IL21 이량체 간의 병용치료 효과를 나타낸 도식도로, NK 세포 치료제와 IL-2, Fc-IL21의 투여방법을 나타낸 것이다.
도 12(A)는 이종이식 인간 흑색종 암 모델에서 NK 세포와 IL-2, Fc-IL21 단량체, Fc-IL21 이량체 간의 병용치료 효과로 종양의 크기를 비교한 결과이며, 도 12(B)는 이종이식 인간 흑색종 암 모델에서 NK 세포 치료만을 투여 시 종양의 크기를 나타낸 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 항체 (Immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍의 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하고,
상기 제1 Fc 영역 또는 제2 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단 중 하나의 말단에 IL-21이 결합되어 있는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)에 있어서,
상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 이종이중체(heterodimer)의 형성이 촉진되도록 CH3 도메인이 변이된 것임을 특징으로 하는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)에 대한 것이다.
바람직하게는 상기 제1 Fc 영역 또는 제2 Fc 영역의 N-말단 중 어느 하나의 말단에만 IL-21이 결합되어 있는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)인 것이다.
본 발명에 있어서, "Fc 영역" 또는 "중쇄불변부위"는 항체 유래의 CH2 도메인, CH3 도메인 및 힌지 영역(hinge domain)을 포함하는 영역을 의미한다.
본 발명에서의 "제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 이종이중체(heterodimer)의 형성이 촉진되도록 변이”되었다는 표현은 자연계에 존재하는 항체는 2개의 Fc 영역이 서로 동일한 서열을 가지는 동종이중체(homodimer) 형태를 가지게 되는데, 이러한 Fc 영역의 일부 서열에 변이를 유발시킴으로써, 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역 간의 특정 비공유 결합을 통해 이종이중체(heterodimer)의 형성이 촉진되며, 동종이중체의 형성이 감소되거나, 바람직하게는 거의 일어나지 않도록 변이되었다는 것을 의미한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역의 이종이중체(heterodimer)의 형성이 촉진되도록 하는 변이는, 상기 항체 유래 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역에 포함된 CH3 도메인 각각이 이종이중체(heterodimer)의 형성이 촉진되도록 하는 변이를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “중쇄불변부위 이종이중체(heterodimeric Fc 또는 Fc heterodimer)”는 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하고, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 이종이중체(heterodimer)의 형성이 촉진되도록 CH3 도메인이 변이된 것임을 특징으로 하는 이종이중체를 의미한다.
본 발명에서의 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 Fc 영역 유래인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 각각 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 유래인 것을 특징으로 하고,
또한 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 동종형(isotype) 항체 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 상기 CH3 도메인의 변이는 다음의 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서의 모든 변이 위치는 EU index에 따른다.
(1) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인의 K360 위치에서의 아미노산 잔기의 치환; 및 제2 Fc 영역의 CH3 도메인의 Q347 위치에서의 아미노산 잔기의 치환; 및/또는
(2) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인의 K409 위치에서의 아미노산 잔기의 치환; 및 제2 Fc 영역의 CH3 도메인의 F405 및/또는 D399 위치에서의 아미노산 잔기의 치환.
바람직하게는 상기 제1 Fc 영역의 CH3 도메인의 K360 위치에서의 아미노산 잔기의 치환은 K360E이고, 상기 제2 Fc 영역의 CH3 도메인의 Q347 위치에서의 아미노산 잔기의 치환은 Q347R인 것을 특징으로 할 수 있으며,
상기 제1 Fc 영역의 CH3 도메인의 K409 위치에서의 아미노산 잔기의 치환은 K409W이고, 상기 제2 Fc 영역의 CH3 도메인의 F405 위치에서의 아미노산 잔기의 치환은 F405T이고, D399 위치에서의 아미노산의 치환은 D399V인 것을 특징으로 할 수 있다.
가장 바람직하게는 상기 제1 Fc 영역 또는 제2 Fc 영역의 CH3 도메인의 변이는 다음의 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. (단, 변이 위치는 EU index에 따름)
(1) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인의 K360 위치에서의 K360E의 아미노산 잔기의 치환;
(2) 제2 Fc 영역의 CH3 도메인의 Q347 위치에서의 Q347R의 아미노산 잔기의 치환;
(3) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인의 K409 위치에서의 K409W의 아미노산 잔기의 치환;
(4) 제2 Fc 영역의 CH3 도메인의 F405 위치에서의 F405T 아미노산 잔기의 치환 및 D399 위치에서의 D399V의 아미노산 잔기의 치환.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체 유래 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역에 포함된 CH3 도메인은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열번호로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 항체 유래 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 IgG4 유래의 표 1에 기재된 CH3 도메인의 서열을 가지는 것이 바람직하다.
Figure PCTKR2017009570-appb-T000001
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 이종이중체-융합단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 대한 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 용도는 생리활성 단백질로 IL-21을 포함하는 이종이중체-융합단백질을 포함하는 암 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 IL-21을 포함하는 이종이중체-융합단백질을 포함하는 암 치료를 위한 약제학적 조성물로 치료 가능한 암은 대장암, 흑생종, 유방암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 소장암, 식도암, 자궁경부암, 폐암, 림프종 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물에는 추가적으로 제약상 허용되는 담체가 포함될 수 있다. "제약상(약학적으로) 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다.
상기 담체는 환자를 자극하지 않고 본 발명에 따른 이종이중체-융합단백질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 다른 담체는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]에 기재되어 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 이종이중체-융합단백질을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1 종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
또한, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 고통받는 환자의 중증도에 따라 달라질 수 있는 투여량 및 빈도로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 또 다른 형태로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.
또한, 상기 IL-21을 포함하는 이종이중체-융합단백질을 포함하는 암 치료를 위한 약제학적 조성물은 다른 항암제와 병용 치료를 위한 용도로 사용될 수 있으며, 상기 다른 항암제는 세포독성 T 세포 및/또는 자연살해(NK: Natural Killer) 세포인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 다른 당해 기술분야에서 사용될 수 있는 모든 항암제가 병용 치료를 위해 사용될 수 있다.
특히 IL-21을 포함하는 이종이중체-융합단백질을 포함하는 암 치료를 위한 약제학적 조성물을 세포독성 T 세포 및/또는 자연살해(NK: Natural Killer) 세포와 병용 치료를 위해 사용하는 경우,
1) 시험관내에서 IL-21에 의해 유도되는 자연 살해세포의 증식능을 보존;
2) 생체내에서 자연살해세포와 병용 투여시 IL-21 단독 처리군에 비해 월등한 항암활성 증대를 유도; 또는
3) IL-21 및 타 gamma-chain 사이토카인 (예, IL-2, IL-7, IL-15등)의 짧은 반감기로 인하여 요구되는 빈번한 생체투여를 대체할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기와 같은 암 치료를 위한 약제학적 조성물을 자연살해(NK: Natural Killer) 세포와 병용 투여하는 경우, 단량체 IL-21을 포함하는 이종이중체-융합단백질은 수용성 IL-21 또는 이량체 IL-21과 비교하여 현저히 우수한 활성을 나타낸다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 이종이중체-융합단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 치료를 요하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료방법을 제공한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 이종이중체-융합단백질 내에 포함된 생리활성 단백질이 IL-21일 경우, 더욱 바람직하게는 단량체 IL-21일 경우, 암 환자의 치료, 특히 대장암, 흑생종, 유방암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 소장암, 식도암, 자궁경부암, 폐암, 림프종 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 암을 앓고 있는 환자의 치료방법을 제공한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 인간 항체 동종형별 이종이중체 형성을 위한 CH3 도메인 변이체의 고안 (서열 분석)
이종이중체 형성이 선호되는 CH3 도메인 돌연변이가 도입된 인간항체 중쇄불변부위 이종이중체의 단편을 만들기 위해, 먼저 이중체 형성을 위한 상호작용에 주요하게 작용하는 CH3 도메인의 인간항체 동종형별간의 아미노산 서열의 유사정도를 분석하였다. 이때, 이종의 CH3A:CH3B(본 발명에 있어, CH3A 및 CH3B는 각각 제1 Fc 영역의 CH3 영역 및 제2 Fc 영역의 CH3 영역을 의미한다)에 유도되는 돌연변이 쌍(EW/RVT)은 기존의 문헌 또는 특허에 공개된 중쇄불변부위 이종이중체 형성을 증진시키기 위한 전략으로 CH3A:CH3B 형성이 고수율로 형성되도록 한다(Choi et al, 2013; 대한민국 특허등록 제10-1522954호). 도 4는 각 인간 항체 면역글로불린 G (IgG) 동종형별 CH3 도메인의 서열(IgG1: 서열번호 4; IgG2: 서열번호 5; IgG3: 서열번호 6; IgG4: 서열번호 7)을 나열하여 비교한 것이다.
Figure PCTKR2017009570-appb-T000002
서열 비교 결과, 진하게 강조한 Q347, K360, D399, F405, K409 잔기들은 돌연변이가 도입된 잔기들로, 인간 항체 IgG의 subtype에 관계없이 거의 유사한 잔기로 보존되어 있는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 이종이중체 CH3 돌연변이체 쌍 형성을 위해 유도되는 돌연변이는 인간 항체 IgG1에 한정되지 않음을 알 수 있었다. 각 아미노산 서열은 International ImMunoGeneTics information system (IMGT; URL: http://www.imgt.org/) 에서 확인하였으며, 본 발명에서의 모든 아미노산 위치 표기는 EU index (numbering)을 따른다.
실시예 2: 인간 Fc-IL21 융합단백질 구축
이종이중체 형성능이 기존에 보고된 IgG1 기반 EW/RVT 중쇄불변부위 이종이중체 변이체와 유사한 정도로 유지될 것이라 예상되는 도 5의 동종형별 변이체 중에서 IgG4를 기반으로 한 변이체 (IgG4-EW/RVT, 서열번호 1, 2)를 이용하여 인간 IL-21(Interleukin 21, 서열번호 3) 융합단백질을 구축하였다. 자연계에 존재하는 IL-21은 단량체로 작동하는 사이토카인으로, 하나의 IL-21이 하나의 IL-21 수용체(IL21R) 및 하나의 γc-chain과 결합함으로써 활성을 가진다. 따라서 상기 IgG4-EW/RVT 이종이중체 변이체를 이용하여, 하나의 IL-21을 서로 다른 이종이중체 Fc 변이체 (CH3A 또는 CH3B) 중 하나에만 연결하여 자연계에 존재하는 IL-21의 단량체 형태를 유지하고자 하였다.
융합단백질의 구축을 위한 중쇄불변부위 이종이중체 변이체는 IgG4를 기반으로 하여 EW/RVT 돌연변이가 도입되어 이종이중체를 형성하는 IgG4-EW/RVT을 사용하였다. 기존 보고에 따르면, 항체와 사이토카인을 융합한 형태인 이뮤노사이토카인 (Immunocytokine)의 구축에 있어 IgG1이 가지는 ADCC/CDC와 같은 항체 고유 기능이 오히려 생체 내 제거현상(clearance)을 촉진한다. 따라서 ADCC/CDC의 기능이 IgG1과 비교하였을 때 거의 나타나지 않는 IgG4 동종형을 사용하여 융합단백질을 구축하였다 (Gillies SD et al., 1999).
도 1 내지 3은 IL-21의 재조합 단백질, 야생형 Fc를 이용한 IL-21 이량체 융합단백질, 그리고 EW/RVT를 이용한 IL-21 단량체 융합단백질의 모식도를 나타낸 것이다. 그 중에서도 도 3은 본 발명에서 제작한 CH3 돌연변이체 쌍이 도입된 융합단백질이다.
CH3 돌연변이체 쌍이 도입된 IL21-Fc(IgG4 EW)와 Fc(IgG4 RVT)를 CMV 프로모터를 지닌 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, USA)에 signal sequence-IL21 mature form-Hinge-CH2-CH3 또는 signal sequence-Hinge-CH2-CH3를 가지도록 인 프레임 (in-frame)으로 NotI/HindIII를 이용하여 클로닝하였다. 이 때 사용된 IL-21은 인간 IL-21(Uniprot entry name, Q9HBE4; 서열번호 3)로, signal sequence를 제외한 mature form을 코딩하는 DNA 서열만을 사용하였다. 특히, 인간 IL-21은 IL-21 수용체와 상호작용이 용이하도록 추가의 펩타이드 링커 없이, hinge 영역을 이용하여 중쇄불변부위와 연결하였다. 이때 사용한 hinge 영역은 기존에 많이 사용하는 IgG1 유래 hinge를 사용하였고, 이중체 형성을 위한 중심 hinge 영역 (core hinge region) 내의 시스테인(cysteine) 잔기를 제외한 나머지 상부 hinge 영역 (upper hinge region)의 시스테인 잔기는 단백질 융합 시, 원하지 않는 이황화 결합이 생기는 것을 막기 위해 세린(serine) 잔기로 치환하였다.
특히, 본 발명에서 사용된 중쇄불변부위의 CH2 도메인은 IgG2/4 hybrid이다. IgG2/4 hybrid는 IgG2의 lower hinge 부분과 IgG4의 CH2 부분이 융합된 형태이다. 이는 기존에 보체 C5를 표적하는 eculizumab 항체 (제품명: Soliris) 에서 유래된 도메인으로써, 항체의 사용목적 (CDC 기능을 완전히 없애기 위함)에 따라 Fc 수용체에 대한 결합능을 억제시키고자 고안된 도메인이다 (Robert A et al, 2009).
도 3에 대한 비교예로 야생형 Fc를 융합한 Fc-IL21 이량체(도 2)를 구축하였다. 상기와 유사한 방법으로 인간 IL-21 mature form을 코딩하는 DNA 서열을 야생형 IgG4 CH3가 들어가 있는 동물세포 발현벡터에 도 8과 같은 인프레인 (in-frame)으로 NotI/HindIII 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 이때 사용한 hinge 영역 및 CH2 도메인 역시 Fc-IL21 단량체 구축에 사용한 서열과 동일하다(도 6).
표 3은 상기융합단백질의 구축에 사용된 인간 IL-21의 mature form에 대한 아미노산 서열이다.
Figure PCTKR2017009570-appb-T000003
실시예 3: Fc-IL21 융합단백질 발현/정제
도 3의 Fc-IL21 단량체 융합단백질은 인간 IL-21이 융합된 IgG4 CH3A(EW) 및 IgG4 CH3B(RVT)의 발현 벡터를 1:1 비율로 하여 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscinece)의 혼합물을 HEK293-F (Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)하여 무혈청 FreeStyle 293 발현배지 (Invitrogen)가 들어있는 진탕 플라스크에서 배양함으로써 이루어진다. 자세한 방법은 다음과 같다.
진탕 플라스크(Corning)에 200 mL 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 1.0×106세포/ml의 밀도로 배지 180 ml에 파종하여, 130 rpm, 8% CO2에서 배양하였다. 24시간 후, 각각의 중쇄불변부위 변이체를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해 그에 따른 CH3A 및 CH3B 플라스미드를 10 ml FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에 CH3A 125μg, CH3B 125μg 총 250μg (2.5μg/ml)으로 희석하여, PEI 750 μg을 희석한 10 ml의 배지 (7.5 μg/ml)와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 180 ml로 파종한 세포에 넣어 짧게는 5일에서 길게는 7일 동안 배양하게 되면, 세포가 생산한 단백질 즉, 중쇄불변부위 변이체를 포함한 융합단백질은 세포에 의해 세포 바깥으로 분비되어 배지에 쌓이게 된다. 때문에 단백질은 세포 배양 후 2500 rpm에서 20 분간 원심분리하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질 A 세파로오스 컬럼 (protein A Sepharose column, GE healthcare)을 이용하여 정제하였다. 이 때, 정제방법은 단백질 A 컬럼 회사에서 제공하는 표준 프로토콜을 참조하였으며, 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다.
상기 정제된 Fc-IL21 단량체 및 이량체 융합단백질 3μg을 12% 비환원성 및 환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다(도 9). 비환원성 조건에서 Fc-IL21 단량체는 71 kDa, Fc-IL21 이량체는 86 kDa에서 관찰되었고, 환원성 조건에서는 IL-21이 융합된 야생형 Fc만으로 이루어져 있는 Fc-IL21 이량체는 43 kDa에서 하나의 밴드만 관찰되었고, IL-21이 융합된 중쇄불변부위 변이체 CH3A(EW)와 IL-21이 융합되지 않은 중쇄불변부위 변이체 CH3B(RVT) 두 개의 플라스미드로 이루어져 있는 Fc-IL21 단량체의 경우에는 43, 28 kDa에서 두 개의 밴드가 관찰되었다.
표 4는 발현된 Fc-IL21 단량체 및 이량체 융합단백질의 정제 수율을 나타낸 것이다. 결과 값은 3회 독립적인 실험을 수행한 후 평균의 표준오차 (mean ± SD)로 나타내었다. Fc-IL21 단량체 형태가 Fc-IL21 이량체 형태에 비해 약 17배 높은 정제수율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2017009570-appb-T000004
실시예 4: 인간 Fc-IL21 융합단백질의 NK 세포 증식능 평가
말초혈액 단핵구와 방사선 조사된 Jurkat 세포와 EBV- LCL 세포를 실시예 3의 인간 IL-21 융합단백질 존재하에 배양하면서 NK 세포의 증식 및 기능의 향상이 유도되는 것을 확인하였다.
자연살해세포의 체외 확장은 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 사람의 혈액을 채혈한 후, Ficoll (Ficoll-paqueTM PLUS, GE healthcare)을 이용하여 2500 rpm에서 30분간 원심분리한 후 연막층(buffy coat)에서 말초혈액 단핵세포를 분리하였다. 그 후 100 Gy로 방사선 조사한 Jurkat 세포주와 EBV-LCL 세포주를 사용하여 IL-2 500 U/ml 존재하에 1:0.5:0.5의 비율로 RPMI1640 배지에 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin을 넣은 hRPMI 배지에서 공배양 하였다. 이때 IL-21 또는 Fc-IL21 (단량체 또는 이량체)를 1.25uM로 처리하여 배양하였다. 이후에 4일 마다 한번씩 IL-2가 500 U/ml로 첨가된 hRPMI 배지로 교환해 주면서 배양을 하였다. 배지를 교환 시 헤마토사이토미터를 이용하여 세포수를 계산하여 2.5×105 cells/ml로 농도를 맞춰서 약 3주간 배양하였다 (대한민국 특허 제 1643165호).
그 결과, 사람의 혈액으로부터 자연 살해세포를 체외 확장 시 Fc-IL21 단량체, Fc-IL21 이량체를 처리하여 배양하면 Fc-IL21 단량체와 이량체 모두 수용성 IL-21과 유사하게 자연살해세포의 확장능이 2배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 10a 및 표 5). 또한, 6명의 공여자로부터 반복하여 진행하였을 때에도 대조군에 비해 IL-21, Fc-IL21 단량체, Fc-IL21 이량체를 추가하여 배양한 경우 증식 확장능이 월등히 향상됨을 확인할 수 있었다 (도 10b).
Figure PCTKR2017009570-appb-T000005
즉, 자연 살해 세포 치료제의 체외 확장 배양시 단량체 Fc-IL21을 추가로 넣어 주면 기존의 방법에 비해 다량의 자연 살해세포의 유도가 가능함을 알 수 있었다.
실시예 5: 인간 Fc-IL21 융합단백질의 생체 내 종양성장 억제능 평가
생체 내에서도 실시예 3의 인간 IL-21 융합단백질의 NK 세포 증식 효과가 동일하게 나타나는지 확인하였다.
도 12는 동물암 모델을 이용하여 마우스 생체 내에서 종양 성장 억제 활성을 측정한 결과이다.
구체적으로, 6~7주령의 면역 결핍 마우스 (Nude)에 흑색종 세포주인 A375를 피하내 2.5×106 세포 주사하여 종양을 유도하였다. 11일 후 종양이 형성되면 3일에 1회 Fc-IL21 단량체 또는 이량체를 동일한 몰농도 (~580uM)로 정맥 투여하고 6일에 1번 1×107 NK 세포를 정맥 주사한 후 3일에 1번 종양 크기를 측정하였다(도 11). NK 세포는 6일에 1번 정맥 투여를 하였고, IL-2는 하루에 2번씩 복강주사 하였으며, Fc-IL21는 3일에 1번 정맥 투여하였다. 대조군으로 IL-2를 NK 세포 투여일로부터 5000IU으로 총 3일간 6회 투여하였다. 동물암 모델에 투여시 Fc-IL21은 Phosphate Buffered saline (PBS)에 희석하여 Fc-IL21 이량체 기준으로 10ug (~580uM)으로 정맥 투여하였다.
아무것도 투여하지 않은 대조군과 기존에 NK 세포 치료효과를 검증하였던 NK+IL-2 투여 그룹, NK+Fc-IL21 단량체 및 NK+Fc-IL21 이량체 투여 그룹을 비교하였다. 그 결과 대조군에 비해 NK 세포와 IL-2, Fc-IL21 단량체, 이량체 처리 그룹에서 암세포 성장이 둔화되어 있는 것을 알 수 있었으며, 무엇보다도 Fc-IL21 이량체에 비해 Fc-IL21 단량체의 항종양 효과가 뛰어난 것을 알 수 있었다 (도 12a). 즉, NK 세포 치료제와 단량체 Fc-IL21를 이종이식 피부암 모델 (human A375 멜라노마)에 병용 투여시 자연살해세포의 체내 항암작용을 증진시키는 것을 확인하였다.
또한, IL-2를 투여하지 않는 경우 인간 NK세포의 항암능은 보이지 않았다 (도 12b). 따라서, NK 세포의 생체내에서 항종양 효과를 관찰하기 위하여 IL-2의 병용투여가 필수적임을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)은 단량체로서 IL-21을 자연계에 존재하는 형태를 최대한 모사함으로써, 자연계에 존재하는 그대로의 활성을 유지할 수 있으며, 또한, 상기 단량체로서 IL-21은 수용성 IL-21 또는 이량체 IL-21과 비교하여 활성이 우수하고, IL-21의 체내에서의 반감기가 현저하게 연장될 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein) 형태는 추가적인 정제 과정의 최적화 과정 없이 단량체 형태의 이종이중체-융합단백질의 제조가 용이하다는 장점도 가진다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (9)

  1. 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍의 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하고,
    상기 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단 중 하나 이상의 말단에 IL-21이 결합되어 있는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein)에 있어서,
    상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 이종이중체(heterodimeric Fc)의 형성이 촉진되도록 CH3 도메인이 변이된 것임을 특징으로 하는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein).
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 Fc 영역 또는 제2 Fc 영역의 N-말단 중 어느 하나의 말단에만 IL-21이 결합되어 있는 이종이중체-융합단백질(heterodimeric Fc-fused protein).
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 Fc 영역 유래인 것을 특징으로 하는 이종이중체-융합단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 완전한 항체(whole antibody) 형태에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 이종이중체-융합단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 Fc 영역 또는 제2 Fc 영역의 CH3 도메인의 변이는 다음의 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 이종이중체-융합단백질. (단, 변이 위치는 EU index에 따름)
    (1) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인의 K360 위치에서의 K360E의 아미노산 잔기의 치환;
    (2) 제2 Fc 영역의 CH3 도메인의 Q347 위치에서의 Q347R의 아미노산 잔기의 치환;
    (3) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인의 K409 위치에서의 K409W의 아미노산 잔기의 치환;
    (4) 제2 Fc 영역의 CH3 도메인의 F405 위치에서의 F405T 아미노산 잔기의 치환, 및 D399 위치에서의 D399V의 아미노산 잔기의 치환.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이종이중체-융합단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 암 치료를 위한 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 대장암, 흑생종, 유방암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 소장암, 식도암, 자궁경부암, 폐암, 림프종 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 다른 항암제와 병용 치료를 위한 약제학적 조성물.
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